一種農藥降解酶劑及其製備方法
2023-10-17 18:32:24
專利名稱：一種農藥降解酶劑及其製備方法
技術領域：
本發明涉及酶製劑製備工藝的技術領域，具體地說是一種農藥降解酶劑及其製備方法。
背景技術：
農藥殘留導致農業生產環境惡化，威脅食品安全，一直是國內外關注的問題。農藥殘留的生物降解是目前國內外研究的熱點，利用基因工程手段構建農藥解毒酶基因工程菌，發酵並表達農藥降解酶是是目前解決農藥殘留問題的有效技術手段，具有安全、高效、無二次汙染等特點。農藥降解酶的製備工藝直接關係到酶活力的高低，利用基因工程菌製備農藥降解 酶的工藝包括種子培養、發酵培養、菌體收集、菌體破碎和粗酶提取等步驟。在種子培養和發酵培養過程中要保持一定的抗生素壓力以保持工程菌中的質粒不丟失。在發酵前期要加入誘導物，誘導酶蛋白的表達，誘導物一般為異丙基硫代半乳糖苷。酶蛋白通常存在於細胞內部，所以發酵結束後首先要收集菌體，離心法簡單易行且回收率高，是工業化生產首選的收集方法。菌體破碎是粗酶提取的關鍵工藝，直接關係到酶活性高低和酶液的品質。菌體破碎方法有超聲波破碎、真空負壓破碎、機械攪拌破碎、低溫凍融破碎等方法，其中超聲波破碎方法簡單且效率較高，適合工業化生產。
發明內容
本發明目的在於提供一種農藥降解酶劑及其製備方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種農藥降解酶劑，所述農藥降解酶劑為，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發酵培養後的菌體破碎的上清液。農藥降解酶劑為在LB培養基中培養後的基因工程菌菌液再經發酵培養後的發酵液；即將基因工程菌在含氨苄青黴素的LB液體培養基中37°C，溶氧量20-30%，培養10-15小時，而後按體積比1% -5%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，37°C，溶氧量20-30%，培養2-4小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到22°C -25°C，誘導表達18-22個小時後菌體經過破碎並回溶於原發酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液，離心得到的上清液即為降解酶劑。農藥降解酶劑的製備方法，將基因工程菌在含氨苄青黴素的LB液體培養基中370C，溶氧量20-30 %，培養10-15小時，而後按體積比I % _5%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，37 °C，溶氧量20-30 %，培養2-4小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到22°C _25°C，誘導表達18-22個小時後菌體經過破碎並回溶於原發酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液，離心得到的上清液即為降解酶劑。
將上述所得發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，並加入發酵液體積1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶菌體，而後以5000rpm離心10分鐘收集菌體，將收集的菌體中加入液氮破碎菌體，待液氮揮發乾淨後將菌體冷凍乾燥，將凍幹後的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶至原發酵液體積，再以10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。所述發酵培養為按重量百分比計，蛋白腖2% -3 %、酵母粉2% -3 %、甘油2% -3%, K2HPO4 O. 25%, KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50-75 μ g的氨苄青黴素。所述LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白腖1%、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50-75 μ g的氨苄青黴素。所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪於鐵製或鋼製容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高於菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發乾淨後將菌體真空冷凍乾燥，其真空度30pa，凍幹溫度-50°C，凍幹時間8-12h。所述降解酶劑用於降解有機磷農藥的殘留。
本發明所具有的優點為1.本發明製備的農藥降解酶劑能夠降解有機磷農藥殘留，可以去除水果、蔬菜表面農藥殘留，保障食品安全。2.本發明製備的農藥降解酶劑酶活力高，作用迅速。3.本發明製備的農藥降解酶劑酶活力穩定。不易失活。4.本發明製備的農藥降解酶劑安全高效，無毒副作用。
具體實施例方式實施例1將保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCCNo. 1529的基因工程菌株接種於含氨苄青黴素的LB液體培養基，培養溫度37°C，溶氧量20%，培養時間10個小時。LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白腖I %、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50 μ g的氨苄青黴素。所述基因工程菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 1529，另參見申請號200510086957. 3中的相關記載。而後按體積比1%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，在370C，溶氧量20%，培養2小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到25°C，誘導表達20個小時後將發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，並加入1/10發酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。上述緩衝液的pH值應使用酸度計加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪於鐵製或鋼製容器中，菌體厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高於菌體表面0. 5cm，待液氮揮發乾淨後將菌體置於真空冷凍乾燥機冷凍乾燥，其中真空冷凍乾燥真空度30pa，凍幹溫度_50°C，凍幹時間12h，將凍幹後的菌體用0. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶至原發酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。發酵培養為按重量百分比計，蛋白腖2%、酵母粉2%、甘油2%、K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨苄青黴素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50 μ g的氨苄青黴素。檢測上述製備所得農藥降解酶的酶活力吸取980 μ I O. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩衝液，10 μ I 10mg/mL的對硫磷溶液(稱取對硫磷標準品IOOmg,用乙醇溶解並定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農藥降解酶劑，30°C反應I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩衝液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。上述緩衝液的pH值應使用酸度計加以校正。)充分混勻，於410nm波長下測定產物對硝基苯酚的吸光度，通過標準曲線，計算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C，pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對硫磷所需要的酶量定義為一個酶活力單位U。測定上述製備的農藥降解酶酶活力為10546U/mL，能夠降解有機磷農藥殘留。 實施例2將基因工程菌接種於含氨苄青黴素的LB液體培養基，培養溫度37°C，溶氧量20%，培養時間10個小時。LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白腖I %、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50的氨苄青黴素。而後按體積比1%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，在370C，溶氧量25%，培養3小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到25°C，誘導表達22個小時後將發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，並加入1/10發酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。上述緩衝液的pH值應使用酸度計加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪於鐵製或鋼製容器中，菌體厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高於菌體表面0. 5cm，待液氮揮發乾淨後將菌體置於真空冷凍乾燥機冷凍乾燥，其真空冷凍乾燥真空度30pa，凍幹溫度-50°C，凍幹時間10h，將凍幹後的菌體用0. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶至原發酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。發酵培養為按重量百分比計，蛋白腖2.5%、酵母粉2.5%、甘油2.5%、K2HPO40. 25%,KH2PO4 0. 016%,NaCl 0. 05%、MgSO4 ·H2O 0. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨苄青黴素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50 μ g的氨苄青黴素。檢測上述製備所得農藥降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩衝液，10 μ I 10mg/mL的對硫磷溶液(稱取對硫磷標準品IOOmg,用乙醇溶解並定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農藥降解酶劑，30°C反應I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩衝液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。上述緩衝液的pH值應使用酸度計加以校正。)，充分混勻，於410nm波長下測定產物對硝基苯酚的吸光度，通過標準曲線，計算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C，pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對硫磷所需要的酶量定義為一個酶活力單位U。測定上述製備的農藥降解酶酶活力為11250U/mL,能夠降解有機磷農藥殘留。實施例3將基因工程菌菌接種於含氨苄青黴素的LB液體培養基，培養溫度37°C，溶氧量20%，培養時間10個小時。LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白腖I %、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50的氨苄青黴素。而後按體積比2%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，在370C，溶氧量30%，培養3小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到22°C，誘導表達20個小時後將發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，並加入1/20發酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。上述緩衝液的pH值應使用酸度計加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪於鐵製或鋼製 容器中，菌體厚度O. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高於菌體表面1cm，待液氮揮發乾淨後將菌體置於真空冷凍乾燥機冷凍乾燥，其中真空冷凍乾燥真空度30pa，凍幹溫度-50°C，凍幹時間12h)，將凍幹後的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶至原發酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。發酵培養為按重量百分比計，蛋白腖3%、酵母粉2%、甘油2. 5%、K2HP04 0. 25%,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨苄青黴素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加75 μ g的氨苄青黴素。檢測上述製備所得農藥降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩衝液，10 μ I 10mg/mL的對硫磷溶液(稱取對硫磷標準品IOOmg,用乙醇溶解並定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農藥降解酶劑，30°C反應I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩衝液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。上述緩衝液的pH值應使用酸度計加以校正。)，充分混勻，於410nm波長下測定產物對硝基苯酚的吸光度，通過標準曲線，計算酶活力。酶活力單位(U)定義為在30°C，pH 7. O的條件下，I分鐘降解I μ g甲基對硫磷所需要的酶量定義為一個酶活力單位U。測定上述製備的農藥降解酶酶活力為11532U/mL，能夠降解有機磷農藥殘留。
權利要求
1.一種農藥降解酶劑，其特徵在於所述農藥降解酶劑為，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發酵培養後的菌體破碎的上清液。
2.按權利要求1所述的農藥降解酶劑，其特徵在於農藥降解酶劑為在LB培養基中培養後的基因工程菌菌液再經發酵培養後的發酵液；即將基因工程菌在含氨苄青黴素的LB液體培養基中37°C，溶氧量20-30%，培養10-15小時，而後按體積比1% _5%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，37 °C，溶氧量20-30 %，培養2-4小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到22°C _25°C，誘導表達18-22個小時後菌體經過破碎並回溶於原發酵液體積的O. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩衝液，離心得到的上清液即為降解酶劑。
3.—種權利要求1所述的農藥降解酶劑的製備方法，其特徵在於將基因工程菌在含氨苄青黴素的LB液體培養基中37 °C，溶氧量20-30 %，培養I O-15小時，而後按體積比1% -5%的接種量將培養液接種於含氨苄青黴素的發酵培養基，37°C，溶氧量20-30%，培養2-4小時後向發酵培養培養基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖後，將培養溫度降到220C -25°C，誘導表達18-22個小時後菌體經過破碎並回溶於原發酵液體積的O. lmol/LpH7. O的磷酸鹽緩衝液，離心得到的上清液即為降解酶劑。
4.按權利要求4所述的農藥降解酶劑的製備方法，其特徵在於將上述所得發酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，並加入發酵液體積1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶菌體，而後以5000rpm離心10分鐘收集菌體，將收集的菌體中加入液氮破碎菌體，待液氮揮發乾淨後將菌體冷凍乾燥，將凍幹後的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩衝液回溶至原發酵液體積，再以10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農藥降解酶劑。
5.按權利要求4所述的農藥降解酶劑的製備方法，其特徵在於所述發酵培養為按重量百分比計，蛋白腖2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%、K2HPO4 O. 25%, KH2PO4O.016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的發酵培養基為每毫升發酵培養基中添加50-75 μ g的氨苄青黴素。
6.按權利要求4所述的農藥降解酶劑的製備方法，其特徵在於所述LB液體培養基為按重量百分比計，胰蛋白腖1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%，餘量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨苄青黴素的LB液體培養基為每毫升LB液體培養基中添加50-75 μ g的氨苄青黴素。
7.按權利要求4所述的農藥降解酶劑的製備方法，其特徵在於所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪於鐵製或鋼製容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高於菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發乾淨後將菌體真空冷凍乾燥，其真空度30pa，凍幹溫度_50°C，凍幹時間8-12h。
8.按權利要求4所述的農藥降解酶劑的製備方法，其特徵在於所述降解酶劑用於降解有機磷農藥的殘留。
全文摘要
本發明涉及酶劑製備工藝的技術領域，具體地說是一種農藥降解酶劑及其製備方法。所述所述農藥降解酶劑為保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1529的基因工程菌株發酵培養後的菌體破碎的上清液。本發明製備的農藥降解酶劑能夠降解有機磷農藥殘留，可以去除水果、蔬菜表面農藥殘留，保障食品安全。
文檔編號A62D101/26GK102994462SQ20111043107
公開日2013年3月27日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者謝建飛, 石元亮, 盧宗雲, 張惠文, 李鵬程, 邢雲鵬, 李敏 申請人:遼寧中科生物工程有限公司