豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株及其生產活疫苗的方法

2023-10-11 18:19:29

專利名稱：豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株及其生產活疫苗的方法
技術領域：
本發明屬於獸用生物製品技術領域，具體涉及一種用基因重組技術構建弱毒活疫苗株並用該毒株生產豬繁殖與呼吸症候群活疫苗的方法。

背景技術：
豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)引起的以母豬發熱、流產，斷奶前後仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特徵的疾病。1991年，荷蘭學者Terpstra等人在感染豬體內分離到歐洲型PRRSV，命名為Lelystad病毒(Lv)；同年，美國學者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為VR-2332。近年來，我國學者相繼分離鑑定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。
豬「高熱病」是新近在我國發生的重大動物疫病，此前在國內外均無相關研究報導。寧宜寶等經過大量的實驗證實了豬藍耳病病毒感染是導致高熱病的主要原因。並首先在國內做了報導。
國內外針對傳統豬藍耳病的診斷和疫苗免疫防治技術已有大量研究成果，但這些現有技術不能滿足我國新出現的高致病性豬藍耳病防控需要，必須有針對性地研究專門針對高致病性豬藍耳病的疫苗產品和鑑別診斷技術。
大量的實驗數據證明人工傳代致弱的豬藍耳病活疫苗具有較好的免疫力、免疫期長等優點，但因在一些豬場使用後出現了藍耳病問題，其安全問題引起了人們的普遍關注。在使用弱毒疫苗時，出於疫苗對豬安全原因的考慮，一般只是建議在發生過豬藍耳病的區域使用，而不建議在未發生過豬藍耳病的養殖場使用。在歐盟之所以禁止用活疫苗來預防豬藍耳病，也是因為曾經在一些豬場使用弱毒活疫苗後爆發了藍耳病。美國在藍耳病活疫苗的使用上同樣非常謹慎。美洲其他一些國家和亞洲地區各國雖然不反對在豬藍耳病流行地區使用人工傳代致弱的豬藍耳病活疫苗，但不提倡在未發生豬藍耳病的豬場使用弱毒疫苗。滅活疫苗由於病原被滅活了，不存在散毒的問題，相對活疫苗來說，安全性要好一些，但是與活疫苗相比，免疫效果差，免疫期也短。在我國高致病性豬藍耳病滅活疫苗使用的結果證明在已經發生豬藍耳病地區，由於豬體本身可能已經感染豬藍耳病病毒，滅活疫苗免疫後不但起不到防病的作用，反而會引起一定的副反應。在疫苗使用對象上說，和活疫苗不同的是，滅活疫苗最好是在未發生豬藍耳病的地區使用。
和經典的豬藍耳病不同，高致病性豬藍耳病是由高變異豬藍耳病毒株引起的，無論是經典的活疫苗，還是滅活疫苗，均不能預防該病的發生。因此，為了有效預防控制高致病性豬藍耳病，疫苗研究是當務之急。根據經典株疫苗研究的經驗教訓，非常有必要開展新型基因工程疫苗的研究。
1、豬藍耳病常規疫苗 隨著豬藍耳病的發現，豬藍耳病的疫苗研究也就隨之開展，儘管大家對現有豬藍耳病疫苗的免疫效果評價不一。目前國內外已經商品化的豬藍耳病疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗兩類。基因工程疫苗研究也已出現積極發展的趨勢。
1.1豬藍耳病弱毒活疫苗 在經典豬藍耳病弱毒活疫苗方面，美國Boehringer Ingleheim公司於1995年首次推出商品化減毒疫苗Resp PRRS/ReproTM，已獲準用於3～18周齡豬的預防接種。隨後多個單位均推出了豬藍耳病弱毒疫苗。目前西班牙、荷蘭、美國和中國已研製出豬藍耳病弱毒活疫苗並商品化。可供各階段豬群使用，但主要供3～18周齡的仔豬接種使用，用於防制豬藍耳病的呼吸障礙。據報導，接種豬藍耳病弱毒疫苗後第110天用同源強毒攻擊，動物可得到完全保護，而且對強毒攻擊的保護甚至是終生的。架子豬接種7天後就激發保護性免疫應答，並可持續16周以上，與未接種的對照豬相比，接種豬攻毒後排毒時間減少，肺部病變減輕，生長發育良好。然而，多數報導認為豬藍耳病弱毒活疫苗存在安全問題。Botner等報導，在丹麥，對1000多頭豬藍耳病血清學陰性豬使用了弱毒疫苗，可是不久後豬群發生了豬藍耳病，而且從流產胎兒和死胎中分離到了疫苗病毒，發現疫苗病毒可經胎盤感染胎兒，並向未接種的母豬傳播，有些豬群則表現出急性豬藍耳病樣綜合症狀。也有研究者用該疫苗接種公豬，隨後以強毒攻擊，發現有精液排毒和精液質量下降等現象。
Opriessnig報導從一個多次接種Ingelvac PRRS MLV的豬場發生豬藍耳病後分離到一株PRRSV 98-38803，並證實該毒株來自於Ingelvac PRRS MLV。所以豬藍耳病弱毒疫苗的毒力返強的可能性是存在的。從以上結果來看，豬藍耳病弱毒疫苗免疫產生期快，在控制豬藍耳病臨床症狀上明顯好於豬藍耳病滅活疫苗。但豬藍耳病強毒和弱毒在豬體內的反應過程是一致的，所以長期使用豬藍耳病弱毒疫苗所帶來的安全問題仍是目前豬藍耳病免疫中最大的爭議。儘管弱毒苗免疫能使豬體獲得一定的免疫力，但弱毒疫苗的不安全性尤其是毒力返強等變異可能性是限制了其廣泛使用。
在高致病藍耳病減毒活疫苗方面，目前，雖然我國有多家單位在通過細胞傳代致弱的方式研究高致病藍耳病減毒活疫苗，並取得良好的進展，但它們的安全性需要做進一步觀察。
1.2豬藍耳病滅活疫苗 在經典豬藍耳病滅活疫苗方面，Bayer公司於1997年推出了滅活疫苗PRRomiSet M，此後西班牙、荷蘭、加拿大和中國都已研製出豬藍耳病滅活疫苗並商品化。主要用於預防後備母豬和經產母豬感染豬藍耳病所造成的繁殖障礙。滅活疫苗的優點是安全性好，但主要刺激豬體產生體液免疫反應，對清除感染巨噬細胞中的豬藍耳病病毒無能為力，因此僅靠滅活苗免疫不能使豬產生牢固的免疫力。滅活疫苗免疫後的缺點是免疫劑量大、免疫次數多、免疫力產生期較長，因而不適合仔豬免疫。據報導，滅活疫苗免疫後攻毒不能保護仔豬對豬藍耳病病毒的感染，病毒感染後病毒血症的持續時間和病毒的滴度與非免疫組無顯著差別。仔豬和架子豬帶毒是豬場豬藍耳病病毒持續存在的最重要原因，因此，通過滅活疫苗難以控制和根除豬藍耳病病毒在豬場的存在和流行。
在高致病藍耳病滅活疫苗方面，2006年夏季以來，我國部分地區陸續發生豬高致病性藍耳病疫情，農業部組織了中國動物疫病預防控制中心、中國獸醫藥品監察所聯合研製等有關單位，進行了高致病性藍耳病滅活疫苗研究，該疫苗於2007年5月正式投產。此疫苗利用流行的高致病性藍耳病變異毒株NVDC-JXA1株作為種毒，這疫苗是目前唯一獲得臨時批准文號並作為政府招標採購緊急預防用的滅活疫苗，但使用結果表明該疫苗存在與其它滅活疫苗同樣的問題。
目前，我國還有多家單位在研究高致病藍耳病活疫苗，但它們都在研究之中，尚未投放市場使用。
2豬繁殖與呼吸症候群基因工程疫苗 目前正在實驗室研製的豬藍耳病新型疫苗種類很多，主要有亞單位疫苗、基因工程重組/嵌合疫苗和DNA疫苗，雖然所取得的進展是喜人的，但他們基本都處在研究階段。
2.1亞單位疫苗 目前對豬藍耳病病毒各結構蛋白免疫原性的研究已比較清楚，豬藍耳病病毒感染豬體後，血清中抗豬藍耳病病毒的免疫球蛋白主要是針對N蛋白和M蛋白，GP3雖不能刺激中和抗體的產生，但可對仔豬提供保護。GP4、GP5和M蛋白可產生中和抗體，GP5比GP4產生中和抗體的能力更強。亞單位疫苗及其他新型疫苗的研究多針對這些蛋白。
2.2基因工程重組疫苗 Gagnon等通過對GP5及M蛋白等基因進行了重組表達，構建基因工程重組疫苗的研究，為豬藍耳病新型疫苗的研究開闢了新領域。用豬藍耳病病毒人工製備重組病毒的工作也已展開，Verheije等構建了豬藍耳病病毒LV株的感染性cDNA克隆、得到人工突變的豬藍耳病病毒，並進行了突變株安全性及免疫保護效力進行了檢測。目前基因工程重組疫苗可給豬體提供一定的保護，但效果不完全。
2.3DNA疫苗 Kwang、Pirzadeh、中國農業大學楊漢春等製備了分別表達豬藍耳病病毒ORFK4、ORF5、ORF6及ORF7的DNA疫苗並用於動物試驗，表明DNA疫苗可誘導體液免疫和細胞免疫的產生。
儘管目前針對PRRS的疫苗研究種類繁多，但沒有任何一種疫苗可對豬體產生理想的安全保護作用。
豬繁殖與呼吸症候群(或豬藍耳病)疫苗的研發是一個世界性難題，活疫苗普遍存在毒力偏強的問題，而滅活疫苗存在的主要問題是免疫效力欠佳。目前，世界上尚沒有一種滿意的疫苗用於該疾病的預防。而2006年在我國出現的高致病性豬藍耳病，由於病原基因的突變，經典的豬藍耳病疫苗對其基本上沒有免疫保護力，用高致病性豬藍耳病病毒分離株生產的滅活疫苗同樣不能對野毒株產生有效的保護，傳代致弱株生產弱毒疫苗同樣存在毒力的問題。因此，目前迫切需要研究出一種安全有效，免疫譜廣的疫苗。


發明內容
本發明為了克服上述現有技術存在的問題及缺點，提供一種豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株及其生產活疫苗的方法，本發明利用反向遺傳操作和基因重組技術將高致病豬繁殖與呼吸症候群病毒株基因與經典豬繁殖與呼吸症候群弱毒株基因嵌合，重組成一個新的嵌合弱毒疫苗株和用該毒株生產疫苗，有效地解決此類疫苗存在的上述問題。
本發明技術方案為 豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株，利用反向遺傳操作和基因重組技術將豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)經典毒PTK株的GP2基因的後半部分及GP3～GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列全部刪除後，替換成中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因，重組成一個同時含有豬繁殖與呼吸症候群經典株和變異株基因的嵌合重組疫苗株(PC株)，嵌合重組疫苗株(PC株)的基因全序列總長度為15562bp，嵌合重組疫苗株(PC株)基因的胺基酸序列。該嵌合重組株毒性低，對豬安全，有良好的免疫原性，用PC株生產疫苗可預防豬繁殖與呼吸症候群經典株和變異株的感染。
所述的中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因為中國高致病性豬藍耳病變異毒株GP2基因的後半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列，且嵌入的目的核酸序列總長度為2421bp，主要編碼PRRSV的結構蛋白以及3』非編碼區。其中GP2基因的後半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因為病毒的結構蛋白，3』非編碼區的核苷酸序列與病毒的複製和活性有關。可通過特異性RT-PCR方法擴增進行檢驗。嵌入的中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因的胺基酸序列。
所述的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株來生產活疫苗的方法，按以下步驟進行 (1)制苗用細胞的傳代與培養將Marc145或MA104細胞系經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成緻密單層時，備用；用於繼續傳代或接種病毒； (2)細胞毒種的繁殖將PC株病毒液按1/10的體積量接入已經生長成良好細胞單層的細胞瓶，吸附1小時後，加入細胞維持液於細胞系單層，繼續培養，當70-80％細胞出現病變後收穫，收穫的毒液凍融2-3次後置-15℃以下保存，取少量做半成品檢驗； (3)配苗、分裝及凍幹將檢驗合格的病毒培養液與常規穩定劑按1∶1的體積比在一容器內混合，充分搖勻，定量分裝；每頭份含細胞毒液不少於105.0TCID50，分裝後迅速進行冷凍乾燥即得成品。
本發明的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株PC株是豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)經典毒PTK株的ORF1-ORF2基因片段前半部分作載體，插入高致病豬繁殖與呼吸症候群中國分離毒株ORF2基因片段後半部分ORF3-ORF7基因片段，構建成重組嵌合的PC株，載體名稱為PB13117質粒。載體的核酸序列包括PBluescript SK全序列、CMV啟動子、T7啟動子以及豬繁殖於呼吸症候群病毒(PRRSV)PTK株的基因組序列，PBS13117質粒的CMV啟動子T7啟動子的大小分別為565bp和19bp。本發明中只使用到T7啟動子，終止子為rrnB rRNA操縱子的t1t2串連轉錄終止子，大小為402bp，CMV啟動子來自於巨細胞病毒，T7啟動子來源於噬菌體，rrnB終止子來源於大腸桿菌，插入中國高致病性藍耳病變異株目的核酸序列後，嵌合疫苗毒PC株的基因全序列為15562bp。本發明構建嵌合重組PC株的工藝流程如圖1所示。
標記基因為氨苄青黴素抗性基因(Ampr)，基因ORF大小為861bp，其功能為可使含有該基因的細菌具有耐受一定濃度氨苄青黴素的能力，來源於大腸桿菌。
基因操作方法 本發明所使用的基因操作方法包括常規的RT-PCR、酶切、連接、轉化、體外轉錄、細胞轉染等分子生物學方法。
豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株PC株的轉基因微生物的檢測方法，採用RT-PCR方法檢測。
本發明具有以下優點 嵌合重組PC株在細胞上的增殖和遺傳穩定性本發明的嵌合重組PC株在病毒拯救成功後，可在Marc145或MA104細胞內穩定地表達和發揮功能，構建的嵌合毒株在Marc145或MA104細胞上能穩定增殖，連續傳代20代以上其各種特性沒有發生變化。在本動物體內回傳5代，毒力沒有返強，遺傳性能穩定。
疫苗生產和疫苗特性本發明的嵌合重組PC株對本動物具有良好安全性和免疫原性，故用其生產疫苗，用以預防豬繁殖與呼吸症候群經典毒株和高致病性變異毒株的感染。
本發明構建的嵌合重組PC株可在Marc145或MA104細胞上高效增殖，使其產生病變。該毒株毒力低，回傳豬5代毒力不返強，遺傳性能穩定；具有良好的免疫原性，由於該嵌合重組PC株同時保留了豬繁殖與呼吸症候群經典株和高致病性變異毒株的基因結構，用其製造的疫苗免疫效力高，可同時保護豬藍耳病經典毒株和高致病性變異毒株的感染。
本發明生產的疫苗具有如下幾大優點 1、由於遺傳背景清楚，疫苗不會出現毒力返強，這可以克服人工傳代致弱疫苗安全性的問題。
2、由於它是一個活疫苗，既能刺激體液免疫，又能刺激細胞免疫，而且基因沒有受到長時間傳代的誘變影響，基因結構同原始株更接近。應該具有良好的免疫效果。
3、由於疫苗中既含有經典株的部分基因，又含有變異株的部分基因，從理論上講，它是一個雙價疫苗，既可用於預防經典的豬藍耳病，又可以預防高致病性豬藍耳病。
4、由於在基因構建是可以人工插入表示基因，因而，對該疫苗可以作鑑別診斷。這對評價疫苗的免疫效力和進行疾病根除十分有利，這一點是傳統疫苗難以做到的。
5、相對長時間病毒在細胞中傳代致弱來說，基因工程疫苗構建過程所花費的時間要短得多，得別是我們已經獲得了安全載體的前提下。這對我國急需高致病性豬藍耳病疫苗的情況下，顯得特別有意義。



圖1為本發明構建嵌合重組PC株的工藝流程圖。

具體實施例方式 本發明的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株，利用反向遺傳操作和基因重組技術將豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)經典毒PTK株的GP2基因的後半部分及GP3～GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列全部刪除後，替換成中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因，重組成一個同時含有豬繁殖與呼吸症候群經典株和變異株基因的嵌合重組疫苗株(PC株)，所述的中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因為中國高致病性豬藍耳病變異毒株GP2基因的後半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列，且插入的目的核酸序列總長度為2421bp，主要編碼PRRSV的結構蛋白以及3』非編碼區。
所述的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株來生產活疫苗的方法，按以下步驟進行 (1)制苗用細胞的傳代與培養將Marc145細胞系經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成良好單層時，備用；用於繼續傳代或接種病毒； (2)細胞毒種的繁殖將PC株病毒液按1/10的體積量接入已經生長成良好細胞單層的細胞瓶，吸附1小時後，加入細胞維持液於細胞系單層，繼續培養，當70-80％細胞出現病變後收穫，收穫的毒液凍融2-3次後置-15℃以下保存，取少量做半成品檢驗； (3)配苗、分裝及凍幹將檢驗合格的病毒培養液，與常規穩定劑按1∶1的體積比在一容器內混合，充分搖勻，定量分裝；每頭份含細胞毒液不少於105.0TCID50，分裝後迅速進行冷凍乾燥即得成品。
本發明生產的疫苗株在細胞上的特性以PB13117質粒為載體，插入中國高致病性豬藍耳病病毒GD株ORF2後半部分和ORF3～ORF7核酸序列後重新獲得的嵌合疫苗毒PC株，可在Marc145細胞內穩定地增殖，使細胞在72小時左右產生拉網式病變，在細胞上連續傳代20代，病毒的增殖特性沒有發生變化，基因結構沒有發生變化。
一、疫苗對本動物的安全性 1、豬藍耳病重組疫苗(第4代)(TCID50＝105.25)分別感染33日齡10頭健康仔豬，感染劑量為3ml/頭豬，滴鼻2ml，頸部肌肉注射1ml，感染後每天上下午各測1次體溫，觀察臨床症狀，30日後，取5頭宰殺後解剖觀測其肺臟及其他器官的變化。
結果所有10頭豬均無體溫升高，全部豬健活。解剖的5頭豬所有內臟器官無肉眼可見病理變化。
2、用豬藍耳病重組疫苗(第5代)(TCID50＝105.0)分別感染35日齡5頭健康仔豬，感染劑量為3ml/頭豬，滴鼻2ml，頸部肌肉注射1ml，感染後每天上下午各測1次體溫，觀察臨床症狀，21日後，全部宰殺後解剖觀測其肺臟及其他器官的變化。
結果所有5頭豬均無體溫升高，全部豬健活。解剖的5頭豬所有內臟器官無肉眼可見病理變化 3、毒力返強能力。
將PRRSV PC株在豬體內連續回傳5代，沒有發現現毒力返強現象。
結果表明用豬藍耳病重組疫苗對豬安全。
二、豬藍耳病PC株疫苗效力試驗 1、使用豬藍耳病重組疫苗(PC株第4代)(TCID50＝105.25)免疫15頭健康仔豬，35日後攻毒，攻毒後觀察21天，宰殺後解剖觀測其肺臟及其他器官的變化。試驗結果如下 安全性所有免疫豬在疫苗接種後的35日內，均無體溫上升。也無臨床症狀。證明疫苗安全。
免疫保護免疫後14天抗體檢測100％陽性；攻擊強毒後，所有免疫豬均健活，三組免疫豬的體重增加明顯高於對照豬。免疫豬的肺部病變保護率為78％。
2、使用兩組豬藍耳病重組疫苗(PC株第5代)(TCID50＝105.25)，5倍稀釋後，每批各免疫5頭36日齡健康仔豬，頸部肌肉注射1ml/頭，21日後，連同對照5頭一起攻毒，每頭點鼻0.5ml，頸部肌肉注射2ml。每天測溫，觀察臨床症狀，21天宰殺後解剖觀測其肺臟及其他器官的變化。結果如下。
免疫豬一組2/5發病，1/5死亡，另一組1/5發病，0/5死亡，對照豬5/5發病，4/5死亡。
結果表明用豬藍耳病重組疫苗免疫豬可產生良好的保護效果。
附件1
CTAGTGATTACGCCTGGCTGGCGTTCCTGTCCTTCAGCTACACGGCCCAGTTCCATCCCGAGATATTTGGGATAGGGAATGTGA
GTCAAGTTTATGTTGACATCAAGCACCAATTCATCTGCGCTGTTCACGACGGGGATAACGCCACCTTGCCTCGCCATGACAATA
TTTCAGCCGTATTTCAGACCTACTACCAACACCAGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTGGAATGGCTGCGTCCTTTCTTTT
CCTCTTGGTTGGTTTTAAATGTTTCGTGGTTTCTCAGGCGTTCGCCTGCAAGCCATGTTTCAGTTCGAGTCTTTCGGACATCAA
AACCAACACCACCGCAGCATCAGACTTCGTTGTCCTCCAGGACATCAGCTGCCTTAGGCATGGCGACTCGTCCTCTCCGACGAT
TCGCAAAATTTCTCAGTGCCGCACGGCGATAGGGACGCCCGTGTACATCACCATCACTGCCAATGTCACAGATGAAAATTATCT
ACATTCTTCTGATCTCCTCATGCTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCCGAGATGAGTGAAAAGGGATTCAAAGTGGTGTTTGG
CAATGTGTCAGGCACTGTGGCTGTGTGCGTCAACTTTACCAGCTACGTCCAACATGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCTTAGT
GGTCGATCATGTGCGACTGCTTCATTTCATGACACCTGAGACCATGAGGTGGGCAACCGTTTTAGCCTGTCTTTTTGCCATCCT
ACTGGCAATTTGAATGTTCAAGTATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCG
TGCCGTTCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGTTATGTG
AGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGTGTTGACTCACATTG
TTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTTTGGCCACTGTGTCTACCGCCGGATATTATCACGGGC
GGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGT
CCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTG
TGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTT
TAACCAGAGTTTCAGCGGAACGATGGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCACAGAAGGTGCTTTTGGC
GTTTTCCATTACCTACACGCCAGTGATGATATATGCTCTAAAGGTAAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCTTTTGAT
CTTTCTGAATTGTGCTTTTACCTTCGGGTACATGACATTCGTGCACTTTGAGAGCACAAATAGGGTCGCGCTCACTATGGGAGC
AGTAGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGG
CCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATT
TGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGC
TGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGC
CAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATA
GGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCGACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAAT
TGTGTCTGTCGTCGATCCAGACTGCCTTCAATCAGGGCGCTGGAACTTGTGCCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAAGTTACACTG
TGGAGTTTAGTTTGCCGACGCAACATACTGTGCGTCTGATCCGCGCCACAGCATCACCCTCAGCATGATGGGCTGGCATTCTTT
GGCACCTCAGTGTTAGAATTGGGAGAATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACACTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGG
CGACCGTGTGGGGGTAAAGTTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGTAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
附件2
TATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGCCTTGACATTTGTATTGTCAGGAGCTGTGATCATTGACACAGCCCAAAGCTTGCTGCACAGAAACACCCTTC
TGTGACAGCCTCCTTCAGGGGAGTTTAGGGGTCGTCCCTAGCACCTTGCTTCCGGAGTTGCACTGCTTTACGGTCTCTCCACCCCTTTAACCATGTCT
GGGATACTTGATCGGTGCACGTGTACCCCCAATGCCAGGGTGTTCATGGCGGAGGGCCAAGTCTACTGCACACGATGCCTCAGTGCACGGTCTCTCCT
TCCTCTGAATCTCCAAGTTCCTGAACTCGGGGTGCTGGGCCTATTCTATAGGCCCGAAGAGCCACTCCGGTGGACGTTGCCACGTGCATTCCCCACTG
TTGAGTGCTCCCCCGCCGGAGCCTGCTGGCTTTCTGCCATCTTTCCAATTGCACGAATGACCAGTGGAAATCTGAACTTTCAACAAAGAATGGTGCGG
GTCGCAGCTGAGCTTTACAGAGCCGGCCAGCTCACCCCTGCAGTCTTGAAGACTCTACAAGTTTATGAACGGGGTTGCCACTGGTACCCCATTGTTGG
ACCTGTTCCTGGAGTGGCCGTTTATGCCAACTCCCTACATGTGAGTGATAAACCTTTCCCGGGAGCAACTCACGTGTTAACCAACCTGCCGCTCCCGC
AGAGACCCAAGCCTGATGATTTTTGCCCCTTTGAGTGTGCTATGGCTACTGTCTATGACATTGGTCATGACGCCGTCATGTATGTGGCCGCAGAGAAA
GTCTCCTGGGCCCCTCGTGGCGGGGATGAAGTGAAATTCGAACCTGTCCCCGGGGAGTTGAAGTTGATTGCGAACCGACTCCGCACCTCCTTCCCGCC
CCACCACGCAGTGGACATGTCTAAGTTCACCTTCACAGCCCCTGGGCGTGGTGTTTCTATGCGGGTCGAACGCCAACACGGCTGCCTCCCCGCTGACA
CAGTTCCTGAAGGCAACTGCTGGTGGAGCTTGTTCAACTTGCTCCCACTGGAAGTTCAGAACAAAGAAATTCGTCATGCCGGCCAATTTGGCTACCAG
ACTAAGCATGGTGTCTCTGGCAAGTACCTACAGCGGAGGCTGCAAGTTAATGGTCTTCGAGCAGTAACTGACCTAAATGGACCTATCGTCGTACAGTG
CTTCTCCGTTAACGAGAGTTGGATCCGCCACTTGAAACTGGCGGAAGAACCCAGCTACCCTGGGTTTGAGGACCTCCTCAGAATAAGGGTTGAGCCCA
ACACGTCGCCATTGGCTGACAAGGATGAAAAAATTTTCCGGTTTGGCAATCACAAGTGGTATGGCGCTGGAAAGAGAGCAAGGAAAGCACGCTCTAGT
GCGACTGCTACAGTCGCTGGCCGCGCTTTGCCCGTTCGTGAAACCCGGCAGGTCGAGGAGCACGAGGTTGCCGGCGCCAACAAGGCTGAGCACCTCAA
ACACTACTCCCCGCCTGCCGAAGGGAATTGTGGTTGGCACTGCATTTCCGCCATCGGCAACCGGATGTTGAATTCCAAATTTGAAACCACCCTTCCCG
AAAGAGTGAGACCTCCAGATGACTGGGCTACTGATGAGGATCTTGTGAATGCCATCCAAATCCTCAGACTCCCTGCGGCCTTGGACAGGAACGGTGCT
TGTGCTAGCGCCAAGTACGTACTTAAGCTGGAAGGTGAGCATTGGACTGTCACTGTGACCCCTGGGATGTCCCCTTCTTTGCTCCCTCTTGAATGTGT
TCAGGGCTGTTGCGAGCATAAGGGCGGTCTTGGTTCCCCAGATGCAGTCGAGGTTTTCGGATTTGACCCTGCCTGCCTTGACTGGCTGGCTGAGGTGA
TGCACTTGCCTAGCAATGCCATCCCAGCCGCTCTGGCCGAAATGTCCGGCGATTCCAATCGTCCGGCTTCCCCGGTCACCACCGTGTGGACTGTTTCG
CAGTTCTTAGCCCGCCACAACGGAGGGAATCACCCTGACCAAATACGCTTAGGGAAAATTATCAGCCTTTGTCAGGTGATTGAGGACTGCTGCTGTTC
CCAGAACAAAACCAACCGGGTCACCCCGGAGGAGGTCGCAGCAAAGATTGACCTGTACCTCCGTGGTGCAACAAATCTTGAAGAATGCTTGGCCAGGC
TTGAGAAAGCGCGCCCGCCACGCGTAATGGACACCTCCTTTGATTGGGATGTTGTGCTCCCTGGGGTTGAGGCGGCAACTCAAACGACCGAACTGCCC
CAAGTCAACCAGTGTCGCGCTCTGGTCCCTGTTGTGACTCAAAAGTCCTTGGACAACAACTCGGTCCCTCTGACCGCCTTTTCACTGGCTAACTACTA
CTACCGCGCGCAAGGTGACGAAGTTCGTCACCGTGAAAGACTAACCACCGTGCTCTCTAAGTTGGAAGGGGTTGTTCGAGAAGAATACGGGCTCATGC
CAACCGGGCCTGGTCCACGGCCCACACTGCCACGCGGGCTCGACGAACTCAAGGACCAGATGGAGGTGGACTTGCTGAAACTGGCTAACGCCCAGATG
ACTTCGGACATGATGGCCTGGGCAGTCGAGCAGGTTGACCTAAAGACTTGGGTCAAGAACTATCCGCGGTGGACACCACCACCTCCTCCGCCAATAGT
TCAGCCTCGAAAAACGAAGCTTGTCAAGAGCTTACCAGAGAGCAAGCCTGTTCCTGCACCGCGTAGGAAGGTCAGGTCCGATTGTGACTGCCCCACCC
TATCGGGCAACAATCTTCCTGACAGTTGGGAAGATTTGGCTGTTGGTTGCCCCTCTGATCTCCCTACCTCACCTGAGCCGGTAACACCTTTGAGTGAG
CCGGCATCTGTGTCCGCACCGCGACGCTCTTTTAGGCCGGTGAAGCCTTTGAGTGAACCAGTTCCAGTCCCTGCACCGCGCAAGACTGTGTCCCGACC
GGCAACACCTCTGAGTGAGCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGACGCAAGTTTCAGCAGGTAGAAAAAGTGAATCCGGCGGCGGCAACCCTGGCGTGCC
AAGACGAGTTTCCAGATTTGTCTGCATCCTCGCATACTGAATATGAGGCGTCTCCCCTTGTACTACCGCAGAACGGGGACGTTCTTGAAGTGGAGGAG
CGGGAAGCTGAGGAAATCCTGAGTGGAATCTCAGACATACTGGATGCCATCAAACCGGCATCTGCATCATCAAGCAGCTCCCTGTCAAGTGTGGCGAT
CACACGCCCGAAATACTCAGCTCAAGCCATCATTGACTCGGGTGGGCCCTACAGCGGGCATCTCCAAGAGGTGAAGGAAACATGCCTAAGCATCATGA
GTGAGGCATGTGATGTGACCAAGCTTGATGACCCTGCCACGCAGGAATGGCTTTCTCGCATGTGGGATAGGGTGGACATGCTGACTTGGCGCAATACG
TCTGTTCACCAGGCGTCTCGCACCTTGGACGACAGATTTAAGTTTCTCCCGAAGATGATACTTGAAACACCGCCGCCCTACCCGTGTGGGTTCGTGAT
GATGCCTCGCACACCTGCACCCTCCGTGGGTGCGGAGAGCGACCTCACTATTGGCTCAGTCGCTACTGAGGGCGTTCCACGCATCTTCGGGAAAGTAA
ATGATGTCTGCAAGATGATCGACCAGAGACCCTTGGTACTCTTTGAAAATGAGCTGGCAGATGACCAACCTGCCAGAGATCCTCGGACATCATCGCAG
AGGTTTGACGGGAGCACACCAGCTCCGCCCGCAGGCACGGATGGCACCGGTTTGGCTTCGGGCCCTGGAGTGAGAGAAGTGGATTCATGTGAGGCGAG
CTCAACCGAGAAAAATGAACAGCCCTTCGTGTTGAACGGCGGCGCCAGCACACAGGCGTCAACGTTTACCAATTTGCCGCCTCCAGGCGGTATAGATG
CGGGCGGGAGTGGGCCGTTACAAACGGTGCGAAAGAAGGCTGAACGGTTCTTTGACCTACTAAGCCGTCAGGTTTTTAATCTCGTCTCCCATCTCCCT
GTTTTCTTCTCACGCCTTTTCAAACCTGGCGGTGACTATTCTCCGGGTGATTGGGGTTTTGCAGCTTTTACTTTATTGTGCCTCTTTTTGTGTTACAG
TTACCCGGCCTTTGGTGCTGTTCCCCTCTTGGGTGTATTTTCTGGGTCTTCTCGGCGTGTTCGAATGGGGGTTTTTGGCTGCTGGTTGGCTTTTGCTG
TTAGTCTGTTCAAACCTGTGTCCGACCCAGTCGGCGCTGCTTGTGAATTTGATTCGCCAGAGTGTAGAAACATCCTTCATTCTTTTGAGCTTCTCAAA
CCTTGGGACCCTGTTCGCGGCCTTGTTGTGGGCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTTGGCAGGTTATTGGGCGGGGCACGCCACATCTGGCACTT
TTTGCTTAGGTTTGGCATTGTTGCAGATTGTATCTTGGCTGGAGCTTATGTGCTTTCTCAAGGCAGGTGTAAAAAGTGCTGGGGATCTTGTATAAGAA
CTGCTCCTAATGAGGTCGCCTTTAACGTGTTTCCTTTTACACGTGCGACCAGGTCGTCACTTATCGACCTGTGCAATCGGTTTTGCGCGCCAAAAGGT
ATGGACCCCATTTTCCTCGCCACTGGGTGGCGCGGGTGCTGGACCGGCCGAAGCCCCATTGAGCAACCCTCTGAAAAACCCATCGCGTTTGCCCAGTT
GGATGAAAAAAAGATTACGGCTAGGACTGTGGTCGCCCAGCCCTATGACCCCAACCAAGCTGTAAAGTGCTTGCGGGTATTGCAGGCGGGCGGGGTGA
TGGTGGCTGAGGCAGTCCCAAAAGTGGTCAAAGTTTCTGCTGTTCCATTCCGAGCCCCCTTCTTTCCCACCGGAGTGAAAGTTGATCCTGAATGCAGG
ATTGTGGTTGACCCCGACACTTTCACTGCAGCCCTCCGATCTGGCTACTCCACCACAAACCTCGTCCTTGGTGTGGGGGACTTTGCCCAGCTGAATGG
ATTAAAAATCAGGCAAATTTCCAAGCCTTCAGGGGGAGGTCCACACCTCATGGCTGCCCTGCATGTTGCTTGCTCTATGGCTCTGCACATGCTTGTTG
GGATTTATGTGACTGCTGTGGGTTCTTGCGGCACCGGCACTAACGATCCGTGGTGCGCCAACCCGTTTGCCGTCCCTGGCTACGGACCTGGCTCTCTC
TGCACGTCCAGATTGTGCATCTCCCAACATGGCCTTACCCTACCCTTGACAGCACTTGTGGCGGGATTCGGCTTTCAGGAAATTGCCTTGGTTATTTT
GATTTTTGTTTCTATCGGAGGCATGGCTCATAGATTGAGTTGCAAGGCTGATATGCTGTGTATTTTGTTTGCAATCGCCAGCTATGTTTGGGTACCTC
TTACCTGGTTGCTTTGTGTGTTTCCTTGCTGGTTGCGCTGTTTTTCGTTGCACCCCCTCACCATCCTATGGTTGGTGTTTTTCCTGATTTCTGTAAAT
ATGCCTTCAGGAATCTTGGCCTTGGTGTTGTTGATTTCTCTCTGGCTTCTTGGTCGTTATACCAACGTTGCCGGTCTTGTCACTCCCTATGACATTCA
TCATTACACCAGTGGCCCCCGCGGTGTTGCCGCCTTGGCTACCGCACCAGATGGGACCTACTTGGCCGCTGTCCGCCGCGCCGCGTTGACTGGTCGCA
CCATGCTGTTTACCCCGTCTCAGCTCGGGTCCCTTCTTGAGGGCGCTTTCAGAACTCGAAAGCCCTCACTGAACACCGTTAATGTGGTCGGGTCCTCC
ATGGGCTCTGGCGGGGTGTTCACCATCGACGGGAAAATTAAGTGCGTAACTGCTGCACATGTCCTTACGGGTAATTCAGCTAGGGTTTCCGGGGTTGG
CTTCAATCAAATGCTTGACTTCGATGTGAAAGGAGACTTCGCCATAGCCGATTGCCCAGACTGGCAAGGGGCTGCTCCCAAGACCCAATTCTGCGAGG
AAGGATGGACTGGCCGGGCCTATTGGCTAACGTCTTCTGGTGTCGAACCCGGCGTCATTGGAAAAGGATTCGCCTTCTGCTTCACCGCGTGCGGCGAT
TCCGGATCCCCAGTAATCACCGAGGCCGGCGAGCTTATCGGCGTTCACACGGGGTCAAATAAACAAGGAGGAGGCATCGTCACGCGCCCCTCAGGCCA
GTTTTGTAGTGTGGCACCCGTCAAATTAAGCGAACTAAGTGAATTCTTTGCAGGGCCTAAGGTCCCGCTCGGTGATGTGAAAGTTGGCAGCCACATAA
TTGAAGACGTAGGCGAGGTGCCTTCAGATCTTTGCGCCTTGCTTGCTGCCAAACCTGAACTGGAAGGAGGCCTCTCCACCGTTCAACTTCTGTGTGTG
TTTTTCCTCCTGTGGAGAATGATGGGACATGCCTGGACGCCCTTGGTTGCCGTAGGGTTTTTTATCTTGAATGAGGTCCTCCCAGCTGTCCTGGTCCG
GAGTGTTTTCTCCTTTGGAATGTTTGTGCTATCCTGGCTCACACCATGGTCTGCGCAAGTTCTGATGATCAGGCTTCTAACAGCAGCTCTTAACAGGA
ATAGATGGTCACTTGCCTTTTACAGCCTCGGTGCAATGACTGGTTTTGTCGCAGATCTCGCGGCTACTCAGGGGTATCCGTTGCAGGCAGTGATGAGT
TTGAGCACTTATGCATTCCTGCCTCGGATAATGGTTGTGACTTCACCAGTCCCAGTGGTTGCGTGTGGTGTTGTGCACCTACTTGCCATCATTTTGTA
CTTGTTTAAGTACCGCTGCCTGCACAACATCCTTGTTGGCGATGGAGTGTTCTCTGCGGCTTTCTTCCTGCGATATTTTGCCGAGGGAAAGTTGAGGG
AGGGGGTGTCGCAATCCTGCGGGATGAATCATGAGTCACTTACCGGTGCCCTCGCTATGAGACTCAATGACGAGGACTTGGATTTCCTCACGAAATGG
ACTGATTTCAAGTGCTTTGTTTCTGCGTCCAACATGAGAAATGCTGCGGGCCAATTCATCGAGGCTGCCTATGCTAAAGCACTTAGAGTAGAACTTGC
CCAGTTGGTGCAGGTTGATAAGGTTCGGGGTACTTTGGCCAAACTTGAAGCTTTTGCCGACACCGTGGCACCCCAACTCTCGCCCGGTGACATTGTTG
TCGCTCTTGGCCATACGCCTGTTGGCAGTATCTTCGACCTGAAGGTTGGTAACACCAAGCACACTCTCCAAGCCATCGAGACCAGGGTCCTTGCTGGG
TCCAAAATGACCGTGGCGCGCGTCGTCGATCCGACCCCCACGCCCCCACCCGCACCCGTGCCCATCCCCCTCCCACCGAAGGTTTTGGAGAACGGTCC
AAACGCTTGGGGGGATGAAGACCGTTTGAATAAAAAGAGGAGGCGCAGGATGGAAGCCCTCGGCATCTATGTTATGGGCGGGAAAAAGTACCAGAAAT
TTTGGGACAAGAATTCCGGTGACGTGTTTTATGAGGAGGTCCATAACAACACAGATGAGTGGGAGTGCCTCAGAGTTGGCGACCCTGCCGACTTTGAC
CCTGAGAAGGGAACTTTGTGTGGGCATGTCACCATTGAAGATAGGGCTTACCATGTTTACACCTCCCCATCTGGTAAGAAATTCCTAGTCCCCGTCAA
CCCAGAGAACGGAAGAGTTCAATGGGAGGCTGCAAAGCTTTCCGTTGAGCAGGCCCTTGGTATGATGAACGTCGACGGCGAGCTGACTGCCAAGGAAC
TGGAGAAACTGAAAAGAATAATTGACAAACTCCAGGGCCTGACTAAGGAGCAGTGTTTAAACTGCTAGCCGCTAGCGGCTTGACCCGCTGTGGTCGCG
GCGGCTTGGTTGTTACTGAGACAGCGGTAAAAATAGTCAAATTTCACAAGCGGACCTTCACCTTGGGACCTGTAAATTTAAAAGTGGCTAGTGAGGTT
GAGCTAAAAGACGCGGTCGAGCACAACCAACACCCGGTTGCTAGACCAGTCGATGGTGGTGTTGTGCTCCTGCGTTCCGCGGTTCCCTCGCTTATAGA
TGTCCTGATCTCCGGTGCTGATGCATCTCCCAAATTACTTGCCCATCACGGACCGGGCAACACCGGGATCGATGGCACGCTCTGGGATTTTGAGTCCG
AAGCCACTAAAGAGGAAGTCGCACTCAGCGCGCAAATAATACAGGCTTGTGACATTAGGCGCGGCGACGCACCTGAAATTGGTCTCCCTTACAAGCTG
TACCCTATTAGGGGCAACCCTGAGCGGGTAAAGGGAGTTTTACGGAATACAAGGTTTGGAGACATACCTTATAAAACCCCCAGTGACACTGGAAGCCC
AGTGCACGCGGCTGCCTGCCTCACGCCTAACACCACTCCGGTGACTGACGGGCGCTCCGTCTTGGCCACGACCATGCCCTCCGGGTTTGAGTTGTATG
TACCGACCATACCAGCGTCTGTCCTTGACTATCTTGATTCTAGGCCCGACTGCCCTAAACAGTTGACGGAGCACGGCTGTGAAGATGCCGCACTGAAA
GACCTCTCCAAGTATGACTTGTCCACCCAAGGCTTTGTTTTGCCTGGAGTTCTTCGCCTTGTGCGGAAGTACCTGTTTGCCCATGTGGGCAAATGCCC
GCCCGTTCATCGGCCTTCCACTTACCCTGCCAAGAATTCTATGGCTGGAATAAATGGGAACAGGTTTCCAACCAAGGACATCCAGAGCGTCCCTGAAA
TCGACGTTCTGTGCGCACAGGCTGTGCGAGAAAATTGGCAAACTGTTACCCCTTGTACCCTCAAGAAACAGTATTGTGGGAAGAAGAAGACTAGGACC
ATACTCGGCACCAATAACTTTATAGCGCTGGCTCACCGTGCAGCGTTGAGTGGTGTCACCCAGGGCTTCATGAAAAAGGCGTTTAACTCGCCTATCGC
CCTCGGGAAAAACAAATTTAAGGAGCTACAGACTCCGGTCCTAGGCAGGTGCCTTGAAGCTGATCTTGCATCCTGCGATCGATCTACACCTGCAATTG
TCCGCTGGTTTGCCGCCAATCTTCTTTATGAGCTTGCCTGTGCTGAAGAGCATCTACCGTCGTATGTGCTGAACTGCTGTCACGACTTACTGGTCACG
CAGTCCGGTGCAGTGACTAAGAGAGGCGGCCTGTCGTCTGGCGACCCGATAACCTCTGTGTCTAATACCATTTACAGCTTGGTGATCTATGCACAGCA
CATGGTGCTTAGTTGCTTCAAAAGTGGTCACCCCCATGGCCTTCTGTTCTTACAAGACCAGCTAAAGTTTGAGGACATGCTCAAGGTTCAACCCCTAA
TCGTCTATTCGGACGACCTCGTGCTGTATGCCGAGTCTCCCACCATGCCAAACTACCATTGGTGGGTTGAACATCTGAATTTGATGCTGGGGTTTCAG
ACGGACCCAAAGAAAACAGCCATAACAGACTCGCCATCATTTCTAGGCTGTAGAATAATAAATGGGCGCCAGCTAGTCCCCAACCGTGACAGGATTCT
CGCGGCCCTCGCCTACCACATGAAGGCGAGTAATGTTTCTGAATACTACGCCTCAGCGGCTGCAATACTCATGGACAGCTGTGCTTGTTTGGAGTATG
ATCCTGAATGGTTTGCAGAACTTGTAGTTGGGATAGCGCAGTGCGCCCGCAAAGACGGCTACAGCTTTCCCGGCACGCCGTTCTTCATGTCCATGTGG
GAAAAACTCAGGTCCAATTATGAGGGGAAGAAGTCGAGAGTGTGCGGGTACTGCGGGGCCCCGGCCCCGTACGCTACTGCCTGTGGCCTCGACGTCTG
CATTTACCACACCCACTTCCACCAGCATTGTCCAGTCACAATCTGGTGTGGCCATCCAGCGGGTTCTGGTTCTTGTAGTGAGTGCAAATCCCCTGTAG
GGAAAGGCACAAGCCCTTTAGACGAGGTGCTGGAACAAGTCCCGTATAAGCCCCCACGGACCGTTATCATGCATGTGGAGCAGGGACTTACCCCCCTT
GACCCAGGTAGATACCAGACTCGCCGCGGATTAGTCTCTGTCAGGCGTGGAATCAGGGGAAATGAAGTTGAACTACCAGACGGTGATTATGCTAGTAC
CGCCTTGCTCCCTACCTGTAAAGAGATCAACATGGTCGCTGTCGCTTCTAATGTATTGCGCAGCAGGTTCATCATCGGTCCACCCGGTGCTGGGAAAA
CATACTGGCTCCTTCAACAGGTTCAGGATGGTGATGTTATTTACACACCAACTCACCAGACCATGCTTGACATGATTAGAGCTTTGGGGACGTGCCGG
TTCAACGTTCCGGCAGGCACAACGCTGCAATTCCCCGTCCCCTCCCGTACCGGTCCGTGGGTTCGCATTCTAGCCGGCGGTTGGTGTCCTGGCAAGAA
TTCCTTCCTGGATGAAGCAGCATATTGCAATCACCTTGATGTTTTGAGGCTTCTTAGCAAAACTACCCTCACCTGTCTAGGAGACTTCAAACAACTCC
ACCCAGTGGGTTTTGATTCTCATTGCTATGTTTTTGACATCATGCCTCAAACTCAACTGAAGACCATCTGGAGGTTTGGACAGAATATCTGTGATGCC
ATCCAGCCAGATTACAGGGACAAACTCATGTCCATGGTCAACACAACCCGTGTGACCTACGTGGAAAAACCTATCAGGTATGGGCAAGTCCTCACCCC
CTACCACAGAGATCGAGAGGACGACGCCATCACTATTGACTCCAGTCAAGGCGCCACATTCGATGTGGTTACACTGCATTTGCCCACTAAAGATTCAC
TCAACAGGCAAAGAGCCCTTGTTGCTATCACCAGGGCCAGACATGCTATCTTTGTGTATGACCCACACAGGCAGCTGCAGAGCTTGTTTGATCTTCCT
GAAAAAGGCACACCCGTTAACCTCGCAGTGCACCGCGACGGGCAGCTGATCGTGCTGGATAGAAATAACAAAGAATGCACGGTTGCTCAAGCTCTAGG
CAACGGGGATAAATTTAGGGCCACAGACAAGCGTGTTGTAGATTCTCTCCGCGCTATTTGTGCTGACCTAGAAGGGTCGAGCTCTCCGCTCCCCAAGG
TCGCACACAACTTGGGATTTTATTTCTCACCTGATTTAACACAGTTTGCCAAACTCCCAGCAGAACTTGCACCTCACTGGCCTGTGGTGACAACCCAG
AACAATGAAAATTGGCCAGATCGGCTGGTTGCCAGCCTTCGTCCTATCCATGAGTATAGCCGCGCGTGCATCGGTGCCGGCTATATGGTTGGCCCCTC
GGTGTTTCTAGGCACCCCCGGGGTCGTGTCATACTATCTCACAAAATTTGTTAAGGGCGAGGCTCAAGTGCTTCCGAAGACGGTCTTCAGCACCGGCC
GAATTGAGGTAGATTGCCGGGAATATCTTGACGATCGGGAGCGAGAAGTTGCTGCGTCCCTCCCACATGCCTTCATTGGTGACGTCAAAGGCACTACC
GTTGGAGGATGTCATCATGTCACCTCCAGATACCTCCCGCGCTTCCTCCCCAAGGAATCAGTTGCTGTGGTCGGGGTTTCAAGTCCCGGAAAAGCCGC
GAAAGCATTGTGCACACTGACAGATGTGTACCTCCCAGACCTTGAAGCCTATCTCCACCCGGAGACCCAGTCCAAGTGCTGGAAAATGATGTTGGACT
TCAAGGAAGTTCGACTAATGGTCTGGAAAGACAAAACAGCCTATTTCCAACTTGAAGGACGCTATTTCACCTGGTATCAGCTTGCTAGCTATGCCTCG
TACATCCGTGTTCCTGTCAACTCTACTGTGTACTTGGACCCCTGCATGGGCCCCGCCCTTTGCAACAGGAGAGTCGTTGGGTCCACTCACTGGGGGGC
TGACCTCGCAGTCACCCCTTATGATTACGGCGCTAAAATTATCCTGTCTAGCGCGTACCATGGTGAAATGCCCCCCGGATACAAAATTCTGGCGTGCG
CGGAATTCTCGTTGGATGACCCAGTCAAGTACAAACATACTTGGGGGTTTGAATCGGATACAGCGTATCTGTATGAGTTCACCGGAAACGGTGAGGAT
TGGGAGGATTACAATGATGCGTTTCGTGCGCGCCAGGAAGGGAAAATTTATAAGGCCACTGCCACCAGCATGAAGTTTTATTTTCCCCCGGGCCCTGT
CATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGATTAATTAATTTAAAAGGCGCGCCAATGAAATGGGGTCCATGCAAAGCCTTTTTGACAAAATTGGTCAACT
TTTTGTGGATGCTTTCACGGAATTCTTGGTGTCCATTGTTGATATCATCATATTTTTGGCCATTTTGTTTGGCTTCACCGTCGCCGGTTGGCTGGTGG
TCTTTTGCATCAGATTGGTTTGCTCCGCGATACTCCGTGCACGCCCTGCCTTTCACTCTGAGCAGTTACAGAAGATCCTATGAGGCCTTTCTTTCCCT
GTGTCAGGTGGACATTCCCACCTGGGGAATCAAACATCCTCTGGGGGTGCTTTGGCACCATAAGGTGTCAACCCTGATTGATGAAATGGTGTCGCGTC
GAATGTACCGCATCATGGAAAAAGCAGGACAGGCTGCCTGGAAACAGGTGGTGAGCGAGGCCACGCTGTCTCGCATTAGTAGTTTGGATGTGGTGGCT
CATTTTCAACATCTTGCCGCCGTTGAAGCCGAGACCTGTAAATATTTGGCCTCTCGGCTACCCATGCTACACAACCTGCGCATGACGGGGTCAAATGT
AACCATAGTATATAATGGTACTTTGAATCAGGTGTTTGCCATTTTCCCGACCCCTGGTTCCCGGCCAAAGCTTCATGATTTTCAGCAATGGCTGATAG
CTGTGCATTCGTCCATATTTTCCTCTGTTGCAGCTTCTTGTACTCTGTTTGTTGTACTGTGGTTGCGGGTCCCAATGCTACGTACTGTTTTTGGTTTC
CGCTGGTTAGGGGCAATTTTTCCTTCGAGCTCTTGGTGAATTACACGGTGTGCCCACCTTGCCTCACCCGGCAAGCAGCCGCACAGCGCTACGAACCT
GGCAAGGCTTTTTGGTGCAGAATTGGGTACGATCGATGTGAGGAGGACGATCACGACGAGCTAGGGTTCGTGATACCGTCTGGCCTCTCCAGCGAAGG
CCACTTGACTAGTGTTTACGCCTGGCTGGCGTTCCTGTCCTTCAGCTACACGGCCCAGTTCCATCCCGAGATATTTGGGATAGGGAATGTGAGTCAAG
TTTATGTTGACATCAAGCACCAATTCATCTGCGCTGTTCACGACGGGGATAACGCCACCTTGCCTCGCCATGACAATATTTCAGCCGTATTTCAGACC
TACTACCAACACCAGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTGGAATGGCTGCGTCCTTTCTTTTCCTCTTGGTTGGTTTTAAATGTTTCGTGGTTTCT
CAGGCGTTCGCCTGCAAGCCATGTTTCAGTTCGAGTCTTTCGGACATCAAAACCAACACCACCGCAGCATCAGACTTCGTTGTCCTCCAGGACATCAG
CTGCCTTAGGCATGGCGACTCGTCCTCTCCGACGATTCGCAAAATTTCTCAGTGCCGCACGGCGATAGGGACGCCCGTGTACATCACCATCACTGCCA
ATGTCACAGATGAAAATTATCTACATTCTTCTGATCTCCTCATGCTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCCGAGATGAGTGAAAAGGGATTCAAAGTG
GTGTTTGGCAATGTGTCAGGCACTGTGGCTGTGTGCGTCAACTTTACCAGCTACGTCCAACATGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCTTAGTGGTCGA
TCATGTGCGACTGCTTCATTTCATGACACCTGAGACCATGAGGTGGGCAACCGTTTTAGCCTGTCTTTTTGCCATCCTACTGGCAATTTGAATGTTCA
AGTATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAG
CAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGTTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGG
AGACTTTTGTCATCTTCCCCGTGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTTTGGCCACTGTGTCT
ACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAA
CTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGA
AAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAA
CGATGGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCACAGAAGGTGCTTTTGGCGTTTTCCATTACCTACACGCCAGTGATGATATAT
GCTCTAAAGGTAAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCTTTTGATCTTTCTGAATTGTGCTTTTACCTTCGGGTACATGACATTCGTGCACTT
TGAGAGCACAAATAGGGTCGCGCTCACTATGGGAGCAGTAGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCA
GATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAAC
CACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAA
GCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAA
ATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCT
AGCGACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCGATCCAGACTGCCTTCAATCAGGGCGCTGGAACTT
GTGCCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCGACGCAACATACTGTGCGTCTGATCCGCGCCACAGCATCACCCTCA
GCATGATGGGCTGGCATTCTTTGGCACCTCAGTGTTAGAATTGGGAGAATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACACTGTGCCTCTAAGTCACCTATTC
AATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTAAAGTTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGTAATTAAAAAAAAAAAA
權利要求
1、豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株，利用反向遺傳操作和基因重組技術將豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)經典毒PTK株的GP2基因的後半部分及GP3～GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列全部刪除後，替換成中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因，重組成一個同時含有豬繁殖與呼吸症候群經典株和變異株基因的嵌合重組疫苗株(PC株)。
2、根據權利要求1所述的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株，其特徵在於所述的中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因為中國高致病性豬藍耳病變異毒株GP2基因的後半部分、GP3基因、GP4基因、GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列，且插入的目的核酸序列總長度為2421bp，主要編碼PRRSV的結構蛋白以及3』非編碼區。
3、根據權利要求1或2所述的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株來生產活疫苗的方法，按以下步驟進行
(1)制苗用細胞的傳代與培養將Marc145或MA104細胞系經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成單層時，備用；
(2)細胞毒種的繁殖將PC株病毒液按1/10的體積量接入已經生長成良好細胞單層的細胞瓶，吸附1小時後，加入細胞維持液於細胞系單層，繼續培養，當70-80％細胞出現病變後收穫，收穫的毒液凍融2-3次後置-15℃以下保存，取少量做半成品檢驗；
(3)配苗、分裝及凍幹將檢驗合格的病毒培養液，與常規穩定劑按1∶1的體積比在一容器內混合，充分搖勻，定量分裝；每頭份含細胞毒液不少於105.0TCID50，分裝後進行冷凍乾燥即得成品。
4、根據權利要求1或2所述的豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株PC株的轉基因微生物的檢測方法，採用RT-PCR方法檢測。
全文摘要
本發明涉及豬繁殖與呼吸症候群病毒嵌合重組疫苗株及其生產活疫苗的方法，利用反向遺傳操作和基因重組技術將豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)經典毒PTK株的GP2基因的後半部分及GP3～GP5基因、M蛋白基因、N蛋白基因及其間隔序列和3』非編碼區的所有核苷酸序列全部刪除後，替換成中國高致病豬藍耳病變異毒株的對應基因，重組成一個同時含有豬繁殖與呼吸症候群經典株和變異株基因的嵌合重組疫苗株(PC株)，並利用嵌合重組疫苗PC株生產活疫苗具有毒力低，回傳豬5代毒力不返強，遺傳性能穩定；具有良好的免疫原性，可同時保護豬藍耳病經典毒株和高致病性變異毒株的感染。
文檔編號C12N7/01GK101603035SQ200910062139
公開日2009年12月16日 申請日期2009年5月18日 優先權日2009年5月18日
發明者寧宜寶, 張學賢, 漆世華, 沈青春, 溫文生, 劉業兵, 雷 楊, 韓明遠, 舒銀輝, 張志學, 高和義 申請人:中國獸醫藥品監察所, 美國Protatek國際股份有限公司, 武漢中博生化有限公司