一種快速創製加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法與流程

2023-10-06 21:55:39 3

本發明屬於花葯培養技術領域，尤其涉及一種快速創製加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法。

背景技術：

目前花葯培養已成為辣椒育種的主要技術。近二十年來已經育成了一些優良的辣椒花培品種，如海花三號(李春玲等，1990)、海豐12號(刑永萍等，2002)、海豐26號(刑永萍等，2003)、海豐14號(張樹根等，2003)、海豐25號(張樹根等，2008)、海豐16號(刑永萍等，2014)、海豐1052(張樹根等，2015)和海豐391(張樹根等，2015)等。通過花葯培養技術1～2年即可獲得純合的二倍體材料，可以加快育種進程，縮短育種所需年限(陳曉等，2003；袁麗等，2011)。分子標記輔助選擇(molecular assisted selection，MAS)的準確性高、不受辣椒生育期等的影響，在辣椒育種中得到了廣泛應用。近年來，研究人員利用MAS和花葯培養技術相結合的方法在水稻中製備了一些優良育種材料(王興春等，2004；於鳳池等，2010；袁麗等，2011；宋丁丁，2011)。育種實踐中加工型辣椒CMS優良恢復系較少，傳統育種選育加工型辣椒CMS恢復系費時費工。因此利用花葯培養和MAS相結合的方法快速創製加工型辣CMS育性恢復材料成為育種工作者需要亟待解決的首要問題，但該方法在加工型辣椒材料創製中尚未相關報導。

綜上所述，育種實踐中加工型辣椒CMS優良恢復系較少，傳統育種選育加工型辣椒CMS恢復系費時費工。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種快速創製加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法，旨在解決育種實踐中加工型辣椒CMS優良恢復系較少，傳統育種選育加工型辣椒CMS恢復系費時費工的問題。

本發明是這樣實現的，一種加工型辣椒花葯培養的方法，所述加工型辣椒花葯的培養方法包括以下步驟：

步驟一，辣椒植株在26.4±0.4℃溫度條件下，進行辣椒花葯培養；

步驟二，辣椒單倍體培養選擇處於單核靠邊期的小孢子用於誘導胚狀體發生；

步驟三，花蕾在4℃冰箱中低溫預處理1-3d；之後在無菌條件下將供試花蕾在70％酒精中浸泡30s後再0.1％升汞中浸泡7min，用無菌水衝洗3-4次，接種到MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO34mg/L+活性炭0.4％的培養基上，pH 5.8；接種密度為直徑100mm培養皿接種8個花蕾；

步驟四，接種花葯到將接種好的花葯置於35℃恆溫培養箱中處理7d；然後在白天溫度28℃，夜晚溫度為20℃的組培室中繼續培養；

步驟五，選擇根尖生長旺盛的植株，從每株取小於2cm的根5-6條，蒸餾水漂洗後，飽和對二氯苯溶液中處理3.5h，卡諾氏固定液固定2h，蒸餾水衝洗3-4次，0.2M鹽酸處理5min，蒸餾水衝洗3-4次，45％冰乙酸溶液處理5min，卡寶染色20min，製片，顯微鏡下觀察，尋找處於細胞分裂中期，染色體分散的細胞，計數；

步驟六，胚狀體在培養基中成苗約4-5cm高時，需要進行移栽，移栽前需對花培植株試管苗進行煉苗。

進一步，所述誘導培養基為：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂+AgNO34mg/L+活性炭0.4％的培養基上，pH5.8；生根培養基為：MS+0.2mg/L NAA+蔗糖3％+瓊脂0.7％的培養基上，pH5.8。

進一步，所述煉苗包括：

(1)閉瓶強光煉苗：將花培植株試管苗的培養瓶移到室外進行強光閉瓶煉苗7d；

(2)開瓶強光煉苗：將培養瓶封口膜打開，在自然光下開瓶煉苗5-7d；

(3)花培植株試管苗的移栽：試管苗要用鑷子小心的從培養基中移出，洗乾淨根部後移入基質中；蓋上塑料薄膜保持溼度；花培植株先移至自然光下光照，再開瓶適應溼度；

(4)露地條件煉苗：幼苗長出新葉、新根後即可移至露地條件下，進行定植前的適應性鍛鍊；長出2-3片新葉時，即可定植。

進一步，所述移栽的基質按照體積比為腐殖質：蛭石＝4:1。

本發明的另一目的在於提供一種利用所述加工型辣椒花葯培養方法進行辣椒單倍體培養。

本發明的另一目的在於提供一種利用所述加工型辣椒花葯培養技術創製加工型辣椒CMS恢復系材料。

進一步，所述加工型辣椒細胞質雄性不育恢復系的構建方法包括以下步驟：

(1)F2群體由恢復系812和優良親本940雜交配製而成；用分子標記輔助選擇在F2群體中篩選含有恢復基因Rf的單株進行花葯培養；

(2)利用篩選到的CRF-SCAR標記篩選F2群體中含恢復基因的單株進行花葯培養，進而用該標記鑑定花培再生株DH系是否含有恢復基因Rf，CRF-SCAR上遊引物序列為：5′-GTACACACCACTCGTCGCTCCT-3′，下遊引物序列為：5′-TTCTTGGGTCCCTTTCTTCCAA-3′；

(3)辣椒葉片DNA採用CTAB法進行提取；含5×PCR緩衝液4μL、25mmol/LMgCl2溶液1.2μL、dNTP溶液1.6μL、33ng/μL上下遊引物各2.0μL、2U/μLTaq聚合酶0.5μL、ddH2O 7μL和模板DNA 1.0μL；

(4)在工作檯上用70％酒精浸泡30s，之後用0.1％HgCL2消毒7min，無菌水漂洗4次，然後放在無菌濾紙上瀝乾水；在無菌條件下接種於胚狀體誘導培養基，9mm×9mm培養皿接6個花蕾的花葯，37℃高溫預處理5d。

進一步，所述胚狀體誘導培養基為MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO34mg/L+活性炭0.4％。

本發明提供的快速創製加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法，創製加工型辣椒(CMS)恢復系材料，採用優勢性狀互補，恢復基因供體加工型辣椒恢復系812和重慶市農科院近年選育的優良自交系940作親本，對其F2進行花葯培養；通過分子標記輔助選擇對花培再生株系進行恢復基因Rf的篩選，利用花葯培養與分子標記輔助選擇將Rf快速導入到自交系940中，加速製備加工型辣椒CMS育性恢復資源；便於辣椒科研工作者更有效地展開辣椒花葯培養工作，掌握取材花蕾形態指標，減少操作環節，保證花葯培養效率。本發明為快速製備加工型辣椒胞質雄性不育(CMS)恢復系材料，利用分子標記輔助選擇和花葯培養相結合的方法將完全恢復的恢復系812的恢復基因Rf導入自交系940，製備含恢復基因的新種質；對其中含Rf的5個花培二代苗系(DH)與不育系83-3A進行測交，結果表明，測交株系均表現恢復，且測交株系的恢復株率均為100％。本發明結合花葯培養和分子標記輔助育種可以達到快速有效育種的目的；為快速製備加工型辣椒CMS恢復系材料，利用分子標記輔助選擇和花葯培養相結合的方法將完全恢復的恢復系812的恢復基因Rf導入自交系940，製備含恢復基因的新種質；對其中含Rf的5個花培二代苗系(DH)與不育系83-3A進行測交，結果表明，測交株系均表現恢復，且測交株系的恢復株率均為100％。本發明說明結合花葯培養和分子標記輔助育種可以達到快速有效地為育種實踐創製優異育種資源的目的。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的加工型辣椒花葯培養方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的加工型辣椒F2群體的分子標記檢測示意圖；

圖中:M:DL5000；1:恢復系812；2:不育系83-3A；3～18:加工型辣椒F2單株。

圖3是本發明實施例提供的CRF-SCAR標記在加工型辣椒DH系中的擴增示意圖；

圖中:M:DM2000；1:不育系83-3A；2:恢復系812；3～8:DH系編號。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的加工型辣椒花葯的培養方法包括以下步驟：

S101：辣椒植株在26.4±0.4℃溫度條件下，進行辣椒花葯培養；

S102：辣椒單倍體培養選擇處於單核靠邊期的小孢子用於誘導胚狀體發生；

S103：花蕾在4℃冰箱中低溫預處理1-3d；之後在無菌條件下將供試花蕾在70％酒精中浸泡30s後再0.1％升汞中浸泡7min，用無菌水衝洗3-4次，接種到MS+BA0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO34mg/L+活性炭0.4％，pH5.8；接種密度為直徑100mm培養皿接種8個花蕾；

S104：接種花葯到將接種好的花葯置於35℃恆溫培養箱中處理7d；然後在白天溫度28℃，夜晚溫度為20℃的組培室中繼續培養；

S105，選擇根尖生長旺盛的植株，從每株取小於2cm的根5-6條，蒸餾水漂洗後，飽和對二氯苯溶液中處理3.5h，卡諾氏固定液固定2h，蒸餾水衝洗3-4次，0.2M鹽酸處理5min，蒸餾水衝洗3-4次，45％冰乙酸溶液處理5min，卡寶染色20min，製片，顯微鏡下觀察，尋找處於細胞分裂中期，染色體分散的細胞，計數；

S106：胚狀體在培養基中成苗約4-5cm高時，需要進行移栽，移栽前需對花培植株試管苗進行煉苗。

在步驟S106中：

煉苗可分為4歩進行：(1)閉瓶強光煉苗：將花培植株試管苗的培養瓶移到室外進行強光閉瓶煉苗7d；(2)開瓶強光煉苗：將培養瓶封口膜打開，在自然光下開瓶煉苗5-7d。(3)花培植株試管苗的移栽：試管苗要用鑷子小心的從培養基中移出，洗乾淨根部後移入基質中。蓋上塑料薄膜保持溼度。花培植株先移至自然光下一段時間適應光照，再開瓶適應溼度，可使幼苗根系發達，移栽成活率達90％以上。(4)露地條件煉苗：幼苗長出新葉、新根後即可移至露地條件下，進行定植前的適應性鍛鍊。長出2-3片新葉時，即可定植。

移栽基質為腐殖質：蛭石＝4:1(體積比)，移栽前先將花培植株移至自然光下一段時間適應光照，再開瓶蓋適應溼度，避免在移栽過程中出現萎蔫現象，使其逐步長出適應自然環境的表皮結構、新葉與新根。在溫水中洗淨培養基，移入基質後，澆足定根水。

下面結合具體實施例對本發明的應用效果作詳細的描述。

實施例1

1結果與分析

1.1花葯培養供體植株的篩選

以加工型辣椒恢復系812為父本，優良自交系940為母本，利用分子標記輔助選擇和雜交技術構建F2群體，然後用分子標記CRF-SCAR篩選含有恢復基因Rf的單株，本試驗共篩選出16個單株含Rf，用其作為花葯培養的供試材料(圖2)。

1.2花培再生植株的獲得與鑑定

2014年5-7月在重慶市農科院生物技術研究中心逆境農業研究重慶市重點實驗室對含恢復基因Rf的16個單株共接種130皿，約3200枚花葯，獲得胚狀體34個，誘導率1.06％。其中成苗21株，成苗率為61.76％，但是當年加倍後僅有6份收到種子，暫定名為DH-1、DH-2、DH-3、DH-4、DH-5、DH-6，次年按照苗系在重慶市農科院基地種植。

用CRF-SCAR標記對6個DH系植株基因組DNA進行PCR擴增鑑定，除DH-1沒有擴增出特異條帶，表現為條帶缺失，不含恢復基因Rf，其餘5個DH系均能擴增出條帶大小為870bp的特異條帶，與恢復系812帶型一致(圖3)。

1.3花培再生植株對83-3A的恢復性

2015年用83-3A不育系作母本，用6個DH系作父本，測交了各組合花培DH系的恢復性。2016年夏季將所得到的測交一代種子種於重慶市農科院基地種植，調查其花粉育性(表1)。除了83-3A×DH-1雜交組合測交株系沒有恢復株系，其餘雜交組合的花培後代測交株系均有可恢復株，且測交株系的恢復株率均為100％(表1)。其與分子標記輔助選擇結果一致。

表1測交花培後代對83-3A的恢復性

1.4利用花葯培養技術選育的3個優良恢復系

種植於基地的5個花培植株DH系，株系田間表現農藝性狀一致，表明這5份材料已純合穩定。進行田間農藝性狀調查和成熟後取樣考種(表2)。綜合田間農藝性狀和分子標記輔助選擇，選育出3個農藝性狀好的DH系恢復材料，均為完全恢復的恢復系。其中DH-3植株的株型緊湊，果面光滑，中早熟；DH-5果實直，果面光滑，抗性強；DH-6植株掛多，果面光滑，較早熟。

表25個恢復系的農藝性狀性狀表現

2在過去的二十多年，花葯培養在辣椒育種中得到較為廣泛的應用。用花葯培養技術製備加工型辣椒優良恢復系，可以在2～3年內選育出恢復系，相比較常規方法的5-7年，節省了篩選恢復系需要的人力、物力和財力。這與在小麥K型雄性不育恢復系選育上的結果一致。大部分研究中花葯培養供體親本都是選擇F1代。經花葯培養獲得的再生苗系差異較大，這與需要培育性狀穩定的育種目標不符。

在本試驗中，用於構建花培供體親本的F2群體恢復系親本812為完全恢復的恢復系，且用CRF-SCAR分子標記輔助選擇的方法提前對花培供體親本F2群體進行恢復基因篩選，所用花培供體親本均為含Rf的植株，分子標記輔助選擇和6個DH系與83-3A的測交後代育性均表明，選育的6個DH系選中有5個DH係為恢復系。結合田間農藝性狀，認為選育出了3個DH系性狀比較優良，可以作為育種材料，用於新組合配製。可見，通過分子標記輔助選擇與花葯培養相結合的方法，可以高效地製備新的加工型辣椒恢復系材料。

因此，本發明認為利用分子標記輔助選擇與花葯培養相結合的方法，既能快速篩選目的基因，又可以使選育的苗系更加符合育種目標。育種工作者可將其作為製備特殊優異育種材料的一個重要手段。

3材料與方法

3.1材料與設計

所用F2群體由恢復系812和優良親本940雜交配製而成。812是由重慶市農業科學院蔬菜花卉研究所辣椒室多年來製備的優良恢復系，果形為長牛角形；940為本發明室多年選育的優良自交系，果形為細牛角形。用分子標記輔助選擇在F2群體中篩選含有恢復基因Rf的單株進行花葯培養。

3.2分子標記

利用已篩選到的CRF-SCAR標記篩選F2群體中含恢復基因的單株進行花葯培養，進而用該標記鑑定花培再生株DH系是否含有恢復基因Rf，CRF-SCAR上遊引物序列為：5′-GTACACACCACTCGTCGCTCCT-3′，下遊引物序列為：5′-TTCTTGGGTCCCTTTCTTCCAA-3′。

3.3分子標記檢測

本發明中，辣椒葉片DNA採用CTAB法進行提取。含5×PCR緩衝液4μL、25mmol/LMgCl2溶液1.2μL、dNTP溶液1.6μL、33ng/μL上下遊引物各2.0μL、2U/μLTaq聚合酶(鼎國生物)0.5μL、ddH2O 7μL和模板DNA 1.0μL。

3.4花葯培養方法

2014年春季在重慶市農業科學院試驗基地，上午9點前在目標單株上取處於單核靠邊期的花蕾置於冰盒中，帶回實驗室。在超淨工作檯上用70％酒精浸泡30s，之後用0.1％HgCL2消毒7min，無菌水漂洗4次，然後放在無菌濾紙上瀝乾水。在無菌條件下接種於胚狀體誘導培養基(MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO34mg/L+活性炭0.4％)，9mm×9mm培養皿接6個花蕾的花葯，37℃高溫預處理5d。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。