氮雜胞苷類似物及其用途的製作方法

2023-10-31 04:15:32 1

專利名稱：氮雜胞苷類似物及其用途的製作方法
技術領域：
本申請涉及氮雜胞苷類似物及其用途。
背景技術：
核苷類似物是作為DNA和RNA構建模塊的天然核苷的衍生物，其在臨床上可有效 治療人癌症或病毒性疾病，但是在早些年，這些化合物是作為抗結核藥被評價的。這些化合 物已經註冊上市有40多年，目前大約有35種產品在日常使用。下表1中所示的天然核苷 由兩類氮鹼基即嘌呤(以腺嘌呤和鳥嘌呤為例)和嘧啶(以胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶為 例)以及單糖核糖或脫氧核糖構成。

天然核苷均以下述式A中所示的所謂3-D構型存在。糖環上氮鹼基和羥基甲基側鏈均位於所述糖環平面的同側(順式)。
式 A為了獲得具有抗癌或抗病毒活性的核苷衍生物，已經對氮鹼基和/或單糖進行了 化學修飾。例如，在氮鹼基中添加滷素原子或其它官能團、插入其它氮原子或者在單糖環中 進行立體化學變化將核糖變成阿拉伯糖或者除去羥基變成脫氧核糖可得到具有潛在治療 益處的產品。在許多產品中，所述單糖環被保留下來，而在另一些產品中，所述糖環被變成 鏈。核苷類似物是小分子，易於具有極好的水溶性。由於AIDS世界範圍內流行而導致的對核苷類似物領域進行的廣泛研究和開發的 努力促進了對作用機制的基本認識和了解，由於化學修飾等引起活性性能的改變也與癌症 治療領域相關。就現今疑難疾病的治療而言，包括核苷類似物在內的許多藥物的普遍缺點是活性 低、特異性差。一些這些問題可能與藥物物質本身的固有活性有關，一些可能與某些耐藥機 制(患者固有的或在治療過程中獲得的，例如在癌症治療中的多藥耐藥(MDR))有關。一些 問題可能與某些差的轉運或細胞吸收和活化機制有關。一些問題可能與藥物的快速失活和 /或排洩有關。核苷類似物的效力在很大程度上取決於其模擬天然核苷的能力，從而與病毒和/ 或細胞酶相互作用並且幹擾或抑制核酸代謝的關鍵過程。為了發揮其抗病毒或抗癌活性， 必須通過病毒和/或細胞激酶作用將核苷類似物經由其單磷酸酯和二磷酸酯形式轉變為 其相應的三磷酸酯形式。一般來說，所述三磷酸酯形式是活性劑，但對於某些產品例如吉西 他濱而言，甚至二磷酸酯形式就可發揮顯著的臨床效果。在經腸或經胃腸外施用後，為了到達患病、癌變或病毒感染的細胞或組織，核苷類 似物應當具有有利的藥代動力學特徵。除了所施用藥物被快速排洩以外，許多核苷類似物 可在血流和組織中失活。例如，胞嘧啶衍生物即使在單磷酸水平上也可通過一類稱為脫氨 酶的酶的作用而快速脫氨基變成無活性的尿嘧啶類似物。許多核苷類似物的細胞吸收和由 此良好的療效強烈取決於膜結合核苷轉運蛋白(稱為富集和平衡型核苷轉運蛋白)。因此， 已經在尋找不依賴於這些特異性吸收機制的化合物。但是，另一個活性限制因素(尤其在 抗癌領域內)是細胞修復機制。當抗癌核苷類似物單磷酸酯被摻入到細胞DNA內時，其應 當不被癌細胞DNA除去，這是由於與p53蛋白有關的核酸外切酶活性造成的。然而，為了限 製藥物的副作用，除去健康細胞DNA中的核苷類似物是有利的。過去數年中，已經開發出了許多核苷類似物，其在很大程度上克服了一些或許多 活性限制特徵。例如，阿昔洛韋(ACV)可作為具有高特異性的化合物的例子給出。ACV單 磷酸酯僅可通過病毒激酶形成，這意味著ACV在未感染細胞內不能被活化。儘管如此，但是 ACV並不是特別有活性的產品。為了避開核苷類似物活化中常見的限速步驟即在細胞內形成核苷類似物單磷酸酯，已經開發出了幾種膦酸酯，例如西多福韋或者甚至單磷酸酯產品。 為了促進口服吸收或保證在機體內有利的藥物處置，已製備了獨特的前藥，例如阿德福韋 酉旨(Hepsera)。除了對核苷類似物進行結構改變以促進提高臨床應用以外，還進行了進一步修 飾以提高活性。存在幾個通過添加脂質部分得到的修飾核苷類似物的實例(美國專利 Nos. 6，153，594,6, 548，486,6, 316，425 和 6，384，019 ；歐洲專利申請 Nos. EP-A-56265 和 EP-A-393920以及W099/26958)。這可通過例如通過酯鍵、醯胺鍵、碳酸酯鍵或氨基甲酸酯 鍵連接脂肪酸來實現。可製備更複雜的產品，例如核苷類似物的磷脂衍生物。參見Eur J Pharm Sci lib Suppl 2 15-27 (2000)；歐洲專利No. 545966 ；加拿大專利No. 2468099 以及 美國專利Nos. 6，372，725和6，670，341。這些類似物被描述為具有抗病毒活性，尤其適用於 治療和預防由DNA、RNA或逆轉錄病毒引起的感染。它們還適用於治療惡性腫瘤。核苷類似 物的脂質衍生物可用於幾種用途。它們可被看作是前藥，這些前藥不是脫氨酶的底物，從而 保護核苷類似物在血流中的轉運過程中免於失活。所述脂質衍生物還可更有效地轉運透過 細胞膜，從而提高核苷類似物的細胞內濃度。脂質衍生物還可更適於用在皮膚製劑、口服產 品(參見美國專利No. 6，576，636和W0 01/18013)或特定劑型(例如設計用於靶向腫瘤的 脂質體)(參見美國專利No. 5，223，263)中。已經證明，就具有保守3-D構型的單糖環的核苷類似物或具有非環狀側鏈的核 苷類似物而言，可通過形成單不飽和《-9C18和C20脂肪酸的脂質衍生物而最有效地提高
夕舌個生。AntimicrobialAgents and Chemotherapy, Vol. ,53-61(1999)； Cancer Research 59 =2944-2949(1999) ；Gene Therapy, 5 419-426(1998) ；Antiviral Research, 45 157-167 (2000)以及 Biochemical Pharmacology，67 :503_511 (2004)。優選 的單不飽和衍生物不僅比多不飽和衍生物活性更好，而且更容易結晶並且對脂質鏈氧化的 化學穩定性更高。因此，從化學品和藥物製備的觀點來看，它們是更有利的化合物。還證明， 單不飽和《-9C18和C20脂肪酸適於提高大量非核苷生物活性化合物的治療活性(參見歐 洲專利 No. 0977725)。核苷類似物的一個相對新的亞類是所謂的氮雜胞苷(aza-C)衍生物。在此類化合 物中，嘧啶鹼基中5位上的CH基團與氮原子交換，如下文式B所示。 被DNA異常甲基化導致沉默的腫瘤抑制基因是這些新化療劑再活化的潛在靶標。 DNA甲基化的強效抑制劑和抗白血病藥即氮雜胞苷和5-氮雜-2』-脫氧胞苷衍生物(5-氮 雜-C，5-氮雜-CdR，地西他濱)可使沉默的腫瘤抑制基因再活化。在高濃度下，化合物是細 胞毒性的，但是在濃度較低時，低甲基化導致細胞系分化。所述化合物需要通過脫氧胞苷激 酶進行代謝活化，產生對DNA甲基轉移酶的抑制。這些衍生物治療潛力的一個障礙是它們 在體內被胞苷脫氨酶(CD)快速失活。在水溶液中的不穩定性以及其副作用譜限制了其臨床活性。本發明涉及克服現有技術中這些和其它缺點。

發明內容
本發明的一個方面涉及式(I)化合物或其可藥用鹽 其中R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，是 其中橫虛線表示禮與式(I)分子相連所形成的鍵，&和民獨立地是0H或H，前提 是R2和R3不同時是0H，R4是H、R5C (0)、R5CH20C (0)或R5CH2NHC (0)，前提是R和R4不同時是 H，R5 具有通式 CH3- (CH2) n- (CH = CH-CH2) m_CH = CH_ (CH2) k- ；k 是 0-7 的整數；m 是 0-2 的整 數；n是0-10的整數。本發明的另一個方面涉及含有式(I)化合物和可藥用賦形劑、稀釋劑和/或載體 的藥物組合物。本發明的又一個方面涉及治療對象的腫瘤性病症的方法。所述方法包括選擇患有 腫瘤性病症的對象，以及在有效治療所述對象中所述腫瘤性病症的條件下向所述對象施用 上文所述的式(I)化合物或其可藥用鹽。本發明的又一個方面涉及治療對象的炎性病症的方法。所述方法包括選擇患有炎 性病症的對象，以及在有效治療所述對象中所述炎性病症的條件下向所述對象施用上文所 述的式(I)化合物或其可藥用鹽。Aza-C在緩衝液和血漿中的不穩定性是眾所周知的(參見lsraili等，Cancer Research 36,1453-1461 (1976) ；Rudek 等，J Clin Oncol，23 17，3906-3911 (2005)； Rustum 等，J Chromat，421 12，387-91 (1987) ；Zhao 等，J Chromat B，813，81-88 (2004)，其 全部內容均在此通過弓I用併入本文)。據報導Aza-C在臨床血漿樣品中的平均終末半衰期為 1. 50士2. 30 小時(參見 Rudek 等，J Clin Oncol, 23 17，3906-3911 (2005)，其全部內容 在此通過引用併入本文)。在體外，即使在-60°C下貯存，4. 5天後損失20%的Aza-C，當在 室溫下貯存時，在0. 5小時內損失10% (參見Zhao等，JChromat B，813，81-88 (2004)，其全 部內容在此通過引用併入本文)。認為Aza-C的主要不穩定性是由於5-氮雜-嘧啶環快速 開環(第一個步驟是可逆的)並且隨後進行甲酸消除引起的(參見Chan等，J Pharma Sci, 68;7，807-12(1979)，其全部內容在此通過引用併入本文)。認為其它降解途徑是4位氨基 進行脫氨並且糖苷鍵水解得到D-核糖和5-氮雜胞嘧啶。出乎意料地發現優選的Aza-C脂 質衍生物具有比Aza-C本身顯著更好的血漿穩定性特性。在室溫和實驗條件下，所述化合 物在空白人血漿基質中穩定(初始化合物的剩餘百分率> 94% )至少4小時，在血漿蛋白 質沉澱後，於提取後上清中未觀察到明顯的降解產物。還考察了優選的脂質化合物在37°C 下貯存時的血漿穩定性。表明當脂質側鏈連接到Aza-C上時，該化合物Aza-部分的開環或 其它降解顯著降低。Aza-C的快速降解是Aza_C臨床應用的一個缺點。相對於Aza_C本身而言，脂質衍 生物的血漿穩定性提高，可使脂質衍生物的患者血漿水平高且持久。首先，這可導致所述藥 物具有比Aza-C本身更好的組織/器官/腫瘤分布，細胞更好地暴露於所述藥物並且藥物 吸收更好，其次，在Aza-C-5』 -酯鍵於細胞內水解後，腫瘤細胞DNA更好地暴露於Aza_C。通過對氮雜胞苷和脫氧胞苷(例如5-氮雜-2』 _脫氧胞苷)進行修飾，本發明 的實施方案產生了具有出乎意料地不同於氮雜胞苷和脫氧胞苷(例如5-氮雜-2』 -脫氧 胞苷)的性能的新分子。這產生了一系列活性遠遠超出氮雜胞苷和脫氧胞苷(例如5-氮 雜_2』 -脫氧胞苷)抗癌活性的化合物，所述氮雜胞苷和脫氧胞苷(例如5-氮雜-2』 -脫 氧胞苷)的抗癌活性局限於血液惡性腫瘤。這些新化合物對許多實體瘤包括乳癌和宮頸癌 具有抗癌效力。所述化合物還出乎意料地對治療抗性(treatmentresistant)癌症具有活 性，因此可提供在當前治療選擇受限的實體瘤中進行治療的優點。本發明的實施方案具有 治療用途，以治療選擇和效力有限的癌症以及滿足未能滿足的需求。在有限的暴露之後，這些化合物表現出活性起效較早，因此，在臨床上可僅在短期 治療後有效。與母藥相比，這將使得治療暴露更短、更不頻繁並且降低了與藥物相關的毒 性。這將提供提高的治療指數。添加脂質(包括酯、醯胺、氨基甲酸酯和碳酸酯)成分的結構改變保留了氮唑胞苷 環，並因此保留了分子對表觀遺傳學機制的影響。表觀遺傳學調節為改變癌症和炎症中的 基因表達提供了重要的機制。這些新化合物在低於氮雜胞苷的濃度下具有活性，因此更有 效。活性譜改變的這些化合物可調節實體瘤和炎性疾病中的表觀遺傳學靶標。表觀遺傳學機制在促炎性狀態中是重要的，所述促炎性狀態包括但不限於肺、結 締組織、胃腸道和脈管系統的炎性狀態。這些化合物通過靶向表觀遺傳學機制可減少或逆 轉引起這些疾病的炎性過程。


圖1是顯示Aza-c和5-AZa-C_5』 -巖芹酸的細胞毒性活性與時間之關係的圖。
具體實施例方式本發明的一個方面涉及式(I)化合物或其可藥用鹽 其中R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，是 其中橫虛線表示禮與式(I)分子相連所形成的鍵，&和民獨立地是0H或H，前提 是R2和R3不同時是0H，R4是H、R5C (0)、R5CH20C (0)或R5CH2NHC (0)，前提是R和R4不同時是 H，R5 具有通式 CH3- (CH2) n- (CH = CH-CH2) m_CH = CH_ (CH2) k- ；k 是 0-7 的整數；m 是 0-2 的整 數；n是0-10的整數。在優選的實施方案中，k是4，n是10。在某些實施方案中，隊是 其中橫虛線表示禮與式(I)分子相連所形成的鍵。在某些實施方案中，R4可以是 H。在某些實施方案中，R是R5C(0)，k是4，m是0，n是10，R2是H，R3是0H，R4是H。本發明的更廣泛的方面涉及式(I) 』化合物或其可藥用鹽

其中 R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，是
nhr4 其中橫虛線表示禮與式(I)，分子相連所形成的鍵，R2和R3獨立地是0H或H，前 提是R2和R3不同時是0H，R4是H、R5C (0)、R5CH20C (0)或R5CH2NHC (0)，前提是R和R4不同時
是H，R5是C3-C26烯基。在式(I)』化合物的一個優選實施方案中，k是4，n是10。在某些實施方案中，隊 是 其中橫虛線表示禮與式(I)』分子相連所形成的鍵。在一些實施方案中，R4可以 是H。在另一些實施方案中，R是R5C(0)，k是4，m是0，n是10，&是11，R3是0H。在某些 實施方案中，&是(9-(26烯基。本發明的另一個方面涉及含有式(I)化合物和可藥用賦形劑、稀釋劑和/或載體 的藥物組合物。本發明的藥劑可口服施用，胃腸外施用，例如，皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、通過鼻 內吸入或施用於黏膜如鼻黏膜、咽喉黏膜和支氣管黏膜。它們可單獨施用或與合適的藥用 載體一起施用，可以是固體或液體形式，例如片劑、膠囊劑、粉末劑、溶液劑、混懸劑或乳劑。本發明的活性劑可口服施用，例如與惰性稀釋劑或與可吸收的可食用載體一起施 用，或者可將其裝在硬殼或軟殼膠囊內，或者可將其壓成片劑，或者可將其直接摻入膳食食 物中。就口服治療性施用而言，可在這些活性劑中摻入賦形劑，並以片劑、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑等形式使用。這種組合物和製劑應當含有至少0.1%的活性劑。當然，這些組 合物中藥劑的百分數可變化，其可便利地為所述單位的重量的約2% -約60%。這種治療 有用的組合物中活性劑的量使得可獲得合適的劑量。製備本發明的優選組合物使得口服劑 量單位含有約l_250mg的活性劑。片劑、膠囊劑等還可含有粘合劑，例如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形 劑，例如磷酸氫鈣；崩解劑，例如玉米澱粉，馬鈴薯澱粉、藻酸；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；以及 甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精。當所述劑量單位形式是膠囊劑時，除了上述類型的物質外， 其還可包含液體載體，例如脂肪油。多種其它物質可作為包衣劑存在或用於改變劑量單位的物理形式。例如，片劑可 用蟲膠、糖或者蟲膠與糖二者進行包衣。除了活性成分以外，糖漿劑可包含作為甜味劑的蔗 糖、作為防腐劑的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、染料和香精例如櫻桃或橙子香精。這些活性劑還可胃腸外施用。可在水中適當地混合表面活性劑例如羥丙基纖維素 來製備這些活性劑的溶液或混懸劑。還可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物中在油中製備 分散體。示例性的油是石油，動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油或礦物油。一 般而言，水、鹽水、右旋糖水溶液和相關的糖溶液以及二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是優 選的液體載體，尤其是用於注射溶液。在常規貯存和使用條件下，這些製劑包含防腐劑以防 止微生物生長。適於注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體或用於臨時製備無菌注射溶 液或分散體的無菌粉末。在所有情形下，所述形式都必須是無菌的並且其流動程度必須達 到易於注射。其在生產和貯存條件下必須穩定，並且必須在不受微生物例如細菌和真菌的 汙染作用下保存。所述載體可以是溶劑或者含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 和液體聚乙二醇)、其合適混合物以及植物油的分散介質。本發明的藥劑還可以以氣霧劑形式直接施用於氣道。就作為氣霧劑使用而言，在 溶液或混懸液中的本發明藥劑可與合適的拋射劑(例如碳氫化合物拋射劑，如丙烷、丁烷 或異丁烷)以及常規輔助劑一起包裝在密閉氣霧劑容器中。本發明的物質還可以在非加壓 形式(例如噴霧器或霧化器)中施用。本發明的又一個方面涉及治療對象的腫瘤性病症的方法。所述方法包括選擇患有 腫瘤性病症的對象，以及在有效治療所述對象中的所述腫瘤性病症的條件下向所述對象施 用上文所述的式(I)化合物或其可藥用鹽。在某些實施方案中，所述腫瘤性病症是癌性疾病。所述癌性疾病可以是實體瘤或 血液癌或惡性腫瘤。所述癌性疾病可以是白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤或骨髓增生異常綜 合徵。在某些實施方案中，所述實體瘤可以是組織的癌症，所述組織為例如乳房、卵巢、 前列腺、腦、膀胱和肺組織。本發明的又一個方面涉及治療對象的炎性病症的方法。所述方法包括選擇患有炎 性病症的對象，以及在有效治療所述對象中所述炎性病症的條件下向所述對象施用上文所 述的式(I)化合物或其可藥用鹽。在某些實施方案中，所述炎性病症是肺、結締組織、胃腸道或脈管系統的炎性狀 態。
除非另有定義，否則本申請中所用的科技術語應當具有本領域普通技術人員通常 理解的意義。此外，除非上下文中另有要求，否則未限定具體數量的術語具有「一個或多個」 的含義。實施例實施例1 試劑、細胞系和細胞培養細胞增殖試劑WST-1 得自 Roche Applied Science (Manheim, Germany)，PI 和 Annexin V-FITC 細胞凋亡試劑盒購自 BD Biosciences, Palo Alto，CA、5-氮雜胞苷 (5-AzaC)、溴化乙啶(EB)、吖啶橙(AO)、硝基藍四氮唑(NBT)、佛波醇_12_豆蔻酸酯-13-乙 酸酯(TPA)購自 SigmaChemical Co (St. Lous，M0)。人早幼粒細胞白血病細胞系HL60、人組織細胞淋巴瘤U937、人慢性髓細胞白血病 K562、人急性T細胞Jurkat、乳腺癌MCF-7、膀胱癌5637、前列腺癌DU-145購自American Type Culture Collection。除Jurkat以外的所有細胞系均維持在37°C、5% C02氣氛下的 RPMI 1640培養基(Gibco，Glasgow. UK)中，所述RPMI 1640培養基添加有10%熱滅活胎 牛血清(FCS)、100U/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素。Jurkat細胞培養在RPMI 1640培養基 中，所述RPMI 1640培養基添加有1. 5g/L碳酸氫鈉、4. 5g/L葡萄糖、10mM丙酮酸鈉和10% FCSU00U/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素。實施例2 細胞毒性測定基於活細胞中線粒體脫氫酶斷裂四唑鹽WST-l(4-[3_(4-碘代苯基)-2-(4_硝基 苯基)-2H-5-四唑啉基]-1，3-苯二磺酸鹽)，通過比色檢測法測定5-氮雜胞苷脂質的細胞 毒性。將細胞以 1 X 106/ml (HL60 細胞)或 1. 25X 105/ml (U937、K562 和 Jurkat)的初始濃 度接種在96孔平底微量板中的培養基中並培養24-72小時，所述培養基含有或不含有不同 濃度的5-氮雜胞苷脂質。將MCF-7、DU-145和5637細胞(lX104/ml)鋪板並使其貼壁鋪 展24小時。加入不同濃度的5-氮雜胞苷脂質，再維持培養24-72小時。將培養物與WST-1 試劑一起孵育1小時。利用酶標儀(Bio-Tek Instruments, Elx 800)於450nm(參比波長 為650nm)測量甲臢的產生。測定相比於未處理細胞的生長抑制(％)。利用CalcuSyn軟 件(Biosoft)計算 IC5Q 值。實施例3 凋亡細胞的定量採用形態學標準和利用Armexin V-FITC染色後的螢光激活細胞分選(FACS)鑑定 凋亡細胞。就形態學分析而言，將含有100 u g/ml AO和100 u g/ml EB的1 yl儲備液加到 25 yl細胞懸液中。藉助螢光顯微鏡分析凋亡細胞和凋亡體。計數總共300個細胞後，計算 凋亡細胞的百分率。就FACS分析而言，用PBS清洗2 X 105至5 X 106個細胞，然後根據製造 商提供的Armexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書，利用ArmexinV-FICS和碘化丙啶(PI) 在結合培養基的試劑中標記所述細胞。在FACSCAN(Becton Dickinson, San Jose，CA)上分 別於518nm和620nm處檢測FITC和PI的螢光信號。Annexin V-FITC螢光的對數值顯示在 X軸上，PI螢光的對數值顯示在Y軸上。通過CellQuest程序(Becton Dickinson)分析數 據。對於每個分析來說，記錄10000個細胞事件。實施例4 細胞周期通過離心沉澱細胞，用PBS清洗兩次，用70% (v/v)冷乙醇(_20°C )固定並於4°C 貯存至少24小時。在PBS中清洗細胞。將細胞團塊用PI/RNA酶染色溶液染色。將細胞混
14懸液於黑暗中在室溫下孵育30分鐘。利用FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson, Mount View, CA)測定DNA含量。利用DNA柱形圖擬合程序(Becton Dickinson)測定處於 細胞周期中亞Gl、Gp S和G2ZM期細胞的百分數。每個樣品最少記錄10000個事件。實施例5 :Aza-C-5 』-巖芹酸酯的合成將巖芹酸(1. 75mmol,494mg)溶解在甲苯(3ml)中。加入DMF(10 μ 1)，然後於室溫 下用10分鐘加入草醯氯(3. 6mmol,457mg)。3小時後，真空下除去甲苯。 將六2&-((1.57讓01，42711^)混懸在DMA(6ml)中，加入 HCl (1M，在 Et2O 中，2. Ommol， 2. Oml)，5分鐘後在室溫下於真空中除去Et20。將所得混濁溶液於冰水浴中冷卻，用40分 鍾加入溶解在DMA(2ml)中的醯氯。攪拌反應混合物過夜，同時溫度慢慢達到室溫。24小時 後，在大約0. Imbar下除去溶劑。將殘留物在飽和碳酸氫鈉水溶液和乙酸乙酯(各25ml) 之間分配。水相用乙酸乙酯萃取(3X25ml)。合併有機相，用鹽水清洗，乾燥(MgSO4)。真空 下除去溶劑後，將粗產物(600mg)通過快速色譜(Si02，CH2Cl2以及2. 5%、5%和10% MeOH) 純化。最後，在大約0. 25mbar下乾燥產物過夜。產率210mg(24% )。實施例6 :Aza-C-5'-反式巖芹酸酯的合成將反式巖芹酸(petroselaidicacid) (1. 77mmol, 500mg)溶解在甲苯(3ml)中。力口 入DMF (10 μ 1)，然後於室溫下用10分鐘加入草醯氯(3. 6mmol，457mg)。3小時後，真空下除
去甲苯。將六2&-((1.75讓01，42711^)混懸在DMA(6ml)中，加入 HCl (1M，在 Et2O 中，2. Ommol， 2. 0ml)，5分鐘後在室溫下於真空中除去Et20。將所得混濁溶液於冰水浴中冷卻，用2小 時加入溶解在DMA(2ml)中的醯氯。攪拌反應混合物過夜，同時溫度慢慢達到室溫，然後 在30°C加熱2小時。冷卻至室溫後，將所得殘留物在飽和碳酸氫鈉水溶液和乙酸乙酯(各 25ml)之間分配。水相用乙酸乙酯萃取(3X25ml)。合併有機相，用水和鹽水清洗，乾燥 (MgSO4) 0真空下除去溶劑後，得到酯，為白色粉末。產率500mg。實施例7 :5-Aza-5'-巖芹酸酯在合併人血漿中的代謝穩定性將5種濃度水平(分別為0. 1、1、3、10以及30 μ M)的5-Aza-C-5，-巖芹酸酯加 到混合的人血漿中。將混合物在37°C下於搖動的水浴中孵育。在設定的孵育時間(0、15、 30、60和120分鐘)取等量份(100 μ 1)的孵育溶液一式三份(η = 3)，用含有0. 甲酸 (300 μ 1)的乙腈立即沉澱血漿蛋白。用測試化合物和Aza-C在測試緩衝液(PBS，ρΗ 7.4) 中以一個孵育濃度(IyM)製備陰性對照。離心後，將上清直接用於LC-MS-MS分析。參見 表1。 表 1實施例8 :Aza-C和5-Aza-C_5，-巖芹酸的細胞毒性在乳腺癌細胞系MT-3和阿黴素(adriablastin)抗性細胞系MT-3/ADR中測定 Aza-C和5-Aza-C-5，-巖芹酸的細胞毒性。MT-3/ADR過量表達MDR-1/p-糖蛋白。將細胞接 種在96孔板中含有2mM穀氨酸鹽和10% FBS的RPMI 1640培養基中，其中每孔含有5 X 103 個細胞。將所述細胞孵育24小時。將測試化合物溶解在DMS0中並在使用前在培養基中進 一步稀釋。每個測試濃度使用6個孔。將細胞與測試化合物一起孵育24小時。將20 yl新 鮮製備的MTT溶液加到每個孔中並孵育4小時。由根據0. 01 ii M至100 ii M的8個不同濃 度繪圖得到的生長曲線來測定IC50值。結果示於表1中。在MT-3乳腺癌細胞系中，Aza-C 和5-Aza-C-5』 -巖芹酸的活性相似，但是在MT-3/ADR抗性細胞系中，Aza-C的活性喪失。 在所測試的高達100 u M的濃度下未觀察到活性，而5-Aza-C-5』-巖芹酸在抗性細胞系與非 抗性MT-3細胞系中均保持活性，具有相似的IC50值。參見表2。 表2實施例9 Aza-C和5-Aza-C-5』 -巖芹酸的抗增殖活性在Hela突變宮頸癌細胞系中在暴露24小時和72小時時測定Aza_C和 5-Aza-C-5，-巖芹酸的抗增殖活性。將細胞接種在96孔板中含有2mM穀氨醯胺和10% FBS 的RPMI 1640培養基中，其中每孔含有5X 103個細胞。將所述細胞孵育24和72小時。將 測試化合物溶解在DMS0中並在使用前在培養基中進一步稀釋。每個測試濃度使用6個孔。 利用MTT法測定細胞毒性。將20 yl新鮮製備的MTT溶液加到每個孔中並孵育4小時。由根 據0. 01 y M至100 y M的8個不同濃度繪圖得到的生長曲線來測定IC50值。長期暴露於兩 種化合物72小時得到相似的細胞毒活性，但是出乎意料地，暴露24小時後，5-Aza-C-5』-巖 芹酸的細胞毒作用已經存在。觀察到Aza-C和5-Aza-C-5』 -巖芹酸具有不同的時間曲線，其中5-Aza-C-5』 -巖芹酸的細胞毒作用快速出現。參見圖1。
實施例10 核苷轉運蛋白抑制對Aza-C和5-Aza-C-5』-巖芹酸在癌細胞中的細胞 毒活性的影響評價了核苷轉運蛋白抑制對Aza-C和5-Aza-C-5，-巖芹酸在癌細胞中的細胞毒性 活性的影響。雙嘧達莫用作平衡型核苷轉運蛋白hENTl和hENT2的抑制劑。將細胞接種在 96孔板中含有2mM穀氨醯胺和10% FBS的RPMI 1640培養基中，其中每孔含有5 X IO3個 細胞。將所述細胞預先孵育24小時。在加入測試化合物之前30分鐘，將雙嘧達莫(10 μ M) 加到所述細胞中。將測試化合物溶解在DMSO中並在使用前在培養基中進一步稀釋。每個 測試濃度使用6個孔。將所述細胞與測試化合物一起孵育72小時。將20 μ 1新鮮製備的 MTT溶液加到每個孔中並孵育4小時。由根據0. 01 μ M到100 μ M的8個不同濃度繪圖得到 的生長曲線來測定IC50值。結果示於表3中。加入核苷轉運抑制劑雙嘧達莫使Aza-C的 活性降低3倍，表明Aza-C在Hela細胞中的流入和流出部分取決於核苷轉運蛋白hENTl和 hENT2。當利用雙嘧達莫阻滯核苷轉運蛋白hENTl和hENT2時，5-Aza-C-5，-巖芹酸的細胞 毒活性不但得以維持而且提高了 10倍。這可能對於其中由於缺少核苷轉運蛋白的表達而 造成Aza-C無活性的患者尤其重要。參見表3。
Aza-C和5-Aza-C-5，-巖芹酸在舍有或 不含有核苷轉運抑制劑雙嘧達莫的He Ia 宮頸癌細胞中的細胞毒活性 表3實施例11 利用氮雜胞苷或5-Aza-C-5』-巖芹酸處理後乳腺癌細胞系中雌激素受 體β (ERβ)的基因表達通過定量實時PCR(TaqMan)測定了雌激素受體β的基因表達(在RNA水平上測 定)。MCF-7乳腺癌細胞在缺乏雌激素的培養基(不含酚紅的RPMI，含有2%穀氨醯胺和 10%炭-右旋糖酐處理的胎牛血清)中培養。將細胞接種在25cm2的培養瓶中並貼壁24小 時，然後用ΙμΜ氮雜胞苷或5-Aza-C-5』 -巖芹酸處理。包括一個未處理的對照作為對照。 暴露於所述化合物5天後收穫細胞，通過胰蛋白酶消化來收穫細胞，將其清洗並快速冷凍 在液氮中。從約IO6個快速冷凍的MCF-7細胞中提取總RNA，測量所述RNA的濃度和純度，利 用TaqMan反轉錄試劑(N808-0234)將RNA轉錄成cDNA。利用標準方案和預混PCR試劑進 行實時定量。引物-探針混合物購自Applied Biosystems,ER^ (ID Hs00230957_ml)和管 家基因羥甲基原膽色烷合成酶HMBS (ID Hs00609297_ml)。利用比較Δ-ACt法計算基因表 達。暴露於5-Aza-C-5』 -巖芹酸後，誘導ERi3表達升高4. 14倍，而暴露於氮雜胞苷後僅 僅升高2. 51倍，參見表4。這可能與其中激素敏感性可被恢復的激素難治療性腫瘤高度相 關，參見表4。


雖然本文中已經詳細地描述和敘述了優選的實施方案，但是對於相關領域技術人員顯而易見的是，可在不背離本發明精神的情況下進行各種改動、增加、替換等，並且因此 這些改動、增加、替換等被認為包含在下述權利要求中所定義的本發明範圍內。
權利要求
式(I)化合物或其可藥用鹽其中R是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)，R1是其中橫虛線表示R1與式(I)分子相連所形成的鍵；R2和R3獨立地是OH或H，前提是R2和R3不同時是OH；R4是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)，前提是R和R4不同時是H；以及R5具有通式CH3-(CH2)n-(CH＝CH-CH2)m-CH＝CH-(CH2)k-；k是0-7的整數；m是0-2的整數；以及n是0-10的整數。FPA00001068276200011.tif,FPA00001068276200012.tif
2.權利要求1的化合物，其中k是4。
3.權利要求2的化合物，其中n是10。
4.權利要求1的化合物，其中隊是
5.權利要求4的化合物，其中R4是H。
6.權利要求1的化合物，其中R是R5C(0)，是 R2是H，R3是0H，R4是H，k是4，m是0以及n是10。
7.—種藥物組合物，其含有權利要求1的化合物和可藥用賦形劑、稀釋劑和/或載體。
8.一種治療對象的腫瘤性病症的方法，所述方法包括 選擇患有腫瘤性病症的對象，以及在有效治療所述對象中所述腫瘤性病症的條件下向所述對象施用下式化合物或其可 藥用鹽 其中，R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)； 隊是 其中橫虛線表示禮與式(I)分子相連所形成的鍵；R2和R3獨立地是0H或H，前提是R2和R3不同時是0H ；R4 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，前提是 R 和 R4 不同時是 H ；以及R5 具有通式 CH3-(CH2)n-(CH = CH-CH2)m-CH = CH-(CH2)k-；k是0-7的整數；m是0-2的整數；以及n是0-10的整數。
9.權利要求8的方法，其中所述腫瘤性病症是癌性疾病。
10.權利要求9的方法，其中所述癌性疾病是實體瘤或血液癌或惡性腫瘤。
11.權利要求9的方法，其中所述癌性疾病是白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤或或骨髓 增生異常症候群。
12.權利要求10的方法，其中所述實體瘤是選自乳房、卵巢、前列腺、腦、膀胱和肺的組 織的癌症。
13.權利要求8的方法，其中k是4。
14.權利要求13的方法，其中n是10。
15.權利要求8的方法，其中隊是
16.權利要求15的方法，其中R4是H。
17.權利要求8的方法，其中R是 R2是H，R3是0H，R4是H，k是4，m是0以及n是10。
18. 一種治療對象炎性病症的方法，所述方法包括 選擇患有炎性病症的對象，以及在有效治療所述對象中所述炎性病症的條件下向所述對象施用下式化合物或其可藥 用4k 其中，R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)； 隊是 其中橫虛線表示R1與式(I)分子相連所形成的鍵；R2和R3獨立地是OH或H，前提是R2和R3不同時是OH ；R4 是 H、R5C (0)、R5CH2OC (0)或 R5CH2NHC (0)，前提是 R 和 R4 不同時是 H ；以及R5 是 C3-C26 烯基，其中 R5 具有通式 CH3-(CH2)n-(CH = CH-CH2) m_CH = CH-(CH2)k-；k是0-7的整數；m是0-2的整數；以及η是0-10的整數。
19.權利要求18的方法，其中所述炎性病症是肺、結締組織、胃腸道或脈管系統的炎性 狀態。
20.權利要求18的方法，其中k是4。
21.權利要求20的方法，其中η是10。
22.權利要求18的方法，其中R1是
23.權利要求22的方法，其中R4是H。
24.權利要求18的方法，其中R是R5C(O)，R1是 R2是H，R3是0Η，R4是H，k是4，m是0以及η是10。
全文摘要
本發明涉及如下的式(I)化合物或其可藥用鹽其中R是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)；R1是其中橫虛線表示R1與式(I)分子相連所形成的鍵；R2和R3獨立地是OH或H，前提是R2和R3不同時是OH；R4是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)，前提是R和R4不同時是H；R5具有通式CH3-(CH2)n-(CH＝CH-CH2)m-CH＝CH-(CH2)K-；k是0-7的整數；m是0-2的整數；n是0-10的整數。本發明還公開了製備和使用這些化合物的方法。
文檔編號A01N43/04GK101877964SQ200880108555
公開日2010年11月3日 申請日期2008年9月25日 優先權日2007年9月26日
發明者劉易斯·西爾弗曼, 奧勒·亨利克·埃裡克森, 芬恩·米倫, 詹姆斯·霍蘭, 馬裡特·利蘭·桑德沃爾德 申請人:西乃山醫學院;克拉維斯製藥股份有限公司