一種去除幹擾的幹化學定量測試試條、谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條及檢測方法

2023-10-05 10:02:49 2

專利名稱：一種去除幹擾的幹化學定量測試試條、谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種幹化學測試試條及測試方法，尤其涉及一種轉氨酶的幹化學測試試條及檢測方法。
背景技術：
幹化學測試中的幹擾物很多，比如氧化還原反應測定中的尿酸、抗壞血酸等的幹擾，轉氨酶檢測中的丙酮酸幹擾，尤其以轉氨酶中的丙酮酸幹擾較為嚴重。轉氨酶的種類很多，其中以谷丙轉氨酶(GPT/ALT)和穀草轉氨酶(GOT/AST)最為重要。谷丙轉氨酶又稱丙氨酸氨基轉移酶，是催化穀氨酸與丙酮酸之間的轉氨作用；穀草轉氨酶又稱門冬氨酸氨基轉移酶，是催化穀氨酸與草醯乙酸之間的轉氨作用。臨床上，全血、 血清、血漿、組織液中這兩種轉氨酶的測定，是心臟病、肌肉疾病、尤其是肝病診斷中非常重要的指標。臨床上測定上述兩種轉氨酶的方法，主要是使用生化分析儀的液體試劑的方法， 此方法是利用乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶分別催化谷丙轉氨酶產物丙酮酸和穀草轉氨酶產物草醯乙酸脫氫，消耗煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，引起吸光值在340nm的變化。此變化率與谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶活性有比例關係，從而得出酶活性。上文提到的反應如下谷丙轉氨酶
L一丙氨酸+ α一酮戊二酸棚龍_ >丙酮酸+ L—穀氨酸(1)
丙酮酸+ NADH + H+兌麵· L一乳酸+ NAD+(2)穀草轉氨酶
L一門冬氨酸+α—酮戊二酸谷I車專草醯乙酸+L—穀氨酸(3)
草醯乙酸+NADH+ H+腹酶 L 一蘋果酸+NAD+(4)此方法耗時、操作複雜、需要比較大型的儀器；並且在該方法中，隨著反應的進行， NADH不斷消耗，340nm的吸光度不斷減少。因為儀器等方面的原因，初始的NADH不能太高， 這使得該方法的測試範圍受到影響，在測試轉氨酶高值樣品時容易出現假陰性。幹化學方法具有方便、靈活、汙染小、操作簡便等特點。目前，幹化學方法大致可以分為以下幾類以雅培為代表的電化學方法(如美國專利US6565738)。富士、柯達、強生為代表的多層膜片法(如美國專利US4897347、US5508173、US5462858)。以羅氏為代表的橫向流動幹化學法(如美國專利US4591553、US5508173、US466502;3)。然而，前述方法都存在部分缺陷，比如雅培電化學法測試谷丙轉氨酶，採用穀氨酸氧化酶法氧化反應(1)產生穀氨酸，但是存在內源性的丙氨酸幹擾(比內源性的丙酮酸更為常見)，影響測試結果。而富士為代表的多層膜片法、羅氏為代表的幹化學方法，均採用偶聯丙酮酸氧化酶法。採用偶聯丙酮酸氧化酶方法的反應過程如下谷丙轉氨酶，在反應(1)後偶聯
丙酮酸+ PO43- +O2 + H2O _同_七鸕乙醯磷酸+ H2O2 +CO2 (5)
H2O2+還原態顯色劑魏側_ 氧化態顯色劑+H2O(6)穀草轉氨酶，在反應(3)後偶聯
草醯乙酸■姆I臓丙酮酸+CO2(7)
丙酮酸 + PO43- +O2 + H2O _同_七-乙醯磷酸 + H2O2 +CO2 (5)
H2O2+還原態顯色劑魏側_ 氧化態顯色劑+H2O(6)根據專利US4665023，其試條的結構如圖1所示，血液樣品加在擴散層1上，經過濾血膜3濾血後，血漿流到流動墊5上。加樣後lmin，下壓透明的保護層9，試劑層6和酶結合墊4與流動墊相接觸。固定在試劑層6上的顯色劑、酶底物和固定在酶結合墊4上的丙酮酸氧化酶、過氧化物酶復溶到樣品中，從而產生可檢測的顏色信號。從測試原理中可以清晰地看出，該方法存在內源性丙酮酸的幹擾。提供顏色信號的丙酮酸，既有酶催化產生的，也有樣品中本身存在的內源性丙酮酸。而採用速率法(即測試顯色的變化率)，去除內源性幹擾需要比較複雜的光學儀器，常常採用積分球等光學器件，並且轉氨酶的正常值一般很低，谷丙轉氨酶為5U/L 40U/L，穀草轉氨酶為8U/L 40U/L，而丙酮酸的正常參考值相對較高，為65 μ mol/L (相當於65U/L轉氨酶在Imin產生的丙酮酸)，在較短的幹化學測試時間Omin ;3min)內，顯色劑顯色的變化率也會在一定程度上受內源性丙酮酸的影響，容易出現假陽性結果。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種測量結果準確、製備簡單、測試成本低、檢測操作方便的去除幹擾的幹化學定量測試試條及特別針對谷丙或穀草轉氨酶的定量測試試條，還提供一種操作簡便、測試成本較低、檢測結果準確、檢測精度高的用該谷丙或穀草轉氨酶的定量測試試條定量檢測血液中谷丙或穀草轉氨酶的方法。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種去除幹擾的幹化學定量測試試條，所述測試試條包括底襯，所述底襯上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區，所述底襯上還設置一固定有信號提供試劑和測試反應啟動試劑的啟動區，所述加樣區和啟動區是以在通常狀態下保持非接觸、在測試狀態下可互相接觸的方式布設在所述測試試條上。所述的去幹擾試劑主要是指能夠去除待測樣品中內源性幹擾物質的反應試劑，所述信號提供試劑是指能夠基於內源性幹擾物質的反應進而提供背景信號的相應試劑，所述的測試反應啟動試劑則優選包括有能夠啟動分析物反應的反應試劑、信號產生試劑以及分析反應需要的一些生物酶試劑等。作為對上述去除幹擾的幹化學定量測試試條的第一種改進，所述加樣區直接固定在所述底襯上，所述啟動區通過一粘結件連接在所述底襯上，該粘結件具有足夠的高度使所述啟動區的大部分區域懸置於所述加樣區上方。在該優選的技術方案中，由於啟動區懸置於加樣區上方，因此在通常情況下，加樣區和啟動區是以非接觸的狀態存在；在用該測試試條進行檢測時，只需將啟動區向下按壓，便可使啟動區與加樣區保持接觸，以啟動相應的檢測反應。作為對上述去除幹擾的幹化學定量測試試條的第二種改進，所述加樣區和啟動區被一分隔層隔開，該分隔層設置為可抽離式的連接方式，以使得該分隔層抽離出測試試條後所述加樣區和啟動區能保持接觸。在該優選的技術方案中，由於啟動區和加樣區分設於分隔層的正反面上，因此在通常情況下，加樣區和啟動區之間通過分隔層隔離並以非接觸的狀態存在；在用該測試試條進行檢測時，只需將該分隔層單獨抽離出測試試條，便可使啟動區與加樣區保持接觸，以啟動相應的檢測反應。作為對上述去除幹擾的幹化學定量測試試條的第三種改進，所述加樣區可直接固定在所述底襯上，所述啟動區則通過一鉸接件鉸接於所述底襯的一端，所述鉸接件的轉軸軸向與水平面平行或垂直，以使得啟動區通過旋轉後能與所述的加樣區保持接觸。當轉軸軸向與水平面平行時，所述啟動區是通過在豎直平面內的翻轉實現與加樣區由非接觸到接觸；當轉軸軸向與水平面垂直時，所述啟動區是通過在水平面內的旋轉實現與加樣區由非接觸到接觸，此時鉸接件的高度應當適當，以便於啟動區在旋轉平移後能夠剛好接觸到加樣區。作為對上述去除幹擾的幹化學定量測試試條的第四種改進，所述加樣區和啟動區分別固定在所述底襯同一面的不同區域(相互保持一定距離)，所述加樣區和啟動區中間的底襯上設有一摺痕線，以使得所述底襯沿摺痕線彎折後能使啟動區與加樣區保持接觸。上述的各種去除幹擾的幹化學定量測試試條中，啟動區可以設置一試劑層，其作用是啟動轉氨酶反應，優選的材料為聚碳酸酯或尼龍，也可以將試劑層上物質直接固定在纖維材料中作為試劑層，此時可根據需要在試劑層上增設一層透明的保護層，所述保護層優選用透明的聚碳酸酯或聚氯乙烯材料製作。上述的各種去除幹擾的幹化學定量測試試條中，具體到加樣區和啟動區的結構， 所述加樣區可以根據待檢測樣品的需要，由樣品流動墊、擴散層、樣品墊、濾血膜、酶結合墊中的全部或者幾種構成，所述加樣區優選包括固定於底襯上的流動墊和固定於流動墊上的酶結合墊，所述酶結合墊上設有濾血膜、樣品墊、擴散層中的一種或疊加設置其中的多種。 例如，所述的酶結合墊上可依次疊加設置濾血膜、樣品墊和擴散層，又如，在用該測試試條檢測血清時，便可取消濾血膜層。所述啟動區也可以根據待檢測樣品的需要，包含試劑層、 酶結合墊、保護層中的一種或者多種。上述的去除幹擾的幹化學定量測試試條中，所述底襯可以採用(透明或者不透明的)高分子聚合材料(如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯等)製作，但優選採用聚氯乙烯 (PVC)、聚碳酸酯、聚醯胺高分子聚合材料製作，底襯的厚度優選為50 μ m 300 μ m。所述流動墊可以採用的材料包括玻璃纖維、聚酯纖維、硝酸纖維素膜、聚碸膜、聚醚碸膜等，優選採用玻璃纖維、硝酸纖維素膜、聚酯纖維膜或濾紙製作，其厚度優選為0. 04mm 0. 2mm。所述酶結合墊優選採用玻璃纖維、纖維素濾紙、聚酯纖維或濾紙製作。所述濾血膜的作用是過濾血細胞，如果待測試樣品為血漿、血清則可不設置該層，其材料可以是各種玻璃纖維和一些廠家提供的專用濾血膜，優選採用不對稱聚碸膜或玻璃纖維製作。所述樣品墊的作用為保持樣品，不讓樣品溢流出來(非必要設置)，其材料可以為玻璃纖維、聚酯纖維等，優選採用玻璃纖維製作。所述擴散層的作用是使待測樣品均勻地滲濾到下層中(非必要設置)，優選採用聚酯纖維或尼龍纖維製成的網布形式，網布孔徑優選為40目 150目，纖維直徑優選為100 μ π! 500 μ m,網布優選為親水性的或親水處理的。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種用上述的去除幹擾的幹化學定量測試試條檢測生物酶的方法，包括以下步驟首先將待測樣品液添加到所述測試試條的加樣區， 所述加樣區上固定的去幹擾試劑復溶到待測樣品液中，所述待測樣品液中含有的內源性幹擾物質與待測樣品液中的去幹擾試劑開始進行反應，經過一段孵化過程後(通常保持Imin 即可)，再使所述測試試條的啟動區與加樣區相接觸，啟動區上固定的信號提供試劑和測試反應啟動試劑復溶到待測樣品液中，並開始啟動分析物的測試反應，測試反應啟動後生成的產物再與所述信號提供試劑進行信號反應，根據信號反應測得的信號值，測算出待測生物酶的含量。上述的檢測方法中，所述信號反應所產生的可識別信號包括顯色信號、螢光信號、化學發光信號中的一種，最優選為顯色信號，尤其是採用吸收波長為600nm 700nm的顯色信號。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種穀丙或穀草轉氨酶定量測試試條，該定量測試試條是由上述的幹化學定量測試試條製成，所述啟動區上固定的測試反應啟動試劑主要是指能夠啟動轉氨酶反應的底物，所述加樣區上固定的去幹擾試劑包括丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶(CAT)，所述啟動區或加樣區上還固定有過氧化物酶(POD)，所述啟動區上固定的信號提供試劑包括適用於所述過氧化物酶的顯色底物、螢光底物或化學發光底物。 此外根據樣品情況，所述加樣區上可以添加抗壞血酸氧化酶或尿酸氧化酶等物質。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種用上述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條檢測谷丙或穀草轉氨酶的方法(不設置濾血膜、樣品墊和擴散層的情形)，包括以下步驟首先將待測樣品液添加到所述測試試條的加樣區，所述加樣區上固定的丙酮酸氧化酶、 過氧化氫酶均復溶到待測樣品液中，所述待測樣品液中含有的內源性幹擾物質丙酮酸與待測樣品液中的丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶開始進行去幹擾反應，經過一段孵化過程後，再使所述測試試條的啟動區與加樣區相接觸，啟動區上固定的底物復溶到待測樣品液中，啟動區或加樣區上固定的過氧化物酶也已經復溶到待測樣品液中，此時開始啟動轉氨酶反應，轉氨酶反應啟動後生成的丙酮酸參與偶聯反應，偶聯反應後生成的雙氧水與所述顯色底物進行顯色反應，根據顯色底物顯色的反射率值並通過終點法或速率法測定出谷丙或穀草轉氨酶的含量。作為一個總的技術構思，本發明還提供另一種穀丙或穀草轉氨酶定量測試試條， 所述定量測試試條是由上述具有特定加樣區結構的(該加樣區內包括酶結合墊、濾血膜、 樣品墊和擴散層)幹化學定量測試試條製成，所述啟動區上固定的測試反應啟動試劑主要是指能夠啟動轉氨酶反應的底物，所述加樣區上固定的去幹擾試劑包括丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶，所述啟動區或加樣區上還固定有過氧化物酶，所述啟動區上固定的信號提供試劑包括適用於所述過氧化物酶的顯色底物、螢光底物或化學發光底物；所述酶結合墊上設有濾血膜，所述濾血膜上設有樣品墊，所述樣品墊上設有擴散層。擴散層、樣品墊和濾血膜中可添加緩衝體系、表面活性劑、防溶血試劑(如糖類)、鹽類(如氯化鈉)等。作為一個總的技術構思，本發明還提供用上述第二種的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條檢測谷丙或穀草轉氨酶的方法，包括以下步驟首先將待測樣品液滴加到所述測試試條加樣區的擴散層上，使待測樣品液依次流經樣品墊和濾血膜並逐漸浸潤到所述酶結合墊上，所述加樣區上固定的丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶均復溶到待測樣品液中，所述待測樣品液中含有的內源性幹擾物質丙酮酸與待測樣品液中的丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶開始進行去幹擾反應，經過一段孵化過程後，再使所述測試試條的啟動區與加樣區相接觸，啟動區上固定的底物復溶到待測樣品液中，啟動區或加樣區上固定的過氧化物酶也已經復溶到待測樣品液中，此時開始啟動轉氨酶反應，轉氨酶反應啟動後生成的丙酮酸參與偶聯反應，偶聯反應後生成的雙氧水與所述顯色底物進行顯色反應，根據顯色底物顯色的反射率值並通過終點法或速率法測定出谷丙或穀草轉氨酶的含量。上述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條中，所述丙酮酸氧化酶的濃度優選為 30KU/L 300KU/L。上述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條中，所述過氧化物酶的濃度優選為30KU/L 200KU/L。上述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條中，所述過氧化氫酶的濃度為1KU/L 200KU/L。上述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條中，所述顯色底物、螢光底物或化學發光底物的濃度優選為ImM 50mM。上述技術方案中，顯色劑的選用可根據實際需要進行確定(已有US4591553、US5274095、US5162200、US4666023等美國專利文獻提及)。 如果顯色劑體系只包括一種組分，則該組分固定在啟動區的試劑層上即可，如果顯色劑體系包含多種組分，則至少有一種組分固定在啟動區的試劑層上。上述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條中，所述啟動轉氨酶反應的底物優選包括 α -酮戊二酸，所述α -酮戊二酸的濃度優選為5mM 300mM ；所述啟動轉氨酶反應的底物還優選包括用於檢測谷丙轉氨酶的L-丙氨酸或者用於檢測穀草轉氨酶的L-門冬氨酸。事實上，如果固定於啟動區的啟動轉氨酶反應的底物包括了 α -酮戊二酸，那麼諸如L-丙氨酸、L-門冬氨酸等物質也可以固定在加樣區上。如無特別提及，本發明中試條上所附著物質的濃度均是指在製備該試條時用於潤溼載體膜所選用的該物質溶液的濃度，例如上述的顯色劑濃度即是指在製備試條時用於潤溼載體膜所選用的該顯色劑溶液的濃度。綜上所述，本發明的測試試條中反應體系可以包括緩衝體系、轉氨酶反應底物、 防溶血試劑、丙酮酸氧化酶(濃度優選為30KU/L 300KU/L)、過氧化物酶(濃度優選為 30KU/L 200KU/L)、轉氨酶激活劑、焦磷酸硫胺素(ΤΡΡ，濃度優選為0. 4mg/ml lmg/ml)、 黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD，濃度優選為0. lmg/ml 0. 2mg/ml)、表面活性劑、顯色劑、丙酮酸激活劑(如Mg2+、Mn2+，優選為0. OlM 0. IM的Mg2+)、谷丙、穀草轉氨酶激活劑(優選為 ImM 500mM的5』 -磷酸吡哆醛)、穩定劑等。其中，包括緩衝體系在內的各非主要組分的選擇、濃度及酶的活性均可以由本領域人員根據現有技術自行確定(可參考US427U65、 US4666832、US4591553等美國專利文獻)。TPP、FAD、表面活性劑、激活劑等物質均可固定在加樣區上。本發明的上述谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條及檢測方法主要基於以下原理在偶聯丙酮酸氧化酶的基礎上，通過再加入過氧化氫酶可以非常有效地去除內源性物質丙酮
8酸的幹擾，因為內源性幹擾物質丙酮酸產生的H2O2(參見上述反應(5))均已被過氧化氫酶通過下述反應(8)去除掉，因此參與後續顯色反應的H2O2 (參見上述反應(6))均是由轉氨酶反應的產物轉化而來。
H2O2 賄德酶_ H2O + O2(8)與現有技術相比，本發明的優點在於通過採用本發明的測試試條和檢測方法可以更加準確、便捷地對谷丙轉氨酶或穀草轉氨酶進行定性檢測和定量分析，而且本發明的測試試條結構簡單，便於製作，檢測方法操作方便、快捷，無需新增其他儀器或設備，符合床邊的診斷(POCT)的要求，適合醫院急診、病房、用戶自己、社區醫院等使用，具有廣闊的應用前景。


圖1為現有技術中幹化學定量測試試條的結構示意圖。圖2為本發明實施例1提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖。圖3為本發明實施例2提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖。圖4為本發明實施例3提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖。圖5為本發明實施例4提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖。圖6為本發明實施例5提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖。圖7為本發明實施例6提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖(俯視)。圖8為本發明實施例6提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的結構示意圖(主視)。圖9為本發明實施例2提供的去幹擾的幹化學定量測試試條的另一變換形式。圖10為本發明實施例7中給出的對比例2對谷丙轉氨酶進行定量測試時建立的直線回歸方程。圖11為本發明實施例7和對比例1中反射率值的對比圖。圖12為本發明對比例4中對穀草轉氨酶進行定量測試時建立的直線回歸方程。圖13為本發明實施例8和對比例3中反射率值的對比圖。圖例說明1、擴散層；2、樣品墊；3、濾血膜；4、酶結合墊；5、流動墊；6、試劑層；7、底襯；8、粘結件；9、保護層；10、鉸接件；11、摺痕線；12、分隔層；13、加樣區；14、啟動區。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體實施例對本發明作進一步描述。實施例1 一種如圖2所示的去除幹擾的幹化學定量測試試條，該測試試條包括底襯7，底襯 7上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區13 (本實施例中具體包括擴散層1、樣品墊2、濾血膜 3、酶結合墊4和流動墊幻，加樣區13直接固定在底襯7上；底襯7上還設置一固定有測試反應啟動試劑和信號提供試劑的啟動區14，啟動區14包括一試劑層6，試劑層6通過一粘
9結件8連接在底襯7的一端，該粘結件8具有足夠的高度使試劑層6的大部分區域懸置於加樣區13的上方。加樣區13和啟動區14在通常狀態下保持非接觸，在測試狀態下可通過向下按壓啟動區14 (試劑層6)使其與加樣區13 (具體為加樣區13的流動墊幻互相接觸。本實施例中，加樣區13包括固定於底襯7上的流動墊5，流動墊5的一端固定酶結合墊4，酶結合墊4的上方依次設置濾血膜3、樣品墊2和擴散層1，且擴散層1、樣品墊2、濾血膜3、酶結合墊4和流動墊5的一側通過粘結件8相互連接，並最終固定在底襯7上。啟動區14的試劑層6具體設置在加樣區13的流動墊5上方。去幹擾試劑固定在酶結合墊4 或流動墊5上，測試反應啟動試劑和信號提供試劑固定在試劑層6上。一種用上述的去除幹擾的幹化學定量測試試條檢測生物酶的方法(適合全血測試、血清、血漿等)，包括以下步驟首先將待測樣品液(如全血)添加到測試試條加樣區 13的擴散層1上，經過樣品墊2、濾血膜3以過濾血細胞，血漿復溶酶結合墊4或流動墊5 上的去幹擾試劑，最後滲透到流動墊5上，待測樣品液中含有的內源性幹擾物質與復溶的去幹擾試劑開始進行去幹擾反應，經過Imin左右的孵化過程後，再使測試試條的啟動區14 的試劑層6與加樣區13的流動墊5相接觸，啟動區14上固定的測試反應啟動試劑(包括反應底物)和信號提供試劑等復溶到待測樣品液中，並開始啟動分析物的測試反應，測試反應啟動後生成的產物再與信號提供試劑進行信號反應，根據信號反應測得的反射率值， 測算出待測生物酶的含量。實施例2 一種如圖3所示的去除幹擾的幹化學定量測試試條，該測試試條包括底襯7，底襯 7上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區13 (本實施例中具體包括擴散層1、樣品墊2、濾血膜 3、酶結合墊4和流動墊幻，加樣區13直接固定在底襯7上；底襯7上還設置一固定有測試反應啟動試劑和信號提供試劑的啟動區14，啟動區14包括一試劑層6，試劑層6通過一粘結件8連接在底襯7的一端，該粘結件8具有足夠的高度使試劑層6的大部分區域懸置於加樣區13的上方。加樣區13和啟動區14在通常狀態下保持非接觸，在測試狀態下可通過向下按壓啟動區14 (試劑層6)使其與加樣區13 (具體指加樣區13中的酶結合墊4)互相接觸。本實施例中，加樣區13包括固定於底襯7上的流動墊5，流動墊5的一端(靠近啟動區14的一端)固定有酶結合墊4，另一端固定有濾血膜3，濾血膜3的上方依次設置有樣品墊2和擴散層1，且擴散層1、樣品墊2、濾血膜3和流動墊5的一側通過粘結件8相互連接，並最終固定在底襯7上。啟動區14的試劑層6具體設置在加樣區13的酶結合墊4上方。去幹擾試劑固定在酶結合墊4或流動墊5上，測試反應啟動試劑和信號提供試劑固定在試劑層6上。由上可見，相比於實施例1，實施例2僅僅是將酶結合墊4的位置作了調整和優化， 即將酶結合墊4固定在流動墊5靠近啟動區14的一端，在進行檢測時，通過向下按壓啟動區14可以使其先與酶結合墊4接觸，本實施例可以很好地避免酶釋放的不同引起的偏差。 除此之外，酶結合墊4還可設置在試劑層6的下方，如圖9所示，使其成為啟動區14的一部分，此時去幹擾試劑應固定在流動墊5上。實施例3 一種如圖4所示的去除幹擾的幹化學定量測試試條，相比於實施例1提供的測試試條，本實施例的測試試條不設酶結合墊4，其餘的結構及應用方式與實施例1相同。由於不設酶結合墊4，原先固定在酶結合墊4上的物質(例如各種催化反應酶)可以直接固定在加樣區13的其他結構(例如流動墊5)上。實施例4 一種如圖5所示的去除幹擾的幹化學定量測試試條，該測試試條包括底襯7，底襯 7上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區13 (包括流動墊5、酶結合墊4、濾血膜3、樣品墊2 和擴散層1等)，加樣區13直接固定在底襯7上；底襯7上還設置一固定有測試反應啟動試劑和信號提供試劑的啟動區14，啟動區14包括一試劑層6，試劑層6也直接固定在底襯 7上，加樣區13和啟動區14通過一分隔層12相互隔離。分隔層12設置為可抽離式的連接方式，加樣區13和啟動區14在通常狀態下保持非接觸，在測試狀態下可通過抽離分隔層 12使位於其正、反面的加樣區13與啟動區14互相保持接觸。本實施例中，加樣區13的流動墊5 —部分直接固定於底襯7上的，一部分則位於分隔層12上方，流動墊5的一端上方設置有酶結合墊4，酶結合墊4的上方依次設置有濾血膜3、樣品墊2和擴散層1。去幹擾試劑固定在酶結合墊4上，測試反應啟動試劑和信號提供試劑固定在試劑層6上。本實施例的測試試條用於檢測時的操作方法與實施例1相似，即首先將待測樣品液(全血)添加到測試試條加樣區13的擴散層1上，經過樣品墊2、濾血膜3以過濾血細胞，血漿復溶酶結合墊4 (或流動墊幻上的去幹擾試劑，最後滲透到流動墊5上，待測樣品液中含有的內源性幹擾物質與復溶的去幹擾試劑開始進行去幹擾反應，經過Imin左右的孵化過程後，再抽離分隔層12使測試試條的啟動區14的試劑層6與加樣區13的流動墊5 相接觸，啟動區14上固定的測試反應啟動試劑(包括反應底物)和信號提供試劑等復溶到待測樣品液中，並開始啟動分析物的測試反應，測試反應啟動後生成的產物再與信號提供試劑進行信號反應，根據信號反應測得的反射率值，測算出待測生物酶的含量。實施例5 —種如圖6所示的去除幹擾的幹化學定量測試試條，該測試試條包括透明的底襯 7，底襯7上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區13(包括擴散層1、樣品墊2、濾血膜3、酶結合墊4、流動墊5等)，加樣區13直接固定在底襯7上的一端；底襯7上還設置一固定有測試反應啟動試劑和信號提供試劑的啟動區14，啟動區14包括一試劑層6，試劑層6直接固定在底襯7的另一端。加樣區13和啟動區14相互隔開一定距離，使加樣區13和啟動區14 在通常狀態下保持非接觸，加樣區13和啟動區14中間的底襯7上還設有一摺痕線11，在測試狀態下可沿該摺痕線11翻折，使位於一端的啟動區14與另一端的加樣區13互相接觸。 本實施例中，加樣區13的流動墊5直接固定於底襯7上，流動墊5上依次設置有酶結合墊 4、濾血膜3、樣品墊2和擴散層1。去幹擾試劑固定在酶結合墊4上，測試反應啟動試劑和信號提供試劑固定在試劑層6上。實施例6:—種如圖7和圖8所示的去除幹擾的幹化學定量測試試條，該測試試條包括底襯 7，底襯7上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區13(包括擴散層1、樣品墊2、濾血膜3、酶結合墊4、流動墊5等)，加樣區13直接固定在底襯7上；底襯7上還設置一固定有測試反應啟動試劑和信號提供試劑的啟動區14，啟動區14包括一試劑層6和保護層9，保護層9位於試劑層6的上方，試劑層6通過一鉸接件10連接在底襯7的一端，該鉸接件10具有適當的高度，使啟動區14經水平旋移後試劑層6的大部分區域能剛好與加樣區13相接觸。在通常狀態下，啟動區14旋轉偏離於加樣區13 (如圖7所示)，與加樣區13保持非接觸狀態， 在測試狀態下可通過繞鉸接件10旋轉啟動區14使其與加樣區13互相接觸。本實施例中，加樣區13的流動墊5直接固定於底襯7上，流動墊5的一端固定有酶結合墊4，酶結合墊4的上方依次設置有濾血膜3、樣品墊2和擴散層1。酶結合墊4、濾血膜3、樣品墊2和擴散層1均設置於流動墊5的一側，另一側餘出的空間便於與啟動區14 的試劑層6進行接觸。去幹擾試劑固定在流動墊5上，測試反應啟動試劑和信號提供試劑固定在試劑層6上。實施例7 —種本發明的谷丙轉氨酶定量測試試條(GPT測試試條)，該定量測試試條是由上述實施例5的幹化學定量測試試條製成。該測試試條包括底襯7，底襯7採用透明的聚碳酸酯(PC)板，其厚度為0. 3mm。底襯7上方的中部設有流動墊5，本實施例中流動墊5的製作方法為將含有0. 5M 的L-丙氨酸PBS溶液(濃度為0. 1M，pH = 7. 2)噴塗在約10 μ m孔徑的硝酸纖維素膜上，乾燥。流動墊5上方的一端設有酶結合墊4，本實施例中酶結合墊4的製作方法為將含有100KU/L過氧化物酶、200KU/L丙酮酸氧化酶、100KU/L的過氧化氫酶的PBS溶液(濃度為0. 1M，pH = 7. 2)噴塗在0. 09mm厚的聚酯纖維膜上，乾燥。酶結合墊4上設有濾血膜3，材料為玻璃纖維，不處理。濾血膜3上設有樣品墊2，本實施例中樣品墊2的製作方法為將含1 % (w/w) NaCl 溶液噴塗在厚為0. 36mm的玻璃纖維上，乾燥。樣品墊2上還設有擴散層1，擴散層1為聚酯纖維製成的網布形式，孔徑為80目。上述底襯7上的一端還設有一試劑層6，本實施例中試劑層6的製作方法為將含有0. IMa-酮戊二酸、5mM 4_氨基安替比林(第一顯色劑)、2mM THBHA (色原劑)的溶液噴塗在厚度為0. 175mm的單面磨砂的聚碳酸酯薄片上，乾燥。該試劑層6是通過粘合的方式組裝在底襯7的一端。由圖6可見，該試劑層6位於流動墊5的一側，且在常態下(即未用於檢測前)加樣區13和啟動區14相互隔開一定距離，試劑層6與流動墊5保持非接觸方式，由於加樣區13和啟動區14中間的底襯7上還設有一摺痕線11，在進行檢測過程中，當待測樣品液滲透到流動墊5上時，試劑層6可通過包括翻折之類的任何方式與流動墊5相接觸。其中，啟動區14固定的測試反應啟動試劑主要是指能夠啟動轉氨酶反應的底物， 具體到本實施例中，試劑層6上固定有適用於過氧化物酶的顯色劑和能夠啟動轉氨酶反應的底物(即上述的a -酮戊二酸)。加樣區13上固定的去幹擾試劑主要包括上述酶結合墊 4上固定的丙酮酸氧化酶、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶等。將一系列不同濃度的谷丙轉氨酶使用生化分析儀試劑盒定值(濃度值見下表1)， 然後分別取30 μ L不同濃度的谷丙轉氨酶溶液作為待測樣品，各待測樣品中均含有幹擾物丙酮酸(濃度為100 μ Μ)，通過上述的本實施例的測試試條和以下方法步驟測試待測樣品中的谷丙轉氨酶含量待測樣品液首先滴加到測試試條的擴散層1上，使待測樣品液依次流經樣品墊2和濾血膜3並逐漸浸潤到酶結合墊4上，酶結合墊4上固定的催化反應酶(包括上述的丙酮酸氧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等)復溶到待測樣品液中，待測樣品液中含有的內源性幹擾物質丙酮酸與前述的催化反應酶進行反應，待測樣品液繼續滲透到流動墊5上，經過一段孵化過程(通常為lmin)後，使測試試條的試劑層6與流動墊5相接觸， 試劑層6上固定的底物(α-酮戊二酸)和顯色劑等復溶到待測樣品液中，並開始啟動轉氨酶反應，轉氨酶反應啟動後生成的丙酮酸參與偶聯反應，偶聯反應後生成的雙氧水與顯色劑進行顯色反應，2min後根據顯色劑顯色的反射率值並通過終點法(或速率法)測定出谷丙轉氨酶的含量(反射率值如下表1所示)。在上述的檢測方法中，谷丙轉氨酶還沒有啟動反應之前，內源性幹擾物丙酮酸已經通過催化反應去除。同樣取以上系列不同濃度的谷丙轉氨酶溶液作為待測樣品液，但各待測樣品液中不含幹擾物丙酮酸，同樣採用上述的測試試條及測試方法對這些待測樣品液進行測試，測試結果如下表1所示，作為上述實施例的對比例1。同樣取以上系列不同濃度的谷丙轉氨酶溶液作為待測樣品液，但各待測樣品液中不含幹擾物丙酮酸，同樣採用上述的測試試條(但測試試條的酶結合墊上不含有過氧化氫酶)及測試方法對這些待測樣品液進行測試，測試結果如下表1所示，作為上述實施例的對比例2。表1 實施例7與其對比例測得的不同濃度待測樣品液的反射率值
權利要求
1.一種去除幹擾的幹化學定量測試試條，所述測試試條包括底襯，所述底襯上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區，所述底襯上還設置一固定有信號提供試劑和測試反應啟動試劑的啟動區，其特徵在於所述加樣區和啟動區是以在通常狀態下保持非接觸、在測試狀態下可互相接觸的方式布設在所述測試試條上。
2.根據權利要求1所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條，其特徵在於所述加樣區直接固定在所述底襯上，所述啟動區通過一粘結件連接在所述底襯上，該粘結件具有足夠的高度使所述啟動區的大部分區域懸置於所述加樣區上方，且該啟動區可通過下壓與所述加樣區保持接觸。
3.根據權利要求1所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條，其特徵在於所述加樣區和啟動區被一分隔層隔開，該分隔層為可抽離式連接方式，以使得該分隔層被抽離出測試試條後所述加樣區和啟動區能保持接觸。
4.根據權利要求1所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條，其特徵在於所述加樣區直接固定在所述底襯上，所述啟動區通過一鉸接件鉸接於所述底襯的一端，所述鉸接件的轉軸軸向與水平面平行或垂直，以使得啟動區通過旋轉後能與所述的加樣區保持接觸。
5.根據權利要求1所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條，其特徵在於所述加樣區和啟動區分別固定在所述底襯同一面的不同區域，所述加樣區和啟動區中間的底襯上設有一摺痕線，以使得所述底襯沿摺痕線彎折後能使啟動區與加樣區保持接觸。
6.根據權利要求1 5中任一項所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條，其特徵在於 所述啟動區上方覆蓋有一保護層，所述保護層選用透明的聚碳酸酯或聚氯乙烯材料製作。
7.根據權利要求1 5中任一項所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條，其特徵在於 所述加樣區包括固定於底襯上的流動墊、酶結合墊、濾血膜、樣品墊、擴散層中的一種或疊加設置其中的多種。
8.一種用權利要求1 7中任一項所述的去除幹擾的幹化學定量測試試條檢測生物酶的方法，包括以下步驟首先將待測樣品液添加到所述測試試條的加樣區，所述加樣區上固定的去幹擾試劑復溶到待測樣品液中，所述待測樣品液中含有的內源性幹擾物質與待測樣品液中的去幹擾試劑開始進行反應，經過一段孵化過程後，再使所述測試試條的啟動區與加樣區相接觸，啟動區上固定的信號提供試劑和測試反應啟動試劑復溶到待測樣品液中， 並開始啟動分析物的測試反應，測試反應啟動後生成的產物再與所述信號提供試劑進行信號反應，根據信號反應測得的信號值，測算出待測生物酶的含量；所述信號反應所產生的可識別信號包括顯色信號、螢光信號、化學發光信號中的一種。
9.一種穀丙或穀草轉氨酶定量測試試條，其特徵在於所述定量測試試條是由權利要求1 6中任一項所述的幹化學定量測試試條製成，所述啟動區上固定的測試反應啟動試劑主要是指能夠啟動轉氨酶反應的底物，所述加樣區上固定的去幹擾試劑包括丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶，所述啟動區或加樣區上還固定有過氧化物酶，所述啟動區上固定的信號提供試劑包括適用於所述過氧化物酶的顯色底物、螢光底物或化學發光底物。
10.一種穀丙或穀草轉氨酶定量測試試條，其特徵在於所述定量測試試條是由權利要求7所述的幹化學定量測試試條製成，所述啟動區上固定的測試反應啟動試劑主要是指能夠啟動轉氨酶反應的底物，所述加樣區上固定的去幹擾試劑包括丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶，所述啟動區或加樣區上還固定有過氧化物酶，所述啟動區上固定的信號提供試劑包括適用於所述過氧化物酶的顯色底物、螢光底物或化學發光底物；所述酶結合墊上設有濾血膜，所述濾血膜上設有樣品墊，所述樣品墊上設有擴散層。
11.根據權利要求9或10所述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條，其特徵在於所述丙酮酸氧化酶的濃度為30KU/L 600KU/L，所述過氧化氫酶的濃度為1KU/L 1000KU/L， 所述過氧化物酶的濃度為30KU/L 600KU/L，所述顯色底物、螢光底物或化學發光底物的濃度為ImM 50mM。
12.根據權利要求9或10所述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條，其特徵在於所述啟動轉氨酶反應的底物包括α -酮戊二酸，所述α -酮戊二酸的濃度為5mM 300mM ；所述啟動轉氨酶反應的底物還包括用於檢測谷丙轉氨酶的L-丙氨酸或者用於檢測穀草轉氨酶的L-門冬氨酸，所述L-丙氨酸的濃度為0. OlM 1M，所述L-門冬氨酸的濃度為0. OlM 1M。
13.一種用權利要求9所述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條檢測谷丙或穀草轉氨酶的方法，包括以下步驟首先將待測樣品液添加到所述測試試條的加樣區，所述加樣區上固定的丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶均復溶到待測樣品液中，所述待測樣品液中含有的內源性幹擾物質丙酮酸與待測樣品液中的丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶開始進行去幹擾反應，經過一段孵化過程後，再使所述測試試條的啟動區與加樣區相接觸，啟動區上固定的底物復溶到待測樣品液中，啟動區或加樣區上固定的過氧化物酶也已經復溶到待測樣品液中，此時開始啟動轉氨酶反應，轉氨酶反應啟動後生成的丙酮酸參與偶聯反應，偶聯反應後生成的雙氧水與所述顯色底物進行顯色反應，根據顯色底物顯色的反射率值並通過終點法或速率法測定出谷丙或穀草轉氨酶的含量。
14.一種用權利要求10所述的谷丙或穀草轉氨酶定量測試試條檢測谷丙或穀草轉氨酶的方法，包括以下步驟首先將待測樣品液滴加到所述測試試條加樣區的擴散層上，使待測樣品液依次流經樣品墊和濾血膜並逐漸浸潤到所述酶結合墊上，所述加樣區上固定的丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶均復溶到待測樣品液中，所述待測樣品液中含有的內源性幹擾物質丙酮酸與待測樣品液中的丙酮酸氧化酶和過氧化氫酶開始進行去幹擾反應，經過一段孵化過程後，再使所述測試試條的啟動區與加樣區相接觸，啟動區上固定的底物復溶到待測樣品液中，啟動區或加樣區上固定的過氧化物酶也已經復溶到待測樣品液中，此時開始啟動轉氨酶反應，轉氨酶反應啟動後生成的丙酮酸參與偶聯反應，偶聯反應後生成的雙氧水與所述顯色底物進行顯色反應，根據顯色底物顯色的反射率值並通過終點法或速率法測定出谷丙或穀草轉氨酶的含量。
全文摘要
本發明公開了一種去除幹擾的幹化學定量測試試條，包括底襯，其上設置一固定有去幹擾試劑的加樣區，還設置一固定有測試反應啟動試劑和信號提供試劑的啟動區，加樣區和啟動區是以在通常狀態下保持非接觸、在測試狀態下可互相接觸的方式布設在測試試條上。測試方法是將待測樣品液添加到加樣區，加樣區上固定的物質復溶到待測樣品液中，開始進行去幹擾反應；再使啟動區與加樣區接觸，啟動區上固定的物質復溶，開始進行測試反應，產物再進行信號反應，根據測得的信號值測算出待測生物酶的含量。本發明的檢測方法操作簡便、測試成本較低、檢測結果準確、檢測精度高，能夠具體用於谷丙或穀草轉氨酶的定量測試。
文檔編號G01N21/78GK102419366SQ201110240460
公開日2012年4月18日 申請日期2011年8月19日 優先權日2011年8月19日
發明者吉翔, 李宗祥, 謝光, 車宏莉 申請人:長沙三諾生物傳感技術股份有限公司