一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備方法

2023-10-04 02:47:54 2

專利名稱：一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備方法
一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備方法技術領域：
本發明屬於生物製劑製備技術領域，特別涉及一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備 方法。背景技術：
凝乳酶(chymosin， EC3.4.23.4)是一種從未斷奶的小牛胃中發現的天門冬氨酸蛋白酶， 其主要的生物學功能是有限剪切酪蛋白的k-酪蛋白中Phel05-Met106連接的肽鍵，導致 牛奶凝結，因此被廣泛用於乾酪製造業，成為食品領域中重要的酶製劑，其產值佔全世界 酶製劑的15%。凝乳酶的傳統製備方法是將出生10-30天的小牛屠宰，從其第四胃中用鹽將凝乳酶浸 提出來。由於凝乳酶是乾酪生產中的關鍵性酶，隨著世界乾酪產業的不斷發展，每年宰殺 5000萬頭犢牛以獲得凝乳酶的方法，仍不能滿足生產需要，也與現代工業發展極不協調。 因此，研究者都在不斷尋找新的來源，主要包括動物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物源 凝乳酶，但是這幾種來源的凝乳酶又都具有一定的局限性。動物性凝乳酶受到來源限制， 而且利用動物性凝乳酶生產的乾酪不能滿足素食主義者的需求。植物性凝乳酶雖然來源廣 泛，但是受到時間、地域、生長周期長等條件限制，很難發展。利用微生物生產凝乳酶是 目前最有前途的發展方向，微生物生長周期短、產量大，受氣候、地域、時間限制小，用 其生產凝乳酶成本較低、酶提取方便、經濟效益高，但是同時也存在著微生物產生其他非 酶類代謝產物， 一般微生物酶在成為商品時，都要進行毒性、致癌性以及皮膚過敏性測試， 因而使得真正用於工業化生產凝乳酶的菌株很受限制。江米酒是我國南方的一種傳統食品，千百年前，我國就開始利用江米酒作為凝乳劑來 製備乾酪，而且已經有研究證明江米酒作為凝乳劑是江米酒中的凝乳酶在發揮作用，江米 酒中的凝乳酶其實是江米酒發酵劑酒藥中微生物代謝產物，屬於微生物源凝乳酶，由於江 米酒本身是傳統食品，所以從江米酒中提取凝乳酶無需考慮微生物所產的非酶類代謝產 物。
發明內容本發明的目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶 的製備方法。本發明提供的江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備方法，是利用江米麵作為培養基，通 過酒藥(發酵劑酒藥購自湖北省荊州市)發酵生產江米酒，採用硫酸銨分級沉澱法從江米 酒中提取凝乳酶，進一步使用SephadexG-100和DEAE-SephadexA-50純化凝乳酶，其具體步驟包括第一、江米酒的製備以10g/100mL的江米麵溶液、115-C滅菌20min，室溫下冷卻 至3(TC作為培養基，將酒藥按0.0032g酒藥/g江米麵的接種量，加入前述冷卻好的培養 基中，140轉/分鐘振蕩培養50~54小時，得到江米酒；第二、離心將第一步得到的江米酒在4'C、 3500轉/分鐘條件下離心10min，取上 清液備用；第三、凝乳酶的提取將硫酸銨烘乾研細，取第二步得到的上清液，向其中緩慢加入 硫酸銨粉末至其飽和度達到40%, 4 。C靜置2小時後，以7000轉/分鐘離心15min，取上 清液，繼續加入硫酸銨粉末至其飽和度達到90%， 4'C靜置2小時，以8000轉/分鐘離心 15min，沉澱溶於0.005mol/L、 pH6.28的磷酸鹽緩衝液中，4'C透析48小時，即為凝乳酶 粗液。第四、將上述第三步得到的凝乳酶粗液進行如下純化首先利用Sephadex G-100凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以0.005 mol/L、 pH6.28的磷 酸鹽緩衝液作為洗脫液，分步收集，檢測收集液活性，合併有活性的洗脫液；利用DEAE-Sephadex A-50進一步純化，以0.02mol/L、 pH 7.4的磷酸鹽緩衝液為起 始緩衝液，採用NaCl梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合併有活性洗脫液，濃縮凍幹得 到高純度的凝乳酶。本發明的有益效果1.以江米麵為培養基利用搖瓶發酵生產江米酒，取代了傳統江 米酒繁瑣的製備工藝，操作簡單，節約原料。2.通過對搖瓶發酵條件的優化，提高了江 米酒產凝乳酶的活力。3.通過對提取純化工藝的控制得到了高純度的凝乳酶。
具體實施方式
實施例l在10個250mL搖瓶中，分別加入5.0g江米麵、50mL水，搖勻，115'C滅菌20min, 室溫下冷卻至3(TC左右，分別加入0.016g酒藥3(TC、 140轉/分鐘振蕩培養50小時即為 江米酒，測得江米酒中蛋白含量為1080.0mg，凝乳活力為21.89U/mg。將各搖瓶中江米酒合併，在4'C， 3500轉/分鐘離心10min，取上清液。向其中緩慢 加入113.0g已烘乾並研細的硫酸銨粉末，4"C靜置2小時，離心(7000轉/分鐘、15min、 4°C)，取上清液，繼續加入167.5g己烘乾並研細的硫酸銨粉末，4'C靜置2小時，離心 (8000轉/分鐘、15min、 4 。C)，沉澱溶於0.005mol/L、 pH6.28的磷酸鹽緩衝液，4 。C透 析48小時，即為凝乳酶粗液，該粗液中蛋白含量為604.8mg，凝乳活力為142.5 U/mg。首先利用SephadexG-100凝膠柱層析對凝乳酶粗液進行純化，0.005M、 pH6.28的磷 酸鹽緩衝液作為洗脫液，分步收集，常規方法檢測收集液凝乳活性，合併有凝乳活性的洗 脫液，利用DEAE-Sephadex A-50進一步純化，以0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩衝液為起始 緩衝液，以含0.15mol/L、 0.25mol/L、 0.35 mol/L、 0.45 mol/L以及0.55 mol/L NaCl濃度 的緩衝液進行梯度洗脫，分步收集，檢測凝乳活性，合併有凝乳活性的洗脫液，濃縮凍幹 得到高純度的凝乳酶。純化後凍幹得到172.8mg凝乳酶，凝乳活力達4282.5U/mg，計算 得到蛋白回收率為16.00%。實施例2在10個250mL搖瓶中，分別加入5.0g江米麵、50mL7jC，搖勻，115'C滅菌20min， 室溫下冷卻至30'C左右，分別加入0.016g酒藥3(TC、 140轉/分鐘振蕩培養52小時即為 江米酒，測得江米酒中蛋白含量為1135.4mg,凝乳活力為23.66U/mg。將各搖瓶中江米酒合併，在4'C， 3500轉/分鐘離心10min，取上清液。向其中緩慢 加入113.0g己烘乾並研細的硫酸銨粉末，4'C靜置2小時，離心(7000轉/分鐘、15min、 4°C)，取上清液，繼續加入167.5g己烘乾並研細的硫酸銨粉末，4'C靜置2小時，離心 (8000轉/分鐘、15min、 4°C)，沉澱溶於0.005M、 pH6.28的磷酸鹽緩衝液，4'C透析48 小時，即為凝乳酶粗液，該粗液中蛋白含量為624.5mg，凝乳活力為167.8 U/mg。首先利用S印hadexG-100凝膠柱層析對凝乳酶粗液進行純化，0.005M、 pH6.28的磷酸鹽緩衝液作為洗脫液，分步收集，檢測收集液活性，合併有活性洗脫液，利用 DEAE-Sephadex A-50進一步純化，以0.02mol/L pH 7.4磷酸鹽緩衝液為起始緩衝液，採 用NaCl梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合併有活性洗脫液，濃縮凍幹得到高純度的凝 乳酶。純化後凍幹得到173.5mg凝乳酶，凝乳活力達4326.6U/mg，計算可知蛋白回收率 為15.28% 。
權利要求
1.一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備方法，其特徵在於該方法利用江米麵作為培養基，通過酒藥發酵生產江米酒，採用硫酸銨分級沉澱法從江米酒中提取凝乳酶，進一步使用Sephadex G-100和DEAE-Sephadex A-50純化凝乳酶，其具體步驟包括第一、江米酒的製備以10g/100mL的江米麵溶液、115℃滅菌20min，室溫下冷卻至30℃作為培養基，將酒藥按0.0032g酒藥/g江米麵的接種量，加入前述冷卻好的培養基中，140轉/分鐘振蕩培養50～54小時，得到江米酒；第二、離心將第一步得到的江米酒在4℃、3500轉/分鐘條件下離心10min，取上清液備用；第三、凝乳酶的提取將硫酸銨烘乾研細，取第二步得到的上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其飽和度達到40％，4℃靜置2小時後，以7000轉/分鐘離心15min，取上清液，繼續加入硫酸銨粉末至其飽和度達到90％，4℃靜置2小時，以8000轉/分鐘離心15min，沉澱溶於0.005mol/L、pH6.28的磷酸鹽緩衝液中，4℃透析48小時，即為凝乳酶粗液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於將上述第三步得到的凝乳酶粗液進行如 下純化首先利用Sephadex G-100凝膠柱層析純化凝乳酶粗液，以0.005 mol/L、 pH6.28的磷 酸鹽緩衝液作為洗脫液，分步收集，檢測收集液活性，合併有活性的洗脫液；利用DEAE-Sephadex A-50進一步純化，以0.02mol/L、 pH 7.4的磷酸鹽緩衝液為起 始緩衝液，採用NaCl梯度洗脫，分布收集，檢測活性，合併有活性洗脫液，濃縮凍幹得 到高純度的凝乳酶。
全文摘要
一種江米酒酒藥微生物源凝乳酶的製備方法。本發明利用江米麵作為培養基，通過酒藥發酵生產江米酒，採用硫酸銨分級沉澱法從江米酒中提取凝乳酶，進一步使用SephadexG-100和DEAE-Sephadex A-50純化，得到高純度的凝乳酶。以該方法產凝乳酶，原料來源廣泛、成本低廉、操作簡單、發酵周期短，所產凝乳酶活力高，純化後凝乳活力達4360±50U/mg，蛋白回收率為16.21±1.98％。
文檔編號C12N9/52GK101250513SQ200810052629
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月8日 優先權日2008年4月8日
發明者陽 張, 王豔萍, 程巧玲 申請人:天津科技大學