一種尿苷二磷酸的製備方法
2023-10-21 02:28:22 3
專利名稱:一種尿苷二磷酸的製備方法
技術領域:
本發明涉及一種尿苷二磷酸的製備方法,具體地說,是以尿苷一磷酸(UMP)為原料,通過發酵和降解兩步法生產尿苷二磷酸的方法。
背景技術:
上世紀六、七十年代,我國開始以核苷一磷酸為原料,利用酵母發酵生產核苷三磷酸(NTP),主要生產腺苷三磷酸(ATP)和胞苷三磷酸(CTP)。利用酵母發酵生產ATP的研究較多,在七、八十年代已有較穩定的發酵生產工藝,並能進行小規模的生產。但這種發酵生產ATP、CTP等的工藝過程還存在很多的弊端,比如工藝複雜、操作繁瑣、生產成本高,而且不適合大規模生產。主要原因如下1.發酵底物濃度低,一般低於2%或20mg/ml,所得產物量不高,因而導致發酵設備利用率低,勞動生產率低,使生產成本增加。
2.發酵液預處理工藝不合理,使用離心分離和酒精沉澱再回溶的方法,能耗大,時間長,回收率低。
3.分離純化工藝不合理,分離純化中採用的方法和使用的設備已落後,使周期長,回收率低,產品質量低,成本增加。
尿苷二磷酸(UDP)是合成阿普林津(Ampligen)的原料之一。阿普林津是一種錯配雙鏈RNA藥物(PolyIC12U),具有抗病毒和免疫調節的雙重作用,高效低毒。目前,在國外該藥正在進行一些疾病的臨床實驗,包括慢性疲勞綜合症、愛滋病、B肝等。
對於尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)的製備方法很少有人進行深入的研究,只是其衍生物,尤其是UDP-糖類由於藥用廣泛而引起國內外的重視。比如,專利文獻98801453.X公開了一種尿苷二磷酸-N-乙醯葡糖胺的製備方法,該方法使用微生物菌體,由尿苷酸(UMP)和N-乙醯葡糖胺製備尿苷二磷酸-N-乙醯葡糖胺(UDPAG),並使N-乙醯葡糖胺激酶共存。
但到目前為止,國內仍沒有高效率、低成本、操作簡便的UTP和UDP生產工藝。
發明內容
本發明的目的是提供一種尿苷二磷酸的製備方法,該方法生產周期短,產品得率高、成本低、操作簡便。
本發明所述尿苷二磷酸的製備方法,包括如下步驟1)將尿苷一磷酸與啤酒酵母混合發酵,發酵終止後得尿苷三磷酸發酵液;2)將所述的尿苷三磷酸發酵液進行預處理,並分離純化;3)將純化後的尿苷三磷酸進行酸熱降解;4)最後將酸熱降解後的產物進行過濾、分離和精製處理。
其中,尿苷一磷酸(UMP)作為底物,以選用高純度的為佳,如電泳純度在75%以上,紫外純度在80%以上。
本發明所用的啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)可採用新鮮啤酒酵母,也可採用啤酒生產過程中淘汰的啤酒酵母,從經濟角度考慮,採用啤酒生產中淘汰的但仍具有較高酶活性的酵母,該酵母細胞存活率在90%以上即可。其經過離心或壓榨後成乾酵母,酵母的含量(重量百分比)在20~25%。
在混合發酵時,每升發酵物中含有尿苷一磷酸40~80克,啤酒酵母400~600克,葡萄糖0.2~0.5mol,磷酸二氫鈉0.3~0.5mol和氯化鎂0.01~0.1mol,剩餘的體積由水補足。
本發明啤酒酵母在冷凍條件下保存為佳,比如冷凍溫度在-15℃~-20℃之間,冷凍時間為5天~100天。
混合發酵的發酵溫度為30~40℃,pH值為6~8,發酵時間為5~8小時。本發明採用一步法發酵,相對於核苷酸發酵來說,縮短發酵時間1/3~1/2,此發酵過程的轉化率可達75%以上。
經快速紙電泳跟蹤檢測發現可以終止發酵,調pH值為2.0~3.0時可使發酵終止,所用的終止反應劑為三氯乙酸、鹽酸或硫酸。優選為三氯乙酸,其作用是蛋白變性劑,使相關酶失活。
對尿苷三磷酸發酵液進行預處理時,採用微濾方法,所述的微濾也稱微孔過濾,其濾膜的孔徑為0.05~5.0μm,微濾的主要作用是固液分離和去除發酵液中的部分蛋白,減少分離純化步驟中的負擔。微濾膜的材質可採用有機和無機兩大類,有機聚合物有醋酸纖維素、聚丙稀、聚碳酸酯、聚碸、聚醯胺等。無機膜材料有陶瓷和金屬等,其中,優選的為孔徑為0.1μm的無機陶瓷膜。
經微濾處理後的溶液澄清,無懸浮物。但經過預處理後還需進行分離純化,分離純化可採用本領域常用的方法,比如離子交換法。
離子交換法以選用強鹼型陰離子交換樹脂為佳,比如HZ201、HZ202、717、或711等。所用的條件可為上柱總量為陰離子交換樹脂總交換量的1.18%~2.36%,即20~40mg UTP/ml樹脂,上柱液濃度UTP含量10~25g/L,上柱pH2.0~3.0,上柱流速4倍~8倍樹脂體積/小時,上柱的終點快速紙電泳檢測有UTP斑點出現。
淋洗劑0.02N、pH2.0 NaCl溶液,洗滌流速4倍~8倍樹脂體積/小時,洗滌終點快速紙電泳檢測無斑點。
洗脫劑0.5N、pH2.0 NaCl溶液,洗脫流速0.5倍~1.0倍樹脂體積/小時。
收集起點95%乙醇中產生白色沉澱或溶液OD260大於30 OD260/ml。
收集終點95%乙醇中無白色沉澱產生或溶液OD260小於30 OD260/ml。
在對尿苷三磷酸進行酸熱降解時,pH值為0.8~1.2,降解溫度為90~100℃,降解時間為30~40分鐘。
對於降解獲得的尿苷二磷酸需要經過過濾、分離和精製的一系列處理。
其中,過濾採用納濾(Nanofilitration,NF)分離方法,其不僅可以截流分子量介於反滲透膜和超濾膜之間的物質,而且還對無機鹽有一定的截流率,本發明採用的是卷式或管式的截留分子量為200~300道爾頓的納濾設備。
分離時可採用前述的分離純化方法,比如離子交換法。
離子交換法以選用強鹼型陰離子交換樹脂為佳,比如HZ201、HZ202、717或711等。所用的條件可為上柱總量為陰離子交換樹脂總交換量的1.77%~2.83%,即25~40mg UDP/ml,樹脂上柱液濃度UDP含量10~25g/L,上柱pH7.0~8.0,上柱流速4倍~8倍樹脂體積/小時,上柱的終點快速紙電泳檢測有UDP斑點出現。
淋洗劑0.012N、pH2.0 NaCl溶液,洗滌流速4倍~8倍樹脂體積/小時,洗滌終點快速紙電泳檢測無UMP斑點。
洗脫劑0.5N NaCl溶液,洗脫流速0.5倍~1.0倍樹脂體積/小時。
收集起點95%乙醇中產生白色沉澱或溶液OD260大於30 OD260/ml。
收集終點95%乙醇中無白色沉澱產生或溶液OD260小於30 OD260/ml。
本發明的精製可採用乙醇沉澱法以去除雜質。
所述的乙醇沉澱法採用兩次沉澱處理過程,具體為先用2~6倍量的95%~100%乙醇沉澱,然後將沉澱溶解為80~120g/l的溶液,調pH值2.0~4.0,再用15~20倍量的無水乙醇沉澱。
精製後的產品還可經過本領域常用的方法進行乾燥處理,比如抽濾乾燥、真空乾燥等。
本發明的尿苷二磷酸的製備方法,具有以下優點(1)採用高底物濃度,UMP濃度在4%以上。
(2)採用一步法發酵,即底物與酵母混合後進行發酵,縮短發酵時間1/3~1/2。
(3)使用微濾設備對發酵液進行預處理。在發酵液的預處理中引入微濾設備,使用孔徑為0.1μm無機陶瓷膜對發酵液進行微濾處理,微濾時間為1~4小時,微濾的主要作用是固液分離和去除發酵液中的部分蛋白,減少分離純化步驟中的負擔。經過微濾處理的發酵液可以直接上柱分離純化,大大縮短了預處理的時間。同時也提高了產品回收率,達到95%~100%。
(4)分離純化工藝過程中的提高上柱和洗滌的流速,縮短分離純化周期。
(5)產品的紫外純度在92%以上,含水量在7%以下,質量得率(產物純量與原料純量之間質量百分比)在30%以上。
經過一系列的改進,相對於核苷酸發酵來說,生產UDP的發酵時間縮短為1/2~2/3;預處理時間縮短為1/3;分離純化的時間縮短為2/3,由此產生的經濟效益顯著。
圖1為本發明尿苷二磷酸生產工藝流程;圖2為本發明尿苷三磷酸的分離圖譜;上柱pH2.5,上柱流速22L/hr;淋洗0.02N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速22-23L/hr;;洗脫0.5N NaCl、pH2.0溶液;洗脫流速2.5L/hr;樹脂HZ201,50-80目,上柱量為HZ201樹脂總交換量的1.24%;圖3為本發明尿苷二磷酸的分離圖譜。
上柱pH8.0,上柱流速12L/hr;淋洗低鹽洗脫0.012N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速15L/hr;洗脫高鹽洗脫0.5N NaCl溶液;洗脫流速1.2L/hr;樹脂HZ201,80-120目,上柱量為HZ201樹脂總交換量的1.92%。
具體實施例方式
以下實施例用於說明本發明,但不用來限制本發明的範圍。
實施例1圖1為本發明尿苷二磷酸生產工藝流程;本實施例採用一次發酵和降解的方法來生產尿苷二磷酸。
1.發酵首先採用一步法對尿苷一磷酸進行發酵(6升規模),發酵條件UMP318.7g(按電泳純度75.3%投料);啤酒酵母3kg;Glu 432g;NaH2PO4280.8g;MgCl224.4g;pH6.7;H2O加至6升;37℃保溫,靜止發酵6小時。
啤酒酵母為啤酒生產中淘汰酵母,酵母細胞存活率為98%以上,其壓榨後成乾酵母中酵母的含量(重量百分比)為25%。
然後用快速紙電泳進行跟蹤檢測發酵產物。
用三氯乙酸調pH值到2.0,發酵終止,發酵轉化率為79%。
2.微濾除蛋白使用孔徑為0.1μm無機陶瓷膜處理髮酵液,微濾前先過80目的篩子除去過大的固體顆粒,微濾中用35L的去離子水洗濾膜,分5~6次加入。
微濾後,溶液澄清,無懸浮物,產品回收率98±2%。
3.UTP分離,採用陰離子交換法(1)方法使用HZ201氯型強鹼型陰離子交換樹脂,上柱pH2.5,上柱流速22L/hr;淋洗低鹽洗脫0.02N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速22-23L/hr;洗脫高鹽洗脫0.5N NaCl、pH2.0溶液;洗脫流速2.5L/hr。
(2)結果見圖2。
上柱量為HZ201樹脂總交換量的1.24%,即21mg UTP/ml樹脂。
柱分離中產品損失率5%以內。
(3)鑑定方法開始收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中產生白色沉澱或溶液OD260大於30 OD260/ml。
停止收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中無白色沉澱產生或溶液OD260小於30 OD260/ml。
4.酸熱降解先用6N鹽酸調pH值到1.0,加熱煮沸35min,採用高效液相和紙電泳檢測,高效液相顯示,降解得率45%。
5.納濾除鹽(1)方法使用截流分子量為200-300道爾頓的納濾設備,10N氫氧化鈉調pH值到8.0;納濾中用60L的去離子水洗,分5~6次加入。
(2)結果納濾後產品濃度為10g/L,除鹽率99%,產品損失率低於3%。
6.UDP離子交換分離(1)方法使用HZ201氯型強鹼型陰離子交換樹脂,上柱pH8.0,上柱流速12L/hr;淋洗低鹽洗脫0.012N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速15L/hr;
洗脫高鹽洗脫0.5N NaCl溶液;洗脫流速1.2L/hr。
(2)結果見圖3。
上柱量為HZ201樹脂總交換量的1.92%,即27.2mg/ml樹脂。
柱分離中產品損失率1%以內。
(3)鑑定方法開始收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中產生白色沉澱或溶液OD260大於30 OD260/ml。
停止收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中無白色沉澱產生或溶液OD260小於30 OD260/ml。
7.精製(1)方法一次沉澱pH8.0,5倍體積的95%乙醇沉澱,4℃保存12小時;二次沉澱將沉澱溶解為濃度100mg/ml的溶液,6N鹽酸調pH3.0,20倍體積無水乙醇沉澱,0℃保存3hr;抽濾乾燥用G4砂芯漏鬥抽濾,乾粉用五氧化二磷真空乾燥。真空度為-0.1Mpa,溫度為40℃以下。
(2)結果一次沉澱產品損失率0.2%;二次沉澱產品狀態鬆散,可以直接抽濾。
採用本實施例的方法獲得的尿苷二磷酸產品參數紫外含量90%,HPLC97.5%,電泳純度84.5%,水分含量6.7%,質量得率32%。
實施例21.發酵首先採用一步法對尿苷一磷酸進行發酵(5升規模),發酵條件UMP 240g(按電泳純度75.3%投料);啤酒酵母2.4kg;Glu 312g;NaH2PO4216g;MgCl257.1g;pH6.2;H2O加至5升;32℃保溫,靜止發酵8小時。
啤酒酵母為啤酒生產中淘汰酵母,酵母細胞存活率為90%以上,其壓榨後成乾酵母中酵母的含量(重量百分比)為20%。
然後用快速紙電泳進行跟蹤檢測發酵產物。
用三氯乙酸調pH值到3.0,終止反應,發酵轉化率78.9%。
2.微濾除蛋白使用孔徑為0.1μm無機陶瓷膜處理髮酵液,微濾前先過80目的篩子除去過大的固體顆粒,微濾中用30L的去離子水洗濾膜,分5~6次加入。
微濾後,溶液澄清,無懸浮物,產品回收率98±2%。
3.UTP分離,採用陰離子交換法(1)方法使用HZ201氯型強鹼型陰離子交換樹脂,上柱pH2.0,上柱流速18L/hr;低鹽洗脫0.02N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速19L/hr;高鹽洗脫0.5N NaCl、pH2.0溶液;洗脫流速2L/hr。
(2)結果上柱量為HZ201樹脂總交換量的1.77%,即30mg UTP/ml樹脂,柱分離中產品損失率5%以內。
(3)鑑定方法開始收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中產生白色沉澱或溶液OD260大於30 OD260/ml。
停止收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中無白色沉澱產生或溶液OD260小於30 OD260/ml。
4.酸熱降解先用6N鹽酸調pH值到0.8,加熱90℃保持40min,採用高效液相和紙電泳檢測,高效液相顯示,降解得率40%。
5.納濾除鹽(1)方法使用截流分子量為200-300道爾頓的納濾設備,10N氫氧化鈉調pH值到8.0;納濾中用50L的去離子水洗,分5~6次加入。
(2)結果納濾後產品濃度為10g/L,除鹽率99%,產品損失率低於3%。
6.UDP離子交換分離(1)方法使用HZ201氯型強鹼型陰離子交換樹脂,上柱pH7.0,上柱流速12L/hr;
低鹽洗脫0.012N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速12L/hr;高鹽洗脫0.5N NaCl溶液;洗脫流速1.0L/hr。
(2)結果上柱量為HZ201樹脂總交換量的1.77%,即25mgUDP/ml樹脂。
柱分離中產品損失率1%以內。
(3)鑑定方法開始收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中產生白色沉澱或溶液OD260大於30 OD260/ml。
停止收集取高鹽洗脫液1~2滴,滴入95%乙醇中無白色沉澱產生或溶液OD260小於30 OD260/ml。
7.精製(1)方法一次沉澱pH7.0,2倍體積95%乙醇沉澱,0℃保存10小時;二次沉澱將沉澱溶解為濃度80mg/ml的溶液,6N鹽酸調pH2.0,15倍體積無水乙醇沉澱,4℃保存4hr;抽濾乾燥用G4砂芯漏鬥抽濾,乾粉用五氧化二磷真空乾燥。
(2)結果一次沉澱產品損失率0.2%;二次沉澱產品狀態鬆散,可以直接抽濾。
實施例3基本步驟同實施例1,不同的是,一步法發酵時,發酵條件UMP 500g(按電泳純度75.3%投料);啤酒酵母(新鮮)3.5kg;Glu 493.8g;NaH2PO4360g;MgCl25.71g;pH7.0;H2O加至8升;39℃保溫,靜止發酵7小時。發酵轉化率77.5%。
使用71 7氯型強鹼型陰離子交換樹脂進行UTP分離純化時,上柱pH2.5,上柱流速26L/hr;低鹽洗脫0.02N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速26L/hr;高鹽洗脫0.5N NaCl、pH2.0溶液;洗脫流速2.8L/hr。
上柱量為717樹脂總交換量的2.36%,即40mg UTP/ml樹脂,酸熱降解時,先用6N鹽酸調pH值到1.2,加熱煮沸30min,採用高效液相和紙電泳檢測,高效液相顯示,降解得率42%。
使用截流分子量為200-300道爾頓的納濾設備進行納濾除鹽,10N氫氧化鈉調pH值到8.0;納濾中用90L的去離子水洗,分5-6次加入。納濾後產品濃度為10g/L,除鹽率98%,產品損失率低於3%。
使用717氯型強鹼型陰離子交換樹脂進行UDP離子交換分離,上柱pH8.0,上柱流速18L/hr;低鹽洗脫0.012N、pH2.0 NaCl溶液;洗脫流速18L/hr;高鹽洗脫0.5N NaCl溶液;洗脫流速1.5L/hr。上柱量為717樹脂總交換量的2.05%,即29mg/ml樹脂。
精製時,一次沉澱pH7.5,6倍體積95%乙醇沉澱,0℃保存16小時;二次沉澱將沉澱溶解為濃度120mg/ml的溶液,6N鹽酸調pH4.0,18倍體積無水乙醇沉澱,0℃保存5hr。
將實施例1-3的生產方法進行對比,結果見表1。
表1實施例1-3檢測結果
雖然,上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述,但在本發明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬於本發明要求保護的範圍。
權利要求
1.一種尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於包括如下步驟1)將尿苷一磷酸與啤酒酵母混合發酵,發酵終止後得尿苷三磷酸發酵液;2)將所述的尿苷三磷酸發酵液進行預處理,並分離純化;3)將純化後的尿苷三磷酸進行酸熱降解;4)最後將酸熱降解後的產物進行過濾、分離和精製處理。
2.根據權利要求1所述尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於在混合發酵時,每升發酵物含有尿苷一磷酸40~80克,啤酒酵母400~600克,葡萄糖0.2~0.5mol,磷酸二氫鈉0.3~0.5mol和氯化鎂0.01~0.1mol。
3.根據權利要求1或2所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於所述啤酒酵母為酵母細胞存活率在90%以上的淘汰啤酒酵母。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於混合發酵的發酵溫度為30~40℃,pH值為6~8,發酵時間為5~8小時。
5.根據權利要求1~4中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於調pH值至2.0~3.0使發酵終止,所用終止反應劑為三氯乙酸、鹽酸或硫酸。
6.根據權利要求1~5中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於所述的預處理採用微濾處理,所用微濾膜的孔徑為0.05~5.0μm。
7.根據權利要求1~6中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於所述的分離純化採用離子交換法,以選用強鹼型陰離子交換樹脂為佳。
8.根據權利要求1~7中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於所述酸熱降解時,pH值為0.8~1.2,溫度為90~100℃,降解時間為30~40分鐘。
9.根據權利要求1~8中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於所述的過濾採用截留分子量為200~300道爾頓的納濾設備。
10.根據權利要求1~8中任一項所述的尿苷二磷酸的製備方法,其特徵在於所述的精製採用乙醇沉澱法,為先用2~6倍量的95%~100%乙醇沉澱,然後將沉澱溶解為80~120g/l的溶液,調pH值2.0~4.0,再用15~20倍量的無水乙醇沉澱。
全文摘要
本發明提供了一種尿苷二磷酸的製備方法,其包括如下步驟將尿苷一磷酸與啤酒酵母混合發酵,發酵終止後得尿苷三磷酸發酵液;然後將所述的尿苷三磷酸發酵液進行預處理,並分離純化;再將純化後的尿苷三磷酸進行酸熱降解;最後將酸熱降解後的產物進行過濾、分離和精製處理。本方法獲得的尿苷二磷酸產品的紫外純度在92%以上,含水量在7%以下,質量得率在30%以上,相對於核苷酸發酵來說,本方法使生產UDP的發酵時間縮短為1/2~2/3;預處理時間縮短為1/3;分離純化的時間縮短為2/3。
文檔編號C12R1/85GK1962875SQ20061011473
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月22日 優先權日2006年11月22日
發明者曾濱, 饒林凡, 黎高沃 申請人:北京燕京中科生物技術有限公司