一種龍血竭誘導劑及其製備方法
2023-10-06 15:45:29 1
專利名稱：一種龍血竭誘導劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種龍血竭誘導劑及其製備方法。
背景技術：
血竭為珍稀名貴中藥，具有活血化瘀、消腫止痛，收斂止血，生肌斂瘡、補血之功效，常用於各種血症，被喻為「和血之聖藥」(見《本草綱目》)。血竭最初來源於西域，近代來自東南亞的蘇門達臘。七十年代，中國科學院西雙版納熱帶植物園的蔡希陶教授在雲南南部發現了產生血竭的植物資源——劍葉龍血樹(Dracaena cochinchinensis)，並通過植物化學和藥理學研究，開發出國產血竭，稱為龍血竭。實驗證明國產龍血竭與《本草綱目》中所記載的由西域來的血竭(dragon’s blood)最為接近，完全可以作為東南亞進口血竭的國產替代用品。我國現有龍血竭生產企業十餘家，以劍葉龍血樹含脂木為原料生產的血竭藥物多達60多種，年產值達5億多元。
在自然狀態下，劍葉龍血樹因雷電、風暴及植食性動物啃食而損傷後，由於微生物的侵入而產生出的防衛性化合物，即為龍血竭。但該過程十分緩慢，往往長達數十年乃至上百年，很難滿足日益增長的市場需求。目前，對劍葉龍血樹共生真菌及其與龍血竭形成的關係僅有少量的初步探討，雖提出了利用真菌誘導龍血竭產生的假說，但現有技術中尚未見有龍血竭誘導微生物的分離培養及製劑方法成功的報導。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種龍血竭誘導劑，通過人工誘導的方法加速龍血竭的形成，提高劍葉龍血樹的栽培效益，保證龍血竭規模化生產的原料供應。
本發明的另一目的在於提供一種所述龍血竭誘導劑的製備方法。
本發明提供了一種龍血竭誘導劑，該誘導劑由以下方法製備獲得將野生劍葉龍血樹活體莖幹上正在形成血竭的部位割下，經消毒、培養、分離和鑑定後得到龍血竭誘導菌株，並在4℃下保藏備用。該菌株現保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，學名鑑定為Fusariumculmorum，菌株命名為龍血竭誘導菌株Brwg，保藏編號為CGMCC No 1621，保藏日期2006年2月20日。將劍葉龍血樹的新鮮莖幹風乾後，粉碎成60～100目的粉末備用。將100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.1份瓊脂和0.1份劍葉龍血樹莖幹組織粉末攪拌均勻，製成菌株培養液，消毒後備用。將龍血竭誘導菌株置於活化培養基中使其活化。將活化的龍血竭誘導菌株加入上述菌株培養液中培養，在每1000ml的培養液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恆溫和280～320r/min下振蕩培養7～10天後，得到每毫升含0.1～0.3g菌絲的具有活性的龍血竭誘導菌株懸浮液體，將其裝瓶即得龍血竭誘導劑。
所述的活化培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。
所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的重量份配比為馬鈴薯汁20，葡萄糖2，瓊脂1.5和蒸餾水76.5。
本發明提供了一種龍血竭誘導劑的製備方法，該方法由以下步驟組成1、龍血竭誘導真菌的採樣和分離培養將野生劍葉龍血樹活體莖幹上正在形成血竭的部位割下，經消毒、培養、分離和鑑定後得到龍血竭誘導菌株，並在4℃下保藏備用；2、菌株培養液的製作將劍葉龍血樹的新鮮莖幹風乾後，粉碎成60～100目的粉末備用。將100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.1份瓊脂和0.1份劍葉龍血樹莖幹組織粉末攪拌均勻，製成菌株培養液，消毒後備用；3、菌株的活化將龍血竭誘導菌株置於活化培養基中使其活化；4、龍血竭誘導劑的製作將活化的龍血竭誘導菌株加入上述菌株培養液中培養，在每1000ml的培養液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恆溫和280～320r/min下振蕩培養7～10天後，得到每毫升含0.1～0.3g菌絲的具有活性的龍血竭誘導菌株懸浮液體，將其裝瓶即得龍血竭誘導劑。
步驟3所述的活化培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。
所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的重量份配比為馬鈴薯汁20，葡萄糖2，瓊脂1.5和蒸餾水76.5。
迄今為止，龍血竭的開發和利用都是依靠野生劍葉龍血樹的採集，不僅價格昂貴，而且供應量也無法保證。應用本發明，能夠極大地縮短龍血竭的形成時間，提高劍葉龍血樹的栽培效益，保證龍血竭規模化生產的原料供應，而且在幫助山區農民脫貧致富的同時也保護了生態環境。其方法簡便、成本低廉，具有良好的市場應用前景。
保藏生物材料的說明本發明涉及的龍血竭誘導菌株現保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，學名鑑定為Fusarium culmorum，菌株命名為龍血竭誘導菌株Brwg，保藏編號為CGMCC No 1621，保藏日期2006年2月20日。
圖1為劍葉龍血樹正在形成龍血竭的莖幹組織和內生的真菌樣品；圖2為劍葉龍血樹內生真菌的分離培養情況；圖3為龍血竭誘導菌株Brwg(Fusarium culmorum)樣品；圖4為龍血竭誘導劑樣品。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明，但它們不是對本發明的限定。
實施例1將野生劍葉龍血樹活體莖幹上正在形成血竭的部位割下，用0.1％升汞(HgCl2)進行5分鐘的表面消毒和6次蒸餾水漂洗；在超淨工作檯上將消毒後的劍葉龍血樹組織切成0.8×0.5×0.3釐米的小塊後，放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(20％馬鈴薯之汁，2％葡萄糖和1.5％瓊脂，其餘為蒸餾水)中培養；經分離、鑑定真菌後得到龍血竭誘導菌株Brwg(Fusarium culmorum)，並在4℃下保藏備用。將劍葉龍血樹的新鮮莖幹風乾後，粉碎成80目的粉末備用。將100份蒸餾水溶液、20份馬鈴薯之汁、2份葡萄糖、0.1份瓊脂和0.1份劍葉龍血樹莖幹組織粉末攪拌均勻，製成菌株培養液，消毒後備用；將龍血竭誘導菌株置於活化培養基(20％馬鈴薯之汁，2％葡萄糖和1.5％瓊脂，其餘為蒸餾水)中，使其活化。將活化的龍血竭誘導菌株Brwg(Fusariumculmorum)加入上述菌株培養液中培養，每1000ml培養液中放入1g菌絲體，在無光照、26℃恆溫和300r/min下振蕩培養9天後，得到每毫升含0.1～0.3g菌絲的具有活性的龍血竭誘導菌株懸浮液體，將其裝瓶即得龍血竭誘導劑。龍血竭誘導劑為活性菌株，需儘快使用，在室溫下可保持活力7天，在4℃下可保持活力3個月。
實施例2重複實施例1，有以下不同點每1000ml培養液中放入0.5g菌絲體，在無光照、25℃恆溫和280r/min下振蕩培養10天。
實施例3重複實施例1，有以下不同點每1000ml培養液中放入1.5g菌絲體，在無光照、27℃恆溫和320r/min下振蕩培養7天。
實施例4重複實施例1，有以下不同點劍葉龍血樹莖幹組織粉末為60目。
實施例5重複實施例1，有以下不同點劍葉龍血樹莖幹組織粉末為100目。
權利要求
1.一種龍血竭誘導劑，該誘導劑由以下方法製備獲得將野生劍葉龍血樹活體莖幹上正在形成血竭的部位割下，經消毒、培養、分離和鑑定後得到龍血竭誘導菌株，並在4℃下保藏備用；將劍葉龍血樹的新鮮莖幹風乾後，粉碎成60～100目的粉末備用；將100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.1份瓊脂和0.1份劍葉龍血樹莖幹組織粉末攪拌均勻，製成菌株培養液，消毒後備用；將龍血竭誘導菌株置於活化培養基中使其活化；將活化的龍血竭誘導菌株加入上述菌株培養液中培養，在每1000ml的培養液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恆溫和280～320r/min下振蕩培養7～10天後，得到每毫升含0.1～0.3g菌絲的具有活性的龍血竭誘導菌株懸浮液體，將其裝瓶即得龍血竭誘導劑。
2.權利要求1所述龍血竭誘導劑的製備方法，該方法由以下步驟組成(1)龍血竭誘導真菌的採樣和分離培養將野生劍葉龍血樹活體莖幹上正在形成血竭的部位割下，經消毒、培養、分離和鑑定後得到龍血竭誘導菌株，並在4℃下保藏備用；(2)菌株培養液的製作將劍葉龍血樹的新鮮莖幹風乾後，粉碎成60～100目的粉末備用；將100份蒸餾水、20份馬鈴薯汁、2份葡萄糖、0.1份瓊脂和0.1份劍葉龍血樹莖幹組織粉末攪拌均勻，製成菌株培養液，消毒後備用；(3)菌株的活化將龍血竭誘導菌株置於活化培養基中使其活化；(4)龍血竭誘導劑的製作將活化的龍血竭誘導菌株加入上述菌株培養液中培養，在每1000ml的培養液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恆溫和280～320r/min下振蕩培養7～10天後，得到每毫升含0.1～0.3g菌絲的具有活性的龍血竭誘導菌株懸浮液體，將其裝瓶即得龍血竭誘導劑。
3.根據權利要求1或2所述的龍血竭誘導劑，其特徵在於所述的活化培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。
4.根據權利要求3所述的龍血竭誘導劑，其特徵在於所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的重量份配比為馬鈴薯汁20，葡萄糖2，瓊脂1.5和蒸餾水76.5。
全文摘要
本發明公開了一種龍血竭誘導劑及其製備方法。將野生劍葉龍血樹活體莖幹上正在形成血竭的部位割下，經消毒、培養、分離和鑑定後得到龍血竭誘導菌株，在每1000ml的菌株培養液中放入0.5～1.5g的菌絲體，在無光照、25～27℃恆溫和280～320r/min下振蕩培養7～10天後，得到具有活性的龍血竭誘導菌株懸浮液體，將其裝瓶即得龍血竭誘導劑。本發明方法簡便，能夠顯著縮短龍血竭的形成時間，提高劍葉龍血樹的栽培效益，具有良好的市場應用前景。
文檔編號C12N5/04GK1821387SQ20061001073
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月9日 優先權日2006年3月9日
發明者宋啟示, 楊曉虹, 陳定芳 申請人:中國科學院西雙版納熱帶植物園