用於藥物濫用治療的半抗原載體軛合物及其製備方法

2023-10-21 04:28:52 2

專利名稱：用於藥物濫用治療的半抗原載體軛合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及藥物濫用的治療。更具體地說，本發明涉及利用激發抗體應答的藥物/半抗原載體軛合物和/或利用藥物/半抗原載體軛合物的抗體治療藥物濫用的方法。
背景技術：
藥物在全世界範圍內，特別是在美國的廣泛使用和濫用已達到盛行的程度。合法和非法藥品的過剩及其濫用已經成為公共政策中的嚴重焦點問題，其明顯的醫療和社會後果影響到了社會的各個層面。一些使用者生活在與貧窮和非法行為相關的高危人群中。另一些使用者則可歸為娛樂使用者，他們的危險在於(a)藥物能使他們上癮，(b)易成為過度使用該藥物的使用者，或者(c)多種因素的共同影響，包括個人情況，艱難狀況，環境和可接近性。對藥物濫用、包括對多種藥物濫用的充分治療要求幹預手段的創新性和創造性。
尤其成問題的三種易上癮藥物是古柯鹼、海洛因和尼古丁。古柯鹼是從植物古柯(Erythroxylon coca)的葉子中提取出的生物鹼。僅在美國，目前就有五百萬以上的古柯鹼固定使用者，其中至少有六十萬是嚴重上癮者(Miller等，(1989)紐約國家醫學雜誌(N.Y.State J.Med.)390-395頁；和Carroll等，(1994)藥學新聞(Pharm.News.)111-16)。在這些人群中，有相當大的一部分成癮者正在積極尋求治療。例如，在1990年，有38萬人在尋求治療古柯鹼上癮問題，此數量目前還在上升。在那時，據估算每年有10萬例與使用古柯鹼有關的急診室病人入院。與古柯鹼累積效果相關的暴力犯罪、個人生產力的喪失、疾病和死亡已成為一個國際性的問題。
缺乏有效治療可卡困成癮問題的方法強烈地表明必須開發新的途徑。導致缺乏成功的治療方法的其他因素是，隨著時間的不同，古柯鹼濫用的方式也在變化。在一篇標題為「1994年治療古柯鹼濫用的化學方法」的文章中(Carroll等，(1994)藥學新聞，第1卷第2期)，Carroll等人報告說自八十年代中期以來，鹽酸鹽(古柯鹼)的靜脈和鼻腔給藥以及古柯鹼游離鹼的吸入已經成為給藥的常用途徑，將導致持續30-60分鐘的欣快和精神運動刺激。與其他一些濫用藥物不同，古柯鹼可以導致持續數小時的狂歡。這種作用導致上癮，在某些情況下，會導致毒性結果(Carrill等人，藥學新聞，同上)。
對藥物濫用的治療非常有限，並且對古柯鹼上癮沒有有效的長期治療。治療包括但不限於，在給予用作類阿片受體或藥物的拮抗劑的藥物的同時進行勸說以嘗試減少與藥物上癮相關的嗜好。一種治療方法是解毒療法。即使是病人生理、社會和心理改善的暫時緩解都優於濫用的繼續和升級及其相關的負面醫療和人際後果(wilson等，Harrison’s內科學原理，第2卷，第12版，McGraw-Hill出版社(1991)，第2157-8頁)。更具體地說，有關古柯鹼濫用的藥理學治療方法通常涉及抗抑鬱藥的使用，例如可以幫助控制脫癮的心理方面、但是通常不直接影響古柯鹼的生理學的地昔帕明或氟西汀。(Kleber(1995)臨床神經藥理學1896-109)。另外，它們的有效性變化很大(Brooke等，(1992)藥物酒精依賴性Drug AlcoholDepend. 3137-43)。在某些研究中，地昔帕明減少了自我服用(Tella(1994)關於藥品依賴問題的大學會議摘要；Mello等，(1990)藥理學與實驗治療學雜誌254926-939；以及Kleven等，(1990)行為藥理學1365-373)，但是在治療後的戒癮率不超過70％(Kosten(1993)藥品依賴性問題，國立濫用藥物研究所(NIDA)研究專刊85)。也使用了加強多巴胺能傳遞的藥品，例如溴隱亭，但是這些藥品的好處部分受到其毒性的限制(Taylor等，(1990)西部醫學雜誌152573-577)。旨在用美沙酮替換類阿片成癮的新藥，例如丁丙諾啡，已在與多巴胺能系統交叉幹預的基礎上得以使用，但是僅有有限的臨床研究信息(Fudula等，(1991)國立濫用藥物研究所研究專刊，105587-588)。據報導丁丙諾啡能減少古柯鹼的自我服用(Carroll等，(1991)精神藥理學106439-446；Mello等，(1989)科學245859-862；以及Mello等，(1990)藥理學與實驗治療學雜誌254926-939)；但是，治療後的古柯鹼脫癮率通常不超過50％(Gastfried等，(1994)關於藥品依賴問題的大學會議摘要；和Schottenfeld等，(1993)藥物依賴性問題，NIDA，10研究專刊311)。
現行用於治療古柯鹼成癮的療法至少有四個導致高復發率的主要局限。第一，也是最重要的是，在古柯鹼濫用和成癮方面導致的神經化學事件很複雜(Carroll等，(1994)，同上)。結果，單獨作用的神經藥理學方法，例如抑制多巴胺攝取，不足以克服成癮現象。第二，目前用於治療古柯鹼成癮的藥品基本上有很大的副作用，限制了它們的功效。第三，在這些病人人群中藥品治療的順從是有問題的。目前的療法需要經常去造訪醫療保健提供者和/或自我服用藥品，以治療其成癮的習性。因為許多這些藥能阻止與古柯鹼相關的欣快，因此會很不情願服用這些藥。(Carroll等，(1994)同上；Kosten等，(1993)藥物依賴問題，NIDA研究專刊13285；Schottenfe1d等，(1993)藥物依賴問題，NIDA研究專刊132311)。
第四，由於涉及藥理學治療的化學問題很複雜，其中許多不能與現行使用的其他療法或臨床試驗相容。最後，大多數藥物療法研究是針對低強度門診病人進行的，與高強度門診病人無關，也不與其他看上去為成功治療古柯鹼依賴者所需要的其他精神社會治療有關。
(Rao(1995)精神病學紀事26(6)363-368)。
海洛因是從罌粟中提取的一種類阿片藥物。它是一種最被廣泛濫用的類阿片藥物，在美國的非法市場上可以獲得。目前成癮者能夠獲得的海洛因質量很高(45-80％純度)，導致身體依賴程度比往年更高。海洛因更強的方式通常是通過吸入或嗅入服用。這種方式對於那些對用靜脈注射這一通常給藥方式不適的人來說更容易開始上癮。海洛因濫用者的死亡率很高，早死源於多種情況，例如因共用注射用具而導致的嚴重的細菌感染和HIV。在美國，沒有關於海洛因濫用者人數的準確數目，但是根據過量死亡者、被逮捕的成癮者和那些申請治療者人數的推斷，海洛因濫用者人數在75-100萬。
注射海洛因溶液會產生一種劇烈的，包括溫暖、味道、高度等一系列的快感(可與性慾高潮相比)。海洛因迅速水解為6-單乙醯基嗎啡(6-MAM)，然後再水解為嗎啡。海洛因和6-MAM都是高液體可溶的，都比嗎啡更易穿過血腦屏障。有一個能持續45秒至數分鐘的欣快起始狀態，接下來是平靜期，根據劑量多少，該平靜期可持續3-5小時，在此之後，當成癮者變得急躁而富有攻擊性時，出現戒癮症狀，並有一種「疾病」的通常感覺。
目前使用的治療方法經常涉及旨在治療戒癮體徵和症狀的藥理學幹預。解毒通常通過給予服用長效類阿片，例如美沙酮開始。另一種方式是使用高血壓藥物可樂定，可以緩解戒癮的許多症狀，但不能緩解特徵性的癮和全身化疼痛。與大多數成癮現象相似，其復發率很高。對病人的長時間的管理以及靠美沙酮穩定，是目前最為成功的治療方法，它需要警醒和順從。
尼古丁(1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷)是從菸葉中提取的一種生物鹼。尼古丁在全球廣泛使用，並能以多種形式合法獲得，例如香菸、雪茄、吸管菸葉和無煙(咀嚼)菸葉。儘管尼古丁的成癮特性和吸菸的危害已眾所周知很多年(Slade等，(1995)美國醫學會雜誌JAMA 274(3)225-233)，吸菸仍然十分流行。據估計，美國有5100萬人吸菸，另據疾病控制和預防中心估計，每年死於與吸菸相關的疾病的人數為42萬。
最為普遍的尼古丁輸送系統是香菸。香菸含有6-11mg尼古丁，吸菸者一般吸入其中的1-3mg。典型的每天一包煙的吸菸者每天吸入20-40mg尼古丁，血漿濃度達到25-50ng/ml。尼古丁的血漿半衰期為2小時左右；主要代謝物可替寧的半衰期為19小時(Henningfield(1995)新英格蘭醫學雜誌333(18)1196-1203)。
由於尼古丁能合法而廣泛地獲得，因此與古柯鹼和海洛因不同，反對其使用的壓力相對較小。儘管大部分吸菸成癮者明確表示戒菸，並且許多曾真的試圖去戒，每年只有2％-3％的吸菸者成為不吸菸著(Henningfield(1995)同上)。試著戒菸的吸菸者的復發率很高，這表明強大的尼古丁依賴作用(O』Brien等，(1996)柳葉刀347237-240)。
尼古丁成癮是一個長期的、易復發的毛病。尼古丁作用於中緣應答(mesolimbic reward)系統，最終導致生理依賴。有證據表明，尼古丁結合到中樞和外周神經系統中的尼古丁乙醯膽鹼受體的α-亞單位上，導致多巴胺釋放增加。腦中的尼古丁乙醯膽鹼受體數目的增加加劇了對尼古丁的生理性依賴(Balfour(1994)成癮891419-1423)。尼古丁的這些生理作用是心理性成癮的強有力的增強劑。尼古丁使用者提高了識別能力並改善了情緒，以及和戒癮相關的負面影響(例如戒癮症狀)，是繼續使用菸草的強有力的動因。
對尼古丁依賴缺乏有效的治療方法以及試圖和放棄使用其的人的低成功率表明強烈需要一種新的療法。目前，兩種最流行的療法是尼古丁polacrilex(「尼古丁口香糖」)和經皮釋放系統(「尼古丁貼片」)。這些「替代藥物療法」在一段時間內向使用者提供少量的尼古丁並慢慢地使其戒除。這些方法將減少戒癮症狀，並對那些以前依賴於香菸的使用者也有效果(例如所期望的情緒和注意力集中狀態)。(Henningfield(1995)同上)。但是，這些方法也有其弱點，如低滲透性，無動機戒癮者的復發。並且，使用尼古丁口香糖也有負面效應，例如口腔刺激，頜骨肌肉潰瘍，消化不良，噁心，呃逆，感覺異常。尼古丁貼片的負面效果，據報導包括皮膚反應(騷癢或紅斑)，睡眠紊亂，胃腸道毛病，嗜睡，焦慮，頭暈和出汗。(Haxby(1995)美國健康系統藥物學雜誌Am.J.Health-Syst.Parm.52265-281)。
有關治療藥物成癮的實驗性診斷方法和治療方法已見諸文字，但未實際使用。例如，用接種疫苗來作為治療藥物成癮的方法，從前已經在理論上描繪過。Bonese等人利用已對嗎啡免疫的恆河猴研究了海洛因自我服用的變化(Bonese等，(1974)自然252708-710)。Bagasra等人研究了將古柯鹼-KLH疫苗作為防止上癮的手段(免疫藥物學(1992)23173-179)，雖然沒有形成結論性的結果，Bagasra所使用的方法也存有爭議。(Gallacher(1994)免疫藥物學2779-81)。很明顯，如果一個軛合物在治療方案中很有用，那麼它肯定能夠升高可識別體內循環的游離古柯鹼、海洛因或尼古丁的抗體。Cerny(WO92/03163)公開了針對這些藥品的疫苗和免疫血清。疫苗由結合在載體蛋白上產生抗體的半抗原組成。另外也披露了針對該藥品的抗體的製備，以及這些抗體在那些已經服用這些藥物的患者的解毒治療中的使用。Carrera等在自然378727-730(1995)中披露了誘導抗古柯鹼抗體的古柯鹼-KLH疫苗的合成，這些抗體阻礙了藥物在大鼠中的運動效果。Blincko在美國專利No.5,256,409中披露一種疫苗，它包含與得自地昔帕明/丙咪嗪類藥物的一種半抗原相結合的一種載體蛋白，和與得自去甲替林/阿米替林類藥物的另一種半抗原結合的一種載體蛋白。Liu等在美國專利No.5,283,066中披露了能誘導免疫應答的半抗原-聚合固體支持複合物的使用。
被動地服用單克隆抗體以治療藥物濫用，在以前已有所描述(參見，Killian等，(1978)藥學，生化學與行為9347-352；Pentel等(1991)藥物代謝與處置1924-28)。在該方法中，針對選定藥品的事先形成的抗體被動地給動物服用。雖然這些數據顯示了對成癮治療的免疫學方法的可行性，被動免疫作為人類治療的長期方法則具有一系列的重大缺陷，第一，如果用於被動治療的抗體是從非人類途徑獲得的，或者是單克隆的抗體，這些製劑將被病人視為外來的蛋白質，因此將對外來抗體產生很快的免疫應答。這種免疫應答可中和被動服用的抗體，阻止其有效性，急劇減少隨後的保護時間。另外，重新服用同類抗體會出現問題，因為會有潛在的高強度應答。這些問題可以通過從獲得疫苗免疫的人類捐獻者中生產免疫球蛋白的方式得以克服。在實施例中，將更具體地討論這種方法。第二，被動給藥的抗體相對較快地從循環中被清除。所給抗體在體內的半衰期為2.5-23天，這將取決於同位型。因此當被動服用抗體而不是通過免疫誘導抗體時，只能獲得短期的功效。
對藥物成癮採用的另外一種免疫學方法是使用催化抗體，該抗體能夠幫助病人體內古柯鹼分子的水解(Landry等，(1993)科學2591899-1901)。該催化抗體是通過用轉運狀態的與載體蛋白相聯的古柯鹼類似物對實驗動物進行免疫而產生的；然後選定一個單克隆抗體，其具有可期望的催化活性。雖然這一方式理論上很吸引人，它也存在一些嚴重的問題。催化抗體必須被動服用，因此它具有被動抗體治療所具有的所有缺點。生成活性抗體的主動免疫是不可行的，因為針對轉運態類似物的抗體中的酶活性很小，並且在多克隆製劑中，活性不能被識別。此外，這類催化抗體的普通酯酶樣活性以及在基因多樣化的個體中的活性免疫反應的不可控特性，使得它們成為潛在的毒性分子，特別是當它們在病人體內生成時。
Yugawa等(EP 0 613 899 A2)提出使用含有用來生成抗體的古柯鹼衍生物的古柯鹼-蛋白軛合物來測定血樣中的古柯鹼或古柯鹼衍生物。Syva專利(美國專利No.3,888,866，No.4,123,431和No.4,197,237)公開了產生用於免疫測定的古柯鹼抗體的軛合物。所披露的是利用從苯甲醯基愛康寧和古柯鹼衍生的重氮鹽的BSA的軛合物，利用古柯鹼和去甲古柯鹼的對亞氨基酯衍生物與載體軛合，從而製得軛合物。Biosite(WO 93/12111)公開了利用在各種古柯鹼衍生物的苯環的對位加入醯胺鍵而增強了其對水解的穩定性的古柯鹼的軛合物。Strahilevtz專利(美國專利No.4,620,977；4,813,924；4,834,973和No.5,037,645)公開了利用內源性物質和藥物的蛋白軛合物治療疾病，防止對於心理性半抗原的依賴，以及用於免疫測定，免疫透析和免疫吸收。
Bjerke等(1987)在免疫學方法雜誌96239-246中描述了與聚L-賴氨酸共價結合的可替寧4』-羧酸的軛合物產生尼古丁代謝物可替寧的抗體的用途，以用於測定可替寧在生理液體中的存在。另外，Abad等(1993)在分析化學65(22)3227-3231中描述了與BSA軛合的3』(羥甲基)尼古丁半琥珀酸酯產生尼古丁抗體的用途，以用於用來測定吸菸者的煙霧冷凝物中的尼古丁的酶聯免疫吸附測定(ELISA)。但是，參考文獻中既沒有教導也沒有建議尼古丁載體軛合物作為對抗尼古丁濫用的疫苗的用途。
對於藥物成癮，特別是對於古柯鹼、海洛因和尼古丁成癮的有效治療方法還未形成。因此，需要開發一種藥物成癮，特別是古柯鹼和尼古丁成癮的長期治療方法，它總體上不依賴於成癮個體的順從和自我服用。

發明內容
本發明克服了上述缺點並提供了治療藥物濫用的方法。利用治療組合物，特別是半抗原載體軛合物，本發明以上癮者體內抗藥物抗體的形式激發了免疫應答，隨後與免疫接種後的個體內的藥物接觸，中和了這些藥物，如果不清除，就會使預期的藥理學作用降低。本發明提供了一種藥物成癮，待別是古柯鹼、海洛因和尼古丁成癮的治療方法，它是基於給受治療者接種藥物/半抗原載體軛合物，更具體地說，接種古柯鹼-蛋白、海洛困-蛋白或尼古丁-蛋白軛合物。本發明的治療組合物包含至少一種半抗原和至少一種含有T細胞表位的載體，當它們結合形成半抗原載體軛合物時，能刺激抗半抗原抗體的產生。半抗原可以是藥物或藥物衍生物，特別是古柯鹼、海洛因或尼古丁。當給上癮者服用含有藥物/半抗原載體軛合物的治療組合物時，該藥物的特異性抗藥物抗體被激發。治療免疫方案足以激發並保持抗藥物抗體的高效價，使得在通過治療提供了保護的期間內，每次與藥物接觸後，抗藥物抗體就中和足夠量的藥物，以減小，如果不是清除的話，藥物的藥理學作用。還提供了製備這些軛合物的新的方法。還提供了被動免疫方法，其中用通過用本發明的半抗原載體軛合物進行接種而在供體中產生的抗體治療患者。
參照下列附圖、說明書和權利要求書，本發明的這些以及其他特性、內容和優點將變得更清晰可見和更好理解。
附圖的簡要描述

圖1A表示多種可能的、隨意標記的、半抗原載體軛合物的「分支」，以便於理解在本發明中所使用的合適的化合物和軛合物。
圖1B表示多種可能的、隨意標記的、半抗原載體軛合物的「分支」，以便於理解在本發明中所使用的合適的化合物和軛合物，其中Q』是修飾的含有T細胞表位的載體，例如修飾的蛋白質載體。
圖2表示在本發明中有用的五種試劑的結構。
圖3表示按照本發明的教導，適於軛合和給藥的四種供選擇的濫用藥物的結構。
圖4A表示顯示天然(單體和五聚體)和重組霍亂毒素-B(CTB)(單體)的相對分子量的凝膠。
圖4B表示顯示在pH3-9範圍內的CTB五聚體穩定性的凝膠。
圖4C是Western Blot凝膠圖，表明利用能導致CTB五聚體的周質表達而得到的35峰值部分rCTB#32和rCTB#53。
圖5A是表明ELISA的圖表，其中抗CTB抗體檢測了rCTB在ELISA板上與神經節甙脂GM1結合的能力。
圖5B是一個掃描圖，它揭示了血細胞計數結合測定，其中rCTB與表達神經節甙脂GM1的真核生物細胞結合。
圖6A是尼古丁結構分子式的簡圖。
圖6B是表明在製備本發明的尼古丁軛合物時的可變性位置圖。這些可變化位置可任意地分配給易於指定的本發明的化合物和軛合物，它們不是必需的反應位置。圖7中指出了這些可變性位置。
圖7(包括圖7A和圖7B)表示本發明的尼古丁軛合物和中間產物的尼古丁分子中可變性位置上的「分支」。當Q為含有T細胞表位的載體時，圖7(包括圖7A和圖7B)所示表明了本發明的尼古丁軛合物。
圖8表示在本發明的某些軛合物的製備中有用的尼古丁代謝物。
圖9A-B顯示了與PS-55的軛合物及雞卵溶菌酶蛋白(HEL)相結合的抗體在小鼠血清中的ELISA測試結果。圖9A中，小鼠已免疫接種了尼古丁-BSA軛合物。圖9B中，小鼠免疫接種了尼古丁-CTB軛合物。
圖10顯示了在競爭性ELISA實驗中抗尼古丁抗血清的測試結果，以確定當加入不同濃度的游離尼古丁和尼古丁代謝物、尼古丁和去甲尼古丁時，抗血清對游離尼古丁的特異性。該抗血清通過給小鼠注射尼古丁軛合物PS-55 BSA而製得。對尼古丁代謝物的識別很少或沒有，這表明在抗血清中的抗尼古丁抗體對尼古丁是特異性的。用麻醉劑利多卡困作為陰性對照，它不能與抗體的結合競爭。尼古丁軛合物PS-55 HEL作為陽性對照，其與抗體的結合受到游離尼古丁的抑制。
圖11A顯示了海洛因結構分子式的簡圖。
圖11B表明在製備本發明的海洛困軛合物時的可變性位置圖。這些可變性位置可任意地分配給易於指定的本發明的化合物和軛合物，它們不是必需的反應位置。圖12中指出了這些可變性位置。
圖12表示本發明的海洛因軛合物和中間產物的海洛因分子中可變性位置上的「分支」。當Q為含有T細胞表位的載體時，所示表明了本發明的尼古丁軛合物。
本發明的詳細描述本文中涉及的專利和科學文獻中描述了本領域技術人員可得到的知識。本文中提到的公開的美國專利、PCT申請，以及其他出版物均在此結合作為參考。
本發明提供了一種藥物成癮的療法，它是基於給成癮者接種藥物/半抗原載體軛合物，更具體地說，接種海洛因-蛋白軛合物或尼古丁-蛋白軛合物。本發明的治療組合物包含至少一種半抗原和至少一種含有T細胞表位的載體，當它們結合形成半抗原載體軛合物時，能刺激抗半抗原抗體的產生。本文中所用的術語「T細胞表位」是指被T細胞受體識別的基本因子或最小單元，其中該表位包含受體識別所必需的胺基酸。摹擬T細胞表位和修正對蛋白質變應原的變應反應的胺基酸序列也在本發明範圍內。「擬肽」(peptidomimetic)可定義為模仿天然分子的從生物活性肽中得到的化學結構。半抗原可以是藥物，如海洛因，尼古丁或藥物衍生物。
當給上癮者服用含有半抗原/藥物(或其衍生物)的治療組合物時，該藥物的特異性抗藥物抗體被激發。治療免疫方案足以激發並保持抗藥物抗體的高效價，使得隨後與藥物接觸時，中和了與足夠量的藥物關聯的抗體，以減小，如果沒有清除的話，該藥物的藥理學作用。例如，當治療組合物為海洛因載體軛合物時，治療誘導了抗海洛因抗體應答，它能降低或中和患者的血流或黏膜組織中的海洛因，由此阻斷了該藥物的心理成癮性能。既然在本發明中到達中樞神經系統的濫用藥物的濃度延遲或降低了，上癮者從使用的海洛因中接受的也就減少了或沒有喜悅感。當服用尼古丁載體軛合物時，這種相同的作用機制將誘導抗尼古丁抗體並減少或消滅從尼古丁的使用中獲得的喜悅感。採用本發明的治療方法沒有預期的副作用。例如，本申請的濫用藥物是小的並且是單價的，因此不能交聯抗體。於是，與濫用的藥物接觸後沒有預期發生免疫複合物的形成和相關的病理變化。正是現在，可期望的是，與目前和將來的藥理學療法相一致。另外，有效的中和作用是長期持續的。例如，已知對抗病原體的中和抗體應答可持續數年。因此，可以期望利用本發明的治療組合物激發的高效價的抗藥物抗體能儘可能地保持較長的時間，至少一年。減少了順從問題的該治療組合物的這種長期作用減少了目前療法中的復發傾向問題。
另外，本發明的對海洛因成癮的治療免疫方法與目前所使用的或臨床實驗中的其他療法相適應。事實上，早期的共同療法(co-therapy)是極其有希望的，因為達到最佳抗體效價所需的時間最合適。
與此類似，本發明對尼古丁成癮的免疫治療方法在將尼古丁脫癮症狀減至最小方面與其他療法一致。例如，本發明的尼古丁載體軛合物可以用於與可樂定，丁螺環酮，和/或抗抑鬱劑或鎮靜劑綴合。由該方法產生的疫苗將適應於目前的尼古丁替代療法，即口香糖和貼片。由於抗尼古丁抗體的產生需要數周時間，有一些程度的成癮要利用尼古丁替代療法來控制。
以下是本文中所用的術語，現給出它們的定義作為指導。本文中所用的「半抗原」是一種能與抗體特異性反應的低分子量的有機化合物，當它與含有T細胞表位的載體結合形成半抗原載體軛合物時，能是免疫原性的，但其本身不能激發免疫反應。另外，該半抗原以半抗原載體軛合物的特異性測定部分為特徵，也就是，它能以游離狀態與其特異性抗體反應。在未免疫接種的成癮者中，沒有形成半抗原的抗體。該治療組合物用於尋求藥物成癮治療的接種患者。在本發明中，術語半抗原將包括更特異的藥物/半抗原的概念，它是藥物，部分藥物的類似物，或藥物衍生物。治療組合物或治療抗藥物疫苗當開始給藥時，將產生「預期的可測量的結果」。開始，該預期的可測量的結果是高效價的抗藥物抗體的產生。效價定義為由ELISA測定的50％最大抗體測量值所需的血清稀釋度。不過，適於個體的劑量方案的操作法給出並保持了持續的預期治療效果。「預期治療效果」是足夠部分的游離濫用藥物被對該藥物具有特異性的抗藥物抗體中和，從而在後來與該藥物接觸時在可接受的治療時間內，降低或消除了藥物的藥理學作用。本領域技術人員對要接受免疫的患者的特性、要進行中和的濫用藥物、以及給藥的方式等情況進行評估後，就可確定可接受的治療時間為多長時可對所給藥物產生足夠的抗體應答，以及抗體應答能保持多長時間。利用這種以及其他免疫方案作為模型，該領域技術人員將預期免疫或保護時間持續數月，直到一年以上。
本文還公開了「被動免疫」，它包括服用或接觸利用本發明的新軛合物製備的完整的抗藥物抗體或多克隆抗體或單克隆抗體片段(例如Fab，Fv，(Fab』)2或Fab』)。如上所述，用本發明的抗海洛因或抗尼古丁抗體對人的被動免疫作為獨立治療的有效性不如主動免疫。被動免疫作為最初的共同治療和/或附加的補充治療(例如，在最初給予疫苗後，但在身體自身抗體產生以前的時間內)或在緊急情況下用於防止死亡(例如，當某人服用過量藥物時)將是特別有用的。在某些情況下，可優選僅採用被動療法，例如當病人是無免疫應答的或需要迅速治療時。
本發明的藥物軛合物，以及本發明的組合物也可用作預防劑。即，該藥物軛合物或組合物可以在哺乳動物與藥物的任何接觸之前給予以產生抗藥物抗體。在服用了該軛合物或組合物之後，所產生的抗藥物抗體將存在於哺乳動物體內與加入的任何藥物結合，並由此減小或防止成為藥物上癮者的機會。
本發明的治療組合物，更具體地說，治療性抗藥物疫苗是一種組合物，它含有至少一種藥物/半抗原載體軛合物，該軛合物能激發對該藥物/半抗原特異性的、具有足夠高效價的抗體產生，使得在隨後的藥物/半抗原的攻擊中，所述抗體能降低該藥物的成癮性能。對半抗原載體軛合物的預期的免疫應答是形成抗半抗原和抗載體抗體。當足夠量的抗藥物特異性抗體被激發並保持到封固了免疫後加入的藥物的中和作用時，就達到了治療水平。本發明的治療方法允許有充分的時間在最初的疫苗接種和加強後產生抗體。另外，最佳的抗藥物疫苗至少含有一種藥物/半抗原載體軛合物，它包含作為半抗原的藥物與載體的最佳結合，從而使抗藥物抗體的產生能達到最佳治療水平，也就是在體內維持足夠高的效價以在數月內抵住隨後的所選藥物的攻擊。更具體地說，該抗體效價在一定時間內保持足夠高的水平以在隨後與藥物接觸時提供一種有效的應答，一定的時間根據個體情況而定，可以是約兩個月到約一年或一年以上，通常至少為三個月。這種最佳組合物由半抗原載體軛合物，賦形劑和任選的助劑組成。
當本發明用於治療海洛因成癮時定義了一種地抗原載體軛合物，其中半抗原是海洛因或海洛因衍生物，它能用於對哺乳動物，特別是人進行免疫，以激發能與游離藥物結合併能防止該藥物轉運到大腦應答系統的抗海洛因抗體，由此消除上癮的吸毒行為。如在對古柯鹼和尼古丁相關部分所述，抗海洛因抗體預計能限制海洛因穿過血腦屏障向大腦的分布，從而降低其藥理作用。
當本發明用於治療尼古丁成癮時定義了一種半抗原載體軛合物，其中半抗原是尼西丁或尼古丁衍生物，它能用於對哺乳動物，特別是人進行免疫，以激發能與游離藥物結合併能防止該藥物轉運到大腦應答系統的抗尼古丁抗體，由此消除上癮的吸毒行為(例如抽菸)。人們相信尼古丁與腦中的尼古丁乙醯膽鹼受體的α-亞單位結合，由此導致多巴胺的釋放增加。據認為，腦中尼古丁乙醯膽鹼受體的數目增加增強了尼古丁的生理依賴性。正如上面討論的有關海洛因的情況一樣，推測抗尼古丁抗體將限制尼古丁穿過血腦屏障向大腦中的分布，由此減小其藥理學作用。
例如，有一些關於尼古丁釋放的標準化水平，即，在抽每根平均含有9mg尼古丁的香菸時，有1-3mg尼古丁被有效地發散。另外，尼古丁的血漿濃度峰值為25-50ng/ml，這比古柯鹼的血漿濃度峰值(0.3-1μg/ml)低得多。這樣就提供了一個用中等高親和力抗體進行幹預的理想機會。
用本發明的治療性半抗原載體綴合組合物進行的初始免疫在體內產生了高效價的半抗原特異性抗體。定期測試免疫接種者的血漿可有用地確定個體的有效劑量。效價水平通過定期加強來提高和維持。可以預料，該治療方法將與目前的藥物康複方案，包括勸說指導結合使用。另外，本發明的治療組合物可以針對單一藥物或同時或依次針對數種藥物，並可與其他療法結合使用。例如，本發明的治療性半抗原載體綴合組合物及方法可以與常規的藥理學方法和以前討論過的「短期的」被動免疫結合使用以增強治療的整體療效，而相互間沒有負面作用。
本發明的治療性半抗原載體綴合組合物是通過下述方法製備的將一種或多種半抗原分子聯結到含有T細胞表位的載體上，得到能刺激T細胞(致免疫的)的半抗原載體軛合物，從而導致T細胞增生和遞質的特徵性釋放，由此激活相關B細胞並刺激特異性抗體產生。令人感興趣的抗體是對該半抗原載體軛合物(也叫做半抗原載體複合物)的半抗原部分具有特異性的那些。還公開了含有或者與相同藥物結合(交叉免疫)，或者與多種藥物結合(互免疫)的軛合物的治療組合物。這種多種藥物的軛合物的共混物在多種藥物濫用的治療中尤為有用。
在選擇按照本發明適於綴合的藥物時，本領域技術人員將選擇可能具有激發高抗體效價性能的藥物。但是，如果所選擇的分子與個體內源性產生的那些分子相類似，則針對這種分子而生的抗體將與身體中的許多不同分子交叉反應，產生不期望的效果。因此，選擇作為半抗原(藥物/半抗原)的藥物必須是充分外源性的，並足夠大以避免激發在人體內經常發現的分子的抗體。基於這些原因，例如乙醇就不適於本發明的治療方法。針對治療組合物而生的抗體是高度特異性的，並有足夠的量以便於在血流中或在黏膜中或在兩者中中和藥物。在不限制本發明的前提下，適於治療組合物的藥物(不以重要性為序)是致幻劑，例如麥司卡林和LSD；大麻素，例如THC；興奮劑，例如苯異丙胺、古柯鹼、芬美曲嗪、苯哌啶醋酸甲酯；尼古丁；抑制劑，例如非巴比妥類藥物(例如溴化物，水合氯醛等)，甲喹酮，巴比妥類藥物，地西泮，氟西泮，苯環利定和氟西汀；阿片及其衍生物，例如海洛因，美沙酮，嗎啡，哌替啶，可待因，噴他佐辛，丙氧芬；「設計者藥物」，例如「狂喜」。
圖3顯示了按照本發明適於軛合的四種藥物的結構。
本發明的載體是含有至少一個能刺激患者的T細胞的T細胞表位的分子，它又幫助B細胞引發並在整個軛合物的某些部分，包括半抗原部分中保持持續的抗體產生。這樣，由於選定的載體是致免疫的，因此可以看到，在不同的病人人群中對該疫苗的強免疫應答。該載體，就象半抗原，必須是足夠外源性的，以激發對該疫苗的強免疫應答。一個保守的，但不是至關重要的方式是，使用一種對大多數病人來說尚未接觸過的載體，以避免載體誘導的表位抑制的現象。不過，即使發生了載體誘導的表位抑制，它也是可以控制的，如同它可以通過改變劑量(Dijohn等，(1989)柳葉刀1415-1418)和改變其他方案的方式(Etlinger等，(1990)科學249423-425)，包括使用CTB(Stok等，(1994)疫苗12521-526)得以克服。使用病人已對其獲得免疫的載體蛋白質的疫苗是商業上可獲得的。另外，含有大量賴氨酸的載體特別適合於根據本發明的方法所進行的綴合。合適的載體分子有許多，包括但不限於下列種類細菌毒素或產物，例如霍亂毒素B(CTB)，白喉毒素，破傷風類毒素，百日咳毒素，絲狀血凝素，志賀毒素，假單胞菌屬外毒素；植物凝集素，例如蓖麻子白蛋白-B亞單位，相思豆毒素和甜豌豆植物凝集素；亞病毒，例如逆轉錄病毒核蛋白(逆轉錄NP)，狂犬病核糖核蛋白(狂犬病RNP)，植物病毒(例如TMV，豇豆和花椰菜花斑病病毒)，水泡性口炎病毒-核殼蛋白(VSV-N)，痘病毒載體和塞姆利基森林病毒載體；人造載體，例如多抗原肽(MAP)，微球；酵母病毒樣顆粒(VLPs)；瘧疾蛋白抗原；以及其他，例如蛋白質，肽，以及上述物質的任何變體、衍生物或類似物。
為了確定合適載體的特徵進行了初始實驗，該實驗使用了牛血清白蛋白作為蛋白質載體。該蛋白質最適合於動物實驗，因為它便宜並含有大量可用於綴合的賴氨酸。但是，它不大適合於人類免疫，因為抗-BSA抗體的生成會產生副作用。因此，利用這些實驗結果，上述標準被用於大量的候選載體。本結果是適合於在本發明中使用的載體的名錄。
優選實施方案的載體是一種蛋白質或分支的肽(例如多抗原肽(MAP))或單鏈肽。一個理想的載體是在疫苗接種時未被廣泛使用的蛋白質或肽，在該國家使用該治療方法，因而避免了潛在的「載體誘導的表位抑制」。例如在美國，標準的兒童期免疫包括白喉和破傷風，諸如破傷風類毒素和白喉類毒素等未修飾的蛋白質，可能不是特別合適的載體。此外，載體蛋白質不應是耐受的。對人類而言，應排除未經修飾的人血清白蛋白。另外，許多食物蛋白質在作為載體使用前應當進行認真的篩選，同樣的，對人類來說，由於很多人吃牛肉，牛血清白蛋白不是一個很理想的載體。更進一步說，如果該載體有內在的免疫原性/佐劑活性，那麼它就具有很高的優勢。必須在載體的免疫原性的願望和使抗半抗原抗體最大化的願望之間獲得精細的平衡。此外，優選載體應當能夠產生系統性應答和接觸部位的應答。這對於在黏膜中廣泛服用的海洛因、古柯鹼和尼古丁來說更是如此。當吸食古柯鹼或海洛因時應答的速度特別重要。相應地，對古柯鹼、海洛因和尼古丁來說，一個優選的載體不僅激發系統的應答，也激發事先存在的黏膜抗體應答。在這種黏膜應答中，抗體與古柯鹼、海洛因和/或尼古丁會發生足夠快的作用，以在其開始在血流中循環前抵消該藥物。
這類優選的載體之一是霍亂毒素B(CTB)，它是一種能夠產生很強的系統性和黏膜抗體應答的高致免疫性的蛋白質的亞單位(Lycke，(1992)免疫學雜誌1504810-4821；Holmagren等，(1994)美國熱帶醫學與衛生學雜誌5042-54；Silbart等，(1988)免疫學方法雜誌109103-112；Katz等，(1993)感染與免疫611964-1971)。這種聯合IgA和IgG抗半抗原應答在阻止被嗅入或吸入的海洛因或古柯鹼、被通過嘴和肺吸收的尼古丁方面是極有希望的。此外，CTB在有關霍亂疫苗的臨床實驗中顯示出在人類的使用中是安全的(Holmagren等，同上；Jertborn等，(1994)疫苗121078-1082；「約旦關於疫苗的加速發展的報告」1993，NIAID，1993)。
其他有用的載體包括那些有能力加強黏膜應答，特別是LTB類的細菌毒素，逆轉錄病毒核蛋白(逆轉錄NP)，狂犬病核糖核蛋白(狂犬病RNP)，水泡性口炎病毒-核殼蛋白(VSV-N)，和重組痘病毒亞單位。
在另外的實施方案中，變應原的不同的蛋白質衍生物、肽片段或類似物作為載體使用。這些載體被選擇是因為它們激發了能幫助抗半抗原抗體的B細胞引發的T細胞應答。在1995年10月19日公布的WO 95/27786中披露了製備變應原蛋白質、肽及它們的序列的實例和方法。特別適合於作為載體的變應原是日本柳杉，更具體地說是重組日本柳杉1，其序列在經細小變化後予以公布。在日本之外的其他國家，日本柳杉是不普遍的。因此，日本柳杉1變應原一般符合合適載體的其中一個標準，即是一種病人先前未接觸過的載體。
使用本發明的方法和組合物，更具體地說，使用下列實施例中的技術，本領域技術人員將選用的藥物/半抗原與選用的載體相聯以製成本發明的半抗原載體軛合物。
在本發明的一個實施方案中，由治療組合物誘導的抗體在一定時間內起作用，即該藥物從肺經過心臟運行到大腦。激發此種抗體應答的能力要求仔細選擇載體分子。
霍亂毒素的重組B亞單位的製備霍亂毒素是由霍亂弧菌產生的腸毒素，它由五個完全相同的、分子量為11.6KDa(103個胺基酸)的B亞單位，和一個27.2KDa(230個胺基酸)的A亞單位組成(Finkelstein(1988)immunochem.Mol.Gen.Anal.Bac.Path.85-102)。結合亞單位CTB與細胞表面上的神經節甙脂GM1結合(Sixma等(1991)自然351371-375；Orlandi等，(1993)生物化學雜誌26817038-17044)。CTA是酶促亞單位，它進入細胞並催化G蛋白質的ADP-核糖基化作用，實質性地活化腺苷酸環化酶(Finkelstein(1988)immunochem.Mol.Gen.Anal.Bac.Path.PP85-102)。在缺少A亞單位時，霍亂毒素不具有毒性。
其他人已公開了CTB五聚體的高濃度重組表達的產生(L』hoir等(1990)基因8947-52；Slos等，(1994)Protein Exp.Purif.5518-526)。天然CTB可在商業上獲得，但是很難排除CTA的汙染。因此，重組CTB已在大腸桿菌中表達，據說已經形成其特徵。霍亂菌素構造已從美國典型培養物保藏中心購得(根據美國專利4,666,837)。重組CTB從原始載體(pRIT10810)克隆到表述質粒(pET11d，Novagen)上，其具有一個含有His6標記的外部N-未端序列，並在大腸桿菌中表達到培養物濃度為25mg/升。該蛋白質利用標準技術經Ni2+柱純化，並用SDS-PAGE進行分析(參見圖4a，b，c)。重組CTB在該測試中是單體的，由於N-末端延長，它比天然CTB單體更大。
五聚體的重組CTB可以伴有或不伴有His標記而生成，方法是用PCR修飾的cDNA去包含Pelb前導序列。將C-末端終止密碼子插入以除去His標記。兩種結構均用pET22b載體(Novagen)在大腸桿菌中表達。His標記的蛋白質用上述Ni2+親和色譜法純化(13mg/L)。未標記的重組CTB用所述神經節甙脂GM1柱親和色譜法純化(Tayot等，(1981)歐洲生物化學雜誌113249-258)。重組CTB五聚體在ELISA中顯示出與神經節甙脂GM1結合，並與在蛋白質印跡及ELISA中的五聚體特異性抗體反應。重組CTB也可從其他途徑獲得，例如SBL疫苗AB。
CTB的五聚體結構可優選地結合到神經節甙脂GM1上。只要樣品未煮沸，該五聚體對SDS就是穩定的，這允許利用SDS-PAGE來評定五聚體化。圖4a中的凝膠顯示天然CTB是一個五聚體，並與變性單聚物CTB相區別。五聚體結構的pH範圍是4-9(參見圖4b)，這促進了大量綴和化學過程。最初表達的重組CTB是單體的。獲得五聚體CTB的一種方式是通過改變適當摺疊的五聚體GTB的表達。據發現，胞質表達提供了一個更高水平的單體CTB，本領域普通技術人員會意識到將單體CTB摺疊成五聚體CTB的方法(參見，例如L』hoir(1990)基因8947-52)。另一種將單體CTB重摺疊以獲得五聚體CTB的方式是周質表達，它產生於能夠通過ELISA與GM1-神經節甙酯相結合的五聚體重組CTB。圖5a和5b顯示了支持這些發現的數據。本領域技術人員可以找出獲得所描述的五聚體重組CTB的方法，包括具有前導序列的周質表達(Slos等，同上；Sandez等，(1989)美國國家科學院院報86481-485；Lebens等，(1993)生物技術111574-1578)或者翻譯後重摺疊(L』hoir等，同上；Jobling等，(1991)分子微生物學51755-1767)。
另一種有用的載體是能夠提供對CTB有改進的黏膜應答的霍亂毒素。據報導，酶促活性A亞單位佐劑增強了活性(Liang等，(1988)免疫學雜誌1411495-1501；wilson等，(1993)疫苗11113-118；Snider等，(1994)免疫學雜誌153647)。
取得本發明的軛合物的一個方面涉及修飾半抗原，充分使其能夠被軛合或加入到一個載體中，同時保留足夠的結構，使其被視作游離態半抗原(例如，游離海洛因或尼古丁)。接種後的個體具有能夠識別游離半抗原(海洛因或尼古丁)的抗體是至關重要的。在實施例中詳細解釋的放射性免疫測定和競爭性ELDA測定實驗能夠測定游離半抗原的抗體效價。感興趣的抗體是半抗原特異性抗體，在一些實施方案中，是海洛因特異性抗體或尼古丁特異性抗體。應該看到，用來描述優選方案的原則和方法可以從本說明書延伸到更為廣泛的半抗原載體軛合物，這些軛合物在治療許多藥物成癮和毒性應答方面是有用的。
軛合物本發明的新的尼古丁載體軛合物是從尼古丁和尼古丁代謝物衍生而製得的。圖8顯示了尼古丁及其代謝物的結構。本發明的新的海洛因載體軛合物是從海洛因和海洛困代謝物衍生而製得的。圖11a和11b顯示了為製備海洛因軛合物所使用的海洛因及其可變位點的結構。
半抗原載體鍵的長度和性質使得半抗原與抗體結構域有足夠的距離，允許它被起先針對它而產生的抗體最優識別。鍵的長度通過改變-CH2-基團的數目得以優化，-CH2-基團被策略性地放置在選自下列成員的「分支」中CJ0 QCJ1 (CH2)nQCJ1.1 CO2QCJ1.2 COQCJ2 OCO(CH2)nQCJ2.1 OCOCH＝QCJ2.2 OCOCH(O)CH2CJ2.3 OCO(CH2)nCH(O)CH2CJ3 CO(CH2)nCOQCJ3.1 CO(CH2)nCNQCJ4 OCO(CH2)nCOQCJ4.1 OCO(CH2)nCNQCJ5 CH2OCO(CH2)nCOQCJ5.1 CH2OCO(CH2)nCNQCJ6 CONH(CH2)nQCJ7 Y(CH2)nQCJ7.1 CH2Y(CH2)nQCJ8 OCOCH(OH)CH2QCJ8.1 OCO(CH2)nCH(OH)CH2QCJ9 OCOC6H5CJ10 如圖2b所示CJ11 YCO(CH2)nCOQ以及本文中圖1a和1b中顯示的那些。關於上述分支，n優選為約2到約20的整數，更特別是約2到約8，最優選3-5；Y優選自S，O和NH；而Q優選自下列成員(1)-H(2)-OH(3)-CH2
(4)-CH3(4a) -OCH3(5)-COOH(6)滷素(7)蛋白質或肽載體(8)修飾蛋白質或肽載體(9)活性酯，例如2-硝基-4-磺苯基酯和N-氧琥珀醯亞氨基酯(10) 對載體或修飾載體具有活性的物質，例如混合酐，醯滷，醯基疊氮，烷基滷，N-馬來醯亞胺，亞氨基酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯；或(11)由其「CJ」索引號識別的另一種「分支」。
含有T細胞表位的載體(例如蛋白質或肽載體)可以用本領域技術人員熟知的方法進行修飾，以有利於其與半抗原的綴和(例如，通過硫化作用(thiolation))。例如與2-亞氨基硫烷(Traut’s試劑)或利用琥珀醯化作用，等等。為簡單起見，其中Q＝H的(CH2)nQi可被稱為(CH3)，甲基或Me，不過，應當理解，它適合圖1a和1b中所示「分支」所確定的要點。
本文中所用的其他商業上可獲得的化合物的簡寫包括BSA＝牛血清白蛋白DCC＝二環己基碳化二亞胺15 DMF＝N，N-二甲基甲醯胺EDC(或EDAC)＝鹽酸N～乙基-N』-(3-(二甲氨基)丙基)碳化二亞胺EDTA＝乙二胺四乙酸，二鈉鹽HATU＝0-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯NMM＝N-甲基嗎啉HBTh＝2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
TNTU ＝ 2-(5-降冰片烯-2，3-二羧亞氨基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯PyBroP＝溴-三-吡咯烷-磷六氟磷酸鹽HOBt＝N-羥基苯並三唑幾種命名化合物的其他IUPAC名稱是尼古丁 1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷可替寧 N-甲基-2-(3-吡啶基)-5-吡咯烷酮反應在一個實施方案中，軛合物PS-54的前體通過在兩當量二異丙基乙胺的存在下，在二氯甲烷中，用琥珀酸酐將外消旋去甲尼古丁醯化而合成。然後該反應的產物利用HATU聯結到載體蛋白質的賴氨酸殘基上，得到軛合物PS-54(參見實施例1，方法B)。
在另一個實施方案中，通過用3-溴丁酸乙酯、5-溴戊酸、6-溴己酸或8-溴辛酸分別將在無水甲醇中的(S)-(-)-尼古丁中的吡啶氮選擇性地烷基化而合成PS-55，PS-56，PS-57和PS-58的前體(參見實施例2，方法A、B、C和D)。這些反應的產物利用HATU綴和到載體蛋白上，得到軛合物PS-55，PS-56，PS-57和PS-58(參見表1軛合物載體蛋白半抗原/單體軛合方法PS-54 BSA 19.5 實施例1，方法BPS-54 HEL 3.2實施例1，方法BPS-55 BSA 33.2 實施例3，方法APS-55 HEL 1.09 實施例3，方法APS-56 BSA 27 實施例3，方法APS-56 HEL 2.2實施例3，方法APS-57 BSA 81 實施例3，方法APS-57 HEL 8 實施例3，方法APS-58 BSA 66.8 實施例3，方法A
PS-58HEL7.4實施例3，方法A這是非限制性的軛合物列表。其他軛合物用與含有T細胞表位的載體聯結的一個以上的半抗原製成。優選的是，1-100個半抗原與含有T細胞表位的載體聯結。更優選的是，1-70個半抗原與含有T細胞表位的載體聯結。
實施例中公開了化合物PS-54，PS-55，PS-56，PS-57和PS-58的合成方法。按照所公開的方法，例如，在含水條件下利用活化劑，本領域技術人員可合成任何一種期望的化合物。
已開發出許多化合物來促進蛋白質/肽的交聯或蛋白質對衍生分子的軛合，例如半抗原。這些包括但不限於羧酸衍生的活性酯(活性化合物)，混合酐，醯滷，醯疊氮，烷基滷，N-馬來醯亞胺，亞氨基酯，異氰酸酯和異硫氰酸酯，它們都是本領域技術人員已知的。它們能與蛋白質分子的反應基形成共價鍵。根據活化基的不同，該反應基是蛋白質分子上賴氨酸殘基的氨基，或是載體蛋白或修飾載體蛋白分子中的巰基，當反應時，它們形成醯胺，胺，硫醚，脒脲或硫脲鍵。本領域技術人員可確定其他合適的活化基，例如，在象《蛋白質軛合和交聯化學》(Wong(1991)CRC出版公司，Boca Raton，FL)這樣的常用參考書中。理想的是經賴氨酸側鏈氨基軛合。多數試劑優選與賴氨酸反應。尤為合適的載體是CTB，因為其天然形式中每個單體有9個賴氨酸殘基。為了確定軛合的CTB五聚體是否保留了其結構和活性，可以評定GM1神經節甙酯結合情況。
申請人已表達並精製了大量重組CTB，它們一旦完善後就大批量發酵生產。表達和純化重組蛋白質的方法是本領域中已知的，參見，例如USSN07/807529。例如，CTB可以利用親和色譜法純化(Tayot等，(1981)歐洲生物化學雜誌113249-258)，軛合到海洛因或尼古丁衍生物上，然後該軛合物可以進一步精製。分析純化CTB和所得軛合物的純度以及CTB的五聚體結構的保持情況。所用的技術包括SDS-PAGE，天然PAGE，凝膠過濾色譜法，蛋白質印跡，直接和GM1-捕捉ELISA，以及與生物素醯化CTB競爭的ELISA。半抗原化(haptenation)水平利用質譜，反相HPLC，並通過分析因半抗原的存在而導致的UV吸收的增加來測量。軛合物的溶解性和穩定性在全面配製的製備中達到最佳。實施例中給出了這些分析測定中的一些詳細情況。
儘管五聚體結構的CTB是實施本發明時的優選載體，且GM1結合是確定CTB的五聚體形式是否存在的一種有效測試，但本發明並不限於使用五聚體形式的CTB。本發明中也包括其他T細胞表位載體，以及可在本發明中使用的其他形式的CTB(例如，單體，二聚體等)。如果使用CTB五聚體形式以外的一種載體，那麼本領域技術人員將使用合適的測試方法以確定所需要的載體的存在和活性(例如，使用GM1結合來確定CTB五聚體形式的存在)。
為了改變半抗原化水平，可以採取其他方式。在一個實施方案中，載體是用一個多價海洛因或尼古丁結構半抗原化的。這種想法是基於多抗原肽(MAP)的概念(Lu等，分子免疫學28623-630(1991))。在該系統中，利用多分支的賴氨酸殘基使半抗原密度和效價最大化。該方法的前提是，如果有多個半抗原連接在同一肽或蛋白質分子，免疫應答將被增強。因此，需要吸附在載體CTB五聚體的一個或兩個位點的多價半抗原按本文中列出的方法製備。該多抗原半抗原的核芯是由Tam所建議的分支的聚賴氨酸核芯(Lu等，同上)。通過引入一個被護Cys殘基可以保留一種化學活性方法。當所有可獲得的氨基的海洛因或尼古丁半抗原化後，Cys的巰基未被屏蔽，並可通過數種雙功能巰基/氨基特異性交聯劑與蛋白質聯結(Yoshitake等，(1979)歐洲生物化學雜誌101395-399)。許多樹狀化合物結構作為核芯使用。
佐劑不會對載體的作用產生屏蔽的任何佐劑在本發明的海洛因和尼古丁治療疫苗中都是有用的(參見，Edelman(1980)傳染病評論2370-373)。申請人最初進行的旨在證明針對古柯鹼成癮的治療疫苗的可行性的試驗使用了有力的佐劑CFA。但是，CFA對人類來說不是優選的，目前許可用在人體上的有用的佐劑是明礬，包括氫氧化鋁(Spectrum Chem.Mtg.公司，New Bruswick，新澤西)或磷酸鋁(Spectrum)。具有典型意義的是，疫苗被吸收到明礬上，其溶解性是非常有限的。鼠模型的預試數據表明，明礬能夠誘導一種很強的抗古柯鹼抗體應答，MF59(Chiron，Emeryville，CA)或者RIBI佐劑也是合適的。
用CTB作為載體蛋白的有效的免疫不要求強有力的佐劑。正如實施例中所示，高效價抗尼古丁抗體應答是通過用CTB-尼古丁軛合物免疫化而誘導的，它可以是使用明礬作為佐劑，或者不需要任何附加的佐劑。對於CTB之外的載體，本領域技術人員能夠確定合適的佐劑，如果需要的話。
賦形劑和輔助劑治療組合物可選地含有一個或多個藥學上可接受的賦形劑，包括但不限於無菌水，鹽溶液如鹽水，磷酸鈉，氯化鈉，乙醇，阿拉伯膠，植物油，苄醇，聚乙二醇，明膠，甘露醇，碳水化合物，硬脂酸鎂，粘性石蠟，脂肪酸酯，羥甲基纖維素，以及緩衝液。其他合適的賦形劑可以由本領域普通技術人員使用。該治療組合物可選地包括至少一種輔助劑，例如分散介質，包衣，例如類脂和脂質體，表面活性劑如溼潤劑和乳化劑，潤滑劑，防腐劑如抗細菌劑和抗真菌劑，穩定劑和本領域技術人員熟知的其他試劑。本發明的組合物還可含有其他佐劑，試劑和/或惰性的藥理學上可接受的賦形劑，它們可以加入以增強該藥物的治療性能或使得能選擇其他的給藥方式。
上面所討論的高度純化的半抗原載體軛合物能夠配製成本發明的治療組合物，並適合於人體治療。如果本發明的治療組合物是通過注射給藥的(即皮下注射)，則優選該高度純化的半抗原載體軛合物溶於在藥學上可接受的pH(即，pH值約為4-9)的水溶液，這樣，該組合物是液體，並易於給藥。但是，也有可能給予一個組合物，其中高度純化的半抗原載體軛合物在水溶液中是懸浮的，該懸浮液是在本發明的範圍內。該組合物也可以可選地包括藥學上可接受的賦形劑、佐劑和輔助劑，或補充活性組合物。根據給藥的方式，可選的成分將確保治療組合物的可期望的性能，例如合適的流動性，阻止不希望的微生物作用，提高的生物利用度或延長的吸收。
本發明的治療組合物應該在生產、儲存、銷售和使用時是無菌、穩定的。在保存時，不被微生物，例如細菌和真菌感染。為了保持組合物的完整，生產本發明的治療組合物的優選方法是，製備能夠使得該組合物以冷凍乾燥粉末的形式出現的軛合物和藥學上的賦形劑，該粉末可在賦形劑或輔助劑中再形成，例如就在使用前用無菌水。在製備無菌的可注射的溶液時，製備無菌粉末的優選方法是真空乾燥，冷凍乾燥，或旋轉乾燥，它們將產生活性成分加上從先前其無菌過濾溶液中獲得的其它預期成分的粉末。
本發明的活性化合物可以按照蓋倫藥劑學的常規方法加工成適於向患者給藥的治療組合物，例如哺乳動物包括人服用的治療組合物。優選的給藥方式包括鼻內的，氣管內的，口服，皮膚的和/或注射。一種特別合適的給藥方式的結合包括以注射開始，同時鼻內加強。
對於胃腸外應用方式來說，特別合適的是可注射的無菌溶液，優選油性或水溶液，以及懸浮液，乳液，或植入物，包括栓劑。安瓿是方便的單位劑量。對於腸內應用來說，特別合適的是片劑，糖衣丸，液體製劑，懸浮液，滴劑，栓劑，或膠囊，它們可包括腸溶衣。在糖漿劑，酏劑或類似製劑中可使用甜化賦形劑。
持續或直接釋放的組合物可以配製成脂質體或者其中活性化合物(軛合物)被可不同降解的包衣，例如被微膠囊，多層包衣等所保護的。也可能通過冷凍乾燥該新化合物和使用所獲得的冷凍乾燥物來製備注射產品。
對於局部應用來說，可用非噴霧形式，粘性至半固體或固體狀，包含可與局部應用相適應的載體，並具有比水更大的動態粘度。可適合的製劑包括但不限於溶液，懸浮液，乳液，霜劑，油膏劑等，如果需要的話，它們是無菌的或者與輔助劑相混合。對於局部應用來說合適的是可噴射的氣霧劑製劑，其中活性化合物，優選與合適的賦形劑或輔助劑結合，裝在一個塑料擠瓶中或與壓縮的揮發性的、通常為氣體狀的推進劑混合。
通過本發明的組合物和方法所產生的抗體的分子量在150KDa到1000KDa之間。當病人用治療組合物中的最佳軛合物進行接種後與游離海洛因或尼古丁接觸時，該游離海洛因或尼古丁以海洛因特異性或尼古丁特異性抗體為目標。該抗體在識別體內藥物時無需改變藥物的形狀或結構。在不限制本發明的前提下，應相信當接種疫苗的個體與海洛因或尼古丁接觸時，抗藥物抗體將阻斷海洛因和尼古丁的作用。人們相信，至少有三種機制導致了這種阻斷活性。第一，抗體不能穿過血腦屏障，因此可以相信，當與抗海洛因或抗尼古丁抗體結合時，海洛因或尼古丁不能穿過血腦屏障，也不能對類阿片受體和多巴胺轉運蛋白產生影響。第二，在不限定任何特定理論的情況下，人們相信抗體通過簡單的空間阻滯來阻止藥物結合到其受體上。這個機制在阻斷藥物的一些非-CNS作用方面(例如心臟毒性)以及抗體在針對其他帶有非-CNS目標藥物的活性時是有用的。第三，海洛因和尼古丁由於酶促和非酶促降解而在體內具有相對較短的半衰期，這產生了非活性代謝物。特別地海洛因和尼古丁是足夠充分小的藥物，因此它們極不可能交聯抗體，這樣，就不太可能形成兩種藥物中任一種的生理學上顯著的免疫複合物。
在實施本發明時，還可使用其他黏膜應用方案，例如，用共聚物微球來誘導或增強黏膜免疫應答。這些細小的、可生物降解的微球將該軛合物包裹並保護起來，並利用黏膜免疫系統促進攝取。儘管它們最廣泛地用於口頭免疫，它們也有報導在鼻內免疫時也是有效的(Walker(1994)疫苗12387-399)。惰性聚合物諸如1-10μm直徑的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)在這方面是特別有用的(Holmgren等，(1994)美國熱帶醫學與衛生學雜誌5042-54；Serva(1994)科學2651522-l524)。
除了優選的軛合物外，用不同的軛合物進行交叉免疫以將抗體交叉反應性減至最小。小鼠用一種軛合物進行初始免疫，然後在第14天用與相同載體聯結的不同軛合物進行加強。只有識別海洛因或尼古丁軛合物的抗體分泌B細胞的亞型被最大刺激和膨脹。人們相信，由於這兩種軛合物附著到藥物分子上的部位不同，識別的特異性增加了。然後利用競爭性ELISA確認所誘導的抗血清的特異性。
此外，含有一種以上軛合物的治療組合物刺激多克隆抗體，由此在隨後的攻擊中增強抗體應答。
劑量中和抗病原體的抗體應答已知多年了，並且有可能實現高效價的抗海洛因或抗尼古丁抗體應答維持至少一年。基於用常規疫苗所得到的數值，應該有可能實現中和海洛因或尼古丁血漿濃度所需要的特異性抗體的濃度。小鼠的藥物動力學數據，數據未顯示出來，清楚地表明可以達到生理學上適當的中和抗體濃度。最終，母源抗體穿過對海洛因成癮的婦女和/或吸菸婦女的胎盤，並由此保護胎兒的能力體現了治療性海洛因和/或尼古丁疫苗接種的另一種期望的作用。對廣泛人群有效的最優治療總是引起爭論的，然而本領域技術人員通過對各種因素的仔細領會來確定合適的治療劑量。另外，抗體應答可以利用實施例中列出的特異性ELISA和其他基於抗體的測試來監控。
消除速率中遺傳上的變化，與其他藥物的相互作用，在消除和分配中誘導疾病的變化，以及其他因素共同作用，使得給予相同劑量的病人對疫苗濃度的應答範圍很廣。臨床指示劑能幫助一些藥物滴定到預期範圍，而沒有化學測定能代替對治療所產生的應答的仔細觀察。由於清除率、半留存期蓄積、和穩態血漿濃度難以表述，因此將對抗濫用藥物抗體的產生的測量用作最優劑量的標示。評估本發明的每種軛合物/載體/佐劑的誘導抗體應答的能力，該抗體應答是最能結合循環中的游離海洛因或游離尼古丁的。
實施例中給出了載體和佐劑對抗體應答的誘導的作用的其他詳細情況。因此，人們將理解，在特定情況下活性化合物的實際優選量將根據所使用的特異性軛合物、所形成的特定組合物、應用的方式、以及所治療的特定部位和器官而變化。例如，在一個實施方案中，含有合適載體的治療組合物首先經胃腸外途徑給予，並經黏膜加強。正如本文中更詳細討論的那樣，用最佳半抗原和載體結合物這種類型的免疫在系統性的初級IgG和局部的初級IgA的產生中是非常有效的。
如實施例中所示，鼠模型已用於證明和測量抗體應答的不同特徵，包括抗體效價，識別游離尼古丁的能力，尼古丁結合容量，對尼古丁的親和力，抗體應答的特異性，抗體異型，抗體組織局部化，和尼古丁給藥後抗體的生理學作用。
抗體效價對免疫接種的第一次篩選是看所感興趣的軛合物是否誘導了高效價的抗體應答。抗體效價可以利用本領域中熟知的ELISA測試來確定。例如，將尼古丁-HEL軛合物塗覆到平板上，充分洗滌，並用不同稀釋度的測試血清孵育。再次洗滌這些平板並用酶標記的抗-小鼠IgG次級抗體使其發育。效價定義為產生50％最大應答時血清稀釋度的倒數。
抗體效價取決於抗體的濃度和抗體親和力。在預估所需的抗體效價時，本領域技術人員考慮的是該抗體的濃度和親和力。
抗體親和力反映了與未結合抗體和未結合濫用藥物平衡的抗體-藥物複合物的量，因此Keq＝[Ab+藥物複合物]/[Ab]×[藥物]其中[Ab]＝空著的抗體結合位點的摩爾濃度；[藥物]＝未結合藥物的摩爾濃度；[Ab+藥物]＝抗體-藥物複合物的摩爾濃度。
抗體應答的特異性為了最有效地阻滯成癮藥物的活性，所誘導的抗體對這些藥物的藥理學上的惰性代謝物的親和力必須最小。抗體與藥物的藥理學上的惰性代謝物的結合將降低疫苗的效能。用競爭性ELISA並利用放射標記的免疫測試來確定抗血清對代謝物的特異性。此外，如果所誘導的抗體與藥物的藥理學上的活性代謝物及衍生物結合，則疫苗的效力就會升高。
另外，所產生的抗體與在成癮治療和其他醫療過程中使用的其他藥物的相互作用應減至最小。特別是，應避免對海洛因和多種藥物濫用者通常所服用的藥物的交叉反應。以下藥物用作共同治療劑，丁丙諾啡，地昔帕明，納洛酮，氟哌啶醇，氯丙嗪(chlorproazine)，馬吲哚和溴隱亭，以及其他可能相關的藥物。
對海洛因LD50的作用進一步評估在誘導高效價特異性抗體應答時最有效的那些軛合物和免疫方案的改變海洛因LD50的能力。在該實驗中，給對海洛因免疫的和對對照載體免疫的小鼠靜脈注射海洛因，劑量在先前定義的LD50附近。每個點用10隻小鼠，數據利用Cochran-Mantel-Haenzel X2檢驗進行分析。
此外，用一種失效時間模型來分析海洛因導致的死亡時間。用該模型測量抗海洛因抗體將(a)致死率所需的海洛因的量和(b)死亡時間增加到何種程度，即測量抗體的效能。這些提供了抗體的體內效能的迅速而精確的檢驗。
對人類的生理學作用的觀察在海洛因濫用發作期間尋求醫療關注的人會出現呼吸淺，瞳孔收縮，心搏徐緩，體溫下降和對外部刺激的響應能力基本消失。當用藥過量的程度高時，這些症狀會發展到發紺和死亡。當用疫苗對人進行主動免疫或抗體的被動免疫時，除了海洛因的血液濃度以外，還要考慮將要評定的所有這些因素和將要確立的特定標準。
在不限制本發明範圍的條件下，現在將以尼古丁和海洛因為例詳細描述本發明的組合物及方法，以及具體的實施方式。
以下實施例中有許多具體描述了尼古丁和抗尼古丁抗體。不過，這些實施例也適用於海洛因。例如，通過給免疫的小鼠注射用氚標記的尼古丁(可從NEN獲得)，從而監控海洛因的再分配(即腦中減少的量)，接著在不同的時間點施斷頭術。抗海洛因抗體對海洛因的代謝及清除的作用的分析測定可以通過對取自3H海洛因注射的小鼠的血漿的TLC分析或通過HPLC進行。
應當理解，本文中描述的實施例和實施方案僅是為了闡明本發明，並且本領域技術人員參照其將可提出各種修正。因此，提供以下非限制性的實施例來指導本發明的實施。
實施例1尼古丁軛合物的製備方法A 向去甲尼古丁(50mmol)的二氯甲烷溶液中加入三乙胺(75mmol)，接著加入琥珀酸酐(100mmol)。將該溶液回流加熱18小時。該反應混合物按順序用10％鹽酸水溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、鹽水和水洗滌。乾燥(MgSO4)並減壓除去溶劑後，殘餘物利用矽膠快速色譜法進行純化得到預期產物。
方法B 然後用琥珀醯化的去甲尼古丁來合成尼古丁軛合物PS-54(圖7)。向琥珀醯化的去甲尼古丁(5μm)的DMF溶液(0.1ml)中依次加入二異丙基乙胺(10μm)和HATU(5.5μm)。10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到HEL或BSA(500μg)在pH8.8的0.1M硼酸鈉緩衝液中的溶液(0.9ml)中，並且將該混合物在室溫下攪拌18小時。仔細地加入0.1M鹽酸水溶液將該軛合物溶液的pH調節到pH7.0，接著利用PBS滲析進行純化。滲析液通過0.2μm過濾器過濾，並利用質譜分析或UV吸光度測量半抗原化水平。
尼古丁特異性抗體應答的誘導為了誘導對小分子或半抗原諸如尼古丁的特異性抗體應答，需要將其與含有T細胞表位的載體，例如蛋白質載體連接。該載體由T細胞識別，它們是由尼古丁特異性B細胞產生的抗體的引發和維持所必需的。在本實施例中，所用的載體是BSA。製備一板結構清楚的尼古丁-BSA軛合物，它們通過尼古丁分子的不同部分與幾種不同類型的連接劑相連(圖6b)。軛合物的不同構造使得檢驗尼古丁分子的不同變化和外觀成為可能。既然所給出的任何尼古丁軛合物都能誘導不定量的識別游離半抗原(尼古丁)、載體、或僅識別軛合物(並且不識別尼古丁本身)的抗體，於是如下列實施例中所述對軛合物進行篩選。
給四隻2-3月齡的Balb/c雌性小鼠腹腔注射在弗氏完全佐劑中的50μg尼古丁-BSA軛合物，PS-55-BSA，進行免疫接種。在研究中這些動物有對抗原的良好的計劃再現應答。第21天時第二次注射PS-55-BSA，並在第35天給小鼠放血。如圖9a中所示，用ELISA檢驗血清，測定與PS-55的軛合物結合的抗體和雞卵溶菌酶蛋白(HEL)。這些數據表明該尼古丁-BSA軛合物能誘導強烈的抗體應答。
將第二組10隻2-3月齡的Balb/cbyj雌性小鼠免疫接種來製備抗尼古丁抗血清的血清混合液。在該實驗中，所用載體是CTB。小鼠通過肌內注射在鋁膠中的10μg PS-55-CTB進行免疫接種，並用相同物質加強三次。給小鼠放血，血清分別處理。從每隻小鼠獲得的血清首先用直接尼古丁ELISA進行檢驗，測定抗尼古丁抗體，然後用競爭性ELISA測定所誘導的抗體是否能識別游離尼古丁。
如下所述，從每隻小鼠獲得的血清用抗尼古丁直接ELISA進行檢驗，以測量所產生的抗體。Immulon 2 96孔ELISA板在4℃下用用1×PBS稀釋的50μl 10μg/ml次級軛合物尼古丁和HEL，PS-55-HEL塗覆過夜。這些板用0.5％PBS中的明膠在室溫下封閉1小時。然後它們用含有0.05％吐溫-20的1×PBS(PBS-T)洗滌三次。以對PS-55-HEL塗覆板1/300稀釋度的量開始將血清樣品加入這些板中。血清用3倍稀釋度稀釋並在室溫下在封閉板上孵育2小時。然後這些板用PBS-T洗滌三次。生物素化的山羊抗小鼠IgG(Lot#J194-N855B或C)以1/10000稀釋於PBS-T中，向每孔中加入100μl並在室溫下孵育1小時。將抗生蛋白鏈菌素-HRP稀釋1/10000倍並加入到這些孔中，30分鐘後用PBS-T洗滌。這些板用PBS-T洗滌三次，然後向每孔中加入TMB底物使其反應。5分鐘後用1M磷酸終止該反應。利用ELISA閱讀器在O.D.450nm讀取這些板。然後用競爭性ELISA檢驗在該直接ELISA中產生抗尼古丁抗體的血清。
游離尼古丁的識別為了測定誘導的抗體是否能識別游離尼古丁分子，進行競爭性ELISA測試。在該測定中，游離尼古丁與塗覆到ELISA板上的PS-55HEL競爭以與血清中的抗體結合。如果對尼古丁具有高親和力的抗體包括與PS-55 HEL結合的多數抗體，則低濃度的尼古丁就能有效地抑制抗體結合。
上述用PS-55 BSA注射的4隻小鼠中的3隻，與PS-55 HEL結合的抗體受到游離尼古丁的抑制(數據未顯示)。注意不期望僅對軛合物具有特異性的抗體的存在幹擾抗尼古丁抗體的作用。這表明在這些血清中均存在識別游離尼古丁的抗體。在競爭性ELISA中還檢測了尼古丁的主要代謝物可替寧，除非它的濃度非常高，否則它不能與任何血清中的抗體競爭。為了驗證所誘導的抗體是否能識別游離尼古丁分子，用RIA來測量與[3H]-尼古丁的特異性結合。從上述實驗中獲得的免疫者血清用[3H]-尼古丁和蛋白質-G-軛合瓊脂糖珠(Gammabind-G瓊脂糖，Pharmacia)孵育，它們結合血清樣品中的IgG。將這些珠子離心，從而分離出抗體結合的[3H]-尼古丁，並通過對這些珠子閃鑠計數來進行檢測。4隻小鼠中有3隻小鼠的血清顯著與游離[3H]-尼古丁結合(數據未顯示)。預先用50倍過量的未標記尼古丁孵育的這些血清完全抑制了[3H]-尼古丁與這些抗體的結合。這些數據表明，已經合成了誘導尼古丁特異性抗體應答的尼古丁載體軛合物，它們應該能防止體內尼古丁向腦中的分布。
對於第二組利用PS-55-CTB免疫的10隻小鼠，與PS-55 HEL結合的抗體受到游離尼古丁的抑制(圖10)。用一份稀釋血清來表示50％點效價。Immulon 2 96孔ELISA板在4℃下用以1×PBS稀釋的50μl 10μg/mlPS-N-3.2 HEL塗覆過夜。這些板在室溫下用PBS中的0.5％明膠封閉1小時，然後它們用含有0.05％吐溫-20的1×PBS(PBS-T)洗滌三次。這些板在不同濃度的游離尼古丁以及代謝物、藥物和相關化合物的存在下，用抗血清在室溫下孵育2小時。然後再用PBS-T將這些板洗滌三次。生物素化的山羊抗小鼠IgG(Lot#J194-N855B或C)用PBS-T稀釋1/10000倍，向每孔中加入100μl並在室溫下孵育1小時。將抗生蛋白鏈菌素-HRP稀釋1/10000倍並加入到這些孔中，30分鐘後用PBS-T洗滌。這些板用PBS-T洗滌三次，然後向每孔中加入TMB培養基使其發育。5分鐘後用1M磷酸終止該反應。利用ELISA閱讀器在0.D.450nm讀取這些板。圖10中顯示了測試的每種血清混合液的競爭曲線。X軸表示競爭者濃度的升高，Y軸表示450nm處的吸收。
如圖10中所示，對尼古丁代謝物可替寧或去甲尼古丁識別很少或沒有。用麻醉劑利多卡因作為陰性對照，它不能與抗體的結合競爭。該軛合物自身也用作競爭劑，它能與該抗體的結合競爭。
為了最有效地阻斷尼古丁的活性，應將所誘導的抗體對尼古丁代謝物的親和力減至最小。這些抗體與更穩定的代謝物的結合將降低疫苗的效能。在對抗血清集合體的篩選中，僅有尼古丁能抑制抗體與軛合物的結合。在該實驗中，很少或沒有看到對代謝物(可替寧和去甲尼古丁)和麻醉劑(利多卡因)的識別。因此，尼古丁-CTB軛合物誘導了識別尼古丁而不識別較低活性代謝物的抗體。該尼古丁-CTB軛合物也不識別具有相關結構的化合物和目前用於治療尼古丁成癮的藥物(數據未顯示)。
尼古丁特異性抗體的特異性為了分析尼古丁疫苗誘導的抗尼古丁抗體的特異性，用競爭性ELISA檢驗用尼古丁-CTB軛合物接種的小鼠的血清。檢驗不同濃度的尼古丁代謝物和相關分子的平板。如果該抗體對代謝物有高親和力，則低濃度就能有效地競爭該測定。相對反應性表達為IC50即使ELISA信號降低50％的抑制劑的濃度。檢測下列代謝物的反應性葡萄糖醛酸化尼古丁，可替寧，葡糖苷酸可替寧，反式-3 』-羥基可替寧，反式-3』羥基可替寧葡糖苷酸，尼古丁1』-N-氧化物，N-氧化可替寧，和去甲尼古丁。
尼古丁特異性抗體在抑制尼古丁分布中的作用體內尼古丁向腦中分布的抑制為了評定由尼古丁特異性抗體引起的尼古丁在組織中分布的變化，對比3H-尼古丁在尼古丁-CTB-免疫的小鼠和在天然(未免疫的)對照小鼠體內的分布。免疫者和對照免疫的小鼠用0.08mg/kg3H-尼古丁靜脈注射，然後在注射後1.0分鐘時處死。將腦和血液(血漿)除去，用於隨後的組織和血漿尼古丁濃度的分析。將血液集中到含有EDTA的試管中以防止凝固。將腦和血漿樣品放置到含有組織穩定劑的閃爍瓶中，樣品在室溫下消化三天。將這些樣品脫色並向每個樣品中加入閃爍混合液。加入冰乙酸使樣品澄清。這些樣品用閃爍計數器計數後，將數據轉化為ng/g或ng/ml組織。在注射了3H-尼古丁後，尼古丁-CTB免疫小鼠的腦組織中的尼古丁濃度顯著低於天然對照小鼠的腦組織的尼古丁濃度(數據未顯示)。
實施例2方法A (S)-尼古丁的N』-丁酸加合物在氬氣下，在冰水溫度下，在10分鐘內向(S)-尼古丁(0.031摩爾)的無水甲醇溶液(50ml中滴加4-溴丁酸乙酯(0.0341摩爾)。使所得橙色溶液恢復到室溫並攪拌18小時。減壓除去溶劑，剩下的棕色殘餘物用己烷沉澱，得到預期酯的分析純樣品。
將該酯(36mg)溶於甲醇(3ml)和1M氫氧化鈉溶液(5ml)並在室溫下攪拌18小時。減壓除去溶劑，將殘餘物溶於10％鹽酸並用乙酸乙酯萃取。乾燥(MgSO4)後，減壓除去溶劑，得到預期化合物。
方法B (S)-尼古丁的N』-戊酸加合物在氬氣下，在冰水溫度下，在10分鐘內向(S)-尼古丁(0.031摩爾)的無水甲醇溶液(50ml)中滴加1-溴戊酸(0.0341摩爾)。使所得橙色溶液恢復到室溫並攪拌18小時。減壓除去溶劑，剩下的棕色殘餘物用己烷沉澱，得到預期化合物的分析純樣品。
方法C (S)-尼古丁的N』-己酸加合物在氬氣下，在冰水溫度下，在10分鐘內向(S)-尼古丁(0.031摩爾)的無水甲醇溶液(50ml)中滴加1-溴己酸(0.0341摩爾)。使所得橙色溶液恢復到室溫並攪拌18小時。減壓除去溶劑，剩下的棕色殘餘物用己烷沉澱，得到預期化合物的分析純樣品。
方法D (S)-尼古丁的N』-辛酸加合物在氬氣下，在冰水溫度下，在10分鐘內向(S)-尼古丁(0.031摩爾)的無水甲醇溶液(50ml)中滴加合適的1-溴辛酸(0.0341摩爾)。使所得橙色溶液恢復到室溫並攪拌18小時。減壓除去溶劑，剩下的棕色殘餘物用己烷沉澱，得到預期化合物的分析純樣品。
實施例3方法A PS-55，PS-56，PS-57和PS-58的通用製備向尼古丁的合適的N』-鏈烷酸類似物(6.27×10-5摩爾)(來自實施例1)的DMF溶液(1.6ml)中加入DIEA(1.25×10-4摩爾)和HAUT(7.53×10-5摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液加入在0.1M碳酸氫鈉，pH8.3(14.4ml)中的HEL或BSA(16.5mg)中並攪拌18小時。該軛合物溶液在4℃利用PBS滲析過夜進行純化。這些軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數量。
方法B PS-55的製備向尼古丁的N 』-丁酸加合物(39mg，1.56×10-4摩爾)(來自實施例2，方法A)的DMF溶液(0.4ml)中加入DIEA(54ml，3.10×10-4摩爾)和HAUT(71mg，1.87×10-4摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml 0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉，pH8.5緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.6×10-6摩爾賴氨酸])中，然後攪拌1小時。該軛合物在4℃利用PBS滲析過夜進行純化。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數量。
方法C PS-56的製備向尼古丁的N』-戊酸加合物(2mg)(來自實施例2，方法B)的DMF溶液(0.4ml)中加入DIEA(2ml)和HAUT(2mg)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml 0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉，pH8.5緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.6×10-6摩爾賴氨酸])中，然後攪拌1小時。該軛合物在4℃利用PBS滲析過夜進行純化。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數量。
方法D PS-57的製備向尼古丁的N』-己酸加合物(2mg)(來自實施例2，方法C)的DMF溶液(0.4ml)中加入DIEA(2ml)和HAUT(2mg)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml 0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉，pH8.5緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.6×10-6摩爾賴氨酸])中，然後攪拌1小時。該軛合物在4℃利用PBS滲析過夜進行純化。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數量。
方法E PS-58的製備向尼古丁的N』-辛酸加合物(2mg)(來自實施例2，方法D)的DMF溶液(0.4ml)中加入DIEA(2ml)和HAUT(2mg)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml 0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉，pH8.5緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.6×10-6摩爾賴氨酸])中，然後攪拌1小時。該軛合物在4℃利用PBS滲析過夜進行純化。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數量。
方法F PS-60的製備i)N-吡咯烷加合物的製備向去甲尼古丁(10mmol)的甲醇溶液中滴加5-溴戊酸乙酯(10mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗完後，減壓除去溶劑，殘餘物用矽膠快速色譜法純化，得到預期的N-吡咯烷加合物。
ii)軛合物的製備將該酯(15mmol)溶於5％甲醇水溶液並向其中加入氫氧化鈉(15mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗完後，通過仔細加入1M鹽酸水溶液將pH調節到pH2，然後用乙酸乙酯萃取。乾燥(MgSO4)並減壓除去溶劑後，該產物用矽膠快速色譜法純化，得到預期的游離酸。
向該游離酸(1.55×10-4摩爾)的DMF溶液(0.4ml)中依次加入DIEA(3.1×10-4摩爾)和HATU(1.86×10-4摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml pH8.5的0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.5×10-6摩爾賴氨酸])中。該混合物在室溫下放置1小時，在4℃用PBS中和並充分滲析，得到PS-60。
方法G PS-51的製備i)6-甲基煙酸甲酯的製備將6-甲基煙酸(0.375mol)加入濃硫酸(25ml的回流的甲醇溶液(250ml)中並在回流下攪拌3小時。然後再加入甲醇(250ml)並將所得混合物回流加熱18小時。將該反應混合物冷卻並減壓濃縮成漿，將其加入碳酸氫鈉(80g)的水溶液(450ml)中。將該混合物減壓濃縮以除去多數甲醇。所得混濁混合物用二氯甲烷萃取，(MgSO4)乾燥，過濾並減壓濃縮。所得粗產物通過減壓蒸餾純化，得到預期酯。
ii)6-甲基肌氨酸(6-methylmyosmine)的製備在氬氣下，在-70℃，向二異丙胺(0.33mol)的二乙醚溶液(500ml)中加入正丁基鋰(0.247mol，1.6M己烷溶液)。向所製得的二異丙胺鋰(LDA)中加入N-(三甲矽烷基)吡咯烷酮(0.265mol)，並將該溶液在-70℃下攪拌15分鐘。向該溶液中加入6-甲基煙酸甲酯(0.165mol)的二乙醚溶液(25ml)，並使該混合物恢復到室溫過夜。之後，該混合物在冰浴中冷卻，加入水(33ml)並將醚層輕輕倒出。加入另外的醚，並重複傾倒過程兩次。向水層中加入濃鹽酸，所得溶液回流過夜。該酸性溶液用二乙醚洗滌，減壓濃縮，在冰浴中冷卻並用50％氫氧化鉀水溶液鹼化。該水層用二乙醚萃取(3×150ml)，(Na2SO4)乾燥，減壓濃縮並通過減壓蒸餾純化，得到預期的6-甲基肌氨酸。
iii)6-甲基肌氨酸的戊酸乙酯加合物的製備向6-甲基肌氨酸(10mmol)的無水甲苯溶液中加入氨基鈉(15mmol)。10分鐘後，加入5-溴戊酸乙酯(20mmol)，並將該混合物攪拌直到用TLC檢測表明起始物已消耗完。該混合物在冰浴中冷卻，用無水乙醇使驟冷，用乙酸乙酯萃取，(MgSO4)乾燥並減壓濃縮。利用矽膠快速色譜法純化，得到預期產物。
iv)6-甲基去甲尼古丁的戊酸加合物的製備向從上述(iii)獲得的加合物(10mmol)的甲醇溶液中加入氰基硼氫化鈉(10mmol)，微量溴甲酚綠指示劑和足量的2N HCl/甲醇，使該溶液的顏色由藍色變為黃色並保持黃色。將該溶液攪拌數小時，之後加入6N鹽酸，並將該混合物減壓濃縮。用碳酸氫鈉溶液鹼化後，用二乙醚萃取並乾燥(MgSO4)，該物質利用減壓蒸餾純化，得到預期化合物。
v)6-甲基尼古丁的戊酸加合物的製備向從上述(iv)中獲得的去甲尼古丁(10mmol)加合物的二乙醚溶液中加入碘代甲烷(20mmoL)。該溶液在氬氣下利用有效冷凝器回流，直到用TLC檢測表明起始物已消耗。減壓除去溶劑，殘餘物用快速色譜法純化，生成預期化合物的外消旋混合物。該異構體利用手性HPLC分離，得到預期的(S)-異構體。
vi)軛合物的製備向從上述(v)中獲得的6-甲基尼古丁衍生物(1.53×10-5摩爾)的(S)-異構體的DMF溶液中依次加入DIEA(3.06×10-5摩爾)和HATU(1.86×10-5摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液加入在4ml0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉，pH8.5緩衝液中的rCTB(2mg，3.40×10-8摩爾蛋白質，1.53×10-6摩爾賴氨酸)中。室溫下1小時後，該溶液在4℃下用PBS充分滲析，並利用質譜分析測定半抗原的數目。
方法H PS-52的製備i)5-甲基煙酸甲酯的製備將5-甲基煙酸(0.375mol)加入濃硫酸(25ml)的回流的甲醇溶液(250ml)中並在回流下攪拌3小時。然後再加入甲醇(250ml)並將所得混合物回流加熱18小時。將該反應混合物冷卻並減壓濃縮成漿，將其加入碳酸氫鈉(80g)的水溶液(450ml)中。將該混合物減壓濃縮以除去多數甲醇。所得混濁混合物用二氯甲烷萃取，(MgSO4)乾燥，過濾並減壓濃縮。所得粗產物通過減壓蒸餾純化，得到預期酯。
ii)5-甲基肌氨酸(5-methylmyosmine)的製備在氬氣下，在-70℃，向二異丙胺(0.33mol)的二乙醚溶液(500ml)中加入正丁基鋰(0.247mol，1.6M己烷溶液)。向所製得的二異丙胺鋰(LDA)中加入N-(三甲矽烷基)吡咯烷酮(0.265mol)，並將該溶液在-70℃下攪拌15分鐘。向該溶液中加入6-甲基煙酸甲酯(0.165mol)的二乙醚溶液(25ml，並使該混合物恢復到室溫過夜。之後，該混合物在冰浴中冷卻，加入水(33ml)並將醚層輕輕倒出。加入另外的醚，並重複傾倒過程兩次。向水層中加入濃鹽酸，所得溶液回流過夜。該酸性溶液用二乙醚洗滌，減壓濃縮，在冰浴中冷卻並用50％氫氧化鉀鹼化。該水層用二乙醚萃取(3×150ml)，(Na2SO4)乾燥，減壓濃縮並通過減壓蒸餾純化，得到預期的5-甲基肌氨酸。
iii)5-甲基肌氨酸的戊酸乙酯加合物的製備向5-甲基肌氨酸(10mmol)的無水甲苯溶液中加入氨基鈉(15mmol)。10分鐘後，加入5-溴戊酸乙酯(20mmol)，並將該混合物攪拌直到用TLC檢測表明起始物已消耗完。該混合物在冰浴中冷卻，用無水乙醇使驟冷，用乙酸乙酯萃取，(MgSO4)乾燥並減壓濃縮。利用矽膠快速色譜法純化，得到預期產物。
iv)5-甲基去甲尼古丁的戊酸加合物的製備向從上述(iii)獲得的加合物(10mmol)的甲醇溶液中加入氰基硼氫化鈉(10mmol)，微量溴甲酚綠指示劑和足量的2N HCl/甲醇，使該溶液的顏色由藍色變為黃色並保持黃色。將該溶液攪拌數小時，之後加入6N鹽酸，並將該混合物減壓濃縮。用碳酸氫鈉溶液鹼化後，用二乙醚萃取並乾燥(MgSO4)，該物質利用減壓蒸餾純化，得到預期化合物。
v)5-甲基尼古丁的戊酸加合物的製備向從上述(iv)中獲得的去甲尼古丁(10mmol)加合物的二乙醚溶液中加入碘代甲烷(20mmol)。該溶液在氬氣下利用有效冷凝器回流，直到用TLC檢測表明起始物已消耗。減壓除去溶劑，殘餘物用快速色譜法純化，生成預期化合物的外消旋混合物。該異構體利用手性HPLC分離，得到預期的(S)-異構體。
vi)軛合物的製備向從上述(v)中獲得的5-甲基尼古丁衍生物(1.53×10-5摩爾)的(S)-異構體的DMF溶液中依次加入DIEA(3.06×10-5摩爾)和HATU(1.86×10-5摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液加入在4ml0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉，pH8.5緩衝液中的rCTB(2mg，3.40×10-8摩爾蛋白質，1.53×10-6摩爾賴氨酸)中。室溫下1小時後，該溶液在4℃下用PBS充分滲析，並利用質譜分析測定半抗原的數目。
方法I PS-53的製備(i)4-甲基煙酸甲酯的製備將4-甲基煙酸(0.375mol)加入濃硫酸(25ml)的回流的甲醇溶液(250ml)中並在回流下攪拌3小時。然後再加入甲醇(250ml)並將所得混合物回流加熱18小時。將該反應混合物冷卻並減壓濃縮成漿，將其加入碳酸氫鈉(80g)的水溶液(450ml)中。將該混合物減壓濃縮以除去多數甲醇。所得混濁混合物用二氯甲烷萃取，(MgSO4)乾燥，過濾並減壓濃縮。所得粗產物通過減壓蒸餾純化，得到預期酯。
(ii)4-甲基肌氨酸(4-methylmyosmine)的製備在氬氣下，在-70℃，向二異丙胺(0.33mol)的二乙醚溶液(500ml)中加入正丁基鋰(0.247mol，1.6M己烷溶液)。向所製得的二異丙胺鋰(LDA)中加入N-(三甲矽烷基)吡咯烷酮(0.265mol)，並將該溶液在-70℃下攪拌15分鐘。向該溶液中加入6-甲基煙酸甲酯(0.165mol)的二乙醚溶液(25ml)，並使該混合物恢復到室溫過夜。之後，該混合物在冰浴中冷卻，加入水(33ml)並將醚層輕輕倒出。加入另外的醚，並重複傾倒過程兩次。向水層中加入濃鹽酸，所得溶液回流過夜。該酸性溶液用二乙醚洗滌，減壓濃縮，在冰浴中冷卻並用50％含水氫氧化鉀鹼化。該水層用二乙醚萃取(3×150ml)，(Na2SO4)乾燥，減壓濃縮並通過減壓蒸餾純化，得到預期的4-甲基肌氨酸。
實施例4海洛因軛合物的製備PS-61的製備I)去甲海洛因的製備在0℃下，向海洛因(10mmol)的水溶液中加入高錳酸鉀(12mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，使該懸浮液恢復至室溫。然後通過過濾除去二氧化錳，並減壓除去溶劑，得到預期產物去甲海洛因。
ii)軛合物前體的製備向去甲海洛因(10mmol)的THF溶液中逐滴加入5-溴戊酸乙酯(2Ommol)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，減壓除去溶劑。然後殘餘物用矽膠快速色譜法純化，得到預期的去甲海洛因的酯加合物。
iii)軛合物的製備將該酯(15mmol)溶於5％甲醇並向其中加入氫氧化鈉(15mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，通過仔細加入1M鹽酸將pH調節到pH2，然後用乙酸乙酯萃取。(MgSO4)乾燥並減壓除去溶劑後，該產物利用矽膠快速色譜法純化，得到預期游離酸。
向該游離酸(1.55×1-4摩爾)的DMF溶液(0.4ml)中依次加入DIEA(3.1×10-4摩爾)和HATU(1.86×10-4摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml pH8.5的0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.5×10-6摩爾賴氨酸)中。該混合物在室溫下保持1小時，然後在4℃下用PBS中和並充分滲析得到PS-61。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數目。
實施例5PS-62和PS-63的製備(I)前體的製備在0℃，向海洛因(1Ommol)的於燥THF溶液中滴加正丁基鋰(1.5mmol，1.6M己烷溶液)。所得混合物在0℃放置2小時，然後在10分鐘內滴加4-溴丁酸乙酯(22mmol)的THF溶液。將所得混合物加熱，直到用TLC檢驗表明起始物已消耗。之後，將該反應混合物冷卻到0℃並仔細加入10％鹽酸。將兩層分離，水層用乙酸乙酯萃取。合併後的有機萃取液依次用1M氫氧化鈉水溶液、水和鹽水洗滌。乾燥(MgSO4)後，減壓除去溶劑，殘餘物用矽膠快速色譜法純化，得到兩種產物，一種鄰位和一種間位的芳香乙酸酯基。
(ii)PS-62的製備將鄰位加合物的酯(5mmol)溶於5％甲醇並向其中加入氫氧化鈉(5mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，通過仔細加入1M鹽酸將pH調節到pH2，然後用乙酸乙酯萃取。(MgSO4)乾燥並減壓除去溶劑後，該產物利用矽膠快速色譜法純化，得到預期游離酸。
向該游離酸(1.55×10-4摩爾)的DMF溶液(0.4ml)中依次加入DIEA(3.1×10-4摩爾)和HATU(1.86×10-4摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml pH8.5的0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.5×10-6摩爾賴氨酸)中。該混合物在室溫下保持1小時，然後在4℃下用PBS中和並充分滲析得到PS-62。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數目。
(iii)PS-63的製備將間位加合物的酯(5mmoL)溶於5％甲醇並向其中加入氫氧化鈉(5mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，通過仔細加入1M鹽酸將pH調節到pH2，然後用乙酸乙酯萃取。(MgSO4)乾燥並減壓除去溶劑後，該產物利用矽膠快速色譜法純化，得到預期游離酸。
向該游離酸(1.55×10-4摩爾)的DMF溶液(0.4ml)中依次加入DIEA(3.1×10-4摩爾)和HATU(1.86×10-4摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml pH8.5的0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.5×10-6摩爾賴氨酸)中。該混合物在室溫下保持1小時，然後在4℃下用PBS中和並充分滲析得到PS-63。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數目。
實施例6PS-64的製備I)乙醯化可待因的製備向可待因(10mmol)的二氯甲烷溶液中加入三乙胺(12mmol)，接著加入乙酸酐(12mmol)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，減壓除去溶劑，殘餘物用矽膠快速色譜法純化，得到預期的乙醯化產物。
ii)乙醯化可待因的脫甲基化向該乙醯化產物(10mmol)的二氯甲烷溶液中滴加三溴化硼(12mmol，1.0M二氯甲烷溶液)。用TLC檢測表明起始物已消耗後，仔細加入無水甲醇並將該混合物減壓濃縮。將殘餘物溶於甲醇，再次減壓濃縮，然後用矽膠快速色譜法純化，得到預期的醇。
iii)脫甲基乙醯化可待因的琥珀醯化向該醇(10mmol)的二氯甲烷溶液中依次加入三乙胺(20mmol)和琥珀酸酐(20mmol)。所得混合物回流加熱直到用TLC檢驗表明起始物已消耗。之後，減壓除去溶劑，殘餘物用矽膠快速色譜法純化，得到預期的半琥珀酸酯。
iv)PS-64的製備向該半琥珀酸酯(1.55×10-4摩爾)的DMF溶液(0.4ml)中依次加入DIEA(3.1×10-4摩爾)和HATU(1.86×10-4摩爾)。室溫下10分鐘後，將該淡黃色溶液滴加到在4ml pH8.5的0.1M硼酸鈉，0.15M氯化鈉緩衝液中的rCTB(2mg，3.4×10-8摩爾[15.5×10-6摩爾賴氨酸)中。該混合物在室溫下保持1小時，然後在4℃下用PBS中和並充分滲析得到PS-64。該軛合物利用雷射解析質譜分析進行測定，以確定半抗原的數目。
實施例7檢測CTB的功能活性的測定為了檢驗單獨的CTB的功能活性，進行兩種測定試驗。首先，利用流式細胞計測量CTB對細胞的結合。細胞用CTB孵育後，接著用商業上獲得的抗-CTB山羊抗血清和異硫氰酸螢光素(FITC)-標記的抗山羊次級抗體孵育(圖13)。天然五聚體的CTB與細胞結合，使得螢光強度顯著位移。在該測定中單體CTB不能與細胞結合。其次，用ELISA來測量CTB結合神經節甙酯GM1的能力。ELISA板用GM1-神經節甙酯塗覆並用不同濃度的CTB孵育。利用抗-CTB抗體(或用鹽水作為對照)檢測結合情況，接著用酶標記的次級抗體進行檢測，並用培養基使其發育。該測定提供了對五聚體的CTB結合GM1神經節甙酯的能力的定量和極靈敏的測量。這些測定用來在進行體內試驗前監控重組和半抗原化CTB軛合物的功能活性。
實施例8與其他藥物的聯合治療關於海洛因濫用的治療，我們進行了篩選以確定用第二種藥物一起治療的藥物療法是否將增強該治療疫苗的活性。我們期望用阿片製劑拮抗劑諸如納洛酮和納曲酮，以及其他拮抗劑諸如納洛芬、左洛啡烷、環佐辛、丁丙諾啡和噴他佐辛一起治療與用海洛因軛合物的治療是相容的。一種或多種治療劑可能是免疫抑制的，因此抑制高效價的抗海洛因抗體應答的產生。為了了解這種可能性，大鼠在有或沒有共同治療藥物的條件下用海洛因載體軛合物進行免疫接種，並在不同時間測量抗體效價。被發現將顯著免疫抑制的聯合治療藥物將作為配伍禁忌的治療而排除。該篩選試驗用於考慮聯合治療的任何藥物。
如果沒有看到免疫抑制，將進行進一步的篩選以確定這兩種方法是否有協同作用。經過培養、免疫接種和檢驗後，用兩種模型在藥物的存在下進一步對大鼠進行評定。大鼠在接受不同劑量的海洛因之前將接受藥物。用對照的載體免疫的大鼠進行初始試驗以選擇出不會完全消滅自我服用行為或藥物辨別系統的藥物的劑量。對數據進行評估以確定共同治療是否增加了治療疫苗的作用。
實施例9黏膜應答的產生霍亂毒素的B亞單位(CTB)已在許多系統中顯示出能保留完整霍亂毒素的活性，包括產生黏膜抗體應答。因此，該載體應誘導強烈的抗-海洛因或抗-尼古丁IgA抗體應答。另外，口服初期應誘導強烈的系統性IgG抗體應答。
在呼吸道中引發免疫應答的有效方式是將抗原直接遞送到這些部位。該抗原加入鹽水中給藥，CTB作為自身佐劑。為了確認CTB給藥後在黏膜IgA表面引發的能力，單獨用載體進行初始試驗。小鼠通過口頭、鼻或氣管內三種途徑用50μg CTB或者海洛因-CTB或尼古丁-CTB軛合物引發。對於口服給藥的小鼠，胃內給予250μg海洛因-CTB或尼古丁-CTB軛合物或者單獨的CTB，或者通過使用一個鈍的23G針直接給到胃。引發後第14天，利用相同的方案給小鼠加強免疫。經鼻給藥是一種簡單而常用的引發途徑。將抗原應用到輕度麻醉的小鼠的每隻鼻孔，每隻小鼠所用的總體積為50μl。引發後第14天，利用相同的方案給小鼠加強免疫。經鼻給藥適於作為鼻噴霧劑應用於人。經鼻免疫已成功地用於活流感疫苗(Walker等，(1994)疫苗12387-399)。
氣管內免疫直接將抗原應用到下呼吸道，由此增強肺中的免疫性。用氯胺酮和賽拉嗪的混合物將小鼠麻醉。將這些動物安置在一個設備上，使它們的嘴張開並暴露出氣管；用光導纖維燈探針對氣管進行目測檢驗。用一個鈍的23號針將50μl溶液遞送到肺中。引發後第14天，利用相同的方案給小鼠加強免疫。
在加強免疫後的不同時間點(14、21或28天)通過CO2窒息將這些動物處死，收集鼻和支氣管肺泡的灌洗液並測定對所給予的軛合物特異性的IgA。如(Tamura等，(1989)疫苗7257-262)所述，用總量1ml PBS將鼻腔洗滌四次而得到鼻洗液。如(Nedrud等，(1987)免疫學雜誌1393484-3492)所述，通過手術暴露出氣管，將0.5ml PBS注射到肺中並衝洗三次，從而得到支氣管肺泡的灌洗液。離心除去細胞後，利用IgA-特異性次級抗體通過ELISA測定這些樣品的抗原-特異性IgA。測量鼻和肺洗液中的海洛因-特異性或尼古丁-特異性IgG，正如已經報導的那樣，IgG在肺中可頻繁地檢測到且是重要的(Cahill等，(1993)FEMS微生物學快報107211-216)。
口頭免疫途徑是用於評估其在腸洗液中產生海洛因-特異性或尼古丁-特異性IgA的能力，並與其他途徑比較其產生對海洛因或尼古丁具有特異性的血清Ig的能力。口服給藥在人類中是特別優選的，因為其給藥容易。直接對比鼻內和氣管內給藥途徑，比較它們在肺或鼻灌洗液中誘導IgA應答的能力。無論哪種途徑是最有力的，優選其並用於剩餘試驗。如果兩種途徑效力差不多，則優選經鼻免疫，因為其簡單。
為了最大地保護性對抗海洛因或尼古丁，可將系統性IgG和黏膜IgA應答最大化。因此，用在明礬(或其他一些佐劑)中的海洛因-CTB或尼古丁-CTB軛合物系統性注射和用軛合物黏膜攻擊都是優選的以有效地引發兩個隔間。用三組進行對比。第一組，將小鼠系統性引發，14天後黏膜攻擊。第二組，小鼠用黏膜引發，14天後系統性攻擊。第三組，它們在相同時間系統性和黏膜引發，14天後同樣加強。對照小鼠僅黏膜引發或僅系統性引發。在每種情況下，通過測量IgG和IgA抗體效價來確定攻擊效力。
作為黏膜抗-海洛因或抗-尼古丁抗體的體內效力的初步測量，分別測量黏膜給予的海洛因或尼古丁的藥物動力學變化。
實施例10小鼠的免疫的免疫球蛋白的被動轉移小鼠利用實施例中所述的最佳免疫方案用海洛因軛合物進行免疫。在不同時間將小鼠放血並用ELISA評定抗-海洛因抗體的效價。將抗體效價約為54,000或以上的動物處死並通過心臟穿刺採血。對照小鼠用單獨的載體蛋白進行免疫。將多個(至少20隻)小鼠的血清集中並通過硫酸銨沉澱分離出IgG部分。滲析除去硫酸銨後，利用ELISA定量測定集中的免疫球蛋白部分中古柯鹼-特異性抗體的水平。原初小鼠腹腔或靜脈注射不同量的免疫球蛋白，24小時後，對這些接受小鼠採血並測定血清以確定古柯鹼-特異性抗體的水平。用這種方法，確定了必須轉移以達到所給效價的抗體的量。給各組小鼠免疫的免疫球蛋白並在不同時間採血以確定抗原-特異性抗體的清除率。其他組小鼠如實施例中所述用放射標記的海洛因攻擊，並測量分布到腦中的海洛因。對照小鼠接受來自載體免疫的小鼠的IgG。這些實驗證明了被動轉移的免疫的免疫球蛋白抑制海洛因進入腦中的能力。
實施例11人體中免疫的免疫球蛋白的被動轉移利用實施例中所述的最佳免疫方案用本發明的軛合物對受試者進行免疫接種。在不同時間，對這些供體通過靜脈穿刺術採血並用ELISA測定抗-半抗原抗體的效價。將從多個供體獲得的超免疫血漿集中並通過冷乙醇分餾分離出IgG級分。象人類使用的超免疫抗體製備需要的那樣通過緩衝、穩定化、保護和標準化來製備抗體。利用ELISA或其他基於抗體的測定將抗-半抗原抗體的水平標準化。
將合適劑量的純化抗體肌內或靜脈注射給予20名患者，伴有或不伴有半抗原-CTB疫苗，但作為疫苗不是在相同的解剖學部位。合適的劑量通過利用ELISA或其他基於抗體的測定檢測試驗患者人群中接受者的血清水平來確定，測定在注射超免疫抗體製劑後24小時或其他合適的時間點進行，和/或通過測定抑制海洛因或尼古丁作用的不同劑量的有效性來確定。
被動轉移的免疫球蛋白抑制了患者體內海洛因或尼古丁的作用。供體庫中人供體、多克隆抗體和大量供體的使用限制了患者對轉移的抗體的免疫應答的機會。
實施例12rCTB的製備級純化將由SBL Vaccin AB提供的從霍亂弧菌獲得的、在0.22M磷酸鹽pH7.3，0.9％NaCl緩衝液中的rCTB滲濾到20mM磷酸鈉，pH6.5中。樣品利用陽離子交換色譜在Pharmacia SP瓊脂糖快速流動樹脂上純化，用緩衝液A20mM磷酸鈉，pH6.5和緩衝液B20mM磷酸鈉，pH6.5，1.0M NaCl作為洗脫緩衝液。純化的部分利用SDS-PAGE進行分析測定，用Daichi銀染色劑染色。純化的樣品通過0.22微米過濾器過濾並在4℃下無菌儲存。
實施例13方法A (分析的)用下述方法製備用於分析型反相HPLC(RPHPLC)的樣品通過加入1.0ml絕對乙醇並在-80℃冷凍過夜使100μl軛合物CTB-5.200沉澱。該軛合物在4℃以14000rpm的速度旋轉20分鐘，然後輕輕倒出乙醇並將所得沉澱空氣乾燥。將這些小丸再懸浮於25μl帶有0.1％三氟乙酸(TFA)的20％乙腈中，並通過PierceMixro BCA測定測量蛋白質濃度。
該軛合物利用C18反相柱(Vydac No.218TP5215窄孔)2.1×150mm；顆粒大小5U，流速200μl/分鐘；緩衝液A100％水0.1％TFA；緩衝液B80％乙腈，0.08％TFA進行分析測定。梯度從16％開始，在50分鐘內升高到56％，60分鐘時升高到80％，並保持10分鐘。
方法B (半製備)如下製備用於半製備型RP HPLC的樣品將兩瓶親液的CTB-5.200再懸浮於20％乙腈0.1％TFA中，無菌過濾，並利用Pierce Micro BCA定量。利用C18柱(Vydac No.218TP1520)10×50mm；顆粒大小5U1，流速1.8ml/分鐘；緩衝液A水中的0.1％TFA；緩衝液B80％乙腈中的0.08％TFA製備用於半製備型RP HPLC系統的兩種1.24mg注射劑。使用下述逐步梯度20％B 10分鐘，35％B 40分鐘，55％B 5分鐘，用100％B洗滌5分鐘結束。合併最高值並立即冷凍乾燥。
實施例14半抗原化對免疫原性的水平軛合物中藥物半抗原與載體蛋白的比例可改變該軛合物刺激半抗原-特異性抗體產生的能力。改變軛合反應以生成具有數種不同半抗原化水平的海洛因-CTB軛合物。利用該軛合物的質譜分析計算半抗原化程度。篩選這些軛合物在免疫原性試驗中的生物學活性並利用質譜分析半抗原化水平。通過不同方法利用與載體蛋白相比不同比例的半抗原化試劑製備軛合物。對比半抗原化和免疫原性的水平。
等同物本領域技術人員至多利用常規實驗就可識別出，或能確定本文中描述的特異性物質和方法的大量等同物。這樣的等同物也被認為在本發明的範圍內，並由以下權利要求所覆蓋。
權利要求
1.一種半抗原-載體軛合物，它包含至少一個半抗原和至少一個含有T細胞表位的載體，其中所述半抗原衍生自尼古丁、古柯鹼、致幻劑、大麻素、興奮劑、抑制劑、阿片或其衍生物或設計者藥物，其中所述半抗原與所述載體通過選自下組化學基團的分支相連接，所述化學基團由CJ索引號確定CJ0 QCJ1 (CH2)nQCJ1.1CO2QCJ1.2COQCJ1.3OCH3CJ2 OCO(CH2)nQCJ2.1OCOCH＝QCJ2.2OCOCH(O)CH2CJ2.3OCO(CH2)nCH(O)CH2CJ3 CO(CH2)nCOQCJ3.1CO(CH2)nCNQCJ4 OCO(CH2)nCOQCJ4.1OCO(CH2)nCNQCJ5 CH2OCO(CH2)nCOQCJ5.1CH2OCO(CH2)nCNQCJ6 CONH(CH2)nQCJ7 Y(CH2)nQCJ7.1CH2Y(CH2)nQCJ8 OCOCH(OH)CH2QCJ8.1OCO(CH2)nCH(OH)CH2QCJ9 OCOC6H5 其中Q′是被修飾的蛋白質CJ11YCO(CH2)nCOQ其中n是整數，Q是載體，並且Y選自S、O和NH。
2.如權利要求1所述的半抗原-載體軛合物，其中n是從約2至約20。
3.如權利要求1或2所述的半抗原-載體軛合物，其中所述載體選自蛋白質或肽、細菌毒素或產品、亞病毒、凝集素、變應原和變應原片段、瘧疾蛋白抗原、人造多抗原肽，以及上述物質的變體、類似物和衍生物。
4.如前述權利要求任一項所述的半抗原-載體軛合物，其中多於一個半抗原與載體聯結。
5.如前述權利要求任一項所述的半抗原-載體軛合物，其中所述半抗原衍生自尼古丁或古柯鹼。
6.如前述權利要求任一項所述的半抗原-載體軛合物，其中半抗原與載體通過CF11基團YCO(CJ2)nCOQ相連。
7.下列半抗原-載體軛合物用於製備治療人藥物成癮的治療性組合物的用途，所述半抗原-載體軛合物包含至少一個半抗原和至少一個含有T細胞表位的載體，其中所述半抗原衍生自尼古丁、古柯鹼、致幻劑、大麻素、興奮劑、抑制劑、阿片或其衍生物或設計者藥物，其中所述半抗原與載體通過選自下組化學基團的分支相連接，所述化學基團由CJ索引號確定CJ0QCJ1(CH2)nQCJ1.1 CO2QCJ1.2COQCJ1.3OCH3CJ2 OCO(CH2)nQCJ2.1OCOCH＝QCJ2.2OCOCH(O)CH2CJ2.3OCO(CH2)nCH(O)CH2CJ3 CO(CH2)nCOQCJ3.1CO(CH2)nCNQCJ4 OCO(CH2)nCOQCJ4.1OCO(CH2)nCNQCJ5 CH2OCO(CH2)nCOQCJ5.1CH2OCO(CH2)nCNQCJ6 CONH(CH2)nQCJ7 Y(CH2)nQCJ7.1CH2Y(CH2)nQCJ8 OCOCH(OH)CH2QCJ8.1OCO(CH2)nCH(OH)CH2QCJ9 OCOC6H5 其中Q′是被修飾的蛋白質CJ11 YCO(CH2)nCOQ其中n是整數，Q是載體，並且Y選自S、O和NH。
8.如權利要求7所述的用途，其中所述藥物製劑包含藥學上可接受的賦形劑。
9.如權利要求7或8所述的用途，其中所述藥物製劑可以通過黏膜給藥，並且包含共聚物微球，選擇性地為聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚物的共聚物微球。
10.如權利要求7或8所述的用途，其中所述藥物製劑可以通過局部給藥，並且所述製劑選擇性地具有比水大的動力學粘度。
11.如權利要求7或8所述的用途，其中所述藥物製劑可以作為可注射的無菌溶液給藥。
12.如權利要求7或8所述的用途，其中所述藥物製劑包含佐劑。
13.如權利要求7至12任一項所述的用途，其中所述半抗原衍生自尼古相或古柯鹼。
14.如權利要求7至13任一項所述的用途，其中所述半抗原與載體通過CJ11基團YCO(CH2)nCOQ相連。
15.一種製備如權利要求1-6任一項所述的軛合物的方法，其包括將半抗原與含有T細胞表位的載體通過與下列化合物交聯連接而連接在一起，所述化合物選自羧酸衍生的活性酯、混合酐、醯疊氮、醯滷和亞氨基酯。
全文摘要
本發明公開了包含至少一個衍生自濫用藥物的半抗原和至少一個含有T細胞表位的載體的半抗原－載體軛合物，還公開了所述軛合物在製備治療藥物成癮的治療性組合物的用途以及製備所述軛合物的方法。
文檔編號A61K9/16GK1951502SQ20061009990
公開日2007年4月25日 申請日期1997年9月30日 優先權日1996年9月30日
發明者P·A·斯溫, J·L·格林斯泰恩, M·A·艾克絲雷, B·S.·福克斯, S·P·帕沃斯, M·L·格夫特 申請人:茨諾瓦研究有限公司