一種測定奶製品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法與流程
2023-10-29 22:01:22
本發明涉及分析檢測領域，具體涉及到一種測定奶製品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法。
背景技術：
三聚氰胺(含氮量66％)與蛋白質(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，因此被一些造假者利用，添加在奶製品中以造成產品中蛋白質含量較高的假象。然而，三聚氰胺能導致腎臟中的不溶性三聚氰胺—三聚氰酸結合晶體的形成，從而導致腎功能衰竭。2008年9月，中國發生了駭人聽聞的含三聚氰胺的嬰幼兒問題奶粉事件，被三聚氰胺汙染的奶粉導致上萬的嬰幼兒患腎結石病住院，甚至有數名死亡。為了確保食品供應三聚氰胺不受摻假，一些國家和組織已採取積極措施，例如增加進口乳源配料和成品的取樣和測試。2008年11月，美國FDA將嬰幼兒配方奶粉中的三聚氰胺的限量值設定在1mg/kg。2008年12月，世衛組織專家會議規定了嬰兒配方奶粉中的三聚氰胺含量為1.0mg/kg。與此同時，中國發布了測定原料乳與乳製品中三聚氰胺的三項國家標準方法：高效液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法、氣相色譜-質譜/質譜法，檢出限分別為2mg/kg、0.01mg/kg和0.05mg/kg[0.005mg/kg]，及一項原料奶和液態奶中三聚氰胺的快速測定的國家標準方法,檢出限為0.05mg/kg。2011年，我國公布三聚氰胺在食品中的限量值規定：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1mg/kg，其他普通食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg(衛生部公告2011年第10號)。2012年7月，食品法典委員會第35屆會議審查制定了嬰兒配方奶粉中的三聚氰胺限量為0.15mg/kg。2013年1月，享譽全球的紐西蘭牛奶及奶製品被檢測出含有有毒物質二聚氰胺，乳製品的安全再次引發了消費者的擔憂。本次紐西蘭奶粉二聚氰胺事件，據悉為由於少數牧場使用了含二聚氰胺的化肥，促進牧草的生長，同時牛、羊吃這種草可以減少二氧化氮的排放，減少硝酸鹽從土壤中滲入河水和溪流，起到保護環境的效果。由於牧草含有二聚氰胺，導致牛奶中二聚氰胺的殘留。目前，與二聚氰胺相關的現行標準有兩條：HG/T3264-1999《工業雙氰胺》和CNS14682-2002《肥料檢驗法(雙氰胺態氮之測定)》。但是還沒有對食品或者奶製品中的雙氰胺的檢測的相關標準，僅有一些關於奶製品中的雙氰胺的測定方法，如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)的研究報導。以上提到的用於三聚氰胺和二聚氰胺檢測的方法均使用了色譜技術或色譜-質譜聯用技術，需要昂貴的、特殊的儀器，不能適用於一般實驗室及現場的快速、簡便、廉價檢測的需求。此外，由於奶製品中存在複雜的基質，上述方法通常耗時或需要用有機溶劑對樣品進行預處理，如萃取。紫外-可見吸收光譜法是一種簡便、快速、準確並廣泛應用於實驗室和工廠的定性和定量分析方法。紫外可見吸收光譜測定的是溶液樣品，而不是粉末樣品。因此，可以獲得更準確和重複性更高的結果。但是，如果將紫外-可見吸收光譜法直接用於測定像奶製品這樣的複雜樣品，它會受到來自基質的嚴重幹擾。因此，以往常需要費時、繁重的化學分離。化學計量學可以使光譜技術在樣品不經過複雜的化學分離的條件下進行分析，它已被廣泛地用於很多領域。但到目前為止，利用紫外-可見吸收光譜結合化學計量學同時測定三聚氰胺和二聚氰胺的含量還未見報導。
技術實現要素：
本發明一種測定奶製品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法，首先利用紫外可見分光光度計採集校正集奶樣品溶液的原始光譜圖，使用一些常見的光譜預處理方法對原始光譜進行預處理，再通過一些化學計量學方法進行模型回歸，最後通過模型預測未知奶樣品中的三聚氰胺和二聚氰胺含量。在此基礎上，針對現有對三聚氰胺和二聚氰胺的檢測方法存在的耗時長、操作繁瑣、成本昂貴等問題，結合在鹽酸中使用矽膠沉澱離心除去樣品基質的簡單前處理，建立了一種簡單、快速、靈敏、準確檢測奶製品中三聚氰胺和二聚氰胺的方法。在沒有其他特別說明的情況下，對本申請相關文件中出現的名詞做出如下約定：化學計量學方法：化學計量學是一門應用數學、統計學和計算機技術的原理和方法來處理化學數據的學問，它是分析化學的三級學科，化學計量學可以優化化學量測過程，並從化學量測數據中最大限度地提取有用的化學信息，與其他以理論計算的化學分支如量子化學不同的是，化學計量學是以化學實驗數據為基礎的學科，其一切理論和方法都是建立在試驗數據的基礎上的。具體到本申請中，涉及到偏最小二乘法、支持向量機法和最小二乘支持向量機法。校正集：化學計量學中用於模型建立的數據集。預測集：化學計量學中用於模型預測的數據集。化學參考值：真實含量的參考值。加標量：即為待測組分的標準添加量。測定三聚氰胺和雙氰胺含量的常規方法：GB/T22388–2008中的HPLC法用於樣品中三聚氰胺的測定，H點標準添加法用於樣品中雙氰胺的測定。本發明的方法由下列技術方案組成：待測樣品經過在酸性條件下，優選氫離子濃度1.5mol/L的酸性環境，採用薄層色譜矽膠沉澱，離心除去蛋白質等基質沉澱物，得到上清液,在一定的酸度下用紫外分光光度計採集樣品的原始光譜,使用常見的光譜預處理方法(Savitzky-Golay三片段零多項式平滑(Smoothing-SG)、面積常態化法(Nor)、標準正態變換(SNV)、多元散射校正(MSC)、一階導數Savitzky-Golay變化(1d+SG)和二階導數Gap-Segment變化(2d+GS))對原始光譜進行適當的預處理，再通過化學計量學方法(偏最小二乘法、支持向量機法和最小二乘支持向量機法等)對校正集樣品建立紫外吸收光譜與化學參考值相關關係的預測模型，最後通過模型預測未知樣品中的三聚氰胺和二聚氰胺含量。該方法的具體實施步驟如下：0.72g奶粉和28mL蒸餾水加入到50mL的離心管中，在超聲波水浴中超聲處理5min，使其充分溶解(或用22mL蒸餾水稀釋6mL的液態奶)，然後加入12mL鹽酸(5mol/L)，渦流混合5min，最後再加入2.4g矽膠。將該混合物渦流混合5min，然後在4000rpm下離心3min，得奶樣上清液。取所得上清液適量，加入不同比例的三聚氰胺和二聚氰胺的標準溶液，並用蒸餾水將該混合物稀釋至5ml。以水為參比，1cm光程的比色皿在紫外-可見分光光度計掃描記錄樣品的紫外吸收光譜(200～290nm)。使用一些常見的光譜預處理方法(Savitzky-Golay三片段零多項式平滑(Smoothing-SG)、面積常態化法(Nor)、標準正態變換(SNV)、多元散射校正(MSC)、一階導數Savitzky-Golay變化(1d+SG)和二階導數Gap-Segment變化(2d+GS))對原始光譜進行預處理，再通過一些化學計量學方法(偏最小二乘法、支持向量機法和最小二乘支持向量機法)進行模型回歸，最後通過模型預測樣品中的三聚氰胺和二聚氰胺含量。本發明一種測定奶製品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法的有益效果是：該測定方法簡便、快速、準確，便於推廣應用。本方法在具體使用過程中避免了使用有機試劑，有利於環境保護。附圖說明圖1奶粉1#(a)和液態奶4#(b)的288個樣品的原始光譜圖具體實施例子1、奶粉樣品①樣品處理0.72g奶粉和28mL蒸餾水加入到50mL的離心管中，在超聲波水浴中超聲處理5min，使其充分溶解，然後加入12mL鹽酸(5mol/L)，渦流混合5min，最後再加入2.4g矽膠。將該混合物渦流混合5min，然後在4000rpm下離心3min，得奶樣上清液。取所得到的上清液適量，加入不同比例的三聚氰胺(0.1～10μg/ml)和二聚氰胺(10～0.1μg/ml)的標準溶液，並用蒸餾水將該混合物稀釋至5ml，對每種奶粉總計配製288個樣品溶液(24個濃度，每個濃度平行12份)。②光譜採集以水為參比，1cm光程的比色皿，在200～290nm波長範圍內，用紫外-可見分光光度計測量樣品的紫外吸收光譜。③化學計量學建模採用①中的方法對奶粉樣品1#、2#和3#進行原始光譜採集。使用一些常見的光譜預處理方法(Savitzky-Golay三片段零多項式平滑(Smoothing-SG)、面積常態化法(Nor)、標準正態變換(SNV)、多元散射校正(MSC)、一階導數Savitzky-Golay變化(1d+SG)和二階導數Gap-Segment變化(2d+GS))對原始光譜進行預處理，根據均一化原理隨機的將樣品分為校正集和預測集，再通過一些化學計量學方法偏最小二乘法(PLS)、支持向量機法(SVM)和最小二乘支持向量機法(LS-SVM)對校正集的數據進行模型回歸，最後通過模型預測校正集和預測集中樣品的三聚氰胺和二聚氰胺含量。④方法檢測限對奶粉樣品而言，在最佳的算法LS-SVM下：三聚氰胺的相對標準偏差RSD＝8.53％，檢測限LOD＝14.2mg/kg；二聚氰胺的RSD＝5.31％，LOD＝8.84mg/kg。2、液態奶樣品①樣品處理用22mL蒸餾水和6mL的液態奶加入到50mL的離心管中，在超聲波水浴中超聲處理5min，使其充分溶解，然後加入12mL鹽酸(5mol/L)，渦流混合5min，最後再加入2.4g矽膠。將該混合物渦流混合5min，然後在4000rpm下離心3min，得奶樣上清液。取所得到的上清液適量，加入不同比例的三聚氰胺(0.1～10μg/ml)和二聚氰胺(10～0.1μg/ml)的標準溶液，並用蒸餾水將該混合物稀釋至5ml，對每種液態奶總計配製288個樣品溶液(24個濃度，每個濃度平行12份)。②光譜採集以水為參比，1cm光程的比色皿，在200～290nm波長範圍內，用紫外-可見分光光度計測量樣品的紫外吸收光譜。③化學計量學建模採用①中的方法對奶粉樣品1#、2#和3#進行原始光譜採集。使用一些常見的光譜預處理方法(Savitzky-Golay三片段零多項式平滑(Smoothing-SG)、面積常態化法(Nor)、標準正態變換(SNV)、多元散射校正(MSC)、一階導數Savitzky-Golay變化(1d+SG)和二階導數Gap-Segment變化(2d+GS))對原始光譜進行預處理，根據均一化原理隨機的將樣品分為校正集和預測集，再通過一些化學計量學方法偏最小二乘法(PLS)、支持向量機法(SVM)和最小二乘支持向量機法(LS-SVM)對校正集的數據進行模型回歸，最後通過模型預測校正集和預測集中樣品的三聚氰胺和二聚氰胺含量。④方法檢測限對液態奶樣品而言，在最佳算法SVM下：三聚氰胺的相對標準偏差RSD＝4.97％，檢測限LOD＝9.94mg/kg；雙氰胺的RSD＝3.46％，LOD＝6.91mg/kg。表1PLS，SVM和LS-SVM三種方法測定三聚氰胺的結果表2PLS，SVM和LS-SVM三種方法測定二聚氰胺的結果