一種酸性β-甘露聚糖酶VMAN及其基因和應用的製作方法

2023-10-11 22:30:44

專利名稱：：一種酸性β-甘露聚糖酶VMAN及其基因和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種酸性β-甘露聚糖酶及其基因和應用。
背景技術：
：甘露聚糖是豆類、穀類中普遍存在的一種植物半纖維素，是由i3-l，4_D-甘露糖連接而成的線狀多聚體，具有高吸水性。飼料中所含的甘露聚糖在單胃動物的消化道內大量吸水，使食糜粘度增加，從而對胃腸的蠕動產生抵抗作用，直接影響了動物對營養物質的消化和吸收。近年來，隨著豆類產品(豆粕等)在飼料中的廣泛應用，甘露聚糖的抗營養問題也越來越受到重視，在飼料中添加酶製劑是解決這一問題的主要途徑。甘露聚糖的完全酶解需要β_甘露聚糖酶、β_甘露糖苷酶、β_葡糖苷酶、半乳糖苷酶和脫乙醯酶的協同作用，其中甘露聚糖酶在飼料中的應用比較廣泛。目前，一般選用大腸桿菌、釀酒酵母和畢赤酵母作為β-甘露聚糖酶基因的表達宿主。由於在大腸桿菌中表達產量較低，蛋白易形成包涵體，產業化生產困難。因此採用真核生物，如釀酒酵母和畢赤酵母等作為表達宿主成為當前的主要趨勢。如雙孢菇(TangCΜ,etal..Thecel4geneofAgaricusbisporuseneodesaβ-mannanase.ApplEnvironMicrobiol,2001,67(5):2298_2303.)、貽貝(XuBingze,SellosD,JansonJC.CloningandexpressioninPichiapastorisofabluemussel(Mytilusedulis)β-mannanasegene.EurJBiochem，2002，269:1753.)、芽孢桿菌(譚秀華等.耐鹼性甘露聚糖酶的克隆及其在畢赤酵母中的表達.微生物學報，2005，45(4)=543-544.)來源的甘露聚糖酶基因分別在畢赤酵母中得到成功表達，表達的酶活力分別為3.3U/ml、41.04U/ml、41.8U/ml。喬宇等將來自枯草芽抱桿菌的甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中表達，最高酶活可達1102IU/ml，表達量為lmg/mL(喬宇，陳小兵，丁宏標，嶽明.甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質研究[J].中國生物工程雜誌，2006，26(7):52-56)。目前，真菌來源的β_甘露聚HBS基13，只有棘包曲β(ChristgauS,etal..Expressioncloning,purificationandcharacterizationofabeta~l,4-mannanasefromAspergillusaculeatus.BioehemMolBiolInt.1994，33(5)917-925)和裡氏木酶(黃生平，汪昌麗，馬立新.一種新型巴斯德畢赤酵母表達載體的構建及甘露聚糖酶的表達.生物技術通訊，2007，18(2)=220-223.)的基因序列在釀酒酵母中得到了表達，但酶活較低。總體上來說，目前所報導的甘露聚糖重組酶酶活普遍較低，酶解產物組成不穩定，生產成本較高。因此篩選高比活酶基因，構建高效產酶微生物，進行基因改良，優化酶的性質，是當前亟待解決的問題。
發明內容本發明的目的是提供一種產β-甘露聚糖酶的菌株，Aspergillusniger，其保藏號為CGMCCNo.4235。本發明的再一目的是提供一種來源於上述菌株的酸性β「甘露聚糖酶。本發明的再一目的是提供上述酸性甘露聚糖酶的基因。本發明的再一目的是提供包含上述β「甘露聚糖酶基因的重組載體本發明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重組菌株。本發明的再一目的是提供一種高效表達β「甘露聚糖酶的方法。本發明的再一目的是提供上述甘露聚糖酶的應用。本發明從土壤環境中篩選到一種天然菌株，黑麴黴AN070902(AspergiIlusniger)，該菌株於2010年10月20日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號是CGMCCNo.4235。從上述菌株中分離得到一種酸性β-甘露聚糖酶VMAN，其胺基酸序列如SEQIDN0.1所示MKFSSSLLALDSLALANVSTTLTKTSPAPSTSSSAASTSFPSTSGLQFTIDGETGYFAGT60NSYffIGFLTDSADVDLVMGHLKSSGLKILRVffGFNDVTSQPSSGTVffYQLDQDGKSTINT120GADGLQRLDYVVSSTEQHDIKLIINFINYffTNYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSA180YQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWVEKASKFLKGLDADRMVCIG240DEGFGLNIDSDGSYPYKFSEGLNFTMNVGIHTIDFGTLHLYPDSffGTSDDWGNGffITAHG300ATCKAAGKPCLLEEYGVTSNHCSVEGSffQKTALSATRVGADLFffQYGDDLSTGKSPDDGN360TIYYGTSDYQCLVTDHVADIHSA383該酶基因編碼383個胺基酸，N端前16個胺基酸為信號肽序列，其理論pI/Mw為4.48/41555.72。經檢索表明，本發明獲得的甘露聚糖酶與已報導的來源於黑麴黴的甘露聚糖酶胺基酸序列同源性約94%(Cloning,expressioninPichiapastoris,andcharacterizationofathermostableGH5mannanendo—1,4_β—mannosidasefromAspergillusnigerBKO1)。本發明獲得的β_甘露聚糖酶最適溫度為65°C，最適pH值為3.0，因此本發明的甘露聚糖酶是一種酸性甘露聚糖酶。與已報導的黑麴黴的甘露聚糖酶相比具有更強的耐酸性。該酶在PH2.09.0的條件下酶活穩定，動物消化道全程的各種PH環境均不會顯著降低酶活，同時蛋白酶體外水解實驗表明本發明獲得的甘露聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。此外，該重組酶的熱穩定性較好，在70°C水浴中放置Ih酶活力仍能保持75%以上，在一定程度上能減少高溫制粒時引起的酶活喪失。因此該酶可廣泛應用於飼料添加劑中，有效降低動物胃腸道食糜的粘度，促進動物對飼料的利用率。本發明還提供了編碼上述β-甘露聚糖酶的基因VMAN，該基因的序列如SEQIDN0.2所示atgaagttctccagctccctcctcgccctggatagcctggcgctggccaacgtctccacg60actctgacgaaaacctcccctgcaccgagcaccagcagcagtgctgcctccacctccttc120cccagcacctccggcctccaattcaccattgatggcgaaactggctacttcgccggaacg180aacagctactggatcggtttcctcactgacagcgcggacgtcgacctcgtcatgggccac240ctgaagtcgtccggcctcaagatcctccgcgtgtggggcttcaacgatgtcacctcgcag300ccctcctccggcacagtctggtaccaactggaccaggacggcaaatcgacaatcaacacg360ggtgccgacggtctccagcgcctcgactacgtcgtctcgtctaccgaacaacacgacatc420aaactcatcatcaacttcatcaactactggaccaattacggtggtatgtctgcgtacgtg480agcgcgtatggcggttccggcgagacggatttctataccagtgataccatgcagagtgcc540tatcagacatatatcaagacggtcgtggagcggtacagtaactcctcggcggtgtttgcg600tgggagttggcgaatgagccgagatgtccgagttgcgatacttctgtgttgtataactgg660gttgagaaggcgagtaagtttcttaaggggttggatgcggatcgtatggtttgtattggt720gatgagggcttcggtctcaacatcgactcggacggcagctacccttataaattctccgag780ggcttgaactttacgatgaacgtcggtatccatactattgactttggtaccctccacttg840taccctgatagctggggcacctccgacgactggggcaacggctggatcaccgcccacggc900gcaacctgcaaagcggccggcaagccatgtctcctggaggaatacggagtcacctcgaac960cactgcagtgtggagggctcgtggcagaagacagcgctcagcgcaacgcgcgtcggcgcg1020gatctgttctggcagtatggtgatgatttgagtaccgggaagtcgccggatgatgggaat1080actatctactatgggactagtgattatcagtgcctggtgacggatcatgttgctgatatt1140catagcgcctaa1152本發明通過同源克隆的方法分離得到上述β-甘露聚糖酶基因VMAN，該基因全長1152bp，其中l-48bp為信號肽序列。本發明還提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因VMAN的重組載體，優選為pPICzaA-VMAN。將本發明的β_甘露聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將本發明的β-甘露聚糖酶基因插入到質粒pPICzalphaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位於AOXl啟動子的下遊並受其調控，得到重組酵母表達質粒pPICzαA-VMAN。本發明還提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因VMAN的重組菌株，優選重組菌株是畢赤酵母菌株Χ33。本發明還提供了一種高效表達上述β-甘露聚糖酶基因VMAN的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；2)重組菌株在發酵罐中進行發酵，誘導重組β-甘露聚糖的表達；以及3)發酵結束後，回收並純化所表達的β-甘露聚糖酶VMAN0其中，重組菌株在發酵罐中的發酵過程可分為3個階段第一階段為菌體培養階段，按10%比例接入種子，培養24-30小時，以補完葡萄糖為標誌；第二階段為飢餓階段，當葡萄糖補完之後，不流加任何碳源，當溶氧上升至80%以上即表明該階段結束，為期約30-60min；第三階段為誘導表達階段，流加誘導培養基，並且保持溶氧在20%以上，培養時間在180-200小時之間。發酵結束後，發酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理後獲得粗酶液。利用本發明的方法高效表達上述的重組甘露聚糖酶，可達到11785U/mL的發酵水平，同目前已有的現有技術相比，本法明的β-甘露聚糖酶通過高效表達後能夠達到更高的發酵水平。本發明是為了解決現有技術的不足，從土壤中篩選、分離得到一種酸性β_甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達，可達到比現有技術更高的表達水平。因此，本發明的甘露聚糖酶在工業生產中可大大降低生產成本，使其在飼料、食品、石油化工、釀酒等工業中顯示出更大應用潛力。圖1重組甘露聚糖酶在50L罐中的發酵過程曲線圖2重組菌株分泌表達甘露聚糖酶的SDS-PAGE圖譜，1純化後的重組甘露聚糖酶；2對照Χ33；M蛋白標準。圖3重組甘露聚I套酶的最適反應溫度圖4重組甘露聚I套酶的最適反應PH值圖5重組甘露聚I套酶的溫度耐受性圖6重組甘露聚I套酶的PH耐受性圖7重組甘露聚I套酶在胃蛋白酶，胰蛋白酶處理後剩餘酶活圖8金屬離子和EDTA對重組甘露聚糖酶酶活力的影響m曲志閱黴AN070902(Aspergillusniger)，該菌株於2010年10月20日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101)，其保藏編號是CGMCCNo.4235。具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實驗材料和試劑1、菌株與載體大腸桿菌菌株ToplO、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA購自Invitrogen公司，載體pMD18-T購自TaKaRa公司。2、酶與試劑盒逆轉錄酶SuperScriptTMIII、RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。質粒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR純化試劑盒購自上海生工公司。限制性內切酶購自Fermentas公司。3、培養基基本鹽培養基磷酸氫二銨5%、磷酸二氫鉀0.5%、七水硫酸鎂1.5%、硫酸鉀1.95%、硫酸鈣0.1%、氫氧化鉀0.1%、消泡劑0.03%。高壓後每升加4.35毫升PTMlPTMl(微量鹽溶液)硫酸銅0.6%、碘化鉀0.018%、一水硫酸錳0.3%、二水鉬酸鈉0.02%、硼酸0.002%、六水氯化鈷0.05%、氯化鋅2%、七水硫酸鐵6.5%、濃硫酸0.5%、生物素0.02%實施例1、產β-甘露聚糖酶菌株Aspergillusniger的分離、培養從魔芋根附近的天然土壤中分離得到一株具有甘露聚糖酶活性的黴菌，後經鑑定為黑麴黴Aspergillusniger(保藏編號CGMCCNo.4235)實施例2、黑麴黴Aspergillusnigerβ-甘露聚糖酶基因VMAN的克隆運用RNA提取試劑盒，提取黑麴黴Aspergillusniger總RNA，按照逆轉錄酶superscriptIIIReverseTranscriptase操作說明合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，設計甘露聚糖酶引物(VMAN5EcoRI，VMAN3NotI)進行PCR擴增，將PCR產物由EcoRI和NotI進行雙酶切，然後與經過同樣酶切的畢赤酵母表達載體pPICzalphaA相連接，連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，經抗生素Zeocin篩選後，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質粒。送樣到上海英駿生物公司測序，測序結果表明，獲得克隆DNA插入片段含有β-甘露聚糖酶基因完整的開放閱讀框。該β-甘露聚糖酶基因VMAN，全長1152bp，編碼383個胺基酸。得到的重組表達載體命名為PPICzαA-VMAN。VMAN5EcoRI5』CTGAAGCTGAATTCAAGTTCTCCAGCTCCCTCCTCACC3'VMAN3NotI5，AAAGCTGGCGGCCGCTTAGGCGCTATGAATATCAGCAACATG3，實施例3、包含β-甘露聚糖酶基因VMAN的畢赤酵母工程菌的構建將上述重組表達載體pPICzαA-VMAN用SacI進行線性化，線性化後的重組載體電擊轉化畢赤酵母Χ33，得到畢赤酵母重組菌株X33/VMAN。實施例4、β-甘露聚糖酶重組菌株的高效表達將上述重組菌X33/VMAN單菌落進行高密度發酵培養。配製20L基本鹽培養基，在50L自動控制發酵罐中滅菌後，冷卻至常溫備用。用氨水和磷酸調節發酵液的ρΗ值至4.8，通過調節轉速和空氣流量控制溶氧大於30%，發酵溫度為30°C。整個發酵過程分3個階段第一階段為菌體培養階段，將重組菌X33-VMAN-pPIC按照10%的接種量接種至發酵罐中，流加已滅菌的4L50%的葡萄糖，培養24-30小時，以補完葡萄糖為標誌；第二階段為飢餓階段，當葡萄糖補完之後，不流加任何碳源，當溶氧上升至80%以上即表明該階段結束，為期約30-60min；第三階段為誘導表達階段，流加誘導培養基，並且保持溶氧在20%以上，培養時間在180-200小時之間。發酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理後獲得酶液。在發酵過程中的不同時間點取樣測定酶活，發酵過程中甘露聚糖酶的表達情況如圖1所示，誘導培養192h的發酵液酶活為11785U/mL。實施例5、重組β-甘露聚糖酶的活性分析採用DNS法測定水解產生的還原糖。1個酶活單位(U)定義為在55°C、ρΗ5.0的條件下，每分鐘分解槐豆膠中的β「甘露聚糖產生具有還原能力相當於1μmol甘露糖所需的酶量。實驗設三次重複，每個樣品測定均設三個平行實驗，相對誤差控制在8%以內。實施例6、重組β-甘露聚糖酶VMAN的性質測定1、β-甘露聚糖酶VMAN的分子量大小和比活將上述發酵液中的β-甘露聚糖酶通過離子交換柱(QSepharoseFastFlowIonExchanger)純化，採用改良型Bradford試劑盒(上海Sangon公司)測定蛋白濃度，得出該甘露聚糖酶比活為2153U/mg，將純化後的蛋白液進行12%SDS-PAGE檢測(見圖2)。2、β-甘露聚糖酶VMAN的最適反應溫度及ρΗ測定最適反應溫度將酶液稀釋適當倍數，在不同溫度(2580°C)下反應，測定β_甘露聚糖酶的酶活。以在55°C的酶活力為基礎，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對酶活。最適反應ρΗ:將稀釋後的酶液，與不同ρΗ(2.O7.5)的0.4M磷酸鈉_醋酸鈉_硼酸鈉緩衝液配製的槐豆膠底物反應，分別測定相對於PH5.O的相對酶活。結果如圖3和圖4所示該重組β-甘露聚糖酶的最適反應溫度為65°C，最適反應ρΗ為3.O。3、β-甘露聚糖酶VMAN的溫度及ρΗ穩定性的測定溫度穩定性將酶液稀釋適當倍數，在不同溫度(6580°C)下處理酶液5、10、20、30、40、60min後，以未處理的酶活力為對照測定β-甘露聚糖酶的相對酶活。ρΗ穩定性將稀釋後的酶液與不同PH的緩衝液混合，室溫放置2h，以未處理的酶液為對照，測定β-甘露聚糖酶的相對酶活。結果如圖5和圖6所示該重組酶在低於70°C下穩定性較好，在70°C水浴中放置Ih酶活仍能保持75%以上，但在75°C和80°C放置IOmin後，酶活分別僅剩47%和10%；該酶的ρΗ穩定範圍較廣，在pH2.O9.O的環境下室溫保持2h，酶活未見顯著下降。4、β-甘露聚糖酶VMAN對胃蛋白酶、胰蛋白酶消化耐受性測定取0.ImL甘露聚糖酶液，分別加入0.5mL0.lmg/mL胃蛋白酶(pH2.0濃度80U/mL)和0.5mL0.lmg/mL胰蛋白酶(ρΗ7·0濃度150U/mL)，於37°C處理2h後測酶活。結果如圖7所示，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2h後，甘露聚糖酶酶活分別維持在80%和65%左右，具有較好的抗胃蛋白酶和抗胰蛋白酶活性。5、金屬離子和EDTA對酶活力的影響將含有ImMK+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Cu2+和EDTA的溶液與稀釋適當倍數的酶液混合，室溫放置30min，以未處理的酶液為對照，測定β-甘露聚糖酶的相對酶活。結果如圖8所示，在供試的9種金屬離子中，ImM的Fe3+和Mn2+對該酶的活性有顯著抑制作用，而ImMCo2+對該酶有激活作用，其餘ImM的金屬離子和EDTA對該酶酶活影響不顯著。權利要求1.一種產β-甘露聚糖酶的黑麴黴Aspergillusniger，其保藏號為=CGMCCNo.423502.—種酸性β-甘露聚糖酶VMAN，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一種酸性β-甘露聚糖酶基因VMAN，其特徵在於，編碼權利要求1所述的β-甘露聚糖酶。4.如權利要求3所述的酸性β-甘露聚糖酶基因VMAN，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO.2所示。5.包含權利要求3或4所述的β-甘露聚糖酶基因的重組載體。6.根據權利要求5所述的重組載體，其特徵在於，所述重組載體為pPICzαA-VMAN。7.包含權利要求3或4所述甘露聚糖酶基因的重組菌株。8.一種高效表達甘露聚糖酶VMAN的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)用權利要求6所述的重組載體轉化畢赤酵母細胞，得重組菌株；2)重組菌株在發酵罐中進行發酵，誘導重組甘露聚糖酶的表達；以及3)發酵結束後，回收並純化所表達的甘露聚糖酶VMAN。9.權利要求2所述的β-甘露聚糖酶VMAN在飼料添加劑、食品、石油化工、釀酒工業中的應用。全文摘要本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明提供一種來源於Aspergillusniger保藏編號是CGMCCNo.4235的β-甘露聚糖酶，其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發明提供了編碼上述β-甘露聚糖酶的基因，其序列如SEQIDNO.2所示。該甘露聚糖酶的最適溫度為75℃，最適pH值為3.0，是一種酸性的β-甘露聚糖酶，因此，在動物腸胃的酸性環境中能夠更有效的降低甘露聚糖的抗營養作用，促進動物對飼料的利用率。本發明還提供了該甘露聚糖酶基因高效表達的方法，其表達量可達到11785U/mL，同現有技術相比其表達量更高，因此，可大大降低工業生產成本，使其在飼料、食品、石油化工、釀酒等工業中顯示出更大的應用潛力。文檔編號C12N15/63GK102002465SQ201010566249公開日2011年4月6日申請日期2010年11月24日優先權日2010年11月5日發明者吳迪,張娟,汪雲飛,羅長財,謝建華,陳麗芝申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司