通過聚合酶鏈式反應檢測血吸蟲病的方法和試劑盒的製作方法
2023-10-21 03:37:02
專利名稱：通過聚合酶鏈式反應檢測血吸蟲病的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過聚合酶鏈式反應(PCR)在人樣品中診斷血吸蟲病的方法和試劑盒。該方法以寄生蟲DNA的檢測為基礎，在低感染強度的情況中尤其有用，而寄生蟲學大便檢驗(Kato-Katz)在這種情況中展示低靈敏度。
背景技術：
血吸蟲病是由感染血吸蟲屬(Schistosoma)寄生蟲引起的疾病，主要的感染物種是孟氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)、和埃及血吸蟲(Schistosoma haematobiom)。這種疾病的記錄已經延續了4000年，而且仍然構成公共健康的重要問題，在不發達國家中受影響的人數超過2億。孟氏血吸蟲流行於54個國家和南美洲、加勒比海、非洲、和東地中海地區。
這些蠕蟲(兩性吸蟲)通過尾蚴(幼蟲期)穿透皮膚感染人類，尾蚴是由不同物種的軟體動物(中間宿主)排洩到水中的。遷移穿過皮膚後，孟氏血吸蟲的幼蟲橫貫肺到達肝門靜脈系，然後在胃腸道靜脈和血管叢中生存，在那裡成熟和交配，隨後雌蟲在靜脈血管中每天產下大約300枚卵。
宿主對進入組織的寄生蟲卵的免疫反應在疾病傳播中佔有重要地位。在有些情況中，它發展成急性臨床形式，具有強烈的血毒症表現；而在大多數受害者中，是使人虛弱的慢性疾病，有可能具有嚴重的且常常是致命的併發症。
在用於控制感染的措施中，治療被感染者、控制軟體動物、改進生活條件、和對危險人群的鑑定及早期治療經證明是最持續，但是絕非完全令人滿意。70年代後，隨著可大規模使用的藥物的出現，特異性治療開始在控制該疾病的所有計劃中起到至關緊要的作用。
診斷方法構成了控制地方流行病計劃的原始手段。非常需要發展比現有技術更有效的技術。
可以通過顯微鏡確認糞便或尿中寄生蟲卵的存在來進行感染的診斷，這取決於物種。Kato-Katz法(N.Katz、A.Chaves、J.Pellegrino，1972，用於孟氏血吸蟲定量大便厚塗片技術的簡易裝置，Rev.Inst.Med.Trop. Paulo.14337-340)這一技術提供了效率、成本、和操作的最好條件；(WHO，1994，血吸蟲病的控制，技術報告系列(TechnicalReport Series)830，日內瓦，第86頁)。然而，當大便中蟲卵數量較少(諸如低流行和低感染強度的條件)時，還有當必須監測治療時，單一糞便樣品檢驗的靈敏度降低，從而必須檢驗較大數量的糞便。即時如此，有些受害者可能沒有得到診斷，也就不會接受治療。
血清學診斷構成寄生蟲學檢驗的另一方案，是除後者之外最為廣泛應用的方法。通過這種方法，通過諸如間接免疫螢光反應和ELISA(酶聯免疫吸收測定法)等技術檢測由感染孟氏血吸蟲產生的抗體。然而，這種技術也有缺點，即不能區分現時感染(active infection)和過時感染(past infection)。因此，在不存在現時感染時針對孟氏血吸蟲抗體的低特異性可以解釋為與其它寄生蟲的交叉反應性(R.Corr a-Oliveira、L.M.S.Dusse、I.R.C.Viana、D.G.Colley、O.S.Carvalho、G.Gazzinelli，1988，針對血吸蟲抗原的人抗體應答，Am J Trop Med Hyg38348-355)、單性感染的存在、與其它尾蚴的接觸、母體抗體的轉移、和先前成功治療後抗體的持續存在。
孟氏血吸蟲的另一種診斷方案是檢測由寄生蟲釋放的抗原物質，從而能夠區分過時感染和現時感染，並消除抗體診斷的非特異性問題。然而，尋找循環抗原存在其它缺點，諸如對輕微感染的低靈敏度、高成本、難以操作、和對單克隆抗體生成的依賴(N.DE Jonge、A.L.T.Rabello、F.W.Krijger、P.G.Kremsner、R.S.Rocha、N.Katz、和A.M.Deelder，1991，血吸蟲循環陽性和陰性抗原在來自巴西的血吸蟲病患者血清中的水平，Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.85756-759)。
隨著聚合酶鏈式反應(PCR)的出現，有可能擴增致病生物體的DNA，從而能夠由最初的微小數量獲得足以達到檢測點的巨大數量。因此，PCR已經作為有效的方法用於多種多樣的感染診斷中。
EP 550 883描述了使用PCR檢測糞便中是否存在原生動物G.lambliaDNA的實驗。該方法使用G.lamblia的18S RNA基因序列作為靶序列。此外，申請人設計了與G.lamblia的核糖體18S RNA靶序列區充分互補的寡核苷酸引物。
WO 94/04681涉及作為PCR引物用於檢測編碼隱孢子蟲(Cryptosporidium sp.)壁(wall)蛋白質的DNA序列以及由此作為試劑盒用於診斷該屬寄生蟲的特異寡核苷酸的開發。除上述範例以外，還可能引用WO 93/03167，它申請的是用於分離、儲存、和切割DNA的過程，能夠以適當形式提供DNA用於經特定連續過程的擴增，諸如PCR。該方法具體用於檢測由具有多聯體閉合環狀動質DNA的微生物引起的寄生蟲病，諸如T.cruzi、利什曼原蟲(Leishmania sp.)、P.falciparum、P.vivax、和P.malariae。
在關於血吸蟲的研究中，PCR已經被用於確定尾蚴的性別(R.B.Gasser、G.Morahan、和G.F.Mitchell，1991，通過聚合酶鏈式反應進行孟氏血吸蟲幼蟲期的性別辨識，分子和生化寄生蟲學(Molecularand Biochemical Parasitology)47255-258)；用於克隆和測序特異基因(P.Francis和Q.Bickl，1992，孟氏血吸蟲21.7kDa疫苗-顯性抗原基因的克隆揭示了Elf手樣基序，分子和生化寄生蟲學(Mol.Bioch.Parasitol.)50215-224；D.Kiang、A.M.Karim、P.T.LoVerde，1996，孟氏血吸蟲p50(一種親免素)編碼基因的克隆，基因(Gene)170137-140)，這是為了確定血吸蟲種品系的種群遺傳變異性(E.Dias Neto、C.P.Souza、D.Rollinson、N.Katz、和A.J.G.Simpson，1993，多態DNA的隨機擴增能夠鑑定血吸蟲屬的品系和物種，分子和生化寄生蟲學(Mol.Bioch.Parasitol.)57(1)83-88；A.J.Simpson、E.Dias Neto、T.H.Vidigal、H.B.Pena、O.S.Carvalho、和S.D.Pena，1995，血吸蟲的DNA多態性及其蝸牛宿主，Mem.Inst.Oswaldo Cruz.90(2)211-213)；以及用於開發和應用產生表達序列標籤(EST)的技術(E.DiasNeto、R.Harrop、R.Correia-Oliveira、S.D.J.Pena、R.A.Wilson、和A.J.G.Simpson，1996，血吸蟲基因組計劃RNA任意引發的PCR能夠加速表達序列標籤的生成，Mem.Inst.Oswaldo Cruz.91(5)655-657；E.Dias Neto、R.Harrop、R.Corr Oliveira、R.A.Wilson、S.D.J.Pena、和A.J.G.Simpson，1997，由通過任意引發RT-PCR產生的cDNA構建的小型文庫用於由納克量的mRNA有效產生EST的標準化文庫的候選方案，基因(Gene)186135-142)。最近，Hamburger等人(J.Hamburger、X.Yu-Xin、R.M.Ramzy、J.Jourdane、和A.Ruppel，1998，聚合酶鏈式反應用於監測水的孟氏血吸蟲感染情況的開發和評價，Am.J.Trop.Med.Hyg.59(3)468-473)開發了用於監測天然水的孟氏血吸蟲感染情況的基於PCR檢驗。
本發明中描述的引物是根據
圖1所示最初由Hamburger等人(J.Hamburger、T.Turetski、I.Kapeller、和R.Deresiewicz，1991，孟氏血吸蟲基因組中由物種特異性探針識別的高度重複DNA短序列，分子和生化寄生蟲學(Mol.Bioch.Parasitol.)4473-80)描述的孟氏血吸蟲序列設計的。在目視檢查最初序列後進行引物設計，從而避免在每種起始物內或在兩種引物間存在互補區。為了促進對降解DNA分子的擴增(糞便或體液中存在的游離DNA預計如此)，選擇引物，以使擴增短序列。同樣，對本發明所有階段嚴格標準化，以使對化學上複雜的生物學樣品(諸如糞便和血清)發揮令人滿意的功能。
至今尚未涉及PCR作為人血吸蟲病診斷方法的應用。
同樣的，尋找快速且有效、在低感染強度的情況中尤其有效的血吸蟲屬之種寄生蟲檢測方法顯然尚未成功。因此，為了達到這一目的，採用了使用與孟氏血吸蟲基因組的特異且高度重複序列互補的引物進行PCR的策略。
發明概述本發明的目的是通過PCR檢測生物學樣品中的血吸蟲屬之種(Schistosoma sp.)。
本發明的第一個實施方案涉及用於通過PCR擴增血吸蟲種DNA序列來診斷血吸蟲的方法。本發明的方法表徵為下列階段(a)收集待測樣品；(b)由階段(a)中獲得的樣品提取血吸蟲屬之種的DNA；(c)使用由SEQ ID NO1所示最初序列構建的特異引物擴增階段(b)中提取的血吸蟲DNA的某一區域；(d)通過電泳分離階段(c)的擴增產物，隨後使用適當染色方法進行檢測。
在第二個實施方案中，本發明致力於用於檢測血吸蟲的診斷試劑盒。基本的試劑盒包含進行PCR技術的所有必需試劑，即用於PCR擴增的特異引物、核苷酸、和適當緩衝液。試劑盒可以任選的包含數量足以用於擴增的Taq聚合酶、作為反應陽性對照的標準DNA、製備擴增物用於電泳的緩衝液、以及為使用者準備的方案和指導手冊。
圖的簡述圖1顯示了孟氏血吸蟲重複單元的DNA序列。粗體指示本發明所述特異引物的位置。
圖2證明了PCR檢測孟氏血吸蟲DNA的靈敏度。
圖3顯示了本發明PCR技術擴增血吸蟲多種物種DNA的能力，包括在世界上具有臨床-流行病重要性的3個物種孟氏血吸蟲、日本血吸蟲、和埃及血吸蟲。
圖4顯示了本發明PCR的特異性。
圖5比較了本發明PCR與寄生蟲學檢驗用於診斷人糞便中孟氏血吸蟲的靈敏度。
圖6顯示了通過PCR對受感染患者糞便樣品中孟氏血吸蟲DNA的檢測。
圖7顯示了通過PCR對人血清樣品中孟氏血吸蟲DNA的檢測。
發明詳述為了便於對本發明的理解，下文列出了本文中所用一些術語易於接受的定義1.引物單鏈合成寡核苷酸，常常成對用於與DNA片段互補鏈的雜交。在PCR中，DNA聚合酶使用引物/DNA模板複合物內端作為合成起始點。
2.聚合酶鏈式反應(PCR)包括若干循環的變性、與引物一起退火、和用熱穩定DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)延伸的技術，用於擴增DNA靶序列。US 4 683 195和US 4 683 202描述了用於擴增核酸的PCR方法。
不恰當選擇的引物可能產生多種非期望效果，諸如不能擴增、在多個位點擴增、形成引物二聚體等等，使得擴增反應不提供信息。
本發明的目的是如下實現的通過PCR擴增血吸蟲屬之種基因組的特異區，然後通過電泳分離擴增產物，最後進行適當染色技術使得凝膠中的DNA適當顯影。適當的染色技術包括(但不限於)銀染、放射性同位素、和聯合使用酶與底物，從而能夠檢測卻無上述非期望效果。
本發明的方法可用於檢測不具有寄生蟲而含足夠完整可經PCR擴增的細胞或DNA的任何生物學樣品中的血吸蟲屬DNA。有些樣品，諸如糞便和尿，需要進行某種處理，由此破裂寄生蟲細胞中可能包裹DNA的膜或包膜，將DNA釋放到溶液中。其它樣品，如受感染人群的血清，早已包含游離分子，因而不需要這種處理。通常可以通過使用特殊化學物質(諸如去汙劑和離液鹽)或者通過使用物理和機械方法(諸如誘導滲透壓和超聲波處理)來破裂膜。破裂細胞膜後，必須將DNA與其它細胞分子分開，這也可以通過物理化學方法來進行，諸如乙醇沉澱或使用矽基質。
一旦游離於溶液，即可以在PCR擴增後檢測樣品中的DNA。必須優選採用標準技術純化DNA，以除去可能抑制擴增反應的物質。
提取後，通過聚合酶鏈式反應選擇性擴增DNA。通過PCR，血吸蟲屬之種的基因組的特異序列選擇性拷貝了數以百萬次，從而能夠檢測寄生蟲DNA。反應是順序過程，需要至少兩種引物--與寄生蟲DNA互補的DNA短序列，它們通過酶延伸，呈現該DNA的忠實拷貝。加入大量的引物以及其它必需試劑後，可獲得數百萬拷貝的寄生蟲DNA。此處PCR所用引物是根據SEQ ID NO1和圖1所示孟氏血吸蟲基因組高度重複最初序列特別為本發明設計的。必須理解，可以構建核苷酸序列與SEQ ID NO2和SEQ IDNO3功能等同的其它引物。若相應的生物聚合物在用法或目的上起著相同功能，而本身並不相同，則這些序列稱為等同(物)。等同序列可以是變異的結果，同樣可以是序列中的任何修飾，無論是自發的還是誘導的，無論是核苷酸的替換和/或刪除和/或插入還是序列一端的延長和/或縮短。基因工程技術可以產生非天然變異。
構建的引物對中的每一種引物優選與待擴增的血吸蟲屬之種基因組特異序列側翼的不同鏈序列實質性互補。因此，每對引物中的一種引物與有義序列部分足夠互補從而能與其發生雜交，而每對引物中的另一種引物與反義的相同序列不同部分足夠互補從而能與其發生雜交。儘管引物序列沒必要反映模板的準確序列，但3』端序列與準確序列越接近，則聚合酶鏈式反應匹配階段中的連接就越好。
可以通過本領域技術人員知道的任何適當方法製備引物，包括例如克隆並消化適當序列和直接化學合成。
PCR的擴增產物是一種DNA片段或不同大小的一系列DNA片段，它們可以通過電泳分離，隨後通過適當染色技術將凝膠中的DNA適當顯影。由於PCR的高度特異性，可以根據特定大小區分擴增的寄生蟲DNA與其它擴增產物。如此，在大多數情況中，可以簡單的通過目視分析擴增產物，即根據是否存在大小符合寄生蟲的片段來確定是否存在感染。在本發明中，PCR被用於擴增並顯現孟氏血吸蟲中最初描述的特異DNA片段，以及擴增其它血吸蟲物種的特異區，由此得出結論，最初在孟氏血吸蟲中查實並在SEQ ID NO1中描述的DNA重複和特異區與所有其它血吸蟲物種是共有的。
使用表1所示特別構建用於本發明的引物，或者能夠擴增孟氏血吸蟲序列或其它血吸蟲物種同源序列的功能等同序列，通過PCR進行血吸蟲屬之種基因組特異區的擴增。
表1.用於擴增血吸蟲屬之種基因組高度重複區的PCR反應的引物
本發明的試劑盒包含能夠檢測由血吸蟲屬蠕蟲引起的任何感染的所有必需試劑。試劑盒包含表1所示針對血吸蟲種基因組特異區的特異引物或功能等同序列，此外，還提供常用於PCR技術的試劑和添加劑，如適當的核苷酸，諸如dGTP(脫氧鳥苷三磷酸)、dATP(脫氧腺苷三磷酸)、dCTP(脫氧胞苷三磷酸)、和dTTP(胸苷三磷酸)；適當的緩衝液，如10-20mM Tris-HCl/50-60mM KCl/1.5-2.0mM MgCl2/pH8.0-8.5；優選有Taq DNA聚合酶。還提供一定量的DNA作為反應陽性對照，以及包含檢驗方案和預期結果示意圖的指導手冊。
實施例本發明通過參考下列實施例詳細描述。必須理解，本發明不限於這些實施例，還包括發明功能範圍內的變更和修改。實施例1破裂孟氏血吸蟲卵由先前感染了100枚孟氏血吸蟲尾蚴的小鼠的肝臟提取蟲卵，並在0.9％鹽溶液中保存於-20℃直至使用(Pellegrino和Siqueira，1956，Rev.Bras.Malar.8589)。為了破裂蟲卵，將10μl含100,000枚蟲卵/ml的鹽溶液與90μl蒸餾水混和，並將終溶液在機械混和儀中搖動5分鐘。將包含破裂蟲卵的這一混和物直接用於提取DNA。實施例2通過修改後的Steiner法(J.J.Steiner、C.J.Polkemba、R.G.Fjellstrom、和L.F.Elliott，1995，用於PCR和RAPD分析的快速單管基因組DNA提取方法，核酸研究(Nucleic Acids Research)23(13)2569-2570)提取DNA將100μl破裂蟲卵溶液用200μl含10mM Tris-鹼pH8.0/270mM EDTApH8.0/1％十二烷基硫酸鈉(SDS)/1％聚乙烯聚聚吡咯烷酮(PVPP)的緩衝液稀釋。將此混和物於95℃溫育20分鐘，在溫育的第一個10分鐘後快速手動搖動一次；然後於室溫以8000xg離心10分鐘。用乙醇沉澱表面層中所含DNA，除去上清，並將沉澱於37℃溫育15分鐘以蒸發殘餘乙醇，然後重懸於TE緩衝液(10mM Tris pH8.0/1mM EDTA pH8.0)。通過於260nm讀取的光密度對DNA量化，並保存於-20℃直至用於PCR。實施例3通過使用表1所示特異引物的聚合酶鏈式反應擴增簡而言之，將1μl提取的DNA在含PCR緩衝液(20mM Tris-HClpH8.0/50mM KCl/1.5mM MgCl2)、200μM dNTP(脫氧核苷酸)、0.5μM每種引物、和0.75U Taq聚合酶，總體積10μl的反應管中進行擴增。擴增反應包括將雙鏈寄生蟲DNA於95℃變性45秒鐘和於63℃與引物退火30秒鐘。在35個連續循環中依次重複這兩步。在第一個循環中，變性步驟延長5分鐘，以確保完全變性；而在最後一個循環時，添加一步，於72℃溫育2分鐘，以結束剩餘退火引物的延伸。
圖2顯示了由孟氏血吸蟲DNA擴增獲得的電泳圖型，以及檢測這種DNA所能獲得的最大靈敏度。M道是分子量標準；1-5道依次是20、10、5、1、和0.5fg DNA。PCR反應能夠檢測少至1fg孟氏血吸蟲DNA。圖3顯示了用相同引物、在與用於孟氏血吸蟲的相同PCR條件中，由其它5種血吸蟲擴增DNA後獲得的電泳圖型。M道分子量標準；1道孟氏血吸蟲；2道埃及血吸蟲；3道日本血吸蟲(來自菲律賓的品系)；4道日本血吸蟲(來自日本的品系)；5道羊血吸蟲(S.matthei)；6道牛血吸蟲(S.bovis)；7道S.leipperi；8道陰性對照。PCR反應能夠擴增檢驗的血吸蟲所有物種的DNA。圖4顯示了同樣是在用於孟氏血吸蟲的相同條件下擴增其它屬蠕蟲DNA的嘗試。M道分子量標準；1道陽性對照(孟氏血吸蟲DNA)；2道，人蛔蟲(Ascarislumbricoides)；3道Ancilostoma duodenales；4道豬帶絛蟲(Taeniasolium)；5道Trichiuris trichiuria。當使用其它屬蠕蟲DNA時，看不見擴增產物。因此，本發明所述PCR對於血吸蟲屬是特異的。實施例4檢測患者糞便樣品中的孟氏血吸蟲DNA在這些實驗中，以實施例1所述方式破裂受感染糞便(天然或人工)中包含的蟲卵。然後通過實施例2所述用於由純的孟氏血吸蟲卵提取DNA的相同技術由糞便提取DNA。
提取後，將1μl孟氏血吸蟲DNA(稀釋100倍)如實施例3所述用相同引物、在相同條件下進行擴增。圖5顯示了人工感染了寄生蟲卵的糞便中孟氏血吸蟲DNA的擴增產物。簡而言之，將100mg患者糞便樣品(每克含216枚蟲卵)與900mg陰性糞便混和，形成具有預定濃度(每克大約20枚蟲卵)的樣品。將此過程再重複兩次，產生每克含大約2和0.2枚蟲卵的糞便樣品。然後通過Kato-Katz法對每種樣品的一部分進行分析，並通過本發明PCR對每種樣品的一部分檢測寄生蟲DNA，由此比較兩種方法的靈敏度。M道分子量標準；1道陽性對照(0.1ng孟氏血吸蟲卵DNA)；2-5道依次是每克糞便含200、48、4.8、和0.48枚蟲卵的糞便樣品的擴增DNA。PCR能夠檢測少至每克含大約4.8枚蟲卵的樣品中的孟氏血吸蟲DNA；而Kato-Katz法的靈敏度是每克48枚蟲卵，低10倍。
圖6顯示了先前通過Kato-Katz法測定具有多種濃度寄生蟲的患者糞便中孟氏血吸蟲DNA的擴增結果。M道分子量標準；1道陽性對照；2-9道依次是每克含0.96、0.168、432、600、96.912、和72枚蟲卵的人糞便樣品。PCR結果符合寄生蟲學檢驗在所有樣品中獲得的結果。實施例5檢測患者血清中的孟氏血吸蟲對於4份血清樣品，每份樣品取100μl，採用Glass-maxDNA分離旋轉柱系統(Life Technologies)，參照製造商的說明書，純化DNA。然後將2μl此DNA用於上述相同條件的PCR擴增。所用人血清先前通過Kato-Katz法進行了檢驗，2份樣品陽性，2份樣品陰性。
圖7顯示了擴增結果。M道分子量標準；1道陽性對照；2-5道依次是每克糞便含0、96、0、和216枚蟲卵的人的血清。
序列表1)一般信息I.a)申請人Fundac Oswaldo CruzI.b)地址Av.Brasil，4365，Castelo Mourisco，sala 05，Manguinhos-21045-900-Rio de Janeiro-RJII)發明題目「通過聚合酶鏈式反應檢測血吸蟲病的方法和試劑盒」III)序列數目3IV)計算機可讀形式IV.a)介質類型磁碟-3.5英寸IV.b)計算機IBM兼容機IV.c)作業系統PC-DOS/MS-DOS2)序列的一般信息I.a)序列編號SEQ ID NO1II)序列特徵II.a)長度120II.b)類型核酸II.c)鏈型雙鏈II.d)拓撲學線性III)基因組定位III.a)圖譜定位no mapa...
GATCTGAATC CGACCAACCG TTCTATGAAA ATCGTTGTATCTAGACTTAG GCTGGTTGGC AAGATACTTT TAGCAACATACTCCGAAACC ACTGGACGGA TTTTTATGAT GTTTGTTTTAGAGGCTTTGG TGACCTGCCT AAAAATACTA CAAACAAAATGATTATTTGC GAGAGCGTGG GCGTTAATAT AAAACAAGAACTAATAAACG CTCTCGCACC CGCAATTATA TTTTGTTCTTI.a)序列編號SEQ ID NO2II)序列特徵II.a)長度20II.b)類型核酸II.c)鏈型單鏈II.d)拓撲學線性，正向III)基因組定位III.a)圖譜定位...GATCTGAATCCGACCAACCGI.a)序列編號SEQ ID NO3II)序列特徵II.a)長度20II.b)類型核酸II.c)鏈型單鏈II.d)拓撲學線性，反向III)基因組定位III.a)圖譜定位...ATATTAACGCCCACGCTCTC
權利要求
1.用於通過檢測生物學樣品中SEQ ID NO1所示血吸蟲屬DNA特異區來診斷血吸蟲屬寄生蟲感染的方法，包括下列階段(a)收集待測樣品；(b)由階段(a)中獲得的樣品提取血吸蟲屬之種DNA；(c)使用由SEQ ID NO1所示孟氏血吸蟲最初序列構建的特異引物通過PCR擴增階段(b)中提取的血吸蟲屬之種的DNA特異區；(d)通過電泳分離階段(c)的擴增產物，隨後通過適當技術進行檢測。
2.權利要求1的方法，其中階段(c)中所用引物包括序列SEQ ID NO2與SEQ ID NO3或者能夠擴增血吸蟲屬之種DNA特異區的功能等同序列。
3.權利要求1的方法，其中通過電泳在聚丙烯醯胺凝膠中分離階段(d)的擴增產物並通過銀染或其它檢測系統進行檢測。
4.包含序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或者其功能等同序列的寡核苷酸引物。
5.權利要求4的引物，其包含序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。
6.用於診斷血吸蟲屬之種感染的試劑盒，其包含由SEQ ID NO1所示孟氏血吸蟲最初序列構建的特異引物和進行PCR的所有必需試劑。
7.權利要求6的試劑盒，其中特異引物包含SEQ ID NO2與SEQ ID NO3或者能夠擴增血吸蟲屬之種DNA特異區的功能等同序列。
8.權利要求7的試劑盒，其中還具有為使用者提供的方案和指導手冊。
全文摘要
本發明的目的是通過PCR檢測生物學樣品中的血吸蟲屬之種。本發明的第一個實施方案涉及用於診斷血吸蟲病的方法,即通過PCR擴增血吸蟲屬之種DNA序列,然後通過電泳分離擴增產物,最後通過適當技術進行檢測。在第二個實施方案中,本發明致力於用於檢測血吸蟲病的診斷試劑盒。基本的試劑盒包含進行PCR技術的所有必需試劑,即用於PCR擴增的特異引物、核苷酸、和適當緩衝液。試劑盒可以任選的包含數量足以用於擴增的Taq聚合酶、作為反應陽性對照的標準DNA、製備擴增物質用於電泳的緩衝液、以及為使用者提供的方案和指導手冊。
文檔編號C12N15/09GK1366553SQ0180081
公開日2002年8月28日 申請日期2001年4月4日 優先權日2000年4月4日
發明者A·L·特勒斯拉貝羅, E·迪阿斯奈託, L·A·龐特斯 申請人:奧斯瓦爾多克魯茲基金會