製備、分離及超低溫保存子宮內膜/月經細胞的製作方法
2023-10-18 00:04:14 1
專利名稱：製備、分離及超低溫保存子宮內膜/月經細胞的製作方法
技術領域：
本案主張美國臨時申請案2007年3月I日申請的第60/904，836，2007年3月20日申請的第60/918，961號，2007年9月17日申請的第60/994，166號，2007年10月9日申請的第60/998，255號，2008年I月22日申請的第61/011，881號及2008年2月29日申請的第—號的優先權，前述姆一案的名稱為"Procurement, Isolation, and Cryopreservationof Endometrial/Menstrual Cells"其整體內容系以引用方式併入本文。本發明通常涉及關於獲得月經幹細胞(MSC)的方法、製程及系統。本發明尤其涉及關於取得及處理月經期間所獲得的血液、體液及組織以分離及收集月經幹細胞群的方法、製程及系統，這些月經幹細胞可經超低溫保存或經由各種培養及選擇步驟進ー步處理以獲得為超低溫保存或為治療或藥妝用途作準備的MSC。本發明還涉及關於包含至少ー個月經幹細胞的相關組合物。
背景技術：
幹細胞固有地具有經由控制細胞與細胞接觸及內在信號而經歷活體內細胞分裂及細胞分化的能力。已顯示幹細胞能藉由經局部環境因子刺激來控制細胞接觸及內在信號而活體外分裂及分化成多種細胞。應了解，幹細胞可獲自若干來源，包括多種成人組織(諸如骨髄)以及胚胎組織。某些幹細胞表達為c-kit受體、青灰因子(Steel factor)受體及幹細胞因子受體的抗原因子CD117。c-kit的基因編碼幹細胞因子(SCF)的酪胺酸激酶生長因子，其亦稱為肥大細胞生長因子且為血細胞生成、黑素生成及生育力所必需。應了解，⑶117在造血幹細胞、肥大細胞、生殖細胞、黑素細胞、某些基底上皮細胞、乳房的腔室上皮細胞及胃腸道的Cajal間質細胞中表達。⑶117在生殖細胞確立、維持及功能方面具有關鍵作用。研究指示在胚胎性腺中，CD117及其相應配位體SCF為原胚生殖細胞存活及増殖所必需。另外，研究指示CD117及其相應配位體SCF為響應促性腺激素產生配子所必需。換言之，與配位體SCF組合的CD117為睪丸生殖細胞、精原細胞的存活和増殖以及為卵母細胞的生長和成熟所必需。研究還指示⑶117為活體外原始造血細胞増殖的有效生長因子。幹細胞的治療應用以骨髓的早期實驗起始。近一個世紀前，醫師將骨髓經ロ投於患有貧血及白血病的患者。儘管該療法並不成功，但實驗室研究者最終證實可以將取自其它小鼠的骨髓輸注至具有缺陷性骨髄的小鼠的血流中而使其恢復健康。這促使醫師推測將骨髓自一人移植至另一人(同種異體移植)是否可行。來自骨髓及臍帶的幹細胞已廣泛地主要用於造血移植以治療多種疾病。自利用骨髄的第一幹細胞移植出發，已鑑別出幹細胞的其它來源，包括羊水、胎盤、臍帶、帶內膜、花頓氏膠(Wharton' s Jelly)、脂肪及上皮細胞。
當研究者遇到由細胞的身體排斥反應(稍後表徵為移植物抗宿主疾病(GVHD))所引起的疾病及/或死亡時，人類免疫系統的作用，亦即防衛本身免受感染及外來物質的身體固有機制，成為早期移植中的關鍵考慮因素。直至發現人類組織兼容性抗原與人類免疫系統之間的關係之後才以較大規模嘗試在人類中進行骨髄移植。體內大多數細胞表面上所發現的這些蛋白質被稱為人類白血球抗原或HLA抗原。身體免疫系統使用這些HLA抗原以鑑別哪些細胞屬於體內且哪些不屬幹。每當免疫系統不識別細胞上的抗原時，其即產生抗體及破壞細胞的其它物質。身體尋找且破壞的對象為致感染細菌、病毒、腫瘤細胞及外來對象(諸如碎片)。以此方式，免疫系統防衛身體抵抗可進入體內且引起損害的物質。視治療所靶向的疾病病況而定，利用個體自身幹細胞的自體移植可具有由準確HLA匹配效益所產生的某些潛在優勢。供體與受體的HL A抗原匹配愈接近，所捐贈骨髄的T細胞(免疫系統細胞)將反抗患者身體的可能性愈小。
來源於骨髓的成人幹細胞的移植已成功用於治療人類疾病，諸如範康尼氏貧血(Fanconi / s Anemia)、再生障礙性貧血、急性及慢性白血病、脊髓增生性病症、骨髄發育不良症候群、淋巴增生性病症及其它惡性疾病。骨髄成人幹細胞的替代性來源包括外周血液祖細胞、臍帶血及自這些來源收集的間質幹細胞。然而，存在與成人幹細胞的治療用途相關的若干缺點。已顯示成人幹細胞具有有限功效，諸如在培養中的若干繼代後生長緩慢及多能性損失。胚胎幹細胞已證實増殖潛力使其適合於細胞療法。然而，已顯示人類胚胎幹細胞產生畸胎瘤。另外，自胚胎收集幹細胞部分由於在收集過程中破壞生長中的胚胎而受到倫
通關注。已鑑別幹細胞的其它來源，其克服至少ー些與成人及胚胎幹細胞相關的問題。ー種來源為含有人類成人幹細胞的臍帶血。臍帶血已出於若干原因而證實為幹細胞的可行來源。臍帶血相對容易在分娩小孩期間取得且經處理以供超低溫保存。臍帶血提供能細胞分裂及分化成多種細胞類型的幹細胞的合適來源。來源於臍帶血的幹細胞已在臨床背景下使用以作為骨髓替代者來治療若干已知人類病症及疾病。詳言之，來源於臍帶血的幹細胞已成功用於造血移植、造血重建及治療脊髓損傷。另外，已顯示來源於臍帶血的幹細胞在動物模型中逆轉中風及心肌梗塞的效應。已確定子宮內膜/月經幹細胞(MSC)證實在培養物中與胚胎幹細胞類似的増殖能力。MSC亦展現某些間質幹細胞標記及某些胚胎幹細胞標記，其證實活體外及活體內多能性能力的潛力。MSC用作幹細胞來源出於若干原因系有益的。首先，MSC證實分化成特定細胞譜系的能力。其次，任何倫理關注或考慮因素系藉由收集另外視為廢棄的MSC而得以緩和。最後，在月經周期期間取得MSC的製程對供體相對不賦予危險性。相信，不存在關於收集MSC抑或取得合適樣本量的MSC的已知方法，及適用於獲得表現某些間質幹細胞標記及/或某些胚胎樣抗原因子(尤其由MSC表現的細胞表面因子)的活的、最大產量MSC的相關處理及細胞收集方法。因此，目前需要收集合適量的存在於月經期間排出的體液、血液及組織中的MSC以為即期運送至實驗室作準備的方法，該實驗室處理月經體液、血液及組織以分離及超低溫保存或處理MSC。目前亦需要處理月經體液、血液及組織以獲得來源於月經血液、體液及組織的MSC的細胞製劑的方法。亦進ー步需要自月經流分離、選擇及/或培養MSC以為超低溫保存、進ー步處理或治療用途作準備，諸如，可表現包含⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的細胞表面標記或細胞內標記中的至少ー者，而表現較低量或不表現細胞標記CD3及HLA II類中的至少ー者的細胞。其它細胞標記特徵系以實施本發明的實施例的結果提供。更進一歩需要超低溫保存獲得及收集自月經血液、體液及組織的MSC或特異性MSC的群。
發明內容
目前需要易於收集、處理及超低溫保存且具有治療、藥妝或其它用途的潛力的幹細胞來源。本發明的方法、製程及組合物滿足此需要。本發明提供獲得月經幹細胞的方法。在一實施例中，該方法包含自月經期間所收集的月經流分離月經幹細胞的步驟。自月經流分離月經幹細胞的步驟包含以離心、密度梯度離心、過濾或沉降的至少ー個步驟處理該月經流。分離月經幹細胞的步驟亦可視情況包
含以包含至少ー種抗生素的溶液淨化該等月經幹細胞。在該實施例中，該方法包含處理分離自月經流的月經幹細胞的另一步驟。處理分離自月經流樣本的月經幹細胞的步驟可包含至少ー個以下步驟針對某些細胞表面標記選擇月經幹細胞，或培養來自月經幹細胞的處理後樣本、所選樣本或解凍樣本的月經幹細胞。在一實施例中，處理分離自月經流的月經幹細胞的步驟包含針對至少ー種包含CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 類的細胞標
記選擇月經幹細胞的步驟。所選細胞可藉由培養月經幹細胞來進ー步處理。可接著使所培養的月經幹細胞經受針對至少ー種包含⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的細胞標記選擇月經幹細胞的又一步驟。可使所選月經幹細胞經受培養該等月經幹細胞的又ー步驟。在選擇或培養月經幹細胞的步驟之後的任ー時亥IJ，可使該等月經幹細胞經受製備供超低溫保存或供治療或藥妝用的月經幹細胞的步驟。可接著將已準備超低溫保存的月經幹細胞超低溫保存且稍後解凍以供使用。在另ー實施例中，處理自月經流分離的月經幹細胞的步驟包含培養月經幹細胞。可接著使所培養的月經幹細胞經受針對某些細胞表面標記選擇月經幹細胞的步驟。可接著使所選月經幹細胞經受培養該等月經幹細胞的又ー步驟。可接著使進ー步培養的月經幹細胞經受針對細胞標記選擇月經幹細胞的另ー步驟。在選擇或培養月經幹細胞的步驟之後的任ー時刻，可使該等月經幹細胞經受製備供超低溫保存或供治療或藥妝用的月經幹細胞的步驟。可接著將已準備超低溫保存的月經幹細胞超低溫保存且稍後解凍以供使用。在又一實施例中，處理自月經流分離的月經幹細胞的步驟包含超低溫保存月經幹細胞的步驟。在另ー實施例中，處理月經幹細胞的步驟包含製備包含月經幹細胞及維持月經幹細胞的生存力的細胞培養基的組合物的又一步驟。在又一實施例中，處理月經幹細胞的步驟包含製備包含月經幹細胞及藥妝製劑的組合物的又一步驟。在又一實施例中，可將經超低溫保存的月經幹細胞解凍以為進一步處理作準備，該進ー步處理包含培養或選擇月經幹細胞的至少ー個步驟。或者，可將經超低溫保存的月經幹細胞解凍以為治療或藥妝用途作準備。
本發明亦提供自月經流收集月經幹細胞的製程。在一實施例中，該製程包含在月經周期期間取得月經流，將該月經流輸送至處理設施中，將月經幹細胞自月經流分離成細胞製劑，及處理月經幹細胞的細胞製劑。本發明亦提供自月經流收集月經幹細胞的系統。在一實施例中，該系統包含一月經幹細胞分離器，其中月經幹細胞分離器將月經幹細胞自月經流分離；一月經幹細胞收集器，其中該月經幹細胞收集器收集月經幹細胞；及一月經幹細胞處理器，其中該月經幹細胞處理器製備供治療用或供超低溫保存的月經幹細胞。本發明提供超低溫保存月經幹細胞的方法。在一實施例中，該方法包含以下步驟自月經期間所收集的月經流分離月經幹細胞，收集自月經流分離的月經幹細胞，及超低溫保存自月經流分離的月經幹細胞。包括自月經流分離月經幹細胞的步驟的超低溫保存月經幹細胞的方法包含由離心、密度梯度離心、過濾或沉降的至少ー個步驟處理月經流。分離月經幹細胞的步驟亦可視 情況包含以包含至少ー種抗生素的溶液淨化該等月經幹細胞。該方法可包含在至少ー個超低溫保存或進ー步細胞培養的步驟之前的至少ー個針對細胞標記選擇月經幹細胞的步驟。該方法可包含至少又ー培養所選月經幹細胞的步驟。包括收集自月經流分離的月經幹細胞的步驟的超低溫保存月經幹細胞的方法包含至少ー個培養月經幹細胞的步驟。該方法可包含至少ー個自細胞培養物選擇月經幹細胞的步驟。本發明提供藉由包含以下步驟的製程所獲得的月經幹細胞的群自月經期間所收集的月經流分離月經幹細胞及收集自月經流分離的月經幹細胞。本發明提供富集自月經流所收集的月經幹細胞群的製程。在一實施例中，該製程包含自月經期間所收集的月經流分離月經幹細胞及收集自月經流分離的月經幹細胞的步驟。該製程包含至少ー個針對包含 CD9、CD 10、CD 13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、⑶105、⑶166及HLA I類的群的至少ー個細胞標記選擇月經幹細胞的步驟。該製程可包含至少ー個培養月經幹細胞的步驟。該製程可包含至少ー個選擇月經幹細胞的步驟及至少ー個培養所選月經幹細胞的步驟。分離月經幹細胞的步驟亦可視情況包含以包含至少ー種抗生素的溶液淨化該等月經幹細胞。在替代者中，該製程可包含至少ー個培養月經幹細胞的步驟及至少ー個自細胞培養物選擇月經幹細胞的步驟。本發明提供富集月經幹細胞群的製程。在一實施例中，該製程包含以下步驟自月經流分離月經幹細胞，收集自月經流分離的月經幹細胞及選擇表現與MSC相關的細胞標記的月經幹細胞。本發明提供包含細胞標記中的至少ー者的月經幹細胞群，該等細胞標記包含⑶9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 類。本發明提供包含月經幹細胞的細胞富集群，該等月經幹細胞表現包含⑶9、⑶10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類的細胞標記中的至少一者，且較低表現或不表現包含細胞標記⑶3及HLAII類中的至少ー者的細胞標記。本發明提供包含至少ー個月經幹細胞及超低溫保存劑的組合物。本發明提供包含至少ー個月經幹細胞及細胞培養基的組合物。本發明提供包含至少ー個月經幹細胞及藥妝劑的組合物。
本發明提供包含至少ー個月經幹細胞及維持細胞生存力的保存劑的組合物。本發明提供包含至少ー個月經幹細胞及細胞培養基的組合物，其繫於容器中以為該至少一個月經幹細胞的治療用途作準備。
根據本發明所收集的細胞可在治療、藥妝或再生醫學或其它合適應用中使用。本發明提供以下方法及製程收集包含月經血液、體液、細胞及組織的月經流的至少ー個樣本；藉由將月經流樣本與收集培養基組合來製備供輸送用的月經流；及將該月經流樣本輸送至處理設施中，在此處理月經流樣本以分離、收集及處理供超低溫保存或供治療或藥妝用的MSC。本發明亦提供以產生高產量的活MSC的方式分離、收集及濃縮MSC的方法及製程。
在一實施例中，選擇月經幹細胞的步驟可包括陽性選擇表現與月經幹細胞一起存在的細胞標記中的至少ー者的細胞。在一替代者中，選擇月經幹細胞的步驟可包含藉由移除表現不與月經幹細胞一起存在的細胞標記的不合需要細胞來陰性選擇細胞。陰性選擇可包含選擇表現(例如)CD45或不存在於月經幹細胞上的其它細胞表面標記的細胞。在又一實施例中，選擇月經幹細胞的步驟可包含使用市售耗盡或濃縮套組，諸如來目 btem Cell i'echnologies, Inc.的 RosetteSep、Easybep、Robobep > btemSep 或SpinSep0在又一實施例中，選擇月經幹細胞的步驟可包含使用ALDEFLUOR (Aldagen, Inc.)選擇月經幹細胞以選擇MSC且排除無完整細胞膜的死亡及/或瀕死細胞。ALDEFLUOR 套組可用於選擇對與月經幹細胞一起存在的表面標記呈陽性的ALDHblr細胞、譜系-抗原陰性(LirT)細胞、群落形成細胞、長期培養起始細胞及N0D/SCID再生細胞。在又一實施例中，選擇月經幹細胞的步驟可包含使該等月經幹細胞經受血清脫除歷時約2周至約4周以濃縮表現相關MSC標記的MSC。一旦收集且培養細胞，即應消除造血幹細胞。
圖I為一般說明本發明的總體方法及製程的流程圖；圖2為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的一實施例的流程圖；圖3為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖4為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖5為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖6為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖7為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖8為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖9為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖10為展示收集及超低溫保存月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖11為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的一實施例的流程圖；圖12為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的又ー實施例的流程圖；圖13為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的又ー實施例的流程圖；圖14為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的又ー實施例的流程圖；圖15為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的又ー實施例的流程
圖16為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖17為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖18為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的又ー實施例的流程圖；圖19為展示收集月經幹細胞及製備供治療用的月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖20為展示解凍超低溫保存的月經幹細胞以為治療用途作準備的本發明的ー實施例的流程圖；圖21為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖22為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖23為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖24為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖25為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖26為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖27為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的另ー實施例的流程圖；圖28為展示製備供治療用的經超低溫保存的月經幹細胞的本發明的又一實施例的流程圖；圖29a至圖29j展示處理後樣本及關於如下所述的M2-01的同型的流式細胞儀分析的結果。自M2-01收集約Iml細胞懸浮液形式的處理後樣本且將其置於分析管中以供流式細胞儀分析。結果指示佔TNC群O. 4%的⑶117+細胞的濃度、佔TNC群17. 7%的⑶44+細胞的濃度、佔TNC群3. 6%的⑶166+細胞的濃度、佔TNC群8. 0%的⑶105+細胞的濃度、佔TNC群6. 8%的⑶90+細胞的濃度、佔TNC群O. I %的⑶29+細胞的濃度、佔TNC群O. I %的⑶34+細胞的濃度，及如由7AAD所測定的95. 4%細胞生存力；
圖30a至圖30e展示關於經由本發明的CD117選擇方法所獲得的陽性溶離份中的細胞的流式細胞儀分析的結果。CD117選擇的後，收集約Iml細胞懸浮液且將其置於分析管中以供流式細胞儀分析。結果指示佔TNC群7. 2%的⑶117+細胞的濃度、佔TNC群93. 6%的CD44+細胞的濃度及由7AAD所測定的95. 8%細胞生存力。結果系藉由根據本發明的流式細胞儀分析來運作處理樣本且減去以與IgG抗體的同型一起運作的處理後樣本所獲得的背景計算值來計算；圖31a至圖31cc說明處理後樣本及關於如下所述的M2-02C的同型的流式細胞儀分析的結果。收集約Iml細胞懸浮液形式的處理後樣本且將其置於分析管中以供流式細胞儀分析。結果指示佔TNC群O. 2%的⑶117+細胞的濃度、佔TNC群I. 8%的⑶44+細胞的濃度、佔TNC群O. 1%的⑶166+細胞的濃度、佔TNC群I. I %的⑶105+細胞的濃度、佔TNC群O. 4%的⑶90+細胞的濃度、佔TNC群O. 5%的⑶29+細胞的濃度、佔TNC群O. 0%的⑶34+細胞的濃度，及如由7AAD所測定的99. 5%細胞生存力；圖32a至圖32cc說明關於經由本發明的⑶117選擇方法所獲得的陽性溶離份中 的細胞的流式細胞儀分析的結果。收集約Iml細胞懸浮液形式的陽性溶離份且將其置於分析管中以供流式細胞儀分析。結果指示佔TNC群18. 40%的CDl 17+細胞的濃度、佔TNC群93. 0%的CD44+細胞的濃度、佔TNC群89. 2%的CD166+細胞的濃度、佔TNC群81. 4%的⑶105+細胞的濃度、佔TNC群78. I %的⑶90+細胞的濃度、佔TNC群73. 6%的⑶29+細胞的濃度、佔TNC群O. 1%的⑶34+細胞的濃度及如由7AAD所測定的91. 9%細胞生存力。結果系藉由根據本發明的流式細胞儀分析來運作處理樣本且減去以與IgG抗體的同型一起運作的處理後樣本所獲得的背景計算值來計算；圖33a至圖33r說明在如本文進ー步詳述的培養、超低溫保存、解凍及解凍後繼代中的若干繼代後關於M2-03E的細胞的流式細胞儀分析的結果。如藉此所示，流式細胞儀結果顯示該等細胞表現 MHC I、CD44、CD29、CD90、SSEA-4、CD105、CD49f、CD9、CD166、CD166 及CXCR4且較低表現或不表現⑶133、MHC II、⑶34、⑶45及⑶38 ；圖34a至圖34f展示月經幹細胞M2-03E對如圖34a所示的CDl 17及如圖34c所示的SSEA-4以及如圖34e所示的⑶117與SSEA-4共定位呈陽性染色。陰性對照對如圖34b所示的CDl 17、如圖34d所示的SSEA-4或如圖34f所示的CDl 17與SSEA-4共定位不呈陽性染色。圖35a及圖35b展示月經幹細胞M2-03E快速生長且表現多能性標記。圖35a展示月經幹細胞M2-03E以約24小時至約36小時的倍增時間在超低溫保存前培養中快速生長。此快速生長允許以八次倍增自50，000個細胞擴增至48，000, 000個細胞。如由RT-PCR所測定，圖35b展示月經幹細胞M2-03E以於培養中至多約12個繼代的RNA水平表現0ct_4，L，梯帶；水；ESC，胚胎幹細胞；P12，第12代；圖36a至圖36g展示月經幹細胞M2-03E分化成神經組織。月經幹細胞經神經誘導以分化成表現如圖36a至圖36c所示的04及GalC的少突神經膠質細胞。月經幹細胞亦表現如圖36d所示的Map-2、如圖36e所示的Tub_3及如圖36f所示的波形蛋白(Vimentin)。分化細胞的RT-PCR結果展示通常對於神經細胞的RNA水平表現，RT-PCR L,梯帶；W，水；B，腦對照；神經誘導的月經幹細胞；圖37a至圖37d展示月經幹細胞M2-03E分化成心臟組織。月經幹細胞經8 μ M Aza處理且經圖37b的免疫細胞化學所示展現肌動蛋白的強表現。如圖37a所示的肌鈣蛋白表現及如圖37c所示的連接蛋白43 (connexin 43)表現系藉由用800 μ M SNAP處理細胞來刺激。RT-PCR確認如圖37d所示的心臟分化，RT-PCR :L，梯帶；W，水；H，心臟對照；心臟誘導；圖38a至圖38f展示月經幹細胞M2-03E分化成中胚層型組織。與圖38a所示的對照相比，如圖38b所示誘導經針對脂肪空泡的油紅O染色而指示分化成脂肪組織的細胞。與如圖38c所示的對照相比，當如圖38d所示誘導時細胞經艾爾遜藍(alcian blue)染色而指示分化成成軟骨組織。與圖38e相比，如圖38f所示細胞經茜素紅S染色而指示鈣沈積物存在；圖39為展示在解凍後培養的第12代，M2-03E的月經幹細胞表現端粒酶活性的圖；hESC，人類胚胎幹細胞；MEF，小鼠胚胎纖維母細胞；MenSCs P12 ；圖40為展示以分成3組且在預設條件下收集的161個樣本進行 研究的結果的圖，其係為了分析與本發明的月經幹細胞收集方法相關的變量。進行該研究以測定使用有及無抗生素的收集培養基及在有及無冰的情況下運送月經流樣本的影響。圖40展示總成核細胞計數分析平均在對於三組所收集的所有樣本中收集的每個樣本為約7，900，000個細胞；圖41為展示圖40所涉及的研究結果的圖。圖41展示處理後樣本的細胞生存力平均在對於三組所收集的所有樣本中為約74%的生存力；圖42為展示圖40所涉及的研究結果的圖。圖42展示對於三組所收集的所有樣本的平均溫度平均為約15°C ；圖43為展示圖40所涉及的研究結果的圖。圖43展示對於三組所收集的所有樣本的平均樣本體積平均為約Ilml，其包含約Iml月經流樣本及約IOml收集培養基 '及圖44為展示圖40所涉及的研究結果的圖。圖44展示自收集至處理設施處接收所計算的平均樣本齡期處於約小於5小時至大於140小時的範圍內。
具體實施例方式本發明將藉由考慮本發明的實施例的以下詳細描述連同如附隨描述及圖式中所述的特定例示性實施例而便於理解。應了解，本發明的圖式及描述已經簡化以出於清楚理解本發明的目的來說明相關要素。現參看圖I至圖44，本發明提供與自月經期間排出的血液、細胞、體液及組織(本掲示案中於本文中亦稱作"月經流")分離且根據本發明的方法、製程及系統收集的月經幹細胞的取得相關的方法、製程、系統及組合物。如貫穿本發明的掲示內容所用的短語"子宮內膜/月經細胞"、"子宮內膜/月經幹細胞"、"月經幹細胞"及"月經細胞"及術i吾"MSC"及"細胞"一般關於表現包括(但不限於)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的細胞標記或細胞內標記中的至少ー者而表現較低量或不表現CD3及MHC II的自月經流收集的任意一或多個細胞而通篇使用。儘管術語"細胞"以單數含義使用，但其亦可以複數含義使用以指代本發明的ー個以上細胞。儘管細胞的上述特徵系作為例示性特徵提供，但月經幹細胞的其它細胞表面特徵繫於本文中貫穿本發明的掲示內容提供(包括(但不限幹)於此任何表及圖式上所提供的特徵)且提供關於本發明的月經幹細胞的進一歩掲示內容。現尤其參看圖36至圖38，應了解，一些幹細胞性質上具有多能性，此系歸因於該等細胞分化成許多獨特細胞類型的能力。多能性細胞具有經歷分化成許多不同哺乳動物細胞類型的能力。詳言之，如圖36至圖38中所說明，本發明的MSC亦表現分化成各種獨特細胞譜系的能力，該等細胞譜系系諸如神經譜系、心臟譜系、成軟骨譜系、成脂譜系及成骨譜系O相信本發明的MSC可能夠分化成體內260個體細胞中的任一者。舉例而言，細胞可至少能夠分化成肝細胞、胰腺細胞、肌源細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神經細胞、角質細胞及心肌細胞。如共培養系統中所見，細胞亦可具有當與諸如肝細胞、胰腺細胞、肌源細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神經細胞、角質細胞及心肌細胞的其它預處理細胞一起培養時分化的能力。自分化獲得的細胞及自共培養獲得的細胞亦可具有用於置換或再生療法、其它治療應用、藥妝、器官排斥療法及其它應用的處理中的潛力。
詳言之，MSC在治療、藥妝及其它應用中的潛在用途出於許多原因是有益的，這是由於MSC:(a)易於自其它方面視為生物廢物的無爭議來源獲得，(b)在無需醫學培訓的情況下由供體有效收集，(C)高度増殖，(d)能分化成所要細胞類型，(e)能自體應用，⑴能同種異體應用，(g)能提供可用作多個療法的潛在來源的單細胞株，(h)能與其它健康細胞潛在地共同培養，(i)能用作專用再生保健解決方案的來源，及(j)能經十年在規則周期上即期及多次收集。自其它來源獲得的幹細胞的用途已在用於以下病況的各種形式的再生醫學中使用糖尿病、心肌梗塞、瓣膜/動脈置換、帕金森氏病(Parkinson' S)、阿茲海默氏病(Alzheimer' s)、MS、中風療法、胰島素再生、抗老化血清、燒傷/創傷癒合繃帶、痤瘡管理、白癲風、假髮、牙齒再生、假乳/豐乳、肝硬化、陰莖増大、運動療法、貧血、白血病、淋巴瘤、肺纖維化、錸刀型細胞貧血、骨骼置換、骨質疏鬆症、脊柱側彎、類風溼性關節炎、脊髄損傷、膝/髖/肘置換、激素置換療法、PMS/抑鬱管理、自閉症、不孕療法、視カ再生及晶狀體置換。一般而言及在一實施例中，本發明提供自月經流獲得及收集MSC的方法。在另ー實施例中，本發明提供自月經流收集MSC的系統。在另ー實施例中，本發明提供超低溫保存自月經流所收集的MSC的方法。在其它實施例中，包含MSC群的產物可藉由自月經流獲得及分離MSC的各種製程來收集。在其它實施例中，本發明提供MSC的富集群及富集自月經流獲得的MSC群的製程。在其它實施例中，本發明提供包含MSC及其它試劑的各種組合物，諸如，包含MSC及超低溫保存劑的組合物、包含MSC及至少ー種藥妝劑的組合物、及包含MSC及保存劑的組合物。本發明的這些各個實施例在下文中進ー步詳述。本發明的總體方法及製程的例示性圖解於圖I中說明。一般而言，各個步驟可用於取得月經流且處理該月經流以獲得可經進ー步處理用於特定用途的MSC。詳言之，可將MSC超低溫保存，經由細胞選擇或培養的單一或多個步驟富集，及/或準備供治療或藥妝使用。貫穿本發明的實施，可藉由諸如表徵所收集的MSC的流式細胞儀及鑑別樣本的任何可能汙染的微生物分析的方法及製程對MSC及周圍環境進行質量控制分析。圖I所描繪的本發明的各個實施例系在圖2至圖28中以及本發明的工作實例的書面描述中進一歩詳述。現參看圖2，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖2，可以收集製程來收集月經流且接著將其轉移至處理設施中，在此可處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可將MSC進ー步處理且與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖3，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖3，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離且收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可由表現某些細胞標記的所選MSC來進ー步富集或濃縮MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可將經選擇及甚至未經選擇的MSC處理且與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖4，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖4，可將月經流收
集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可由表現某些細胞標記的所選MSC來進ー步富集或濃縮MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以使該等MSC擴增。可接著將經培養的MSC與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖5，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖5，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可由表現某些細胞標記的所選MSC來進ー步富集或收集MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以使該等MSC擴增。可接著針對特異性細胞表面標記來進ー步選擇經培養的MSC以富集或收集特異性MSC。可將經選擇及甚至未經選擇的MSC與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖6，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖6，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可由表現某些細胞標記的所選MSC來進ー步富集或收集MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以使該等MSC擴增。可接著針對特異性細胞表面標記來進ー步選擇經培養的MSC以富集或收集特異性MSC。可接著進ー步培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著將MSC與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖7，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖7，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可將經培養的MSC處理且與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖8，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖8，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮經培養的MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著將經選擇及甚至未經選擇的MSC分別與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖9，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖9，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮經培養的MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可 接著培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以使該等MSC擴增。可將MSC的經選擇及甚至未經選擇的培養物分別與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供使用。現參看圖10，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖10，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮經培養的MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以使該等MSC擴增。可針對特異性細胞標記來進ー步選擇MSC的經選擇及未經選擇的培養物。可接著將經選擇及未經選擇的細胞分別與超低溫保存劑組合以為超低溫保存作準備且接著超低溫保存。可接著將經超低溫保存的MSC稍後解凍以供治療用。貫穿本發明的實施例的所有描述，短語"治療用途"包括使用MSC用於任何類型的幹細胞療法且亦包括藥妝用途。現參看圖11，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖11，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可將MSC處理且與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖12，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖12，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。培養後，可將MSC處理且與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖13，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖13，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著將經選擇及未經選擇的MSC分別與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖14，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖14，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著分別培養經選擇及未經選擇的MSC以擴增細胞數目。可接著將經培養的MSC分別與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖15，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖15，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可培養MSC以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞標記來選擇經培 養的MSC。可接著分別培養經選擇及未經選擇的MSC以擴增細胞數目。可接著針對某些細胞表面標記再次選擇經分別培養的MSC。可接著將經選擇及未經選擇的MSC分別與維持細胞生存カ的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖16，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖16，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著將經選擇及甚至未經選擇的MSC分別與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖17，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖17，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著分別培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著將經培養的MSC與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖18，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖18，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著分別培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著針對特異性細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著將經選擇及未經選擇的MSC與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。現參看圖19，本發明提供超低溫保存MSC的方法及製程。根據圖19，可將月經流收集且轉移至處理設施中，在此可接著處理該月經流以分離及收集MSC。自月經流分離及收集MSC可經由用於使所收集的MSC數目最大化的離心、密度梯度離心、過濾或沉降方法來進行。一旦收集，即可藉由選擇表現某些細胞標記的MSC來富集或濃縮MSC，該等細胞標記系諸如與MSC相關的細胞標記中的任意一或多者。可接著分別培養經選擇及甚至未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著針對特異性細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著進ー步培養經選擇及未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著將經培養的MSC與維持細胞生存力的細胞培養基組合以為治療用途作準備。本發明的其它實施例繫於圖20至圖28中提供且描述。該等其它實施例包括在根據本發明的先前所述實施例中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存MSC的後處理MSC。現參看圖20，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖20，將經超低溫保存的MSC解凍且接著與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖21，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖21， 將經超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細胞表面標記來選擇。可接著將經選擇及未經選擇的細胞與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖22，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖22，將經超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細胞表面標記來選擇。可接著培養經選擇及未經選擇的細胞以擴增MSC數目。可接著將經培養的MSC與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖23，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖23，將經超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細胞表面標記來選擇。可接著培養經選擇及未經選擇的細胞以擴增MSC數目。可接著針對某些MSC細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著將經選擇及未經選擇的細胞與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖24，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖24，可將經超低溫保存的MSC解凍且接著針對某些MSC細胞表面標記來選擇。可接著培養經選擇及未經選擇的細胞以擴增MSC數目。可接著針對某些MSC細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著培養經選擇及未經選擇的細胞以擴增MSC數目。可接著將經培養的MSC與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖25，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖25，可將經超低溫保存的MSC解凍且接著培養以擴增MSC數目。可接著將經培養的MSC與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖26，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖26，可將經超低溫保存的MSC解凍且接著培養以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著將經選擇及未經選擇的MSC分別與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖27，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖27，可將經超低溫保存的MSC解凍且接著培養以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著分別培養經選擇及未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著將經培養的MSC與細胞培養基組合以供治療用。現參看圖28，本發明提供製備根據先前所述方法或製程中的任一者或任何其它細胞收集及/或超低溫保存方法或製程收集且超低溫保存的MSC的方法及製程。根據圖28，可將經超低溫保存的MSC解凍且接著培養以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞標記來選擇經培養的MSC。可接著分別培養經選擇及未經選擇的MSC以擴增MSC數目。可接著針對某些細胞表面標記來選擇經培養的MSC。可接著將經選擇及未經選擇的MSC與細胞培養基組合以供治療用。如圖I至圖28中所涉及的本發明的上述實施例系如下文所提供及描述而進一歩詳述。根據本發明，包含月經幹細胞及諸如超低溫保存劑、細胞培養基或藥妝劑的其它試劑 的組合物亦於下文提供且描述。收集及輸送月經幹細胞根據本發明的方法及製程，月經幹細胞系藉由首先在月經期間使用具備收集套組的收集裝置來收集包括月經幹細胞的月經流而獲得。月經流可在月經的任何時間收集，包括(但不限幹)月經時期的重度日、中度日或輕度日。視情況，可自供體收集外周血液的樣本以供比較傳染病分析用。可出於收集用於處理出月經幹細胞的月經流的至少ー個樣本的目的向供體提供收集套組。舉例而言，可提供月經幹細胞收集套組以收集、處理及封裝月經流的至少ー個樣本以供運送。該收集套組可包含輸送容器，諸如盒、袋或適合於(視情況)於低溫下運送月經流的至少ー個樣本的其它容器(例如Nanocool、Styrofoam或隔熱容器)；收集裝置，諸如Mooncup、Divacup、Instead杯或適合於收集月經流的至少ー個樣本的任何其它衛生收集裝置；至少ー個尺寸合適的無菌收集容器，諸如50ml管或其它合適尺寸的管；用於懸浮至少ー個月經流樣本的收集培養基；至少ー個塑料拉鏈袋；至少一條吸收毛巾；至少ー個生物危害品袋；無菌4X4紗布；用於包覆至少ー個收集容器的封ロ膜；及消毒清潔小毛巾或抹布。在收集至少ー個包含月經幹細胞的月經流樣本之前，可對供體身份指定ー寄存編號，該編號可在本發明的實施中使用以鑑別由該供體所收集的任何樣本。用於收集套組的收集培養基可包含DPBS與肝素的混合物。具有必要pH值的合適的相當組織培養基可替代DPBS使用。舉例而言，肝素可以約1000単位/毫升的濃度提供。在一實施例中，收集培養基可包含具有200単位的處於約1000単位/毫升濃度下的肝素的約10毫升DPBS。收集套組的培養基可藉由將約0. 20毫升肝素以1000単位/毫升的濃度添加至約10毫升DPBS中來製備。可於收集樣本前將此體積置於無菌收集容器中。在另ー實施例中，收集培養基可包含杜氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbecco' s PhosphateBuffer Saline,DPBS) (Mediatech或合適替代培養基的其它製造商)，其不含鈣、鎂或酚紅；抗生素，其可包括盤尼西林(Penicillin)(約100單位/毫升)、鏈黴素(Streptomyocin)(約100微克/毫升)、兩性黴素B (Amphotericin B)及/或其它合適的抗生素；及處於每毫升DPBS培養基或合適抗凝劑約10単位至約20単位的範圍內的無保存劑肝素，該抗凝劑系諸如A⑶、CPD、CPDA或CPDA-1。收集培養基可使用無菌技術來製備。
可用消毒劑清潔陰道區域以為收集至少ー個包含月經幹細胞的月經流樣本作準備。在一實施例中，消毒劑可提供於小毛巾上。供體接著可根據收集裝置的使用說明書將先前已用肥皂及水清潔的收集裝置置於陰道內。須在供體的月經期間將該收集裝置置於陰道內以收集月經流的至少ー個樣本。在一實施例中，可在月經的重度日期間將收集裝置置於陰道內。在一替代實施例中，可在月經的中度日或輕度日期間將收集裝置置於陰道內。應將收集裝置在陰道內維持一定時間以收集月經流的至少ー個樣本。舉例而言，可將收集裝置在陰道內維持約3小時或更短時間。收集樣本的額外時間可為必需的。在陰道內維持約3小時後，可接著移除含有月經流樣本的收集裝置。月經流樣本可包含約O. Iml至約5ml體積的月經血液、組織、 體液及月經幹細胞。可接著將月經流樣本轉移至無菌收集管中的收集培養基中。月經流樣本向無菌容器中的轉移可藉由將月經流樣本自收集裝置傾入容器中的培養基中來進行以為將月經流樣本運送至處理設施作準備。該容器應加以封蓋或以其它方式密封以防止月經流樣本與收集培養基的溶液洩漏。密封件亦應防止空氣進入收集容器內部。在一實施例中，可將具有相應密閉蓋的容器用封ロ膜包覆且封裝以供輸送。可將ー個以上月經流樣本收集，轉移至容器且準備運送至處理設施。若收集ー個以上月經流樣本，則可將於收集管中的收集培養基中的各所收集樣本維持於冰箱中直至收集最後ー個樣本為止。一旦收集所有月經流樣本，即可接著封裝該等樣本以供運送。在一實施例中，月經幹細胞可由在子宮內膜或子宮頸區域中所進行的帕帕尼科拉烏試驗(Papanicolaou test)或任何活組織檢查來製備。取得後在運送及於處理設施處處理的過程中，可將包含月經幹細胞的月經流的至少ー個樣本維持於低溫下。可將容納月經流與培養基的溶液的任何密封容器封裝供運送以在運送至處理設施期間將各樣本維持於約rc至約25°C的範圍內的溫度下。在一實施例中，在運送至處理設施期間可將各樣本維持於約1°C至約15°C的溫度範圍內。在另ー實施例中，在取得後及在整個運送中，可將所收集的月經流樣本維持於室溫或周圍空氣溫度下。含有包含月經幹細胞及收集培養基的月經流樣本的各收集容器可藉由將該收集容器置於以袋子拉鏈功能密封的大塑料拉鏈袋中而封裝以供輸送。可將封裝有殺菌容器的大塑膠袋置於第二個大拉鏈袋中且亦密封。可將兩條吸收毛巾置於輸送容器的底部。若正使用Nanocool裝置，則不需要額外冰。泡沫磚或其它裝置可用於冷卻載運月經流樣本的輸送容器。可將充滿溼冰的袋置於吸收毛巾之上。可將密封袋中的殺菌容器置於冰袋之下。可將其餘吸收毛巾置於冰袋之上。將輸送容器關閉，緊固且密封。其它合適的容器可用於容器的輸送，只要該容器在運送期間將包含月經幹細胞的月經流樣本維持於約l°c與約25°C之間的溫度下即可。舉例而言，其它合適的容器包括(但不限於)由Therapak Corporation出售的冷卻及隔熱運送容器、任何類型的隔熱容器或經設計用於運送的苯こ烯泡沫盒(Styrofoam box)。在運送的至少兩個小時內可接觸承運方以獲取含有於收集培養基中的至少ー個月經流樣本的輸送容器。承運方可為AirNet或適合於輸送生物材料的其它較佳快遞或諸如FedEx或UPS的其它運送公司。輸送容器應在收集後約5個小時至約125個小時內到達處理設施。在一實施例中，輸送容器可在收集後約24個小時至約72個小時的間到達處理設施。在另一實施例中，輸送容器可在約24個小時至約48個小時的間到達處理設施。輸送容器不應儲存於熱環境中。
處理設施接收輸送容器且為各供體樣本的識別信息編目錄以在處理包含月經幹細胞的月經流樣本期間使用。適當障壁及個人保護措施可在處理設施處處理包含月經幹細胞的月經流的任何樣本期間使用。一旦在處理設施處接收輸送容器，即可將具有月經流樣本的各容器自輸送容器移除，置於冰盤中(或冰箱中)的冰上，且轉移至生物安全櫃(BSC)中的清潔室中以自月經流分離月經幹細胞、收集月經幹細胞且稍後處理以供使用及/或超低溫保存。處理設施處的月經流處理由處理設施接收月經流樣本且記錄至處理設施系統中。一旦在處理設施處接收月經流樣本，即可在整個處理期間將其維持於約1°C至約25°C的溫度下。可在BSC及離心機中使用無菌技術處理各月經流樣本。當在BSC中工作時以70% IPA頻繁擦拭手套。在處理月經流樣本之前於無菌條件下置放BSC中處理所需的所有其它材料，包括(但不限幹)紅色頂端管、針、注射器、紅色頂端管的託架、BacT瓶、酒精墊、50ml錐形管、50ml錐形管的託架及移液器。在已對BSC消毒後設置所有無菌供應品。可將製程所使用的所有無菌供應品 置於盤或無菌鋪巾中。無菌供應品可包括針、注射器及置於BSC中的其它材料，該等材料包括紅色頂端管、紅色頂端管的託架、血液培養瓶、酒精墊、50ml錐形收集管、50ml錐形收集管的託架、移液管及冰盤。基於製造商的說明書，將所有培養基及試劑較佳置於冰上且儲存於約1°C至約15°C之間下，但亦可為約2°C至約8°C。緩衝生理食鹽水培養基(DPBS)或合適的替代品可在月經幹細胞分離過程期間使用。DPBS培養基包含具有約5ml至約IOml肝素(肝素鈉1，000USP單位/毫升-AmericanPharmaceutical Partners)的約 100 毫升 DPBS。在處理設施處接收月經流樣本的第一天，可對包含月經幹細胞的各月經流試樣進行第I階段處理。首先，可對容納月經流樣本的收集容器外部進行消毒，接著離心。可使收集容器中的月經流樣本經受離心、密度梯度離心、過濾及/或澱粉沉降。離心在一實施例中，在約4°C下月經流樣本的離心可以約2000rpm進行歷時約7分鐘。離心後，可接著自離心機移除月經流樣本的各試樣。可對收集容器外部消毒，接著將收集管轉移至BSC中以抽吸上清液。可使離心塊再懸浮於約IOml DPBS或相當替代品中，且接著對其進行第2階段處理。亦可根據如本文所述的可選淨化步驟處理離心塊。密度梯度離心在另ー實施例中，月經流樣本的離心可使用密度梯度液進行。舉例而言，密度梯度液可為淋巴細胞分離培養基(約20°C下密度I. 077-1. 083g/ml-Cellgro)或為可具有較高或較低密度的其它合適梯度液。使含有月經流樣本、收集培養基及密度梯度液的錐形收集管經受離心。舉例而言，可在約15°C至約30°C之間、較佳約20°C下將錐形收集管以約14，OOOrpm離心約30分鐘而無需應用制動器以減緩離心機。作為密度梯度離心的結果，白血球層形成於上清液與密度梯度液的界面處。該白血球層含有包含自月經流樣本獲得的月經幹細胞的所要細胞群。將白血球層上方的上清液抽吸至白血球層上方約5ml且摒棄。藉由使白血球層緩緩渦旋且在白血球層處用IOml移液管刮拭錐形管側面來移除白血球層。應儘可能與白血球層一起收集最小體積的密度梯度液。可摒棄剩餘密度梯度液及含有紅血球的離心塊。可在室溫下以試劑及細胞進行密度梯度分離。若將細胞冷卻，則分離不會提供最佳細胞回收。可將所收集的白血球層置於50ml錐形收集管中且用洗滌溶液使體積達到約30ml。可接著在約15°C至約30°C的間下使細胞懸浮液以約2000rpm離心歷時約7分鐘。離心後，可接著自離心機移除試樣且可對收集容器外部消毒，接著將收集管轉移至BSC中以抽吸上清液。可使離心塊再懸浮於約IOml DPBS中且接著對其進行第2階段處理。亦可根據如本文所述的可選淨化步驟處理離心塊。過濾在又一實施例中，可在無菌過濾器中使月經流樣本經受過濾。該無菌過濾器可為約40微米、約70微米或約100微米。過濾可包含在約1°C至約30°C之間下使包含月經幹細胞的月經流樣本以約2000rpm離心約7分鐘。離心後，可接著自離心機移除試樣且可對收集容器外部消毒，接著將收集管轉移 至BSC中以抽吸上清液。可使離心塊再懸浮於約IOml DPBS中且接著對其進行第2階段處理。亦可根據本文所述的可選淨化步驟處理離心塊。澱粉沉降在又一實施例中，可藉由澱粉沉降來處理月經流樣本。在一實施例中，羥こ基澱粉可以I比5的比率使用，亦即，約I毫升澱粉比約5毫升月經流樣本。可根據上述比率混合各月經流樣本。可使混合物經受離心以有助於以約50g沉降約6分鐘。亦可在有或無上述離心步驟的情況下使混合物沉降歷時約30分鐘或至多約兩小吋。沉降後，移除包含月經幹細胞的白血球層且使其經受離心以濃縮該等月經幹細胞。離心包含在約1°C至約30°C之間下使懸浮於DPBS中的月經幹細胞以約2000rpm離心約7分鐘。離心後，可接著自離心機移除試樣且對收集容器外部消毒，接著將收集管轉移至BSC中以抽吸上清液。可使離心塊再懸浮於約IOml DPBS中且接著對其進行第2階段處理。亦可根據本文所述的可選淨化步驟處理離心塊。淨化可使如根據離心、密度梯度離心、過濾或澱粉沉降之上述步驟中的任一者所收集的月經幹細胞的樣本經歷可選淨化過程。在首先計算樣本的總體積後可移除離心塊周圍的過量流體。可使離心塊再懸浮於約5ml浄化培養基中。浄化培養基可用於淨化月經流樣本。浄化培養基包含於合適培養基中的至少ー種抗生素。作為非限制性實例，抗生素可包含萬古黴素(Vancomycin)、凱福隆(Claforan)、阿米卡星(Amikacin)、慶大黴素(Gentamycin)及兩性黴素B中的至少ー者。合適的培養基可包含漢克斯平衡鹽溶液(Hanks Balanced Salt Solution,HBSS)或其它培養基。若以乾式提供，則抗生物可需要復水。在一實施例中，浄化培養基可包含以下濃度的抗生素50yg/ml萬古黴素、250 μ g/ml凱福隆、100 μ g/ml阿米卡星、120 μ g/ml慶大黴素及2. 7 μ g/ml兩性黴素B。抗生素的其它濃度水平可為合適的。舉例而言，浄化培養基可藉由將約IOml HBSS添加至萬古黴素的約Ig小瓶中以獲得約100mg/ml的濃度而製成。將約Iml的100mg/ml濃度的萬古黴素添加至約199mlHBSS中以獲得約500 μ g/ml的濃度。將約Iml的約500 μ g/ml濃度的萬古黴素添加至最終小瓶中用於製備淨化培養基。將約2ml HBSS添加至約500毫克/小瓶的凱福隆中以獲得約250mg/ml的濃度。將約Iml的約250m g/ml凱福隆溶液添加至約99mlHBSS中以獲得約2500 μ g/ml的凱福隆濃度。將約Iml的約2500 μ g/ml濃度的凱福隆添加至浄化培養基的最終小瓶中。將約IOml HBSS添加至阿米卡星的約Ig小瓶中以獲得約100mg/ml的濃度。將約Iml的約100毫克/小瓶濃度的阿米卡星添加至約99mlHBSS中以獲得約1000 μ g/ml。將約Iml阿米卡星添加至最終小瓶中以製備淨化培養基。將約IOml HBSS添加至慶大黴素的約Ig小瓶中以獲得約100mg/ml的濃度。將約Iml的約100mg/ml濃度的慶大黴素添加至約99ml HBSS中以獲得約1000 μ g/ml濃度。將約I. 2ml的約1000 μ g/ml慶大黴素溶液添加至最終小瓶中以製備淨化培養基。將約2ml兩性黴素B添加至約8ml無菌水中以製備約50 μ g/ml濃度的兩性黴素B。約O. 540ml (27 μ g)兩性黴素B系用以製備最終濃度的兩性黴素B。對於抗生素溶液而言，淨化培養基可於50ml無菌管中藉由添加約Iml的500 μ g/ml萬古黴素、約Iml的2500 μ g/ml凱福隆、約Iml的1000 μ g/ml阿米卡星、約I. 2ml的1000 μ g/ml慶大黴素及約O. 540ml (27 μ g)兩性黴素B以構成約4. 74ml培養基來製備。將1000單位/毫升的約O. 200ml肝素添加至抗生素溶液中且將約5. 06ml HBSS添加至抗生素溶液中以形成最終體積IOml的浄化培養基。可將培養基儲存於約2°C至約8°C下直至使 用。可使離心塊再懸浮於約5ml浄化培養基中。若凝塊或其它巨分子存在，則細胞可需要過濾。若再懸浮的細胞因凝塊或出於任何其它原因而需要過濾，則可使用100微米過濾器過濾樣本。對於過濾而言，可使用100微米過濾器或更小尺寸過濾器(視懸浮液中的凝塊尺寸而定)及無菌50ml錐形管過濾懸浮液。一旦懸浮液穿過過濾器，即可使用額外抗生素培養基洗滌該過濾器。為淨化起見可培育淨化培養基中的經過濾或未經過濾的細胞。在一實施例中，於清潔室中在冰箱中將淨化培養基中的經過濾或未經過濾細胞在約2°C至約8°C下培育約20小時至約30小吋。培育期間，可將細胞置於旋轉器上或以每小時約一次翻轉歷時培育的頭5個小吋。淨化過程結束時，接著對包含月經幹細胞的細胞懸浮液進行第2階段處理。在經受或不經受淨化過程的情況下，包含月經幹細胞的細胞懸浮液可根據第2階段處理來處理。第2階段處理包含使DPBS或浄化培養基中的細胞懸浮液經受離心。在一實施例中，在約4°C下細胞懸浮液的離心可以約2000rpm進行歷時約7分鐘。離心之後及轉移至BSC之前，可對容納月經幹細胞的管外部消毒。一旦於BSC中，即可移除上清液，在管底部留下細胞離心塊。可使細胞再懸浮於約10ml DPBS中，混合且在約4°C下以約2000rpm離心約7分鐘。離心後，可將容器浄化，接著轉移至BSC中。月經幹細胞的細菌學分析可在處理中的此時進行。在BSC中，且使用無菌技木，可使用無菌注射器移除包含月經幹細胞的離心塊上方的約5ml上清液。可將約4ml上清液置於厭氧血液培養瓶中且可將約Iml上清液置於好氧血液培養瓶中。該等瓶可經組態以供BacT/Alert系統中使用。可接著根據製造商的說明書使用BacT/Alert系統培育該等瓶。BacT/ALERT血液培養瓶及系統系作為用於實施本發明的合適測試系統的ー實例而提供。可使用其它合適的自動或手動血液培養試樣瓶及系統，只要其依照21C. F. R.部分610. 12或經驗證效能與此CFR部分類似即可。可自離心塊上方移除剩餘上清液。使包含細胞的離心塊再懸浮於DPBS中達到約5. Iml且混合。可將約ΙΟΟμ I細胞等分至管中以供處理後測試以獲得細胞計數及生存力。可使用自動或手動血球計進行細胞計數。可使用錐蟲藍或其它方法進行細胞生存力分析。懸浮於DPBS中的剰餘細胞可準備超低溫保存、細胞培養、細胞選擇或治療或藥妝使用。超低溫保存對於超低溫保存而言，可將懸浮於DPBS中的剰餘細胞置於冰上歷時至少約15分鐘以為超低溫保存作準備。該準備可包含將超低溫保存培養基添加至月經幹細胞中且接著利用控速冷凍器或其它合適的冷凍器系統(急降冷凍(dump-freeze)監控或冷凍容器(Nalgene))對混合物進行若干降溫步驟以使該等月經幹細胞的溫度降至約_90°C的最終溫度。合適的控速冷凍器包括(但不限於)Cryomed Thermo Forma控速冷凍器 7454 (Thermo Electron, Corp. )、Planar 控速冷凍器 Kryo 10/16 (TS Scientific) >Gordinier、Bio-Cool-FTS 系統及 Asymptote EF600、BIOSTORCBS 2100 系列。
可製備包含培養基及DMSO的超低溫保存培養基。可將約3ml DPBS添加至諸如50ml錐形管的容器中。可將約Iml人類血清白蛋白(HSA)添加至約3ml DPBS中且接著在冰上冷卻約10分鐘。將約Iml經冷卻的99% DMSO添加至HSA及DPBS中以製備最終超低溫保存培養基。可接著將超低溫保存培養基及細胞樣本置於冰上歷時約15分鐘，隨後將該超低溫保存培養基添加至該細胞樣本中。分批處理可用於將超低溫保存培養基等分至細胞樣本中。舉例而言，可將約ΙΟΟμ I細胞懸浮液的單一等分試樣與約3ml DPBSUml HSA及約Iml的99% DMSO組合。可將約200 μ I細胞懸浮液的約2份等分試樣與約6ml DPBS、2mlHSA及約2ml的99% DMSO組合。可將細胞樣本的約5份等分試樣與約15ml DPBS、約5ml HSA及約5ml的99% DMSO組合。可將細胞樣本的約10份等分試樣與約30ml DPBS、約IOmlHSA 及約 IOml 的 99% DMSO 組合。在一替代實施例中，可使用其它超低溫保存培養基。舉例而言，具有超低溫保存劑的超低溫保存培養基可用於維持解凍後高細胞生存力成果，諸如CryoStor CSlO或CS5 (Biolife)、補充有丙ニ醇及蔗糖的胚胎超低溫保存培養基(Vitrolife)、或SAGE培養基(Cooper Surgical)。甘油可與諸如DMSO的其它超低溫保存劑一起使用，或可以於具有合適蛋白質的培養基中約10%的濃度單獨使用。可將超低溫保存培養基添加至細胞樣本中。可將超低溫保存培養基逐滴添加至懸浮於DPBS中的月經幹細胞中直至所懸浮的月經幹細胞與超低溫保存培養基的總混合物的體積達到超低溫保存細胞混合物的最終所要體積為止。可將最終超低溫保存細胞培養基轉移至2X5ml條形碼冷凍四級瓶(cryoquat)中，其中Q C樣本儲存於5ml小瓶的蓋中。使用移液器移除樣本的約200 μ I等分試樣且將其等分至Q C蓋中。已填充蓋後，將剩餘4.8ml試樣添加至5ml小瓶中。應將樣本送至進行傳染病及其它分析。應將冷凍小瓶置於CRY0MED冷凍器中且對其進行控速降溫至處於或低於約_85°C的溫度。應將經超低溫保存的試樣轉移至貯倉中以儲存於-150°C或更低溫度下的液氮蒸氣中。應對對傳染病測試呈陽性的任何樣本進行檢疫。可將對傳染病測試呈陰性的任何樣本轉移至不同永久儲存倉。可在控速冷凍器中程序化以下降溫步驟，首先降低超低溫保存劑與月經幹細胞的混合物。可使與超低溫保存劑組合的月經幹細胞經受控速降溫以為最終儲存於冷凍器中作準備。控速降溫可經設計以維持細胞生存力。Cryo-Med冷凍器(Thermo Electron Corp.) >液氮缸及攜帯型Cry0-Med冷凍器可用於控速降溫以為最終儲存於冷凍器中作準備。可在冷凍小瓶或冷凍袋中使細胞經受控速降溫以達到約-90°C的溫度。對於在冷凍袋中所收集的月經幹細胞的樣本而言，可使細胞經受以下控速降溫概況在約4 °C下等待，I. (TC /分鐘至-6. (TC (樣本)，25. (TC /分鐘至-50. (TC (腔室)，10. (TC / 分鐘至-14. (TC (腔室)、I. (TC / 分鐘至-45. (TC (腔室)、10. (TC / 分鐘至-90. (TC (腔室)及結束(樣本處於或低於-85. (TC )。對於在冷凍小瓶中所收集的月經幹細胞的樣本而言，可使細胞經受以下控速降溫概況在4. (TC下等待，I. (TC /分鐘至-3. (TC (腔室)，10. (TC /分鐘至-20. (TC (腔室)，I. (TC /分鐘至-40. (TC (腔室)，10. (TC /分鐘至-90. (TC (腔室)及結束。一旦超低溫保存劑與月經幹細胞的混合物處於或低於約_85°C，即將超低溫保存小瓶轉移至低溫儲存單元中且在處於或低於約_135°C的溫度下的液氮蒸氣中儲存，或另外可將小瓶儲存於液氮的液相中。舉例而言，合適的低溫儲存單元包括(但不限幹)LN2冷凍 器 MVE 1830 (Chart Industries)。流式細胞儀分析月經幹細胞的任何所收集樣本可藉由錐蟲藍經由染料排除測試總細胞計數及細胞生存力。亦可分析月經幹細胞的樣本的表現細胞標記的細胞的存在。可藉由使用血球計、流式細胞儀或適合於獲得細胞計數的其它方式(諸如ViCell (Beckman Coulter))的手動計數或適合於對呈現於顯微鏡影像上的細胞進行計數的軟體來量化細胞的處理前樣本、處理後樣本及任何其它樣本的總細胞計數及細胞生存力。可藉由流式細胞儀分析處理前細胞。若紅血球存在，則可藉由將約36ml蒸餾水及約4ml的10溶胞溶液添加至50ml管中來製備IXNH4Cl溶胞溶液(StemKit)。可將每個委託者約ΙΟΟμ I處理前樣本添加至兩個管中以進行分析。一管用於⑶34+/生存力分析且第二管用於異純系對照(isoclinic control) 可將約20 μ I CD45-FITC/CD34-PE添加至各管底部。應將約20 μ I 7-AAD生存力染料添加至管中。可使混合物渦旋且接著在免受光照下於約15°C至約30°C下培育至少20分鐘。可接著將約Iml的IXNH4Cl溶胞溶液添加至各管中且使其渦旋。可將混合物在約15°C至約30°C下培育約20分鐘。可將約100μ LStem-Count螢光球添加至各管中且使其渦旋。接著應將樣本在流式細胞儀上運作以供分析。可藉由流式細胞儀分析處理後細胞。可自StemKit藉由將約36ml蒸餾水及4ml的10溶胞溶液添加至50ml管中來製備IXNH4Cl溶胞溶液。可將每個委託者約50 μ I處理後樣本添加至兩個管中以進行分析。一管用於⑶34+/生存力分析且第二管用於異純系對照。可將約10 μ L 7-AAD生存力染料添加至各管中。可將約10 μ I⑶45-FITC/⑶34-ΡE添加至第一管中。可將約10 μ I⑶45-FITC/CTRL-PE添加至第二管中。可使混合物渦旋且接著在免受光照下於約15°C至約30°C下培育至少20分鐘。可接著將約Iml的IXNH4Cl溶胞溶液添加至各管中且使其渦旋。可將混合物在約15°C至約30°C下培育約20分鐘。可將約100 μ LStem-Count螢光球添加至各管中且使其渦旋。接著應將樣本在流式細胞儀上運作以供分析。月經幹細胞的新鮮樣本及先前經超低溫保存的月經幹細胞的解凍樣本亦可藉由流式細胞儀分析以分析細胞表面標記、細胞生存力及其它細胞特徵。新鮮樣本亦可於細胞溶解後根據以下方案來分析。經超低溫保存的月經幹細胞須根據本文所述的解凍過程來解凍。在細胞樣本須解凍的狀況下，細胞可需要在解凍後或在細胞培養後即刻進行流式細胞儀分析以評估某ー細胞繼代。可將經超低溫保存的樣本在37°C水浴中攪動而不便細胞完全解凍。可將該等細胞轉移至約Iml經冷卻的洗滌培養基中且藉由翻轉來混合。可將樣本以約2000rpm離心約7分鐘。可移除上清液且使細胞懸浮於約ΙΟΟμ I洗滌培養基(25% HSA，DNAse，肝素及HBSSw/Ca+與Mg+)中。可接著將再懸浮的細胞在Bl ood Bank Serofuge中離心約I分鐘。可傾析上清液且使細胞再懸浮於約I. 2ml鞘流中且使其渦旋。可針對許多細胞表面標記來分析鞘流中的細胞。舉例而言且並非限制性地，可將細胞於鞘流中的約100 μ I樣本添加至含有下列試劑(各管中每ー試劑10 μ I或20 μ I體積)的各管中且接著使管渦旋以將如表A中所述的試劑與樣本混合。表A :流式細胞儀負荷示意表
管[FITCPE I ECD Γ PC5
~IgGIgGIiGiiG
2HLA-I CD133 ' HLA-II 7AAD
3CD9CD54 ' CD45CDlO
4CD59CD63 ' CD34CD13
5CD49e CD81 '無CD49f
6CD44CDl17 '無CD38
7CD29CD105 ' CD41CD3
8CD19CD166 '無CD90
9NANOG SSEA3 '無7AAD
10CD14SSEA4 '無7AAD
11無CD56 '無7AAD在室溫(15-30°C )下培育20分鐘。免受光照。若運作含有RBC的新鮮樣本，則添加500 μ I溶胞溶液且在室溫下再培育10分鐘且免受光照。若運作密度梯度液或經解凍樣本，則不溶解。若不溶解樣本，則在培育20分鐘後用Iml洗滌培養基洗滌。離心I分鐘且接著傾析上清液。若溶解樣本，則將樣本離心I分鐘且傾析溶胞液。添加Iml洗滌培養基，渦旋，再次離心且接著再次傾析。將500 μ L鞘流添加至各管中，渦旋且在FC500流式細胞儀上運作。
在細胞標記分析之前，可對新鮮細胞樣本或經解凍樣本進行總細胞計數。可使用Kasumi-3對照細胞或其它對照細胞設置許多陽性對照用於流式細胞儀分析。用於細胞計數及細胞生存力分析的材料包括(但不限於)流式細胞儀，Isoflow鞘流，Coulter Clenz 清潔劑，及包括(但不限於)CD45-FITC/CD34-PE、CD45-FITC/ 異純系對照-PE、7-AAD生存力染料、Stem-Count螢光球、10X濃縮氯化銨(NH4Cl)溶胞溶液及22%牛白蛋白溶液的試劑。參見Stem Kit CD34+HPC列舉套組包裝插頁-03版(PNIM2390) ；Beckman Coulter Product Corrective Action, CXP 2. 0&2.I PanelInterruption-3/10/06, PCA-M-D-1013 ；14. 3StemLab，創建號 200706260856,3. 2. I 版。用於流式細胞儀的材料亦包括(但不限於)Isoflow鞘流；Coulter Clenz清潔劑；及使用前約 20-25 °C 的以下試劑CD 117-PE、CD29-FI TC、CD34-ECD、CD44-FI TC、CD45-ECD、CD90-PC5、CD105-PE、CD166-PE、IgG-FITC、IgG-PE、IgG-ECD、IgGl-PC5、HLA-I-FITC、CD133-PE、HLA-IIECD、CD9-FITC、CD54-PE、CD10-PC5、CD59-FITC、CD63-PE、CD13-PC5、CD49e_FITC、CD81-PE、CD49f-PC5、CD44-FITC、CD38-PC5、CD29-FITC、CD105-PE、CD41-ECD、CD3-PC5、CD19-FITC、NAN0G-FITC、SSEA3-PE、SSEA4-PE、CD14-FITC、CD56_PE、7_AAD 生存力染料、10 X 濃縮氯化
銨(NH4Cl)溶胞溶液、洗滌培養基(包含HBSS (具有Ca+與Mg+的漢克斯液)500ml、肝素5ml、人類血清白蛋白25% 50ml、DNASE-l安瓿)、Kasumi-3細胞株-CD117+細胞、定時器及渦旋式混合器。在一替代實施例中，細胞可藉由類似於先前所述的流式細胞儀方法的替代流式細胞儀方法來分析，該等先前所述的流式細胞儀方法包括使用對照及製備月經幹細胞的新鮮樣本、處理前樣本、處理後樣本或經解凍樣本的方法。細胞標記亦可藉由免疫組織化學分析來評估。可在流式細胞儀的前分析各樣本的總細胞計數。若樣本含有> 3. 5X IO6個細胞，則可評估全板。若樣本含有< 3. 5X IO6個細胞，則較少管可為必需的。若流動測試需在需要解凍的冷凍樣本上進行，則在37°C水浴中攪動小瓶而不使細胞完全解凍。可根據對於先前所討論的流式細胞儀分析法的方法來處理經解凍樣本且視細胞數而定根據下表B將其添加至若干管中。表B :流式細胞儀負荷示意表
權利要求
1.一種用於獲得月經幹細胞的方法，該方法包含下列步驟 a)自月經流分離月經幹細胞；及 b)處理該自月經流分離的月經幹細胞。
2.如權利要求I所述的方法，其中自月經流分離月經幹細胞的步驟包含以離心、密度梯度離心、過濾或沉澱中的至少一個方法處理該月經流。
3.如權利要求I所述的方法，其中處理自該月經流分離的月經幹細胞的步驟包含針對至少一種包含下列的細胞標記選擇月經幹細胞⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類。
4.如權利要求3所述的方法，其中處理月經幹細胞的步驟包含培養月經幹細胞的進一步步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其中處理月經幹細胞的步驟包含針對至少一種包含下列的細胞標記選擇月經幹細胞的進一步步驟⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類。
6.如權利要求5所述的方法，其中處理月經幹細胞的步驟包含培養月經幹細胞的進一步步驟。
7.如權利要求I所述的方法，其中處理分離自該月經流的月經幹細胞的步驟包含培養月經幹細胞。
8.如權利要求7所述的方法，其中處理該月經幹細胞的步驟包含選擇月經幹細胞的進一步步驟。
9.如權利要求8所述的方法，其中處理月經幹細胞的步驟包含培養月經幹細胞的進一步步驟。
10.如權利要求9所述的方法，其中處理月經幹細胞的步驟包含針對細胞標記選擇月經幹細胞的進一步步驟。
11.如權利要求I所述的方法，其中該方法包含超低溫保存月經幹細胞的進一步步驟。
12.如權利要求11所述的方法，其中該方法包含解凍經超低溫保存的月經幹細胞及處理經解凍的月經幹細胞的進一步步驟。
13.如權利要求I所述的方法，其中該方法包含製備包含月經幹細胞及維持月經幹細胞存活的細胞培養基的治療組合物的進一步步驟。
14.如權利要求I所述的方法，其中該方法包含製備包含月經幹細胞和藥妝製劑的藥妝組合物的進一步步驟。
15.一種自月經流收集月經幹細胞的方法，該方法包含 a)在一月經周期期間取得月經流； b)將該月經流輸送至一處理設施； c)將月經幹細胞自月經流分離而成細胞製劑'及 d)處理該月經幹細胞的細胞製劑。
16.一種自月經流收集月經幹細胞的系統，該系統包含 a)一月經幹細胞分離器，其中月經幹細胞分離器將月經幹細胞自月經流分離； b)一月經幹細胞收集器，其中該月經幹細胞收集器收集月經幹細胞 '及 c)一月經幹細胞處理器，其中該月經幹細胞處理器製備供治療用或供超低溫保存的月經幹細胞。
17.一種超低溫保存月經幹細胞的方法，該方法包含下列步驟 a)自月經期間所收集的月經流分離月經幹細胞； b)收集自月經流分離的月經幹細胞；及 c)超低溫保存分離自該月經流的月經幹細胞。
18.如權利要求17所述的方法，其中自該月經流分離月經幹細胞的步驟包含經由離心、密度梯度離心、過濾或沉降中的至少一種處理該月經流。
19.如權利要求17所述的方法，其中收集分離自月經流的月經幹細胞的步驟包含至少一個針對細胞標記選擇月經幹細胞的步驟。
20.如權利要求19所述的方法，其中收集分離自月經流的月經幹細胞的步驟包含至少一個培養所選擇月經幹細胞的步驟。
21.如權利要求17所述的方法，其中收集分離自月經流的月經幹細胞的步驟包含至少一個培養月經幹細胞的步驟。
22.如權利要求21所述的方法，其中收集分離自月經流的月經幹細胞的步驟包含至少一個自細胞培養物選擇月經幹細胞的步驟。
23.一種月經幹細胞群，其通過包含下列步驟的方法獲得 a)從月經期間所收集的月經流中分離月經幹細胞；及 b)收集分離自月經流的月經幹細胞。
24.一種用於富集收集自月經流的月經幹細胞群的方法，該方法包含下列步驟 a)從月經期間所收集的月經流中分離月經幹細胞；及 b)收集分離自月經流的月經幹細胞。
25.如權利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個針對下列細胞標記中的至少一者選擇月經幹細胞的步驟CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 類。
26.如權利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個培養月經幹細胞的步驟。
27.如權利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個選擇月經幹細胞的步驟及至少一個培養所選擇的月經幹細胞的步驟。
28.如權利要求24所述的方法，其中該方法包含至少一個培養月經幹細胞的步驟及至少一個自細胞培養物選擇月經幹細胞的步驟。
29.一種用於富集表達⑶117的月經幹細胞群的方法，該方法包含下列步驟 a)自月經流分離月經幹細胞； b)收集分離自月經流的月經幹細胞；及 c)選擇表達⑶117的月經幹細胞。
30.一種月經幹細胞群，其包含至少一種下列細胞標記⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 類。
31.一種經富集化的細胞群，其包含 a)表達至少一種包含下列的細胞標記⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I類的月經幹細胞；及 b)較低表達或不表達包含CD3及HLAII類的細胞標記中的至少一者的月經幹細胞。
32.—種組合物，其包含至少一個月經幹細胞及超低溫保存劑。
33.一種組合物，其包含至少一個月經幹細胞及細胞培養基。
34.一種組合物，其包含至少一個月經幹細胞及藥妝劑。
35.一種組合物，其包含至少一個月經幹細胞及維持細胞存活的保存劑。
36.一種組合物，其包含至少一個月經幹細胞及細胞培養基，該組合物位於一容器中以為該至少一個月經幹細胞的治療用途作準備。
全文摘要
本發明提供包含月經幹細胞(MSC)的組合物及關於獲得其的方法、製程及系統。MSC系經由處理月經期間收集的月經流而得。可將MSC超低溫保存，經各個培養及選擇步驟處理以為超低溫保存作準備，或經處理以供治療或藥妝用。可將經超低溫保存的MSC解凍以為治療及藥妝用途作準備。MSC表現CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166及HLA I類且其CD3及HLA II類表現較少或不表現。
文檔編號C12N5/071GK102851254SQ20121032254
公開日2013年1月2日 申請日期2008年3月3日 優先權日2007年3月1日
發明者默西迪絲·A·沃爾頓, 朱莉·G·阿利克遜 申請人:幹細胞國際公司