調節多譜系激酶蛋白的製作方法

2023-10-21 04:04:42

專利名稱：調節多譜系激酶蛋白的製作方法
本申請為中國專利申請No.2004100491086的分案申請發明領域本發明部分涉及調節多譜系激酶蛋白(MLK)家族成員的方法，鑑定能夠調節多譜系激酶蛋白和有助於細胞存活或者促進細胞死亡的化合物的方法，鑑定能夠用於治療神經變性疾病和/或炎症的化合物的方法，以及應用能夠抑制多譜系激酶蛋白的化合物治療神經變性疾病的方法。
發明的
背景技術：
MLK家族包括一組蛋白，其中家族成員激酶區的蛋白質序列與MAPKKKs極為相似，但是和其它的MAPKKKs相互之間更為相似。MLK的家族成員包含有很複雜激酶串部分，例如產生緊張信號的激酶串，該激酶串特別涉及c-Jun N-終止的激酶(JNK)的調變，所述的調變可依次調節轉錄因子，這包括c-Jun、ATF2和ELK-1。JNK在USP5,534,426、5,593,884、5,605,808和WO 95/03324中已有描述，本發明引用上述各篇專利全文作為參考。
MLK家族有部分包括下述各組1)多譜系激酶1(MLK1)；2)多譜系激酶2(MLK2)；3)多譜系激酶3(MLK3)；4)亮氨酸拉鏈攜帶激酶(LZK)；5)雙亮氨酸拉鏈攜帶激酶(DLK)；和6)多譜系激酶6(MLK6)。MLK 1具有和對Tyr和Ser/Thr有特異性的兩種激酶類似的催化區。Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。MLK2也具有和對Tyr或Ser/Thr有特異性的兩種激酶類似的催化區。Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710。已知MLK 2也如同是MST。Katoh等人，Oncogene，1995，10，1447-1451。MLK 3含有的蛋白質附加於激酶區，其中含有兩個亮氨酸拉鏈，帶有相鄰的羧基終止的基本區域，並富含有脯氨酸區。Ing等人，Oncogene，1994，9，1745-1750。已知MLK 3也是SPRK(Gallo等人，J.BioL Chem.，1994，269，15O92-15100)，和PTKI(Eeoe等人，Oncogene，1994，9，935-938)。LZK是亮氨酸拉鏈支撐的激酶。Sakuma等人，J.Biol.Chem.，1997，272，28622-28629。DLK具有激酶區和兩種推定的亮氨酸拉鏈基序。Holzman、等人，J.Biol.Chem.，1994，269，30808-30817。已知DLK也是ZPK(Reddy、等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1994，202，613-620)和MUK(Hirai等人，Oncogene，1996，12，641-650)。MLK家族的成員在例如下述專利和文獻中已有描述U.S.P5,676,945；5,554,523；WO 93/15201；CA 2,148,898；Diener，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，9687-9692；DeAizpurua等人，J.Biol.Chem.，1997，272，16364-16373；Tung等人，Oncogene，1997，14，653-659；Sells等人，Trends in Cell Biol.，1997，7，161-167；Mata，等人，J.BioLChem.，1996，271，16888-16896；Hirai等人，J.BioL Chem.，1997，272，15167-15173；Fan等人，].Biol Chem.，1996，271，24788-24793；Blouin等人，DNA and Cell Biol.，1996，15，631-642；Pombo等人，Nature，1995，377，750-754；Kiefer等人，EMBO 1，1996，15，7013-7025；Hu等人，Genes Dev.，1996，10，2251-2264；Su等人，BMBO J.，1997，16，1279-1290；和Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500。最近，在EST資料庫中還鑑定出其它MLK相關的激酶。此克隆體MLK 6的序列用七個重疊的通道(entries)表述。這些克隆體的ID數目是1007489，1460085，510915，666323，F5555，482188和178522，本發明引用本段各篇文獻全文作為參考。
最近，如群體形成試驗所測定的，已指出ZPK的穩定表達可減少NIH3T3成纖維細胞的增生能力。Bergeron等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1997，231，153-155。但是，Bergeron等人沒有提供任何數據來說明ZPK可調節ZPK基質的活性，或者說明ZPK是否能夠促進細胞的死亡。
已有人指出在Swiss 3T3細胞中構成編碼Myc-MLK2的表達在注射後大約20小時是能夠導致編程性細胞死亡，Nagata等人，EMBOI，1998，17，149-158.
申請人研究了某些吲哚並和茚並化合物，它們可抑制與過度增生狀態有關的細胞生長，以及在各種胚胎培養物，如脊神經節、紋狀體、高級頸神經中樞和運動神經元中抑制細胞死亡。USP 5,475,110、5,591,855、5,594,009、5,461,146、5,621,100、5,621,101、5,705,511和5,756,494，它們已經轉讓給本申請人的受讓人，本申請引用上述全文作為參考。U.S.P 5,705,511中所述的化合物具有式G結構，本申請引用作為參考，為式I。申請人還指出K-252a衍生物可抑制運動神經元編程性細胞死亡，所述化合物是吲哚並咔唑，它還可以調節緊張信號級聯擴增。Maroney等人，J.Neurosci.，1998，18，104-111，本申請引用上述全文作為參考。
由於篩選的調節緊張信號級聯擴增以及促進細胞死亡和存活的化合物功能不全，因此仍然需要得到新的，篩選化合物的選擇性方法。此外，也需要有用於治療炎症和神經變性疾病的治療篩選試驗方法。本發明就涉及了上述目的，以及其它一些重要的目的。
發明概述本發明提供了能夠調節多譜系激酶蛋白和促進細胞存活的化合物的鑑定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細胞與所述化合物接觸，測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的下降，和測定化合物是不是有助於細胞的存活的步驟。
本發明還提供了能夠調節多譜系激酶蛋白和促進細胞死亡的化合物的鑑定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細胞與所述化合物接觸，測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的提高，和測定化合物是不是促進了細胞的死亡的步驟。
本發明還提供了用於治療神經變性疾病的化合物的鑑定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細胞或細胞萃取物與所述化合物接觸，並測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的下降。
本發明還提供了用於治療炎症的化合物的鑑定方法，該方法包括使含有多譜系激酶蛋白的細胞或細胞萃取物與所述化合物接觸，並測定化合物是不是造成了多譜系激酶蛋白活性的下降。
本發明還提供了哺乳動物已有或疑有神經變性疾病的治療方法，該方法包括給所述的哺乳動物施用能夠抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。
本發明還提供了哺乳動物已有或疑有炎症的治療方法，該方法包括給所述的哺乳動物施用能夠抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。
本發明還提供了調節多譜系激酶蛋白活性的方法，該方法包括使所述的蛋白或含有該蛋白的細胞與下述式II化合物接觸 式中環B和環F都與它們所連接的碳原子成環，並分別各自選自下述基團，不飽和的6元芳香碳環，環上的1-3個碳原子可被氮原子置換；不飽和的5元芳香碳環；和不飽和的5元芳香碳環，在環上或1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；2個碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或兩個氮原子置換；或3個碳原子被3個氮原子置換；R1選自下述基團H，取代或未取代的1-4個碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的雜芳基，或取代或未取代的雜芳烷基；-C(＝O)R9，其中R9選自烷基、芳基或雜芳基；-OR10，其中R10選自H和1-4個碳原子的烷基；-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-O(CH2)POR10和-O(CH)PNR11R12，其中p為1-4；和其中或R11和R12分別各自選自H和1-4個碳原子的烷基；或R11和R12一起構成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團，其中X1選自-O-，-S-和-CH2-；R2選自下述基團H，1-4個碳原子的烷基，-OH，1-4個碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10個碳原子的芳烷基，取代或未取代的雜芳烷基；R3，R4，R5和R6各自分別選自下述基團；H，芳基，雜芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)PNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；-CH2OR14，其中R14是在羧基的羥基脫除後的胺基酸殘基；
-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14其中y是0，1或2；1-8個碳原子的烷基，2-8個碳原子的烯基，2-8個碳原子的炔基，其中每個烷基、烯基、炔基是未取代的，或每個烷基、烯基、炔基是由下述1-3個基團取代的6-10個碳原子的芳基、雜芳基、芳基烷氧基、雜環烷氧基、羥基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基-烷硫基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pOC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)pCO2R9，-X2(CH2)pS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氫吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)，-OR14，和5-7個碳原子的單糖，其中單糖的每個羥基各自分別或未取代或由H、1-4個碳原子的烷基、2-5個碳原子的烷基醯氧基或1-4個碳原子的烷氧基；X2是O，S或NR10；R7和R8是各自分別選自H、1-4個碳原子的烷基、1-4個碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10個碳原子的芳烷基或取代或未取代的雜芳烷基、-(CH2)POR10、-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12；或R7和R8一起構成結構式-CH2-X3-CH2-的連結基團，其中X3是X2或單鍵；m和n各自分別是0，1，或2；Y選自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；Z選自單鍵、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；R15和R16各自分別選自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10；R17選自H，烷基，芳基，和雜芳基；A1和A2選自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1與A2一起構成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團；B1和B2選自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1與B2一起構成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團；同時以A1與A2或B1與B2中的至少一對形成＝O為條件。
本發明還提供了調節多譜系激酶蛋白活性的方法，包括使該蛋白或包含該蛋白的細胞同式III化合物接觸 式中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同構成＝O；R1選自下述基團H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
R2選自下述基團H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X選自下述基團H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)2OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述結構式之一 和
R選自OH和OCH3。
本發明還提供了調節多譜系激酶蛋白活性的方法，包括使該蛋白或包含該蛋白的細胞同式IV化合物接觸 其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
附圖的簡要說明為了說明本發明的實施方案，在附圖中說明了某些技術特徵。可以理解的是，本發明並不限於副圖所示確定的實施方案。


圖1是橋連的茚並吡咯並咔唑的一般製備方法示意圖。
圖2是橋連的茚並吡咯並咔唑的一般製備方法示意圖。
圖3是樹脂鍵連的茚並吡咯並咔唑的一般製備方法示意圖。
圖4是被保護的、可溶解的茚並吡咯並咔唑的一般製備方法示意圖。
圖5是中間體V的一般製備方法示意圖。
圖6是用方法A製備橋連的茚並吡咯並咔唑的示意圖。
圖7是用方法B製備橋連的茚並吡咯並咔唑的示意圖。
圖8是B-環取代的橋連茚並吡咯並咔唑的製備方法示意圖。
圖9是橋連茚並吡咯並咔唑的E環衍生方法示意圖。
圖10描述了在沒有NGF的情況下培養5天後，可生存的神經分化PC-12細胞的數量的兩組不同試驗的圖解。結果以每組的NGF控制百分數表示(沒有NGF的情況下的載體對照組，n＝12；所有其它組，n＝3)。通過雙側T-檢驗，載體對照組和在沒有NGF時主要表達為陰性的MLK-3突變體的穩定的細胞庫之間的差別是令人滿意的。
圖11A說明了用放射性膠基試驗，死亡激酶GST-SEK-1通過杆狀病毒群表達的FLAG-MLK-3(全長和激酶區的混合物)磷酸化。
圖11B說明了杆狀病毒群表達的FLAG-MLK-3(全長和激酶區的混合物)或GST-MLK-3激酶區催化的激酶反應結果所形成的32P標記的磷酸化髓磷脂鹼性蛋白質產物。
圖12的免疫印跡分析指出通過杆狀病毒群表達的FLAG-MLK-3(全長和激酶區的混合物)磷酸化的死亡激酶GST-SEK-1以磷酸-特異性SEK-1抗體的形式檢出。
圖13說明了通過細菌表達的GST-MLK-3激酶區的髓磷脂鹼性蛋白質的磷酸化作用，試驗採用了(o)多篩選三氯乙酸沉澱試驗，或(·)磷酸纖維素膜方法。
圖14給出了用MLK-3桿狀病毒群感染的昆蟲細胞的裂解物孵化的[3H]K252的飽和結合曲線。
圖15說明了用細胞過量表達的MLK-3，MLK-2或DLK，和經過0.025％DMSO(對照組)或500nM K-252a處理，在免疫沉澱物/激酶反應中32P標記的c-jun的數量。
圖15B以圖示說明了用圖15A所述樣品，在免疫沉澱物/激酶反應中保留的定量的活性百分數。各柱高表示多個樣品的平均值，誤差線條說明了平均範圍。
圖15C說明了用細胞過量表達HA-JNK1單獨使用，或如圖所示在各種cDNA量的情況下與MEKK1一起，經過0.025％DMSO(對照組)或500nM化合物III-3(見表3)處理，在免疫沉澱物/激酶反應中32P標記的c-jun的數量。各柱高表示多個樣品的平均值，其中的誤差線條說明了平均範圍。
圖16說明了化合物III-3促進神經元存活與濃度的關係。將取自交感神經節(SG)(A)、背根神經節(DRG)(B)、睫狀神經節(CG)(C)和運動神經元(MN)(D)的分離的神經元在有或沒有所指明的營養因子的情況下進行培養。如材料和方法部分所述，在平皿接種48小時後對細胞計數，數據以三次或四次重複試驗的平均值±SD表示。
圖17給出了在有或沒有各自的神經營養因子(對交感神經元和感覺神經元而言為20ng/ml NGF，對睫狀神經元而言為10ng/ml CNTF，對運動神經元(A-D)而言為30μg/ml肌萃取物(MEX))，或在1μM化合物III-3(E-H)存在下培養48小時後，El2 DRG(A，E)、交感神經E9(B，F)、睫狀E8(C，G)和E5.5運動神經元(D，H)培養物的相差顯微照片。Bar＝2Ooμm。
圖18給出了體外背根神經節外植體的顯微照片。取自小雞DRG(E9)的外植體置入96穴培養板，其中的介質含有0.05％BSA。附著期2小時後，再加入下述附加物(A)用於對照的DMSO；(B)20ng/mlNGF；(C)250nM化合物III-3。48小時後，移出介質，外植體在磷酸鹽緩衝液中用多聚甲醛固定。
圖19說明了每天用特定劑量的化合物III-3處理(E5-9)後，存活在E10中的小雞腰運動神經元數目。所示的數據是每個處理組5-6隻動物的平均值±SD。所報告的試驗重複兩次。數據取自一有代表性的試驗，並用腰柱的一側表示。用Bonferroni校正化合物III-3和對照組之間的斯氏T試驗的*p＜0.01，**p＜0.001。
圖20說明了每天用化合物III-3處理(PN1-5)後，或是對照載體組(5％SolutoITM)，生存於PN 10或PN6O中的雌性大鼠脊柱的球海綿體肌(SNB)的神經核中的運動神經元的數目。在PN10(A，B)或PN 60(B)的情況下，處死大鼠，分割出含有SNB的脊髓部位，用組織學方法加工，然後如文獻所述(Wingfield等人，Steroids，1975，26，311-327)，在脊髓的腰5-骶骨1區的一系列切片上對Cresylecht紫染色的運動神經元計數。試驗數據是每一處理組4-8隻動物的平均值±SD。
圖21說明了成年大鼠用化合物III-3在舌下神經axotomy處理後ChAT免疫活性的損失。在把舌下神經橫斷和用載體溶液(5％SolutoITM)處理之後(A)，和在橫斷處用200μg化合物III-3處理(B)的舌下神經核顯微照片。(C)是在上述(A)和(B)處理ChAT-免疫反應性舌下運動神經元的數目。結果表示為ChAT-免疫反應性舌下運動神經元的百分數，100％定義為對側、未損害的舌下神經核中ChAT-免疫反應性運動神經元的數目。
圖22說明了MLK-3途徑的體內抑制作用顯示出來的效力和磷酸化作用後的保護。圖22A說明了在化合物III-3系統用藥造成MPTP損害後，黑質酪氨酸羥化酶免疫反應性神經元的增加。圖22B是說明MPTP誘導的磷酸化MKK4水平提高的有代表性的免疫印跡。圖22C給出了有代表性的免疫印跡，以及ELISA說明了在有化合物III-3存在時，MPTP誘導的磷酸化MKK4的衰減。
圖23說明了Jurkat細胞中IL-2的誘導作用。圖23A說明了IL-2誘導與時間的關係。圖23B說明了化合物III-3對IL-2誘導的抑制作用。圖23C說明了化合物III-3和化合物I-4對IL-2誘導的抑制作用。
發明的詳細描述上文及本發明全文所用的下述術語應理解為具有下述定義，除非另有說明。
「編程性細胞死亡」是指細胞死亡的特定形態學形式，其特徵在於細胞的碎片和細胞核在膜結合的顆粒之內。編程性細胞死亡可由例如能誘導編程性細胞死亡的化合物觸發，這些化合物例如是依託泊甙、癌基因抑活藥、腫瘤壞死因子、cerurnide等，或者是由如X-射線的條件觸發。
術語「細胞死亡」是指細胞由於編程性細胞死亡、壞死或其它本領域普通技術人員所熟知的手段造成的細胞死亡。例如，「細胞死亡」的特徵在於總細胞數的減少，或與未處理對照組的細胞種群相比細胞的生存能力下降。與未處理對照組的種群相比，「促進細胞死亡」的化合物能夠引起細胞數的減少，或細胞生存能力下降。與此相反，「促進細胞存活」的化合物可使細胞數增加，或提高細胞的生存能力，或減緩或減少細胞死亡的速率。
術語「選擇性地反應」或「特異性結合」是指化合物以物理的或化學的方式直接與MLK蛋白發生作用。與此相反，不能「選擇性地反應」或「特異性結合」的化合物可以與MLK蛋白的上遊或下遊作用，以及可以影響MLK蛋白的活性，但是不能以物理的或化學的方式直接與MLK蛋白發生作用。
術語「調節」是指特定蛋白或基質活性的增加或減少。
本發明部分地涉及能夠調節MLK蛋白活性，和促進細胞存活或細胞死亡的化合物的鑑定方法。能夠提高MLK蛋白活性和可以促進細胞死亡的化合物，另一方面，該化合物也能夠降低MLK蛋白活性和促進細胞存活。
MLK蛋白可以是任何鑑定為屬於MLK蛋白質。優選的，MLK蛋白選自上文所述的一組蛋白MLK1、MLK2、MLK3(SPRK，PTK1)、LZK，DLK(ZPK，MUK)和MLK6。在本發明一個優選實施方案中，對直接作用於或結合於MLK蛋白的化合物進行鑑定的方法可以通過結合試驗、激酶試驗或其它等同的試驗完成。
為了鑑定能夠調節MLK蛋白活性和促進細胞存活或細胞死亡的化合物，使細胞或含有MLK蛋白的細胞與所述化合物接觸。接觸可在本領域普通技術人員已知的緩衝溶液或介質中進行。另外，接觸也可以在體內進行，在此情況下，使諸如小鼠的動物或本領域普通技術人員已知的其它的適當動物通過施用與含有試驗化合物的藥物組合物以及藥用鹽、載體或稀釋劑接觸。此外，也可以改變細胞的數目和試驗化合物的濃度。可以測定出試驗化合物使MLK蛋白的活性增加還是減少，以及也可以測定出試驗化合物促進細胞的存活還是死亡。
與試驗化合物接觸的細胞可以是任何哺乳動物的細胞，優選神經元細胞。優選涉及神經變性疾病的細胞。為實現本發明的目的，「神經變性疾病」、「神經變性障礙」和「神經變性症狀」是可以互換的，並可用來描述與神經元細胞或涉及神經元系統的細胞有關的疾病或失調，這包括，但不限於阿耳茨海默氏病、運動神經元疾病、肌萎縮側索硬化、帕金森氏病、腦血管疾病、局部缺血症狀、AIDS、痴呆、癲癇、杭廷頓氏舞蹈病以及腦或脊髓的震動或貫通傷。
MLK蛋白活性可由多種技術測定。例如MLK活性可用蛋白質基質的活性測定。這些基質是已知的，對本領域熟練技術人員而言是很容易辨別的。優選的，所述的基質是一種絲分裂素活化的蛋白質激酶，激酶家族或絲分裂素活化的蛋白質激酶家族或更下遊的基質包括，但不限於選自下述的一組蛋白JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2、p38α、p38β、P38γ、P38δ、MEK1、MEK2、MKK3、MKK4(SEK1)、MEK5、MKK6、MKK7、jun、ATF2、ELK1和哺乳動物的AEX-3類似物，還包括Ser/Thr蛋白激酶的一般基質如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)。測定這些基質活性的試劑和方法是本領域熟練技術人員已知的。通過測定MLK蛋白或mRNA編碼的MLK蛋白可以確定MIX的存在。測定DNA或蛋白質，包括RNA印跡和蛋白質印跡的試劑，以及測定的方法是本領域熟練技術人員已知的，所述的試劑包括抗體和寡核苷酸探針。MLK蛋白的活性也可用體外的激酶試驗方法測定。體外激酶試驗方法也是本領域熟練技術人員已知的。測量蛋白質活性的其它方法是本領域熟練技術人員已知的，並且包括在本發明的範圍之內。因此，本領域熟練技術人員可以確定試驗化合物是不是能夠調節，即提高或減少MLK蛋白的活性。
試驗化合物是不是能夠促進細胞的存活或死亡可以用多種方法確定。優選的，可使用頻死細胞測定是否能夠促進細胞的存活或死亡，並且將與試驗化合物接觸的細胞並存活的數目，和沒有與試驗化合物接觸並存活的細胞數目進行比較。優選的，所述的細胞是在預程序中死亡的初級的胚胎運動神經元細胞。初級的胚胎運動神經元細胞在Maroney等人，J.Neurosci，1998，18，104-111中已有描述，該文獻的全文被引用作為參考。除非由試驗化合物營救，所述的初級的胚胎運動神經元細胞會死。因此，與不用試驗化合物處理的運動神經元細胞種群中活著的運動神經元細胞相比，用試驗化合物處理的運動神經元細胞種群中活著的運動神經元細胞更多，這說明試驗化合物可以促進細胞存活。相反，與不用試驗化合物處理的運動神經元細胞種群中活著的運動神經元細胞相比，用試驗化合物處理的運動神經元細胞種群中活著的運動神經元細胞更少時，說明試驗化合物可以促進細胞死亡。
在本發明的另一實施方案中，如下面的實施例所述，由於MLK蛋白的過表達，正常細胞、野生型細胞可轉化成有死亡危險的細胞，然後，使其與試驗化合物接觸。除非由試驗化合物營救，所述過表達的MLK蛋白細胞會死亡。用能夠表達特定蛋白質內側細胞的載體可以完成MLK的過表達。表達用的載體是本領域熟練技術人員已知的。此外，製備表達載體的方法也是本領域熟練技術人員已知的。表達任何MLK蛋白的表達載體可以按照本發明實施例所述類似的方法製備。與不用試驗化合物處理的過表達細胞種群中活著的細胞相比，用試驗化合物處理的細胞種群中活著的細胞數目更多，說明試驗化合物可以促進細胞存活。相反，與不用試驗化合物處理的過表達細胞種群中活著的細胞相比，用試驗化合物處理的細胞種群中活著的細胞數目更少，說明試驗化合物可以促進細胞死亡。
在另一實施方案中，通過觀察或測定編程性細胞死亡減少，說明可促進細胞存活。相反，與不用試驗化合物處理的過表達細胞種群中活著的細胞相比，用試驗化合物處理的細胞種群中活著的細胞數目更少，說明試驗化合物可以促進細胞死亡。細胞質的皺縮和細胞核的濃縮與編程性細胞死亡有關。因此，本領域熟練技術人員通過觀察或測定細胞質的皺縮和/或細胞核的濃縮測定編程性細胞死亡減少。此外，本領域熟練技術人員通過觀察或測定細胞質的皺縮和/或細胞核的濃縮測定編程性細胞死亡減少。此外，本領域熟練技術人員用常規的染色法可測定編程性細胞死亡。
在本發明的另一實施方案中，可使用正常細胞、野生型神經元細胞鑑定能促進細胞死亡的化合物。除非由試驗化合物營救，所述的正常細胞會死亡。與不用試驗化合物處理的正常細胞種群中活著的細胞相比，用試驗化合物處理的正常細胞種群中活著的細胞數目更少，說明試驗化合物可以促進細胞死亡。相反，與不用試驗化合物處理的正常細胞種群中活著的細胞相比，用試驗化合物處理的正常細胞種群中活著的細胞數目更多或相等時，不說明試驗化合物可以促進細胞死亡。
本發明還部分的涉及調節MIX蛋白活性的方法，該方法包括使所述蛋白或含有所述蛋白的細胞與式G(本文表示為式I)化合物接觸，該化合物公開在USP 5,705,511，該專利由本申請的受讓人申請，這裡引用其全文作為參考。
本發明還部分地涉及調節MLK蛋白活性的方法，包括用下述式III化合物接觸該蛋白或包含該蛋白的細胞
式中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2共同構成＝O；R1選自下述基團H，Cl，CH2SO2C2H5，Br，CH2S(CH2)2NH2，CH2S(CH2)2N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH2n-C4H9，NHCONHC6H5，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2SC6H5，N(CH3)2，CH3，CH2OCONHC2H5，NHCO2CH3，CH2OC2H5，CH2N(CH3)2，OH，O-正丙基，CH＝NNH-C(＝NH)NH2，CH＝N-N(CH3)2，CH2S(CH2)2NH-n-C4H9，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S(3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，
R2選自下述基團H，Br，Cl，I，CH2S(CH2)2N(CH3)2，NHCONHC2H5，CH2SC2H5，CH2OCH2OCH2CH3，CH2S[3-(1，2，4-三嗪)]，CH2CH2SCH3，和CH2OH；X選自下述基團H，CH2OH，CH2NH-絲氨酸H，CO2CH3，CONHC6H5，CH2NHCO2C6H5，CH2NHCO2CH3，CH2N3，CONHC2H5，CH2NH-甘氨酸，CON(CH3)2，-CH2NHCO2-，CONH2，CONHC3H7，CH2NH-絲氨酸，CH2SOCH3，CH＝NOH，CH2NH-脯氨酸，CH2CH2(2-吡啶基)，CH＝NNHC(＝NH)NH2，CONH(CH2)OH，CH＝NNHCONH2，CH2OCOCH3，-CH2OC(CH3)2O-，CH2SC6H5，CH2SOC6H5，CO2正己基，CONHCH3，和CO2(CH2)4CH3；或下述結構式之一 和R選自OH和OCH3。
在本發明的優選實施方案中，Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1是NHCONHC2H5，R2是CH2CH2(2-吡啶基)，和R是OH。在本發明的其他優選實施方案中，Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2OCH2OCH2CH3，和R是OH；或Z1和Z2都是H，X是CO2CH3，R1和R2都是CH2SCH2CH3和R是OH；或Z1，Z2，R1和R2是H，X是CO2CH3；和R is OH；或Z1，Z2，R1，和R2是H，X是CO2(CH2)4CH3，和R is OH；或Z1，Z2和R1是H，R2是CH2OH，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1和Z2是H，R1和R2是H2S[3-(1，2，4-三嗪)]，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1和Z2是H，R1是Br，R2是I，X是CO2CH3；和R是OH；或Z1和Z2是H，R1和R2是CH2CHSCH3，X是CO2CH3，和R是OH；或Z1，Z2，R1，和R2是H，X是CO2CH3；和R是OCH3或Z1和Z2一起構成＝O，R1和R2是Br，X是CO2CH3，和R是OH。
本發明還部分地涉及調節MLK蛋白活性的方法，包括用下述式II化合物接觸該蛋白或包含該蛋白的細胞 式中環B和環F都與它們所連接的碳原子成環，並分別各自選自下述基團，a)不飽和的6元芳香碳環，環上的1-3個碳原子可被氮原子置換；b)不飽和的5元芳香碳環；和c)不飽和的5元芳香碳環，在環上或1)1個碳原子被氧、氮或硫原子置換；2)2個碳原子被硫和氮原子、氧和氮原子或兩個氮原子置換；或3)3個碳原子被硫3個氮原子置換；R1選自下述基團a)H，取代或未取代的1-4個碳原子的烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基，取代或未取代的雜芳基，或取代或未取代的雜芳烷基；b)-C(＝O)R9，其中R9選自烷基、芳基或雜芳基；c)-OR10，其中R10選自H和1-4個碳原子的烷基；
d)-C(＝O)NH2，-NR11R12，-(CH2)pNR11R12，-(CH2)POR10，-(CH2)POR10和-O(CH)PNR11R12其中p為1-4；和其中或1)R11和R12分別各自選自H和1-4個碳原子的烷基；或2)R11和R12一起構成式(CH2)2-X1-(CH2)2-的連接基團，其中X1選自-O-，-S-和-CH2-；R2選自下述基團H，1-4個碳原子的烷基，OH，1-4個碳原子的烷氧基，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)PNR11R12，-O(CH2)POR10，取代或未取代的6-10個碳原子的芳烷基，取代或未取代的雜芳烷基；R3，R4，R5和R6各自分別選自下述基團a)H，芳基，雜芳基，F，Cl，Br，I，-CN，CF3，-NO2，-OH，-OR9，-O(CH2)pNR11R12，-OC(＝O)R9，-OC(＝O)NR2R7，-OC(＝O)NR11R12，-O(CH2)POR10，-CH2OR10，-NR11R12，-NR10S(＝O)2R9，-NR10C(＝O)R9；b)-CH2OR14，其中R14是在羧基的羥基脫除後的胺基酸殘基；c)-NR10C(＝O)NR11R12，-CO2R2，-C(＝O)R2，-C(＝O)NR11R12，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-(CH2)PNR11R12，-(CH2)PNHR14，或CH＝NNR2R2A，其中R2A同R2；d)-S(O)YR2-(CH2)PS(O)YR9，-CH2S(O)YR14其中y是0，1或2；e)1-8個碳原子的烷基，2-8個碳原子的烯基，2-8個碳原子的炔基，其中1)每個烷基、烯基、炔基是未取代的，或2)每個烷基、烯基、炔基是由下述1-3個基團取代的6-10個碳原子的芳基、雜芳基、芳基烷氧基、雜環烷氧基、羥基烷氧基、烷氧基-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基-烷硫基，F，Cl，Br，I，-CN，-NO2，-OH，-OR9，-X2(CH2)PNR11R12，-X2(CH2)PC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)POC(＝O)NR11R12，-X2(CH2)PCO2R9，-X2(CH2)PS(O)YR9，-X2(CH2)PNR10C(＝O)NR11R12，-OC(＝O)R9，-OCONHR2，-O-四氫吡喃基，-NR11R12，-NR10C(＝O)R9，-NR10CO2R9，-NR10C(＝O)NR11R12，-NHC(＝NH)NH2，-NR10S(O)2R9，-S(O)YR9，-CO2R2，-C(＝O)NR11R12，-C(＝O)R2，-CH2OR10，CH＝NNR2R2A，-CH＝NOR2，-CH＝NR9，-CH＝NNHCH(N＝NH)NH2，-S(＝O)2NR2R2A，-P(＝O)(OR10)，-OR14，和5-7個碳原子的單糖，其中單糖的每個羥基各自分別或未取代或由H、1-4個碳原子的烷基、2-5個碳原子的烷基醯氧基或1-4個碳原子的烷氧基；X2是O，S或NR10；R7和R8是各自分別選自H、1-4個碳原子的烷基、1-4個碳原子的烷氧基、取代或未取代6-10個碳原子的芳烷基或取代或未取代的雜芳烷基、-(CH2)P-OR10，-(CH2)POC(＝O)NR11R12和-(CH2)PNR11R12；或R7和R8一起構成結構式-CH2-X3-CH2-的連結基團，其中X3是X2或單鍵；m和n各自分別是0，1，或2；Y選自-O-，-S-，-N(R10)-，-N+(O-)(R10)-，-N(OR10)和-CH2-；Z選自單鍵、-O-，-CH＝CH-，-S-，-C(＝O)-，-CH(OR10)-，-N(R10)，-N(OR10)，CH(NR11R12)-，-C(＝O)N(R17)-，-N(R17)C(＝O)-，-N(S(O)YR9)-，-N(S(O)YNR11R12)-，-N(C(＝O)R17)-，-C(R15R16)-，-N+(O-)(R10)-，-CH(OH)-CH(OH)-，和-CH(O(C＝O)R9)CH(OC(＝O)R9A)-，其中R9A同R9；R15和R16各自分別選自H，-OH，-C(＝O)R10，-O(C＝O)R9，羥基烷基和-CO2R10；R17選自H，烷基，芳基，和雜芳基；A1和A2選自H，H；H，OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和A1與A2一起構成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團；B1和B2選自H，H；H，-OR2；H，-SR2；H，-N(R2)2；和B1與B2一起構成的部分選自＝O，＝S，和＝NR2的基團；條件是A1與A2或B1與B2之中至少一對形成＝O。
本發明還部分地涉及調節MLK蛋白活性的方法，包括用下述式IV化合物接觸該蛋白或包含該蛋白的細胞
其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
在本發明的優選實施方案中，R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是CH2CH＝CH2.在本發明的其他優選實施方案中，R1是Br和R2，R4，Z1和Z2是H；或R1，R2，Z1和Z2是H和R3和R4是CH2CH＝CH2；或R1，R2，R3，Z1和Z2是H和R4是CH2CH＝CH2；或R1，R2，Z1和Z2是H，和R3和R4CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是 本發明還提供鑑定可用於治療神經變性疾病的化合物的方法，包括使包含有多譜系激酶的細胞或細胞抽提物同該化合物接觸，並測定該化合物是否減少多譜系激酶蛋白的活性。細胞和細胞抽提物包括前面提到的那些。由本方法找到的化合物(即抑制或減少多譜系激酶蛋白的活性的那些化合物)可以用來治療神經變性疾病。這種蛋白優選多譜系激酶1、多譜系激酶2、多譜系激酶3、亮氨酸拉鏈攜帶激酶、雙元亮氨酸拉鏈攜帶激酶、多譜系激酶6。該細胞在體外或在體內接觸。該蛋白的活性優選通過測試所說蛋白基質的活性或磷酸化態來測定。所說的基質優選JNK1，JNK2，JNK3，ERKI，ERK2，p38α，p38β p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEKI)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELKI，和AEX-3的哺乳動物同系物以及一般的Ser/Thr基質，如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)。蛋白的活性還可以通過測定蛋白基質的活性、蛋白基質的數量或mRNA編碼的蛋白基質來測定。蛋白活性也可通過體外激酶試驗或鍵合試驗來測定。細胞優選初級胚運動神經元細胞、充分表達多譜系激酶蛋白的細胞，或神經元細胞，但可以是任何細胞或其抽提物。如上所述，直接鍵合多譜系激酶蛋白的化合物優選被鑑定。
本發明還提供鑑定可用於治療炎症的化合物的方法，包括使包含有多譜系激酶的細胞或細胞抽提物同該化合物接觸，並測定該化合物是否減少多譜系激酶蛋白的活性。細胞和細胞抽提物包括前面提到的那些。由本方法找到的化合物(即抑制或減少多譜系激酶蛋白的活性的那些化合物)可以用來治療炎症。這種蛋白優選多譜系激酶1、多譜系激酶2、多譜系激酶3、亮氨酸拉鏈攜帶激酶、雙元亮氨酸拉鏈攜帶激酶、多譜系激酶6。該細胞在體外或在體內接觸。該蛋白的活性優選通過測試所說蛋白基質的活性或磷酸化態來測定。所說的基質優選JNK1，JNK2，JNK3，ERKI，ERK2，p38α，p38β p38γ，p38δ，MEK1，MEK2，MKK3，MKK4(SEKI)，MEK5，MKK6，MKK7，jun，ATF2，ELKI，和AEX-3的哺乳動物同系物以及一般的Ser/Thr基質，如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)。蛋白的活性還可以通過測定蛋白基質的活性、蛋白基質的數量或mRNA編碼的蛋白基質來測定。蛋白活性也可通過體外激酶試驗或鍵合試驗來測定。
細胞優選初級胚運動神經元細胞、充分表達多譜系激酶蛋白的細胞，或神經元細胞，但可以是任何細胞或其抽提物。這種細胞還包括但不限於涉及炎症的那些細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞和其他本領域內的專業技術人員公認的白細胞。直接鍵合多譜系激酶蛋白的化合物優選被鑑定。
本發明還提供治療患有或被懷疑患有神經變性疾病的哺乳動物的方法，包括給該哺乳動物服用抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物包括但不限於具有式I，II，III和IV的化合物。優選的化合物包括上述有關篩選調節多譜系激酶蛋白活性，或促進細胞存活或死亡的化合物的方法所描述化合物。優選的哺乳動物是人。如果一個人具有特定的神經變性疾病的症狀，或是處高危險的群體，或有神經變性疾病家族史，他就被懷疑患有神經變性疾病。
本發明還提供治療患有炎症疾病的哺乳動物的方法，包括給該所說的哺乳動物服用抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物。抑制或減少多譜系激酶蛋白活性的化合物包括但不限於具有式I，II，III和IV的化合物。優選的化合物包括上述有關篩選調節多譜系激酶蛋白活性，或促進細胞存活或死亡的化合物的方法所描述化合物。優選的哺乳動物是人。
與式I-IV化合物的接觸可在緩衝液或介質中進行，這是本領域內的專業技術人員所熟知的。另外，這種接觸可通過給適宜的動物或哺乳動物，如小鼠或本領域內的專業技術人員熟悉的其他適宜動物，服用包含有試驗化合物的藥用組合物和藥用鹽、載體或稀釋劑來進行。此外，各種各樣的細胞和化合物濃度都可使用。優選的細胞是神經元細胞。優選的細胞涉及神經變性疾病，如阿爾茨姆默氏病運動原神經元疾病；肌肉萎縮硬化；帕金森病；腦血管疾病；局部缺血；AIDS；痴呆；癲癇；杭廷頓氏病和腦或脊髓的振蕩性或穿透性損傷。式I化合物及其製備方法描述在美國專利5,705,511中，引用於此以供參考。式III化合物及其製備方法描述在美國專利5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，以及WO 97/46567，全部引用於此以供參考。式IV化合物及其製備方法描述在美國專利5,741,8098，5,621,100，5,621,101，5,461,146，和5,756,494，以及WO97/46567，全部引用於此以供參考。
式II化合物包括環繞連接取代基R2，R7，和R8的碳原子的非對映異構體和對映異構體。
優選的橋式茚並吡咯並咔唑由式II表示 在式II化合物某些優選的實例中，R1is H。在更優選的實例中，R2是H，羥基或取代或未取代烷基。
在其他優選的實例中，R3，R4，R5和R6各自分別是H，取代或未取代烷基、滷素、取代或未取代烷氧基、或取代或未取代氨基、或取代或未取代芳基。在更優選的實例中，R7和R8各自分別選自是H，取代或未取代烷基。
在某些優選的實例中，Y是O。在更優選的實例中，Z是單鍵、O、S或取代或未取代的N。在更進一步優選的實例中，m和n各自分別是1或2。在某些特別優選的實例中，Y是O，Z是單鍵或O，m和n各自分別是1或2。
在進一步優選的實例中，A1A2和B1B2是＝O或H，H。
在某些特別優選的實例中，R1，R4，R6和R7都是H，Y是＝O，n為1，A1A2和B1B2是＝O或H，H，R2是H，OH或低級烷基，R3是H，取代或未取代烷基，R5和R8都是H或烷氧基，優選甲氧基，Z是單鍵或O，m和n是1或2。
式II化合物特別優選的實例是在下面表1列出的化合物II-1，II-2，II-3，II-4a，II-4b，II-5，II-6，II-7a，II-7b，II-8，II-9，II-10，II-11和II-12。
由式II化合物表示的化合物此後表示為化合物(II)。
這裡所用的術語「碳環」指環的部分僅由碳原子組成的環基。術語「雜環」或「雜環的」指環的部分至少包含一個雜原子如O，N或S的環基。
這裡所用的術語「烷基」指1-8個碳原子的直鏈的、環狀的或支鏈的烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、辛基、環丙基和環戊基。包含烷基基團的烷基部分如烷氧基、烷氧羰基和烷氨基羰基的烷基部分與上述定義的烷基意思相同。低碳烷級優選上述定義的具有1-4個碳原子烷基。術語「烷烯基」指至少有一個碳-碳雙鍵的直鏈的或支鏈的烴鏈。烯基的實例包括乙烯基或丙烯基。這裡所用的術語「炔基」指至少有一個碳-碳三鍵的直鏈的或支鏈的烴鏈。炔基的實例包括乙炔基或丙炔基。
包含醯基基團如醯氧基的醯基部分指1-6個碳原子的直鏈的或支鏈的烷醯基，如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、新戊醯基或己醯基。
這裡所用的術語「芳基」指具有6-12個碳原子的芳基，如苯基、二苯基和萘基。優選的芳基包括未取代或取代的苯基和萘基。這裡使用的術語「雜芳基」指一個或多個環碳原子被雜原子(即非碳原子)如N，O或S取代的芳基。優選的雜芳基包括吡啶基、嘧啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、三唑基、四唑基、喹啉基、異喹啉基、苯並咪唑基、噻唑基、吡唑基和苯並噻唑基。
術語「芳烷基」(或「芳基烷基」)用來表示由帶有芳基的烷基構成的具有7-15個碳原子基團。芳烷基的實例包括苄基、苯乙基、二苯甲基和萘基甲基。
烷基和取代基包含的烷基部分，如芳烷基、烷氧基、芳烷氧基、羥基烷氧基、烷氧-烷氧基、羥基烷硫基、烷氧基烷硫基、烷基醯氧基、羥基烷基和醯氧基，可以是取代或未取代的。取代的烷基具有1-3個各自獨立的選擇性取代基，優選羥基、低級烷氧基、低級烷氧基烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基低級烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基低級雜芳基烷氧基-低級烷氧基、取代或未取代的芳烷氧基、取代或未取代的雜環烷氧基、氫、羧基、低級烷氧羰基、硝基、氨基、單或雙低級烷氨基、二氧戊環、二氧六環、二硫戊環、二硫六環、呋喃、內酯或內醯胺。
取代芳基、取代雜芳基、取代芳烷基都具有1-3個各自獨立的選擇性取代基，優選的是低級烷基、羥基、低級烷氧基、羧基、低級烷氧羰基、硝基、氨基、單或雙低級烷氨基和氫。
與氮原子形成的雜環基包括吡咯烷基、哌啶基、哌啶子基、嗎啉基、嗎啉子基、硫代嗎啉子基、N-甲基哌嗪基、吲哚基、異吲哚基、咪唑基、咪唑啉基、唑啉基、唑基、三唑基、三唑啉基、吡唑基和吡唑啉酮基。與氧原子形成的雜環基包括呋喃、四氫呋喃、吡喃和四氫吡喃基。
「羥基烷基」是帶有羥基的烷基。滷素包括氟、氯、溴和碘。
這裡使用的術語「雜芳烷基」指含有雜原子的芳烷基。術語「氧」表示氧原子的存在。因而，「烷氧基」是由氧原子連接的烷基，「醯氧基」是由氧原子連接的羰基。
術語「雜環烷氧基」指具有連接在烷基部分上的雜環基的烷氧基，術語「芳烷氧基」指具有連接在烷基部分上的芳基的烷氧基。術語「烷基醯氧基」指結構式為-O-C(＝O)-的基團。
這裡使用的術語「烷氧基烷氧基」指在它的烷基部分含有烷氧基的烷氧基。術語「烷氧烷硫基」指在它的烷基部分含有烷氧基的烷硫基(即結構式-S-烷基表示的基團)。術語「羥基烷硫基」指在它的烷基部分含有羥基的烷硫基(即結構式-S-烷基表示的基團)。
這裡使用的術語「單糖」，其習慣含義表示簡單的糖。
這裡使用的術語「胺基酸」，表示含有氨基和羧基的分子。胺基酸的實例包括α-胺基酸，即通式HOOC-CH(NH2)-(側鏈)表示的羧酸。
胺基酸的側鏈包括天然存在和非天然存在的兩部分。非天然存在的胺基酸側鏈是在同類胺基酸中用來取代天然存在的胺基酸側鏈的部分。例如，參閱Lehninger，Biochemistry，第二版，Worth Publishers，Inc，1975，73-75引用於此作為參考。
優選的α-胺基酸包括具有D構型、L構型或作為外消旋的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、穀氨酸和賴氨酸。更有代表性的α-胺基酸的側鏈示於下面表1。
表1CH3-HS-CH2-HO-CH2- HO2C-CH(NH2)-CH2-S-S-CH2-C6H5-CH2-CH3-CH2-HO-C6H4-CH2- CH3-S-CH2-CH2- CH3-CH2-S-CH2-CH2-HO-CH2-CH2-CH3-CH(OH)-HO2C-CH2-NHC(＝O)-CH2- HO2C-CH2-CH2-NH2C(＝O)-CH2-CH2-(CH3)2-CH-(CH3)2-CH-CH2- CH3-CH2-CH2-H2N-CH2-CH2-CH2-H2N-C(＝NH)-NH-CH2-CH2-CH2-H2N-C(＝O)-NH-CH2-CH2-CH2- CH3-CH2-CH(CH3)-CH3-CH2-CH2-CH2-H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-在某些優選的實例中，式II化合物的取代基包括在脫除了羧基的羥基後的胺基酸殘基，即結構式-C(＝O)-CH(NH2)-(側鏈)。
式II化合物上存在的官能團可包括保護基。例如，式II化合物的胺基酸側鏈取代基可由苄氧基羰基或叔丁氧基羰基這樣的保護基取代。保護基在本質上被認為是可選擇性地連接到羥基和羰基等官能團以及從這些官能團上脫除的化學官能團。化合物中存在的這些基團，使這種官能團對化合物所經受的化學反應條件成惰性。任何一種保護基都可用於本發明。這種保護基之一是苄氧羰(Cbz；Z)基。本發明的其他優選保護基可參閱Greene，T.W和Wuts，P.G.M.，「Protective Groupsin Organic Synthesis」，第二版，WileySons，1991。
橋式茚並吡咯並咔唑化合物具有十分重要的功能藥物活性，在許多方面都有用途。這些衍生物可用作治療藥劑。這些化合物的活性對營養因子響應細胞的功能和/或存活顯示正效應。對營養因子響應細胞如神經譜系細胞的功能和/或存活的影響，已利用下述任一試驗進行了驗證(1)培養的脊髓乙醯膽鹼轉移酶(「ChAT」)試驗；或(2)培養的基前腦神經ChAT活性試驗。
這裡所使用的術語「影響」，當用來修飾術語「功能」或「存活」時，指正或負的改變或變化。正效應這裡可能指「增強」或「增加」，負效應這裡可能指「抑制」或「抑制作用」。
這裡所使用的術語「增強」或「增加」，當用來修飾術語「功能」或「存活」時表示，橋式茚並吡咯並咔唑化合物對營養因子響應細胞的功能和/或存活的影響，與不存在該化合物的細胞相比，具有正效應。例如，但並不局限於此，相對於神經元的存活而言，如果被治療的人群比未被治療的人群具有更長的官能度期，與不存在這種化合物的人群膽鹼能神經元相比，該化合物能顯著增加處於死亡危險(如損傷、疾病、退化條件或自然進化)的人群膽鹼能神經元存活期。
這裡所使用的術語「抑制」或「抑制作用」，指在橋式茚並吡咯並咔唑化合物存在下，指定材料的特殊響應(如酶活性)相對減少。
這裡所使用的術語「trk」，指目前包含trkA、trkB和trkC的高親和性的一組神經營養蛋白受體和神經營養蛋白可結合其上的其他膜結合蛋白。
這裡所使用的VEGFR的抑制作用，指在血管發生起重要作用的疾病中的應用，如實體瘤癌症、子宮內膜異位症、糖尿病人的視網膜病、牛皮癬、成血管細胞瘤以及其他眼病和癌症。
Trk的抑制作用，指在前列腺疾病中的應用，如前列腺癌和良性前列腺增生，以及治療炎症痛。
血小板引發的增長因素受體(PDGFR)的抑制作用，指用於各種形式的瘤形成、類風溼關節炎、肺纖維質生成、骨髓纖維質生成、非正常創傷癒合、心血管末端疾病如粥樣硬化、再狹窄(尤指心瓣的)、血管形成術後再狹窄等。
這裡所使用的術語「癌」或「癌性的」，指任何哺乳動物細胞的惡性增生。實例包括前列腺、良性前列腺增生、卵巢、乳房、腦、肺、胰腺、結腸、胃的實體瘤、頭和頸的成神經細胞瘤、腎細胞瘤、淋巴瘤、白血病、其他已識別出的造血系統癌症以及其他已識別的癌症。
這裡所使用的「神經元」、「神經元系細胞」和「神經元細胞」包括但不限於具有單一或複合遞質和/或單一或複合功能的異基因人群神經元類型；優選膽鹼能神經元和感覺神經元。這裡所使用的詞組「膽鹼能神經元」指神經元遞質是乙醯轉移酶的中樞神經系統(CNS)和周圍神經系統(PNS)的神經元；實例是前腦神經元、紋狀體神經元和脊髓神經元。這裡所使用的詞組「感覺神經元」包括皮膚、肌肉和關節對環境條件(如溫度、運動)產生響應的神經元，實例是脊神經節的神經元。
這裡所定義的「營養因子響應細胞」，是包括營養因子可以特別結合其上的受體的細胞；實體包括神經元(如膽鹼能神經元和感覺神經元)和非神經元細胞(如單核細胞和腫瘤性轉化細胞)。
這裡描述的橋式茚並吡咯並咔唑化合物在研究領域和治療領域都能找到用途，例如，抑制酶的活性。例如，在研究領域，該化合物可用來開發某些試驗和方法，以進一步加深對絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸蛋白激酶(如PKC、trk酪氨酸激酶)的抑制作用在相關的失調和疾病的機理方面所起作用的理解。在治療領域，抑制這些酶活性的化合物，可用來抑制這些酶對失調如癌症帶來的有害結果。
像後面的實施例證明的那樣，利用橋式茚並吡咯並咔唑化合物對酶活性的抑制作用可由下面的試驗確定1.trkA酪氨酸激酶活性抑制試驗；2.在所有細胞製備中NGF-摸擬trk磷酸化的抑制作用；3.血管內皮生長因子受體(VEGFR)激酶抑制試驗；4.PKC活性抑制試驗；5.PDGFR活性抑制試驗。
公開的橋式茚並吡咯並咔唑化合物可用來增強哺乳動物如人的神經譜系細胞的功能和/或存活期。在這些應用中，該化合物可單獨使用，或同其他稠合的吡咯並咔唑化合物和/或吲哚並咔唑化合物一起使用，或同其他也能影響所說細胞功能和/或存活期的有益的分子一起使用。
各種各樣的神經紊亂由死亡的、受損的、功能減退的、正遭受軸突退化的、處於死亡危險的神經元細胞所表徵。這些紊亂包括但不限於阿爾茨姆默氏病；運動原神經元紊亂(肌肉萎縮硬化)；帕金森病；腦血管紊亂(如衝程、局部缺血)；杭廷頓氏病；AIDS痴呆；癲癇；多發性硬變；包括糖尿病人神經病在內的外周神經病(如在治療外周神經病的化學療法中影響DRG神經元的那些病)；由興奮性胺基酸引起的疾病；和腦或脊髓的振蕩性或穿透性損傷相關的疾病。
ChAT催化神經元遞質乙醯膽鹼的合成，它被看作是功能膽鹼能神經元的酶標誌。功能神經元也是能存活的。神經元存活通過活的神經元對染料(如鈣黃綠素AM)的特定吸收量和酶轉化量來測試。
這裡描述的化合物，包括由這裡描述的方法鑑定的化合物，由於它們用途的多樣性，在許多領域都可找到應用。這裡化合物可用來開發神經元細胞存活、功能、鑑定的體外摸型，或區分與這裡描述的化合物或由這裡描述的方法鑑定的化合物具有相同活性的其他合成化合物。這裡描述的化合物以及由這裡描述的方法鑑定的化合物，可在研究領域應用，以研究、定義和確定與功能響應相關的分子目標。例如，通過放射性標記橋式茚並吡咯並咔唑化合物或由這裡描述的方法鑑定的化合物，結合特定的細胞功能(如分裂)，該衍生物結合的目標實體可被鑑定、分離、純化以進行表徵。
這裡描述的化合物以及由這裡描述的方法鑑定的化合物，尤其用來不僅增強營養響應細胞的營養因子誘導活性，如膽鹼能神經元，而且還可作為其他神經元細胞的存活保護劑，如多巴胺能神經元或穀氨酸能神經元。通過包括但不限於ras，rac和cdc42在內的小GTP結合蛋白向下遊的信號級聯擴增，生長因子可調節神經元的存活期(Denhardt，Biochem.J.，1996，318，729)。具體地說，ras的活性導致磷酸化和胞外受體活化激酶(ERK)的活化，這同生物生長過程和微分過程相聯繫。rac和cdc42的刺激作用導致NJK和p38活性以及同脅迫、編程性細胞死亡和炎症相關的響應的增加。雖然生長因子響應主要是通過ERK路線，但後面這些過程的影響，可導致摸擬增強存活性生長因子的神經元存活機理的改變(Xia等，Science，1995，270，1326)。該化合物還可作為神經元細胞和非神經元細胞的存活保護劑，這是通過與生長因子平均存活相關的機理，但不同於該機理而實現的，例如，由抑制編程性細胞死亡過程可導致存活的JNK和p38路線的抑制作用。
本發明的化合物可用來治療與ChAT活性減少或死亡以及脊髓運動神經元損傷相關的疾病，還可用於內部和周圍神經元系統、免疫系統的編程性細胞死亡相關的疾病以及炎症疾病。
本發明的化合物還可用來治療涉及癌細胞增殖的疾病，如各種癌症。
這裡描述的化合物以及由本發明的方法鑑定的化合物的藥用鹽，包括藥用的酸加成鹽、金屬鹽、氨鹽、有機胺加成鹽和胺基酸加成鹽。酸加成鹽的實例有無機酸加成鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽，以及有機酸加成鹽如乙酸鹽、馬來酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽和乳酸鹽；金屬鹽的實例有鹼金屬鹽如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽，鹼土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽、鋁鹽和鋅鹽；銨鹽的實例有銨鹽和四甲基銨鹽；有機胺加成鹽的實例有同嗎啉和哌啶加成的鹽；胺基酸加成鹽的實例有同甘氨酸、苯丙氨酸、穀氨酸和賴氨酸加成的鹽。
這裡提供的化合物，包括由本發明的方法鑑定的化合物，通過與藥用可接受的賦形劑和載體混合，可配製成藥用組合物。這些組合物可製備成不經腸給藥的用劑，特別是溶液或懸浮液；可製備成口服給藥的用劑，特別是丸劑或膠囊；可製備成鼻內給藥的用劑，特別是粉劑、鼻滴劑或煙霧劑；可製備成經皮膚給藥的用劑，例如，經皮膚的膜片劑。
該組合物可以單劑量的形式常規給藥，可由藥物領域內眾所周知的任何方法製備，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(MarkPub.Co.，Easton，PA，1980)內描述的方法。不經腸給藥的製劑可含有普通的賦形劑，如無菌水或鹽水、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、油和菜油、氫化萘等。特別是，生物可適應的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是可用作控制活性化合物釋放的賦形劑。這些活性化合物的其他潛在有用的不經腸的輸送系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、反滲透泵、可植入的注入系統和脂質體。吸入給藥的製劑作為賦形劑包含的有乳糖，或是包含如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或作為鼻滴劑形式給藥的油性溶液，或作用凝膠經鼻內使用。不經腸給藥的製劑還可包含頰給藥用甘膽酸鹽、直腸給藥用水楊酸鹽或陰道給藥用檸檬酸。經皮膚膜片劑優選親油性乳化液。
本發明的化合物在藥用組合物中可作為單一活性劑使用。另外，它們可同其他活性組分一塊使用，如其他有助於病人或失調者神經元存活或軸突再生的生長因子。
本發明的化合物及其藥用鹽可口服或非口服，如軟膏劑和注射劑。本發明的化合物在治療組合物中的濃度是可變化。其濃度將取決於所服藥的總劑量、所用化合物的化學特性(如疏水性)、服藥的方式、病人的年齡、體重和症狀等。本發明的化合物一般是提供包含大約0.1-10％w/v為非腸道給藥化合物的生理緩衝水溶液。一般的劑量範圍從大約1μg/kg到大約1g/kg體重/每天；優選的劑量範圍從大約0.01mg/kg到大約100mg/kg體重/每天，更優選大約0.1-20mg/kg，每天1-4次服用。服藥的優選劑量似乎取決於很多因素，如疾病或失調的類型和發展程度、具體病人的總的健康狀況、所選擇化合物的相對生物有效性、化合物賦形劑的配製和服用的方式。
本發明的化合物，包括試驗化合物和由本發明的方法鑑定化合物，及其藥用鹽，依照藥理活性和服用的目的，可單獨服用，也可以各種藥用組合物的形式服用。本發明的藥用組合物可通過均勻混合作為活性組分的有效量的化合物或其藥用鹽同藥用載體來製備。根據適於服用的組合物的各種形式，載體可從很寬的範圍選取。製備成適合於口服或非口服的單劑形式的那些藥用組合物是所希望的。非口服的製劑包括膏劑和針劑。
片劑可按照常規方法利用賦形劑如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和甲基纖維素；分散劑如澱粉、藻酸鈉、羧基甲基纖維素鈣和晶態纖維素；潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石；粘合劑如明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素和甲基纖維素；表面活性劑如蔗糖脂肪酸酯和山梨醇脂肪酸酯等來製備。優選每片劑包含15-300mg的活性組分。
粒劑可按照常規方法利用賦形劑如乳糖、蔗糖、分散劑如澱粉、粘合劑如明膠等來製備。粉粒可按照常規方法利用賦形劑如乳糖、甘露糖醇等來製備。膠囊劑可按照常規方法利用明膠、水、蔗糖、阿拉伯樹膠、山梨醇、甘油、晶態纖維素、硬脂酸鎂和滑石等來製備。優選每粒膠囊包含15-300mg的活性組分。
糖漿製劑可按照常規方法利用糖如蔗糖、水、乙醇等來製備。
膏劑可按照常規方法利用膏劑基料如凡石林、液體石臘、羊毛脂和大粒凝膠；乳化劑如十二烷基乳酸鈉、苯札氯銨、脫水山梨醇單脂肪酸酯、羧基甲基纖維素鈉和阿拉伯樹膠等來製備。
針劑可按照常規方法利用溶劑如水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇；增溶劑如苯甲酸鈉、水楊酸鈉和尿烷；等滲劑如氯化鈉、葡萄糖；防腐劑如酚、苯甲酚、對羥基苯甲酸酯和氯化丁醇；抗氧化劑如抗壞血酸和焦亞硫酸鈉等來製備。
本發明由下述用來解釋本發明的實施例進一步說明。這些實施例不是要限制本發明的範圍，也不構成對本發明範圍的限制。
實施例實施例1合成方法和實施例概述為製備本發明式II表示橋式茚並吡咯並咔唑化合物所採用的一般合成路線示於圖1和2。茚並吡咯並咔唑(III)/(XIII)合成的一般程序可按美國專利No.5,705,511中描述的方法進行，其公開內容特此引用以全面參考。當R1是H時，茚並吡咯並咔唑(III)/(VIII)的內醯胺氮由導致(IV)/(X)的適當的保護基保護。將該被保護的化合物用合適的鹼在無水有機溶劑中處理，就產生被認為是碳負離子的暗紅色溶液。碳負離子同雙功能試劑(V)反應，導致親電加成到(V)的C＝Y鍵上，形成初始中間體(VI)/(X)。用磺酸或路易斯酸如三氟化硼乙醚合物處理中間體(VI)/(X)和/或(VII)/(XI)，就得到橋式茚並吡咯並咔唑(I)/(II)。
內醯胺氮保護方法(示於圖3和4)可由酸或鹼催化法進行。酸催化反應可由能夠把茚並吡咯並咔唑(III)/(VIII)固定在聚合物載體上的樹脂結合試劑，如聚苯乙烯基的Rink酸樹脂(XII)(圖3)進行，由此得到(XIII)。另外，酸催化反應可由可溶性試劑進行，得到化合物(XIV)(圖4)。矽烷基保護的化合物(XV)由鹼催化製備(圖4)。
圖5描述了幾種製備中間體(V)的方法。方法(a)描述的是各種縮醛(XVI)向(XVII，Z＝鍵)的轉化。例如，酯-縮醛/縮酮(XVI，D＝COOR)完全被還原成相應的醇，接著被氧化(例如，Swern or Dess-Martin氧化)為醛-縮醛/縮酮(XVII，R8＝H)。另外，酯-縮醛/縮酮(XVI，D＝COOR)部分由DIBAL還原，直接得到醛(XVII，R8＝H)。同樣，腈-縮醛(XVI，D＝CN)由DIBAL還原，給出醛(XVII，R8＝H)。氧代-縮醛/縮酮通過把格利雅試劑加入到Weinreb胺-縮醛/縮酮(XVI，D＝CON(OMe)Me)中而製備。
中間體(XVII，Z＝鍵)還可通過方法(b)概述的兩步法製備。有機金屬試劑(XIX)加入到縮醛/縮酮(XVIII)中得到烯(XX)，臭氧分解後再進行還原反應分離，得到縮醛/縮酮(XVII)。中間體(XVII，Z＝雜原子)的兩步法製備概述於方法(c)。偶聯縮醛(XXII)與烯(XXI)，接著臭氧分解(用還原劑)所得到的烯；得到氧代-縮醛/縮酮(XVII)。另外，中間體(XVII，Z＝雜原子)由方法(d)概述的兩步法製備。化合物(XXIV)與縮醛/縮酮(XVIII)反應給出(XXV)，再由方法(a)描述的方法轉化為氧代-縮醛/縮酮(XVII)。氧代-縮醛/縮酮(XVII)與羥基胺、肼、N-烷基-N-烷氧基胺和胺縮合，給出親電性C＝N功能基的中間體(XXVI)。
樹脂結合的茚並吡咯並咔唑(XIII)(圖6，方法A)用過量的作為鹼的格利雅試劑處理，結果產生暗紅色的負碳離子溶液。接著與(V)反應，得到親電加成到C＝Y基上的產品。用稀酸(1％TFA在二氯甲烷中)使該產品從其樹脂上分離淨化，就分離出化合物(XXVII)和/或(XXVIII)。用磺酸或路易斯酸如三氟化硼醚合物處理中間體(XXVII)和/或(XVVIII)，得到橋式茚並吡咯並咔唑(II)。
類似的方法被用於可溶性內醯胺保護的中間體，如(XV)(圖7，方法B)。但是，在這種情況，中間體(XV)是用在吡啶中的氫氧化四烴銨(Triton B)作為鹼來處理，而不是用格利雅試劑。中間體(XXIX)和/或(XXX)可同內醯胺保護的接觸而分離出來，它們適合於用色譜法純化。如方法A，(圖6)，用路易斯酸(如三氟化硼醚合物)，就得到橋式茚並吡咯並咔唑(II)，其中R1＝H。
引入基團R3，R4，R5and R6可照美國專利Nos.5,705.511和4,923,986中描述的方法進行，整體引入其公開內容以供參考。R3取代基可在構成橋式茚並吡咯並咔唑後另外引入，如圖8所示。B環的3位置由NBS溴化就得到化合物(XXXI)。碳片斷通過利用鈀催化的Stille，Suzuki，Heck，Kumada或Castro-Stephens反應隨後引入，得到(XXXII)，(XXXIII)等類型的化合物。此外，化合物(XXXI)可利用溴被雜原子取代的化合物，如胺作基礎的基團，由Buchwald′s鈀催化的銨中和反應製備。
通過氧化方法，氧連接基可在E環的茚碳上引入，如圖9所示的化合物(XXXIV)。這個化學反應還可導致內醯胺(A環)亞甲基的氧化，得到亞胺衍生物，如所示。
實施例2Rink樹脂結合的中間體(XIII-A)，(XIII-B)和(XIII-C)的製備，(圖3)實施例2A在裝備有塔頂機械攪拌器和Dean-Stark阱的三頸圓底燒瓶中順序加入Rink酸樹脂XII(10.00g，0.64mmol/g)，1-甲基-2-吡咯烷酮(80mL)，苯(350mL)，VIII-A(A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H))(3.00g)和對甲苯磺酸(1.00g)。該反應混合物被加熱到回流20小時，而後過濾。樹脂用THF(5×175mL)過濾，濾液放置一邊。而後樹脂順序用DMSO(4×100mL)，2％NaHCO3水溶液(4×100mL)，水(4×100mL)，DMSO(2×200mL)，THF(4×100mL)和乙酸乙酯(4×100mL)洗滌。使樹脂真空乾燥(24小時)，得到11.70(0.47mmol/g)樹脂結合的VIII-A，(XIII-A)。
蒸發第一次的THF洗滌液，殘留物用水(750mL)洗滌，過濾所得沉澱，再順序用水2％NaHCO3水溶液(4×100mL)和水(4×100mL)洗滌。真空乾燥後重新獲得VIII-A(1.28g)。
實施例2-B按照類似的方法，將VIII-B(A1，A2＝O，B1，B2＝H2，R3＝R4＝R5＝R6＝H)(0.5g)偶聯到Rink酸樹脂XII(1.52g)上，得到1.58g樹脂結合的VIII-B，(XIII-B)。
實施例2-C按類似的方法，將VIII-C(A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝H，R6＝10-OMe)(1.02g)偶聯到Rink酸樹脂XII(3.12g)上，得到3.70g(0.46mmol/g)樹脂結合的VIII-C，(XIII-C)以及重新獲得的VIII-C(0.44g)。
實施例3化合物(II-1)，(II-2)，(II-3)，(II-4a)，(II-4b)，(II-6)和(II-8)的製備(方法A，圖6)向(XIII-A)(1.25g)在THF(24mL)懸浮液加入1.0M的EtMgBr(6.25mL在THF)溶液，反應混合物在加入HMPA(5.0mL)之前攪拌1小時。攪拌10分鐘後，加入二乙氧基丁醛(3.0g)(按照Paquette等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，9662-71文獻中的方法製備)，該反應攪拌20小時。反應用10％NH4Cl(5mL)水溶液淬滅，並過濾。該樹脂連續用10％NH4Cl(3×10mL)水溶液，水(3×10mL)，THF(3×10mL)，DMF(3×10mL)，水(3×10mL)，THF(3×10mL)，和乙醚(3×10mL)洗滌。再將該樹脂真空乾燥，溶解在二氯甲烷(15mL)中，用三氟乙酸(0.15mL)處理。攪拌1小時後，過濾反應物，蒸發濾液。所得到的殘留物溶解在二氯甲烷(20mL)中，並用吡啶甲苯磺酸鹽(50mg)處理，將所得溶液攪拌4小時。這時用飽和的NaHCO3水溶液和鹽水洗滌反應物，用MgSO4乾燥。
過濾和蒸發溶劑後，殘留物用製備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，由60％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當的餾分用NaHCO3中和並萃取到二氯甲烷(3×50mL)中，MgSO4乾燥。過濾和蒸發溶劑後，得到70.2mg的化合物II-1，為白色粉末，具有以下特性13CNMR(DMSO 171.8，143.3，142.4，141.4，140.1，140.0，136.6，129.2，127.9，127.4，127.1，126.8，124.1(2C)，122.7，121.6，121.5，118.3，112.1，88.1，79.2，56.6，45.6，33.4，24.8；1H NMR(DMSO-d6)d 9.21(d，J＝7.5，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.86(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.3，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.41(dd，J＝7.5，7.4，1H)，7.36-7.27(m，2H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.91(s，2H)，4.53(d，J＝3.3，1H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)計算值379，實測值379。
化合物II-2(0.5mg)也可由該反應混合物用製備性HPLC分離得到，具有以下的特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.17(d，J＝8.1，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.0，1H)，7.85(d，J＝6.8，1H)，7.57(d，J＝6.8，1H)，7.49(dd，J＝7.9，7.4，1H)，7.44-7.26(m，3H)，6.81(d，J＝6.0，1H)，5.43-5.33(m，1H)，4.43(s，2H)，2.23-2.14(m，1H)，1.96-1.92(m，1H)，1.45-1.55(m，2H)，0.96-0.88(m，1H)，0.60-0.57(m，1H)，0.29(t，J＝7.0，3H)；MS m/z(M+H)計算值407，實測值407。
實施例3-B按照同樣的方法，像上面製備化合物II-1描述的那樣，樹脂(XIII-A)(70.3 25mg)用1，1-二乙氧基-2-戊酮(0.75mL)(按照Sworin等，J.Org.Chem.，1988，53，4894-6文獻中的方法製備)處理，得到化合物II-3(3.5mg)，由製備性TLC(矽膠，用50％EtOAc/甲苯洗脫)分離，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.42(d，J＝8.2，1H)，8.58(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.79(d，J＝8.3，1H)，7.71(d，J＝7.1)，7.50-7.20(m，4H)，6.81(d，J＝5.9，1H)，4.90(s，2H)，4.46(s，1H)，2.35-2.20(m，1H)，1.98(s，3H)，1.75-1.60(m，1H)，1.25-1.00(m，1H)，0.35-0.15(m，1H)；MS m/z(M+H)計算值393，實測值393。
實施例3-C按照同樣的方法，(XIII-A)(74.3mg)用1，1-二乙氧基-2-己酮(按照Brenner，J.org.Chem.1961，26.22-7文獻中的方法製備)(0.75mL)處理，得到化合物II-4a(2.10mg)和化合物II-4b(1.06mg)，分別由製備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離。化合物II-4a具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.30(d，J＝8.3，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，J＝7.2，1H)，7.65(d，J＝8.5，1H)，7.59(d，J＝7.5)，7.48(dd，J＝7.8，7.2，1H)，7.39-7.15(m，3H)，6.31(dd，J＝5.9，5.5，1H)，5.02(s，1H)，4.88(s，2H)，0.88(s，3H)其他脂族訊號在溶劑峰下損失；MS m/z(M+H)計算值407，實測值407.化合物II-4b具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.43(d，J＝8.1，1H)，8.59(s，1)，7.99(d，J＝7.3，1H)，7.75-7.65(m，2H)，7.49(dd，J＝7.0，6.4，1H)，7.43(dd，J＝8.2，8.1，1H)，7.36-7.25(m，2H)，6.75(s，1H)，4.91(s，2H)，4.50(s，1H)，1.95(s，3H)其他脂族訊號在溶劑峰下損失；MS m/z(M+H)計算值407，實測值407.
實施例3-D按照同樣的方法，(XIII-C)(1.00g)用二乙氧基丁醛(3.65g)處理，得到化合物II-6(87.8mg)，由製備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離。具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝8.6，1H)，8.60(s，1H)，7.95(d，J＝7.4，1H)，7.84(d，J＝8.3，1H)，7.47(dd，J＝7.2，7.0，1H)，7.35(s，1H)，7.29(dd，J＝7.0，7.0，1H)，6.98(dd，J＝8.6，1.9，1H)，6.83(d，J＝6.0，1H)，5.65-5.55(m，1H)，4.88(s，2H)，4.48(d，J＝3.9，1H)，3.82(s，3H)，225-2.10(m，1H)，2.08-1.85(m，1H)，0.96-0.75(m，1H)，0.65-0.50(m，1H)；MS m/z(M+Na)計算值431，實測值431。
實施例3-E按照同樣的方法，樹脂(XIII-B)(153.2mg)用二乙氧基丁醛(1.5mL)處理，得到化合物II-8(3.6mg)，由製備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)分離。具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.09(d，J＝7,9，1H)，8.81(s，1H)，7.81-7.73(m，3H)，7.48-7.35(m，3H)，7.24(dd，J＝7.6，7.5，1H)，6.85(d，J＝6.2，1H)，5.63-5.59(m，1H)，4.86(s，2H)，4.61(d，J＝3.6，1H)，3.82(s，3H)，2.21-2.13(m，1H)，1.96-1.90(m，1H)，0.87-0.79(m，1H)，0.61-0.56(m，1H)；MS m/z(M+H)計算值379，實測值379.
實施例4化合物II-7a and I1-7b製備(方法A，圖6)實施例4A(1，1-二乙氧基乙氧基)丙酮的製備向冷的(0℃)NaH(2.68g，60％)在THF(150mL)懸浮液加入在THF(20mL)中的1，1-二乙氧基乙醇(按照Zirkie等，J.Org.Chem.，1961，26，395-407文獻中的方法製備)(9.00g)，在加入二氯甲烷(8.0mL)前使該反應混合物在室溫下攪拌1小時。將該反應混合物加熱到回流過液，冷卻，通過塞裡塑料管塞過濾。旋轉蒸發除去溶劑，殘留物由柱色譜法純化(矽膠，20％乙醚/己烷)，得到1，1-二乙氧基乙基甲代烯丙基醚(11.5g，90％)。對該醚(6.00g)在EtOAc(80mL)中冷卻了的(-30℃)溶液進行臭氧分解，至到起始原料不能被TLC(1小時)檢出止。這時，反應物用氧清洗，用Pd(OH)2(150mg)處理，在氫氣氛下攪拌過夜。濾除催化劑，濾液由旋轉蒸發濃縮。所得到的殘留物用柱色譜法純化(矽膠，20％EtOAc/己烷)，得到標題化合物(4.53g，82％)。
實施例4-B按照方法A(圖6)，樹脂(XllI-A)(230.2mg)用EtMgBr(1.25mL)處理，而後用(1，1-二乙氧基乙氧基)丙酮(實施例3-A)(1.2mL)處理。在從樹脂上分離淨化後，將一部分粗反應產物混合物(10.5mg)溶解在二氯甲烷(20μL)中，並用BF3醚合物(20μL)處理。在攪拌2.5小時後，該溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，而後用MgSO4乾燥。在過濾並蒸除溶劑後，殘留物用製備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)淨化，得到化合物II-7a(2.34mg)和化合物II-7b(1.34mg)。化合物II-7a具有以下特性1H NMR(CDCl3)δ9.35-9.20(m，1H)，7.87(d，J＝7.6，1H)，7.62(d，J＝7.0，1H)，7.60-7.45(m，1H)，7.49(dd，J＝7.7，7.5，1H)，7.40(d，J＝8.1，1H)，7.37-7.26(m，3H)，6.22(s，1H)，5.20-4.85(m，1H)，4.47(s，1H)，3.67(d，J＝12.7，1H)3.52(d，J＝11.8，1H)，3.40(d，J＝12.7，1H)，3.38(d，J＝11.8，1H)，1.91(s，3H)；MS m/z(M+H)計算值409，實測值409。化合物II-7b具有以下特性1H NMR(CDCl3)δ9.58-9.22(m，1H)，7.82(d，J＝7.4，1H)，7.60-7.40(m，3H)，7.37-7.27(m，3H)，7.21(d，J＝8.1，1H)，5.81(s，1H)，5.21(s，1H)，5.10-4.80(m，1H)，4.59(d，J＝13.5，1H)，4.38(dd，J＝13.5，5.3，1H)，4.21(d，J＝13.1，1H)，3.82(d，J＝13.2，1H)，1.13(s，3H)；MS m/z(M+H)計算值409，實測值409。
實施例5化合物II-5的製備(圖8)向化合物II-1(8.1mg)在THF(2mL)中的溶液加入NBS(4.6mg)，使反應攪拌過夜。加入另外的NBS(4.5mg)使該反應攪拌2.5小時。濾除不溶物，濾液由旋轉蒸發濃縮。所得到的殘留物用柱色譜法純化(C-18，65％MeCN/水wI 0.1％三氟乙酸)。適當的餾分用NaHCO3中和，並萃取到二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4乾燥。過濾並蒸除溶劑後，得到化合物II-5(5.1mg)，白色粉末，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.4，1H)，8.67(s，1H)，8.14(s，1H)，7.86(d，J＝8.7，1H)，7.72(d，J＝7.0，1H)，7.63(d，J＝7.8，1H)，7.42(dd，J＝7.5，7.3，1H)，7.35(dd，J＝7.3，7.2，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.94(s，2H)，4.54(d，J＝3.1，1H)，2.30-2.14(m，1H)，2.00-1.82(m，1H)，0.96-0.88(m，1H)，0.62-0.50(m，1H)；MS m/z(M+H)計算值457/9(1∶1)，實測值457/9(1∶1)。
實施例6中間體XV的製備(圖4)向VIII-A[A1，A2＝H2，B1，B2＝O，R3＝R4＝R5＝R6＝H)](1.05g)在DMF(25ml)中的溶液加入三乙胺(0.75mL)和氯代叔丁基二甲基矽(TBS-Cl)(0.65g)。攪拌3小時後，該反應用飽和NaHCO3淬火，並萃取到EtOAc中。有機層用水和鹽水洗滌，用MgSO4乾燥。在過濾蒸出溶劑後，所得到的殘留物用乙醚研製，得到化合物XV(848mg)。洗滌液蒸發留下殘留物，用柱色譜法純化(矽膠，1％EtOAc/CH2CI2)，得到另一份產品(502mg，結合產率94％)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ11.94(s，1H)，9.32(d，J＝7.6，1H)，8.03(d，J＝7.7，1H)，7.64(d，J＝7.2，1H)，7.58(d，J＝8.1，1H)，7.44(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.39(dd，J＝7.7，7.6，1H)，7.32(d，J＝7.3，1H)，7.25(dd，J＝7.6，7.3，1H)，5.00(s，2H)，4.14(s，2H)，0.99(s，9H)，0.46(s，6H)；MS m/z(M+H)計算值425，實測值425。
實施例7由方法B製備化合物II-1(圖7)Triton B在吡啶(0.45M)中的溶液通過在吡啶(10mL)中溶解40％的Triton B甲醇溶液(10mL)而製備。減壓(20mm Hg)排除溶劑到最後剩8mL。殘留物由吡啶稀釋到50mL，在氮氣氛下過濾保存。XV(20.3mg)在吡啶(2.0mL)的溶液用氬氣清洗，用300μL的TritonB(0.45M在吡啶中)和二乙氧基丁醛(50μL)處理。在攪拌2小時後，將反應物萃取到EtOAc中，用1N的HCl水溶液、鹽水洗滌，MgSO4乾燥。過濾並蒸出溶劑，加成物溶解在CH2Cl2(10mL)，用BF3醚合物(10mL)處理。在攪拌2小時後，該溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，而後MgSO4乾燥。由旋轉蒸發排除溶劑，得到的殘留物用製備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，65％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當的餾分用NaHCO3中和，並萃取到中二氯甲烷(3×20mlL)中，並用MgSO4乾燥。過濾蒸出溶劑後，得到II-1(11.8mg，產率65％)，其1HNMR和MS光譜以及HPLC保留時間同由實施例3-A描述的方法A製備和分離的產品相同。
實施例8化合物II-9的製備(圖8)向溴代化合物II-5(6.2mg)在1-丙醇(4.0mL)中的溶液加入3-氨基苯基硼酸(3.8mg)。攪拌0.25小時後，順序加入Pd(OAc)2(2.0mg)，Ph3P(4.8mg)，Na2CO3(2.8mg)，and水(2.0mL)。將該混合物加熱回流0.75小時，冷卻，萃取到CH，Cl2中，用水和鹽水洗滌。有機層用MgSO4乾燥，旋轉蒸發排除溶劑，得到的殘留物用製備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，50％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當的餾分用NaHCO3中和，並萃取到中二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4乾燥。過濾蒸出溶劑後，得到II-9(3.1mg，產率49％)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.22(d，J＝7.5，1H)，8.66(s，1H)，8.00-7.25(m，8H)，7.12(dd，J＝7.1，7.0，1H)，6.95-6.80(m，3H)，6.53(d，J＝6.0，1H)，5.63-5.58(m，1H)，4.99(s，2H)，4.55(s，1H)，2.25-2.10(m，1H)，1.95-1.90(m，1H)，0.98-0.88(m，1H)，0.65-0.57(m，1H)；MS m/z(M+H)計算值470，實測值470。
實施例9化合物II-10的製備(圖9)向化合物II-1(5.0mg)在DM50(1mL)中的溶液加入NaCN(4.3mg)，反應混合物加熱到145℃1小時。使該混合物冷卻，萃取到EtOAc，用水(3×20mL)和鹽水洗滌。有機層用MgSO4乾燥，過濾蒸發，得到的殘留物用製備性HPLC(Zorbax RX-8，2.5×25cm，55％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)純化。適當的餾分用NaHCO3中和，並萃取到二氯甲烷(3×20mL)中，用MgSO4乾燥。過濾蒸出溶劑後，得到II-10(2.7mg，產率50％)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ11.4(s，1H)，8.86(d，J＝7.9，1H)，8.79(d，J＝7.6，1H)，7.90(d，J＝8.3，1H)，7.62-7.55(m，2H)，7.49(dd，J＝7.6，7.4，3H)，7.40(dd，J＝7.4，7.31H)，7.35(dd，J＝7.5，7.4，1H)，6.86(d，J＝6.0，1H)，6.03(s，1H)，5.40-5.30(m，1H)，2.25-2.14(m，1H)，2.03-1.90(m，1H)，1.10-0.98(m，1H)，0.82-0.77(m，1H)。
實施例10化合物II-11的製備(方法A，圖6)按照方法A，樹脂(XIIIa)(150.2mg)同EtMgBr(1.0mL)反應，接著用2，5-二氧代戊酸乙酯(Schmidt等，Synthesis，1993，809)(1.5mL)處理。在與樹脂分離淨化後，將粗反應產物混合物溶解在二氯甲烷(20mL)中，並用BF3醚合物(20μL)處理。在攪拌2.5小時後，該溶液用飽和NaHCO3水溶液和鹽水洗滌，而後用MgSO4乾燥。在過濾除去溶劑後，殘留物用製備性HPLC(Zorbax RX-8，4×25cm，55-57％MeCN/水w/0.1％三氟乙酸)淨化，得到化合物II-11(6.4mg)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.36(d，J＝7.7，1H)，8.68(s，1H)，8.00(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.3，1H)，7.58-7.15(m，5H)，6.97(d，J＝5.9，1H)，4.93(s，2H)，4.82(s，1H)，4.48(q，J＝7.1，2H)，2.42-1.91(m，2H)，1.37(t，3H，J＝7.1)，1.25-0.63(m，2H)。
實施例11化合物II-12的製備化合物II-11(3.4mg)在THF(2mL)中的溶液用2M的LiBH4溶液(1.0mL在THF中)處理，使該反應攪拌1小時。加入IN的HCI(4mL)水溶液使反應淬火。在攪拌20分鐘後，加入10％NaOH水溶液(15mL)，並將該混合物萃取到二氯甲烷(3×10mL)中。用MgSO4乾燥後，過濾反應混合物，蒸出溶劑，得到化合物II-12(0.32mg)，具有以下特性1H NMR(DMSO-d6)δ9.35(d，J＝7.7，1H)，8.62(s，1H)，7.98(d，J＝7.7，1H)，7.83(d，J＝8.2，1H)，7.75(d，J＝8.2，1H)，7.50-7.25(m，4H)，6.84(d，J＝7.7，1H)，6.11(s，1H)，4.91(s，2H)，4.71(s，1H)，4.50-4.40(m，1H)，4.30-4.20(m，1H)2.42-1.91(m，2H)，1.25-0.63(m，2H)；MS m/z(M+H)計算值.409，實測值409。
實施例12脊髓ChAT活性的增加ChAT是功能性膽鹼能神經元的特定標記物。膽鹼能神經元表示輸入海馬趾結構、嗅覺神經核、腳間核、皮質、扁桃體和部分背側丘腦的主要膽鹼能。在脊髓中，運動神經元是含有ChAT的運動神經元(Phelps等人，J.Comp.NeuroL，1988，273，459-472)。ChAT活性用於研究神經營養因子(例如，NGF或NT-3)對膽鹼能神經元的存活和/或功能的影響。ChAT試驗也用作調整膽鹼能神經元內ChAT水平的指示。
方法分離出大鼠胎兒脊髓細胞，試驗按Smith等人，J.CellBiology，1985，101，1608-1621；Glicksman等人，J.Neurochem.，1993，61，210-221所述的方法進行。用標準的胰蛋白酶技術(Smith等人，見上文)，由大鼠(14-15天的胚胎)分割出來的脊髓製備分離的細胞。在多鳥氨酸塗覆的塑料組織培養皿上，在補充了0.05％牛血清白蛋白(BSA)的無血清N2介質(Bottenstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1979，76，514-517)中，以6×105細胞/cm2進行平板培養。培養物在37℃，於潮溼的5％CO2/95％空氣氣氛中孵化48小時。2天後，用改進的Fonnum方法(Fonnum，Neurochem.，1975，24，407-409)，按照McManaman等人和Glicksman等人的方法(McManaman等人，Develop.Biol.，1988，125，311-320；Glicksman等人，J.Neurochem..見上文)，進行ChAT活性的體外測定。
實施例所述式II化合物列於表2，其中R1、R4、R6和R7是H；Y是O；和n是1。
表2

實施例13pCDNA-3-EE-MLK3，pcDNA3-EE-MLK(K144R)MLK 3如文獻所述克隆(Lee等人，Oncogene，1993，8，3403-3410；Ezoc等人，Oncogene.1994，9，935-938)。由200ng聚腺苷酸鹽黑素細胞mRNA製備cDNA，用5％反應液作為擴增PTK cDNAs所有組成成分的模板，使用由保存的下述PTKs的VIb和IX子域的共有序列衍生的2或4種高簡併的寡核苷酸引物PTK1，5′-CGGATCCACMGIGAYYT-3′(SEQ ID NO1)；PTK2，5′-GGAATTCCAWAGGACCASACRTC-3′(SEQ ID NO2)；PTK3，5′-CGGATCCRTICAYMGIGAYYTIGCIGCIMGIAA-3′(SEQ ID NO3)；PTK4，5′-GGAATTIAYIGGAWAIGWCCAIACRTCISW-3′(SEQ ID NO4)。用Taq DNA聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer/Cetus)和DNA自動熱循環物，使PCR進行40個循環，每個循環在94℃進行40秒，在37℃進行2分鐘，和在63℃進行3分鐘。將8種PCRs產物置於池中，用DNA聚合酶(Kienow)處理，用BamH1加上EcoR1分離以及在5％聚丙醯胺凝膠中進行電泳操作。溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶染色鑑定出佔優勢的200-230bp帶，將其酶切開、洗滌和克隆到M 13mp18。在一實施方案中，不把部分PCR擴增的cDNA分開，而是直接克隆到用Smal分開的M13mp18。用鏈-終止的測序方法測定核苷酸序列。
鑑定為PTK1的一種cDNA可用作探針，以篩選人體黑色素瘤和黑素細胞cDNA文庫。定義為PTK1-3.2的克隆體，包括2541n完全開放的讀框，847個胺基酸編碼。此cDNA用Ncol酶切開，用DNA聚合酶(Kienow)鈍化，再用EcoR1酶切開和載體pCDNA3-EE連接，以BamH1酶切開，鈍化和用EcoR1酶切。通過在HindIII/BamH1位點插入寡核苷酸構成載體PCDNA3-EE，寡核苷酸編碼起始密碼子隨後是EE抗原表位，MEEEEYMPME(SEQ ID NO5)(Gmssenmeyer，等人，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1985，82，7952-7954)。應用以前已經公開的方法(Chen等人，Biotechniques，1994，17，657-59)，通過用PCR製備K144R突變體來製備MLK3的激酶死亡模型。第一種誘導有機體突變的寡核苷酸是5′-GTGGCTGTGCGGGCAGCTCGCCAG-3′(SEQ ID NO6)，以及第二種寡核苷酸是5′-GAGACCCTGGATCTCGCGCTT-3′(SEQ ID NO7)。用MLK3作為模板，這些寡核苷酸被用於PCR，以產生806鹼基對片段，在第二PCR反應中使用T7引物作為其它擴增引物，用MLK3作為模板可產生1285鹼基對片段。用瓊脂糖凝膠電泳分離片段，克隆至pGEM-5(Promega)和測序。所述片段以HindIII和Hpal酶切開，並插入到用Hind III和HpaI切開的pCADA3-EE-MLK3。在核苷酸1342測出另外的點突變。為了進行校正，由野生型MLK3上酶切下Pf1M1片段(nt 1093-1418)，並用來代替KI44R突變的MLK3片段。
實施例14pFB-FLAG-MLK3為了得到MLK3蛋白，將cDNA克隆成為杆狀病毒表達的載體pFB-FLAG。通過用Nco 1消化由PTK1-3.2上酶切下MLK3，用DNA聚合酶(Kienow)鈍化，再用Not 1酶酶切，和用Stul和Noti消化的pFB-FLAG連接。pFB-FLAG由pFB衍生而來(Life Technologies)，並具有FLAG表位編碼序列(Hopp等人，Biotechnology，1988，6，1205-1210)，起始密碼子是MDYKDDDDK(SEQ D NO8)，再加上在BamH1位點的多接頭。
實施例15pFB-GST-MLK3(KD)用EcoR1和Xhol由pGEXKG-MLK3(KD)上酶切下MLK3片段得到MLK3激酶區的杆狀病毒表達，並使其和用EcoR1和Xhol酶切下的pFB載體結合，其中谷光甘肽5-轉移酶(GST)的編碼序列被向上遊克隆。這可用載體為模板，通過得到GST的編碼序列和用PCR，由pGEXKG載體的多接頭來實現(Guan等人，Anal.Bioch.，1991，192，262-267)。為得到PCR，5′寡核苷酸可製成在片段的5′端基為Bg12的限制酶酶切位點。然後，將此分離的片段用Bg12和HinD3消化，並和用BamH1及HinD3消化的pFB連接。
實施例16pGEXKG-MLK3(KD)通過用PTK1 cDNA的PCR，可以得到包括有MLK3激酶區和有部分亮氨酸拉鏈(nt 736-1791)兩部分的cDNA片段。分離的片段用限制酶EcoR1和Xho 1消化，位點包括在PCR寡核苷酸中，和克隆至用EcoR1和Xho 1消化的pGEX-KG。然後將在pGEX-KG上的此片段用PCR縮短，以便只含有激酶區(nt 736-1638)。
實施例17pKH3-MLK3，pKH3-MLK3(KA)用簡併的PCR克隆MLK2(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710；Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1995，234，492-500)。在上皮腫瘤細胞系Colo16中表達的cDNAs編碼催化的蛋白激酶子域片段由RNA被反轉錄酶PCR擴增。在對表皮生長因子受體家族激酶催化的區域的子域Vib和VIII中基序序列編碼中是以簡併的PCR引物為基礎。引物的序列如下前引物5′-CGGATCCGTG(A)CACC(A)GT(CG)G(A)ACC(T)T-3′(SEQ ID NO9)，反轉引物5′-GGAATTCACCA(G)TAA(G)CTCCAG(C)ACATC-3′(SEQ ID NO10)。將幾種PCR產物克隆為M 13和用T7 Super-Base測序試劑盒(Bresatec)測序。用一216-鹼基對PCR產物作為探針以篩選人體克隆λgt11 cDNA文庫(Clontech，catalog #HL 10346)。將片段隨機標號，在65℃雜化，和在65℃洗滌過濾器至stringency 0.2X NaCl/檸檬酸鹽(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉，pH 7.0)和0.5％SDS。過濾器在-70℃用Kodak XAR-5膠片放射能照像16小時。分離4種克隆產品，在相同的條件下最長的1.2kb用作同一文庫的反探針(reprobe)。對4個更長的克隆體進行選擇，其中之一表示為MLK3的1034bp片段。此克隆體用作人腦λgt11文庫的探針。差不多篩選了500,000克隆體，並分離出一3454bp的克隆體，代表MLK2的整個編碼區。
由ATG至polyA尾，用2個步驟，將MLK 2克隆至BamH1和EcoR1位點之間的載體pKH3，在MLK2序列的中間有BamH1。插入3份HA抗原表位標記構建載體pKH3，接著在pRK7多接頭的Xbal和EcoR1之間插入BamH1。為了製成誘導有機體突變的物質的模型，MLK25′BainH1片段K125A被克隆為Promega pAlter載體，並按生產者所推薦的方法使之突變。然後把片段克隆回到MLK2 pKH3載體。
實施例18pcDNA3-HA-JNK1如(Coso等人，Cell，1995，81，1137-1146)所述可得到JNKI cDNA。用人體骨骼肌cDNA(Invitrogen)模板，通過PCR得到cDNA，它可被克隆成為pcDNA3-HA的Bg12/Sal 1位點，是一種改性的pcDNA3表達質粒編碼HA表位(Wilson等人，Cell，1984，37，767-778)。然後由包括HA表位的pcDNA3上酶切，並引入pGEX-4T3(Pharmacia)。由構建成Bg12/Sal 1片段的pGEX-4T3上酶切得到JNK1 cDNA，並引入pcDNA3-HA，帶有HA表位的載體加在pcDNA3-HA的HinD3/BamH1位點。
實施例19pFLAG-DLK如(Holzman等人，J.BioL Chem.，1994，269，30808-30817)所述將DLK克隆為帶FLAG表位的表達載體pcDNA3。用簡併寡核苷酸-基PCR克隆法分離DLK的cDNA片斷。按照製造者(TRIzol Reagent，LifeTechnologies，Inc.)的指示用常規的製備酚/異硫氰酸胍試劑的方法由13.5天胚胎的腎(32個器官)和17.3天胚胎的腎(16個器官)萃取得到總RNA。在用無DN酶的RN酶消化後，總RNA用RNA酶H-反轉錄酶(Superscript，Life Technologies，Inc.)從寡核苷酸(dT)合成寡核苷酸引物反轉錄為單鏈cDNA。與蛋白質酪氨酸激酶催化的子域Vib和IX相應的，簡併寡核苷酸引物最先由Wilks提出(Wilks，Proc Nad AcadSci USA.，1989，86，1603-1607)，將其改性為5′EcoR1和HindIll位點，分別為(5′-ATAATTC(GT)GC(TAGC)GCCA(GA)GTC(TAGC)CGGTG-3′(SEQ ID NO11)，5′-ATAAGCTTCC(TC)(AG)T(GC)AAGTGGA(TC)(GC)GC(AGC)CC(CT)GA-3′)(SEQ ID 25 NO12)。在94℃，1.5分鐘，37℃，2分鐘，63℃，3分鐘可進行40個PCR循環。加入新鮮試劑，在72℃最後延長的10分鐘之前，再完成40個循環。得到的200-210-bp DNA擴增產物進行矽膠分離，亞克隆為製備的pGEM7zf(+)質粒(Promega)，並變換成大腸桿菌(Escherichia coli)。小量製備的DNA質粒可由被變換的細菌製備，和用EcoR I和Hind III限制核酸內切酶部分消化；對含有插入體的克隆體進行測序。
將由簡併的PVR得到的195-bp DLK cDNA片段進行放射性標記，並用於篩選差不多1×106Uni-ZAP II重組體(Stratagene，LaJolla，CA)，寡核苷酸(dT)-引導的抗原的成年小鼠腦cDNA文庫(Holzman等人，Mol Cell Biol，1990，10，5830-5838)。42℃下，過濾器在含有50％甲醯胺、5x SSC、3x Denhardt′s溶液、0.25％SDS，1mg/ml聚腺苷二磷酸和200mg/ml鮭魚精子DNA的緩衝溶液中雜化，並於室溫下用2x SSC，0.2％SDS洗滌一次，於65℃以同樣的溶液在30分鐘內洗滌二次。鑑定出25個獨特的克隆體，按照製造者的方法和限制性內切酶圖進行體內酶切，將10個克隆體純化為同質性。對兩種最長的克隆體(分別為3401和3397bp，，其差別僅在於5′末端)沿著其全長的鏈測序。
將全長的Not I-Xho 1 DLK cDNA片段(3401bp)亞克隆為巨細胞病毒促進劑為基的真核生物表達載體pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，CA)(註冊為pcDNA3-DLK的構成)。下一步，製備標記的NH4-Met FLAG表位(DYKDDDDK)(SEQ ID NO13)構成(pFLAG-DLK)。用PCR擴增cDNA片段，該片段編碼5′HindIII表位，DLK′s Kozak′s共有序列，其中包括有由核苷酸88擴展到核苷酸758 EcoR I的內表位的啟動子ATG、FLAG表位和DLKcDNA可讀框序列。(以等量使用的HPLC純化合成寡核苷酸對FLAG構成有義引物而言為5′-ATAAAGCTTCCAGAGGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGCCTGCCTCCATGAAACCCGAACA-3′(SEQ ID NO14)，對反義引物而言為5′-GACAGGGCGGCCGGCTCT-3′(SEQ IDNO15))。凝膠純化的HindIII和EcoR1消化擴增的片段經亞克隆成為HindIII-EcoR1，以製備pcDNA3-DLK質粒。沿雙鏈對構成測序，以確認Taq聚合酶的精確度和保持可讀框。
實施例20pcDNA3-MLK 1由EST資料庫(註冊號#AA 160611)得到MLK1的5』部分。該克隆體是MLK1和其它未知同一性的cDNA的融合體。它含有以前沒有公布的MLK1的5′序列，所述的MLK1伴隨有以前公布的MLK1激酶區(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。來自EST克隆體的MLK1 cDNA序列如下 GAATTCGGCA CGAGAGGACTCGCAGGTGTC CGGCGACGAG GGCTGGTGGA CCGGGCAGCT GAACCAGCGGGTGGGCATCT TCCCCAGCAA CTACGTGACC CCGCGCAGCG CCTTCTCCAGCCGCTGCCAG CCCGGCGGCG AGGACCCCAG TTGCTACCCG CCCATTCAGTTGTTAGAAAT TGATTTTGCG GAGCTCACCT TGGAAGAGAT TATTGGCATCGGGGGCTTTG GGAAGGTCTA TCGTGCTTTC TGGATAGGGG ATGAGGTTGCTGTGAAAGCA GCTCGCCACG ACCCTGATGA GGACATCAGC CAGACCATAGAGAATGTTCG CCAAGAGGCC AAGCTCTTCG CCATGCTGAA GCACCCCAACATCATTGCCC TAAGAGGGGT ATGTCTGAAG GAGCCCAACC TCTGCTTGGTCATGGAGTTT GCTCGTGGAG GACCTTTGAA TAGAGTGTTA TCTGGGAAAAGGATTCCCCC AGACATCCTG GTGAATTGGG CTGTGCAGAT TGCCAGAGGGATGAACTACT TACATGATGA GGCAATTGTT CCCATCATCC ACCGCGACCTTAAGTCCAGC AAC(SEQ ID NO16).它譯成為NSAREDSQVSGDEGWWTGQL NQRVGIFPSN YVTPRSAFSS RCQPGGEDPS CYPPIQLLEIDFAELTLEEI IGIGGFGKVY RAFWIGDEVA VKAARHDPDE DISQTIENVRQEAKLFAMLK HPNIIALRGV CLKEPNLCLV MEFARGGPLN RVLSGKRIPPDILVNWAVQI ARGMNYLHDE AIVPIIHRDL KSSN(SEQ ID NO17).
如以前所公開的，MLK1的3』部分最初可被簡併PCR克隆(Dorow等人，Eur.J.Biochem.，1993，213，701-710)。上文描述了將MLK 1的3』部分克隆為MLK2的方法，除了下述例外。由具有1.2kb克隆體文庫的再篩選中得到的四個克隆體中有三個被表示為MLK1。沒有包括整個激酶區的克隆體可由PCR獲得。
由每等份1ml的擴增文庫得到的噬菌體(在1Uni-ZAPXR(Stratagene，cat#937204)正常人體結腸上皮和人體T84結腸癌細胞系cDNA)通過懸浮於20ml水溶解，並快速冷凍。在每一文庫的兩個反應中均使用5ml溶解了噬菌體的樣品作為PCR模板。由核苷酸序列側區克隆位點得到代表載體的引物。在T84結腸癌細胞系文庫中，使用T3和T7序列的引物(Promega)。在各個反應中，一個引物取自MLK1基因的3′-5′鏈，由已知序列的5』端起在100bp左右。第二個引物是兩個載體引物中的一個。在總量50ml中，PCR反應物含有1X PCR緩衝溶液、2.5mM氯化鎂、1U Taq聚合酶(都購自Bresatec)、0.2mMdNTP和0.4mM各種引物。反應條件是在95℃60秒，52℃90秒和在72℃90秒進行30個循環，在最後一個循環中時間擴展到15分鐘。如上所述克隆PCR產物並測序。從文庫中篩選出的最長的克隆體和含有附加MLK1序列的PCR片段結合在一起形成pUCI18的1.08kbMLKI cDNA。
來自EST資料庫的MLK1克隆體可在載體pBluescript 10(Stratagene)中獲得。來自結腸文庫的MLK1 cDNA結合成為EST克隆體，這是通過將前者用EcoR1消化，用Kienow鈍化，用AflII酶切。將此分離的片段克隆成為來自EST資料庫的，用Xhol酶切，Kienow鈍化，用AflII酶切的MLK1 cDNA。由pBluescript酶切得到的新構成用Not1和Apal消化，並結合到用Not1和Apal酶切的pcDNA3-EE中。所有克隆的結合物進行序列檢測。
實施例21GST-MLKKD D的E.coli表達通過電穿孔將PGEXKG-MLK3(KD)轉變為E.coli菌株BL12。將含有質粒的細菌在15升Applikon發酵罐(fermenter)中於10升體積下述介質中接種1.95g/L K2HPO4、0.9g/L KH2PO4、0.1g/L氨苄青黴素、0.3g/L(NH4)2SO4、0.92g/L MgSO4·7H2O、42.7mg/L檸檬酸鈉、21.8mg/L FeSO4·7H2O、0.5ml畢赤酵母屬痕量金屬(Higgins等人，Methods Molecular Biology，1998，103，149-177)、20g/酪蛋白胺基酸、40g/L甘油、25.5mg/L CaCl2。細菌在800rpm/68％溶解氧/3O℃生長過夜，直到培養物達到OD600＝4.4。重組蛋白質的生成由加入1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷誘導，在25℃連續發酵達6小時。然後，離心回收細菌，細胞糊在-20℃冷凍儲存直至純化。
實施例22細菌GST-MLK3KD的純化在100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM二硫蘇糖醇(DTT)，pH 7.5(緩衝液A)中超聲處理100gm細菌糊可製備部分純化的GST-MLK3KD。所述溶液用1％Triton X-100製備，然後在冰中攪拌1小時。在20,000xg離心45分鐘後，在冰中將澄清的溶液和以緩衝液A平衡的10ml谷光甘肽瓊脂糖凝膠4B樹脂(Pharmacia)混合1小時。壓成片的樹脂用12.5x體積的緩衝液A洗滌二次，然後用20mL 100mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM DTT(緩衝液B)洗脫，緩衝液B中含有20mM谷光甘肽，pH為7.5。蛋白質用緩衝液B透析，並以多份於-80℃儲存。
實施例23FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的杆狀病毒群表達用BAC-TO-BAC系統(Life Technologies)，按照手冊的指示，表達FLAG-MLK3和GST-MLK3KD的重組體杆狀病毒群由它們各自的轉移載體pFB-FLAG-MLK3和pFB-GST-MLK3KD生成。Sf21細胞(Vaughn等人，In Vitro，1977，13，213-217)的懸浮培養物在27℃/120rpm，和在補充的Grace介質(Hink，Nature，1970，226，466-467)中，與10％熱失活的胎兒牛血清(FBS)一起培養。為了生成重組體FLAG-MLK3，使細胞密度1.5×106細胞/ml補充的Grace介質的Sf21細胞多次重複感染3.1(MOI)，介質中含有5％FBS，在感染39小時後收穫。為了得到重組GST-MLK3KD，使細胞密度1.5×106細胞/ml補充的Grace介質的Sf21細胞多次重複轉染2(MOI)，介質中含有5％FBS，在轉染41小時後收穫。在兩種情況下，見壓成片的細胞再懸浮於含有10mMHEPES，50mM NaCl，0.5mM Pefabloc SC，5μM胃酶抑素，10μg/mL抗蛋白酶肽和10μg/ml白胃素的緩衝液，pH 7.4。在147,000xg離心1小時後，用3M Tris鹼調整上清液溶液的pH為7.4，在純化前於-70℃儲存。
實施例24桿狀病毒群GST-MLK3KD的純化部分純化的杆狀病毒群GST-MLK3KD由谷光甘肽親和色譜製備。就10ml細胞萃取液(26.6mg總蛋白)而言，需要加入在10mMHEPES、150mM NaCl，pH7.4(緩衝液C)平衡的1ml谷光甘肽瓊脂糖凝膠4B樹脂(Pharmacia)，使蛋白在4℃結合45分鐘。然後在柱中以30倍柱體積的緩衝液C洗滌樹脂，以5倍柱體積的，含有20mM谷光甘肽的緩衝液C洗脫。把匯集的最終產物用緩衝液C透析，並以多份於-70℃儲存。
實施例25桿狀病毒群FLAG-MLK3的純化部分純化的杆狀病毒群FLAG-MLK3用抗體親和色譜製備。15mL萃取液的蛋白(19.5mg總蛋白)和0.1M NaCl在0.25ml柱中結合，所述的柱為與瓊脂糖樹脂(Sigma)偶合的M2單克隆FLAG肽抗體，該柱需要重複負載(共三次)。在進行色譜層析之前，樹脂用5倍柱體積的50mM Tris-HCI、150mM NaCl，pH 7.4(TBS)洗滌平衡，和用3倍柱體積的0.1M甘氨酸(pH 3.5)，接著用另外5倍柱體積的TBS洗滌。重組體蛋白主要由5倍柱體積的0.2mM FLAG肽(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)(SEQ ID NO18)TBS的溶液洗脫。試驗前以多份於-80℃儲存。
實施例26顯性負性突變體在不同的PC12細胞除去神經生長因子後，MLK家族區組死亡的顯性負性突變體由大鼠嗜鉻細胞瘤腫瘤衍生的PC12細胞廣泛用於測定導致神經元死亡的分子行為的神經元細胞模型(參見綜述Troy等人，Adv.Neurology，1997，103-111)。神經生長因子(NGF)誘導PC-12細胞分化成交感神經神經元表型(Greene，Cell BioL，1978，78，747-755)。在由培養介質中移動出NGF後，NGF分化的PC-12細胞的存活依賴於NGF和經歷形態學描述的編程性細胞死亡。為了測定NGF排出後各種混合譜系激酶家族對PC-12細胞死亡的作用，給細胞系統顯影。PC-12細胞用cDNA編碼的MLK-3顯性負性(DN)突變體轉染，製造者推薦使用Pfx脂質體轉移系統(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用G418硫酸鹽(Mediatech Inc.，Henidon，VA)選擇轉染體表達DN-MLK-3的穩定池。在該池中30％左右的細胞表達了用免疫組織化學法測定的DNMLK3。細胞池穩定的表達的突變激酶在多鳥氨酸/層粘連蛋白(在磷酸鹽緩衝鹽水中每個為10μg/ml)塗覆的組織培養96穴培養板上鋪板，密度為2×104細胞/穴，並用100ng/ml NGF處理7天。除去含有NGF的介質，細胞單層用磷酸鹽緩衝液和含有中和抗體(cat.#N6655；Sigma，St.Louis，MO)的介質洗滌，最後以1∶1000稀釋替代1-5天。用細胞生存試驗定量測定細胞的生存能力，如製造者(Promega，Madison，WI)所推薦的，使用四唑鹽，MTS轉化成染色的甲(formazan)，它可用CytoFluor 2350(Millipore，Bedford，MA)儀器上，於570nm讀出吸收值。穩定池中表達的DN-MLK-3可部分救活由於NGF排出造成的細胞死亡(圖10)。
實施例27重組體MLK蛋白的酶活性試驗為了顯示以杆狀病毒群或細菌表達系統表達的MLK蛋白具有酶活性，可採用幾種試驗方式。MLK蛋白可以是全長構成或是以杆狀病毒群或細菌表達系統表達的激酶區。試驗可以抗體為基礎，例如酶連接的免疫吸附試驗(ELISA)，時間分辨螢光免疫測定法(ThF)或螢光偏振(FP)。抗體可以是對磷絲氨酸、磷蘇氨酸或磷-特異性基質具有活性的單克隆的或多克隆抗體。另外，也可以使用非-抗體為基礎的方法，例如放射性-膠基試驗(見圖11)、多篩選三氯乙酸(TCA)沉澱試驗(見圖13)、閃爍親近試驗(SPA)、快速板層析法或磷酸纖維素過濾試驗法(phosphocellulose filter assay format)(見圖13)。設計試驗，以控制基質的直接磷酸化或在形成信號的途徑中用下遊激酶控制偶合試驗系統。所述的基質可以是特異性的基質，如SEK-1，或是相對非特異性的基質如髓磷脂鹼性蛋白(MBP)。
實施例28激酶試驗(1)放射性膠-基激酶試驗(Radioactive Gel-Based Kinase Assay)
MLX-3激酶活性通過控制[γ-32P]-ATP的32p與MLK基質的結合(如死亡激酶SEK-1；髓磷脂鹼性蛋白)。50μl試驗混合物含有緩衝液A(20mM MOPS，pH 7.2，25mM β-甘油磷酸酯，5mM EGTA，1mM原釩酸鈉，1mM二硫代蘇糖醇)、15mM MgCl2、100μMATP，10μCi[γ-32P]-ATP和0.1μg死亡激酶SEK-1基質(Stressgen，Inc；由帶有10mM谷光甘肽，pH 8.0的谷光甘肽-瓊脂糖串釋放出結合的谷光甘肽5-轉移酶-SEK-1(GST-SEK-1))或25μg MBP(SigmaChernical Co.)。通過加入MLK蛋白(激酶區或含有全長和激酶區兩者的製劑)或控制蛋白質開始反應。混合物於30℃孵化30分鐘。反應最後加入2x還原樣品的緩衝液。使混合物沸騰5分鐘，負載於12％SDS-PAGE凝膠(以MBP為基質)或8％凝膠(SEK-1)。電泳後，乾燥凝膠。對結合基質SEK-1的磷酸鹽定量，試驗在Molecular DynamicsPhosphorimager(Sunnyvale，CA)上進行。試驗結果說明杆狀病毒群表達MLK-3(FLAG-標記的全長或GST-標記的激酶區)具有酶活性，以死亡激酶GST-SEK-1或MBP為基質的活性如圖11A和11B所示。
(2)蛋白質印跡分析杆狀病毒群表達MLK-3的激酶活性通過免疫印跡法進行分析。20μl試驗混合物含有緩衝液A，15mM Mgcl2，100μM ATP和0.1μg死亡激酶SEK-1基質。使反應於30℃進行30分鐘，然後用10μl4x還原樣品的緩衝液使反應停止。在8％Tris-甘氨酸凝膠上分離蛋白質，並用電泳法轉移至固定PVDF膜。所述膜與磷-特異性的SEK-1(Thr223)抗體(New England Biolabs，Inc.)一起孵化，接著加入用標記了山羊抗-兔IgG(Bio-Rad)的辣根過氧化物酶。免疫活性帶的測定是通過化學螢光(Amersham)的增加來測定。死亡激酶GST-SEK-1由FLAG-MLK-3蛋白(含有全長和激酶區的杆狀病毒群製劑)磷酸化在圖12說明。
(3)多篩選三氯乙酸(TCA)沉澱試驗細菌表達GST-MLK3激酶區的激酶活性用Pitt等人，J.Biomol.Screening，1996，1，47-51所述的Millipore Multiscreen三氯乙酸(CA)″in-plateTM試驗方法評價。試驗在96穴Multiscreen Durapore板(Millipore)上進行。每一50-μl試驗混合物含有20mM Hepes，pH 7.4，20mM MgCl2，20mM MgCl2，2mM DTT，0.1mM Na3VO4，1μCi[γ-32P]ATP和30μg MBP基質。加入MLK蛋白使反應開始，並使反應於37℃進行15分鐘。加入25μl 50％TCA使反應停止。將所述的板於4℃平衡30分鐘，然後用冰冷卻的25％TCA洗滌。在板上加入閃爍的混合物，並用Wallac MicroBeta 1450 PLUS閃爍計數器測定其放射性。蛋白質的劑量響應與32P-標記MBP的關係如圖13所示。
(4)磷酸纖維素過濾試驗激酶試驗在50-μl反應混合物中進行，該混合物含有20mMHepes，pH 7.4，20mM MgCl2，20mM MnCl2，2mM DTT，0.1mMNa3VO4，IμCi[γ-32P]ATP和30μg MBP。加入MLK蛋白使反應開始，並使反應於37℃進行15分鐘。加入75μl 75mM磷酸使反應停止。將停止反應的等份溶液直接負載於磷酸纖維素膜(Pierce)。另外，可使用96穴磷酸纖維素多篩選板(MiIlipore)。所述膜用75mM H3PO4洗滌。加入1M氫氧化鈉洗脫出結合的32P-標記的磷酸化的MBP，收集在收集管中。用Beckman閃爍計數器(Somerset，NJ)通過Cerenkov計數測定放射活性。隨著細菌表達GST-MLK-3激酶區濃度的增加形成磷酸化的MBP，結果如圖13所示。
實施例29測定化合物和重組體MLK家族結合的試驗K-252a(化合物III-3；見表4)，Nocardia物種的吲哚並咔唑代謝物，與多種絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶結合(Angeles等人，AnaLBiochem，1996，236，49-55；Knight等人，AnaL Biochem.，1997，247，376-381)。用氚化的K-252a配體評價與人體重組體全長MLK-3的結合，所述MLK-3來自杆狀病毒群感染細胞粗製劑。通過NEN研究產物(Billerica，MA)感染在[3H]K-252a的3-和9-位用氚標記，並具有40Ci/mmol的特定活性。結合試驗在96穴板上於1ml試劑中進行。反應混合物含有50mM MOPS緩衝液，pH 7，150mM NaCl，5mMMnCl2，1mg/ml BSA，1％DMSO和0.25nM[3H]K252a。以5μg/ml濃度的粗製杆狀病毒群衍生MLK-3進行三次重複試驗。非特異性結合在未標記的1.2μM[3H]K252a存在下鑑定，並由總的特異性結合中減去。總量的12-15％稀釋對蛋白質是非特異性結合，總量的75-85％對MLK-3為特異性結合(圖14)。所有的試驗在4℃進行2小時。使用Brandel收集器，在GF/C Whatman過濾器上收集[3H]K252a/MLK-3複合物，用冷的MOPS/NaCl緩衝液洗滌，並在Wallac Micro Beta計數器上計數。進行飽和結合試驗以得到K-252a的Kd。這些試驗中的一個實施例如圖14所示，得到的Kd值為0.89nM(置信界限0.2-1.5nM)。
實施例30完整細胞試驗(A)Cos 7過表達系統材料K-252a和此化合物的衍生物由Kyowa-Hakko Kogyo Co.Ltd.(Tokyo，Japan)(Kaneko等人，1997)提供。將化合物溶解於細胞培養級的二甲亞碸(DMSO)，儲存於4℃，黑暗中。化合物的所有稀釋液在Dulbecco改性的Eagle介質(DMEM)中進行，其中含有1％牛血清白蛋白。紅血球凝聚素(HA)抗體購自BAbCO(Richmond，CA)。AP-1(c-jun)基質購自Promega(Madison，WI)。[γ-32P]ATP(6000Ci/mmol)購自Amersham(Arlington Heights，IL)。
Cos7細胞培養Green Monkey Kidney Cos7細胞由ATCC，Rockville，Maryland(CRL 1651)得到，保存在DMEM中，其中含有10％牛血清，2mM谷醯胺，1mM丙酮酸鹽，50U/ml青黴素/鏈黴素，保存需要在37℃，10％CO2和90％空氣的氣氛中。加入0.25％胰蛋白酶分離Cos7細胞以傳代。
(I)MLK家族膜的過表達和Cos7細胞中的JNK1用提供者(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)推薦的脂質轉染胺製劑(lipofectamine)，將Cos7細胞以80％融合鋪板，和以每個cDNA構成物2μg轉染。人體MLK-3，MLK-2或小鼠DLK的長cDNA或部分的人體MLK-1如上文所述，全長紅血球凝聚素A-標記的人體JNK1由J.Silvio Gutkind(NIH，Bethesda，MD)善意地提供，將它們亞克隆為pcDNA載體(Invitrogen，San Diego，CA)。轉染48小時後，細胞用0.025％DMSO或500nM指定的化合物處理2小時，接著溶解在0.4ml Triton緩衝液(1％Triton X-100，50mM氯化鈉，10mM Tris(pH7.6)，0.1％牛血清白蛋白，30μM磷酸鈉，50mM氟化鈉，20μg/ml抑蛋白酶肽，1mM苯基甲基磺醯基氟化物，1mM釩酸鈉)中。溶解物中JNK的活性用上文所述免疫沉澱激酶試驗測定。
(2)全細胞的免疫沉澱和激酶試驗用Pierce(Rockford，IL)的Micro BCA藥盒，測定由Cos 7細胞獲得的溶解產物的蛋白質濃度，將等同量的蛋白質與HA抗體於4℃免疫沉澱1小時。用微型離心機離心20秒，再懸浮於Triton緩衝液離心洗滌2次以上，最後以激酶緩衝液洗滌(20mM Hepes pH 7.4，20mMMgCl2，2mM二硫代蘇糖醇，0.1mM釩酸鈉)。將免疫沉澱再懸浮於激酶緩衝液，該緩衝液含有1μM ATP和5μCi[γ-32P]ATP和基質(1μg/AP-1樣品)，於30℃孵化15分鐘。通過加入還原樣品的緩衝液(Laemmli，Nature 1970227；680-685)停止反應。樣品於80℃加熱5分鐘，負載於10％SDS-聚丙烯醯胺凝膠。用電泳分離蛋白質。乾燥凝膠，用Molecular Dynamics Phosphorimager(Sunnyvale，Ca.)，在AP-1基質上對放射性進行定量分析，試驗結果見圖15A和15B，該試驗中MLK-3，MLK-2和DLK與HA-JN1共表達，以及在有或沒有K-252a的情況下孵化。與此相反，命名為化合物-3(見表4)的母體K-252a化合物衍生物是選擇性更好的激酶抑制劑，不受其他JNK上遊MAPKKK，MEKK1活化的JNK途徑的幹擾(圖15C)。
(B)JNK活化的MIK的全細胞報導試驗用衍生的克隆體組成型表達MLK家族的嘗試沒有成功，MLK的過表達可能影響細胞的存活(Bergeron等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997，231，153-1SS；Nagata等人，EMBO J.，1998，17，149-158)。因此，在誘導生物化學作用的跟蹤MLK的顯影全細胞試驗中，可能需要含有感興趣的激酶的基因工程形成的誘導型表達系統的細胞系。例如，用反式激活蛋白控制的四環素轉染的PC-12細胞系。當細胞進一步被感興趣的基因轉染時，基因的表達被介質中的四環素嚴格控制(Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6522)，所述的基因是由誘導型的啟動子衍生的。
為了對MLK的活性定量，一種方法是在上文所述多次重複試驗方法中測量下遊基質如MEK4，JNK或c-jun的磷酸化。另一在全細胞中定量MLK活性的方法是利用報導基因酶活性，所述的酶例如可以是c-jun螢光素酶報導基因系統，可通過PathDetectTM系統(Stratagene，LaJolla，CA)購買。在此系統中，四環素誘導的細胞系是由兩種質粒轉染的。一種質粒組成型地表達了cJun NH2-端基的反式激活區與酵母GAL4 DNA結合區的融合(cjun-DBD融合蛋白)。另一種質粒帶有有螢光的螢光素酶的編碼序列，所述的酶是由GAL4結合位點的5個串聯重複部分衍生的。根據MIK的活性，JNK、cJun-DBD融合蛋白的下遊基質是被磷酸化的，鍵合於GAL4結合位點，並誘導螢光素酶基因轉錄。加入其基質就很容易進行螢光素酶在細胞溶解產物中的試驗(Promega，Madison，WI)和測定化學發光。
實施例31MLK家族成員對運動神經元的抑制和皮質存活兩者的結合大鼠脊髓富集運動神經元培養物的存活由Sprague-Dawley大鼠胎兒分割出脊髓(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)，胚胎齡(E)14.5-15。從脊髓僅有的腹部部分，如前文所述(Henderson等人，1993)，通過用6.5％三碘苯甲醯氨基葡萄糖進行梯度離心可進一步富集運動神經元，以及通過用低親和力的神經營養蛋白受體抗體(IgG-192，Boehringer-Mannheim)進行分析純化(數據未顯示)。將細胞接種在96穴板上，該板用以化學方法鑑定為無血清N-介質(Bottenstein的人，1979；見前文)中的多鳥氨酸和層粘連蛋白(每穴5μg/ml)預塗，密度為6×104細胞/ml。為了由存活作用中分離出附著物，在附著期開始後1-3小時在培養物中加入化合物。4天後用鈣黃綠素AM(Molecular Probes，Eugene，OR)，以螢光測定生存能力(BozyczkO-Coyne等人，1993，同前)來評價存活的神經元。用顯微鏡對相對螢光質直接有關的神經元計數。主要的是，培養介質在DPBS中進行系列稀釋(Dulbeccos磷酸鹽緩衝鹽水)，將最後濃度為6μM的鈣黃綠素AM儲備液加入96-穴板的每個穴。該板在37℃孵化30分鐘，接著用DPBS的下列稀釋液洗滌。用Millipore(Cytofluor 2350)的讀板螢光計對螢光信號讀數，激發波長＝485nm，放射波長＝538nm。對每板而言，只接受鈣黃綠素AM，但不含細胞而得到的平均本底由總數值中減去。在這些試驗中，螢光信號於細胞密度範圍的線形關係隨濃度和孵化時間變化。在試驗化合物以250nM存在時上述試驗中運動神經元存活百分數的實施例見表3。
皮質神經元的存活由18天大鼠胎兒的胚胎分割出大腦皮質，酶消化後得到單一的腦分散液。所述細胞在含有B27補充材料的無血清Neural BasalMedium介質中，接種在用多鳥氨酸和層粘連蛋白預塗的96穴組織培養板上，密度為1.56×105/cm2。培養板用PBS中的多鳥氨酸和層粘連蛋白(每穴8μg/ml)塗覆，在37℃至少為2小時。在離體5-7天後，在有或沒有試驗化合物的情況下，使皮質神經元與Ab25-35(2OμM)接觸。Ab2S-35(Sigma，SL Louis，MO)儲備溶液(1mM)在去離子無菌蒸餾水中製備。在後肽(post-peptide)加入後48小時測定神經元的相對存活，用乳酸鹽脫氫酶(LDH)釋放作為質粒膜完整性/細胞生存能力的指示物。根據製造者的說明書用Cytotoxicity Detection Kit(Boelrringer-Mannheim，Indianapolis，IN)測定LDH。數據以相對於只用Ab25-35處理的培養物而言，釋放LDH的抑制百分數表示。
表3

1式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OH。
2式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；以及R是OH。
3式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
4式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；以及X是CH2。
實施例32在有或沒有吲哚並咔唑或稠合吡咯並咔唑類化合物存在下，運動神經元培養物中內源JNK活性的免疫沉澱測定在16mm的穴中，以6×104細胞/cm2將純化的運動神經元鋪板。在處理之前使細胞附著2小時。將細胞用0.0125％DMSO或500nM化合物在前文所定義的N2介質中進行處理。然後用冰冷卻的磷酸鹽緩衝溶液洗滌，接著溶於實施例30所述的0.4ml Triton緩衝液。對運動神經元培養物的溶解產物的細胞數目進行歸一化處理，用購自SantaCruz Biotechnology(Santa Cniz，CA)的JNK1抗體(cat#sc-474)進行免疫沉澱。在如上述32P-ATP和c-jun基質存在下由免疫沉澱測定JNK的活性。將四種化合物的抑制活性與運動神經元和Cos7細胞過表達的DLK，MLK-1，MLK-2或MLK-3進行比較(表3)。
實施例33最初的胚胎培養物中，誘導MLK的JNK活性的抑制作用在Cos7細胞和乙醯膽鹼轉移酶活性兩者中的相關性為了測定通過激酶(所述的激酶與神經營養化合物相關)調節的JNK途徑的抑制作用，可以評價化合物對Cos7細胞過表達的HA-JNK和MLK3中的JNK活性的作用。在轉染48小時後，將細胞與500nM的化合物一起孵化2小時，接著進行細胞溶解。將溶解產物進行免疫沉澱試驗，並如上文所述測定激酶活性。所報告的結果以對照樣品的抑制百分數表示，所述的對照是在DMSO存在下的JNK活性。如表4中所看到的，對於脊髓和/或基本的前腦ChAT活性而言，大多數化合物具有活性，其趨勢是JNK的MLK-3活性的有效抑制劑。
表4Cos7細胞過表達MLK-3中吲哚並-和茚並-咔唑對JNK活性的影響

1式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1是NHCONHC2H5；R2是CH2CH2(2-吡啶基)；以及R是OH。
2式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2OCH2OCH2CH3；以及R是OH。
3式III化合物，其中Z1和Z2是H；X是CO2CH3；R1和R2是CH2SCH2CH3；以及R是OH。
4式I化合物，其中A1，A2，R1，R3和R4是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；R5和R6是OCH3；以及X是CH2。
5式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2-起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是Br；以及X是CH2。
6式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2-起表示O；R2是CH2CH2OAc；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
7式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2OH；以及X是CH2。
8式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2OH；以及X是CH2。
9式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；以及X是CH2。
10式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是CH2CH2CH2NHCO(4-(OH)Ph)；以及X是CH2。
11式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2(CH2)4CH3以及R是OH。
12式III化合物，其中Z1，Z2和R1是H；R2是CH2OH；X是CO2CH3；以及R是OH。
13式III化合物，其中Z1和Z2一起形成＝O；R1和R2是Br；X是CO2CH3；以及R是OH。
14式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-嘧啶基)；以及X是CH2。
15式III化合物，其中Z1和Z2是H；R1是Br；R2是碘；X是CO2CH3；以及R是OH。
16式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OH。
17式III化合物，其中Z1和Z2是H；R1和R2是CH2CH2SCH3；X是CO2CH3；以及R是OH。
18式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH2CH2(2-噠嗪基)；以及X是CH2。
19式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是H；R4是CH2CH2(2-吡啶基)；以及X是CH2。
20式III化合物，其中Z1，Z2，R1和R2是H；X是CO2CH3；以及R是OCH3。
21式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是(CH2)3-NH-C(＝O)-3，5-二羥基苯基；以及X是CH2。
22式I化合物，其中A1，A2，R1，R3，R4，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R2是苯甲醯基；以及X是CH2。
23式I化合物，其中A1，A2，R1，R2，R3，R5和R6是H；B1和B2一起表示O；R4是CH＝CH-C≡N；以及X是CH2。
實施例34MLK活性的凝膠位移試驗MLK的活性可能導致c-jun轉錄，致使c-jun蛋白增加。c-Jun蛋白增加的量可以用標準試驗方法測量，以凝膠位移試驗鑑定，Garner等人，Nucleic Acids Res.，1981，9，3047-3060，本申請引用該文獻全文作為參考。將c-Jun DNA-結合位點編碼的放射性標記雙鏈DNA低聚體和核細胞萃取物一起孵化，接著丙烯醯胺凝膠電泳，和放射性標記DNA定量位移至更緩慢的流動性。這代表了與c-Jun結合的DNA蛋白，並且與萃取物中c-Jun蛋白的量有直接的比例關係。此方法可用對檢測系統如蛋白質印跡或ELISAs之中的蛋白質的磷酸化形式有特異性的抗體進行測定。
實施例35雞胚神經元的存活材料購自Gibco的Leibovitz L 15介質、葡萄糖、碳酸氫鈉、胰蛋白酶和抗生素。肌萃取物如Henderson等人，Nature，1983，302，609-611所述製備，本申請引用該文獻全文作為參考。所有的試劑來自Sigma，除非另有說明。
細胞培養按照Bloch-Gallego等人，Development，1991，111，221-232確定的方法，用免疫方法分離運動神經元(5.5天胚胎)，本申請引用該文獻全文作為參考，並用Weng等人，NeuroReport，1996，7，1077-1081所述的方法改進，本申請也引用該文獻全文作為參考。運動神經元的純化按下述方法進行將其接種於35mm組織培養盤(Nunc)，該盤用聚-DL-鳥氨酸和層粘連蛋白(1μg/ml，Upstate Biotech)預塗。培養介質是L 15，其中含有碳酸氫鈉(22.5mM)、葡萄糖(20mM)、黃體酮(2×10-8M)、亞硒酸鈉(3×10-8M)、伴白蛋白(0.1mg/ml)、胰島素(5μg/ml)、青黴素-鏈黴素和10％熱失活的馬血清。補入30μg/ml肌萃取物。將化合物III-3製成DMSO中的4mM儲備液，並於4℃避光保存。在處理和對照培養物中DMSO的最終濃度是0.125％。
如Lindsay等人，Dev.Biol，1985，112，319-328所述(本申請引用該文獻全文作為參考)，在指定的胚胎天數，由雞胚分割得到脊柱交感神經節(SG，12天胚胎(E12))，背根神經節(DRG；E9)和睫狀神經節(CG；E8)。在胰蛋白酶消化和分離之後，將神經細胞懸浮液在Ham F14培養介質中塗於預塗了聚鳥氨酸和層粘連蛋白的板上，補充10％馬血清。在塗板之後，立刻以下述濃度加入存活因子神經生長因子(NGF)，20ng/ml；睫狀中性粒細胞因子(CNTF)，10ng/ml。將培養物保存在37℃，和5％CO2的潮溼環境中。
細胞計數將神經元在35mm培養盤上以柵格(Nunc)鋪板。在鋪板後立即在每盤存在明亮細胞的面積選擇掃瞄面積的10％左右，48小時後評估存活的百分數。用錐蟲藍(未顯示)活體染色確定細胞的存活。
完整的(intact)DRG將神經節鋪於96穴板，該板預塗了在無血清的N-介質中的聚鳥氨酸和層粘連蛋白(每穴5μg/ml磷酸鹽緩衝液)(Bottenstein等人，Proc.Natl Acad.Sci，USA，1979，76，514-517，本申請引用該文獻全文作為參考)，其中含有0.05％牛血清白蛋白(BSA)，培養物在37℃和5％CO2的潮溼環境中保存48小時。鋪板後2小時神經節用250nM化合物III-3或20ng/ml NGF處理。
化合物III-3支持小雞胚胎外周神經元的存活，且和濃度有依賴關係。
來自分開的E6脊神經節感覺神經元(DRG)和交感神經節(SG)培養物的NGF的退縮行為使它們在48小時內經過了PCD。通過在NGF的退縮的時間內於培養介質中加入化合物III-3可阻止退縮行為。48小時後，1μM化合物III-3可使SG神經元保持94％，保持890％DRG神經元存在活(NGF-處理對照SG 65％，DRG 66％)。與此類似，24小時後，化合物III-3促進76％的CNTF-依賴的睫神經節(CG)神經元存活(CNTF-處理對照67％)。在10％血清存在下，化合物III-3促進存活的作用是濃度依賴型的，在1μM左右，對三種神經元種群達到一個平臺(圖16A-C)。與對照培養物相比，存活的神經元顯示出廣泛的軸突生長暈，具有更厚的和更彎曲的軸突(圖17E-H)。4天後，促進存活的活性依然是完整的DRG化合物III-3 52％，處理對照的生長因子41％；SG化合物III-3 83％，處理對照的NGF 55％；CG化合物III-3 58％，處理對照的CNTF 50％)。在最佳條件下培養物與化合物III-3一起保存一周或更長(未顯示)。
化合物III-3支持小雞胚胎運動神經元的存活，且和濃度有依賴關係。
在有肌肉萃取物存在的情況下，培養後的小雞運動神經元可以存活，而在缺少時會迅速死亡。在我們的試驗中，與14％未處理對照組相反，在沒有肌肉萃取物存在的情況下，48小時後有65％存活的運動神經元。在沒有血清的條件下，化合物III-3的存活作用在300nM時最大，比肌肉萃取物誘導的更高(79％)。在此系統中，化合物III-3存活作用對濃度的依賴性和在外周神經元不同，因為化合物III-3濃度大於300nM時顯示出日益增多地還原作用(圖16A)。這些可能說明化合物III-3活性方面對運動神經元的特定靈敏度。就形態學而言，化合物III-3營救出的運動神經元顯示出階段明亮細胞體，並能夠擴展長軸突，與由肌肉萃取物誘導的那些相比似乎更粗(圖17)。培養4天後，與用肌肉萃取物大42％相比，用化合物III-3時的運動神經元存活56％。在300nM時，化合物III-3處理組神經元的離體存活至少達到一周(未顯示)。
化合物III-3對完整背根神經節的軸突生長暈的促進作用上述試驗結果表明化合物III-3不僅能夠促進外周和中樞神經系統胚胎神經元的存活，而且會產生粗壯的軸突生長暈。在有生長因子存在時，許多這樣的擴展似乎比有生長因子存在時所引起(elicted)的更粗(將圖17A-D與圖17E-H比較)。在250nM化合物III-3存在下，由完整胚胎背根神經節的軸突生長暈引起的軸突生長暈之中還觀察到上述作用(圖18C)。對NGF(圖18B)和化合物III-3兩者的響應是軸突生長；由NGF引起的比只存在化合物III-3時的生長更細和有更多的分枝，在只有化合物III-3時似乎生長的粗和可能是簇生的。
實施例36體內處理在小雞胚胎中試驗性調節運動神經元死亡此實施例在Glicksman等人，J.NeurobioL，1998，1535，361-370中有詳細描述，本申請引用其全文作為參考。如Oppenheim等人，Science，1991，251，1616-1617中所述(本申請引用其全文作為參考)，在雞蛋殼(Spafas，Preston，CT)上開口E6，由E6-E9，每天一次將任意載體，(5％SolutolTMHS15、聚乙二醇660羥基硬脂酸酯；BASF Aktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany(於磷酸鹽緩衝鹽水溶液中，pH 7.2))或特定劑量化合物III-3載體溶液直接用於血管化的絨膜尿囊膜。在E10處死胚胎，取出脊髓，在Carnoy溶液(10％冰乙酸，60％絕對乙醇，30％氯仿)中固定，進行系列石蠟切片，用硫堇染色。按前文所述的標準方法(Clarke等人，Methods In CellBiologyCell Death，1995，Schwart Osborne，Eds.，Academic Press，New York，pp277-321，本申請引用其全文作為參考)，取腰段1-8的每個第20切片計數。
在大鼠新生兒中試驗性調節運動神經元死亡由Harlan實驗室(lndianapolis，IN)得到Untimed懷孕的Sprague-Dawley大鼠。每天在雌性大鼠的幼兒(pups)上，就作為靶標的會陰肌肉皮下(SC)注射，化合物III-3於5％SolutolTMHS 15中的溶液，或者注射載體，從出生的那天(P1)，連續注射到第5天(P5)。在P10或P60那天，處死幼兒，用肝素化的毛細管收集血液，在動物體用鹽水/福馬林灌流之後，分割出含有球海綿體肌(SNB)的性雙態脊柱核，和含有球海綿體肌(BC)和提肌(LA)肌肉的會陰面。將含有SNB的脊髓部分進行後固定，包埋至Paraplast中，切片成10μm，用Cresylecht紫染色(Nordeen等人，Science，1985，229，671-673，本申請引用其全文作為參考)。如前所述(Nordeen等人，同上)，在由脊髓的腰段5至骶骨1區的連續切片中以X500對運動神經元計數。通過觀察者對盲試到處理組對編號的切片進行顯微鏡計數。運動神經元計數用於細胞大小和切片厚度校正(Konisgsmark，Contemporary ResearchMethods in Neuroanatomy，Nauta Ebbesson，Eds.，1970，Springer-Verlag，New York，pp.315-340，本申請引用其全文作為參考)，並用單向反差分析(one-way analysis of variance)(ANOVA)進行統計學分析。將會陰肌肉組織後固定，脫鈣，包埋至Paraplast中，切片成10μm，用Milligan′s Trichrome染色。使用明視場顯微鏡(X250)，以正常雌性的BC和LA肌肉和化合物III-3-處理組的雌性動物(405隻動物/組)作為陽性檢測組，對其部位和存在的條紋狀纖維進行測定。用投影顯微鏡(62.5)由另外的切片跟蹤肌肉組織的輪廓，並用數位化的墊和計算機為基礎的形態計量系統(Sigrnascan，Jandel Scientific)測定橫斷面積。用橫斷面的總面積計算肌肉的體積，乘以切片厚度，並校正為樣品結構的百分數。
收集的血液於室溫離心5分鐘，然後取出質粒，於-20℃冷凍。按照.Wingfield等人於Steroids，1975，26，311-327中所確定的反射線免疫試驗方法測定睪丸素水平(6-7隻動物/組)，本申請引用其全文作為參考。
成年大鼠誘導Axotomy的運動神經元去分化在Neumbutol感覺缺失的條件下，將雌性Sprague-Dawley大鼠(120-180g)頸部橫切得到左舌下神經，將50μl化合物III-3和其載體(5％SolutolTMHS 15)用於GelfoamTM(AJ Buck，Owings Mills，MD)部分，然後圍著橫切神經的近端纏繞。七天後，麻醉動物，並撒以4％聚甲醛於Sorenson緩衝液中的溶液，該緩衝液是0.07M磷酸鹽溶液，pH 7.2。取出腦幹，在低溫槽中切下40-μm粗串狀冠須部分(Chiu等人，NeuroReport，1994，5，693-696，本申請引用其全文作為參考)。按照前文所述(Chiu等人，J.Comp.NeuroL，1993，328，351-363，本申請引用其全文作為參考)，用從Chemicon得到的抗-ChAT的單克隆抗體的1∶350稀釋液對每5個切片部分進行ChAT免疫組織化學加工。在上述本底的基礎上進行清晰染色的細胞在染色區計數；計數細胞的數目以舌下神經核解剖端(axotomized side)的ChAT-免疫活性細胞數目與對照端(未傷害的)的免疫活性細胞數目之比例表示。
化合物III-3可營救離體大鼠胚胎運動神經元使之免於編程性細胞死亡，並抑制信號通道，從而引起這些細胞中JNKI的活化(Maroney等人，J.Neurosci.，1998，18，104-111，本申請引用其全文作為參考)。為了測定體內的有效活性，以發育調節編程性細胞死亡程序的兩種模型，和對成年大鼠運動神經元解剖誘導(axotomyinduced)的去分化模型對化合物III-3進行評價。在小雞中，在ES-b期間，差不多有50％的脊髓運動神經元經過了PCD(Hamburger等人，J.NeuroscL，1982，1，38-55；Purves等人，Body and BrainA Trophic Theoiy of NeuralConnections，1988，Harvard University Press，Cambridge，MA，本申請引用兩者的全文作為參考)。在此期間，應用化合物III-3在尿囊絨膜上防止運動神經元死亡時是劑量依賴模式(圖19)。40％的會發生正常死亡的運動神經元在兩個最高劑量的試驗中得到了營救(2.3和7μg/天)，在最低劑量(1.2和1.8μg/天)時可營救25％的運動神經元。
在雌性大鼠的圍產早期(後期胚胎階段直到出生日(PN)4)，SNB中50％以上的運動神經元PCD消除(Breedlove，J.NeurobioL，1986，17，157-176，本申請引用其全文作為參考)。在雄性大鼠的神經核中，運動神經元神經支配與交配反射有關的有紋陰莖肌肉。睪丸的雄激素類固醇分泌誘導雄性大鼠的SNB運動神經元死亡，並防止大部分被運動神經元神經支配的BC和LA肌肉的萎縮。給雌性幼兒以睪酮用藥，使其達到雄性的全部SBN運動神經元數目(Nordeen等人，同上)和防止BC和LA肌肉萎縮(Waiman等人，Endocrinology，1941，29，955-978，本申請引用其全文作為參考)。每天給雌性大鼠經皮下給藥化合物III-3(PN 1-5)，可使運動神經元死亡顯著變少(圖20A)。在兩種劑量(每天0.5和1mg/kg)時可用化合物III-3營救SBN運動神經元使其免於死亡。在以每天0.5和1mg/kg的最高有效劑量施用化合物III-3時，可使運動神經元的存活提高70％，這與睪酮的效果相等(圖20A)。化合物III-3不會使被處理的雌性大鼠的血漿睪酮水平發生變化。對血漿睪酮水平為1mg/kg/天的處理組進行放射性免疫測定，將其與載體對照組比較，兩者沒有顯著的區別。(分別為0.016±0.008ng/ml和0.029±0.015ng/ML的平均標準誤差(S.E.M.))。
為了測定化合物III-3處理是不是長期有效，以維持運動神經元存活，在同樣的時間期限內PN(1-5)，將雌性大鼠用化合物III-3t處理(0.5和1mg/kg/天)。一半動物用載體處理，兩種處理組都在PN1O時處死。然後將其餘的動物不用額外的化合物IH-3處理，並在PN6O時處死。如前面所觀察到的(圖20A)，用化合物III-3處理可使運動神經元的存活提高70％(圖20B)。進一步的，在最後用化合物III-3處理後55天，由形態學鑑定可知，對運動神經元的營救可達到100％(圖20B)。在新生兒期，對化合物III-3動神經元死亡的抑制使運動神經元存活至成年期。
儘管有清楚的論證，和對成人疾病如肌萎縮側索硬化的運動神經元損失的破壞性作用，在大多數動物運動神經元損傷模型中，成人運動神經元有穩定的死亡。但是，軸突的損傷不會導致形態學變化(Oppenheim等人，同上)，和成人運動神經元的生物化學變化(Oppenheim等人，同上；Rende等人，J.Comp.NeuroL，1992，319，285-298，本申請引用其全文作為參考；Chiu等人，J.Comp.NeuroL，1993，328，351-363，本申請引用其全文作為參考)，在變性性改變的運動神經元中，所述的成人運動神經元在因病死亡前可能會有模仿的變性性改變。此種變化的一個實施例起因子舌下神經的axotomy，它可刺激舌的活動。7天後，對成年大鼠此神經的單向橫切會導致同側神經核中95％的ChAT-免疫反應性舌下運動神經元損失(Chiu等人，NeuroReport，1994，5，693-696，本申請引用其全文作為參考)。ChAT-免疫活性的損失是永久性的。axotomy四個星期後，100％運動神經元的ChAT-免疫活性恢復到對照組水平(Borke等人，J.Neurocytol.，1993，22，141-153，本申請引用其全文作為參考)。對側舌下運動神經元的ChAT-免疫活性不受影響(Chiu等人，同上)(圖21和表5)。
當在舌下神經的近端應用GelfoamTM時，在axotomy7天後，評價同側的舌下運動神經元的ChAT-免疫活性，其減少依賴於化合物III-3劑量的減少。最高有效劑量(50μg/天)時，與axotomized，的未處理組的ChAT-免疫活性相比多40％圖21B和表5)。對使存活大於未處理組的較低或較高劑量而言，兩者都有鈴形的劑量依賴關係，但是比在50μg時達到的要小。正如在SNB模型中確實存在的，在動物的任何劑量試驗中，這些都與重量損失、死亡率或總的阻止損傷無關。
在此體內運動神經元退化病變的三個模型中，化合物III-3表現出神經保護活性發展性的調節胚胎腰脊髓運動神經元的PCD(圖19)，出生後的SNB運動神經元對雄激素敏感的死亡(圖20)，和axotomy誘導的成年舌下運動神經元的功能性標記物ChAT的的損失圖21和表示5)。經皮下注射外圍給藥，在神經的切下端局部用藥，或直接覆蓋於小雞胚胎的尿囊絨膜時，化合物III-3是有效的。與母體分子K-252a相反，在調節富含運動神經元的培養物中的存活率時化合物III-3多5倍左右(數據未顯示)，並且對trkA酪氨酸激酶和幾種絲氨酸蘇氨酸激酶未顯示出活性(Maroney等人，同上；Kaneko等人，J.Med.Chem.，1997，40，1863-1869，本申請引用其全文作為參考)。
表5在axotomized舌下運動神經元中化合物III-3對乙醯膽鹼轉移酶免疫活性的作用

在橫切之後立刻在舌下神經的近端加入於凝膠泡沫中的化合物III-3或載體，7天後，將動物處死，並把整個舌下神經核系列切片，每五個切片用抗-ChAT抗體免疫染色，在神經核的同側(試驗組)和對側(對照組)進行ChAT-陽性神經核計數，將對照載體組和處理組進行比較有統計學意義，*p＜0.05。
MLK-3途徑的抑制劑在體內顯示的效力以及在MPTP模型中對MLK-3下遊磷酸化作用的阻斷將MPTP以(40mg/kg)的劑量給藥，所述劑量在黑質中會產生條紋狀多巴胺能終端和細胞體的損失。酪氨酸羥基化酶被用作黑質中多巴胺能神經終端的標記物。MPTW損害之後，將化合物III-3系統給藥可減少黑質酪氨酸羥基化酶免疫活性神經元的損失(圖22a；Saporito等人，1999)。因為化合物III-3是已知的MLK3抑制劑，可在MPTP-處理的小鼠中測定MLK3基質下遊的活性。磷酸化MKK4的水平可用磷酸化-MKK4特異性抗體測定(New England Biolabs，Beverly，MA)，用任一免疫印跡(圖22b)或ELISA(圖22c)方法可識別MKK4的單磷酸化形式。相對於對照的水平，MPTP給藥可將黑質中磷酸化MKK4的水平提高達到5倍(圖22b)。MPTP給藥後4小時可達到峰值，同時達到MPP+、MPTP-介導的MKK4磷酸化的CNS峰值，上述提高可由於1-丙炔苯丙胺(deprenyl)預處理而減少，這說明MKK4磷酸化作用可由MPP+介導(圖22c)。而且，當用1mg/kg劑量的化合物III-3預處理時，MKK4的磷酸化作用可部分地受到抑制，因而對MPTP-誘導的黑質紋狀體多巴胺能損失具有保護作用(圖22c)。這些數據說明MPTP(MPP+)活化了MLK3下遊的基質，MKK4。另外，這些數據也說明已知的抑制劑可以抑制這些激酶途徑在體內的活性。
實施例37炎症THP-1細胞中的LPS對IL-1和TNF-α的誘導以及吲哚並咔唑和吡咯並咔唑對所述誘導的影響選擇免疫系統的細胞，由於許多激酶與多種免疫功能的調節有關，例如誘導細胞因子的合成和誘導細胞因子的生物響應。最近的研究報告(Hambleton等人，Proc.Natl Acad.Sci.，USA，1996，93，2774-2778，本申請引用其全文作為參考)指出用LPS處理衍生單核細胞的細胞系能引起JNK活性的迅速活化。當單核細胞與細菌內毒素如脂多糖(LPS)接觸，它們能夠產生炎性細胞因子IL-1和TNF-α。抑制這兩種細胞因子的產生，可用於治療免疫系統的某些炎症疾病。這些細胞因子易於由商品化的ELISA試劑盒測定。我們設計的一些實驗用來確定(1)是否吲哚和稠合的吡咯並咔唑能夠在單核細胞系THP-1中抑制IL-1和TNF-α的合成，(2)是否JINK被THP-1細胞中的LPS活化，(3)是否JNK被LPS的活化可由吲哚和稠合的吡咯並咔唑抑制。
實驗方法THP-1細胞生長在10％胎牛血清補加的RPMI 1640培養基中。LPS(大腸肝菌血清型0111.B4，TCA萃取的)由Sigma購買，並溶解在PBS中。用於IL-1和TNF-α測試的ELISA試劑盒購於Boerhinger Mannheim，THP-I培養基的試驗按製造商的指示進行。依照說明得到每個試驗的標準曲線。
實驗是在12穴扳中進行的，採用1或2ml的THP-1細胞，細胞數為4×105個細胞/ml。IL-1和TNF-α通過加入LPS誘導到該培養基中，在不同時間收集培養基，而後進行細胞因子試驗。離心排除細胞，試驗前上清液在-70℃冷凍。為減少費用，實驗在雙份培養基中進行，在離心後使雙份上清液合併，合併的上清液均兩次試驗。吲哚和稠合的吡咯並咔唑在100％DMSO中的原液，在包含10％胎牛血清的培養基或包含0.5mg/ml BSA的培養基中，被稀釋到所希望的濃度。除非另有說明，是在加入LPS1小時前將化合物加入到THP-1細胞中。
JNK活性試驗在從溶解THP-1細胞的萃取液中免疫沉澱JNK蛋白後進行的。沉澱的THP-1細胞在500μl的Frac緩衝液(10mMTris-Hcl，pH 7.5，50mM NaCl，30μM焦磷酸鈉1mg/ml BSA，1％Triton-X-100)中的冰上溶解15分鐘。萃取液在在14K離心10分鐘，向上清液加入5μl的JNK抗體(Santa Cruz)。萃取液在4℃旋轉60分鐘，加入75μl洗滌蛋白A Sepharose(20％w/v in Frac)。萃取液再旋轉30分鐘，以使抗體複合物結合到蛋白A Sepharose上。蛋白ASepharose用Frac緩衝液洗滌兩次，每次用20mM Hepes，pH 7.6，20mMMgCl2，2mM DTT，而後在30℃在30μl激酶緩衝液(20mMhepes，20mM MgCl2，2MM DTT，1μg重組體c-jun，和2μM ATP-γ-32P，2μCi)中孵化15分鐘。反應通過加入10μl的4X SDS凝膠加樣緩衝液而終止，在80℃加熱3分鐘，該蛋白在10％SDS凝膠上分析。乾燥凝膠，放到磷光板(Phosphorimager plate)上，在磷光板上分析放射性帶。
初步試驗結果表明，在2ug/ml的LPS給出最大的IL-1產量，這個濃度的LPS用於此後的所有實驗中。在加入LPS後，獲取該細胞因子最大產量的最小時間，通過利用在加入LPS後為在不同時間試驗的同等試樣的培養基來測定。第一個實驗表明，IL-1和TNF-α加入LPS後在低於5小時內獲得最大產量。因為第一個實驗最早的收集時間是2.4小時，所以第二個實驗用加入LPS後15分鐘開始收集的培養基進行。這個僅用來評價TNF-α的實驗結果表明，它在加入LPS後3小時獲得最大產量。在加入LPS後90分鐘內培養基中未發現明顯的TNF-α。
最大產量的迅速獲得表明非常緊密地調節2細胞因子的合成—迅速合成和迅速減量調節。細胞的培養物在加入LPS前用ActinomycinD、RNA合成抑制劑、或一種蛋白合成抑制劑環己醯亞胺處理30分鐘。加入LPS後3小時後收集培養基，並進行TNF-α試驗。新RNA和蛋白合成需要TNF-α誘導，因為在用各個抑制劑處理的細胞培養基中沒有發現TNF-α。接下去的實驗是為了確定化合物III-3是否能抑制IL-1和TNF-α的誘導。化合物III-3抑制IL-1和TNF-α的誘導分別在IC50值267nM和139Nm。這些實驗結果是在包含10％胎牛血清培養基的細胞中獲得的。因為對脊髓組織和基前腦組織就化合物的神經營養性活性試驗是在無血清的培養基(500μg/ml BSA)中進行的，所以確定無血清培養基中抑制IL-1和TNF-α的IC50值是有意義的。當THP-1細胞用化合物III-3在無血清培養基(500μg/ml BSA)中處理時，IC50值減少10倍，從269mM到23mM。除非另有說明，後面所有實驗都是在無血清培養基中進行的。化合物III-3在THP-1細胞中IL-1和TNF-α的抑制作用表明，化合物III-3可用作由產生這些正常量的細胞因子而引起的病理性疾病的治療劑。膿毒性休克就是這種疾病。膿毒性休克是由在循環中革蘭氏陰性菌的增長並接著釋擴增量的內毒素LPS引起的。LPS主要刺激單核細胞和巨噬細胞，並產生大量的IL-1和TNF-α，它們又引起大量組織損傷，並在許多情況下導致組織死亡。
測定了某些化合物抑制TNF-α的能力，並同抑制JNK的能力做了比較。結果示於表6。
表6

在Jurkat細胞中化合物III-3對誘導II-2的影響進行這些實驗是為了確定在Jurkat細胞中化合物III-3是否抑制化合物II-2的誘導作用。
實驗方法Jurkat細胞生長在10％胎牛血清補加的RPMI 1640培養基中。TNF-α由Promega購買，抗CD3和抗CD28抗體由Pharmigen購買。Jurkat實驗在96穴扳中進行的。IL-1由購於Boerhinger Mannheim的ELISA試劑盒測定。在加入細胞前，使CD3和CD28抗體結合到96穴扳的塑料板上(在PBS中18小時)。細胞在加入到抗體塗抹的板以前用化合物1處理。CD3和CD28抗體用來活化T細胞受體和誘導IL-2。誘導作用開始後的6小時和24小時之間，IL-2從Jurkat細胞上釋放(圖23A)。IL-2基本上未產生(圖23ACNT)。下面評價化合物-III(在誘導前用化合物-III處理1小時)對IL-2誘導作用的影響(圖23B)。濃度為500nM的化合物III-3抑制了80％以上的IL-2誘導作用(圖23B)。用化合物III-3和化合物I-4進行了更大範圍的劑量響應實驗，得到的1C50值，化合物III-3是139nM，化合物I-4是207nM(圖23C)。
我們希望本專利文獻所引用的每一個專利、專利申請和印刷出版物都從整體上予以參考。
正如本領域內的專業技術人員所公認的那樣，本發明的優選實施方案在不偏離本發明精神的前提下可進行很多的變化和改進。我們期望所有這些變化都處於本發明的範圍內。
權利要求
1.一種抑制多譜系激酶蛋白的化合物在製備用於治療哺乳動物神經變性疾病的藥物中的應用，其中所述的的化合物具有以下結構式 其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
2.權利要求1的應用，其中R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是CH2CH＝CH2。
3.權利要求1的應用，其中R1是Br，和R2，R3，R4，Z1和Z2是H。
4.權利要求1的應用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H；R3和R4是CH2CH＝CH2。
5.權利要求1的應用，其中R1，R2，R3，Z1，和Z2是H；R4是CH2CH＝CH2。
6.權利要求1的應用，其中R1，R2，Z1和Z2是H；R3和R4是CH2CH2＝CH2OH或R1，R2，R4，Z1，和Z2是H；R3是
7.一種抑制多譜系激酶蛋白的化合物在製備用於治療哺乳動物炎症疾病的藥物中的應用，其中所述的的化合物具有以下結構式 其中Z1是H和Z2是H或Z1和Z2一起構體＝O；R1是H或Br；R2是H；R3是H，CH2CH＝CH2，CH2CH2CH2OH，或 和R4是H，CH2CH＝CH2或CH2CH2CH2OH。
8.權利要求7的應用，其中R1，R2，R4，Z1和Z2是H；R3是CH2CH＝CH2。
9.權利要求7的應用，其中R1是Br；R2，R3，R4，Z1和Z2是H。
10.權利要求7的應用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H；R3和R4是CH2CH＝CH2。
11.權利要求7的應用，其中R1，R2，R3，Z1，和Z2是H；R4是CH2CH＝CH2。
12.權利要求7的應用，其中R1，R2，Z1，和Z2是H，和R3和R4是CH2CH2CH2OH；或R1，R2，R4，Z1和Z2是H和R3是
全文摘要
本發明涉及鑑定調節多譜系激酶蛋白活性和促進細胞存活和死亡的化合物的方法，該方法包括下述步驟使含有所述的多譜系激酶蛋白的細胞同所述化合物接觸；測定所述化合物是否使多譜系激酶蛋白的活性減少；和測定所述化合物是否促進細胞存活。本發明還涉及可用於治療神經變性疾病和/和炎症的化合物的鑑定方法。本發明提供了調節多譜系激酶蛋白活性的方法，該方法包括使含有所述蛋白的細胞與的茚－並或吲哚並－化合物接觸；本發明還提供了治療神經變性疾病和/和炎症的方法。
文檔編號A61K31/5355GK1879617SQ20061009970
公開日2006年12月20日 申請日期1999年8月18日 優先權日1998年8月26日
發明者安娜·馬羅尼, 凱文·M·沃爾頓, 克雷格·A·迪奧納, 尼古拉·尼夫, 埃梅斯特·小奈特, 馬西·A·格利克斯曼 申請人:賽福倫公司