一種全燕麥固態混菌發酵生產益生菌活菌粉劑及製備方法

2023-10-05 12:26:44 3

一種全燕麥固態混菌發酵生產益生菌活菌粉劑及製備方法
【專利摘要】本發明屬於生物製劑領域，公開了一種利用多種益生菌直投劑混菌固態發酵全燕麥獲得三聯益生菌活菌粉劑及其製備方法，所述三聯益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9，植物乳桿菌P-8和乾酪乳桿菌Zhang，以燕麥全粉為發酵基質製備而得,具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力；改善人體腸道菌群結構的能力；調節血脂代謝；提高腸道抗致病菌感染能力；有效預防緩解腹瀉、便秘、腹痛、腹脹等腸易激綜合症。
【專利說明】一種全燕麥固態混菌發酵生產益生菌活菌粉劑及製備方法
發明領域
[0001]本發明屬於生物製劑領域，是一種利用多種益生菌直投劑混菌固態發酵全燕麥獲得二聯益生菌活菌粉劑及其製備方法。
【背景技術】
[0002]益生菌是一類通過改善腸道微生物從而對宿主產生有益影響的微生物。它可通過參與腸道微生物平衡來抑制病原菌生長，避免了長期使用抗生素產生的耐藥性和二重感染，因此，益生菌產品近年來備受人們的關注。[0003]目前，雖然市場上的益生菌產品極其豐富，但是開發的產品以發酵乳製品為主，其中含有高的脂肪和膽固醇，還可能引發乳糖不耐症。所以，非乳益生菌產品成為發展的趨勢。而居於穀物之首的燕麥，具有很高的營養和保健價值，其含有大量的膳食纖維，而膳食纖維的主要成分之一 β_葡聚糖在燕麥麩皮中含量高，其具有降低血液中膽固醇的含量以及餐後血糖水平的作用。同時，腸道微生物發酵β -葡聚糖(作為一種益生元)後會形成短鏈脂肪酸，從而保護結腸膜。並且燕麥還具有含量相對較高的蛋白質，必需胺基酸組成合理，賴氨酸含量高於小麥粉和稻米，有利於飲食中其他胺基酸的吸收，色氨酸含量比較豐富。所以，以燕麥為基質的發酵食品越來越受到人們的關注。
[0004]然而，開發的燕麥發酵產品中普遍使用各種糖類以及添加劑，其高脂高糖並不適宜長期食用，尤其針對具有高血脂、高血糖的消費人群。以全燕麥(包含燕麥麩皮)為唯一基質的益生菌產品具有很好的發展前景，而通過三株益生菌直投劑進行混菌固態發酵燕麥全粉(包含燕麥麩皮)生產三聯益生菌活菌粉劑產品的報導國內外還未見，且在混菌固態發酵中，菌株間的互利共棲協同作用，能提高產率和菌體濃度；多菌株的產酶、產酸和產營養物質能力、對基質的分解能力等要顯著優於單菌發酵。混菌固態發酵還具有獲得純種發酵無法獲得的產物，生長速度快，對底物利用率高，可多級轉化，發酵後的微生物群體穩定，省工節能，簡化工藝及發酵設備和易控制等諸多優點，且不易染菌。
[0005]植物乳桿菌P-8 (L.P lantarum P-8)是2005年分離自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發酵酸牛乳樣品中的I株具有優良益生特性的植物乳桿菌。具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠在人體腸道中定植及繁殖，改善人體腸道菌群結構的能力；調節血脂代謝，對高血脂症肝臟具有保護修復作用，增強機體抗氧化能力；對機體免疫具有調節作用。
[0006]乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)是於2005年從健康蒙古族兒童腸道中分離篩選出的I株性能卓越的益生菌。具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠有效拮抗腸道致病菌，提高腸道抗致病菌感染能力；有效預防緩解腹瀉、便秘、腹痛、腹脹等腸易激綜合症。
[0007]乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)是於2001年從內蒙古錫林郭勒盟正藍旗草原上自然發酵酸馬奶樣品中分離篩選出的I株性能卓越的益生菌。具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠在人體腸道中定植及繁殖，改善人體腸道菌群結構的能力；能夠有效拮抗腸道致病菌，提高腸道抗致病菌感染能力；調節血脂代謝，對高血脂症肝臟具有保護修復作用，增強機體抗氧化能力；對機體免疫具有調節作用；有效預防腫瘤生長和II型糖尿病的發生。
[0008]其中，植物乳桿菌P-8 (L.P lantarum P-8)與乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)均為兼性厭氧菌，而乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)為嚴格厭氧菌。利用其直投劑混菌發酵接種工藝為接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)與乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)一定時間後，再接種乳雙歧桿菌V9(B.1actis V9),混菌發酵固態燕麥全粉。其機理在於，發酵前期植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)與乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)的生長、增殖及新陳代謝能夠為乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的增殖提供豐富的營養物質及必要的厭氧環境，更利於乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)生長的啟動。再者，植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)與乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)對膳食纖維的利用相對較少,保證乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)對膳食纖維的利用，進而產生多樣化的生物活性物質，其機理類似於膳食纖維作為益生元進入人體後的作用機理。
[0009]具體涉及利用植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)、乾酪乳桿菌Zhang (L.caseiZhang)、乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，混菌固態發酵全燕麥製成三聯活菌粉劑及其製備方法。三株菌中乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)和乳雙歧桿菌V9 (B.1actisV9)，於2011年11月18日，而植物乳桿菌P-8(L.plantarum P-8)於2012年6月28日，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心(國家專利局指定專利微生物保藏中心)保藏，乾酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9和植物乳桿菌P_8的保藏號分別為CGMCCN0.5469,CGMCC N0.5470和CGMCC N0.6312。保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0010]名稱為 一種乾酪乳桿菌及其在固態發酵中的應用，申請號:200710118485.4。發明涉及一種乾酪乳桿菌及其在固態發酵中的應用。所述乾酪乳桿菌(Lcasei Zhang)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；改菌菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌株保藏中心，保藏號:CGMCC N0.1697。本發明的乾酪乳桿菌(L.caseiZhang)能實現在固態發酵中的應用，特別是作為發酵劑在乳製品、保健食品、微生物飼料以及動物保健製品中的應用；本發明的乾酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，是一種優化固態培養基的方法，能得到較高的菌體密度和菌體存活率；本發明的乾酪乳桿菌固態發酵活菌數是液體MRS發酵活菌數的二十倍以上。
[0011]名稱為一株植物乳桿菌及其高密度培養和凍幹菌株製備的方法，申請號:201210115452.5。本專利設計一株植物乳桿菌及其高密度培養和凍幹菌粉製備的方法。技術方案是:其特徵在於:所述植物乳桿菌(L.plantarum P8)是分離自內蒙古巴彥悼爾市烏拉特中旗傳統發酵乳製品(酸牛奶)中的一株益生菌，具有人工胃液和人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、腸道凝集作用及抑制常見腸道致病菌等特性；該菌菌株已於2011年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCCN0.5468。
[0012]名稱為有效緩解酒精性肝損傷的複合益生菌發酵豆乳飲料及製備方法，申請號:201210005581.9。本發明涉及有效緩解酒精性肝損傷的複合益生菌發酵豆乳飲料，其特徵是配料組成為:大豆乳或大豆粉還原乳300kg、葡萄糖10~15kg、鹿糖100~120kg、穩定劑2~4kg、酸液0.1~0.3kg、食用香精或香料0.1~0.3kg、乾酪乳桿菌(L.casei Zhang)發酵劑0.012~0.03kg、雙歧桿菌(B.1actis V9)發酵劑0.015~0.03kg。所述發酵劑菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號分別為CGMCCN0.5469和CGMCC N0.5470。本發明還公開了其製備方法。

【發明內容】

[0013]本發明的目的在於提供一種益生菌直投劑混菌固態混菌發酵全燕麥而生產三聯M生囷活囷粉劑及其製備方法。
[0014]本發明實現目的技術方案如下:
[0015]一種益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或乾酪乳桿菌Zhang中至少一種，所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發酵基質，所述益生菌活菌粉劑採用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或乾酪乳桿菌Zhang中至少一種經固態發酵製備而得。[0016]三聯益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和乾酪乳桿菌Zhang ;所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發酵基質，所述益生菌活菌粉劑採用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和乾酪乳桿菌Zhang經固態發酵製備而得。
[0017]所述三聯活菌粉劑產品中植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P_8)活菌數不少於1.73X 109CFU/g，乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)的活菌數不少於 4.65 X 109CFU/g，乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數不少於1.73X 108CFU/g。
[0018]一種三聯益生菌活菌粉劑，可由下述方法製得:
[0019]以燕麥全粉和水製得固態培養基，植物乳桿菌P-8、乾酪乳桿菌Zhang直投劑分別按2%-10% (v/w)和2%-12% (v/w)的接種量接種固態培養基培養，pH自然，控制溫度為
34-38°C;固態發酵培養O~16h後將乳雙歧桿菌V9直投劑再按2%_12% (v/w)的接種量接種固態培養基，再混菌固態發酵18_40h，溫度不變，共計培養時間為24-42h ;發酵結束獲得的燕麥固態發酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護劑，真空冷凍乾燥16-28h，最後粉碎、過篩，得到三聯活菌粉劑。
[0020]固態培養基以燕麥全粉(非燕麥精粉，包含燕麥麩皮)為唯一的發酵基質，含水量為40%_70%，不含各種糖類以及添加劑。
[0021]有益效果:
[0022]凍幹後的三聯活菌粉劑產品中同時含有高活性的三種益生菌，其中植物乳桿菌 P-8 (L.plantarum P-8)活菌數不少於 1.73X 109CFU/g,乾酪乳桿菌 Zhang (L.caseiZhang)的活菌數不少於4.65X 109CFU/g，乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數不少於1.73X 108CFU/g ;發明產品中乾酪乳桿菌Zhang和植物乳桿菌P-8主要作用於人體的小腸，乳雙歧桿菌V9主要作用於人體的大腸，從而更好的調理腸道健康。
[0023]而且，燕麥中含有較為豐富的益生元一膳食纖維及葡聚糖等。相比於單菌發酵而言，混菌發酵中膳食纖維的損失偏低；而作為重要益生元的葡聚糖，發酵前後均為3.lg/100g DW，可有效促進益生菌在人體內的增殖。
[0024]而且，初步人體試驗證實:利用三株益生菌混菌固態發酵燕麥製得的三聯活菌粉劑治療腹瀉的效果比對照組顯著。112名(0-15歲者:38名，15-35歲者:23名，35歲以上者:51名)志願者食用三聯活菌粉劑2周的平均治癒率為94.6% ;尤其是對於15-35歲的志願者，腹瀉的治癒率達100%。同時，比已報導的乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)和雙歧桿菌(B.1actis V9)發酵豆乳飲(專利申請號:201210006200.9)的治療效果顯著。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1:含水量對益生菌混菌固態發酵燕麥活菌數的影響
[0026]圖2:直投劑接種量對益生菌混菌固態發酵燕麥活菌數的影響
[0027]圖3:總培養時間對益生菌混菌固態發酵燕麥總活菌數的影響
具體實施方案
[0028]以下將結合具體實施例對本發明的方法進行更具體的描述，但本發明並不限於具體實施例。
[0029]1 植物乳桿菌 P-8 (L.plantarum P-8)、幹釀乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)與乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)混菌固態發酵燕麥，加水量、接種量以及培養時間的確定
[0030](1)加水量的確定
[0031]篩選實例I
[0032]燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉55 ;水45 ;115°C滅菌20min。
[0033]接種與培養條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養溫度37±1°C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0034]測得的總活菌數為3.56X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.82X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 1.74X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 3.71 X 107CFU/g。
[0035]篩選實例2
[0036]燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉50 ;水50 ;115°C滅菌20min。
[0037]接種與培養條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養溫度37±1°C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0038]測得的總活菌數為5.59X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.57X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 3.21 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 8.39X 107CFU/g。
[0039]篩選實例3
[0040]燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉45 ;水55 ;115°C滅菌20min。
[0041]接種與培養條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養溫度37±1°C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0042]測得的總活菌數為3.69X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.60X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 2.08 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 8.33X 107CFU/g。
[0043]篩選實例4
[0044]燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉40 ;水60 ;115°C滅菌20min。
[0045]接種與培養條件:先接種植物乳桿菌P_8(L.plantarum P_8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑，混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，再混菌發酵16h，三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養溫度37±1°C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0046]測得的總活菌數為3.18X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.12X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 1.05 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 7.28X 107CFU/g。
[0047]結果:最佳的加水量為50% (見附圖1)。
[0048](2)接種量的確定
[0049]篩選實例5
[0050]在含水量已優化的固態發酵培養基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發酵16h。
[0051]接種量與培養條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為2%(v/w)，pH自然，培養溫度37 ± I °C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0052]測得的總活菌數為3.59X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.70X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 1.88 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 7.14X 107CFU/g。
[0053]篩選實例6
[0054]在含水量已優化的固態發酵培養基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發酵16h。
[0055]接種量與培養條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為5%(v/w)，pH自然，培養溫度37 ± I °C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0056]測得的總活菌數為5.59X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.57X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 3.21 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 8.39X 107CFU/g。
[0057]篩選實例7
[0058]在含水量已優化的固態發酵培養基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發酵16h。
[0059]接種量與培養條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為8%(v/w)，pH自然，培養溫度37 ± I °C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0060]測得的總活菌數為6.47X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.40X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 5.07 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 1.46X 108CFU/g。
[0061]篩選實例8
[0062]在含水量已優化的固態發酵培養基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，再混菌發酵16h。
[0063]接種量與培養條件:三株乳酸菌直投劑的接種量均為10% (v/w), pH自然，培養溫度37 ± I °C，共計培養24h，對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。
[0064]測得的總活菌數為5.15X 109CFU/g。其中植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.14X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 4.00 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 1.34X 108CFU/g。
[0065]結果:最適的接種量為8% (見附圖2)。
[0066]( 3 )培養時間的確定
[0067]篩選實例9
[0068]在含水量已優化的固態發酵培養基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)和乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)直投劑,混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9(B.1actisV9)直投劑，三株乳酸菌直投劑的接種量均為8% (v/w),pH自然，培養溫度37±1°C，再分別混菌發酵4、10、16、22、28、34h，分別對新鮮曲料中的益生菌活菌數進行檢測。 [0069]結果:最佳培養時間為乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑接種後再混菌發酵28h，即最佳總發酵時間為36h(見附圖3)。此時測得的總活菌數為8.83X 109CFU/g。其中植物乳桿菌 P-8(L.plantarum P-8)活菌數為 2.32X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang(L.caseiZhang)活菌數為 6.25 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 2.61 X IO8CFU/g°
[0070](4)真空冷凍乾燥保護劑的選擇
[0071]篩選實例10
[0072]在上述最佳優化結果的條件下(即篩選實例9)，向混菌固態發酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚異麥芽糖保護劑，攪拌均勻，預凍l_5h後，-70~_50°C進行真空冷凍乾燥，真空度為l_8pa，真空冷凍乾燥16-28h，再進行粉碎。
[0073]測得的總活菌數為1.77X 109CFU/g。植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 6.93X 108CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 9.86 X 108CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 8.72 X 107CFU/g。
[0074]篩選實例11
[0075]在上述最佳優化結果的條件下(即篩選實例9)，向混菌固態發酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚果糖保護劑，攪拌均勻，預凍l_5h後，-70~-50°C進行真空冷凍乾燥，真空度為l_8pa，真空冷凍乾燥16-28h，再進行粉碎。
[0076]測得的總活菌數為1.90X 109CFU/g。植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 8.14X 108CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 9.86 X 108CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 1.02 X 108CFU/g。
[0077]篩選實例12
[0078]在上述最佳優化結果的條件下(即篩選實例9)，向混菌固態發酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護劑，攪拌均勻，預凍l-5h後，-70~-50°c進行真空冷凍乾燥，真空度為l_8pa，真空冷凍乾燥16-28h，再進行粉碎。
[0079]測得的總活菌數為6.55X 109CFU/g。植物乳桿菌P_8 (L.plantarum P-8)活菌數為 1.73X 109CFU/g、乾酪乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 4.65 X 109CFU/g、乳雙歧桿菌 V9 (B.1actis V9)活菌數為 1.73X 108CFU/g。
[0080]結果:保護劑為10%低聚半乳糖時的活菌數最高。
[0081]2 植物乳桿菌 P_8 (L.plantarum P-8)、幹釀乳桿菌 Zhang (L.casei Zhang)與乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌固態發酵燕麥
[0082]篩選實例13
[0083](1)植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)單菌固態發酵燕麥
[0084]通過優化確定植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)單菌固態發酵燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉50 ；7jC 50 ;115°C滅菌20min。
[0085]最佳接種與培養條件:乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)直投劑單菌的接種量為8%(v/w), pH自然，培養溫度37±1°C，培養24h。
[0086]向植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P_8)單菌固態發酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護劑，攪拌均勻，真空冷凍乾燥再進行粉碎，測植物乳桿菌P-8(L.plantarum P-8)的活菌數。
[0087]結果:單菌固態發酵新鮮曲料中植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P_8)的活菌數為1.58X 109CFU/g，添加保護劑冷凍乾燥後植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)的活菌數為
1.04X 109CFU/g。
[0088]篩選實例14
[0089](2)乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)單菌固態發酵燕麥
[0090]通過優化確定乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)單菌固態發酵燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉50 ；7jC 50 ;115°C滅菌20min。
[0091]最佳接種與培養條件:乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)直投劑單菌的接種量為10% (v/w), pH自然，培養溫度37±1°C，培養28h。
[0092]向乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)單菌固態發酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護劑，攪拌均勻，真空冷凍乾燥再進行粉碎，測乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)的活菌數。
[0093]結果:單菌固態發酵新鮮曲料中乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)的活菌數為
6.26 X 109CFU/g,添加保護劑冷凍乾燥後乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)的活菌數為
4.31X109CFU/g。
[0094]篩選實例15
[0095](3)乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌固態發酵燕麥
[0096]通過優化確定乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌固態發酵燕麥固態發酵培養基(%):燕麥全粉40 ;水60 ;115°C滅菌20min。
[0097]最佳接種與培養條件:乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑單菌的接種量為10%(v/w), pH自然，培養溫度37±1°C，培養36h。
[0098]向乳雙歧桿菌V9(B.1actis V9)單菌固態發酵的燕麥全粉新鮮曲料中加入10%的低聚半乳糖保護劑，攪拌均勻，真空冷凍乾燥再進行粉碎，測乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數。
[0099]結果:單菌固態發酵新鮮曲料中乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數為1.22X 108CFU/g，添加保護劑冷凍乾燥後乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數為
7.81X107CFU/g。
[0100]總之，利用三株益生菌直投劑單菌或混菌固態發酵燕麥全粉的對比如表1所示。
[0101]3混菌、單菌發酵前後總膳食纖維、可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維以及β_葡聚糖含量的測定
[0102]篩選實例16
[0103]利用AACC32-07和A0AC995.16法對單菌或混菌發酵前後總膳食纖維、可溶性膳食纖維、不可溶性膳食纖維含量及β_葡聚糖含量進行測定結果見表2。其中，作為重要益生元的β_葡聚糖含量在發酵前後相差不大。
[0104]4人體試驗:三聯活菌粉劑對志願者腹瀉的治療情況
[0105]篩選實例17
[0106]選擇22 4名(0-15歲者:76名，15-35歲者:46名，35歲以上者:102名)腹瀉志願者，實驗組連續食用經三株益生菌混菌固態發酵燕麥製得的三聯活菌粉劑15天；對照組連續食用三株益生菌等比例配比的複合菌粉(直投劑)15天，調查每周平均排便次數，調查結果如表3所示。實驗組職員制食用三聯活菌粉劑10或15天，平均每周排便次數達到正常指標4-9次，且糞便狀態呈現健康人群糞便狀態，證實本產品能有效的治療腹瀉，且比對照組(只食用三株益生菌複合菌粉)的治療效果顯著。
[0107]本實驗以燕麥全粉為原料,和水按一定的配比製成固態培養基，經滅菌後先接種植物乳桿菌P-8 (L.plantarum P-8)直投劑、乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)直投劑一定時間後再接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑進行混進固態發酵，獲得的燕麥固態發酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護劑，真空冷凍乾燥16-28h，最後粉碎、過篩，得到三聯活菌粉劑。通過混菌發酵製備的燕麥複合益生菌粉劑產品中三株益生菌的活菌數優於單菌發酵的活菌數，尤其是乳雙歧桿菌V9(B.1actis V9)，且膳食纖維的損失相對較低，亦提供多樣化的生物活性物質。
[0108]混菌發酵製備的燕麥複合益生菌粉劑中乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)活菌數為 4.65X 109CFU/g，植物乳桿菌 P-8 (L.plantarum P-8)的活菌數為 1.73 X 109CFU/g，乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數為1.73 X 108CFU/g，而乾酪乳桿菌Zhang和植物乳桿菌P-8主要作用於人體的小腸，乳雙歧桿菌V9主要作用於人體的大腸，從而更好的調理腸道健康。再者，燕麥中含有較為豐富的益生元——膳食纖維及β_葡聚糖等，相比於單菌發酵而言，混菌發酵中膳食纖維的損失偏低；而作為重要益生元的葡聚糖，發酵前後均為
3.lg/100g DW，可有效促進益生菌在人體內的增殖。
[0109]並且，初步人體試驗證實三聯活菌粉劑能有效的治療腹瀉，112名志願者食用三聯活菌粉劑2周的平均治癒率為94.6% ;尤其是對於15~35歲的志願者，腹瀉的治癒率達100%。比對照組(只食用三株益生菌複合菌粉)的治療效果顯著；比《營養學報》2011年第33卷第I期報導的雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)單菌的治療效果顯著；也比已報導的乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)和雙歧桿菌(B.1actis V9)發酵豆乳飲(專利申請號:201210006200.9)的治療效果顯著。
[0110]故而，通過乾酪乳桿菌Zhang (L.casei Zhang)、植物乳桿菌P_8 (L.plantarumP-8)和乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑混菌固態發酵燕麥製備的複合益生菌粉中含有多種益生菌、益生元及豐富的賴氨酸、色氨酸、蛋白質等營養物質，且能有效治療腹瀉，有望成為新的功能性、複合益生菌食品。
[0111]表1益生菌單菌或混菌固態發酵燕麥的比較
【權利要求】
1.一種益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或乾酪乳桿菌Zhang中至少一種，所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發酵基質，所述益生菌活菌粉劑採用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8或乾酪乳桿菌Zhang中至少一種經固態發酵製備而得。
2.一種三聯益生菌活菌粉劑，所述益生菌活菌粉劑中含有乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和乾酪乳桿菌Zhang ;所述益生菌活菌粉劑以燕麥全粉為發酵基質，所述益生菌活菌粉劑採用乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8和乾酪乳桿菌Zhang經固態發酵製備而得。
3.根據權利要求1所述三聯益生菌活菌粉劑，其特徵在於，所述三聯活菌粉劑產品中植物乳桿菌P-8 (L.Plantarum P-8)活菌數不少於1.73X 109CFU/g,乾酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)的活菌數不少於4.65 X 109CFU/g,乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)的活菌數不少於 1.73X 108CFU/g。
4.根據權利要求1所述三聯益生菌活菌粉劑，由下述方法製得: 以燕麥全粉和水製得固態培養基，植物乳桿菌P-8、乾酪乳桿菌Zhang直投劑分別按2%-10%(v/w)和2%-12%(v/w)的接種量接種固態培養基培養，pH自然，控制溫度為34_38°C;固態發酵培養O~16h後將乳雙歧桿菌V9直投劑再按2%-12% (v/w)的接種量接種固態培養基，再混菌固態發酵18~40h，溫度不變，共計培養時間為24-42h ;發酵結束獲得的燕麥固態發酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護劑，真空冷凍乾燥16-28h，最後粉碎、過篩，得到三聯活菌粉劑。
5.如權利要求4所述三聯益生菌活菌粉劑的製備方法，其特徵在於，所述固態培養基以燕麥全粉為唯一的發酵基質，含水量為40%-70%。
6.如權利要求1-5所述三聯益生菌活菌粉劑的製備方法，包括如下步驟:以燕麥全粉和水製得固態培養基，植物乳桿菌P-8、乾酪乳桿菌Zhang直投劑分別按2%-10%和2%_12%的接種量接種固態培養基培養，PH自然，控制溫度為34-38°C ;固態發酵培養O~16h後將乳雙歧桿菌V9直投劑再按2%-12%的接種量接種固態培養基，再混菌固態發酵18~40h，共計培養時間為24-42h ;發酵結束獲得的燕麥固態發酵新鮮曲料中添加5%-15%的低聚半乳糖作為保護劑，真空冷凍乾燥16_28h，最後粉碎、過篩，得到三聯活菌粉劑。
7.如權利要求5所述三聯益生菌活菌粉劑的製備方法，包括如下步驟:在燕麥固態發酵培養基中先接種植物乳桿菌P-8 (L.P lantarum P_8)和乾酪乳桿菌Zhang (L.caseiZhang)直投劑，混菌發酵8h後接種乳雙歧桿菌V9 (B.1actis V9)直投劑，三株乳酸菌直投劑的接種量均為8% (v/w),pH自然，培養溫度37±1°C，混菌發酵28h。
【文檔編號】A61K35/74GK103893214SQ201410123174
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2014年3月28日
【發明者】高鵬飛, 張善亭, 姚國強 申請人:北京和美科盛生物技術有限公司