用於治療癌症的協同藥物組合的製作方法

2023-10-11 09:41:44

專利名稱：：用於治療癌症的協同藥物組合的製作方法
技術領域：
：本發明涉及新的治療癌症的藥物組合，其中，所述組合顯示協同效應。該藥物組合包含選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑，和至少一種選自式I化合物(如本文所述)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。本發明還涉及治療癌症的方法，該方法包括向需要這種治療的患者施用治療有效量的所述組合。
背景技術：
：癌症是用於描述其中異常細胞不受控制地分化的疾病的通用術語。癌細胞可以侵入周圍組織，並且可以通過血流和淋巴系統擴散到身體的其它部位。存在不同類型的癌症，如膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、頭頸癌、子宮內膜癌、腎(腎細胞)癌、白血病、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、曱狀腺癌、皮膚癌、非何杰金氏淋巴瘤和黑色素瘤。目前比以往有更多可用的治療癌症方法，包括化療、放療、手術、激素治療、免疫治療和基因治療。化療是對於多種癌症常規使用的治療方法。最廣泛使用的化療藥物(抗腫瘤劑)包括紫杉醇、多西他賽、阿黴素、依託泊苷、卡鉑、順柏、拓樸替康和吉西他濱。這些以及其它類似的抗肺瘤劑已成功用於治療不同的癌症。但是，在一定的時間內，發現某些癌症患者產生對於涉及使用這樣的標準抗腫瘤劑的單一治療的抗性。對藥物的耐受性或抗性是成功治療的主要障礙。這種抗性往往被認為是固有的(即，在治療開始時存在)或獲得性的(即，在化療過程中出現)。涉及人類非小細胞肺癌細胞(NCI-H460)接觸濃度逐漸增加的阿黴素的研究報導了對阿黴素(96.2倍)具有抗性和對依託泊苷、紫杉醇、長春花鹼和表阿黴素具有交叉抗性的新細胞系5(NCI畫H460/R)的出現(J!C7^woAa,2006Feb;18(1)66-73))。在另一項描述非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤培養的體外化療抗性的流行度研究中，報導了對於包括順鉑、阿黴素、依託泊苷、吉西他濱、諾維本(navelbine)、紫杉醇、泰索帝(taxotere)和拓樸替康的抗腫瘤劑的極端耐藥性或中間耐藥性(爿朋.T7zorac.2006Feb;81(2):440-6;討論446-7)。吉西他濱被認為是治療胰腺癌的臨床最有效的藥物，但由於大部分腫瘤細胞預先存在或獲得對該藥物的抗性，它未能明顯改善胰腺癌患者的狀況((9"coge"e2003May22;22(21):3243-51)。另一個在癌症治療中觀察到的或普遍存在的問題是與大多數抗腫瘤劑相關的嚴重毒性。在J￡g>^A^/Owe2005Dec—17(4)—291-300中報導了在如阿黴素的藥物的情況下嚴重的副作用如心臟毒性的發生率。儘管發生了與常規的抗肺瘤劑如吉西他濱、紫杉醇相關的抗性和嚴重毒性，這些藥物在癌症治療中仍然是重要的，因為它們有能力減小腫瘤塊。為了提高反應率並防止與常規的抗腫瘤劑的毒性，正在對新的治療方法進行評估。一種這樣的辦法是涉及聯用具有不同的生物學機制的不同抗癌劑的方案(Jekunen等人,Br.J.Cancer,69，299-306(1994);Yeh等人,LifeSciences,54,431-35(1994))。最佳的聯合化療方案可能導致療效提高、主體毒性降低和最低或延遲的抗藥性。當組合具有不同毒性的藥物時，各種藥物可以以其最佳劑量使用，有助於最小化不能耐受的副作用，如Oncology(WillistonPark),2002Oct;16:17-22才艮道的對卡培他濱(capecitabine)和多西他賽的組合。已經發現某些抗腫瘤劑在結合其它抗癌劑使用時比作為單一療法使用時具有協同增效作用。例如，如CancerLett.2001Jan10;162(l):39-48報導，環磷醯胺和5-氟尿嘧啶在卵巢透明細胞腺癌細胞中協同發揮作用。聯合化療也可有利地在難以用單治療、放療或手術治療處理的晚期階段中用於癌症治療，例如，已報導紫杉醇與吉西他濱聯合用於治療轉移性非小細胞肺癌(Ca"cer，2006Sep1;107(5):1050-4)。最近，為改善藥物反應率和解決對抗腫瘤劑的抗性，已嘗試了一種或多種標準抗肺瘤劑(如紫杉醇、順鉑等)與治療癌症的分子靶向抗癌劑的組合。分子耙向藥物，例如甲磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)、夫拉平度(flavopiridol)等，調節其活性更特異性地與癌細胞相關的蛋白質(如激酶)。長期的研究證明，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)家庭的成員在各種細胞過程中發揮關鍵作用。到現在已知有11個CDK家庭的成員。其中，已知CDK1、2、3、4和6在細胞周期中發揮重要作用(Cyclinsandcyclin-dependentkinases:themeandvariations./UvQwcerM1995;66:181-212)。CDK通過與細胞周期蛋白如A-、B-、C-、D-(D1、D2和D3)和E-型細胞周期蛋白形成非共價複合體而激活。該家族的各種同工酶負責細胞周期的特定方面(細胞信號傳導、轉錄等)，且某些CDK同工酶對於特定種類的組織是特異性的。在許多疾病狀態下確認了這些激酶的異常表達和過度表達。已開發和在文獻中報導了許多具有潛在有用的CDK抑制性能的化合物。夫拉平度是第一種進入臨床試驗的有效的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的抑制劑。已經發現夫拉平度在多種癌細胞系中協同增強常規抗腫瘤劑的細胞毒性反應。例如，ActaPharmacolSin.2006Oct;27(10):1375-81已報導用多西他賽、夫拉平度和5-氟尿嘧啶對HCT116結腸癌的連續處理。此外，RadiotherOncol.2004May;71(2):213J1報導了多西他賽與夫拉平度聯合用於肺癌細胞的處理和MolCancerTher.2003Jun;2(6):549-55報導了多西他賽與夫拉平度聯合用於對胃癌的治療。儘管抗癌劑的組合已被證明在癌症治療方案中具有重大的進步，但對於難以治療或對作為單一療法的常少見抗腫瘤劑表現出治療抗性的癌症的治療，仍有一些未滿足的需求和改善癌症的藥物治療的空間。尤其是，開發用於遞送具有不同作用機制的已知抗癌劑的新型組合途徑是本領域的重要進步。雖然涉及具有不同作用機制的抗癌劑組合的方案可以在某些組合的情況下發揮作用，但相同的方式對於抗癌劑的其它組合可能不起作用，且這樣的組合可能不總是產生具有有利治療效果的組合。不過，本發明人令人驚奇地發現，包含選自式I代表的化合物(如本文所述)的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑和用於治療不同癌症的標準細胞毒性抗肺瘤劑的新型藥物組合提供了比單獨使用抗癌劑出人意料地高的效果。發明概述一方面，本發明涉及新的藥物組合，包含選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑和選自式I的化合物(如本文所述)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑；其中，所述組合在癌症的治療中顯示協同效應。另一方面，本發明涉及藥物組合，包含選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素或吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑和選自式I的化合物(如本文所述)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑，用於同時或順序施用以治療癌症。在進一步的方面，本發明涉及新的藥物組合用於治療癌症和誘導細胞凋亡的用途。在另外的進一步的方面，本發明涉及治療癌症的方法，該方法包括與治療有效量的選自式I的化合物(如本文所述)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑結合向需要治療的患者施用治療有效量的選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑。在更另外的進一步的方面，本發明涉及新的藥物組合在製備治療癌症的藥物中的用途。本發明的其它方面和進一步的應用範圍通過下面的進一步的詳細描述而變得明顯。附圖簡述圖l說明阿黴素與化合物A組合在體外H-460非小細胞肺細胞的處理中顯示協同作用。圖A、B、C和D分別代表不同處理組的細胞周期分布，即對照(96小時)、單獨的200nM阿黴素(24小時)、單獨的800nM的化合物A(72小時)和包括施用200nM阿黴素(24小時)、接著施用800nM的化合物A(72小時)的組合。圖2說明阿黴素與化合物A組合在體外H-460非小細胞肺細胞的處理中顯示協同作用。圖A、B、C和D分別代表不同處理組的細胞周期分布，即對照(120小時)、單獨100nM阿黴素(24小時)、單獨1200nM的化合物A(96小時)和包括施用100nM阿黴素(24小時)、接著施用1200nM的化合物A(96小時)的組合。圖3表明吉西他濱和化合物A的組合在體外胰腺(Panc-1)細胞處理中使用導致協同作用。圖A、B、C、D和E分別顯示不同處理組的細胞周期分布，即對照(24小時)、對照(96小時)、單獨70nM吉西他濱(24小時)、單獨300nM的化合物A(72小時)和包括施用70nM吉西他濱(24小時)、接著施用300nM的化合物A(72小時)的組合。圖4顯示在阿黴素接著化合物A的協同組合中，使用膜聯蛋白V染色在120小時處理末期檢測的早期細胞凋亡。圖A、B、C和D分別顯示不同處理組在4個象限的細胞分布，即對照(120小時)、單獨1200nM的化合物A(96小時)、單獨100nM的阿黴素(24小時)和包括施用100nM的阿黴素(24小時)、接著施用1200nM的化合物A(96小時)的組合。圖5說明在集落形成試驗中測試時，阿黴素和化合物A的組合在體外H-460非小細胞肺細胞的處理中顯示協同作用。圖6顯示參與細胞周期調控和細胞凋亡的各種蛋白質的蛋白質印跡分析。圖7a說明阿黴素(2mpk)在人類非小細胞肺癌(H-460)細胞中及化合物A(20mpk)組合在H-460異種移植模型中的體內效力。圖7b說明阿黴素(2mpk)和化合物A(35mpk)的組合在H-460異種移植模型中的體內效力。圖8a和8B顯示研究結束時來自各組的單個小鼠的8個腫瘤的處理結束時平均腫瘤重量和SE(棒)。各自組的處理結束時的生長抑制百分比(GI)顯示在各棒頂端。配對"企驗用來評估不同處理組之間的差9異的統計學顯著性。統計學顯著的差異被認為是P〈0.05。圖9顯示使用C0X-2抗體的蛋白質印跡。發明詳述現在已經發現，包含選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的常規細胞毒性抗腫瘤劑和選自式I的化合物(如本文所述)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的CDK抑制劑的本發明的新組合在用於治療癌症、尤其是實體腫瘤時顯示協同效應。用於本發明的藥物組合中的CDK抑制劑選自如本文下面所述的式抑制劑。式I的化合物是有希望的CDK抑制劑，其可以抑制許多癌細胞的增殖。用於本發明中的式I的化合物對於各種實體和血液惡性腫瘤是有效的。本發明的發明者觀察到，將式I的CDK抑制劑與選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱的常規細胞毒性抗腫瘤劑組合導致細胞凋亡或程序性細胞死亡的增加。用於本發明的CDK抑制劑選自下列式I代表的化合物，其中，Ar是苯基，其是未取代的或被選自以下的1、2或3個相同或不同的取代基取代如氯、溴、氟或硤的滷素、硝基、氰基、C廣C4烷基、三氟曱基、羥基、C廣C4烷氧基、羧基、C廣C4烷氧羰基、CONH2和NR^R2;其中，R!和R2各獨立地選自氫或C廣Ct烷基。PCT專利公開WO2004004632公開了式I的化合物(其可以是藥學式1上可接受的鹽和溶劑化物的形式)的製備，和包含上述化合物的口服和/或腸胃外施用的藥物組合物的製備。這項專利(本文引入作為參考)披露了式I代表的CDK抑制劑顯示明顯的抗癌效力。如上文表明，可以以其鹽或溶劑化物的形式使用式I的CDK抑制劑。優選的式I化合物的鹽包括鹽酸鹽、曱磺酸鹽和三氟醋酸鹽。本領域的技術人員可以理解式I的化合物包含至少兩個手性中心。因此，式I的化合物以兩種不同光學異構體的形式存在(即，(+)或(-)對映異構體)。所有這些對映異構體及其混合物(包括外消旋混合物)都包括在本發明的範圍之內。可以通過PCT專利申請公開WO2004004632和申請人的未決國際專利申請PCT/IB2006/052294中所公開的方法獲得式I化合物的對映異構體，本文完整引入這些專利申請作為參考。也可以通過本領域熟知的方法如手性HPLC和酶法拆分獲得式I的化合物的對映異構體。或者，可以通過使用光學活性原料合成式I化合物的對映異構體。因此，式I的CDK抑制劑的定義包括所有可能的立體異構體及其混合物。式I的定義包括外消旋形式和分離的具有指定活性的光學異構體。用於本發明的新型藥物組合中的常規細胞毒性抗腫瘤劑可以選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素、吉西他濱和通過類似的作用機制顯示抗癌活性的類似細胞毒性抗腫瘤劑。紫杉醇是一種從短葉紫杉(raxM6rev,/o//a)分離的天然二萜產物(Rowinsky等人，J.Natl.CancerInst"82，1247-1259(1990))。J.Am.Chem.Soc.93,2325(1971)公開了紫杉醇的分離及其結構。它是促進從微管蛋白二聚體組裝微管並通過防止解聚穩定微管的抗微管劑(antimicrotubuleagent)。已批准紫杉醇臨床用於卵巢癌的治療(Merkman等人；YaleJournalOfBiologyandMedicine,64:583,1991)和用於乳腺癌的治療(Holmes等人；J.Nat.cancerInst"83;1797，1991)，但是，它也可用於治療其它癌症，例如，它已經被認為是治療頭頸癌(Forastire等人，Sem.Oncol"20:56,1990)和肺癌(M.Ghaemmaghami等人；Chest;113;86-91(1998))的潛在候選藥物。美國專利5,670,537公開了紫杉醇，本文引入其紫杉醇用於治療易感性的癌症的用途的記載作為參考。紫杉醇作為注射液Taxol⑧是市售的。作為單藥使用紫杉醇通常伴隨不希望的副作用，包括過敏反應、低血壓、心動過緩、高血壓、噁心和嘔吐及注射部位反應。多西他賽屬於紫杉烷(taxane)家族，是紫杉醇的半合成衍生物。多西他賽表明主要用於治療乳腺癌和非小細胞肺癌。它還可用於治療其它癌症。美國專利4,814,470公開了這種化合物，本文引入其對於多西他賽的合成和用於治療易感性癌症的用途的記載作為參考。多烯紫杉醇三水合物(Docetaxeltrihydrate)作為注射液Taxotere⑧是市售的。基於紫杉醇類(taxoid)衍生物(包括多西他賽)的所有治療可以顯示嚴重和麻煩的毒性如骨髓抑制、中性白細胞減少、超敏反應、周圍神經病變和體液瀦留等(Fumoleau等人，Bull.Cancer，(82)8:629-636(1995))。阿黴素是Adriamycin⑧的通用名稱，且作為注射劑是市售的。阿黴素首先乂人波賽鏈黴菌青灰變種(5V^ptow^c^y/7ewce"'wsw/rca^s7'ws)的發酵液分離(美國專利3,590,028)。這種細胞毒性抗腫瘤劑主要通過平面蒽環類的核與DNA雙螺旋特異性插入結合核酸，導致異常的細胞複製。阿黴素用於治療乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌和曱狀腺癌，骨與軟組織肉瘤，淋巴瘤和白血病，以及兒童肺瘤。阿黴素的使用通常伴隨著一些副作用，包括骨髓抑制、噁心和嘔吐、黏膜與皮膚的和心臟的效應。吉西他濱是2'-脫氧-2'，2'-二氟胞苷(difluorocytidine)的通用名稱。它作為單鹽酸鹽和J3-異構體是市售的。美國專利4,808,614和5，464，826公開了吉西他濱，本文引入其對于吉西他濱的合成和用於治療易感性癌症的用途的記載作為參考。鹽酸吉西他濱的商業製劑作為單一藥劑對於局部晚期或轉移性胰腺癌或肺細胞癌(NSCLC)的患者是一線治療藥物，且通常用於以前用5-氟尿嘧啶治療的患者。除非另有說明，上下文使用的一般術語優選在本公開的上下文中具有以下含義單數形式"a，""an，"和"the"包括複數指代，除非文中另有明確指出。12術語"抗腫瘤劑"與"化療藥物"或"抗癌劑"同義，指通過抑制或防止腫瘤生長發揮作用的治療劑。術語"抗腫瘤劑"或"抗癌劑"一般指防止癌細胞繁殖的化合物(即抗增殖劑)。一般來說，抗腫瘤劑分為兩類，抗增殖細胞毒性和抗增殖細胞抑制。細胞毒性藥物通過(1)幹擾細胞複製DNA的能力和(2)在癌細胞中誘導細胞死亡和/或凋亡而防止癌細胞繁殖。抗增殖細胞抑制劑通過調整、幹擾或抑制對細胞增殖進行調控的細胞信號傳導的過程發揮作用。在本發明中，包含在本發明的藥物組合中的抗腫瘤劑是細胞毒性藥物，因此被稱為細胞毒性抗胂瘤劑。如本文所用，術語"協同的"是指本發明的方法和組合所取得的效果大於分別使用細胞毒性抗肺瘤劑或其藥學上可接受的鹽和式I的CDK抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物產生的效應的總和。有利地，這種協同作用在相同的劑量下提供更高的效力，和/或防止或延遲多藥抗性的建立。如本文所用，術語"治療有效量"是指以對於非增殖細胞的最小毒性產生增殖細胞的最大凋亡的化療藥物的量。術語"細胞凋亡，，指其中細胞中的一系列分子步驟導致其死亡的細胞死亡類型。這是機體排除不需要或不正常細胞的正常方式。在癌細胞中細胞凋亡的過程可能被阻斷。細胞凋亡也被稱為程序性細胞死亡。(癌術i吾字典。國立癌症研究所(Dictionaryofcancerterms.NationalCancerInstitute))。如本文所用，術語"增加細胞凋亡"定義為程序性細胞死亡的速度提高，即與暴露於(接觸)單獨的細胞毒性抗腫瘤劑或單獨的CDK抑制劑，更多的細胞被誘導進入死亡程序。本文中所用的術語"受試者"指的是已成為治療、觀察或實驗的對象的動物，優選哺乳動物，最優選人類。在一種實施方式中，本發明涉及用於治療癌症的新的藥物組合，其中，所述組合包含選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素或吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑和至少一種選自式I的化合物(如本文所述)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑。在一種實施方式中，如本文所述的包含式I的CDK抑制劑和細胞毒性抗腫瘤劑的藥物組合併不專門限於通過所述成分的物理結合獲得的那些組合，而是也包括那些允許單獨施用的組合，單獨施用可以是同時、順序或在一段時間內間隔施用，以便取得組合的最大的效力。因此，為了進行有效的癌症治療，可以同時或在一4更時間內間隔施用藥物組合。出於本發明的目的，選自式I的化合物的CDK抑制劑可以在例如細胞毒性抗腫瘤劑之前、之後或同時施用。在本發明的優選的實施方式中，在施用CDK抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物之前，以下述劑量範圍施用細胞毒性抗腫瘤劑或其藥學上可接受的鹽。然而，可以由本領域的技術人員按照常規技術和本說明書中包含的信息適當地選擇給定條件下施用CDK抑制劑和細胞毒性抗腫瘤劑的最佳方法和順序。在一種實施方式中，由於其不同的物理和化學特性，包含在組合中的成分可以通過不同途徑施用。例如，可以口服或腸胃外施用式I的CDK抑制劑以產生並保持其良好的血液水平，而細胞毒性抗腫瘤劑可以通過靜脈內、皮下或肌肉內途徑進行腸胃外施用。對於口服使用，式I的CDK抑制劑可以，例如，以片劑或膠嚢、粉末、分散顆粒或扁嚢劑的形式，或作為水溶液或懸浮液施用。在用於口服的片劑的情況下，常用的載體包括乳糖、玉米澱粉、碳酸鎂、滑石粉和糖，且通常加入潤滑劑如硬脂酸鎂。對於膠嚢形式的口服施用，有用的載體包括乳糖、玉米澱粉、碳酸鎂、滑石粉和糖。對於肌肉內、腹膜內、皮下和靜脈內的使用，通常採用有效成分(細胞毒性抗肺瘤劑或CDK抑制劑)的無菌溶液，且溶液的pH值應適度調整和緩沖。在另一種實施方式中，本發明涉及癌症的治療方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效量的所述組合。因此，在本發明的方法中，通過與治療有效量的選自式I的化合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的CDK抑制劑結合向受試者施用治療量的有效治療癌症的細胞毒性抗腫瘤劑治療受試者的癌症，其中產生協同作用。正如上文指出的，藥物組合物中包含的活性成分可以同時或順序施用。因此，根據本發明，治療癌症的方法包括與治療量的式I的化合物代表的CDK抑制劑同時向需要這種治療的受試者施用治療量的細胞毒性抗腫瘤劑。在一種實施方式中，癌症的治療方法包括向需要這種治療的受試者順序施用治療量的細胞毒性抗腫瘤劑和治療量的式I的化合物代表的CDK抑制劑。在另一種實施方式中，癌症的治療方法包括在施用式I的化合物代表的CDK抑制劑之前向需要這種治療的受試者施用治療量的細胞毒性抗腫瘤劑。本發明的方法和藥物組合可用於治療選自乳腺癌、肺癌(包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、結直腸癌和肝細胞癌的癌症。在一種優選的實施方式中，本發明的藥物組合可以用於治療選自非小細胞肺癌和胰腺癌的癌症。組合中包含的活性成分的實際劑量可以隨患者的需要和待治療的病症的嚴重性而變化。本領域的技術人員可以確定特殊情況的適當劑量。一般來說，以比化合物的最佳劑量低的較小劑量開始治療。隨後，各種成分的劑量少量增加，直至達到在這種情況下的最佳效果為止。然而，藥物組合中各種成分的量通常低於其單獨施用時產生治療作用的量。為方便起見，每日總劑量可以按照需要分成幾份並在這一天內按份施用。在一種優選的實施方式中，以注射的形式順序施用細胞毒性抗腫瘤劑或其藥學上可接受的鹽，以及式I的化合物代表的CDK抑制劑或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，從而以10mg-1400mg、優選15mg-1000mg的協同有效劑量施用細胞毒性抗腫瘤劑，和以5mg-750mg、優選10mg-300mg的協同有效劑量施用CDK抑制劑。在本發明的一種優選的實施方式中，當細胞毒性抗肺瘤劑是紫杉醇時，它以30mg-300mg的協同有效劑量施用。在本發明的另一種優選的實施方式中，當細胞毒性抗肺瘤劑是多西他賽時，它以20mg-175mg的協同有效劑量施用。在本發明的更另外的一種優選的實施方式中，當細胞毒性抗腫瘤劑是阿黴素時，它以17.5mg-75mg的協同有效劑量施用。在本發明的更另外的一種優選的實施方式中，當細胞毒性抗腫瘤劑是吉西他濱時，它以70mg-1200mg的協同有效劑量施用。已在某些分析系統中和以幾個不同的體外施用時間表對本發明提供的組合進行了評估。實驗細節如本文下面所述。本文提供的數據清楚地表明，細胞毒性抗肺瘤劑與式I的CDK抑制劑組合時顯示協同效應。清楚地表明，在癌症治療中抗癌劑聯合使用時比僅用單獨的式ICDK抑制劑或單獨的細胞毒性抗胂瘤劑處理細胞時增殖細胞的細胞凋亡或細胞毒性提高。例如，可以從表2-4提供的數據清楚地觀察到，CDK抑制劑(本文稱為化合物A的典型的式I化合物)在體外分析中協同提高了阿黴素對於非小細胞肺癌H-460細胞的細胞毒性。代表化合物(用於藥理分析的化合物A)指(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥曱基-1-曱基-吡咯烷-3-基)-苯並吡喃-4-酮鹽酸，且是一種在公布的PCT專利申請WO2004004632中公開的化合物，本文引入該專利申請作為參考。本發明者也建立了異種移植模型以將體外觀察擴展到體內系統。本發明者使用SCID(嚴重聯合免疫缺陷)雄性小鼠的非小細胞肺異種移植模型測試了本發明的組合的體內效力。觀察到當與阿黴素順序組合施用時，CDK抑制劑協同增強阿黴素的效力。從圖7a和7b的圖解可以明顯看出本發明的藥物組合在SCID小鼠的非小細胞肺異種移植模型中顯示治療協同作用。在本發明者進行的涉及使用包含常規的細胞毒性抗腫瘤劑阿黴素和另一種已知的CDK抑制劑夫拉平度的組合處理人類非小細胞肺癌H-460細胞系的平行體外研究中，發現阿黴素和夫拉平度的組合(與施用16順序無關)產生加性效應，沒有顯示協同作用(表16-A,B，C)。本文下面說明這項研究的細節。因此，不能確定地預言，具有不同的作用機制的抗癌劑的組合總能產生有利的治療作用。然而，本發明者清楚地證明本發明的新藥物組合的協同效力。腫瘤劑和CDK抑制劑的組合的協同效應。應該指出，提供這些只是作為示例，而不是為了限制本發明。藥理分析體外細胞毒性分析所用的細胞毒性分析是MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑錄(tetrazolium)，內鹽)分析。在96孔板中以1500細胞/孔的密度在180pL培養基中接種人類非小細胞肺癌H-460細胞，並孵育過夜以4吏細胞粘附。向孔中加入在組合中包含的不同濃度的藥物，並在單藥物暴露的情況下在37。C、潮溼的5。/。C02培養箱中孵育合適的時間。當用兩種藥物處理時，施用常規的細胞毒性抗腫瘤劑(紫杉醇、多西他賽和阿黴素)3小時或24小時，接著除去培養基並用培養基洗滌細胞一次。洗滌細胞後，向孔中加入兩種不同濃度的化合物A,並在37。C、潮溼的5%(302培養箱中孵育板48、72或96小時。用載體處理對照孔。在孵育結束時，從孔中除去培養基，並向各孔加入20pLMTS(2mg/mL,在pH6-6.5和無菌過濾的磷酸鹽緩衝鹽水中)和1]LiL的吩。秦硫酸曱酯(phenazinemethosulfate)(PMS，在pH7.3和過濾除菌的磷酸鹽緩衝鹽水中為3mM)，用完全培養基調節總體積至200pL。在37。C、潮溼的5%<:02培養箱中孵育板2-4小時。用分光光度計(SpectraMax，MolecularDevices)在490nM處讀板，使用SoftMax(用於SpectraMax的軟體)計算細胞毒性百分比和IC50。實施例1:本實施例顯示阿黴素與化合物A的組合的協同效應，其中，順序施用阿黴素和化合物A以使得在化合物A之前施用阿黴素。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物中的任一種單獨處理細胞，即單獨的阿黴素或化合物A。阿黴素處理首先24小時，接著完全培養基處理72小時；而在化合物A的情況下，首先完全培養基處理24小時，接著化合物A處理接下來的72小時。使用的阿黴素的濃度為100nM和200nM，而化合物A的濃度是800nM(48小時處理後的IC3。濃度)。在組合研究中，首先用200nM或100nM的阿黴素處理細胞24小時，接著800nM的化合物A處理72小時。藥物處理完成後，即在96小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照比較計算細胞毒性百分比。結果如下面的表1所示。表ltableseeoriginaldocumentpage18實施例2:本實施例顯示阿黴素與化合物A的組合的協同效應，其中，順序施用阿黴素和化合物A以使得阿黴素在化合物A之前施用。在本實施例中，以1200nM的濃度使用化合物A。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物中的任一種單獨處理細胞，即單獨的阿黴素或化合物A。阿黴素處理首先24小時，接著完全培養基處理72小時；而在化合物A的情況下，首先完全培養基處理24小時，接著化合物A處理接下來的72小時。使用的阿黴素的濃度為200nM和100nM,而化合物A的濃度是1200nM(48小時處理後的IC5Q濃度)。在組合研究中，首先用100nM或200nM的阿黴素處理細胞24小時，接著1200nM的化合物A處理72小時。藥物處理完成後，即在％小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照比較計算細胞毒性百分比。結果如下面的表2所示。表2tableseeoriginaldocumentpage19實施例3:本實施例顯示阿黴素與化合物A的組合的協同效應，其中，順序施用阿黴素和化合物A以使得在化合物A之前施用阿黴素。在本實施例中，以1200nM的濃度使用化合物A,且間隔的時間是96小時。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物中的任一種單獨處理細胞，即單獨的阿黴素或化合物A。阿黴素處理首先24小時，接著完全培養基處理96小時；而在化合物A的情況下，首先完全培養基處理24小時，接著化合物A處理接下來的96小時。使用的阿黴素的濃度為100nM和200nM，而化合物A的濃度是1200nM(48小時處理後的ICso濃度)。在組合研究中，首先用100nM或200nM的阿黴素處理細胞24小時，接著1200nM的化合物A處理96小時。藥物處理完成後，即在120小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照比較計算細胞毒性百分比。結果如下面的表3所示。表3tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20實施例4:本實施例顯示同時施用阿黴素和化合物A的組合120小時的協同效應。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物中的任一種單獨處理細胞120小時，即單獨的阿黴素或化合物A。使用的阿黴素的濃度為30nM和100nM，而以800nM和1200nM的濃度使用化合物A(48小時處理後的IC3o和IC5o濃度)。在該組合研究中，分別一起加入30nM或100nM的阿黴素和1200nM或800nM的化合物A處理120小時。藥物處理完成後，即在120小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照比較計算細胞毒性百分比。結果如下面的表4所示。表4藥物處理阿黴素濃度CDK抑制劑C化細胞毒(nM)合物A)濃度(nM)性％阿黴素100019300CDK抑制劑(化合物A)01200440細24阿黴素和CDK抑制劑(化合物10080061A)—起120小時30120060實施例5:本實施例表明在細胞毒性抗腫瘤劑阿黴素前施用化合物A時沒有20協同效應。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物中的任一種單獨處理細胞，即單獨的阿黴素或化合物A。化合物A處理首先96小時，接著完全培養基處理24小時；而在阿黴素的情況下，首先完全培養基處理96小時，接著阿黴素處理24小時。使用的阿黴素的濃度為30nM、70nM、100nM和200nM，而以800nM和1200nM的濃度使用化合物A(48小時處理後的IC3o和ICs。濃度)。在該組合研究中，加入1200nM或800nM的化合物A首先96小時，接著加入30nM、70nM、100nM或200nM的阿黴素24小時。藥物處理完成後，即在120小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照比較計算細胞毒性百分比。表6表明這種組合中的細胞毒性百分比低於單獨施用時化合物A的細胞毒性。因此，該順序效應是拮抗的，因為阿黴素不會增強第一種藥物(在本情況中是化合物A)的效應。結果如下面的表5所示。表5tableseeoriginaldocumentpage21實施例l-4清楚地表明，當在細胞毒性藥物之後或同時施用時，CDK抑制劑協同增強阿黴素的效應。實施例5也表明順序處理的重要性。據發現阿黴素處理接著CDK抑制劑處理具有協同作用，而相反順序則是無效的。實施例6:本實施例顯示多西他賽與化合物A的組合的協同效應，其中，順序施用多西他賽和化合物A以使得在化合物A之前施用多西他賽。以3000細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物的任一種單獨處理細胞，即單獨的多西他賽或化合物A。多西他賽處理首先3小時，接著完全培養基處理45小時；而在化合物A處理的情況中，首先完全培養基處理3小時，接著化合物A處理接下來的45小時。使用的多西他賽的濃度為0.1nM和3nM,而以700nM濃度(48小時處理後的IC3。濃度)使用化合物A。在該組合研究中，首先用0.1nM或3nM的多西他賽處理細胞3小時，接著700nM的化合物A處理45小時。藥物處理完成後，即在48小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照比較計算細胞毒性百分比。結果如下面的表6所示。表6tableseeoriginaldocumentpage22實施例7:本實施例顯示多西他賽與化合物A的組合的協同效應，其中順序施用多西他賽和化合物A以4吏得在化合物A之前施用多西他賽。以3000細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物的任一種單獨處理細胞，即單獨的多西他賽或化合物A。多西他賽處理首先3小時，接著完全培養基處理45小時；而在化合物A處理的情況中，首先完全培養基處理3小時，接著化合物A處理接下來的45小時。使用的多西他賽的濃度為0.1nM和3nM，而以1000nM濃度〗吏用化合物A(48小時處理後的ICso濃度)。在組合研究中，首先用0.1nM或3nM的多西他賽處理細胞3小時，接著1000nM的化合物A處理45小時。板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照相比計算細胞毒性百分比。結果如下面的表7所示。表7tableseeoriginaldocumentpage23實施例8:本實施例顯示紫杉醇與化合物A的組合的協同效應，其中順序施用紫杉醇和化合物A以使得在化合物A之前施用紫杉醇。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先用兩種藥物的任一種單獨處理細胞，即單獨的紫杉醇或化合物A。紫杉醇處理首先3小時，接著完全培養基處理45小時；而在化合物A處理的情況中，首先完全培養基處理3小時，接著化合物A處理接下來的45小時。使用的紫杉醇的濃度為10nM,而以700nM濃度〗吏用化合物A(48小時處理後的IC3。濃度)。在組合研究中，首先用10nM的紫杉醇處理細胞3小時，接著700nM的化合物A處理45小時。藥物處理完成後，即在48小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照相比計算細胞毒性百分比。結果如下面的表8所示。表8tableseeoriginaldocumentpage24實施例9:本實施例顯示吉西他濱與化合物A的組合的協同效應，其中順序施用吉西他濱和化合物A以^使得在化合物A之前施用吉西^f也濱。以1500細胞/孔的密度接種來自人類胰腺(Panc-1)細胞系的細胞。首先用兩種藥物中的任一種單獨處理細胞，即單獨的吉西他濱或化合物A。吉西他濱處理首先24小時，接著完全培養基處理72小時。而在化合物A處理的情況中，首先完全培養基處理24小時，接著化合物A處理接下來的72小時。以70nM濃度使用吉西他濱，而以300nM濃度(48小時處理後的IC3。濃度)使用化合物A。在組合研究中，首先用70nM的吉西他濱處理細胞24小時，接著300nM的化合物A處理72小時。藥物處理完成後，即在96小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照相比計算細胞毒性百分比。結果如下面的表9所示。表9tableseeoriginaldocumentpage24吉西他濱(24小時)，接著CDK抑制劑(化合物A)(72小時)200300971003008270300743030053細胞周期分布和流式細胞分析在25mm3的組織培養瓶中接種人類非小細胞肺癌H-460。24小時後，用化合物A單獨處理細胞72小時或96小時，和用細胞毒性抗腫瘤劑阿黴素單獨處理24小時。對於組合研究，首先用細胞毒性抗腫瘤劑阿黴素處理細胞處理24小時，接著在除去細胞毒性抗腫瘤劑並用PBS洗滌細胞兩次後，用化合物A處理72小時或％小時。保留對照細胞不處理96小時或120小時。在不同時間點收穫分離的和粘附的細胞。通過以1000rpm離心10分鐘用大約5mL的PBS洗滌細胞兩次。將糹田月包再懸浮於500pL的PBS中，並在500pL冰冷的70。/。乙醇中固定。固定的細胞在室溫下孵育30分鐘，以1000rpm旋轉IO分鐘。向細胞團中加入1mL冷凍的70%乙醇，然後將細胞團保存在冰箱中直至進一步分析。用PBS洗細胞兩次以除去固定劑，並再懸浮於250|liLPBS中。向其中加入50inL的碘化丙啶(在PBS中為4mg/mL)和12.5核糖核酸酶A(1mg/mL)。在37。C下孵育30分鐘後，使用流式細胞儀分析細力包。按照製造商的建議使用BectonDickinsonFACSCalibur流式細胞儀。使用設定在488nm的氬離子雷射器作為激發源。通過紅色螢光水平確定，具有2n和4n之間的DNA含量的細胞被認定處於細胞周期的G!、S和G2/M期。顯示少於2n的DNA含量的細胞認定為亞G!細胞。各個細胞周期分區中的細胞數表示為存在的細胞總數的百分比。實施例10:本實施例給出圖1所示的各種處理的細胞周期分布。對於處理組，在組織培養瓶接種大約1-2x106細胞。分析方案是在上文"細胞周期分25布和流式細胞分析"中提到的。細胞周期分為4個部分，在圖1中用Ml、M2、M3和M4來代表。M1對應於亞G1期，M2對應於S期，M3對應於G2-M期，和M4對應於亞G1期，其代表發生凋亡的細胞。其中沒有藥物處理的96小時對照顯示出只有2%的可忽略的細胞凋亡，而單獨的任一藥物的處理組顯示對於單獨的化合物A和阿黴素都只有10%的細胞凋亡。兩種藥物的組合顯示34%的更高的細胞凋亡。實施例11:本實施例給出圖2所示的各個處理組的細胞周期分布。對於處理組，在組織培養瓶接種大約1-2x106細胞。分析方案是在上文"細胞周期分布和流式細胞分析"中提到的。細胞周期分為4個部分，在圖中用M1、M2、M3和M4來代表。M1對應於G1期，M2對應於S期，M3對應於G2-M期，和M4對應於亞G1期，其代表發生凋亡的細胞。其中沒有藥物處理的120小時對照顯示只有8%的可忽略的細胞凋亡，而單獨的任一藥物的處理組顯示對於化合物A和阿黴素分別有32%和3%的細胞凋亡。兩種藥物的組合顯示65%的更高的細胞凋亡。實施例12:本實施例給出圖3所示的各個處理組的細胞周期分布。對於處理組，在組織培養瓶接種大約1-2x106胰腺細胞(Panc-1)。分析方案是在上文"細胞周期分布和流式細胞分析"中提到的。細胞周期分為4個部分，在圖中用M1、M2、M3和M4來代表。M1對應於G1期，M2對應於S期，M3對應於G2-M期，和M4對應於亞G1期，其代表發生凋亡的細胞。其中沒有藥物處理的96小時對照顯示只有2.1%的可忽略的細胞凋亡，而單獨的任一藥物的處理組顯示對於化合物A和吉西他濱分別有4.3%和1.7%的細胞凋亡。兩種藥物的組合顯示25.4%的提高的細胞凋亡。實施例13:膜聯蛋白V-FITC染色(對於早期凋亡的檢測)膜聯蛋白V-FITC是用於識別凋亡細胞的靈敏探針。在早期細胞凋亡過程中，膜磷脂磷脂醯(phosphotidyl)絲氨酸(PS)從質膜的內小葉(leaflet)轉移到外小葉，從而將PS暴露於外部細胞環境。膜聯蛋白V是35-36kDa的鉤磷脂結合蛋白，其對於PS具有高親和性並與具有暴露的PS的細胞結合。碘化丙啶(PI)是通過滲漏的膜(leakymembranes)進入細胞的極性染料，並因此用於與FITC結合而檢測晚期凋亡。在25mm3的組織培養瓶中接種人類非小細胞肺癌H-460。24小時後，分別用1200nM的化合物A或100nM的阿黴素單獨處理細胞96小時和24小時。對於組合研究，首先用100nM的細胞毒性抗腫瘤劑阿黴素處理細胞24小時，接著在除去細胞毒性抗腫瘤劑(阿黴素)並用培養基洗滌細胞一次後，用1200nM的化合物A處理96小時。保留對照細胞不處理120小時。收集含有漂浮細胞的培養基，並在不同時間點用胰蛋白酶收穫後與粘附細胞合併。通過以1000rpm離心IO分鐘用冷的PBS洗滌細胞兩次。將細胞團以1x106細胞/毫升的濃度再懸浮於IX結合緩沖液(10mmHEPESpH7.4，140mMNaC1,2.5mMCaCl2)中。100|il溶液(lxlS細胞)用膜聯蛋白V-FITC和碘化丙口定染色。在室溫下、黑暗中孵育細胞15分鐘，並通過流式細胞儀分析樣品。按照製造商的建議，BectonDickinsonFACSCalibur流式細胞儀用於這些研究。使用設定在488nm的氬離子雷射器作為激發源。圖4表明4個象限的細胞分布。位於左下角(LL)的象限1顯示FITC和PI陰性的細胞，表明細胞是健康的。位於右下角(LR)的象限II是僅對PI陽性的細胞，表明這些細胞是完全凋亡的。右上角(UR)的象限III是對膜聯蛋白和PI都是陽性的細胞，表明這些細胞正從早期凋亡進入晚期凋亡。左上角(UL)的象限IV顯示只有膜聯蛋白陽性的細胞，表明這些細胞處於早期凋亡。如果細胞即使在終止接觸化合物之後仍繼續進入細胞凋亡，它們會對於膜聯蛋白染色陽性。細胞一旦處於早期凋亡，則轉入程序性細胞死亡並且處於非反轉點(apointofnoreturn)。結果如表10所示。據發現，相比於兩種藥物單獨處理，組合中比例最高的細胞處於早期或早期到晚期凋亡。表10藥物處理活細胞膜聯蛋白+膜聯蛋白和PI十PI+載(%)(健載體(％)(處栽體(％)(處於體(％)康細胞)於早期凋亡早期到晚期凋(死亡的的細胞)亡的細月包)細胞)對照90.5342.3阿黴素(100nM)6030.48.61CDK抑制劑(化合5338.58.20.3物A)(1200nM)阿黴素，接著CDK14.158.227.31抑制劑(化合物A)實施例14:集落形成試驗(Clonogenicassay):以750-1000細胞/35mm組織培養級平板的密度接種人類非小細胞肺癌細胞(H-460)。在37。C下孵育過夜以使細胞粘附於平板。用細胞毒性抗腫瘤劑處理細胞處理24小時，接著洗滌細胞，並加入包含化合物A的新鮮培養基96小時。在處理結束時，培養基再次用新鮮的包含10%FCS的完全培養基替換，並孵育7-14天以形成集落。一旦平板上出現可見集落，除去培養基，並用2:1比例的曱醇:乙酸混合物固定集落5分鐘。用水洗滌板，並重複固定程序。乾燥板，並用0.1%結晶紫染色3-5分鐘。用水仔細漂洗板，乾燥並在Geldoc對集落計數。分別單獨用1200nM的化合物A或100nM的阿黴素處理細胞96小時和24小時，或者用100nM的阿黴素，接著1200nM的化合物A的組合處理96小時。圖5表明了組合的協同效應，因為相比於對照或單獨的任一藥物，在組合中只看到一個集落。28處理後的恢復實驗化合物A和阿黴素的單獨處理或聯合處理的分析方案與細胞周期分布的分析中所述一樣。藥物處理後，使得這些細胞在新鮮的含有10%FCS的完全培養基中恢復。在任一藥物單獨處理和組合處理的0、6、18、24和48小時的時間點，通過FACS分析恢復中的細胞。在下面的實施例中，細胞的恢復由發生凋亡的細胞的百分比表示。實施例15:只用細胞毒性抗腫瘤劑阿黴素處理細胞24小時，接著除去培養基並用新鮮的完全培養基替換。如特別用來確定藥物處理結束後的恢復期中發生凋亡的細胞的百分比的方法中所述的進行FACS分析。在恢復期的0、6、18、24和48小時測定細胞凋亡。在24小時藥物處理結束時，細胞凋亡的百分比是3%，其在恢復期沒有明顯增加，表明細胞最終從藥物處理中恢復。結果如表ll所示。表lltableseeoriginaldocumentpage29實施例16:如方案中所述進行分析。只用化合物A處理細胞96小時，接著除去培養基並用新鮮的完全培養基替換。如用來測定藥物處理結束後的恢復期中發生凋亡的細胞的百分比的方法中所述的進行FACS分析。在恢復期的0、6、18、24和48小時測定細胞凋亡。在96小時藥物處理結束時，細胞凋亡的百分比是32%，其在48小時的恢復結束時從24%下降到19%,表明細胞在恢復期間恢復逐漸增加。結果如表12所示。表12隻用化合物A處理96小時後，在0、6、18、24和48小時的細胞恢復tableseeoriginaldocumentpage30實施例17:如方案中所述進行分析。只用阿黴素處理細胞24小時，接著化合物A處理細胞96小時，接著除去培養基並用新鮮的完全培養基替換。如用來測定藥物處理結束後的恢復期中發生凋亡的細胞百分比的方法中所述的進行FACS分析。在恢復期的0、6、18、24和48小時測定細胞凋亡。在藥物處理結束時，細胞凋亡的百分比是55%。在恢復期間，在6小時結束時，另外的32%進入細胞凋亡，細胞凋亡百分比在恢復期的48小時結束時增加到57%，表明細胞在恢復期沒有恢復，反而繼續發生凋亡。結果如表13所示。表13用阿黴素處理24小時，接著用化合物A處理96小時後，在0、6、18、24和48小時的細胞恢復tableseeoriginaldocumentpage300小時恢復556小時恢復3218小時恢復3424小時恢復4948小時恢復57實施例18:蛋白質印跡分析人類非小細胞肺癌(H-460)細胞未經處理(即，對照細胞)或用100nM的阿黴素單獨處理24小時或用1200nM的化合物A單獨處理96小時。在組合處理中，細胞首先用100nM的阿黴素處理24小時，接著1200nM的阿黴素處理96小時。在處理期結束時，細胞裂解，並使用布拉德福德試劑(Bradfordreagent)估計裂解產物的蛋白質含量。將40昭的蛋白質加載在SDS-PAGE上，並轉移到PVDF膜。用p53、Bax、Bcl-2、細胞周期蛋白D1、Cdkl和肌動蛋白抗體探測膜。一級抗體用辣才艮過氧化物第二抗體檢測，並經westpico化學發光試劑處理。圖6顯示涉及細胞周期調控和細胞凋亡的各種蛋白質的蛋白質印跡分析。等量的蛋白質是加載在4條道中。用圖例(figurelegend)描述孔中加載的不同樣品。結果表明，與任一藥物單獨處理相比，在組合處理中抗凋亡蛋白Bcl-2明顯下調，這幾乎等同於對照。這與在FACS分析的組合處理中可見的凋亡增加相關。在所有處理樣品中，促凋亡蛋白Bax相對於對照略有上調。在組合處理中腫瘤抑制蛋白p53相比於對照明顯上調，但不如其它兩個處理組那麼多。Cdkl-Bl是有絲分裂的引發劑。這種酶的去調節(deregulation)導致肺瘤發生。因此，抑制Cdkl將抑制其活性並因此啟動有絲分裂和細胞增殖。圖表明，阿黴素明顯誘導Cdkl水平，而加入化合物A降低Cdkl至可忽略的水平，從而阻止細胞進入有絲分裂。單獨的化合物A顯示與對照相等的水平。細胞周期蛋白Dl的水平在各處理組中沒有顯示明顯變化。在組合處理中，水平等同於對照，而在化合物A和阿黴素單獨處理中，發現水平略有下降。31實施例19:本實施例顯示阿黴素和CDK抑制劑(化合物A)的組合在非小細胞肺(H-460)異種移植模型中的體內效力測試。從美國菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC),USA獲得的人類非小細胞肺癌(H-460)細胞系用於這項研究。通過將化合物溶於鹽水製備用於腹腔注射(i.p.)的阿黴素和化合物A。使用體重為20g的一組36隻雄性的6-8周齡的嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠。在37。C、5。/。C02培養箱中，人類非小細胞肺癌(H-460)細胞在含有10%的胎牛血清的RPMI1640培養基上生長。通過以1000rpm離心10分鐘使細胞沉澱。細胞再懸浮於鹽水中，以得到25X106細胞/毫升的計數，通過皮下(s.c.)途徑向SCID小鼠注射0.2毫升的這種細胞懸液。每隔一天觀察小鼠的可觸知的腫瘤塊。一旦腫瘤的大小達到5-7毫米直徑，動物隨機分入如下面表14標明的各處理組。如表15所示，每周施用阿黴素一次，而連續5天每天一次施用化合物A。首次施用阿黴素6小時的間隔後施用化合物A，接著在構成一個周期的5天的時間中每天施用化合物A。在兩天的間隔後，開始下一周期。處理包括總共2個周期。每天記錄體重。每隔一天記錄腫瘤大小和其它毒性症狀。沒有發現明顯的體重減輕或病態症狀。按長橢球公式估計腫瘤重量(mg):(長度(mm)x[寬度(mm)"x0.5)，假設比重是1且兀是3。在化合物處理的動物中的肺瘤生長計算為T/C(處理/對照)x100%，且生長抑制百分比(GI%)為[100-T/C。/0]。結果如圖7a、7b、8和9中圖形所示。表14tableseeoriginaldocumentpage32tableseeoriginaldocumentpage33S-鹽水，P-化合物A，D-阿黴素。M、T、W、T和F:周工作日(星期一、星期二、星期三、星期四和星期五)">，，表示在化合物A之前施用阿黴素。實施例20:使用COX-2抗體的蛋白質印跡分析圖9表明使用COX-2抗體的蛋白質印跡分析。用圖例描述孔中加載的不同的樣品。結果表明對照顯示低的COX-2的基礎水平。單獨的化合物A也顯示COX-2的低水平。阿黴素強烈誘導的COX-2,其通過NFKB信號傳導途徑導致藥物抗性。在阿黴素之後加入化合物A明顯下調COX-2。因此，化合物A對NFkB介導的C0X-2抑制可能參與抑制腫瘤的生長和在人類非小細胞肺癌(H-460)肺瘤異種移植物中阿黴素誘導的藥物:沆性。實施例21:阿黴素和夫拉平度在人類非小細胞肺癌細胞系(H-460)中的組合研究本實施例說明，在施用細胞毒性抗肺瘤劑阿黴素後(表16A)、前(表16B)或伴隨(表16C)施用夫拉平度沒有協同效應。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。按照表16A,首先單獨使用任一藥物(即，單獨的阿黴素或單獨的夫拉平度)處理細胞。阿黴素處理進行首先24小時，接著完全培養基處理96小時；而在夫拉平度的情況中，首先完全培養基處理24小時，接著夫拉平度處理接下來的96小時。所用的阿黴素的濃度為30nM、70nM、100nM和200nM,而以200nM和350nM的濃度使用夫拉平度(分別是48小時處理後的IC3o和ICso濃度)。在組合研究中，首先用30nM、70nM、100nM和200nM的阿黴素處理細胞24小時，接著200nM和350nM的夫拉平度處理96小時。藥物處理完成後，即在120小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照相比計算細胞毒性百分比。結果如下面的表16A所示。按照表16B，首先單獨使用任一藥物(即，單獨的阿黴素或單獨的夫拉平度)處理細胞。首先夫拉平度處理進行96小時，接著完全培養基處理24小時；而在阿黴素的情況中，首先完全培養基處理96小時，接著阿黴素處理24小時。所用的阿黴素的濃度為30nM、70nM、100nM和200nM,而以200nM和350nM的濃度使用夫拉平度(48小時處理後的IC3。和IC5o濃度)。在該組合研究中，加入200nM或350nM的夫拉平度前96小時，接著30nM、70nM、100nM或200nM的阿黴素24小時。藥物處理完成後，即在120小時結束時，板進行處理以進行MTS生存力分析，並與對照相比計算細胞毒性百分比。結果如下面的34表16B所示。表16C顯示，同時施用阿黴素和夫拉平度的組合120小時沒有協同效應。以1500細胞/孔的密度接種人類非小細胞肺癌H-460細胞。首先單獨使用任一藥物，即，單獨的阿黴素或單獨的夫拉平度處理細胞120小時。所用的阿黴素的濃度為30nM、70nM、100nM和200nM,而以200nM和350nM的濃度使用夫拉平度(48小時處理後的IC3和~1FP(200nM)(96小時)tableseeoriginaldocumentpage35B)夫拉平度，^接著阿黴素FP(96小時)(200nM)>Doxo(24小時)FP(96小時)(350nM)>Doxo(24小時)Doxo,濃度細胞毒性％Doxo,濃度細月包毒小生%200nMFP>Doxo26200nMFP〉Doxo80100nMFP>Doxo26100nMFP〉Doxo7570nMFP>Doxo2670nMFP>Doxo7930nMFP>Doxo2430nMFP>Doxo77FP200nM29FP350nM73'〉'表示在另一藥物之前施用一種藥物,c)同時施用的夫拉平度和阿黴素Doxo+FP(200nM)(120小時)Doxo,濃度細胞毒性％200nMDoxo.48Doxo.+FP68100nMDoxo.24Doxo.+FP6270nMDoxo.28Doxo.+FP6530nMDoxo.2Doxo.+FP35FP200nM39Doxo+FP(350nM)(120小時)Doxo,濃度細胞毒性%200nMDoxo.48Doxo.+FP88100nMDoxo.24Doxo.+FP8570nMDoxo.28Doxo.+FP8730nMDoxo.2Doxo.+FP80FP350nM81Doxo=阿黴素，FP二夫拉平度"+"表明同時施用藥物。3權利要求1.一種藥物組合，包含選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑，和CDK抑制劑或其對映異構體或藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述CDK抑制劑由下面的式I代表；式1其中，Ar是苯基，其是未取代的或被選自以下的1、2或3個相同或不同的取代基取代選自氯、溴、氟或碘的滷素、硝基、氰基、C1-C4烷基、三氟甲基、羥基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4烷氧羰基、CONH2和NR1R2；其中，R1和R2各獨立地選自氫或C1-C4烷基。2.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述CDK抑制劑是式I的化合物，其中，所述苯基被選自以下的l、2或3個相同或不同的取代基取代選自氯、溴、氟或硤的滷素、C廣C4烷基或三氟甲基。3.如權利要求2所述的藥物組合，其中，所述CDK抑制劑是式I的化合物，其中，所述苯基被選自氯、溴、氟或石典的l、2或3個滷素取代。4.如權利要求3所述的藥物組合，其中，所述CDK抑制劑是式I的化合物，其中，所述苯基被氯取代。5.如權利要求2所述的藥物組合，其中，所述CDK抑制劑是式I的化合物，其中，所述苯基被l、2或3個三氟甲基基團取代。6.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述由式I的化合物代表的CDK抑制劑是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羥基-8-(2-羥甲基-l-曱基-吡咯烷-3-基)-苯並吡喃-4-酮或其藥學上可接受的鹽。7.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述細胞毒性抗腫瘤劑是紫杉醇。8.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述細胞毒性抗肺瘤劑是多西他賽。9.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述細胞毒性抗腫瘤劑是阿黴素。10.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述細胞毒性抗腫瘤劑是吉西他濱。11.如權利要求1所述的藥物組合，其中，所述組合適合用於治療選自乳腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卯巢癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌和肝細^<癌的癌症。12.如權利要求11所述的藥物組合，其中，所述癌症是非小細胞肺癌或胰腺癌。13.—種治療需要治療的受試者的選自乳腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌和肝細胞癌的癌症的方法，其中，所述方法包括施用權利要求1所述的藥物組合。14.如權利要求13所述的方法，其中，所述癌症是非小細胞肺癌或胰腺癌。15.—種治療需要治療的受試者的選自乳腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌和肝細胞癌的癌症的方法，其中，向需要治療的受試者施用權利要求1所述的藥物組合，使得同時或順序施用治療量的選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑，和治療量的由式I的化合物代表的CDK抑制劑或其對映異構體或藥學上可接受的鹽或溶劑化物。16.如權利要求15所述的方法，其中，同時施用治療量的選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑，和治療量的由式I的化合物代表的CDK抑制劑或其對映異構體或藥學上可接受的鹽或溶劑化物。17.如權利要求15所述的方法，其中，順序施用治療量的選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗肺瘤劑，和治療量的由式I的化合物代表的CDK抑制劑或其對映異構體或藥學上可接受的鹽或溶劑化物。18.如權利要求17所述的方法，其中，在治療量的由式I的化合物代表的CDK抑制劑或其對映異構體或藥學上可接受的鹽或溶劑化物之前施用治療量的選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素和吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑。19.如前述權利要求13-18中的任一項所述的方法，其中，所述組合顯示治療的協同作用。全文摘要本發明涉及包含一種選自紫杉醇、多西他賽、阿黴素或吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑，和至少一種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑的新的藥物組合；其中，所述組合在用於治療癌症時顯示協同效應。本發明還涉及使用治療有效量的所述組合治療癌症的方法。文檔編號A61K31/522GK101677567SQ200780052995公開日2010年3月24日申請日期2007年5月15日優先權日2007年5月15日發明者H·克漢瓦爾卡爾,K·喬施,M·拉索斯,S·沙瑪申請人:皮拉瑪生命科學有限公司