白細胞介素抗體在製備子宮內膜異位症藥物組合物中的用途的製作方法

2023-10-11 05:15:09 2

本發明屬醫藥技術領域，涉及白細胞介素抗體新的藥用用途，具體涉及白細胞介素是il-10和il-17抗體用於製備治療子宮內膜異位症(內異症)藥物組合物中的用途。經體外實驗和體內動物試驗顯示，重組il-10和il-17a蛋白明顯促進子宮內膜間質細胞(esc)生長和侵襲；il-10和il-17a中和性抗體藥物組合顯著抑制異位灶的生長。進一步可用於製備治療內異症的藥物。

背景技術：
：

現有技術公開了子宮內膜異位症(簡稱內異症，endometriosis，ems)是一種常見的婦科疾病，表現為子宮內膜出現在子宮腔以外的其他部位(如卵巢、腹膜等)。所述異位的內膜組織在卵巢激素的變化影響下發生周期性出血，伴有周圍纖維組織增生和粘連形成，進而形成子宮內膜異位症的異位病灶(簡稱異位灶)。據who統計全球ems發病人數超過1.76億人，在育齡女性中的發病率約為10％～15％。研究顯示，ems雖為良性病變，但卻有增生、種植浸潤、轉移及復發等惡性行為，使之成為難治之症。臨床實踐顯示，患者多呈現漸進性加重的盆腔纖維化、粘連、疼痛及不孕(約30～50％的ems患者繼發不孕)，以致嚴重影響廣大女性的身心健康和生活質量，乃至整個家庭和社會的和諧。雖然歷經近一個半世紀的研究，目前對於ems的發病機制仍有太多的未解之謎。藥物和手術治療仍是目前主要的治療措施，但是復發仍是一個令業內困惑的問題。因此，深入解析內異症的發病機制將為業內更好的理解這種疾病並找到更有效的治療措施奠定基礎，對提高婦女健康素質和整個家庭和社會的健康和諧具有重要的戰略意義。

子宮內膜的經血逆流學說是最為人們所公認的學說，然而，經血逆流發生在大多數婦女的月經周期中，卻只有10％～15％的婦女罹患ems；有研究顯示子宮內膜間質細胞(esc)內在異常與ems相關，包括基因異常表達，內膜對激素的反應，增高的神經密度以及氧化應激；在正常的情況下，逆流至盆腔的子宮內膜被機體的免疫系統識別為「異物」所清除了，而在ems患者的盆腹腔內，局部的免疫微環境很可能發生 了改變，免疫細胞功能異常不僅不能夠有效的清除異位的子宮內膜細胞，甚至幫助其在異位種植、生長；因此，近年來越來越多的證據顯示ems患者盆腹腔局部免疫微環境異常在ems的發生和發展中扮演了不可或缺的作用，尤其是異位灶中各種免疫細胞以及產生的細胞因子。

研究積累的證據表明，th17細胞在各種自身免疫性疾病以及過敏性炎症性疾病中發揮關鍵作用；近來有研究研究提示il-10+th17細胞具有調節功能。

基於現有技術的現狀，本申請的發明人擬通過實驗研究評估拮抗il-10+th17細胞兩個關鍵功能分子il-10和il-17在治療ems中的潛在價值，提供白細胞介素il-10和il-17抗體用於製備治療子宮內膜異位症(內異症)藥物組合物中的用途，為ems的臨床治療提供新方法和新思路。

技術實現要素：

本發明的目的是提供白細胞介素抗體新的藥用用途，具體涉及白細胞介素是il-10和il-17抗體用於製備治療子宮內膜異位症(內異症)藥物組合物中的用途。

本發明中通過評估il-10和il-17中和性抗體在體外實驗和ems動物模型中的抗ems內膜esc生長和侵襲中的活性；提供了一種白細胞介素是il-10和il-17抗體用於製備治療ems的藥物組合物中的用途。

基於本發明前期的研究發現，ems患者腹腔液存在高水平th17細胞及il-17a，iii-iv期患者有更高水平il-10及其il-10+th17細胞，提示隨疾病進展，呈促炎和耐受並存並偏向耐受的過程；本發明進行了體外實驗和體內動物試驗，結果顯示，重組il-10和il-17a蛋白明顯促進子宮內膜間質細胞(esc)生長和侵襲；il-10和il-17a中和性抗體藥物組合顯著抑制異位灶的生長；該藥物組合進一步可用於製備治療內異症的藥物。

具體的，本發明的公開了一種通過聯合拮抗細胞因子il-10和il-17a的生物學作用，進而發揮抗ems內膜esc生長和侵襲力，可用於製備治療ems的藥物。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

收集對照和ems患者腹腔液，結果顯示ems患者腹腔液存在高水平th17細胞 及il-17a，iii-iv期患者有更高水平il-10及其il-10+th17細胞(如圖1所示)；通過體外試驗顯示，重組人il-17a蛋白(10ng/ml，r&d公司)明顯促進esc的活力、抑制其凋亡，並促進其增殖(如圖2所示)，尤其是ems患者的異位灶內膜esc；進一步研究分析，結果顯示，重組人il-10蛋白(10ng/ml，r&d公司)可放大il-17a對esc生長的促進作用(如圖3所示)；聯合應用抗人il-10(5ug/ml，r&d公司)和il-17的中和性抗體(5ug/ml，r&d公司)明顯抑制th17細胞對共培養的esc細胞生長和侵襲的促進效應(如圖4所示)；進一步，本發明構建ems小鼠模型(如圖5所示)，腹腔注射抗鼠il-10中和性抗體(5ug/ml，r&d公司)和或後抗鼠il-17a中和性抗體(5ug/ml，r&d公司)，結果顯示，相對於對照組，單獨il-10抗體注射組和單獨il-17a抗體注射組小鼠異位灶體積均明顯縮小(如圖5所示)；聯合應用抗鼠il-10和il-17a抗體注射組小鼠異位灶體積縮小最為顯著(如圖5所示)。

本發明提供了il-10和il-17抗體用於治療ems藥物的用途；尤其是經體外實驗和動物實驗證實，聯合應用il-10和il-17中和性抗體均顯著抑制esc生長和侵襲及其異位灶大小，進一步，所述的白細胞介素是il-10和il-17抗體可用於製備治療子宮內膜異位症(內異症)藥物組合物。

附圖說明

圖1是il-10、il-17和il10+th17細胞在ems患者腹腔液中的表達，

其中，ctrl:對照組腹腔液，

s(i-ii)：i-ii期內異症患者腹腔液，

s(iii-iv)：i-ii期內異症患者腹腔液，

mfi:平均螢光密度，

*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001；ns:無顯著差異。

圖2是il-17a蛋白促進esc的體外生長和侵襲，

其中，rhil-17a：重組人il-17a蛋白，

normalescs：正常子宮內膜esc，

eutopicescs:ems患者在位子宮內膜esc，

ectopicescs:ems患者異位灶內膜esc，

其中，cellinvasionindexofescs：esc侵襲力指數(5個隨機視野下平均細胞數量)，以對照組為100，各組侵襲力指數＝100*實驗組平均esc數量/對照組平均esc數量；*p<0.05and**p<0.01；ns:無顯著差異；originalmagnification:×200.。

圖3是il-10蛋白放大il-17a對esc生長的促進作用，

其中，il-10：重組人il-10蛋白處理組，

il-17a：重組人il-17a蛋白處理組，

il-10+il-17a：聯合應用重組人il-10和il-17a蛋白處理組，

*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001；ns:無顯著差異，originalmagnification:×100或×400.。

圖4是il-10和il-17抗體顯著抑制th17細胞對esc細胞生長和侵襲的促進作用，

其中，ctrl:單獨esc組，

th17:體外誘導分化的th17細胞與esc共培養組，

α-il-10：抗人il-10中和性抗體，

α-il-17：抗人il-17中和性抗體，

th17+α-il-10：th17細胞與esc共培養+抗人il-10中和性抗體組，

th17+α-il-17：th17細胞與esc共培養+抗人il-17中和性抗體組，

th17+α-il-10+α-il-17：th17細胞與esc共培養+抗人il-10中和性抗體+抗人il-17中和性抗體組，*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001。

圖5是聯合應用il-10和il-17a抗體顯著抑制ems模型小鼠異位灶生長，

其中，ctrl：對照組ems模型小鼠，

α-il-10：抗鼠il-10中和性抗體處理組，

α-il-17a：抗鼠il-17a中和性抗體處理組，

α-il-10+α-il-17：抗鼠il-10中和性抗體+抗鼠il-17a中和性抗體處理組。

具體實施方式

實施例1分析ems患者腹腔液中il-10、il-17和il10+th17細胞水平

首先採用cba(bd公司)法檢測，結果顯示，相對於對照組，在ems(i-ii期)，即疾病初期，促炎性細胞因子il-17a明顯升高；但是在ems(iii-iv期)，即疾病後期抗炎細胞因子il-10明顯升高(如圖1a所示)；隨後用流式細胞術(流式抗體均購自於biolegend公司)檢測，結果顯示，i-ii期ems患者腹腔液il-17a水平顯著升高，但是隨著疾病進展，無進一步升高的趨勢，但iii-iv期患者有更高水平il-10+th17細胞(如圖1b,1c所示)。

實施例2體外實驗證實阻斷il-10和il-17明顯抑制th17細胞對esc增殖和侵襲的促進作用

1)il-17a蛋白促進esc的體外生長和侵襲

收集對照內膜組織、ems患者在位子宮內膜和異位灶內膜組織，通過iv膠原酶(sigma)消化並原代分離培養esc，然後用重組人il-17a蛋白刺激48小時後，分別用cck8(東仁化學公司)法、annexinv-fitc/pi雙染(invitrogen公司)法和matrigel(bd公司)侵襲試驗檢測esc的細胞活力(如圖圖2a所示)、凋亡(如圖2b所示)和侵襲力(如圖2c,2d所示)，結果顯示，重組人il-17a明顯促進esc活力、抑制其凋亡並促進其侵襲；

2)il-10蛋白放大il-17a對esc生長的促進作用試驗

用重組人il-10、il-17a或者聯合應用il-10和il-17蛋白處理esc48小時，同上法檢測esc的細胞活力、凋亡和侵襲力((如圖3a、3b、3c所示)，結果顯示單獨il-10蛋白具有促進esc活力、抑制其凋亡，並促進其侵襲；此外，重組人il-10蛋白顯著放大il-17a對esc細胞活力和凋亡的調節作用，但對esc侵襲力的調節無進一步放大效應；

3)il-10和il-17抗體顯著抑制th17細胞對esc細胞生長和侵襲的促進作用實驗

收集正常生育期婦女人外周血，用淋巴細胞分離(深圳達科為公司)獲得外周血單個核淋巴細胞(pbmc)，然後通過磁珠(磁珠抗體購自美天妮公司)分選獲得人t細胞，然後接種於包被有抗-cd3抗體(5ug/ml)和抗-cd28抗體(1ug/ml)(抗 體均購自ebioscience公司)的細胞培養板中，隨後用重組人il-6(50ng/ml)和tgf-β(5ng/ml)蛋白(均購自r&d公司)刺激5天後，收集誘導分化的th17細胞，將其與esc進行共培養，並加入或不加入抗人il-10中和性抗體和或抗人il-17中和性抗體，並共培養48小時；然後，同上法，esc的細胞活力、凋亡和侵襲力(如圖4a、4b、4c所示)，結果顯示，聯合應用il-10和il-17抗體顯著抑制th17細胞對esc細胞生長和侵襲具有促進作用。

實施例3聯合應用il-10和il-17中和性抗體顯著抑制ems小鼠異位灶生長動物實驗

(1)構建ems小鼠模型：健康7周齡雌性c57b/l6小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，術前一周用雌激素肌肉注射誘導1次，然後麻醉下開腹取自體雙側子宮，均分為4份，分別縫在自身腹膜四個象限，術後14天常規處理小鼠，ems小鼠模型建立成功(如圖5a所示)；

(2)ems小鼠建模後4天，實驗組予以抗鼠鼠il-10中和性抗體、抗鼠il-17a中和性抗體或者聯合應用兩種抗體(抗體均5ug/ml,總體積15ul/g)，並於4天後加強一次，共計2次；對照組給予溶媒(pbs)處理；同樣建模後14天常規處理小鼠，取異位灶，結果顯示，相對於對照組單獨應用抗鼠il-10抗體或抗鼠il-17抗體組異位灶縮小；聯合應用il-10和il-17中和性抗體顯著抑制ems小鼠異位灶生長，具有顯著強的抗ems效果。

本發明經體外和體內試驗結果證實，利用il-10和il-17中和性抗體組合可明顯抑制esc生長、侵襲和異位灶生長。