製備腎病綜合症出血熱疫苗的方法
2023-10-11 10:27:59 1
專利名稱：製備腎病綜合症出血熱疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備Hanta病毒疫苗的方法，特別是利用正常人的二倍體細胞系製備腎病綜合症出血熱Hanta病毒疫苗的方法，以及由此生產的一種疫苗。
自本世細三十年代以來，對流行性出血熱病原已進行了廣泛的研究，雖然日本和俄國研究者推測是一種病毒，但未能分離出。
1976年，一位韓國病毒學家Ho-Wang Lee首次從韓國京畿道Dongdoochun-Eup Songnae-Ri捕獲的條斑地鼠(Apodemus agrarius)的肺組織中發現了病毒，同時他也發現該病毒與未康復的出血熱病人血清特異性地結合著;在這種情況下，就將其初步命名為「韓國抗原」(參見Lee et al.，The Korean Journal of Internal Medicine，9371-383，1976)。1978年，「韓國抗原」被證明是流行性出血熱的病原(參見Lee et al.，J.Infect.Dis.，137298-308，1978);並於1980年重新命名為「Hantaan病毒」(參見Information Exchange Sulicommittee，American Committee on Arthropod-borne Viruses(Karabastos，ed.)Ft.Collins，Colo.，80522，1980)，其根據為它是一種病毒，並且，這種條斑田鼠是由韓國Hantaan河周圍捕獲的。目前，Hantaan病毒已被收錄在美國出版的蟲媒病毒手冊(Arbovirus Catalogue)中。
具有類似症狀的疾病不僅在韓國，而且在日本、中國和斯堪迪納維亞國家出現，從抗原結構看，被鑑出的致病性病毒與所說的Hantaan病毒相似(參見Gajdusek，J.Pediatr.，60841-857，1962;Lee and Lee，Lancet，i186-187，1979;Svedmyr et al.，Lancet，i100，1979;Lee et al.，Lancet，i819-820;Lee et al.，Lancet，i1025-1026，1980;Gavrilovskaya.，Lancet，i1050，1981;Kitamura et al.，Jap.J.Med.Sci.Biol.，3617-25，1983;Song et al.，J.Infec.Dis.，150889-894，1984;Sugiyama et al.，J.Infec.Dis.，152126-136，1985)。在這種情況下，世界衛生組織(WHO)決定稱所有這類類流行性出血熱為「腎病綜合症出血熱(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome，HFRS)」(參見WHO Report，1982，Tokyo，WHO/WPR/RPD/WG/82，16)。
腎病綜合症出血熱的病原已被分類為Bunya病毒科的一個新病毒屬，即Hanta病毒。Hanta病毒的亞屬包括Hantaan病毒，漢城病毒(Seoul Virus)，景山病毒(Prospect Hill Virus)和Puumala病毒，它們均已按其血清學特性作了鑑定(參見Schmaljohn，Science，2271041-1044，1985)。
1981年，用一株肺癌細胞-A549細胞(ATCC登記號CCL185)首先將Hantaan病毒繁殖成功(參見French et al.，Science，2111040-1048，1981);1982年用一株非洲綠猴(African Monkey)腎細胞克隆Vero E6細胞(ATCC登記號C1008，CRL1586)，成功地繁殖了該病毒(參見McCormik et al.，Lancet，i765-768，1982)。
另一方面，一些其他Hanta病毒，如漢城病毒、景山病毒和Puumala病毒據報導也能感染所說的Hantaan病毒的宿主細胞Vero E6細胞株(參見Lee et al.，Manual of Hemorrhagic Fever withRenal Syndrome，Ryo Moon Gak Press，1989);1989年也報告了Hantaan病毒感染了MDCK細胞(ATCC登記號CCL34)、一株狗腎細胞(參見Chung，Sang-In，Choongang J.Med.，Vol.14，Number 2，1989)。
Song Gan等人報告指出腎病綜合症出血熱疫苗可通過滅活金黃倉鼠腎細胞(GHKC)和蒙古Gerbils腎細胞(MGKC)而製備得到的(參見Song Gan et al.，J.of Korean Virology Society，Vol.21，Number 2，abstract，222-223，1991)。
為了製備適合於人用的疫苗，從人器官中分離的病毒通常被認為是製備疫苗基質材料的理想毒種，因為它可降低由接種外源蛋白而引起的副作用;因而，MRC-5(ATCC登記號CCL171)和WI-38細胞(ATCC登記號CCL75)已被很好地建議用於此目的。可是，這些細胞也已發現有其不利的一面，即它是已轉化的細胞(肺癌)和/或異源細胞(即來源於狗或猴腎細胞;或倉鼠或小鼠腎細胞)。
因此，一直不斷地存在有各種需求即採用人器官細胞來研製出一種增殖Hanta病毒的實用方法，以滿足所提到的穩定性和/或同源性的要求。
根據本發明亦已發現的腎病綜合症出血熱病原Hanta病毒能在來自胎兒的正常人二倍體細胞系上增殖，由此分離出的病毒是疫苗生產最好的基本材料。
因此，本發明的一個主要目的是提供一種使用正常人二倍體細胞系製備腎病綜合症出血熱Hanta病毒疫苗的新方法。
本發明的另一個目的是提供一種由此而生產出的疫苗。
本發明人研製出可以使Hantaan病毒增殖的胚源化的正常人二倍體細胞系;也就是說，所述的這些細胞系源自胎兒的肺、腎、皮膚肌肉和胸腺，並分別命名為「LuMA」(源自肺)，「KiMA」(源自腎)、「SMMA」(源自皮膚肌肉)和「ThyMA」(源自胸腺)。本發明使用上述細胞系作為宿主細胞用於Hanta病毒培養。這些細胞中有2株於1992年12月16日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NOC92007(LuMA)和CCTCC NOC92006(KiMA)。另一面，來自肺癌細胞的MRC-5和WI-38兩株細胞也已由ATCC分發供應作為對照細胞。
本發明的正常人二倍體細胞系來自胎兒器官和組織，具有接觸抑制效應，是非轉化細胞。它們均保持各自原有的形態學、生物學特徵和染色體數(2n＝46)。本發明人還發現本發明使用的正常的原代人二倍體細胞系的染色體數目，統計學上非常近似於2n＝46，這一點不同於MRC-5和WI-38細胞;所述細胞系從未受到外源病原的感染(參見Song-Yong Park et al.，J.Kor.Soc.Virol.，Vol.21.No.11-9，1991)。
本發明使用下列組份的複合培養基用於細胞培養90%(V/V)Eagle培養基和10%(V/V)胎牛血清(FBS)作為生長培養基;98%(V/V)Eagle培養基(Gibco.U.S.A.，Cat.No.＃430-2100)和2%(V/V)胎牛血清作為維持培養基;細胞在37℃和5%CO2條件下培養。用Hanta病毒屬四個亞屬，即Hantaan病毒，漢城病毒，景山病毒和Puumala病毒，感染正常人二倍體細胞系，在相同的生長條件下培養10多天。用間接免疫螢光抗體方法監測病毒對所說細胞的感染情況(參見J.of Clinical Microbiology，Vol22，No.6，1985)。
在上述情況下，本發明人驚奇地發現Hanta病毒能夠在正常人二倍體細胞系上大量繁殖;因此，本發明可用這種培養病毒來研製一種更為實用的生產疫苗的方法。按照本發明，以酶免疫測定法(enzyme immunoassay-EIA)為基礎，就能從組織培養器(表面積150cm2)培養Hanta病毒後的LuMA細胞上獲得10，000多抗原滴度。
經廣泛的研究，用本發明培養的病毒生產的Hantaan病毒疫苗，其抗體的產生能力要高於現有技術所用小鼠或大鼠腦組織繁殖的病毒疫苗。這一點與Lee等人的早期結果，即Hantaan病毒苗誘導的抗體產生是不顯著的，正好相反(參見Lee et al.，Arch Virol.，(Suppl.1)35-47.1990)。
本發明提出製備疫苗的新方法包括以下幾個步驟在胎兒的正常人二倍體細胞上增殖Hanta病毒;用胰蛋白酶或EDTA處理細胞培養物來收集所述的病毒;凍/融或超聲處理所收集的病毒，然後離心所述的病毒，用含有福馬林的溶液或用熱或紫外線滅活病毒，再加入氫氧化鋁佐劑以及按下列配方的穩定劑(參見表1)。
表1
在下列條件下，可通過熱、福馬林和紫外線處理以完全滅活Hanta病毒60℃ 20分鐘熱處理，0.05%(V/V)福馬林處理7天，或高於5.4×104J/m2(波長為365nm)的紫外線處理。根據測定，在福馬林或紫外線處理時採用低溫(低於4℃)會更好。
本發明在下列實施例中將進一步闡明，但這些並不應用來限定本發明的範圍。
本發明在上述或其它的目的和特性將在下面的附圖表的說明中表述得十分明顯，即
圖1顯示Hantaan病毒對不同宿主細胞的感染性發展過程測定;
圖2A顯示不同時間的熱處理對EIA值的影響;
圖2B描述不同時間的福馬林處理對EIA值的影響;
圖2C顯示不同紫外輻射劑量對EIA值的影響。
實施例1確定正常人二倍體細胞系對Hanta病毒的敏感性正常人二倍體細胞系對Hanta病毒的敏感性確定按下列步驟進行胎組織正常人二倍體細胞和Vero E6細胞(對照)培養成單層;以10∶1的比例(V/V)用維持培養基將吮乳小鼠或吮乳大鼠體內增殖的Hanta病毒(Hantaan病毒、漢城病毒、景山病毒和Puumala病毒)製成病毒懸液，用濾膜(孔徑0.22μm)過濾。按上述培養好的細胞用過濾後的病毒感染，在37℃，5%CO2培養箱中培養，每3-4天用間接免疫螢光抗體方法監測病毒感染情況。
如上述所示那樣，對Hanta病毒敏感的正常人二倍體細胞系進行了研究。表2和圖1提供了宿主細胞對Hantaan病毒的敏感性和按不同培養時間進行感染性的比較結果。表3也給出了對其它Hanta病毒敏感性的測定結果。
表2
表3
實施例2大量細胞培養按照下列方法中的任何一種就可以進行大量病毒培養用Hantaan病毒感染的正常人二倍體細胞(LuMA，CCTCC NOC92007)和長好的宿主細胞以1∶10至1∶50(V/V)比例同時培養;或用Hantaan病毒感染的細胞直接加入到培養好的單層細胞上培養。用幾種物理方法(超聲、凍/融)將Hantaan病毒感染的細胞破碎，該溶液以0.1至0.02M.O.I(感染複數-multiplicity of infection)接種到單層細胞，這樣獲得的接種液置5%CO2中吸收30多分鐘，加入維持培養基後進行10天增殖培養。最後，收穫病毒感染的宿主細胞。
實施例3病毒的分離病毒分離按如下步驟進行在實施例2中獲得的病毒感染宿主細胞通過反覆凍(-70℃)和融(37℃或室溫);或，在20KHz超聲30-90秒來破碎，含有破碎細胞的病毒液以3500rpm離心30分鐘，收集上清液為以後使用。按韓國專利號39，291公開的方法確定上清液和沉澱物的EIA值，在表4已列出結果。
表4
＊組織培養器的表面積為150cm2實施例4病毒的滅活用熱、福馬林或紫外線輻射處理來滅活上述獲得的病毒。表5和圖2提供了抗原滴度和滅活比率。
從表5和圖2的結果可知，可以肯定在下列條件下可達到完全滅活熱處理(60℃，20分鐘以上)，福馬林處理(0.05%(V/V)，七天以上)，紫外輻射(波長365nm，大於5.4×104J/m2)。
實施例5Hantaan病毒疫苗的配製通過給由實施例4獲得的滅活Hantaan病毒液中加入表1中所列的穩定劑來配製Hantaan病毒疫苗。以0.5ml/大鼠的劑量接種大鼠，用間接免疫螢光抗體法來確定免疫原性。依照不同的滅活方法在表6中提供了各抗體滴度值的比較。
從表6的結果來看，用各種滅活方法製備的疫苗在抗體產生中沒有明顯的差異。
為了說明本發明的Hantaan病毒疫苗，按實施例6和7對藥物特性進行了研究。
實施例6大鼠免疫劑量的確定用實施例1至5中製備的Hantaan病毒疫苗以不同的抗原滴度接種大鼠以獲得最佳免疫劑量，同時用間接免疫螢光抗體方法監測抗體產生情況，每10天肌肉內注射Hantaan病毒一次，共三次，表7表示三次接種後的抗體效價。
表7的結果表明，本發明的疫苗注射10多個EIA值的量時就可監測到抗體的產生力。
實施例7比較Hantaan病毒的免疫原性來自正常人二倍體細胞系和鼠腦的Hantaan病毒疫苗，即，用本發明生產的和在韓國專利號39.291上描述的現有技術製備的疫苗，它們的免疫原性，在它們以不同抗原滴度接種到大鼠後進行了比較。表8提供肌肉內接種後確定的抗體滴度值。
如表8所示，已確定用本發明中的正常人二倍體細胞系生產的Hantaan病毒疫苗誘導的抗體要比早先鼠腦製造的疫苗誘導的抗體更優越。
實施例8使用來自腎(KiMA)、皮膚肌肉(SMMA)和胸腺(ThyMA)的細胞系進行疫苗生產來自腎(KiMA，CCTCC NOC92006)，皮膚肌肉(SMMA)和胸腺(ThyMA)的細胞系也按實施例2、3和4中所描述的相同程序參與了病毒培養、分離和滅活過程;同時也確定了免疫原性。幾種細胞系生產的免疫原性分別確定為8，500EIA(KiMA)、6，000EIA(SMMA)和5，200EIA(ThyMA)，它們在實際使用中相當於在實施例3中用150cm2組織培養瓶獲得的10，000EIA LuMA(CCTCC NOC92007)。福馬林的完全滅活是與實施例4相同的處理條件下進行監測，抗體滴度也幾乎是與LuMA相等水平上進行測定的。
隨著上述清楚的說明和討論，已確定本發明使用正常人二倍體細胞系，即來自肺的LuMA細胞，來自腎的KiMA細胞，來自皮膚肌肉的SMMA細胞和來自胸腺的ThyMA細胞，製備Hanta病毒疫苗的新方法適合於製備針對腎病綜合症出血熱的疫苗，以及由此生產的疫苗按抗體產生和免疫原性看也對預防所述疾病是高度有效的。
權利要求
1.一種製備腎病綜合症出血熱疫苗的方法，該方法包括在胎兒的正常人二倍體細胞上繁殖Hanta病毒；收集所述的繁殖後的病毒；凍/融或超聲處理所收集的病毒；用熱、福馬林或紫外線輻射滅活病毒；以及，加入如Al(OH)3類佐劑及穩定劑。
2.如權利要求1的製備腎病綜合症出血熱疫苗的方法，其中所說的Hanta病毒是選自Hantaan病毒、漢城病毒、景山病毒和Pummala病毒中的一種。
3.如權利要求1的製備腎病綜合症出血熱疫苗的方法，其中所說的正常人二倍體細胞系是LuMA(CCTCC NOC92007)。
4.如權利要求1製備腎病綜合症出血熱疫苗的方法，其中所說的正常人二倍體細胞系是KiMA(CCTCC NOC92006)。
5.一種由權利要求1的方法生產出的腎病綜合症出血熱疫苗。
全文摘要
本發明涉及了使用正常人二倍體細胞系製備腎病綜合症出血熱Hanta病毒疫苗的新方法以及由此生產出的疫苗。本發明的方法包括在來自胚胎源的正常人二倍體細胞上增殖Hanta病毒；收集所述增殖後的病毒；凍/融或超聲處理收集的病毒；用熱、福馬林或紫外線處理來滅活病毒；加入如Al(OH)
文檔編號C12N7/04GK1076865SQ93102220
公開日1993年10月6日 申請日期1993年3月10日 優先權日1992年3月27日
發明者金惠淑, 黃圭桂, 樸松用, 文洪模 申請人:牧巖生命工學研究所