一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑及其製備方法
2023-10-11 22:24:39 4
一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑及其製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑及其製備方法，取豬腦，去雜，加純化水勻漿；勻漿液先後經胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；清液調節pH至1.7～3，加熱至100～110℃，保溫15～45min，然後調pH至8.0～9.0；8～10kd膜超濾，收集濾液；濾液上柱層析，洗脫液調pH至8.0～9.0，陰離子交換膜濃縮，0.2μm膜過濾得原液；原液凍結，然後解凍，加賦形劑，調pH至6.9～7.5，8～10kd膜超濾，0.2μm膜過濾；灌裝，凍幹。所得凍乾粉針劑中多肽與對照品相似≥0.90，含有16種胺基酸，總胺基酸的氮量佔總氮含量比例≥85％，無需額外補充添加胺基酸，完全依靠豬腦水解製得，穩定安全。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物製劑領域，尤其涉及一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑及其製備方 法。 一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑及其製備方法
【背景技術】
[0002] 腦蛋白水解物產品是由原材料經檢驗、檢疫合格，提取，精製，滅菌等生產工藝制 備得到；腦蛋白水解物的主要成分是低分子肽和游離胺基酸。易通過血腦屏障進入腦神經 細胞，低分子肽具有與天然存在的神經營養因子相同的作用，能誘導神經元分化、維持正常 神經細胞的功能、增加神經遞質的產生和突觸傳遞，保護神經細胞免受各種損害，調節人體 腦代謝、神經傳遞及神經生長；能提高葡萄糖分解酶活性，增加腦對葡萄糖的無氧能量代 謝，降低腦內乳酸的濃度，在缺血缺氧時對神經細胞的線粒體有保護作用。
[0003] 腦蛋白水解物注射液上世紀由奧地利EBEWE藥廠進口註冊，到2010年底，已有公 開的涉及腦蛋白水解物製劑及工藝的專利申請29件。
[0004] 例如中國發明專利文獻CN01130523. 1公開了一種腦蛋白水解物注射液生產工 藝：新鮮豬腦去除表面的黏膜及血漬等，勻漿，雙層紗布過濾，胃蛋白酶水解，加胰酶水解， 加鹽酸調pH值2. 5?3.0, -20?10°C下靜置10?30小時；室溫，雙層紗布過濾，加水， 調pH值到中性，微孔濾膜過濾澄清，超濾膜超濾，超濾膜進行濃縮，濃縮液加熱沸騰15分 鍾，然後迅速冷卻，再微孔濾膜和超濾膜，得到的超濾液，再經121°C蒸汽滅菌；根據所需藥 液量，按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的藥品標準（編號WS1-XG-25-2000) 計算需要添加的胺基酸用量，與上述溶液配製成濃配液，然後稀配裝針成成品藥液，滅菌成 無菌製劑。又如CN1857711A公開了一種腦蛋白水解物及其凍幹製劑的生產方法：將豬腦勻 漿，胃蛋白酶、胰酶水解，上羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化，調配肽圖，收集目標物， 採用對分子截留為8KD的濾膜進行超濾，進行定氮、胺基酸分析，添加相應胺基酸配製成濃 配液，濾膜過濾，即得。現有的製備工藝在生產製劑時需要額外添加相應胺基酸才能製得符 合標準的腦蛋白水解物，而根據國家食品藥品監督管理局2008年734號關文件要求，腦蛋 白水解物不得添加外源性胺基酸。因而我們需要進行不添加外源性胺基酸的腦蛋白水解物 的製備方法的研究。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於克服現有腦蛋白水解物製備技術中需要額外添加相應胺基酸 的缺陷，提供一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑及其製備方法，採用該製備方法製備的腦蛋白 水解物凍乾粉針劑中小分子肽反相肽圖色譜鑑別與對照品相似度> 〇. 90,無需補充添加外 源性胺基酸，完全依靠豬腦水解製得。
[0006] 本發明的第一個方面是提供一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑，所述腦蛋白水解物凍 乾粉針劑中小分子多肽與中檢所腦蛋白水解物140697?200602中的小分子多肽的相似度 > 90% ;所述腦蛋白水解物凍乾粉針劑含有16種游離胺基酸：門冬氨酸、穀氨酸、絲氨酸、 組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮 氨酸、賴氨酸、脯氨酸；所述腦蛋白水解物凍乾粉針劑中總的胺基酸的氮含量佔所述腦蛋白 水解物凍乾粉針劑的總氮量的85%以上。
[0007] 優選地，所述腦蛋白水解物凍乾粉針劑採用下述步驟製備而成：
[0008] 1)取檢驗合格豬腦，去雜（去除血管、脂肪等雜質），加純化水勻漿；
[0009] 2)將步驟1)得到的勻漿液先後經胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
[0010] 3)將步驟2)得到的清液調節pH至1. 7?3,加熱至100?110°C，保溫15? 45min (優選為20?40min，更優選為25?35min)，然後調節pH至8. 0?9. 0 ;
[0011] 4)冷處理，取清液，8?10kd膜超濾，收集濾液；
[0012] 5)將步驟4)得到的濾液上柱層析，用純化水衝洗柱，解析，收集洗脫液，調節pH至 8. 0?9. 0,陰離子交換膜濃縮，0. 2 μ m膜過濾得原液；
[0013] 6)將步驟5得到的原液凍結，然後解凍，加入賦形劑，控制賦形劑的含量為4? 8wt%，調節pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超濾，0· 2 μ m膜過濾；
[0014] 步驟7)灌裝，設置凍幹曲線，凍幹，壓塞，軋蓋，既得。
[0015] 其中，步驟4)中所述冷處理，是指將液體冷卻到10°C以下。
[0016] 優選地，步驟7)中所述凍幹曲線為：將溫度降至_38°C以下，維持3?5小時；開 啟冷凝器，當冷凝器溫度降至-50°C以下開啟抽真空，當真空度低於10Pa，升溫，但控制溫 度低於〇°C，維持4?10小時；再次升溫至10°C?45°C，維持4小時以上。
[0017] 優選地，在步驟1)之後，進行步驟2)之前，將勻漿液加熱使蛋白質變性。
[0018] 進一步優選地，使蛋白質變性具體可採用下述步驟：將勻漿液與75?85°C下保溫 15 ?30min〇
[0019] 優選地，步驟6)中所述的賦形劑為甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、 乳糖或葡萄糖。
[0020] 優選地，步驟5)中上柱層析所使用的層析填料為Amberlite IRA-200。
[0021] 優選地，步驟5)中所述陰離子交換膜採用美國進口膜DUS-8040C離子膜（孔徑 0· 001 μ m)。
[0022] 優選地，步驟2)具體為：調節pH至1.7?3.0,加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解 於35?45°C下進行，保溫3?5h，然後調節pH至7. 2?7. 8,加入胰酶水解，胰酶水解於 35?45 °C下進行，保溫2?4h，滅活酶，終止水解，收集清液。
[0023] 其中，步驟2)中收集清液可以通過過濾、離心等本領域已知的方式實現。
[0024] 本發明的第二個方面是提供一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑的製備方法，包括以下 步驟：
[0025] 步驟1，取檢驗合格豬腦，去雜（去除血管、脂肪等雜質），加純化水勻漿；
[0026] 步驟2,將步驟1得到的勻漿液先後經胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液；
[0027] 步驟3,將步驟2得到的清液調節pH至1. 7?3,加熱至100?110°C，保溫15? 45min (優選為20?40min，更優選為25?35min)，然後調節pH至8. 0?9. 0 ;
[0028] 步驟4,冷處理，取清液，8?10kd膜超濾，收集濾液；
[0029] 步驟5,將步驟4得到的濾液上柱層析，用純化水衝洗柱，解析，收集洗脫液，調節 pH至8. 0?9. 0,陰離子交換膜濃縮，0. 2 μ m膜過濾得原液；
[0030] 步驟6,將步驟5得到的原液凍結，然後解凍，加入賦形劑，控制賦形劑的含量為 4?8wt%，調節pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超濾，0· 2 μ m膜過濾；
[0031] 步驟7灌裝，設置凍幹曲線，凍幹，壓塞，軋蓋，既得。
[0032] 其中，步驟4中所述冷處理，是指將液體冷卻到10°C以下。
[0033] 優選地，步驟7中所述凍幹曲線為：將溫度降至_38°C以下，維持3?5小時；開啟 冷凝器，當冷凝器溫度降至-50°C以下開啟抽真空，當真空度低於10Pa，升溫，但控制溫度 低於〇°C，維持4?10小時；再次升溫至10°C?45°C，維持4小時以上。
[0034] 優選地，在步驟1之後，進行步驟2之前，將勻漿液加熱使蛋白質變性。
[0035] 進一步優選地，使蛋白質變性具體可採用下述步驟：將勻漿液於75?85°C下保溫 15 ?30min〇
[0036] 優選地，所述製備方法還包括步驟7 :灌裝，100?120°C滅菌,檢漏。
[0037] 優選地，步驟6中所述的賦形劑為甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、 乳糖或葡萄糖。
[0038] 優選地，步驟5中上柱層析所使用的層析填料為Amberlite IRA-200。
[0039] 優選地，步驟5中所述陰離子交換膜採用美國進口膜DUS-8040C離子膜。
[0040] 優選地，步驟2具體為：調節pH至1.7?3.0,加入胃蛋白酶水解，胃蛋白酶水解 於35?45°C下進行，保溫3?5h，然後調節pH至7. 2?7. 8,加入胰酶水解，胰酶水解於 35?45 °C下進行，保溫2?4h，滅活酶，終止水解，收集清液。
[0041] 其中，步驟2中收集清液可以通過過濾、離心等本領域已知的方式實現。與現有技 術相比，本發明製備工藝具有如下優點：
[0042] 1、本發明在胃蛋白酶、胰酶水解成多肽與游離胺基酸的清液後，調pH至1.7? 3. 0,100?110°C加熱30分鐘，可防止水解液中游離胺基酸再次結合成肽鍵，形成短肽，同 時可以滅活人畜共患病毒，比現有專利更合理，防止多肽與游離胺基酸可逆結合和滅活人 畜共患病毒在雙酶水解後進行，屬於末端控制，無其它生物材料加入，更安全；
[0043] 2、採用Amberlite IRA-200交換填料可大大改善現有陰離子交換不能吸附全部氨 基酸的問題；
[0044] 3、採用陰離子交換膜，在pH8. 0?9. 0溶液中，胺基酸帶負電荷，與膜表面電荷相 互排斥，游離胺基酸和多肽被截留；陽離子交換膜優選美國進口膜DUS-8040C離子膜，孔徑 為0. OOlum，孔徑50d分子量，游離胺基酸可進一步被截留；
[0045] 4、本發明工藝中採用了 2次超濾，2次過濾，最大限度降低大分子致敏物質、保證 了最終不可滅菌SAL無菌保證值；
[0046] 5、本發明工藝中採用超濾後凍結，超濾去除大分子後凍結可減少胺基酸析出，凍 結後解凍可以進一步去除少量雜質；
[0047] 6、本發明提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑中小分子肽反相肽圖色譜鑑別與腦蛋 白水解物140697?200602的相似度> 0. 90 ;含有16種胺基酸，總胺基酸的氮量佔總氮含 量比例> 85%，含有門冬氨酸、穀氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈 氨酸、蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸等16種胺基酸。
[0048] 本發明工藝簡單，製得的腦蛋白水解物凍乾粉針劑中小分子多肽與16種游離氨 基酸含量恆定，所得腦蛋白水解物凍乾粉針劑中多肽與對照品相似> 〇. 90,含有16種氨基 酸，總胺基酸的氮量佔總氮含量比例>85%，無需額外補充添加胺基酸，完全依靠豬腦水解 製得，藥效穩定，更安全；凍乾粉針劑中水分含量小於3%，製劑穩定，物質不易改變，保存 期質量更穩定，降低不良反應發生率，提高用藥安全。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049] 圖1為本發明實施例1製備工藝中的凍幹曲線圖；
[0050] 圖2為本發明實施例1提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑與中檢所腦蛋白水解物 140697?200602的對比指紋圖譜；
[0051] 圖3為本發明實施例1提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑的指紋圖譜；
[0052] 圖4為中檢所腦蛋白水解物140697?200602的指紋圖譜；
[0053] 圖5為本發明實施例1提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑與中檢所腦蛋白水解物 140697?200602的重疊指紋圖譜；
[0054] 圖6為中檢所腦蛋白水解物140697?200602的16種胺基酸的高效液相圖譜；
[0055] 圖7為本發明實施例1提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑的游離胺基酸的高效液相 圖譜；
[0056] 圖8為本發明實施例1提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑的總胺基酸的高效液相圖 譜；
[0057] 圖9為本發明實施例2製備工藝中的凍幹曲線圖；
[0058] 圖10為本發明實施例2提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑與中檢所腦蛋白水解物 140697?200602的對比指紋圖譜；
[0059] 圖11為本發明實施例2提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑的指紋圖譜；
[0060] 圖12為本發明實施例2提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑與中檢所腦蛋白水解物 140697?200602的重疊指紋圖譜；
[0061] 圖13為本發明實施例2提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑的游離胺基酸的高效液 相圖譜；
[0062] 圖14為本發明實施例2提供的腦蛋白水解物凍乾粉針劑的總胺基酸的高效液相 圖譜。
【具體實施方式】
[0063] 下面參照附圖，結合具體的實施方式對本發明做進一步的描述，以更好地理解本 發明。
[0064] 實施例1
[0065] 腦組織（檢疫合格）去除血管、脂肪等等雜質後取100kg，加1. 5倍體積純化水勻 漿，於80°C保溫25分鐘，冷卻，鹽酸調pHl. 7,胃蛋白酶水解，42°C保溫3小時，氫氧化鈉調 PH7. 6,胰酶水解，42°C保溫2小時，離心收集清液；鹽酸調pH2,105°C下保溫30分鐘，氫氧 化鈉調PH8. 5 ;冷處理，抽取上清，10kd膜超濾去除大分子，收集濾液150L ;上柱層析，用純 化水衝洗柱，解析，收集洗脫液，調節pH至8. 0?9. 0,用DUS-8040C離子膜濃縮50L，0. 2 μ m 膜除菌過濾，得原液，-15°C以下凍結保存；原液解凍，加入賦形劑5 %，調節pH6. 9?7. 5， 8?10kd膜超濾，0.2μπι膜除菌過濾，灌裝；設置凍幹曲線（參照圖1 :灌裝製品溫度達 至卜40°C以下時，繼續降溫3小時，且冷凝器的溫度達到-50°C以下時，抽真空，當真空系統 的真空度低於l〇Pa時，一次乾燥溫度設定為0°C以下乾燥，維持5小時；二次乾燥溫度設定 為10°C?45°C，到達溫度恆溫乾燥4小時以上），凍幹，真空壓塞，乳蓋，每支為含總氮30mg 的規格。
[0066] 相似度測定：
[0067] 對照品為中檢所腦蛋白水解物140697?200602。以十八烷基矽烷鍵合矽膠為 填充劑（250mm X 4mm，粒徑5μπι);以0.1 %三氟醋酸溶液為流動相A ;以0.085 %三氟醋酸 乙腈溶液一0. 1 %三氟醋酸溶液（80:20)為流動相B，按表1進行梯度洗脫；流速為每分鐘 0.8ml ;檢測波長為276nm。柱溫40°C;按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統計算，結果如圖 2?5和表2所不。
[0068] 表1相似度測定中的梯度洗脫表
[0069]
【權利要求】
1. 一種腦蛋白水解物凍乾粉針劑，其特徵在於，所述腦蛋白水解物凍乾粉針劑中小分 子多肽與中檢所腦蛋白水解物140697?200602中的小分子多肽的相似度> 90% ;所述腦 蛋白水解物凍乾粉針劑含有16種游離胺基酸：門冬氨酸、穀氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、 蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯 氨酸；所述腦蛋白水解物凍乾粉針劑中總的胺基酸的氮含量佔所述腦蛋白水解物凍乾粉針 劑的總氮量的85%以上。
2. 所述腦蛋白水解物凍乾粉針劑採用下述步驟製備而成： 1) 取檢驗合格豬腦，去雜，加純化水勻漿； 2) 將步驟1)得到的勻漿液先後經胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液； 3) 將步驟2)得到的清液調節pH至1. 7?3,加熱至100?110°C，保溫15?45min， 然後調節pH至8. 0?9. 0 ; 4) 冷處理，取上清液，8?10kd膜超濾，收集濾液； 5) 將步驟4)得到的濾液上柱層析，用純化水衝洗柱，解析，收集洗脫液，調節pH至 8. 0?9. 0,陰離子交換膜濃縮，0. 2 μ m膜過濾得原液； 6) 將步驟5得到的原液凍結，然後解凍，加入賦形劑，控制賦形劑的含量為4?8wt %， 調節pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超濾，0· 2 μ m膜過濾； 步驟7)灌裝，設置凍幹曲線，凍幹，壓塞，乳蓋，既得。
3. 根據權利要求2所述的腦蛋白水解物凍乾粉針劑，步驟7)中所述凍幹曲線為：將溫 度降至-38°C以下，維持3?5小時；開啟冷凝器，當冷凝器溫度降至-50°C以下開啟抽真 空，當真空度低於l〇Pa，升溫，但控制溫度低於0°C，維持4?10小時；再次升溫至10°C? 45°C，維持4小時以上。
4. 根據權利要求2所述的腦蛋白水解物凍乾粉針劑，其特徵在於，在步驟1)之後，進行 步驟2)之前，將勻漿液加熱使蛋白質變性。
5. 根據權利要求2所述的腦蛋白水解物凍乾粉針劑，其特徵在於，步驟6)中所述的賦 形劑為甘露醇、聚乙二醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖或葡萄糖。
6. 根據權利要求1所述的腦蛋白水解物凍乾粉針劑，其特徵在於，步驟5)中上柱層析 所使用的層析填料為Amberlite IRA-200,所述陰離子交換膜採用美國進口膜DUS-8040C 離子膜。
7. -種腦蛋白水解物凍乾粉針劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： 步驟1，取檢驗合格豬腦，去雜，加純化水勻漿； 步驟2,將步驟1得到的勻漿液先後經胃蛋白酶、胰酶水解，收集清液； 步驟3,將步驟2得到的清液調節pH至1. 7?3,加熱至100?110°C，保溫15?45min， 然後調節pH至8. 0?9. 0 ; 步驟4,冷處理，取上清液，8?10kd膜超濾，收集濾液； 步驟5,將步驟4得到的濾液上柱層析，用純化水衝洗柱，解析，收集洗脫液，調節pH至 8. 0?9. 0,陰離子交換膜濃縮，0. 2 μ m膜過濾得原液； 步驟6,將步驟5得到的原液凍結，然後解凍，加入賦形劑，控制賦形劑的含量為4? 8wt%，調節pH至6. 9?7. 5,8?10kd膜超濾，0· 2 μ m膜過濾； 步驟7灌裝，設置凍幹曲線，凍幹，壓塞，乳蓋，既得。
8. 根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，步驟7中所述凍幹曲線為：將溫度降 至-38°C以下，維持3?5小時；開啟冷凝器，當冷凝器溫度降至-50°C以下開啟抽真空，當 真空度低於l〇Pa，升溫，但控制溫度低於0°C，維持4?10小時；再次升溫至10°C?45°C， 維持4小時以上。
9. 根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，在步驟1之後，進行步驟2之前，將勻 漿液加熱使蛋白質變性。
10. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，步驟6中所述的賦形劑為甘露醇、聚 乙二醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖或葡萄糖；步驟5中上柱層析所使用的層析填料為 Amberlite IRA-200,陰離子交換膜採用美國進口膜DUS-8040C離子膜。
【文檔編號】A61K38/01GK104096214SQ201410255066
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】張莉, 李捍雄 申請人:廣州一品紅製藥有限公司