結合ccx-ckr2的試劑的製作方法

2023-10-11 15:31:34 3

專利名稱：結合ccx-ckr2的試劑的製作方法
結合CCX-CKR2的試劑相關專利申請的交叉參考 本專利申請要求於2005年4月21日提交的第60/674， 140號美國臨時專利申請， 的優先權，出於所有目的，該申請被納入本文作為參考。發明背景趨化因子構成小細胞因子家族，尤其是在炎症中產生並調節白細胞補充、活化 和增殖的小細胞因子家族(Baggiolini，M等，Jdv. /mmw"o/. 55: 97-179(1994); Springer, T.A.， J""", i ev. P/z>w'o/.57:827-872(1995);禾卩Schall， T丄和K.B.Bacon， 0#r. 0/ /". /wmwo/. 6:865-873(1994))。趨化因子能選擇性誘導血液中成形元素(除紅血細胞外) 的趨化作用，包括白細胞如中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜曙紅細胞、嗜鹼 細胞、肥大細胞以及包括T細胞和B細胞在內的淋巴細胞。除了刺激趨化作用外， 趨化因子還可選擇性誘導應答細胞內的其它變化，包括細胞形狀變化、暫時提高細 胞內游離鈣離子(<^2+)濃度、顆粒胞吐、上調整聯蛋白、形成生物活性脂質(如白細胞 三烯)、表達細胞因子、以及與白細胞活化、生長和增殖相關的呼吸爆發。因此，趨 化因子是炎症反應的早期觸發器，能引起炎症介質釋放、趨化和外滲到感染或炎症 部位。趨化因子的兩個亞家族，稱之為CXC和CC趨化因子，根據4個保守半胱氨酸 殘基中前2個的排列來區分，其要麼被一個胺基酸所隔開(如CXC趨化因子中的 SDF-1、 IL-8、 IP-IO、 MIG、 PF4、 ENA-78、 GCP-2、 GRO a 、 GRO P 、 GRO y 、 NAP-2、 NAP-4、 I-TAC)，要麼為相鄰殘基(如CC趨化因子中的MIP-1 a 、 MIP-1 P 、 RANTES、 MCP-1、 MCP-2、 MCP-3、 1-309)。大多數CXC趨化因子吸引中性粒細胞。 例如，CXC趨化因子白介素8(IL-8)、血小板因子4(PF4)和中性粒細胞活化肽2(NAP-2) 是中性粒細胞的有效化學引誘物和活化劑。稱為MIG(Y幹擾素誘導的單核因子)和 IP-10(幹擾素Y可誘導的10kDa蛋白質)的CXC趨化因子在誘導活化的外周血淋巴細 胞的趨化方面尤其具有活性。CC趨化因子通常具有較少選擇性並能吸引各種白細胞 類型，包括單核細胞、嗜曙紅細胞、嗜鹼細胞、T淋巴細胞、粒細胞和自然殺傷細胞。 CC趨化因子如人單核細胞趨化蛋白l-3(MCP-l、 MCP-2和MCP-3)、 RANTES(活化 後可調節的、正常T細胞表達並分泌的)和巨噬細胞炎性蛋白1 a和1 P (MIP-1 a和 MIP-1 0 )具有單核細胞或淋巴細胞的化學引誘劑和活化劑的特徵，但似乎不是中性 粒細胞的化學引誘劑。CC和CXC趨化因子通過屬於7跨膜的G蛋白偶聯受體超家族的受體進行作用 (Murphy， P.M.， /^ammco/^v.52:145-176(2000))。該G蛋白偶聯受體家族包括含有 7個跨膜區的一大群整合膜蛋白。該受體可與G蛋白偶聯，該G蛋白為能結合GTP 並例如通過生產胞內介質來介導來自偶聯受體的信號傳導的異源三聚體調控蛋白。 而且，趨化因子受體可獨立進行G蛋白偶聯。例如主要在紅血細胞上表達的Duffy 受體是一種濫交趨化因子結合受體，其被認為是像趨化因子般作用，從循環環境中 除去趨化因子。總地來講，趨化因子和趨化因子受體之間的相互作用傾向於濫交，即一種趨化 因子能結合許多趨化因子受體並且反過來一種趨化因子受體能與多種趨化因子相互 作用。針對該規則還有一些例外； 一種此類例外為SDF-1和CXCR4之間的相互作用 (Bleul等， /五x; MM， 184(3): 1101-9(1996); Oberlin等，A^wre ， 382(6594):833-5(1996))。 最初確定為前B細胞生長刺激因子(Nagasawa等，7Vw/ Jcfld Sd ， 91(6):2305-9(1994))的SDF-1為唯一報導過的CXCR4的人配體。SDF-1基因通過另 路剪接編碼兩種蛋白質，稱為SDF-1 a和SDF-1 P 。除了存在於SDF-1 6的N端而 在SDF-1 a上不存在的4個胺基酸殘基外，這兩種蛋白質是相同的。趨化因子受體信號轉導和對配體的選擇的許多方面還未被理解。例如，有許多 功能未確定的孤受體。例如，RDC1，雖然早期認為它是血管活性腸肽(VIP)的受體， 但由於無法確定其內源性配體，直到最近才認為它是孤兒受體。參見例如Cook等， ^m 丄她.300(2):149-152(1992)。最近確定，被重命名為CCX-CKR2的RDC1結合趨化因子SDF-1和I-TAC。參 見例如PCT/US04/34807和美國專利申請號10/698,541、 10/912,638和11/050,345， 均將其全文納入本文作為參考。發明概述本發明提供了競爭性抑制競爭者抗體與CCX-CKR2結合的抗體，其中該競爭者 抗體含有以下序列的互補決定區(CDR): SEQIDNO:12和SEQIDN0:14;或 SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18。一些實施方式中，該抗體連接到可檢測標記上。 一些實施方式中，該抗體連接 到放射性同位素或細胞毒化學物質上。一些實施方式中，該抗體為單克隆抗體。 一些實施方式中，該抗體為抗體片段。 一些實施方式中，該抗體為人源化抗體。一些實施方式中，該抗體包含SEQIDNO:12和/或SEQIDNO:14的互補決定區 (CDR)或與SEQ ID NO: 12禾口/或SEQ ID NO: 14的CDR基本相同的CDR。 一些實施 方式中，該抗體包含SEQ ID NO: 12和/或SEQ ID NO: 14。一些實施方式中，該抗體包含SEQIDNO:16和/或SEQIDNO:18的互補決定區 (CDR)或與SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:18的CDR基本相同的CDR。 一些實施 方式中，該抗體包含SEQ ID NO: 16和/或SEQ ID NO: 18。本發明還提供了含有藥學上可接受的賦形劑和競爭性抑制競爭者抗體與 CCX-CKR2結合的抗體的藥物組合物，其中所述競爭者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR):SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14;或 SEQ ID NO: 16禾卩SEQ ID NO: 18。一些實施方式中，該抗體為單克隆抗體。 一些實施方式中，該抗體為抗體片段。 一些實施方式中，該抗體為人源化抗體。一些實施方式中，該抗體包含SEQIDNO:12禾卩/或SEQIDNO:14的互補決定區 (CDR)或與SEQ ID NO: 12禾口/或SEQ ID NO: 14的CDR基本相同的CDR。 一些實施 方式中，該抗體包含SEQ ID NO: 12和/或SEQ ID NO: 14。一些實施方式中，該抗體包含SEQIDNO:16禾n/或SEQIDNO:18的互補決定區 (CDR)或與SEQ ID NO: 16和/或SEQ ID NO: 18的CDR基本相同的CDR。 一些實施 方式中，該抗體包含SEQ ID NO: 16禾口/或SEQIDNO:18。本發明還提供了在生物樣品中檢測表達CCX-CKR2的細胞的方法。 一些實施方 式中，該方法包括將生物樣品與抗體接觸並檢測抗體的存在，其中所述抗體競爭性 抑制競爭者抗體與CCX-CKR2結合，其中所述競爭者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR):SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或 SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO:18。一些實施方式中，該抗體連接到可檢測標記上。
本發明還提供抑制血管發生或癌細胞增殖的方法。
一些實施方式中，該方法包括將所述細胞接觸競爭性抑制競爭者抗體與CCX-CKR2結合的抗體的步驟，其中所 述競爭者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR): SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或SEQIDNO:16和SEQIDNO:18，從而抑制癌細胞非血管發生或增殖。一些實施方式中，該抗體為單克隆抗體。 一些實施方式中，該抗體為單克隆抗 體。 一些實施方式中，該抗體為抗體片段。 一些實施方式中，該抗體為人源化抗體。一些實施方式中，該抗體包含SEQIDNO:12禾卩/或SEQIDNO:14的互補決定區 (CDR)或與SEQ ID NO: 12和/或SEQ ID NO: 14的CDR基本相同的CDR。 一些實施 方式中，該抗體包含SEQ ID NO: 12禾口/或SEQ ID NO: 14。一些實施方式中，該抗體包含SEQIDNO:16和/或SEQIDNO:18的互補決定區 (CDR)或與SEQ ID NO:16禾口/或SEQ ID NO:18的CDR基本相同的CDR。 一些實施 方式中，該抗體包含SEQIDNO:16和/或SEQIDNO:18。一些實施方式中，該細胞存在於個體中。 一些實施方式中，該個體患有或易患 關節炎。 一些實施方式中，該個體不是人。本發明還提供了鑑定CCX-CKR2調控因子(modulator)的方法。 一些實施方式中， 該方法包括(a) 將表達CCX CKR2多肽的細胞或細胞提取物與檢測試劑混合；和(b) 進行試驗以測試檢測試劑是否與競爭者抗體競爭結合CCX CKR2多肽，其中 所述競爭者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR):SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或 SEQ ID NO: 16禾口 SEQ IDNO:18，其中，競爭者抗體與檢測試劑之間結合CCX-CKR2多肽的競爭是該檢測試劑為 CCX CKR2活性調控因子的表徵。一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:14的互補決 定區(CDR)。在一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的互補決 定區(CDR)。 一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。本發明還提供了測試檢測試劑調控CCX-CKR2活性的效力的方法。該方法可用 於，例如，當利用本發明的抗體作為對照藥物來分析CCX-CKR2小分子激動藥或拮 抗藥時。 一些實施方式中，該方法包括(a) 將檢測試劑給予第一動物；(b) 給予第二動物與競爭者抗體競爭結合CCX CKR2多肽的抗體，其中該競爭者 抗體含有以下序列的互補決定區(CDR):SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或 SEQIDNO:16和SEQIDNO:18;和(c) 比較檢測試劑對第一動物的影響和抗體對第二抗體的影響。 一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14的互補決定區(CDR)。在一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。 一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQIDNO:16和SEQIDNO:18的互補決定區(CDR)。 一些實施方式中，該競爭者抗體包含SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。 本發明還提供了含有SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18或者SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的至少一種CDR的多肽。 一些實施方式中，該多肽為抗體。本發明還提供了編碼SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18或者SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的至少一種CDR的多核苷酸。 一些實施方式中，該多核苷酸含有SEQIDNO:ll、 SEQ IDNO:13、 SEQIDNO:15或SEQIDNO:17。本發明還提供了製備嵌合體抗體的方法。
一些實施方式中，該方法包括將編碼SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的至少一種互補決定區(CDR)的多核苷酸可操作地連接到至少編碼抗體重鏈或輕鏈骨架區 的異源多核苷酸上，以形成編碼抗體的嵌合重鏈或輕鏈的融合多核苷酸；和 從所述融合多核苷酸表達嵌合重鏈或輕鏈。定義"RDC1"，本文中稱為"CCX-CKR2"，指假定有7跨膜區的G蛋白偶聯受體 (GPCR)。 CCX-CKR2狗直向同源序列最初在1991年確定。參見Libert等，&/e"ce 244:569-572(1989)。該狗序列描述於Libert等，7Vwci油U(7): 1917(1990)。小 鼠序列描述於如Heesen等，/mmw"oge""/cs 47:364-370 (1998)。人序列描述於如 Sreedharan等，屍rac. Ato/. Jcad "SL4 88:4986-4990 (1991)，其將該蛋白質錯誤描 述為血管活性腸肽受體。"CCX-CKR2"包含為SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的保守性修飾變體的序列。CCX-CKR2的片段為上面列出的序列之一或其保守性修飾變體的至少5個，某些時候至少IO、 20、50、 100、 200、 300或直到300個毗連胺基酸的片段。"對象"或"個體"指動物，包括人、非人靈長類、小鼠、大鼠、狗或其它哺 乳動物。"化療劑"指一種試劑，當其被給予個體後足以抑制、減慢或停止癌細胞的生 長，或足以在癌細胞內產生細胞毒性效應。因此，短語"化療有效量"描述了將化 療劑給予個體後足以抑制、減慢或停止癌細胞生長，或者足以對癌細胞產生(直接或 間接)細胞毒性效應的量。"亞治療量"指比足以抑制、減慢或停止癌細胞生長，或足 以對癌細胞產生細胞毒性效應的量少的量。"抗體"指包含免疫球蛋白基因的骨架區或其片段從而能特異性結合併識別抗 原的多肽。公認的免疫球蛋白基因包括K 、 A、 a、 y、 S、 e和P恆定區基因， 以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為K或入。重鏈分為Y、 U、 a、 S和e， 其依次分別定義免疫球蛋白類型IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。天然形成的免疫球蛋白具有相同的核心結構，其中兩條相同輕鏈(大約24kD)和 兩條相同重鏈(大約55或70kD)形成四聚體。每一條鏈的胺基酸末端部分已知為可變 區(V)並且可與每條鏈剩下的較為保守的恆定區(C灘區另l」。輕鏈的可變區內有已知為 J區的C端部分。重鏈的可變區內除了 J區外還有D區。免疫球蛋白上的大多數氨 基酸序列變化均限於已知為與抗原結合直接相關的超變區或互補決定區(CDR)的V 區上的3個分離的部位。從胺基酸末端開始，這些區域分別稱為CDR1、 CDR2和 CDR3。 CDR由更保守的骨架區(FR)限制於固定位置。從胺基酸末端開始，這些區域 分別稱為FR1、 FR2、 FR3和FR4。 CDR和FR區的位置以及編號系統由Kabat等確 定(Kabat等，《免疫學感興趣的蛋白質序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，美國健康和人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services),美國政府印刷辦公室(U. S. Government Printing Office) (1991))。示例性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含一四聚體。每一四聚體由兩對同樣的多肽 鏈組成，每對均具有一 "輕"鏈(大約25kDa)和一 "重"鏈(大約50-70kDa)。每條鏈 的N末端定義有大約100-110或更多胺基酸的主要負責抗原識別的可變區。術語可 變輕鏈(VO和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。抗體例如以完整的免疫球蛋白或以由各種肽酶消化產生的許多特徵片段而存 在。因此，例如，胃蛋白酶消化抗體鉸鏈區內的二硫鍵以生產F(ab)'2，其為Fab的 二聚體，Fab本身是通過二硫鍵連接到VH-Cm的輕鏈。F(ab)'2可在溫和條件下還原
以打破其鉸鏈區的二硫鍵，從而將F(ab)，2二聚體變為Fab，單體。Fab，單體本質上是 Fab加上部分鉸鏈區(參見(f基鄉競i^學JY屍WW^M五;V7^L/MMtWOZ0GJ9 (Paul編， 第三版，1993)。雖然各種抗體片段被定義為通過消化完整抗體製得，本領域技術人 員將意識到此類片段可通過化學方法或通過利用重組DNA方法從頭合成。因此，本 文中採用的術語抗體還包括通過修飾完整抗體生產的或利用重組DNA法從頭合成 的(例如單鏈Fv)或利用噬菌體展示文庫鑑定的抗體片段(參見McCafferty等，Atowe 348:552-554(1990))。可以採用本領域任何已知技術製備單克隆或多克隆抗體(參見例如Kohler和 Milstein， Atow" 256:495-497 (1975); Kozbor等，/mmwwo/ogy 7bi/ay 4:72 (1983); Cole等，(f単^"蘑拔^"/〃^^i^治^^ (Mo"oc/o"a/ v4""Zw&" Ca"cer 7T2era^」第77-96 頁(1985))。"單克隆"抗體指來源於單個克隆的抗體。生產單鏈抗體的技術(美國專利 No.4，946,778)可用於生產本發明多肽的抗體。同樣，轉基因小鼠或其它生物如其它哺 乳動物可用於表達人源化抗體。或者，噬菌體展示技術可用於確定特異性結合所選 抗原的抗體和異側Fab片段(參見例如McCafferty等，A^wre 348: 552-554 (1990); Marks等，所o/ec/mo/ogy 10:779-783(1992))。"嵌合抗體"是一種抗體分子，其中，(a)恆定區或其部分被改變、替換或互換， 以至於抗原結合位點(可變區)連接到不同或變化的綱、效應器功能和/或種、或完全 不同的分子的恆定區，從而為嵌合抗體帶來新的屬性，如酶、毒素、激素、生長因 子、藥物等；或(b)可變區或其部分被改變、替換或與具有不同或變化的抗原特異性 的可變區互換。"人源化"抗體是一種保留非人抗體反應性卻對人較少有免疫原性的抗體。這 可通過例如保留非人CDR區並用人對應部分替換抗體的剩餘部分而獲得。參見例如 Morrison等，屍rac,胸/. ^ca"c/.固，81:6851-6855(1984); Morrison和Oi， A/v. /mmw"o/.， 44:65-92(1988); Verhoeyen等，Sde"ce， 239:1534-1536(1988); Padlan， 7Wo/ec./mmww, ， 28:489-498(1991); Padlan， Molec. Immun.， 31(3):169-217(1994)。術語"分離的"當用於蛋白質時表示該蛋白質基本上不帶天然狀態下與其聯合 的其它細胞組分。優選處於均質狀態，但也可以為無水或含水溶液。純度和同質性 一般利用分析化學技術如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜測定。存在於製備物 中的優勢種蛋白質是基本純的。術語"純的"表示在電泳凝膠中基本產生一條帶的 蛋白質。具體地，意味著該蛋白質為至少85%純、更優選至少95%純、和最優選至 少99%純。 當涉及蛋白質或肽時，短語"特異性(或選擇性)結合"抗體或"與……進行特異 性(或選擇性)免疫反應"指在非均質蛋白質和其它生物製品中存在的蛋白質的起決定 性作用的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，特異抗體以背景的至少2倍 來結合特異性蛋白質並且基本上不以顯著量結合樣品中存在的其它蛋白質。通常， 特異性或選擇性反應將為背景信號或噪聲的至少2倍，並且更通常為背景的10-100 倍以上。術語"模擬物肽模擬物"和"模擬物"指具有與天然或非天然生成的多肽基本相同的結構和功能特徵的合成的化合物(如結合CCX-CKR2的試劑)。肽類似物通常 作為具有與模板肽有類似屬性的非肽藥物而用於藥物工業。這些類型的非肽化合物被稱為"肽模擬物"或"模擬物肽模擬物"(Fauchere， A/v. Z)rwgi " 15:29(1986); Veber和Freidinger， WS第392頁(1985);和Evans等， / 30:1229(1987)，其納入本文作為參考)。與治療上有用的肽結構類似的肽模擬物可用於產生同等或增 強的治療或預防效果。總體上，模擬物肽模擬物在結構上與模板多肽類似(即具有生 物學或藥學活性的多肽)，如在感興趣的多肽中發現的，然而具有被選自下組的鍵任 選取代的一個或多個肽鍵例如-CH2NH-、 -CH2S-、 -CH2-CHr、 -CHK:H-(順式和反 式)、-COCH2-、 -CH(OH)CH2，-CH2SO-。模擬物可以是完全由合成的、胺基酸的非 天然類似物組成、或是部分天然肽胺基酸和部分胺基酸的非天然類似物的嵌合體分 子。模擬物還可結合有任何量的天然胺基酸保守取代，只要此類取代基本上不改變 模擬物的結構和/或活性。例如，當模擬物組合物能實現感興趣的多肽的至少一種結 合或酶活性，其就包括在本發明的範圍內。"配體"指一種能夠結合受體的試劑，如多肽或其它分子。 "保守修飾的變體"應用於胺基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，"保守修 飾的變體"指那些編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的核酸，或當核酸不編碼氨 基酸時，指基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡併，許多核酸序列編碼任何給定 的蛋白質。例如，密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU全都編碼丙氨酸。因此，在由 密碼子限定的丙氨酸的每一個位置，可將該密碼子改變為任何所述對應密碼子而不 改變編碼的多肽。此類核酸變異為"沉默變異"，是一種保守性修飾變異。還描述了 本文中每種編碼多肽的核酸序列的每種可能的核酸沉默變異。本領域技術人員能認 識到核酸中的每種密碼子(除了 AUG，其通常為甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG， 其通常為色氨酸的唯一密碼子)可進行修飾以產生功能上相同的分子。同樣，編碼多 肽的核酸的每種沉默變異暗含在每種所述序列中。
就胺基酸序列而言，本領域技術人員能認識到對核苷酸、肽、多肽或蛋白質序 列進行單個取代、缺失或插入以改變、插入或缺失編碼序列中的單個胺基酸或小比 例胺基酸是一種"保守修飾變體"，其中，該改變能引起胺基酸被化學上相似的氨基 酸取代。保守取代表提供了本領域公知的功能上相似的胺基酸。此類保守修飾變體 被加進並不排除本發明的多態變體、種間同系物和等位基因。以下8組均包含互相保守取代的胺基酸1) 丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2) 天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);3) 天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);4) 精氨酸(R)、賴氨酸(K);5) 異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7) 絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);禾口8) 半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M) (參見例如Creighton，屍rato'似(1984))。"序列相同性百分比"是通過比較窗口比較兩條最佳匹配序列來確定的，其中比較窗口中的多核苷酸序列部分當與用於兩條序列的最佳匹配的參考序列(其不包含插入或缺失)相比時可包含插入或缺失(即缺口)。該比例由確定兩條序列中發生相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置的個數來得到匹配位置個數，用比較窗口中的位置總個數除匹配位置個數，用100乘該結果來得到序列相同百分比來計算。在上下文中涉及兩條或多條核酸或多肽序列時，術語"相同的"或"相同性"百分比指，當在比較窗口或指定區域內利用以下序列比較算法之一或通過手工比對和肉眼檢査進行比較和比對以得到最大對應性時，兩條或多條序列或亞序列是相同 的或具有特定比例的相同的胺基酸殘基或核苷酸(即在特定區域如本發明的完整多肽序列或本發明多肽的胞外結構域內有60%相同性、任選有65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%相同性)。此類序列即被稱為"基本相同的"。該定義還指檢測序列 的互補序列。或者，相同性存在於長度為至少約50的核苷酸的區域中，或更優選的 在長度為100-500或1000或更多核苷酸的區域中。本發明包括與SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、 SEQIDNO:16禾口/或SEQIDNO:18禾口/或SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16禾卩/或SEQ ID NO:18內的CDR1或CDR2基本上相同的多肽，如

圖1 所示。
為了進行序列比較， 一般需要一條序列作為參考序列，檢測序列與之比較。當 採用序列比較算法時，檢測序列和參考序列被輸入計算機，如果需要的話設定亞序 列坐標，並設定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或可設定可選參數。然 後該序列比較算法即基於程序參數計算檢測序列相對參考序列的序列相同性百分 比。"比較窗口"在文中包括，參照任何一種選自下組的連續位數的區段例如全長序列或者20-600、約50-200、或約100-150個胺基酸或核苷酸，其中在兩條序列 最佳比對後， 一條序列可與相同連續位數的參考序列進行比較。將要比較的序列進 行比對的方法為本領域公知。可通過以下方法進行比較序列的最佳比對例如Smith 和Waterman (1970)爿c/v.々p/. Ma /z. 2:4S2c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch (1988) ■/Mo/. 48:443的同源性比對算法、Pearson和Lipman (1988)屍rac. TVar/. 爿cfld Sc/. USA 85:2444的相似性檢索方法，這些算法由計算機執行(Wisconsin Genetics軟體包中的GAP、 BESTFIT、 FASTA和TFASTA， Genetics Computer Group, 575 Science Dr.， Madison， WI)，或通過手工比對和肉眼檢驗來進行比較序列的最佳 比對(參見例如Ausubel等，(f分ff激學虔,新^^展J1 fO#re"f屍ratoco/s /" Mo/ecw/ar 歷o/ogy)(1995增補本))。適用於檢測序列相同性百分比和序列相似性的算法的例子為BLAST和 BLAST2.0算法，其分別描述於Altschul等(1977) Wwa 25:3389-3402和Altschul等(1990) J Mo/ 215:403-410。進行BLAST分析的軟體公開獲自[美國] 國家生物技術信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法包括首先通過在查詢序 列中確定長度為W的短字，其在資料庫中與同樣長度的字比對時或匹配或滿足某些 正值閾分數T，以此確定高評分序列對(HSP)。 T指相鄰字的分數閾(Altschul等，如 上)。這些初始相鄰字命中作為進行初始檢索包含它們的更長HSP的種子。該字命中 沿每條序列往兩方向延伸直到能夠增加累積比對分數。針對核苷酸序列的累積分數 採用參數M(—對匹配殘基的獎分；總是X))和N(錯配殘基的罰分；總是O)計算。針對胺基酸序列，採用評分距陣來計算累積分數。每個方向的字命中延伸當累積比對分數從其最大獲得值下降值X;由於累積到一個或多個負分殘基比對，該累積分數變為零或更低；或達到序列的任一末端時停止。BLAST算法參數W、 T和X決定 算法的敏感度和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)默認採用字長(W)為11、期望 (E)或IO、 M=5、 N^4和雙鏈的比較。針對胺基酸序列，BLASTP程序默認採用字長 為3、和期望(E)為10和BLOSUM62評分距陣(參見Henikoff和Henikoff (1989) /Voc. 7Va" Jcad Sc/. 89:10915)比對(B)為50、期望(E)為10、 M=5、 N二4和雙鏈比較。 BLAST算法還進行兩條序列之間相似性的統計學分析(參見例如Karlin和 Altschul (1993)A^/.爿caJ. 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一種相似性檢測為最小和概率(P(N))，其提供一種兩條核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配 的概率指標。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較的最小和概率小於大約0.2，更 優選地小於大約0.01，和最優選地小於大約0.001，則該核酸被認為與參考序列相似。兩條核酸序列或多肽基本上相同的指標是由第一核酸編碼的多肽與由第二核酸 編碼編碼的多肽引起的抗體發生免疫交叉反應，如下所述。因此，例如，在兩條肽僅在保守取代處有差異時，其中一條多肽通常與第二條多肽基本上相同。兩條核酸 序列基本上相同的另一個指標是這兩個分子或它們的補體在嚴格條件下相互雜交， 如下所述。兩條核酸序列基本上相同的再一個指標為可採用相同引物來擴增該序列。附圖簡述圖1描繪了本發明抗體的一些互補決定區(CDR)的一些實施方式(SEQ ID NO: 19-22)。發明詳述/.本發欲艦沐本發明提供了利用抗CCX-CKR2抗體治療、預防和診斷CCX-CKR2相關疾病和 病症的試劑和方法。CCX-CKR2相關疾病和病症在以下有更多舉例並包括但不限於 癌症、涉及血管發生過度或異常疾病和關節炎。一些實施方式中，所述抗體為分離的。本發明的一些實施方式中，該抗體識別 的表位與SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14中CDR結合的表位相同。本發明的一些實 施方式中，該抗體識別的表位與SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18中CDR結合的表位 相同。包含SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14，或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的 抗體結合CCX-CKR2並與趨化因子SDF-1和I-TAC競爭結合CCX-CKR2。 CCX-CKR2結合的競爭試驗描述於，例如，參見例如PCT/US04/34807和美國專利公 開號US2004/0170634和2005/0074826。本發明的一些實施方式中，抗體結合CCX-CKR2卻不結合人外周血。例如，一 些實施方式中，本發明的抗體不結合以下至少一種嗜鹼細胞、單核細胞、類漿樹 突細胞；B細胞或CD4+T細胞。 一些實施方式中，本發明抗體包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18。一些實施方式中，本發明的抗體包含SEQ IDNO:12和SEQ IDNO:14，或SEQIDN0.16和SEQIDNO:18。 一些實施方式中，本發明抗體包含 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18的CDR。 一些實 施方式中，本發明的抗體包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:14，或SEQIDN0.16和 SEQ ID NO: 18的CDR。之前已描述了 CDR和FR區的定位和編號系統，如Kabat等(Kabat等，《免疫學 感興趣的蛋白質序列》，第5版，美國健康和人類服務部，美國政府印刷辦公室(1991))。 CDR通常採用NCBI IgBLAST算法確定。本領域技術人員將認識到不同的序列算法 可提供特定抗體胺基酸序列中的CDR位置的略微不同的描述。 一些情況下，重鏈 CDR發生於胺基酸位31-35(CDR1)、 50-65 (CDR2)和96-102 (CDR3)。 一些情況下， 輕鏈CDR發生於胺基酸位24-34 (CDR1)、 50-56 (CDR2)禾卩89-97 (CDR3)。 一些實施 方式中，CDR如圖l所示。特定抗體識別與另一抗體相同的表位的能力由抗體競爭性抑制第二抗體結合抗 原如CCX-CKR2或其片段或其融合的能力所決定。可採用許多競爭性結合試驗中的 任何一種來檢測兩種抗體對相同抗原之間的競爭。 一個示例性試驗為Biacore試驗。 簡單地說，在這些試驗中，通過檢測相互作用物如不同抗體抑制另一方結合的能力 將結合位點在結構範圍內定位。以足夠濃度連續注入兩種抗體樣品能判斷針對相同 結合表位的競爭者抗體對。每次注射，抗體樣品均應能夠達到顯著飽和。第二次抗 體注入的淨結合指示結合表位分析。兩種應答水平可用來描述由不同表位引起的完 美競爭性比非競爭性結合的分界線。對應於相同和不同結合表位的結合的第二次抗 體注入的相對結合應答量確定表位重疊程度。抗體可識別線性或結構表位，因此抗 體在識別不相似的和遠距離的表位時才是競爭性的。本發明可採用本領域已知的其它傳統免疫試驗。例如，可採用夾心ELISA試驗 通過抗體結合的表位來區分抗體。通過利用捕獲抗體包被孔表面來進行。往捕獲表 面內添加不飽和濃度的標記抗原。該蛋白質將通過特定的抗體:表位相互作用而結合 到抗體上。洗滌後，將與可檢測部分共價連接的第二抗體(如，HRP，標記抗體定義 為檢測抗體)加入ELISA。如果該抗體識別與捕獲抗體相同的表位，則由於特定表位 已不再供結合，它就無法結合目標蛋白質。然而，如果該第二抗體識別目標蛋白質 上的不同表位，它就能夠結合併且該結合可通過利用有關酶底物定量活性水平(並抗 體因此結合)來檢測。用單個抗體同時作為捕獲抗體和檢測抗體來限定背景，同時通
過用抗原特異性抗體捕獲並用抗原上標記的抗體檢測來建立最大信號。通過利用背 景和最大信號作為參考，可評估抗體的配對方式以確定表位特異性。在第一抗體存在下利用任何上述試驗，如果第二抗體與抗原的結合減少至少30%、通常至少大約40%、 50%、 60%或75%，且常為至少約90%,則認為第一抗體 競爭性抑制第二抗體的結合。製備多克隆抗體的方法為本領域技術人員已知的。多克隆抗體可如通過注入一 種或多種免疫試劑和一種佐劑(如果需要)從哺乳動物中培養。 一般，該免疫試劑和/ 或佐劑通過多次皮下或腹膜內注射被注入哺乳動物內。該免疫試劑可包括核酸編碼 的蛋白質或其片段或其融合蛋白質。可採用將該免疫試劑與已知在被免疫哺乳動物 內具有免疫原性的蛋白質結合。此類免疫原性蛋白質的例子包括但不限於匙孔槭血 藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用的佐劑的例 子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷醯脂質A、合成的海藻糖二白喉菌酸 (trehalose dicorynomycolate))。該免疫方法不需要過度試驗即可由本領域技術人員進 行選擇。或者，抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可採用雜交瘤方法製備，如由Kohler 和Milstein， iVa化^ 256:495(1975)所描述的那些方法。在雜交瘤方法中，通常用免疫 試劑免疫小鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物以引發生產或能生產將特異性結合到免 疫試劑的抗體的淋巴細胞。或者，該淋巴細胞可在體外免疫。該免疫試劑一般包括 CCX-CKR2多肽、或其片段或其融合。通常，如果需要人體器官細胞時採用外周血 淋巴細胞("PBL")，當需要非人哺乳動物來源時採用脾細胞或淋巴結細胞。然後利 用合適的融合試劑如聚乙二醇使淋巴細胞與無限增殖細胞系融合以形成雜交瘤細胞 (Goding，《單克隆抗體原則與實踐》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice), 第59-103頁(1986))。無限增殖細胞系通常為轉變的哺乳動物細胞，具體是嚙齒類動 物、牛和人類的骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可在含有一種或多種抑制為融合的無限增殖細胞的生長或存活的物質的合適的培養基 中培養。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)， 培養雜交瘤的培養基一般將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷("HAT培養 基")，該物質阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。一些實施方式中本發明的抗體為與包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14,或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的抗體競爭結合CCX-CKR2的嵌合的或人源化抗體。如 上所述，抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，其中人抗體的互補決定區(CDR)的殘 基被如具有所需專一性、親和性和能力的小鼠、大鼠或兔子這樣的非人物種的CDR殘基所取代。例如，SEQIDNO:12和SEQIDNO:14，或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO: 18的CDR可插入人抗體骨架中。可採用本領域已知的各種技術製備人抗體，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom 和Winter, /Mo/, 5/o/. 227:381(1991); Marks等，Mo/, 5/o/. 222:581(1991))。 Cole 等和Boerner等的技術還可用於製備人單克隆抗體(Cole等，Mo"oc/owa"w油oofes am/ Ca騰r 77^r卿，第77頁(1985)和Boerner等，J. ImmunoU47(l): 86-95 (1991))。類 似地，可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物，如內源免疫球蛋白基因已被 部分或全部失活的小鼠中來製備人抗體。通過攻擊來觀察各方面包括基因重排、組 裝和抗體清單，與人中見到的極為相似的人抗體產物。該方式描述於美國專利號 5,545,807; 5,545,806; 5，569，825; 5，625，126; 5,633,425; 5,661,016，和以下禾鬥學出 版物Marks等，10: 779-783 (1992); Lonberg等，A^we 368:856-859 (1994); Morrison, A^we 368: 812-13 (1994); Fishwild等，A^we 14:845-51 (1996); Neuberger， A^rt^e說otecA"o/ogy 14:826 (1996); Lonberg禾口 Huszar， /"tem. TmmMwo/. 13:65-93 (1995)。一些實施方式中，本發明的抗體為單鏈Fv(scFv)。 ScFv抗體的Vh和VL區(如 SEQIDNO:12和SEQIDNO:14，或SEQIDNO:16和SEQ ID NO:18)包含摺疊形成 與在雙鏈抗體中發現的相似的抗原結合位點的單鏈。 一旦摺疊，非共價相互作用穩 定單鏈抗體。儘管一些抗體實施方式的Vh和Vl區可直接連接在一起，技術人員將 意識到該區域可被由一種或多種胺基酸組成的肽接頭所分隔。肽接頭及其用途為本 領域公知。參見例如Huston等，iVoc,淑'"cac/. 腦8:5879 (1988); Bird等， Sc/e"ce 242:4236 (1988); Glockshuber等，5/oc/zem/s^y 29:1362 (1990);美國專利號4， 946， 778、美國專利號5， 132， 405禾卩Stemmer等，5滅c崎酒14:256-265 (1993)。總體上該肽接頭除了將Vh和VL區之間連接起來或維持其最小距離或其它空間關係之外不具有其它特異性生物活性。然而，可選擇肽接頭的組成胺基酸來影響分子的一些屬性如摺疊、淨電荷或疏水性。單鏈Fv(scFv)抗體任選包括長度不超過50個氨 基酸，通常不超過40個胺基酸，優選不超過30個胺基酸，和更優選不超過20個氨 基酸的肽接頭。 一些實施方式中，肽接頭是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO: 23) 的多聯體，優選2、 3、 4、 5或6條此類序列。然而，應該認識到可以進行接頭內的 一些胺基酸取代。例如，用纈氨酸取代甘氨酸。製備scFv抗體的方法已描述於參見Huse等，&/e"ce 246:1275-1281(1989); Ward
等，A^加re 341:544-546 (1989);禾卩Vaughan等，TNtowre 14:309-314 (1996)。簡單地說，分離免疫動物B細胞內的mRNA並製備cDNA。採用特異於免疫球蛋白 重鏈和輕鏈可變區的引物擴增cDNA。純化PCR產物並與核酸序列連接。如果需要 接頭肽，將編碼肽的核酸序列插入到重鏈和輕鏈核酸序列間。將編碼scFv的核酸插 入載體並在合適宿主細胞中表達。特異性結合所需抗原的scFv—般通過在噬菌體展 示文庫中進行淘選而找到。可通過任何方法進行淘選。利用表面表達所需抗原的細 胞或利用包被有所需抗原的固體表面進行常規淘選。為了方便，該表面可以是磁珠。 從固體表面洗滌掉未結合的噬菌體並洗脫結合的噬菌體。根據選擇方法的效力並依賴可篩選的克隆數目和完成的嚴格性找到具有最高親 和性的抗體。 一般，更高的嚴格性對應於更具選擇性的淘選。然而，如果條件太嚴 格，將找不到噬菌體。 一輪淘選之後，結合CCX-CKR2包被平板或結合在其表面表 達CCX-CKR2的細胞的噬菌體在大腸桿菌中擴增並接受另一輪淘選。以這種方式， 許多摺疊的富集發生於3輪淘選中。因此，即使每輪中的富集很低，多輪淘選將引 起稀少噬菌體的分離並且其含有的遺傳物質編碼帶有最高親和性或一種在噬菌體上 較好表達的scFv。不考慮所選的淘選方法，噬菌體展示提供的基因型和表型之間的物理連接使得 在甚至大克隆文庫中檢測cDNA文庫中每一成員對抗原的結合成為可能。一個實施方式中，抗體為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原 具有結合特異性或對相同抗原上兩種表位具有特異性的單克隆抗體，包括但不限於 人抗體或人源化的抗體。 一個實施方式中， 一種該結合特異性為針對CCK-CKR2蛋 白，另一種是針對另一個不同的癌抗原。或者，四聚體類型技術可創建多價反應物。一些實施方式中，抗體結合到效應部分。該效應部分可以是任何分子，包括可 檢測標記部分如放射性標記或螢光標記，或可以是治療部分。其它實施方式中，治療部分為細胞毒劑。該方式中，將細胞毒劑靶定到癌組織 或細胞上，引起受難細胞數目減少，從而減少癌症相關症狀。細胞毒劑有各種各樣 包括但不限於細胞毒藥或毒素或此類毒素的活性片段。合適的毒素及其相應片段包 括白喉A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、麻瘋樹毒素、巴豆毒 素、酚黴素、依諾黴素、auristatin等。細胞毒劑還包括將放射性同位素結合到本發 明抗體製成的放射化學物質。本發明的抗體可採用許多公知免疫結合試驗來檢測表達CCX-CKR2或CCX-CKR2的細胞(參見例如美國專利4,366,241; 4,376,110; 4,517,288和4,837,168)。 有關免疫試驗的綜述也可參見《細胞生物學方法(MethodsinCellBiology)》，37巻， Asai編，Academic Press, Inc.，紐約(1993);《基礎和臨床免疫學》(Basic and Clinical Immunology),第7版，Stites和Terr編(199"。因此，本發明提供了檢測表達CCX-CKR2的細胞的方法。 一種方法中，對個體 進行活檢並對收集到的組織進行體外檢測。然後，用本發明的抗CCX-CKR2抗體接 觸組織的組織或細胞。得到的任何免疫絡合物均提示活檢樣品中存在CCX-CKR2蛋 白。為了幫助此類檢測，可將抗體進行放射性標記或與是檢測標記的效應分子如熒 光標記偶聯。另一種方法中，可採用成像系統體內檢測細胞。然後，確定標記的位 置。可採用傳統的視覺診斷成像方法。例如，順磁同位素可用於MRI。由於胞外結 合易於被胞外酶環境清除和被循環清除，因此抗體內化對相比胞外結合延長其在器 官中的生命周期很重要。CCX-CKR2蛋白還可通過標準免疫試驗方法和本發明的抗體來檢測。標準方法 包括，例如放射性免疫試驗、夾心免疫試驗(包括ELISA)、免疫螢光試驗、蛋白質印 跡法、親和色譜(結合固相的親和配體)和用標記抗體進行原位檢測。還可採用次級檢 測試劑，如山羊抗小鼠FITC。可採用技術的總述可在Harlow和Lane，《抗體:實驗 室手冊》(Antibodies: A Laboratory Manual)(1988)中找到。本發明提供了檢測癌細胞的方法，包括提供一種預防或診斷癌症的方法。至今 為止CCX-CKR2表達於每種檢測的癌細胞附近，但是CCX-CKR2的正常(非癌性)表 達看似受腎臟和一些大腦細胞以及某種發育階段的胚胎肝臟的限制。參見例如 PCT/US04/34807和美國專利申請號10/698,541和10/912,638。因此，CCX-CKR2在 細胞，具體是非胚胎細胞和/或除腎臟或大腦細胞外的細胞中表達表示可能存在癌細 胞。CCX-CKR2存在於組織血管內皮上還可表示存在癌。 一些情況中，採用本領域 已知的其它方法證實，包含CCX-CKR2表達細胞的樣品中存在癌細胞。根據本發明的還有另一個方面，提供了為患有或懷疑患有癌症個體提供選擇療 程的方法。該方法包括從個體中獲得生物樣品，用特異性結合CCX-CKR2的抗體或 其抗原結合片段接觸該樣品，檢測抗體結合的存在或不存在，並選擇適於該個體癌 症的療程。 一些實施方式中，所述治療是給予該個體本發明的CCX-CKR2抗體。本發明提供了診斷人類疾病的方法，所述疾病包括但不限於癌症如瘤、神經 膠質瘤、間皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、成 膠質細胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、頭頸癌、結腸癌、結腸
直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝膽管癌、膽囊癌、 小腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、陰莖癌、尿道癌、睪丸癌、宮頸癌、 陰道癌、子宮癌、卵巢癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、胰腺癌、胰腺內分 泌癌、類癌、骨癌、皮膚癌、視網膜母細胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(其它癌症參見《癌症:原理和實踐》(CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE)(DeVita， V.T.等編，1997));以及腦和神經功能障礙，如阿耳茨海默病和多發性硬化；腎功能 障礙；類風溼性關節炎；心臟同種異體移植排斥；動脈粥樣硬化；哮喘；腎小球腎 炎；接觸性皮炎；炎性腸病；結腸炎；銀屑病；再灌注損傷；以及本文中描述的其 它病症和疾病。 一些實施方式中，個體未患有卡波西肉瘤、多中心Castleman病或 AIDS相關原發性滲出性淋巴瘤。 ///. CCX"-C02A鑑定遭鄉殘伴腳鄉預誠可採用許多不同的篩選方法來鑑定在細胞中，具體是在哺乳動物細胞中，且尤其是在人細胞中調控CCX-CKR2活性水平或功能的試劑。總而言之，篩選方法包括， 例如通過結合CCX-CKR2並阻止本發明的抗體結合CCX-CKR2或活化CCX-CKR2 而從大多數試劑中篩選以確定一種與CCX-CKR2(或其胞外區)相互作用的試劑。一些 實施方式中，試劑結合CCX-CKR2的親和性是試劑結合另外蛋白質的至少大約1.5、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 50、 100、 300、 500或1000倍。 1 .趨化因子受體結合試驗一些實施方式中，CCX-CKR2調控因子通過篩選與本發明的抗體競爭結合 CCX-CKR2多肽的分子來確定。本領域技術人員將認識到有許多方法可進行競爭性 分析。 一些實施方式中，將帶有CCX-CKR2的樣品與標記的本發明抗體(如至少包含 SEQIDN0:12、 SEQIDN0:14、 SEQ ID NO:16禾口/或SEQ ID NO:18的CDR的抗體) 預培養，然後接觸潛在競爭者分子。在測試化合物存在的情況下，抗體結合 CCX-CKR2的量的變化(如減少)指示該測試化合物為潛在的CCX-CKR2調控因子。可通過篩選能結合CCX-CKR2的試劑來進行初篩，這是因為至少這樣確定的試 劑中至少有些可能是趨化因子受體調控因子。該結合試驗通常包括用一種或多種檢 測試劑接觸CCX-CKR2並給予充分時間讓蛋白質與檢測試劑形成結合複合物。形成 的任何結合複合物均可採用任何已經建立的分析技術檢測。蛋白質結合試驗包括單 不限於免疫組織化學結合試驗、流式細胞術、放射性配體結合、銪標記配體結合、 生物素標記配體結合或維持CCX-CKR2構象的其它試驗。此類試驗採用的趨化因子 受體可以是天然表達、克隆的或合成的。可利用結合試驗來確定激動劑或拮抗劑。例如，通過用潛在激動劑接觸CCX-CKR2並檢測CCX-CKR2活性，就有可能確定那 些刺激CCX-CKR2活性的分子。2. 細胞和試劑本發明的篩選方法可以通過體外或以基於細胞的試驗來進行。體外試驗通過例 如包含CCX-CKR2的膜碎片或完整細胞來進行。基於細胞的試驗可在任何表達 CCX-CKR2的細胞中進行。基於細胞的試驗利用包含CCX-CKR2的完整細胞或細胞碎片來篩選以試劑結合 CCX-CKR2或調控CCX-CKR2活性的試劑。本發明的可採用的示例性細胞類型包括 如，任何哺乳動物細胞包括白細胞如中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜曙紅細 胞、嗜鹼細胞、肥大細胞和淋巴細胞如T細胞和B細胞、白血病細胞、伯基特淋巴 瘤、腫瘤細胞、內皮細胞、周細胞、纖維母細胞、心肌細胞、肌肉細胞、乳腺癌細 胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、成膠質細胞瘤細胞、肝細胞、腎細胞和神經元細胞 以及真菌細胞(包括酵母)。細胞可以是原代細胞或腫瘤細胞或其它類型的無限增殖細 胞系。當然，CCX-CKR2可以在不表達內源性CCX-CKR2的細胞中表達。某些情況下，CCX-CKR2片段，以及融合蛋白，均可用於篩選。在需要競爭結 合CCX-CKR2配體的分子時，採用的CCX-CKR2片段為能結合本發明抗體的片段。 或者，CCX-CKR2的任何片段均可用作鑑定結合CCX-CKR2的分子的耙。CCX-CKR2 片段可包括任何片段，如CCX-CKR2中至少20、 30、 40、 50個胺基酸直到包含除 一個胺基酸外所有胺基酸的蛋白質。 一般地，配體結合片段將包含CCX-CKR2的跨 膜區和/或大部分或所有胞外區。3. 信號傳導和粘連活性一些實施方式中，由CCX-CKR2活化所觸發的信號傳導被用來確定CCX-CKR2 分子。趨化因子受體的信號傳導活性可以許多方式確定。例如，信號傳導可通過檢 測趨化因子受體介導的細胞粘連來確定。趨化因子和趨化因子受體間的相互作用能 通過調控整聯蛋白的親和力和親合力來引起快速粘連。參見例如Laudanna， 7w聽wo/og/ca/i ev/e薦186:37-46 (2002)。信號傳導還可通過定性並定量地確定次級信使如環狀AMP或磷酸肌醇來檢測， 以及還可監控磷酸化或去磷酸化事件。參見例如Premack等，Atowe 2: 1174-1178 (1996)和Bokoch，腸od 86:1649-1660 (1995)。此外，還可監控CCX-CKR2活化下遊的其它事件來檢測信號傳導活性。下遊事
件包括作為趨化因子受體的刺激結果而發生的那些活動或表現。示例性下遊事件包 括如，細胞時期改變(如從正常變為癌細胞或從癌細胞變為非癌細胞)。細胞應答包括 細胞粘連(如粘連到內皮細胞)。已建立的涉及血管發生的信號傳導級聯(如VEGF介導的信號傳導)還可監控由CCX-CKR2調控因子產生的影響。可例如在小雞絨(毛)膜 尿囊膜中估計試劑促進血管發生的能力，如Leung等(1989) Sc/e"ce 246:1306-1309 所述。另一種選擇是用大鼠角膜進行試驗，如Rastinejad等(1989) Ce〃 56: 345-355 所述。其它試驗公開於美國專利號5,840,693。還可採用卵巢血管發生模型(參見例如， Zimmerman, R.C.等，(2003) J C7/"./"ve" 112:659-669; Zimmerman, R.C.等(2001) M/crawwc. 62:15-25;和Hixenbaugh， E.A.等(1993)i ec. 235: 487-500).其它篩選方法基於以下觀察CCX-CKR2的存在或活化能誘導某種調控蛋白質 的表達。因此，對此類蛋白質的檢測可用於間接確定CCX-CKR2的活性。進行了一 系列ELISA研究來比較轉染有CCX-CKR2細胞和未轉染細胞的各種分泌蛋白質在細 胞培養基中的相對濃度。通過這些研究確定了 CCX-CKR2能誘導許多分化調控蛋白 質包括生長因子、趨化因子、金屬蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑的產生。因此，所提 供的一些篩選方法包括確定檢測試劑是否調控CCX-CKR2產生某種生長因子、趨化 因子、金屬蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑。 一些情況下，這些試驗採用在限制血清條 件下生長的細胞(或其提取物)來進行，因為發現這樣能增加CCX-CKR2誘導的蛋白 質的產生。以下蛋白質為檢測到的各種類型蛋白質的例子，並給出了各類中具體的蛋白質 (l)生長因子(如GM-CSF); (2)趨化因子(如RANTES、 MCP-1); (3)細胞因子(如IL-6); (4)金屬蛋白酶(如MMP3);和(5)金屬蛋白酶抑制劑(如TIMP-1)。預計也可檢測到這 些不同類別中的其它蛋白質。這些具體的蛋白質可用本領域已知的標準免疫學檢測方法進行檢測。例如，適 用於高通量模式的一種方法是在多孔平板上進行的ELISA。檢測TIMP-1的ELISA 試劑盒購自DakoCytomation(產品編號:EL513)。針對IL-6和MMP3的ELISA試劑盒 可獲自R and D Systems。特異性結合上面列出的蛋白質的抗體的供應商的進一步例 子在如下例子中提供。酶類的蛋白質如金屬蛋白酶也可通過已知的酶學試驗進行檢其它實施方式中，檢測CCX-CKR2潛在調控因子調控細胞粘連的能力。腫瘤細 胞粘連內皮細胞的單層被作為轉移性侵入的模型來研究(參見例如Blood和Zetter， 所ov/zew.說o; /z;^. ^"a， 1032， 89-119(1990))。這些內皮細胞單層模擬淋巴脈管系統
並可被各種細胞因子和生長因子(如TNF ct和IL-1 e )刺激。可用靜態粘連試驗以及使 細胞處於流動條件下以模擬體內脈管系統作用力的試驗來評估表達CCX-CKR2的細 胞粘連接到該單層的能力。而且，評估粘連的試驗還可在體內進行(參見例如von Andrian， U. R Mfcra">cw/"^w. 3(3): 287-300 (19%)》 4.確認通過任何前述篩選方法最初確定的試劑可被進一步檢測以確認其表現的活性。 優選的此類研究採用合適的動物模型來進行。此類方法的基本步驟包括給予作為人 類的疾病模型的動物在初級篩選中確定的導聯化合物，然後判斷疾病(如癌症、心肌 梗塞、傷口癒合或與血管發生相關的其它疾病)是否實際上得到調控和/或疾病或病症 是否改善。在確認研究中採用的動物模型通常為任何類型的哺乳動物。合適的動物 的特定例子包括但不限於靈長類、小鼠、大鼠和斑馬魚。一些實施方式中，採用關節炎動物模型來篩選和/或確認調控CCX-CKR2的試劑 的治療用途。示例性關節炎動物模型包括，如，膠原誘導的關節炎(CIA)動物模型。 與CCY-Cffi 2務互^^效試浙CCX-CKR2的調控因子(如拮抗劑或激動劑)可包括，例如，抗體(包括單克隆抗 體、人源化抗體或本領域已知的其它類型的結合蛋白)、小有機分子、siRNA、 CCX-CKR2多肽或其變體、趨化因子(包括但不限於SDF-1和/或I-TAC)、趨化因子 模擬物、趨化因子多肽等。檢測CCX-CKR2調控因子的試劑可以是任何小化合物或生物實體，如多肽、糖、 核酸或脂質。或者，調控因子可以是趨化因子或其它配體的遺傳改變形式或肽模擬 物形式。典型地，測試化合物是小化學分子和肽。實質上，任何化合物都可用作本 發明試驗中的潛在調控因子或配體，儘管最常採用可溶解於水性溶液或有機溶液(特 別是基於DMSO的溶液)的化合物。設計該試驗以通過一般平行進行的自動化試驗步 驟和為實驗提供任何便利來源的化合物來篩選大的化學庫(如，在機器人試驗中採用 微量滴定平板上的微量滴定模式)。應該認識到有許多化合物的供應商，包括Sigma(St Louis ， MO)、 Aldrich (St. Louis ， MO)、 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO)、 Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs ， 瑞士傳。一些實施方式中，該試劑的分子量小於1， 500道爾頓， 一些情況下小於1， 000、 800、 600、 500或400道爾頓。需要相對小分子量的試劑是因為較小分子相比分子量 較大的試劑更可能具有與好的藥物代謝動力學特徵(包括口服吸收)相一致的物理化 學屬性。例如，由於其滲透性和溶解性而不太可能成為成功的藥物的試劑由Lipinski 等描述如下(具有超過5個H鍵的供體(表達為OH和NH的總和))；具有超過500 的分子量；具有超過5的LogP(或超過4.15的MlogP);和/或具有超過10個H鍵的 受體(表達N和O的總和)。參見例如Lipinski等"dvDragDe//veo; 23:3-25(1997)。取代生物運載體的化合物類型一般是該規則的例外。一個實施方式中，高通量篩選方法包括提供一種包含大規模可能的治療化合物 (可能的調控因子或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然後用本文中描述的一種或多 種試驗篩選此類"組合化學文庫"或"配體文庫"來確定呈現所需特徵活性的那些文庫成員(特別是化學的種類或亞類)。由此確定的化合物可作為常規"導聯化合物" 或可將其本身用作可能的或實際的治療藥物。組合化學文庫為通過組合許多化學的"構件塊"由化學合成或生物合成產生的 各種化合物的集合。例如，線性組合化學文庫如多肽文庫是通過對給定化合物長度(即 多肽化合物中的胺基酸數目)在每一種可能方向上組合一系列化學構件塊(胺基酸)而 形成的。很多化合物可通過此類組合性混合化學構件塊來合成。組合性化學文庫的製備和篩選為本領域技術人員所公知。此類組合性化學文庫 包括但不限於肽文庫(參見例如美國專利5， 010， 175， Furka， 屍印AA" 37: 487-493 (1991)和Houghton等，Atow^ 354:84-88(1991))。還可採用產生化學多樣性文 庫的其它化學物質。此類化學物質包括但不限於類肽(如，PCT公開號WO 91/19735)、編碼的肽(如，PCT公開號WO 93/20242)、隨機生物寡聚物(如，PCT公 開號WO 92/00091)、苯並二氮萆(如，美國專利號5,288,514)、多聚體(diversomer)如 乙內醯脲、苯並二氮萆和二肽(Hobbs等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993))、插烯多肽(Hagihara等，J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568(1992))、帶有葡萄糖骨 架的非肽類肽模擬物(Hirschmann等，J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992))、類 似的有機合成小化合物文庫(Chen等，J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994))、寡氨基 甲酸酯(Cho等，&&"ce 261:1303 (1993))和/或肽基磷酸酯(Campbe11等，《/ Og. C/zem. 59:658 (1994))、核酸文庫(參見Ausubel、 Berger和Sambrook，均同上)、肽核酸文庫 (參見例如美國專利5， 539， 083)、抗體文庫(參見例如，Vaughn等，A^wre 5/ofec/wo/ogy， 14(3): 309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(參見例如， Liang等，Science, 274: 1520-1522 (1996)和美國專利5,593,853)、小有機分子文庫(參 見例如苯並二氮萆，Baum C&EN， 1月18日，第33頁(1993);類異戊二烯(美國專 禾ij 5,569,588);噻唑烷酮(thiazolidinone)和間硫嗎啉酮(metathiazanone)(美國專利 5,549,974);吡咯烷(美國專利5,525,735和5,519,134);嗎啉代化合物(美國專利 5,506,337);苯並二氮萆(5,288,514等)。製備組合文庫的設備可商業化購得(參見例如357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech， Louisville KY， Symphony, Rainin， Woburn， MA， 43 3A Applied Biosystems， Foster City, CA， 9050 Plus, Millipore， Bedford, MA)。而且，各種組合文庫本身為 商業化提供(參見例如ComGenex, Princeton, N丄，Tripos， Inc., St丄ouis， MO， 3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek Biosciences, Columbia, MD等)。化艦、賄發主浙CCY-CJO 2縱紐欽舒面本發明的抗體可在體外、體內或先體外後體內(即從體內取出、處理並放回體內) 情況下接觸表達CCX-CKR2的細胞。本發明的抗體可直接給予哺乳動物個體以在體 內調控趨化因子受體活性。 一些實施方式中，該抗體與SDF1和/或I-TAC競爭結合 CCX-CKR2。本發明的一些實施方式中，該抗體識別的表位與SEQIDNO:12和SEQ IDNO:14、或SEQIDNO:16和SEQIDNO:18中CDR結合的表位相同。 一些實施方 式中，該抗體包含SEQIDNO:12禾口/或SEQIDNO:14、或SEQ ID NO:16禾口/或SEQ ID NO: 18一些實施方式中能夠，CCX-CKR2抗體被給予癌症患者。 一些情況下， CCX-CKR2調控因子被施用來治療癌症，如瘤、神經膠質瘤、間皮瘤、黑素瘤、淋 巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、成膠質細胞瘤、白血病、淋巴瘤、 前列腺癌和伯基特淋巴瘤、頭頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞 肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝膽管癌、膽囊癌、小腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱 癌、前列腺癌、陰莖癌、尿道癌、睪丸癌、宮頸癌、陰道癌、子宮癌、卵巢癌、甲 狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、胰腺癌、胰腺內分泌癌、類癌、骨癌、皮膚癌、 視網膜母細胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(其它癌症參見《癌症:原理和實踐》 (DeVita， V.T.等編，1997));以及腦和神經功能障礙，如阿耳茨海默病和多發性硬化； 腎功能障礙；類風溼性關節炎；心臟同種異體移植排斥；動脈粥樣硬化；哮喘；腎 小球腎炎；接觸性皮炎；炎性腸病；結腸炎；銀屑病；再灌注損傷；以及本文中描 述的其它病症和疾病。 一些實施方式中，個體未患有卡波西肉瘤、多中心Castleman 病或AIDS相關原發性滲出性淋巴瘤。本發明還包含通過給予本發明的抗體在任何需要的個體中增加血管發生。例如， 通過用本發明的抗體接觸CCX-CKR2來減少CCX-CKR2活性而增加血管發生有用於 抑制腫瘤，特別是固體腫瘤的形成、生長和/或轉移。有關調控CCX-CKR2和血管發 生的實施方式的描述描述於如美國專利申請號11/050,345。
涉及不需要的或有問題的血管發生的其它病症包括類類風溼性關節炎；銀屑 病；眼部血管發生病，如糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植片排斥(comeal graft rejection)、新生血管性青光眼、晶狀體後纖維組織增生症； Osler-Webber症候群；心血管發生；斑塊新生血管發生；毛細血管擴張；血友病關節； 血管纖維瘤；內皮細胞過度或異常刺激病，包括腸粘連、克羅恩病、皮膚病如銀屑 病、excema和硬皮病、糖尿病、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、年齡相關的 黃斑變性、動脈粥樣硬化、硬皮病、創口肉芽和肥厚性瘢痕即瘢痕瘤，和以血管發 生為病理性結果的疾病如貓抓病和潰瘍(幽門螺旋桿菌(i/e/fco^c妙刃/on'))也可用本 發明的抗體進行治療。血管發生抑制劑可用於預防或抑制粘連，尤其是如開創性或 腹腔鏡外科手術和臀部收縮術(bum contractions)後引起的腹膜內或骨盆性粘連。應該 能利用血管發生抑制劑有效處理的其它病症包括由移植術引起的瘢痕化、肝硬化、 急性呼吸窘迫症候群引起的肺纖維化或其它新生兒肺纖維化、臨時假體植入、和腦 與硬膜之間的術後粘連。子宮內膜異位症、息肉病、心肌肥大、以及肥胖也可通過 抑制血管發生來治療。這些病症可涉及其它類型的正常組織的尺寸增加或生長，如 子宮纖維瘤、前列腺肥大和澱粉樣變性病。本發明的抗體可預防性地或治療性地用 於本文中所述的任何症狀或疾病。用本發明的抗體來降低CCX-CKR2活性也可用於預防新生血管生成來有效治療 宿主病症。因此，例如，減少血管發生可用作為治療血管病症(如血管瘤和動脈粥樣 硬化斑塊中的毛細血管增殖)、肌肉病症(如心肌血管發生、心肌梗塞或平滑肌內的血 管發生)、關節(如關節炎、血友病關節等)和其它血管發生相關病症的一部分。促進 血管發生也可幫助加速各種生理進程並治療需要增加血管形成的疾病如傷口癒合、 骨折和燒傷、炎症、心肌缺血和外周血管病。本發明的抗體也可用於增進傷口癒合。並非打算將本發明限制於特定的作用機 制，可以是CCX-CKR2的拮抗使得內源性配體結合到較低親和性受體上來代替，從 而觸發增進的傷口癒合。例如，SDF-1結合CCX-CKR2和CXCR4，然而對CXCR4 的親和具有較低親和性。類似地，I-TAC結合CXCR3相比I-TAC結合CCX-CKR2 具有較低親和性。通過阻止這些配體結合CCX-CKR2， CCX-CKR2拮抗劑使得這些 配體結合到其它受體上，從而增進傷口癒合。因此，相比於通過用激動劑刺激 CCX-CKR2活性來增進傷口癒合，CCX-CKR2拮抗劑可採用不同機制介導來增進傷 口癒合。除了治療與新生血管形成相關的病症和症狀，抑制拮抗劑還可用於調控或預防
新生血管性乘相關的正常生理狀況的發生。因此，例如本發明方法可用於節育。根據本發明，降低CCX-CKR2在卵巢或子宮內膜中的活性能減少與排卵、胚芽植入、胎盤形成等相關的新生血管形成。血管發生抑制劑還具有其它治療用途。例如，本發明的抗體可用於以下(a) 消除脂肪組織並治療肥胖。參見例如《o/om>z等，A^we ^f"/Zc/朋10(6): 625-632 (2004)。(b) 治療先兆子癇(preclampsia)。參見例如Levine等，W J! Med 350(7): 672-683 (2004); Maynard等,C//"./廳"111(5):649-658 (2003);禾口(c) 治療心血管疾病。參見例如March等，Jw. J /Vi^/o/. C/rc.屍/z;^W. 287: H458-H463 (2004); Rehman等，C/rcw/油ow 109:1292-1298(2004)。K絲微欽射激本發明的藥物組合物可包括本發明的抗體和藥學上可接受的載體。藥學上可接 受的載體部分由特定給藥組合物以及由用來施用該組合物的特定方法所決定。因此, 本發明的藥物組合物的合適製劑有很多種(參見例如《雷明頓藥物科學(Remington 's Pharmaceutical Sciences)》，第17版，1985)。適用於給藥的製劑包括水溶液和非水溶液、等滲無菌溶液(可包含抗氧化劑、緩 衝液、抑菌劑和使該製劑等滲的溶質)和水性懸液和非水懸液(可包含懸浮劑、增溶劑、 增稠劑、穩定劑和防腐劑)。本發明的操作中，組合物可通過口服、經鼻、局部、靜 脈內、腹膜內、皮下或鞘內給藥。化合物製劑可以單劑或多劑封閉容器如安瓿和藥 水瓶存在。溶液和懸液可由上述類型的無菌粉末、顆粒和片劑製備。所述組合物可通過輸液泵的方式給藥，例如，用來遞送胰島素或化療物質到特 定器官或腫瘤的類型。本發明的組合物可採用注射劑或導管直接注射到腫瘤或在切 除之前或之後注射到原發性腫瘤附近。本發明的組合物可按需局部或全身給藥。對 延長的局部給藥而言，抗體可以通過緩釋植入注射到腫瘤附近來給藥。或者，可用 質粒體外轉染個體細胞從而表達本發明的抗體，之後將其注射到腫瘤附近。用於局部治療皮膚病時，酶抗體可以軟膏劑或凝膠施用到皮膚。一些實施方式中，本發明的CCX-CKR2抗體可與其它合適的治療劑包括如化療 劑、放射劑等組合施用。對用於組合治療的合適試劑的選擇可由本領域普通技術人 員根據常規藥物學原理來確定。治療試劑的組合可以協同作用來影響各種病症如癌 症、傷口、腎功能障礙、腦功能障礙或神經功能障礙的治療或預防。採用該方法， 即能夠用較低劑量的每種試劑實現療效，從而降低副作用的可能。 本發明內容中給予患者的劑量應該足以在對象內長時間引起有益反應(如減小腫 瘤尺寸或腫瘤負荷)。針對任何患者的最佳劑量水平依賴於各種因素，包括採用的特 定調控因子的效力、年齡、體重、生理活性、和患者的日常飲食、關於與其它藥物 的可能組合、和關於特定疾病的嚴重性。劑型的大小也將由伴隨給予特定化合物或 載體到特定對象的任何副作用的存在、性質和程度所決定。在確定要施用的抗體有效量過程中，醫生可評估抗體的循環血漿水平、抗體毒 性和抗抗體抗體的生產。總體上，對典型對象而言，抗體的等效劑量約為lng/kg-10mg/kg。為了給藥，當被用於全身並考慮對象的全身健康時，本發明的抗體可以由抗體 的LD-50以及各種濃度下抗體的副作用所決定的速率進行給藥。受體免疫系統對抗 體的清除也可影響給藥的合適劑量。給藥可通過單劑量或多劑量實現。可給予包含本發明抗體的組合物以進行治療性或預防性治療。在治療性應用中， 給予患有疾病(如癌症、關節炎或其它CCX-CKR2相關疾病或病症)的患者的組合物 的量足以治療或至少部分阻止疾病及其併發症，如縮小腫瘤尺寸等。足以實現上述 目的的量被定義為"治療有效量"。對該目的有效的量取決於疾病的嚴重性和患者的 總體健康狀態。可根據劑型和所需頻率以及患者的耐受程度單次或多次施用組合物。 任何事件中，該組合物應該能提供足以有效治療患者的足夠量的本發明的試劑。能 夠在哺乳動物中防止或減緩癌症的發展的調控因子的量被稱為"預防有效量"。預防 治療所需的特定量依賴於哺乳動物的醫療條件和病情歷史、所要預防的特定的癌症、 以及其它因素如年齡、體重、性別、施用路徑、效力等。此類預防性治療可用於如 之前患過癌症的哺乳動物以預防癌症復發、或被懷疑具有患癌症的顯著可能性的哺 乳動物。本發明的抗體可單獨施用或與一種或多種其它藥物聯用。可能的組合搭檔可包 括如添加的抗血管發生因子和/或化療劑(如細胞毒劑)或放射劑、癌症疫苗、免疫調 節劑、抗血管劑、信號轉導抑制劑、抗增殖劑或凋亡誘導物。本發明的抗體可與阻斷整聯蛋白銜接的抗體和肽、抑制金屬蛋白酶的蛋白質和 小分子(如marmistat)、阻斷內皮細胞內的磷酸化級聯的試劑(如herbamycin)、血管發 生的已知誘導物的顯性負受體、抗血管發生誘導物的抗體或阻斷其活性的其它化合 物(如蘇拉明)、或通過其它方式發生作用的其它化合物(如維生素A、 IL-4、幹擾素等)。 實際上，由於此類因素可通過各種機制調控血管發生，採用本發明的抗體與其它抗 血管發生劑組合能夠更有效(可能協同地)已知所針對組織內的血管發生。抗血管發生劑，如MMP-2(基質金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9(基質金屬蛋白酶 9)抑制劑和COX-II(環氧合酶II)抑制劑均可用於與本發明的抗體和本文中描述的藥 物組合物聯合。本發明的抗CCX-CKR2抗體還可與信號轉導抑制劑如能夠抑制 EGFR(表皮生長因子受體)應答的試劑，如EGFR抗體、EGF抗體和EGFR抑制劑分 子；VEGF(血管內皮生長因子)抑制劑如VEGF受體和能抑制VEGF的分子；以及 erbB2受體抑制劑如結合erbB2受體的有機分子或抗體，例如HERCEPTINtm(美國加 裡福尼亞舊金山南部的Genentech， Inc.)共同使用。本發明的抗CCX-CKR2抗體還可與能促進血管發生和/或傷口癒合的其它藥物 組合。本領域技術人員可意識到，當將該組合物應用於需要血管發生的所需部位時， 可摻入一種或多種用於醫學外科的物質或治療劑，例如那些可進一步加強血管發生 反應和/或加速和/或有益改善癒合過程的物質。例如，為了進一步促進血管發生、修 復和/或組織生長，所述組合物中可包含至少一種激素、生長因子或促有絲分裂蛋白 質，如成纖維細胞生長因子、血小板衍生的生長因子、巨噬細胞衍生的生長因子等。 此外，所述組合物中還可包含抗菌劑，如抗生素如硫酸雙生黴素或紅黴素。其它可 用於醫學外科的試劑可包括消炎劑、鎮痛劑、麻醉劑、紅玉黃菌素、酶、抗組胺劑 和染料。本發明的抗CCX-CKR2抗體還可組合有其它藥物包括治療關節炎的藥物。此類 試劑的例子包括消炎治療劑。例如，糖皮質類固醇如氫化潑尼松和甲潑尼松為常用 的消炎藥物。非類固醇類消炎藥物(NSAID)也用於抑制炎症。NSAID抑制環氧合(COX) 酶、COX-l和COX-2，其對在發炎部位過量產生的前列腺素的產生很重要。而且， 促炎症細胞因子、腫瘤壞死因子a(TNFa)與多種發炎事件包括關節炎相關，抗TNF a療法被已臨床應用。VII.為用於診斷性和/或預防性應用的試劑盒為了應用於上述診斷、研究和治療用途，本發明還提供試劑盒。在診斷和研究 用途中此類試劑盒可包含以下的任何或所有試驗試劑、緩衝液和本發明的抗 CCX-CKR2抗體。治療產品可包括無菌鹽水或另一種藥學上可接受的乳劑和懸浮基。而且，該試劑盒可包含含有對本發明方法的操作的指導(即方案)的指導材料。盡 管指導材料一般包括手寫或印刷的材料，它們並不局限於此。能夠儲存此類指導並 將它們傳播到終端用戶的任何媒介均被本發明所涵蓋。此類媒介包括但不限於電子 儲存媒介(如磁碟、磁帶、膠巻、晶片)、可視媒介(如CDROM)等。此類媒介可包括 提供此類指導材料的網際網路站點地址。實施例公認製備G蛋白偶聯受體(GPCR)的抗體非常困難。發明人採用加拿大專利申請CA 2 350 078中描述的Genovac AG， DE方法。結合CCX-CKR2的抗體通過用表達 CCX-CKR2(SEQ ID NO:l)的cDNA接種小鼠來產生。簡單地講，CCX-CKR2被克隆 入表達載體，用基因槍方法將該載體接種入小鼠。在合適的時間點分離B細胞，通 過標準技術與骨髓瘤細胞融合，選擇融合的雜交瘤細胞進行體外培養。通過流式細 胞計數分析克隆培養物的上清液對被CCX-CKR2穩定轉染的細胞的結合。擴增陽性 克隆並進行再一輪的流式細胞計數篩選。認為單克隆抗體6E10和11G8結合CCX-CKR2。抗體6E10和11G8檢測內源性 不產生CCX-CKR2的轉染細胞系以及內源性表達CCX-CKR2的細胞(如HeLa和 MCF-7(ATCC， VA))上的CCX-CKR2。而且該抗體能識別CCX-CKR2的小鼠同源物。 例如，抗體6E10和11G8檢測小鼠乳腺腫瘤細胞系4T1和Lewis肺癌細胞(ATCC， Va)上的CCX-CKR2。在被CCX-CKR2轉染的HEK293細胞系上檢測到抗體6E10和 11G8，但未檢測到非同種型對照，但這兩種抗體不結合被空載體或表達其它趨化因 子受體(如CXCR2)轉染的HEK293細胞。放射性配體競爭性結合試驗證實抗體還是中和性的。抗體6E10和11G8與SDF-1 和I-TAC競爭結合小鼠和人CCX-CKR2。抗體11G8通常比抗體6E10顯示更高的趨 化因子結合抑制百分比。在固定的石蠟包埋組織切片上進行的免疫組織化學(IHC)試驗中，抗體6E10和 11G8還識別CCX-CKR2。對各種組織類型的實驗中，抗體6E10和11G8的IHC染 色與各個組織上結合有放射性標記SDF或I-TAC的結合試驗所確定的表達模式相匹 配。例如在E13胎鼠切片中發現CCX-CKR2染色，但在E17胎鼠或成年鼠的切片中 未發現。CCX-CKR2染色也見於穩定表達人CCX-CKR2的細胞的細胞離心塗片中。確定了重鏈和輕鏈可變區編碼序列和預測的胺基酸序列。6E10的重鏈可變區包 含在SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO: 11所編碼)中。6E10的輕鏈可變區包含在SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 13所編碼)中。11G8的重鏈可變區包含在SEQ ID NO: 16 (SEQ ID NO: 15所編碼)中。11G8的輕鏈可變區包含在SEQIDNO:18(SEQIDNO:17所編碼)中。
離附加的權利要求的精神和範圍。本說明書中所引用的所有出版物、資料庫、Genbank序列、專利和專利申請均納 入本文作為參考，正如其被明確地和分別地表明為作為參考而包含在本文中那樣。formula see original document page 32 SEQ ID NO:4 CCX-CKR2.2胺基酸序列MDLHLFDYAEPGNFSDISWPCNSSDCIWDTVMCPNMPNKSVLLYTLSFIYIFIFVIGMTCKVTHLIFSINLFSGIFFLTCMSVDRYLSITYFTNTPSSRKKMVRRVVCILVWLLAFC VSLPDTYYLKTVTSASNNETYCRSFYPEHSIKEWLIGMELVSVVLGFAVPFSIIAVFYFTEYSALEQNAKSEQ ID N0:5 CCX-CKR2.3編碼序列CAGAGACGGAGTACTCTGCCTTGGAGCAGAGCACCAAATGA SEQ ID NO:6 CCX-CKR2.3胺基酸序列SEQ ID NO:7 CCX-CKR2.4編碼序歹ljETEYSALEQSTK formula see original document page 34SEQ ID NO: 12抗體6E10重鏈可變區的胺基酸序列VRQSPEKGLEWVGQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRTEDT GIYYCTSLRYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPVAPGSLSEQ ID NO: 13抗體6E10輕鏈可變區的DNA序列SEQIDNO:14抗體6E10輕鏈可變區的胺基酸序列TYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG SEQIDNO:15抗體11G8重鏈可變區的DNA序列ATCCCTTGGCCCCTGGAAGCTTGG SEQIDNO:16抗體11G8重鏈可變區的胺基酸序列VRQTPEKRLEWVAYITNGGDRSYYSDTVTGRFIISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAM YYCARQGNWAAWFVYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSLSEQDDNO:17抗體11G8輕鏈可變區的DNA序列G ，"AGAAGGT Ac cAA ^3c GA GG TAs就c訂5TGcl麗w燈G ST G5 cG AG AA wA Ac ATccccGGTGTcc麗GGccccccccAGcAAAAccGAcGTc rT_T S丁 PG t:T TG c丁 AG GG G微gT rG Mb cA <JA T_5 GG GJ GG MT wc wc Mw GG AG cK GP AG GcK AS cbecTGcTc LT ^G AT AA GA TA GG AG AT TP GG AA cA wc A廟BG aT T^ cG bG Aa c丁 y丁 bG mc SA SH AM Ac cb AA cT GTTm GG cG GA GG 、A Ac AA虹c MT Ac GG tT Tc yT GA cG KG GT Tc c^ cS TccS cT TJ c^ AG ct cJ TG cT Ac wt cTGTccA GA bG AA TG AA cA Pc AM cG 1T Hy c^ cT TG §c JA rac Tc AG Ac cc cAT cT乂 cw GA Tt GT TG GA G汀A GSAGG g gT 丁 TS y TM G cWAGS TG cA ac Tc G訂Gg GS G5 GA 丁A ct ATTTGfi Gc t:T ^G仏T "5T Ac G^ G汀GH GG丌GGTcTGT AT GG TA 9G AG ^J GA T乂G T，Gc仏wccTG打HG 1)T ^c AG ^c Ac AG AG AG cT cc GA AG GG TA TG cA AA cc JG G丁 GG TT cc TA cm AGT AA Ac cc cG GA GSEQIDNO:18抗體11G8輕鏈可變區的胺基酸序列MKLPVRLLVLMFWIPASTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSHYrVHSDGNTYLE WYLQKPGQSPKLLrYKVSNRFSGWDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGrYYCFQGS HVPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSKLG
權利要求
1.一種抗體，其競爭性抑制競爭者抗體與CCX-CKR2的結合，其中所述競爭者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR)SEQ ID NO12和SEQ ID NO14；或SEQ ID NO16和SEQ ID NO18。
2. 如權利要求l所述的抗體，其特徵在於，所述抗體連接可檢測標記。
3. 如權利要求l所述的抗體，其特徵在於，所述抗體為單克隆抗體。
4. 如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，所述抗體為人源化抗體。
5. 如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID N0:12和 SEQ ID N0:14的互補決定區(CDR)。
6. 如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID N0:12和 SEQ ID NO:14。
7. 如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID NO: 16和 SEQ ID N0:18的互補決定區(CDR)。
8. 如權利要求1所述的抗體，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID N0:16和 SEQ ID NO:18。
9. 一種藥物組合物，包含藥學上可接受賦形劑和權利要求1的抗體。
10. 如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗體為單克隆抗體。
11. 如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗體為人源化抗體。
12. 如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14的互補決定區(CDR)。
13. 如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
14. 如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18的互補決定區(CDR)。
15. 如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗體含有SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。
16. —種在生物樣品中檢測表達CCX-CKR2的細胞的方法，所述方法包括用權 利要求1的抗體接觸該生物樣品並檢測抗體的存在。
17. —種抑制血管發生或癌細胞增殖的方法，所述方法包括用權利要求1的 抗體接觸細胞的步驟。
18. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述細胞位於個體內。
19. 如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述個體患有或易患關節炎。
20. 如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述個體非人。
21. —種確定CCX-CKR2調控因子的方法，其特徵在於，包括(a) 將表達CCX CKR2多肽的細胞或所述細胞的提取物與檢測試劑混合；和(b) 進行實驗以檢測檢測試劑是否與競爭者抗體競爭結合CCXCKR2多肽，其 中，所述競爭者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR):SEQ ID NO:12禾卩SEQ ID NO:14;或 SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18，其中競爭者抗體與檢測試劑之間就結合CCX-CKR2多肽存在競爭指示該檢測 試劑為CCX CKR2活性調控因子。
22. —種檢測檢測試劑調控CCX-CKR2活性的效力的方法，其特徵在於，所述方法包括(a) 將檢測試劑給予第一動物；(b) 給予第二動物與競爭者抗體競爭結合CCXCKR2多肽的抗體，其中該競爭 者抗體含有以下序列的互補決定區(CDR):SEQ ID N0:12和SEQ ID NO: 14;或 SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18;和(c) 通過比較檢測試劑對第一動物的影響和抗體對第二抗體的影響來確定檢 測試劑的效力。
23. —種多肽，含有SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16或SEQ ID N0:18。
24. —種多核苷酸，編碼SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16或 SEQ ID NO:18。
25. 如權利要求24所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸含有SEQID NO:11、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17。
26. —種製備嵌合抗體的方法，所述方法包括可操作地將編碼至少一種SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16或 SEQ ID N0:18的互補決定區(CDR)的多核苷酸連到至少編碼抗體重鏈或輕鏈的骨 架區的異源多核苷酸，以形成編碼抗體的嵌合體重鏈或輕鏈的融合多核苷酸；和由融合多核苷酸表達嵌合體重鏈或輕鏈。
全文摘要
提供了結合CCX-CKR2的抗體及其使用方法。
文檔編號C07K16/00GK101163718SQ200680013393
公開日2008年4月16日 申請日期2006年4月19日 優先權日2005年4月21日
發明者M·霍華德, T·沙爾 申請人:凱莫森特裡克斯股份有限公司