在生物液體中滅活微生物的方法、流通式反應器以及控制光輻照總劑量從而有效滅活間...的製作方法

2023-10-12 00:13:14 2

專利名稱：在生物液體中滅活微生物的方法、流通式反應器以及控制光輻照總劑量從而有效滅活間 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種確定從一個或者多個光源發出的單色光或者多色光滅活在存在於生物體液特別是非透明體液中微生物的有效劑量的方法。本發明還提供了一種滅活存在於流通式反應器中生物液體所含微生物的方法。而且，本發明有利地提供了一種具備一個或者多個熱穩定光源的流通式反應器。本發明還進一步提供了一個控制從單個或多個光源發出的單色或者多色光的光輻照總劑量(light sum dose)從而有效滅活間歇反應器中微生物的方法。
背景技術：
在諸如營養學、化妝品，醫學診斷或者治療中，通過輻射處理生物液體是一種得到廣泛研究的滅活微生物的方法。眼下正在研究的輻射方法例子包括短波紫外光、長波紫外光或者具有光敏化合物的可見光，以及光譜寬的高強閃光。
例如，沙門氏細菌屬(Salmonella spp.)、單核細胞增生症李斯德氏菌屬(Listeriamonocytogenes)，真菌或者腸道出血性大腸桿菌屬O157:H7等汙染食物的細菌，可以很容易就汙染牛奶，果汁，發酵飲料和其他由此製作而來的其他飲料等液體。另外一個微生物汙染的例子是，存在於生物液體(如血液及其衍生製品，細胞培養液上清或裂解液)中的原蟲、細菌以及病毒，一方面可以從這些液體中提取藥物，但同時也存在由此而將這些微生物傳播到使用這些藥品的病人體內的風險。
為了在一個小型實驗室的規模上來滅活這些微生物，人們開發出了間歇式光滅活反應器(batch photoinactivation reactors)。這類間歇式光滅活反應器通常主要由一個被一系列燈光環繞的空腔組成，將待處理樣品裝在一個透光的容器內的空腔中，並曝光一定的時間；同時，也可以通過攪拌以保證樣品得到均一的光照。位於美國康乃狄克州Branford的南新英格蘭紫外線公司(Southern England Ultraviolet Company)製造的柱狀「Rayonet」和「Rayonette」反應器，以及位於加拿大安大略省渥太華的路茲化學研究公司(Luzchem Research Inc.)生產的光室型光滅活反應器，就是這類光滅活反應器的典型例子。
為了確保大容積的待處理液體完全有效地暴露於光場中以防止汙染，人們設計了多種流通式反應器。這些反應器中，有的設計成將液體平鋪成一層薄膜或薄層以最大限度減少由於自吸收而造成的光強度的損失；有的在縱向流動的液體中加上一個橫向的混合裝置，使得所有的液體組分都能夠到達能被光線照射到的淺表外液體層，從而確保所有的液體得到均勻的光照。
Caillet-Fauquet等在2004年描述了一類流通式UV-C(紫外光C)照射來滅活細菌和病毒方法，利用腦脊髓炎病毒摻合的樣品作為生物劑量測定或者內部感光測定樣品，關於這一點，沒有更多的細節見諸報導。
過去，以上提到的流通式照射裝置一般是這樣設計的一根傾斜的管圍繞著管形光源旋轉，將內壁上的液體分布到一層自由流動的薄膜上(Habel Sockrider 1947)，一個平的透明小室將液體流擠壓成一個薄層；或者一個透明的螺旋狀管纏繞在管形光源(Oppenheimer等，1959)。在一個直徑超過光照穿透深度的流通式裝置中，橫向的混合可以通過一個圈中一種被稱為迪恩渦流(Dean vortices)的二次渦流來實現，或者通過一個靜止的位於管中的折流板來實現，或者也可以依靠位於兩個逆流柱之間的立體環形泰勒渦漩(toroidal Taylorvortices)，液體在此之間的環狀間隙流過。
如果光照的穿透有限，那麼可以將液體分布於一層薄膜上經過光源，正如美國專利5,567,616和6,540,967描述的那樣。在位於深度大於光照穿透深度的液體層中，橫向混合原則上可以主動或者被動地產生。
一個廣為人知的主動混合的原則就是，在同心逆流旋轉柱的表面，誘導泰勒渦旋的產生。這些泰勒渦旋被疊加在縱向流上，造成稱之為Taylor-Gortler的渦流。美國專利6,576,201介紹了一類柱狀的UV-C透明流通式小室，它帶有靜止的透明外壁和旋轉內柱。位於此間的液體層，被水泵驅動通過該流通式小室的液體依靠逆流泰勒渦流(counter-current TaylorVortices)而混合。一個連續性光波或者脈衝雷射—紫外光源用來作為輻射發生裝置。
另外一種用於主動混合的裝置就是基於阿基米德螺旋槳(Archimedean screw)的流通式反應器，泵出的液體依靠旋轉的螺旋槳在流線圈得到混合(Della Contrada 2004)。
被動式混合既可以通過亂流產生，也可以通過障礙物繞流(如位於液體流經通路上的靜止的混合擋板)來實現。早期的滅活反應器大多設計為，液體流經位於管形輻照燈(或者其包被管envelope tube)外壁和同心輻照反應器內壁之間的角形間隙。這類的薄層輻射發生器可以從位於奧地利Seewalchen的Wedeco-Visa GmbH公司購得。
另外一類被動橫向混合的有效技術就是，在弧形管中(尤其是在螺旋盤繞的管中)引發一種被稱為Dean Vortices的二次渦流。例如，Bayha等在1952年介紹了一個用於消毒牛奶等高吸收液體的盤管狀反應器(coil reactor)，在這一裝置中，一個石英玻璃盤管縱向包繞在多重低壓汞燈周圍；Hiatt等在1960年也介紹了一種通過光敏化滅活存在疫苗或其他生物液體中的病毒的類似的盤管反應器，在Hiatt的裝置中，反應器由硼矽玻璃做成，盤管是包繞在白熾燈絲上的。盤管在透光性水夾套中被冷卻。在過去，儘管硼矽玻璃和石英玻璃的特殊工藝以及他們的易碎的特性限制了它們的應用，但紫外半透性、抗紫外以及化學惰性氟多聚體的易得減少了設計和規模化使用這類流通式反應器的難度。盤管纏繞在一個同心的管狀光源(通常是一個低壓汞燈)上，同時依靠加在流體上的一種被稱為Dean vortices的二次渦流而實現橫向混合。美國專利申請2003/0049809A1就介紹了這樣一類的螺旋狀包繞反應器(helicalenvelope-reactor)。2004年，Wang等報導，通過草酸鐵絡合物感光測定法測得的燈強度、吸收值以及滯留時間，可以計算出泵過反應器的液體所接收到的光照劑量滯留。
過去，有不少人試圖進行精確確定在輻射過程中有效光能的嘗試。光能既可以依靠光敏性電子傳感器、或者也可以依靠光子激發的光化學反應來計算，或者光能也可以依靠測定生物液體中含有的或者是人為添加的的微生物被滅活的效率來計算。其他理論方法還包括數學模擬，如簡單地將一個體積元的滯留時間乘以強度來計算光照劑量；也可以通過一種更為精細的計算方法，如通過流體模擬來球算出滯留時間和劑量。
化學感光測定法也可以測量光照對於光化學反應性混和物的影響(Kuhn等，1989；Favaro等，1998)。總的來說，對於已知光量子產率和溫度依賴性的已建立的光化測定法，其測定的穩定性和可重複性都較電子裝置要好。光化學反應產物最好能便利地在線測量，如依靠光電分光法或者化學傳感器(Gauglitz 1983)。
另外一種更常選用的方法中，利用了在測量波長下測量感光測定溶液的阻光度，光化學反應僅僅在表面發生(Kuhn等，1989；Favaro，1998)。因此，對於這類方法，應當儘量選用較高的反應物濃度。
在一種滅活流感病毒的疫苗流通式紫外反應器中，用尿苷感光計(actinometer)來測量燈光的強度(Zheleznova 1979)。
泰勒渦流(Taylaor-vortex)發生裝置作為一種光化學反應器，在均相和異相光化學反應過程中也得到研究(Sczechowski等，1995；Forney Pierson，2003)。為了對這類發生器進行感光測定，通常用到了草酸鐵絡和物感光計或者碘化物/碘酸鹽感光計。然而，還沒有關於進行吸光度匹配的校正數據以確定碘化物溶液中的劑量的報導(Forney Pierson，2003)。
對於UV-C測定而言，經典的感光計是草酸鈾醯感光計(Bowen 1949；Kuhn等，1989)和草酸鐵絡和物感光計，但是草酸鈾醯感光計的應用由於其鈾放射毒性而受到了限制，草酸鈾醯感光計的應用由於其UV-A，UV-B，以及可見光的敏感性而受到了一定的限制(Kirk Namasivayam，1983)。硫化氫或三苯甲烷燃料的氫化氰加成物也已知可以作為UV-C敏感的感光計。例如，溶解於乙醇中的無色的孔雀石綠無色氰(malachite green leucocyanide)並沒有表現出長波紫外光或者可見光的敏感性，但是綠色的光產物在UV-C區有一定的吸收(Calvert Rechen，1952；Fisher等，1967)。溶解於乙醇中偶氮苯(光化發色團2R 245、440)以及雜靠厄二蒽酮內過氧化物(heterocoerdianthrone endoperoxide)(光化學發色團1R248/334)(Brauer Schmidet，1983)可以使得這種感光測定溶液能重新使用(Gauglitz Hubig，1981，1984，1985)。儘管這些溶解在有機溶劑中的複合有機物是無害的，人們通常假定感光測定物質和溶液應當是無毒的和無危險的。
在20世紀早期，在多種紫外燈源變得易得後，酸性碘化物立即成為一種感光計而得到應用(Bering Meyer，1912)。但是，像0.05這麼低的光量子產率導致了氮氧化物被用來作為一種電子清除劑(Dainton Sills，1960；Rahn，1993)。另外一種較為最近出現的不透光UV-C感光測定法，是碘酸鹽穩定化的碘化物光化學分解反應(Rahn，1997；Rahn等，1999，2003)。在253.7nm波長下碘化物光解為三碘化物，在352nm波長下或者更長波長下(375nm，400nm)對這一反應進行分光光度測定。該體系具有對超過300nm波長不敏感的優點。
有人提出，可以將含有感光計溶液的流通式或者靜態式探測器插入輻射發生器中，用以替代UV-傳感器。將濃縮的感光計溶液，如美國專利6,596,542中的碘化物/碘酸鹽感光計或者2001年Schulz等報導的尿苷溶液泵入並通過紫外通透的管子，該管子同時還接收來自光源的紫外線；或者，這些感光計溶液也可以置於帶有一小窗能接收紫外燈光照的小室。在暴露在光照中一定的時間後，產生的光化學產物用光電分光光度計進行測量。然而，這些傳感器僅僅能測量到他們所受到的附帶輻射(radiation incident)的一部分，但是不能測量對於輻照反應器中所含待輻照液體有效的平均光通量(光劑量)。
水溶性三苯基甲烷染料，4，4』，4」-三(二β羥乙基)氨基三苯乙腈(4，4』，4」-tris-di-β-hydroxyethylaminotriphenyl acetonitrile)作為另外一種感光計物質，可以應用於UV-C輻射，對存在於果汁和植物汁液中的微生物(Koutchma Adhikari，2002)進行「冷滅菌」。實現這一過程的裝置已經實現了商業化，例如由位於紐約Macedon的FPE公司(FPE Inc.)生產的「Cidersure」和「Sap Steady」薄膜輻射器，或者由位於加州Fallbrook的Salcor公司生產的「Light Processed System」環繞管狀輻射器。從水果中榨取的果汁，由於含有懸浮顆粒而顯示混濁狀，由於含有溶解的苯酚化合物和維生素C而具有很高的UV-C吸收率，由於具有類似蛋白溶液的粘度。經過澄清處理後的蘋果汁在253.7nm波長下具有9/cm的吸收係數。感光計物質被添加到具有高吸收性的果汁中而後放置於準直光裝置中進行光照輻射，就如同完全用紫外光滅活動力學來確定非吸收性懸浮液中的微生物一樣(Bolton Linden，2003)。在600nm波長處，感光計光產物的光吸收增加，但實際上，添加的感光計物質僅僅吸收對應於其總吸收中吸收組分的光量子組分。通過對增加的感光計染料的降解進行測量，從而可以計算出有效光照劑量。在一個玻璃碟子的蘋果果汁中，190mJ/cm2的吸收劑量相當於滅活不超過3 log10大腸桿菌K12菌落形成單位(cfu)/mL，將一種感光計物質加入到樣品本身有時可能造成有效劑量結果呈明顯的錯誤結果。在非吸收性的懸浮液中，5 Log10cfu/mL大腸桿菌在大約10mJ/cm2下被滅活(Wright Sakamoto，1999)。然而，在溶液中發揮作用的照射劑量必須和在微生物中起作用的劑量保持一致。因此，為了實現精確的有效劑量的測量，將一種感光計物質加入到一種已經存在吸收的介質中的做法是不可取的。
利用產氣氣桿菌(肺炎克雷伯氏菌的過時的叫法)，儘管沒有能夠給出生物劑量學的所有細節，利用可被光照滅活的微生物來進行生物劑量，這是第一個被用來確定血漿中的可使用的輻照劑量的方法。另外，微小噬菌體科大家族中的單鏈DNA噬菌體，如S13和Phi X174噬菌體隨著紫外輻照劑量的增加，其滴度成線性遞減。基於噬菌體(如PhiX174，或單鏈RNA噬菌體MS2)滅活的劑量測定法，或者基於枯草桿菌孢子滅活的生物劑量法，已經開發為用來測試流通式紫外光水消毒器的方法。在被稀釋的紫外光通透性懸浮緩衝液中，在33mm的培養皿中水平攪動，並置於均一的9瓦的0.225mW/cm2的UV-C燈中，噬菌體Phi X174的隨劑量的非衰減性滅活速率為-0.44(Log10pfu/mL)/(mJ/cm2)(Anderle等，2004)。
已經商業化的薄層輻照器「CiderSure」(美國紐約州羅切斯特，FPE公司製造)可適用於果汁，這種裝置基本構成為，圍繞著管狀紫外光源，同心並行設置一個外部不鏽鋼管和一個內部石英管，液體縱向流過這兩個管的間隙區域。通過生物劑量學，對於每一類果汁，可以調整液體的流速，對於大腸桿菌O157:H7而言，以達到減少＞5log10cfu/mL的滅活效果。同時，因為為劑量H通常假定為E乘以滯留時間t，所以光強度的損失可以通過調整流速而得到補償(FDA，2000)。不過，單純依靠這種生物劑量學上的校正，並不能使得這種流通式反應器的滯留時間分布優化在一個比較窄的分布，從而使得避免對液體的過量照射。即便對於營養性液體來說，這一點更應該避免，因為過量的紫外光照射可以使得液體產生變味的不良效果，使得液體不那麼可口。
上面提到的那些流通式反應器，存在著流變學和技術的缺點等待克服。進入輻照的每一個體積元被縱向分配成一個較快的流體組分，該流體組分由於其較短的滯留時間而受到較少的輻照劑量；一個較慢的尾隨組分，該組分受到叫道的輻照劑量；和介於這連個組分之間的流體組分。圖7是關於美國專利6,576,201中，在一個泰勒渦流發生室中，滯留時間的分布取決於內部柱體旋轉速度的一個例子。如果輻照劑量太低則不能完全滅活存在的微生物；輻照劑量太高則可能損害流體中的有效成分，如果汁中的維生素和香料，血液衍生物中的蛋白質，或者疫苗中的抗原等。這樣，最好是能夠對輻照過程進行優化，使得既能足夠有效地滅活靶微生物，同時又能夠安全地保存其中的有效成分。對這一過程進行優化的方法是非常有用的。
前面提到的流通式和間歇式反應器的另外一個技術性限制是，光源會在使用壽命期限內發生老化，從而使得使用期間內產生的發光量較剛開始時損失一部分。為了彌補這一缺陷，一種積分計數器(integrating counter)可以被用來保證穩定和可重複的光輻照劑量，但是不能兼顧到待輻照溶液的吸收(Rider Robert，1951)。另外，在反應時，可能會由於至少一個光源的失靈而造成滅活反應的不連續發生。儘管這種失靈或者不正常關閉可以僅僅用一個電子光敏傳感器來檢測，但是為了確定一個有效光輻照劑量對流體的影響，需要對這一劑量進行測量以建立燈光強度、吸收、劑量衰減之間的聯繫，以便能夠通過改變其他過程變量來補償這種劑量衰減。這類裝置同時還需要在特定的時間間隔進行校正，以保證持續有效的運行。一種用於在生物液體中微生物的光滅活期間測量、控制和補償諸如光輻照波動的方法，優選能夠兼顧到在間歇反應器中待輻照生物液體的吸收的方法是非常有用的；另外，一種用於控制滅活過程不因為光輻照而波動的方法，也是非常有用的。
而且，在輻照裝置如間歇式和流通式反應器運行過程中，光源還產生了相當數量的熱能。來自輻照燈的熱量更進一步導致了光發射產生相當大的波動。例如，對於低壓汞燈而言，大部分的輻照燈的能量被轉化成了熱能，僅僅只有大約三分之一被轉化成了光輻照發射出去。儘管低壓汞燈很少發熱到溫度高於60℃，但適中的熱量就能導致對那些溫度敏感有效成分的破壞。僅僅直接對光滅活反應器中的流體管進行冷卻，並不能使得輻照燈恆溫和輻照強度穩定；對輻照燈電壓進行調整來穩定輻照強度不能移去產生的熱量或過量熱量。因此，如果能開發出這樣一種流通式反應器，它既能減少因燈源發熱而導致的光輻照波動，同時最好還能保證輻照燈溫度基本恆定或者不那麼波動，那將是十分理想的。這樣一種溫度穩定裝置在美國專利2,725,482中有描述，它使用了一個六個輻照燈的離心式膜輻照器(centrifugal filmirradiators)，每一個輻照燈都配有的一個靠水冷卻的導熱管可以移去過量的熱量(Benesi，1956)。其他流通式反應器如Dill反應器(美國專利5,567,616)，有擋板的或者其他包含有靜止混合器元件的管狀輻照器(美國專利6,596,172)，螺旋管形輻照器(WO 02/38191)已經有一些嘗試和披露，不過僅僅是沒有直接的輻照燈溫度穩定裝置。在美國專利6,586,172中，設想了一種輔助空氣流冷卻(通風式)裝置，不過這種裝置較直接的液體溫度穩定裝置效率更低。其效率取決於環境空氣溫度。在自由流薄膜輻照器中，穩定的冷空氣流可能會使得生物液體中的水分蒸發。液體式的輻照燈熱穩定也許可以保證，在沒有內燃燒時間的情況下，在最大的病原體殺滅強度下立即運行，例如，對於低壓汞燈UV-C最大產率在41.5℃；或者也可以從白熾燈光源中過濾掉紅外輻照，因為白光可能被生物液體吸收而被轉化成過量的熱能。
在1960年，在UV-C輻照疫苗技術方面的權威專家認為為了計算出用來滅活病毒這一過程本身所用到的能量絕對量，必須要對被病毒和培養基所吸收的紫外光能的相對量進行定量化，然而這一點目前還沒有能夠實現。更進一步，絕對的曝光取決於一系列可變的因素，如粘度、溫度、表面張力和流體的摩擦阻力(Taylor，1960)。儘管蛋白溶液或病毒懸浮液經常是澄清的或者稍微有點不透明的膠體，但是其他的液體可能包含有可能過濾掉的固體顆粒。對於多種粘土類礦物在滅活水中存在的產氣克雷伯菌過程中的保護作用的研究表明，這種能吸收紫外的粘土質可以對細菌有保護作用，但能發散紫外光的粘土質則沒有這樣的保護作用(Bitton，1972)。最近有研究表明，對於混濁的蘋果汁和澄清的蘋果汁，在用分光光度法進行測量時，這類懸浮溶液具有類似的表觀吸收，但在混濁液中比在澄清液中微生物被滅活得更迅速(Koutchma等，2004)。完全的曝光顯然取決於被顆粒散射到溶液中的一部分光。到目前為止，在科技文獻或者專利中，液體樣品中對微生物的有效光化學劑量的確定還沒有報導。同樣地，用於確定在生物液體(特別是不透明的生物液體)中滅活微生物的有效光照劑量的方法(特別是對於流通式反應器而言)也沒有報導。另外，本發明的一個目的在於提供一種在保證有效的生物活性成分不受影響的同時，對於包含在生物液體，特別是不透明的生物液體中的微生物進行有效滅活的方法。

發明內容
解決上述技術問題的方案通過權利要求限定的具體實施方式
而實現，特別需要指出的是，本發明首要目的在於提供一種用於確定從一個或多個光源發出的單色光或多色光滅活生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測量所述單色光或多色光對於劑量測定溶液的影響，其中所述滅活在流通式反應器中進行。
本發明的另一目的在於提供一種流通式反應器中滅活生物液體中微生物的方法，包括用有效輻照劑量的來自一個或者多個光源的單色光或多色光輻照生物液體，其中根據前述的方法和下面的詳細描述確定有效光輻照劑量。
本發明的另一目的在於提供一種用於在滅活存在於不透明的生物液體的微生物時，確定來自單個或者多個光源的單色光或多色光的有效輻照劑量的方法，包括測量在所用光滅活波長下單色光或者多色光對於與生物液體的濁度、與生物液體的濁度和吸光度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物液體的濁度、吸光度和粘度、與生物液體的吸光度、或與生物液體的粘度和吸光度相匹配的劑量測定溶液的影響，上述測量是基於採用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對薄層內的劑量測定溶液進行輻照以施加一能夠導致可測量的物理量或化學量發生變化的規定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長度薄到在規定時間內只能吸收預定輻照度的入射光部分，ii)在對光輻照反應器中劑量測定溶液輻照期間或之後，讀取與這些測到的量的變化相應的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進行，反之亦然。
本發明的另一目的在於提供一種滅活非光透性生物液體中微生物的方法，包括使用來自一個或者多個光源的單色或者多色光的有效輻照劑量來輻照生物液體，其中有效輻照劑量依據前述的方法和下面詳細描述的方法進行測定。
本發明的再一目的在於提供一種紫外光滅活流通式反應器，在該反應器中，封套恆溫器包裹了一個或者多個光源，通過該封套恆溫器，恆溫並且基本透光的液體進行流動，帶走燈來自輻照的熱量，從而保證基本上恆定的燈發光強度。
另外，本發明的另一目的在於提供一種通過控制發自單個或多個光源的單色或多色光的光輻照總劑量以有效滅活間歇式反應器中存在於生物液體中的微生物的方法，包括如下步驟
a)基於滅活生物液體中的微生物時的單色或多色光的有效輻照劑量，確定取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量、在間歇式反應器中有效滅活微生物所需要的光輻照劑量速率和輻照時間；
b)在滅活間歇式反應器中生物液體中的微生物期間，記錄光輻照劑量速率和輻照時間；
c)基於步驟b)的測量計算取決於吸收的輻照源光輻照總劑量；
d)將步驟c)中測得的取決於吸收的輻照源光輻照總劑量與步驟a)中得到的取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量進行比較；和
e)一旦取決於吸收的輻照源光輻照總劑量等於或者大於取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量，則中斷對生物液體進行曝光。
本發明的其他目的、特點和優點隨著以下詳細的描述將會變得越來越明顯。然而，應當理解，儘管給出了本發明的較佳實施例，這些詳細的描述和特定的實施例僅用於闡明本發明。對於本領域的技術人員而言，在本發明精神和範圍內的各種變化和改進都是顯而易見的。


下述附圖作為本說明書的一部分，說明了本發明的一個具體實施方式
，連同以上的概述和後面將要給出的詳細的實施例描述，可以解釋本發明的原則。為了更加完全地理解本發明，包括它的目的和優點，下面結合下述附圖進行描述以供參考。
圖1描述了吸光係數與碘化物/碘酸物濃度之間的線性相關性(參見實施例1)。
圖2描述了粘度的增加與聚乙烯吡咯烷酮濃度之間的非線性相關性。(參見實施例1)。
圖3描述了對於2.5/cm標準溶液的校正曲線。(參見實施例1)。
圖4描述了對於4.5/cm，7.5/cm和10/cm標準溶液的校正曲線。(參見實施例1)。
圖5描述了對於有限定的分子吸光度的標準溶液，以及同一種溶液裡加入了2g膨潤土/L以增加懸浮粒子濁度的溶液的校正曲線。(參見實施例10)。
圖6描述了吸光係數與濃度之間的線性關係(參見實施例10)。
圖7描述了粘度與聚乙烯吡咯烷酮濃度之間的非線性關係(參見實施例10)。
圖8描述了吸光度隨著施用的表面劑量而增加，以及敏感性隨著碘化鉀/碘酸鉀濃度而增加(參見實施例10)。
圖9描述了敏感性隨著PVP而增加(參見實施例10)。
圖10描述了輻照燈強度的變化(參見實施例15)。
圖11描述了具有以Y軸常量表示的誤差的劑量增加(參見實施例15)。
圖12描述了本發明的一個示範性校正裝置(參見實施例17)。
圖13描述了一個裝有光強度傳感器和溫度傳感器的恆溫輻照燈固定裝置的橫斷面示意圖(參見實施例18)。
圖14描述了使用恆溫液體的管狀輻照燈恆溫設計(圖14a和14b)的橫斷面示意圖。
具體實施例方式本發明的第一個方面提供了一種滅活生物液體中微生物時，確定所用的發自一個或多個光源的單色或多色光的有效劑量的方法，包括測量單色或多色光對生物劑量溶液的影響，其中的生物滅活反應在流通式反應器中進行。光照對劑量測定溶液的影響優選通過一種方法來測定，其包括測量在所用光滅活波長下單色或多色光對於與生物液體的吸光度、或與生物液體的吸光度和粘度相匹配的劑量測定溶液的影響，上述測量是基於採用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對薄層內的劑量測定溶液進行輻照以施加一能夠導致可測量的物理量或化學量發生變化的規定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長度薄到在規定時間內只能吸收預定輻照度的入射光部分，ii)在對光輻照反應器中劑量測定溶液輻照期間或之後，讀取與這些測到的量的變化相應的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進行，反之亦然。優選的實施方式是實施例1、2和17。
微生物是指任何選自原核生物界的微生物(monera kingdom)種、原核生物界的孢子、真菌生物(fungi kingdom)中的非致病性性或微生物種、真菌生物界種的孢子、古細菌(archaea)、原核生物(prokaryotes)，特別是細菌、真核微生物(eukaryotes)、可以使這些或者類似的微生物被殺死或者減少其活性的病毒、以及噬菌體。病毒優選細小病毒、細小鼠病毒(MMV)、犬細小病毒(CPV)、牛細小病毒(BPV)、豬細小病毒(PPV)、貓細小病毒(FPV)、環形病毒、圓環形病毒、小核糖核酸病毒、噬肝性病毒如A型肝炎病毒(HAV)和腦心肌炎病毒(EMV)、Anelloviridae viruses、腸RNA病毒(Enteroviridae RNA viruses)、微小病毒DNA噬菌體、以及光滑病毒科RNA噬菌體等。優選微生物是指脂質包裹的單鏈或雙鏈病毒、脂質或非脂質包裹的病毒等。
生物液體是指任何一種天然的或人工的生物液體，包括乳、乳清和乳蛋白組分、血液或者血液的一部分、血液製品、血漿、血漿組分、血清、血液衍生液體、血漿衍生液體、血漿組分、血清衍生液體、包含蛋白質組分的液體、脊髓和腦髓液體、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核細胞培養上清、真核細胞培養上清、原核細胞裂解液、真核細胞裂解液、或者任何以上這些液體的液體衍生物。
特別優選本發明的生物液體是指用於內部、外部或者皮下給藥方式具有治療作用的液體，它們在光滅活波長下基本上是不透明的並且對光滅活放射能量的劑量敏感。這些液體包括血液、血液製品、血漿、血漿組分、血清、以及血、血漿和血清的衍生物等。透明或澄清的液體如水、生理鹽水、林格氏(Ringer’s)乳酸鹽溶液或者葡萄糖液體可以經受過量的輻照並且並不總是需要一個確切的光輻照劑量。
本發明的另外一種特別優選的生物液體是化妝品液體，包括任何經腸道的液體，它們基本上不透明，即，有光吸收或者混濁，或者在光滅活波長下有光吸收或者混濁，對過量輻照劑量的光滅活輻照能敏感。透明而澄清的液體如酒精—水揮發物可以經受過量輻照而且並不總是有一個確切的光照劑量。
本發明的另外一種特別優選的生物液體是營養液，包括任何口服或經鼻給藥的液體，特別優選為了營養或者解渴目的的液體。它們基本上不透明，即它們有光吸收或者混濁，或者在光滅活波長下有光吸收或者混濁，對過量劑量的光滅活輻照能敏感。這些液體包括乳、乳清、乳製品、乳衍生產品、果汁、水果衍生製品、蔬菜汁、蔬菜衍生產品、原生樹汁、轉基因樹汁、人工合成飲料、加工的飲料、發酵飲料以及酒精飲料等。透明液體如自來水、瓶裝礦泉水、或者添加有檸檬酸的檸檬汁、溶解在水中的二氧化碳和糖類等飲料一般要經受過量輻照而且並不總是有一個確切的光照劑量。
本發明的再一種特別優選的生物液體是液體診斷試劑、或者其衍生液體，即診斷試劑或者診斷試劑盒的液體，如抗體溶液或者含有抗體的溶液等。透明的診斷試劑，如蒸餾水、無機鹽緩衝液、或者凝聚前的氯化鈣溶液可以經受過量輻照而且並不總是有一個確切的光照劑量。
本發明的生物液體優選是這樣的生物液體它們能在病原體光滅活反應器中沿著光程方向很大程度地輕易減弱輻照光對病原體殺滅作用。這種減弱作用要麼是由於生物液體中含有分子發色基團導致的，如胺基酸、蛋白質、核苷、核苷酸、染料、或者來自於添加物質如光活化劑或者光保護劑的分子發色基團引起，要麼是由於散光性和有光吸收的生物大分子引起的混濁導致的，要麼是由於以上原因綜合引起的。這種減弱作用取決於光程的長度。一種十進位吸收係數為1/cm的液體呈0.5mm液體層時，僅僅能吸收5.5％的入射光，因而可以認為是透明的。而在10cm深液體層時，可以吸收95.7％的入射光。優選地，如果沿著反應器的光程方向，任何可以使得入射光減弱達到5％以上，更優選10％以上，進一步優選20％更好的生物液體，通常就需要對發明進行化學劑量測定測定來確定有效輻照劑量。根據指數的光減弱原理，在10倍於半光程長度時，光強遞減為開始時的1024分之一，而該長度下，光強減弱為起始強度值的50％。優選地，用於紫外光滅活病原體的生物液體在253.7nm波長下是高度不透明的，例如疫苗的無血清細胞培養上清(a253.7＝5/cm，d1/2＝0.06cm)、凝血酶原複合物洗脫液(a253.7＝7.5/cm，d1/2＝0.04cm)(Brummelhuis，1980)，蘋果汁(a253.7＝10/cm，d1/2＝0.03cm)或者血清(a253.7＝25/cm，d1/2＝0.012cm)。這意味著，在6mm後、優選4mm、更優選3mm、更優選1.2mm後，入射紫外光的能量將被基本上完全消耗完畢，使得該生物液體變得很不透明。
生物液體可以含有天然的或者人工添加的物質，這些物質不會引起或抑制微生物核酸的光損傷，但通過作為活性氧自由基的淬滅劑，可以對有效成分提供一種對抗光輻照有利的保護作用，其中特別是顯著對抗紫外光輻照，例如蘆丁所含類黃酮(Erdmann，1956)、維他命如抗壞血栓(Erdmann 1956)、肌酸酐(JP 11286453-A)。但是，如果這些添加劑在使用的波長處增加了附加的吸光度，同時沒有對施用的這一附加光吸收的光強進行補償的話，可能只有很少的病原體殺滅光能可以實際到達微生物。因此，要求的足夠滅活微生物的紫外光或者可見光劑量強度必須不能過量，並且一定要儘可能計算精確，地如同實施例1、2、11、12和15到17的描述。
光、單色光、或者多色光是指電磁波形式的能量，優選波長和頻率在紫外或者可見光區內。
根據本發明，用於滅活微生物的光化學方法包括使用以下光波輻照
波長為200到280nm範圍內的UV-C區域的短波長紫外光，優選接近核酸最敏感的有殺菌作用的265nm波長；
波長範圍在約280到約320nm之間的UV-B區的中波長紫外光；
波長範圍在約320到約400nm之間的UV-A區的長波長紫外光，或者在有至少一種天然或人工添加的光增敏劑存在的情況下，波長範圍在約400到約700nm之間的可見光；
脈衝單色相干光或非相干光，或者前面提到波長範圍內的脈衝寬譜光，優選是連續發射的光。
根據一種用於確定滅活生物液體中微生物的有效光輻照劑量的方法的優選具體實施方式
，沿著光程長度，大約有100％，更優選80％，更優選60％，更優選50％，更優選30％或者以下的入射光輻照被吸收掉。
被生物液體吸收的光數量是通過限定的波長1和通常為1cm的光程長度d下的透光率和吸光度表示的。從不能超過100％的透光率T出發，由公式A＝-log10T計算出十進位吸光率A，對於d＝1cm，A就變成十進位吸光係數al，單位為1/cm。對於大多數264nm波長附近的殺菌短波紫外光，光的吸收可以降低最大穿透深度至小於1mm。
根據本發明的方法和反應器，使用的光源通常為管狀的金屬氣體蒸汽放電燈。低壓金屬蒸汽燈，由於僅僅產生適度的熱量，適用於對熱敏感的生物液體，其特別是對過量的熱量敏感。從這種燈發出的光線最好為單色的，如，在低壓鈉蒸汽燈發出589nm的橘色光；低壓汞蒸汽燈發出的253.7nmUV-C區光。後一種輻照燈可以在內層塗上一層磷，以獲得白色螢光，光化藍+UV-A，黑光UV-A，或者UV-B的寬譜或者窄譜發射光譜。其他適用本發明的殺滅病原體的光源有中壓和高壓金屬蒸汽燈，閃爍放電燈，潛水式電弧，雷射，激發態燈，發光二極體，白熾燈，等等。
分光光度計測量的生物液體的總吸收在模糊雲狀或者添加混濁液體而混濁情況下可以包括因分子發色團而產生的分子吸收，即由於膠體樣分散的大分子和懸浮顆粒而成光散射和減弱。對於有懸浮顆粒(例如細胞碎片)吸光溶液例如沒有經過過濾的混濁的果汁而言，濁度可以這樣求得未經過濾的果汁的吸光率減去過濾澄清的果汁的吸光率(參見實施例10)。
光增敏劑是可以與微生物直接發生反應的物質，如補骨脂素及其衍生物；或者光增敏劑也可以從存在於溶液的另一種成分產生的反應性分子，如來自於溶解氧的單原子態氧或者來自於溶劑化的電子。後一種光增敏劑包括吩噻嗪染料、吖啶、黃素、紫質以及酞菁。
微生物對於光照的敏感性取決於它的基因組大小、它的核酸類型以及它修復光損傷的能力。總的來說，真菌和細菌的孢子以及真核細胞對光的抗性最強，病毒的抗性稍弱，植物細菌抗性最強。將微生物的活性減少到所要求的水平所需要的光通量，對於不同的微生物來說，是不同的。光通量是指射入一個區域的光能，如，在暴露於光照過程中的一個微生物的橫斷面，該橫斷面僅僅吸收利用該光能一部分(Bolton，1999)。名詞光輻照劑量(light dose)也經常作為光通量(fluence)的另外一種叫法。
在一個非吸光性的懸浮液中，在已知的光通量速率下(單位面積上的光通量)，如果微生物被輻照一定的時間，那麼施加在微生物上的光輻照劑量可以被計算出來，隨劑量的滅活速率也可以被確定(Bolton Linden，2003)。已有多種微生物的滅活速率常數已經被確定，其中一些微生物作為標誌微生物被用來顯示一個光化學處理過程的效率。
然而生物液體可以同時伴隨有一些可以吸收光的物質或者可以散射殺滅病原體作用的光的顆粒，如蛋白質、維生素、酚類化合物，或者脂質體和細胞碎片。大多數的入射光被這些伴隨的物質所消耗或者被這些顆粒所阻擋，僅僅一部分入射光實際到達靶微生物而發揮效果。因此，在這類生物液中將同一種微生物的滅活到所要求的水平所需要的光輻照時間，大於在非吸收性液體懸浮液中同樣的微生物滅活所需要的時間，本發明的也考慮了這一點。
很多種天然篩選的化合物都可以保護生物體免受到高能量光輻照的有害作用。然而，它們不僅通過捕獲或者淬滅光作用產生的自由基或激發分子，也可以僅僅通過吸收光中具有光生物活性頻率部分的光。將這類保護性添加劑，例如活性氧類淬滅劑比如類黃酮和微生素C，添加到根據本發明的透明或者吸光性生物液體中，如果這些添加劑在殺菌的波長下有光吸收，那麼將導致附加的光吸收和減少的光穿透。將0.1％或者0.5％的維生素C添加到蘋果汁中，在Hanovia Bio-Steritron燈的輻照下，在平面的0.2mm深流通式比色杯中，較之沒有添加劑的蘋果汁，隨滯留時間的微生物滅活速率從50％下降到20％(Mack等，1959)。
在本發明的一個優選的具體實施方式
中，有效輻照量通過化學劑量法測量。劑量測定溶液是指用在一定波長下發生實質性光化學反應的試劑配置而成的待測溶液，產生的光化學產物可以被測量。光化學產物可在薄層中以和溶液的吸光係數相當的靈敏度被測量，因此在這一薄層，僅僅一小部分的入射輻照被吸收，因為輻照在薄層的一定區域的光能通過實際上沒有吸收的薄層，從而使得光通量能得到確定。優選的實施方式參見實施例1～6、10～13以及15～17。
已知有許多化學感光計足以應用於本發明。例如，從一組鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、碘化銨和尿苷磷酸鹽水溶液中，可以選出能用來作為紫外光C的輻照的劑量測定溶液。
本發明的一個特點是，提供了一種評價光滅活微生物裝置的方法，這一方法使得在輻照波長下，使得劑量測定溶液具有預定的光吸收；或者更優選在輻照波長下，使得劑量測定溶液具有預定的光吸收和預定的粘度，這種光吸收和粘度可以與在滅活微生物過程中將要被輻照的生物液體的吸光度相匹配或者同時與其吸光度和粘度相匹配。
許多特別適於濃縮的紫外光C敏感的化學劑量測定劑，即高吸光性的生物液體可以與本發明一起使用。例如，稀釋的碘化鉀/碘酸鉀感光計優選但不限於含有大於或等於6.69mM的KI和大於等於1.16mM的KIO3，具有和這類生物液體吸光度相應的高吸光度，例如但不限於a253.7為2/cm、高光量子產率和三碘化物的高比消光係數。這種劑量測定溶液可以用相應濃度的KI和KIO3來配製，以便於優選但不限於吸光係數a253.7至少為2/cm)的生物液體相匹配，它能用於薄層吸收池，其光程長度可為大約0.1到1mm，優選約為0.1到0.7mm，更優選約為0.1到0.5mm，更優選約為0.1到0.3mm，更優選約為0.3到1mm，更優選約為0.5到1mm，更優選約為0.7到1mm。通過添加已知能穩定三碘化物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可以增加碘化物/碘酸鹽溶液的敏感性，並且蛋白溶液的粘度可以達到很大的精確度。
另一種優選的特別適合稀釋的紫外光C敏感的化學劑量測定劑，即低吸光性生物溶液是苯甲酸鈉感光計，這種感光計可以在薄層螢光小室中對光反應產物進行螢光定量，並且這種感光計可以但不限於稀釋到與如下吸光係數a253.7相匹配約0.1/cm到大約2/cm更優選約0.4/cm到2/cm；更優選約0.8/cm到2/cm；更優選約1.2/cm到2/cm；更優選約1.6/cm到2/c，其中對於薄層螢光比色杯而言，優選但不限於其光程長度為至少1×10mm。
另外一種更優選的而且特別適合極度稀釋的紫外光C敏感的化學劑量測定劑，即始終為非吸光性的生物溶液是過二硫酸鉀/叔丁醇感光計，優選這種感光計可以但不限於稀釋到與a253.7為0.5/cm的吸光度相匹配。這種劑量測定溶液更優選但不限於適用光程長度為0.5到1cm的吸收池，更優選0.7到1cm的吸收池。光反應產物和氫離子可以用插入一個小型的pH電極的pH計來進行測量。
在本發明的一個經優選實施方式中，劑量測定溶液可以包含從下列中選取的試劑或試劑組合碘化鹼金屬鹽、碘化鹼土金屬鹽、碘化銨、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸鹼金屬鹽、苯甲酸鹼土金屬鹽，苯甲酸銨、過二硫酸鹼金屬鹽、過二硫酸鹼土金屬鹽、過二硫酸銨、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤土(bentonite)、雲母、蒙脫石(montmorillonite)、囊脫石(nontronite)、鋰榮脫石(Hectorite)、高嶺石、多水高嶺石、地開石、粘土礦物、白堊、矽石、煅制二氧化矽、重晶石、石膏、滑石、氧化鎂、氧化鋁、氯氧化鉍、氧化鋅、硫酸鹼土金屬鹽、碳酸鹼土鹽、磷酸鹼土鹽、羥基磷酸鹼土鹽、滷代磷酸鹼土鹽、不溶性矽酸鹽、不溶性矽酸鋁鹽、不溶性碳酸鹽、不溶性硫酸鹽、不溶性磷酸鹽、不溶性羥基磷酸鹽、滷代磷酸鹽、全氟烴或其衍生物、全氟醋酸或其鹽、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
更優選劑量測定劑溶液可以包含稀釋的碘化鉀/碘酸鉀感光計、稀釋的碘化鉀/碘酸鉀/多聚吡咯烷酮感光計；優選在光滅活反應發生的光波長下，劑量測定劑溶液吸光度應該和生物液體的吸光度相匹配，或者劑量測定劑溶液的吸光度和粘度與生物液體的相匹配。
如果可能增加總吸收率的生物液體的濁度必須大於不含有限制性金屬礦物的可增加濁度的添加物，這類限制性金屬礦物包括膨潤土、蒙脫石、雲母、蒙脫石、囊脫石、鋰榮脫石、高嶺石、多水高嶺石、地開石、其他粘土礦物、矽石、煅制二氧化矽、白堊、石膏、重晶石等；或者多聚物如聚乙烯聚吡咯烷酮(PPVP)也可以添加到稀釋的或者吸光度/粘度相匹配的碘化—碘酸鉀—聚乙烯吡咯烷酮感光計中，或者添加到其他合適的感光計中。更優選劑量測定溶液可以含有稀釋的苯甲酸鈉感光計。更優選劑量測定溶液也可以含有稀釋的吸光度相匹配的硫代硫酸鉀/叔丁醇感光計。
劑量測定試劑是一些過量存在的溶解的小分子，它可以很容易地擴散到被輻照區域。因此，入射光子將把這些劑量測定試劑轉化成光化學反應產物。輻照燈在幾乎恆定的強度下工作時，相同多的光子將照射反應容積，相同多的光子將在特定時間間隔施加幾乎相同的有效輻照劑量(mJ/cm2)，產生一定的化學劑量速率((mJ/cm2)/min)。通過控制總的燈光輻照劑量可以大致考慮燈的輻照強度。對於含有噬菌體或者病毒的蛋白質溶液而言，輻照劑量最好能和一個給定的吸光度和粘度一致。
生物樣品溶液的的十進位吸光係數可以在一個比色杯中(用分光光度計進行測量，比色杯厚度薄到保持溶液的光吸收率在儀器的測量範圍之內。吸光係數可以這樣計算儀器測得的吸光度除以光程的長度(一般以釐米cm計)；Napierian吸光係數這樣計算十進位吸光係數的Log值即為Napierian吸光係數。
粘度可以用毛細管粘度計測量流動時間來確定粘度計上的結果乘以本技術領域通常已知的毛細管粘度計常數。
一般來說，使用的薄層比色杯的光程長度要和稀釋後的光輻照溶液相配，而且優選要小，這樣比色杯僅僅吸收一小部分的入射光。
在這樣的薄層中，用有部分吸收的稀釋的光輻照溶液進行校正，可以儘可能精確地計算出光通量。例如，0.02cm比色杯中a253.7＝15/cm下的光通量為27.3％，0.1cm比色杯中a253.7＝2/cm下的光通量為19.9％。這表示，通過光程後的入射光輻照的有效輻照劑量分別72.7％和80.1％(Morowitz，1950)。因此，Morowit校正因子對於第一個比色杯為72.7％，對於第二個為80.1％。這樣可以計算和校正自吸收誤差。為了達到準確的校正，建議一般應使用低於50％的Morowitz校正因子，這就意味著比色杯的光程長度不會超過入射光強衰減為起始值25％時的距離。
為了得出劑量測定校正曲線，例如可以用電子輻射計、光譜輻射計、或者帶有濃縮和完全吸收的感光計溶液的化學光輻照方法，對已知輻照光源進行測量。在確定來自光源的入射輻照後，對含有稀釋的吸光度匹配的或者吸光度和粘度匹配的劑量測定溶液的比色杯，以一定的方位和一定的時間，以及一定的表面劑量進行輻照，得到的光輻照信號相對於光的輻照劑量畫一曲線，即為校正曲線。
例如可以這樣進行校正用一個輻照燈、一個在光程長度之內用於將比色杯曝光限定的曝光時間的光閥，將比色杯和輻照燈平行安置於光路經的末端。這種光閥通常用作諸如照相機的膠片—影像平面光快門，這種光閥機構通過類似鐘錶的機械裝置進行精確控制，或者更優選通過一個電子振蕩源進行控制。振蕩源驅動的光閥和位置固定的比色杯確保了重複性和對比色杯進行精確的輻照。為了實現這一目的，可以對商品35mm或者中等規格的膠片單鏡頭反光相機或者旁軸取景相機進行一定的改進，通過將輻照燈固定裝置附著於相機鏡頭座，將比色杯附加安放入相機背面的一個孔徑中。優選相機背面的孔應當具有一定的直徑，以使比色杯的整個表面都能夠得到光輻照，而孔徑的邊緣則可以作為一個部分瞄準器。為了提高燈光強度的穩定性和輻照光量子產率，可以用諸如風扇，環形流動液體或者Peltier元件等的裝置使得輻照燈和比色杯凹槽的溫度保持恆定。
校正裝置可以優選包含下述器件一個光源，一個光線出口孔，以便光線能夠輻射進入光瞄準器孔，一個光閥，以及安置在恆溫具有光入射孔的倉室內的比色杯槽，以便光線輻照入比色杯或者是含有劑量測定溶液的光學小池中。對於輻射計傳感器裝置，可以提供一個較好的恆溫座架，以便從光源發出的光線能夠通過光閥進入比色杯的同時，還能通過相機背部的孔徑進入該傳感器的入射窗口，這樣就能夠用這種校正方法對光源進行監控，或者能夠對這樣的傳感器進行隨時間而保持不變的那些性質進行檢測，即通過對同時被曝光的比色杯或者光學小池中含有的現有標準感光計溶液進行比對而進行檢測。特別優選光閥由一個精確的定時器驅動以獲得精確的可重複的比色杯或者光學小池曝光時間。圖12顯示了一種優選的校正設備。安裝在一個倉室(U)中的優選管形輻照燈(T)優選恆溫或者恆流，特別優選既恆溫又恆流，以確保在整個校正過程中光輻照保持不變。如圖12所示，可以通過一種透光性液體流經輻照燈而實現恆溫。箭頭所標示的光線從輻照燈發出後，通過孔(V)以及其開關時間受到控制的開放光閥輻照到比色杯上，如果該比色杯比比色杯室(holder)的最大空間更薄，其連同距離調節器一起插入到最好是恆溫的比色杯室(X)內。在光閥打開期間，比色杯中的光輻照溶液或者標準劑量測定溶液就可以受到精確的光輻照。一個可選的孔(Y)位於和孔(X)不同的位置，最好能夠空間相似，使得同時有部分光線從輻照燈射入孔徑X和孔徑Y。孔(Y)也可以設計為帶有一個電子傳感器(Z)，例如優選但不限於在反應器輻射器中用到的一個傳感器，這樣基於比色杯室(X)中光輻照方法和使用傳感器(Z)的輻照測量方法同時測到的光強度的比值，提供一種可以對傳感器進行重新校正的精確方法。傳感器(Z)也可以用於監控和記錄校正曝光期間燈光的曝光強度，以便於下一步中如果輻照燈強度發生改變的時候，用於對強度進行糾正。在實施例17中描述的這樣一種校正裝置的用途，並且通過在輻照燈固定裝置處安裝一個輻射計傳感器用座架，可以用來對輻射計傳感器進行檢查和重新校正，這樣從輻照燈發出的光線可以被感光計比色杯和輻射計傳感器同時測得。
根據一個確定滅活生物液體中微生物所需光輻照有效劑量的方法的優選實施方式，規定通量可以通過改變規定輻照度和/或通過改變規定時間來改變，所述規定時間由流通式反應器中生物液體的流速確定。因為微生物對於輻照滅活的敏感性也是所用的光的波長或者波長譜段的函數，因此特定的光通量也可以通過改變發出的光的波長或者波長的譜段進行調整。
為了實現較高的流量，前面提到的薄層輻照器的製造商Wedeco Visa AG公司推薦通過將多個輻射器串聯或並聯在一起，以增加流經容量。較低的流速下可以通過增加滯留時間而增加輻照劑量，或者在基本上恆定的流速下通過增加聯在一起的輻射器的個數而增加輻照劑量。為了改進溶液流動性質，可以將一個螺旋形流動引導管插入到環形間隙中(Harrington Hills，1968)。在美國專利6,586,172中，對於處理血液製品的設備，採用了擋板靜止混合方式，這種設備用到了輔助的空氣流冷卻裝置來移去來自紫外輻照燈的熱量。
在這一方面，一種更為有效的具有更高混合度的方法可以使滯留時間的分布變得狹窄，並增加滅活率。例如，這種更高程度的混合可以通過這樣但不限於此的方式實現如同用擋板穩定地施加影響，在縱向流動的液體上施加橫向流，或者通過動力學原理產生泰勒渦流或者迪恩渦流。
為了測量光輻照有效劑量，例如，在輻照裝置中對與待測樣品體積相同的劑量測定溶液進行輻照，在特定時間取出一小部分劑量測定試樣溶液置於薄層比色杯中，對光化學反應產物進行測量。記錄下從所用輻照的劑量測定溶液得到的信號，並與相應的校正曲線進行比較。從校正曲線上可以讀出輻照劑量值。作為選擇之一，至少有一種用於在反應器中測量光輻照有效劑量的手段。對流通式反應器來說，這些手段可以在輻照滅活區域之前或之後安裝。
可以用一種非常簡單的UV-C流通式反應器，例如將一個螺旋盤繞的紫外透射管包繞在發光低壓汞蒸汽燈上的反應器，通過用吸光度和粘度匹配的、或者吸光度和濁度及粘度匹配的化學劑量測定法，對UV-C輻照裝置進行試驗性校正。
帶有光輻照溶液的劑量測定化學方法能夠測量薄層比色杯中裝的樣品體積上施用的平均光輻照劑量(光通量)。光化學反應物通常要過量存在，任何局部過量的光化學反應產物都要充分混合併稀釋，反應產物的濃度隨輻照所施加的光量子數的增加而增加，呈良好的線性相關性。
一般來說，同樣數目的光量子數可以滅活每單位體積或每升液體中殘存的同樣多的活性微生物，滴度在log對數上的減少呈線性。而且，局部的過量光輻照強度並不能將有活性微生物的數目減少到小於零，不過局部不足的光輻照劑量卻會導致樣品中活性微生物的殘留。
為了確定輻照劑量，優選該方法還進一步包括在監測輻照過程中一個或者多個光源的強度的方法。更優選所用的光源在紫外光區，最好在紫外光C區。對於流通式反應器，對光源進行輻照劑量的監測是一種通常的做法。輻照燈的功率可以得到持續性地監測，同時對信號進行顯示或者記錄。有利的是，待處理的液體沒有阻擋光源和劑量測定傳感器之間的光程，所以液體並沒有減弱光照強度。如果確實由於設計上的限制而無法避免這種光強度上的減弱，那麼最好在對液體進行輻照之前和之後，應當對燈光強度的減弱進行測量，以便於計算出平均的輻照強度。
為了得出劑量測定校正曲線，將化學劑量測定溶液分布於確定厚度的薄膜層上，這樣溶液就只吸收一小部分入射光。然後將薄膜層置於一定的光輻照劑量中照射，溶液發生一系列實質性的可量化的化學變化，將其中的化學物質進行轉化而產生光吸收或在特定的波長處發出螢光，或造成pH值的上升等。對這些光輻照信號進行測量並以此信號值對光輻照劑量作圖。
在混合的批量體積內，對相應的溶液進行輻照，抽出一定體積並對光化學反應產生的產物進行測量。從受到輻照的劑量測定溶液得到的信號被記錄下來並與相應的校正曲線進行比較。從而可以得到和劑量測定校正曲線上信號增加相對應的有效輻照劑量。將輻照劑量的增加除以輻照時間單位，得出輻照劑量速率。有效輻照劑量如上面所定義。
劑量測定溶液和目標蛋白溶液類似，因為在特定的波長下劑量測定溶液具有和蛋白質溶液相同的吸光度，並且優選還有相同的粘度。可以用有效的UV劑量對光化學反應中的化學物質例如三碘化物的轉化的測量進行糾正。化學劑量測定法保證了具有不同吸光度的蛋白質溶液可以接收到相同的有效UV劑量。具體細節請參見實施例1～56。
根據在滅活生物液體中微生物時確定光有效輻照劑量的方法的一個優選實施方式，該方法進一步還包括有，在對輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進行輻照之前和之後、或者之前、期間和之後，通過滴定存活微生物的數量來確定劑量分布。在另一個實施方式中，生物學上有效的光輻照劑量(光通量)可以通過生物劑量測定方法來確定，這是指通過對微生物的光滅活進行確定。生物劑量測定可以通過流通式或者間歇式反應器裝置來實現，並且這一方法已經被用來作為測量滯留時間分布(Qualls Johnson，1983)以及光輻照劑量分布(Cabaj Sommer，2000)的常規方法。優選的實施方式參見實施例3至6，以及12至17。
在一個優選實施方式中，生物劑量測定方法可以和化學劑量測定法聯合使用來確定混合效率(參見實施例3到6，以及12到17)。
優選根據本發明的生物液體中可以包含選自如下微生物種類原核生物界、原核生物界的孢子、真菌界的非致病性細菌或微生物、真菌界的孢子、原蟲類、原核細胞、細菌、真核細胞、病毒等，以確保這些或者類似的微生物可以被殺滅或者降低活性，以及噬菌體。
優選病毒選自如下病毒種類微小病毒(Parvoviridae viruses)、微小鼠病毒(MinuteMurine Virus，MMV)、犬微小病毒(Canine Parvovirus，CPV)、牛微小病毒(Bovine Parvovirus，BPV)、豬微小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)、貓微小病毒(Feline Parvovirus，FPV)、環形病毒(Circoviridae Viruses)、圓環形病毒(Circinoviridae Viruses)、微小RNA病毒(Picornaviridae viruses)，優選噬肝性病毒A型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)和腦脊髓炎病毒(Encephalomyocarditis Virus，EMC)、阿內羅病毒(Anelloviridae Viruse)、腸道RNA病毒(Enteroviridae RNA viruses)、微小病毒DNA噬菌體(Microviridae DNA bacteriophages)，以及光滑病毒RNA噬菌體(Leviviridae RNA bacteriophages)。
為了確保在進行根據本發明的光滅活處理過程中，生物液體中的有效生物成分如蛋白質或其他重要成分得到良好保存，可以用本技術領域內常用的功能分析對其中的蛋白質或維生素的生物學活性進行測定，例如實施例4中描述的彈性蛋白酶抑制分析，或者實施例13和16中描述的醯胺水解FX反應等。這些活性分析物最好也能包含在劑量測定溶液中。優選地，可以對劑量測定溶液的吸光度、粘度或者濁度進行調整，以使得加有活性分析物的劑量測定溶液的吸光度、粘度或者濁度與將活性分析物加入後測試的生物液體的吸光度、粘度或者濁度相匹配。這種測定方法可以確保，在有效滅活汙染性微生物的同時，生物液體和/或其中的有效組分仍然保持其生物活性。
微生物，例如噬菌體、病毒和細菌最好能在存活能力上表現出呈指數減少。這意味著，一個給定的輻照劑量能夠滅活同樣數量的存活的微生物，例如，如果1mJ/cm2將微生物的滴度滅活到開始時的1/10，那麼2mJ/cm2應當能夠滅活到開始時的1/100，3mJ/cm2可以滅活到1/1000，如此類推。如果通過使所有的微生物僅僅通過輻射區一次以保證所有的微生物得到同等的輻照，那麼所有的微生物受到一個滅活擊(inactivatinghit)。然而，和蛋白質相比，即便是最小的微生物，如單鏈DNA噬菌體，也可以看作大顆粒(～25nm)，從而在蛋白溶液對流和流動的過程中被除去。在一個反應器中，有些微生物在一個特定的時間間隔內被轉運到輻照區域多次，而其他的微生物僅僅一次，有些可能從沒有被轉運到過輻射區。因此，基於化學方法確定的劑量速率的滅活速率(隨著溶液的混合而增加。因此，滅活微生物的過程進行得越快，那麼需要得輻照時間就越短，需要的有效輻照劑量也就越小。因此，可以通過較高的攪拌效率，來保存生物液體中的蛋白質或者其他生物活性。
在紫外輻照之前、期間和/或或之後，對在輻照之前或期間、或者之前與期間摻合了存活微生物的生物液體的微生物滴度進行測定，即測量生物劑量學滅活性。例如，這一過程可以通過計數殘留的活細菌的菌落數目，或者被裂解的細菌斑的數目來實現，其中細菌斑數目對應於仍然存活的噬菌體的數目。以菌落形成單位(cfu)或者斑點形成單位(pfu)表示的存活微生物的滴度，隨後可以計算為培養皿上每毫升稀釋樣品體積的log10(cfu×10稀釋因子)/mL或log10(pfu×10稀釋因子)/mL。
經生物劑量測定驗證，當噬菌體滅活速率(其表示為log[滅活的數目]/紫外光有效劑量)相似或者基本上相等時，在相同的混合效率下用幾乎相同的有效輻照劑量對不同的蛋白質溶液進行輻照。如果樣品中不含任何對微生物或其宿主有害的或有抑制性作用的成分，那麼生物劑量測定特別適合於驗證不同的樣品。同樣地，生物劑量測定幾乎可以適用於任何生物液體。
在本發明的另外一個優選實施方式，生物劑量測定用上面提到的方法得到了應用。
例如，生物液體可以在薄膜或者橫向混合管形反應器中接收輻照。如果光線沒有直接輻射到液體表面，那麼光輻照滅活區裡含液體管道的材料必須在所用的滅活光的波長下是基本上透明的。對於小於350nm的紫外光，硼矽玻璃可以認為是透光的；對於小於300nm的紫外光，其他特殊玻璃如無鐵硼矽玻璃、磷酸鹽玻璃、高矽玻璃，或者熔融石英玻璃可以認為是足夠透光的，以及其他特殊的塑料如氟聚合物也特別適用。許多微生物光滅活反應器可以這樣設計，以便在不同的流速下處理不同的不透明液體。這些液體可以含有至少一種添加劑以減少液體中有效成分的破壞和喪失。
在本發明的測定有效輻照劑量的方法的一個優選實施方式中，該方法可以和至少一種其他的滅菌或者微生物滅活方法聯合起來使用。已知有多種滅活、滅菌、消毒或者保存方法，例如有但不限於熱法或者非熱法，或者添加化學防腐劑等。不同種類的微生物對不同的處理方法有不同的敏感性，因此，用不同類型滅菌方法的組合來確保對不同的病毒進行滅活通常是很必要的。本發明中，輻照處理的一個特別的優點是，特定類型的對其他常採用的處理方法有抗性的病毒對這種輻照方法敏感。
在另外一個實施方式中，本發明中用來確定有效輻照劑量的方法，連同其他已知用於對生物液體進行滅菌或滅病毒的方法被聯合使用。在本技術領域已知有多種方法，如傳統的溼熱滅菌法或者常用於對白蛋白進行滅菌的巴斯德氏滅菌法，其中巴斯德氏滅菌法包含在有或沒有穩定劑存在的條件下，在一個給定的時間內，對樣品溶液進行程序性升溫的保溫過程。另外一種是乾熱滅菌法，適用於對諸如凝血因子VIII等成分的滅菌，其包括液體被凍幹後在給定時間內對其程序性升溫的保溫過程。另外一種滅菌方法則包括對樣品進行超濾或者液體去垢劑處理，在這種滅菌方法種，溶液與液體去垢劑系統充分混合後，在一定時間內孵育，然後用疏水層析的方法去掉液體去垢劑成分，其中去垢劑系統例如是1％的磷酸三丁酯，1％的曲通X-100或土溫-80。在WO 94/28120，美國專利Nos.4,946,648，；4,481,189和4,540,573中，對液體去垢劑處理方法有詳細描述。
在另一個本發明具體實施方式
中，用來確定有效輻照劑量的方法與液體去垢劑系統聯合使用，該液體去垢劑系統的一個特點是，它能造成樣品溶液的吸光度顯著上升。因此，本發明具有以相對較高的吸光度來達到有效滅活液體中病毒的能力是一個特別優點。
在本發明的另一個具體實施方式
中，根據本發明確定有效輻照劑量的方法，生物液體中至少要加入至少一種添加劑以減少對液體中生物活性的損傷或者丟失。已知的多種保護性添加劑包括，維生素E可以保護細胞不收損害，抗壞血酸可以防止血漿不致丟失功能活性，自由基以及活性氧的淬滅劑如組氨酸、蘆丁、槲皮素或其他類黃酮，其他穩定劑如包括甘露糖醇在內的糖醇和胺基酸用於減少血液組分活性的喪失。因為單原子態氧的生成需要溶解氧的存在，所以移除溶解在溶液中的氧，例如在進行輻照之前或期間用一種諸如氮氣的惰性氣體來驅除空氣也能對於樣品中的有效成分產生保護作用。如果這些保護性添加劑能夠影響到到微生物對輻照的敏感性，為了考慮到這些保護性添加劑對於滅活微生物所需的有效輻照劑量的影響，可以依據實施例16的方案對劑量測定方法進行調整。
根據本發明的一個方法，有效輻照劑量是指能夠滅活所有的，或者至少99.9％、優選99.99％、進一步優選99.999％的生物液體中微生物所需的輻照劑量。更優選該方法在流通式反應器中進行。在實施例2、5、6、11、15和17中，提供了該方法的優選實施方式。
本發明的另外一個方面是，提供了一種用於確定從一個或者多個光源發出的單色或多色光用以滅活非透明生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測量在所用光滅活波長下單色或多色光對於與生物溶液的濁度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物溶液的濁度和吸光度以及粘度、與生物溶液的吸光度、或與生物溶液的粘度和吸光度相匹配的劑量測定溶液的影響，上述測量是基於採用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對薄層內的劑量測定溶液進行輻照以施加一能夠導致可測量的物理量或化學量發生變化的規定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長度薄到在規定時間內只能吸收預定輻照度的入射光部分，ii)在對光輻照反應器中劑量測定溶液輻照期間或之後，讀取與這些測到的量的變化相應的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進行，反之亦然。
在一個優選實施方式中，生物溶液是指如上所定義的溶液。
根據本發明的一種非透明生物溶液涉及到膠體生物溶液，其看起來可能澄清或者呈煙霧狀，但沿著光程方向，具有光散射的性質。更優選該膠體生物溶液含有的顆粒大小在分散體系中為0.1nm到100nm之間，優選在1nm到100nm之間，最好是在10nm到50nm之間。更優選地，在一種膠體生物溶液中所含膠體中分散的大分子的最大分子光吸收附近，其光散射增強，這樣散射光將可以有助於對病原體進行光滅活。對於優選的膠體生物溶液例如蛋白質溶液，有可能可以通過估算在非吸收波長和吸收波長下的濁度測量，估算出整個光吸收度中溶液濁度的貢獻部分。然後分子吸光度可以通過從分光光度法測得的總吸光度中減去估算的濁度而計算出來。為了模仿一種膠體生物溶液中膠體分散體系的光散射特點，可以用沉澱的方法分出溶液中造成混濁的物質如上述描述的諸如粘土礦物，並且用含有預期大小的顆粒組分去與劑量測定標準溶液的濁度相匹配。
更優選地，非透明生物溶液是一種含有懸浮的粒經至少為約100nm的顆粒的生物液體，該大小在本技術領域是公知的並且在上面進行了詳細描述。可以通過測量在通過如過濾或者離心的方法移除這些懸浮顆粒之前和之後的吸光度，而確定這種生物溶液如蘋果汁、橘子汁或者蔬菜汁的濁度。經過澄清處理後的沒有懸浮顆粒的溶液的吸光度是由分子發色基團引起的。測得的混濁液和澄清液體之間吸光度的差異即為濁度。
還優選這種不透明生物溶液是一種乳化液例如乳，它是一種水包油的乳化液，並且其光散射作用引起的混濁導致了對整個光的減弱。對於包含有上述成分的紫外光劑量測定標準乳化液，需要化學惰性的和紫外透光的乳化劑和乳化的液體，特別是多氟羧酸鹽類和多氟烴類或者它們的衍生物。
為了調整劑量測定溶液以便與不透明生物溶液的吸光度和濁度相匹配，首先，在滅活時所用的光波長下測量這種不透明生物液體的吸光度(也即是它的濁度值)。然後，最好用過濾的方法除去這種生物溶液中的混濁組分，再在滅活時所用的光波長下測量這時的吸光度(也即非濁性吸光度)。製備出在光滅活時所用波長下其吸光度與非濁性吸光度相匹配的劑量測定溶液。優選這種劑量測定溶液的粘度值也和已經去掉其混濁組分的生物溶液的粘度值相匹配。這種劑量測定溶液的配製方法在前面已有詳細描述。隨後，如前述部分所描述的那樣，將一種引起混濁的組分加入到溶液中，以使得在所用的滅活波長下這種劑量測定溶液的吸光度和濁度相匹配。更進一步的對這樣的劑量測定溶液進行校正的細節，以及本發明的優選實施方式，請參見實施例4和實施例10。
根據一種確定滅活不透明生物溶液中微生物所需要的有效光輻照劑量的方法的優選實施方式，大約100％，優選80％，更優選60％，更優選50％，更優選30％或更少的入射輻照在沿著光程的方向被吸收掉。
根據另外一個優選的實施方式，規定通量可按照上面的描述進行調整。優選該方法進一步包括有，在確定輻照劑量測定時，監測發自一個或者多個光源的光強度。更優選所用的光源在紫外光範圍之內。在上面的描述中對該監測裝置也有介紹。
優選在一種確定滅活不透明生物液體中的微生物所需的有效光輻照劑量的方法中進一步包括，如前所述，在對輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進行輻照之前和之後、或者之前、期間和之後，通過滴定所述存活微生物的數量來確定劑量分布。在另一個優選實施方式中，生物學上的有效輻照劑量(光通量)可以用生物劑量測定的方法進行測定，最好是用如前所述的化學劑量測定方法和生物劑量測定方法的組合進行測定。更優選這種方法還包括，為了確定如前所述的輻照劑量，對在輻照過程中發自一個或者多個光源的光強度進行監測；更優選輻照光在紫外光區，最好是在紫外光C區。
優選劑量測定溶液是指前面詳細描述的溶液。
更優選地，這種劑量測定溶液含有稀釋後的碘化鉀/碘酸鉀感光計，或含有稀釋後的碘化鉀/碘酸鉀聚乙烯吡咯烷酮感光計，或者含有稀釋的過二硫酸鉀/叔丁醇感光計。
進一步優選這種劑量測定溶液中還可以含有前述的可以引起混濁的物質。這種劑量測定溶液最好被調整到在光滅活波長下其吸光度，或者吸光度和濁度，或者吸光度和粘度以及濁度與生物液體相同，如同前述的和實施例4和10中所描述的那樣。
可以用於本發明的方法的微生物如前面部分所描述。
優選確定滅活不透明生物溶液中微生物所需有效光輻照劑量的方法與前面介紹的至少一種消毒或滅菌方法聯合起來進行。更優選這種生物液體如上所述含有至少一種添加劑以減少液體中生物活性成分的破壞和喪失。更優選該方法如前所述在有液體去垢劑處理的情況下進行。
根據本發明的方法，有效輻照劑量是指前面所定義的輻照劑量。
更優選該方法在流通式反應器中進行，優選在流通式反應器中，包括用來自單個或者多個光源的有效輻照劑量的單色或多色光對生物液體進行輻照；其中有效輻照劑量依據上述方法和實施例3、5、16和17所詳述的方法進行確定。
另外，本發明的另外一個方面是，提供了一種滅活不透明生物溶液中微生物的方法，包括，用發自單個或者多個光源的單色或多色光以有效光輻照劑量對生物溶液進行輻照，其中有效光輻照劑量根據前述的方法進行測定。這種方法可以在任何一種類型的輻照反應器中進行，優選在間歇式或者流通式反應器中進行(參見實施例3至6、12、13以及15至17)。
優選在確定光輻照有效劑量和滅活方法中，用到了一種帶有封套恆溫器包裹的一個或者多個光源的紫外光滅活流通式反應器，通過該封套恆溫器包層，一種恆溫並基本透明的液體通過流動來移去來自輻照燈的熱量，從而保證幾乎不變的燈光強度。優選這種流通式反應器選自下面這些重力驅動的產薄膜型(gravity-driven thin＝film-generating type)、渦流主動混合流型(turbulent actively mixed flow type)、離心驅動的產薄膜型(centrifugally driven thin-film-generating type)、盤管型(coiled tube type)、擋板管狀型(baffled tube type)、靜止混合管狀型(motionless mixer tube type)、渦流靜止性混合流管型(turbulent statically mixed flow-tube type)、層疊管型(laminar-tube type)，渦流管型(turbulent flow-tube type)。所有這些將在下面詳細描述。
本發明的另外一個方面還提供了紫外光滅活流通式反應器，在這種反應器中，一個或者多個光源被封套恆溫器所包裹，通過該封套恆溫器中的恆溫的基本透明液體的流通移除輻照燈發熱所產生的熱量，優選過量的熱量，從而確保一種基本上不變的光強度優選該液體薄膜應當是一種生物液體薄膜。更優選從一個或者多個光源發出的光線用來滅活這種生物液體。優選該封套恆溫器是包含或者由紫外半透光的、抗紫外線的、基本上化學惰性石英玻璃組成，更優選硼矽玻璃，以及半透明、抗紫外線並且基本上化學惰性的聚合物如含氟聚合物。
本發明中所提到的過量發熱優選是在反應器中尤其是反應器光路經上，任何足以將生物液體加熱到一定溫度的熱能或者紅外能量，該溫度對生物液體中的有效生物活性產生不良作用或者生物活性喪失以及使其中的組分產生不可逆變性失活。該溫度可以取決於液體的組成和是否存在穩定劑。對大多數酶和凝結蛋白質來說，將生物液體加熱到大約37℃的最佳生理溫度，就有可能產生不利變化和損失。更優選過量發熱是指反應器中的生物溶液的溫度，在該溫度下大部分的未經穩定化的血漿蛋白會發生聚集，也就是說大約55到60℃或者更高的溫度。過熱果汁等溶液會發生變味。
根據本發明，這種流通式反應器最好是選自下面這些如上所述的反應器重力驅動產薄膜型如Dill輻照器、盤管型(Bayha 1951)，擋板型或者其他含有靜止混合元件的管狀型、渦流靜止混合流管型、層疊管型、渦流管型。
根據本發明，這種流通式反應器提供了一種穩定的燈光強度以確保在輻照過程中的接近恆定的輻照能，從而減少本技術領域所知的反應器的輻照波動(參見實施例7、8和13)。更進一步的穩定燈光輻照的方法包括調整電壓(Cortelyou等，1954)，其可以和其他恆溫方法聯合使用。如同本發明的介紹，流通式反應器中引入的光源的直接恆溫方案能同時保證金本上恆定的燈光強度和移除產生的熱，優選移除產生的過量熱量。優選使用純水(蒸餾水或去離子水)或者任何其他透光性的、對光不敏感的、無毒、不燃的液體來實現恆溫。優選依據測得的與輻照燈預期溫度的偏差，對恆溫器封套中的恆溫溶液溫度或者流速進行調整，這樣，依據輻照燈實際溫度和目標溫度之間的差異，可以對輻照燈的冷卻程度進行調節。
優選光源也可以用於其液體深度大於光穿透路徑深度的反應器，如攪拌間歇式反應器，或者主動或被動混合流通式反應器。
根據本發明的一個流通式反應器的優選實施方式，有兩種使用液體使低壓金屬蒸汽燈恆溫的模式，圖14a和14b描繪了相應設計的橫斷面。使用液體對整個輻射輻照燈表面進行恆溫，可以最大程度避免金屬蒸汽在較冷的一些點上的聚集，其使用了現有的金屬熱管冷卻系統(Benesi，1956)，並且防止通風式冷卻系統產生的灰塵在輻照燈上的留存(美國專利6,586,172)，從而可以確保輻照燈壁溫度的均勻分布。
在圖14a中，管形輻照燈被(A)一個內置的包層管(B)和一個外部的包層管(C)所圍繞，優選它們同心安裝並且置於在光滅活波長下透光性足夠的材料構成。在輻照燈(A)和內包層管(B)之間，有一個間隙(D)，該間隙一般充滿氣體或者什麼都不含，可以對該間隙的寬度進行調整以優化足夠透光的液體(E)的恆溫效率。液體通過流經內包層管(B)和外包層管(C)之間的間隙，避免對生物溶液的過度加熱。可以對包含液體(E)的間隙的寬度進行調整，以確保依據需要對產生的熱量進行最有效的移除。這樣的設計對於美國專利申請2003/0049809 A1描述的螺旋管流通式反應器來說更為適用，在這種反應器中，優選同心管形流體管直接或者非常接近地和輻照燈包層貼附。這種設計也適用於高光強度汞合金燈，這種燈能產生三倍於平常的低壓汞燈的UV-C(a253.7nm)表面輻照。然而，在大約燈壁最佳溫度的80℃附近，需要對生物液體在這麼高的變性溫度下提供一定的保護，這種保護可以通過優化間隙(D)寬度而實現，此寬度可以決定熱量被轉移到恆溫液體(E)中的效率。
在另一項優選實施方式中，圖14b所示，提供了一種去掉內包層管和空氣間隙的簡化設計，這樣就可以依靠在輻照燈(A)和外包層管(C)之間流動的液體(E)，而實現對輻照燈(A)的恆溫效果。如果對輻照反應器的足夠絕熱距離能避免對待處理的生物液體進行過度加熱，這種設計對於在輻照燈壁溫度40℃下發射最大UV-C區(253.7nm)表面輻照的低壓汞燈來說尤為適合。
更優選地，如果用一種流動的液體來對用於反應器的光源進行恆溫，那麼在幾乎不變的燈光強度並且不對樣品進行過度加熱的條件下，可以安全而溫和地操作重力驅動產薄膜型反應器如Dill輻照器及其衍生類型、螺旋管式或者螺旋管包層輻照器。更優選這種對光源的流動液體式恆溫方案也可以用於其他液體深度大於光穿透深度的反應器，如攪拌間歇式反應器，或者主動或被動攪拌流通式反應器。
任何給定的紫外輻照劑量可以測量為用mJ/cm2。輻照劑量是指在整個過程中總的輻照燈功率。然而，總的輻照劑量中只有一部分是有效輻照，有效輻照可以用化學劑量測定法或者通過對噬菌體的滅活試驗而得出。例如，一個30升的間歇式反應器需要的輻照燈劑量比有效靶輻照劑量高1000倍。如前所示，用化學劑量測定法對有效輻照劑量進行確定也可以得出輻照時間。在輻照燈功率發生微小變化的情況下，輻照劑量可以取代輻照時間。這可以通過記錄在對標準劑量測定溶液進行輻照試驗的過程中輻照燈強度而測定。殺滅病毒的有效靶輻照劑量確定後，將在整個輻照過程中強度計數累計起來，可以得出對應於有效靶劑量的輻照劑量靶輻照燈劑量。通過控制輻照燈劑量這一過程，可以對輻照燈功率的變化進行補償，並且提高該方法的準確度。
本發明的另外一個方面是提供了一種通過控制發自單個或多個光源的單色或多色光的輻照總劑量以有效滅活間歇式反應器中存在於生物液體中的微生物的方法，包括如下步驟[151]a)基於滅活生物液體中的微生物時的單色或多色光的有效輻照劑量，確定取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量、在間歇式反應器中有效滅活微生物所需要的光輻照劑量速率和輻照時間；[152]b)在滅活間歇式反應器中生物液體中的微生物期間，記錄光輻照劑量速率和輻照時間；[153]c)基於步驟b)的測量，計算取決於吸收的輻照源光輻照總劑量； d)將步驟c)中測得的取決於吸收的輻照源光輻照總劑量與步驟a)中得到的取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量進行比較；和[155]e)一旦步驟c)中測得的取決於吸收的輻照源光輻照總劑量等於或大於取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量，則中斷對生物液體進行曝光。優選繼續進行該方法，直到取決於吸收的輻照源光輻照總劑量基本上等於取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量，而不管輻照光劑量速率的變化和/或中間至少一個或者多個光源的突然關閉。更優選用以上詳述的方法確定有效輻照劑量。進一步優選用至少一種電子輻射計、至少一種圖表記錄器和/或至少一種計數器(sum counter)來記錄輻照光劑量速率和輻照時間。
實施例7，8和15描述了這種方法的一個優選實施方式。優選該方法還考慮到了輻照波動。
優選靶光輻照總劑量可以按如下方法確定首先，用具有不同的吸光係數的不同標準劑量測定溶液對間歇式反應器進行驗證，以測定有效輻照劑量速率(以mJ/cm2/min計)、輻照光劑量速率(以mJ/cm2/min計)、達到給定有效輻照劑量所需要的輻照時間。如前所述，優選用化學劑量測定法來確定滅活生物液體中的微生物時，所用的單色或多色光的有效輻照劑量。然後，如同下一段詳細描述的那樣，對光輻照劑量速率和輻照時間進行監測。當整個輻照過程中的輻射計總信號的增加時，計算取決於吸收的輻照源光輻照總劑量。總的說來，因為輻射計傳感器所接收到的紫外光實際上不因任何介質吸收而減弱，因此光輻照劑量速率要在數量級上大於化學劑量速率。對於給定的在生物液體中取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量來說，其輻照時間乘以取決於吸收的輻照源光輻照劑量速率，即得出作為輻照參數的取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量。
優選使用標準儀器如至少一種電子輻射計、至少一種圖表記錄器、以及至少一種計數器，按照如上所述以及實施例7和8所述的方法，來記錄光輻照劑量速率和輻照時間。輻照燈功率(光輻照劑量速率)可以連續性地監測，並且對信號進行顯示或者記錄。待處理液體最好不要阻擋光源和輻射計傳感器之間的通光程，如此，則液體不會減弱光的強度。如果由於設計上的局限性而不能避免這種對光強度的減弱，則優選需要在液體被輻照之前和之後，對沒有減弱的輻照燈的光強度進行測量，以便能計算出平均光強度。電子輻射計優選含有一個對位移不敏感(drift-insensitive)的光電輻射計傳感器。這種記錄使得在輻照時間的過程中，以光輻照劑量速率的測量為基礎，而計算出取決於吸收的輻照源光輻照總劑量。即便輻照發生波動或臨時被打斷，這樣的設計也仍然可以對生物溶液所接受到的取決於吸收的輻照源光輻照總劑量進行計算。在一個優選的實施方式中，通過對取決於吸收的輻照源光輻照總劑量和取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量進行比較，從而可能確定或者甚至期望在哪個時間點終止輻照滅活反應，以便確保生物液體基本上接受到有效輻照劑量而滅活其中的微生物，與此同時，優選本方法還可以確保這種生物液體基本上不會因為受到過度輻照而受到影響。為了實現這一目的，行使對取決於吸收的輻照源光輻照總劑量和取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量進行比較的功能的手段，可以和一個開關相聯接，該開關可以關掉用來輻照生物溶液的光源。除此之外，在本技術領域內也有其他有效地中斷對生物溶液進行輻照的合適的方式。
優選該方法持續進行，直至取決於吸收的輻照源光輻照總劑量基本等於相應的取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量，即便光輻照劑量速率發生變化並且/或者至少一個或多個光源其間發生關閉。這種取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量也可以由在通過多種不同物質測定的取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量之間進行內插法而推導出來。這一方法在實施例6和7中有詳細描述。
和流通式輻照方法相比，間歇式輻照有這樣的優點，即其整個間歇體積在攪拌下受到平均光強的輻照，一直到所有的微生物都被有效地滅活。(Brooks，1920)[161]間歇式輻照反應器可以包含一個待處理溶液用容器，該容器可以是至少一部分使用在光滅活致病微生物波長下基本上足夠透光的材料製成，並且用設置在外面的光源對該容器進行輻照。或者該容器所裝液體可以用安裝在該液體表面之上的光源照射，也可以用浸入該液體的光源進行照射。整攪拌個體積的溶液，從而保證所有的溶液組分暴露於基本上有效並且均一的光滅活致病微生物的輻照光下。由於沒有合適的驗證和控制方法，直到現在這類裝置還沒有得到實際應用。
優選外部光源將光線輻照到輻照容器內，以便待處理吸光性溶液不會阻擋輻照燈傳感器，並且傳感器受到基本上不衰減的光的輻照，輻照燈的燈強度測量最好是連續進行。輻照劑量測定靶燈輻照劑量(the radiometric target lamp dose)隨著蛋白溶液的吸光度以線性比率增加。在較低光強度下工作的輻照燈需要更多的輻照時間來達到輻照劑量測定靶燈輻照劑量。
下述實施例闡明了本發明的具體實施方式
，但不以任何方式限制本發明的保護範圍。
實施例1高度稀釋的碘化物/碘酸鹽感光計溶液的吸光係數和碘化物/碘酸鹽感光計溶液的劑量測定響應[164]將含有0.24M KI和0.04M KIO3的0.01M，pH 9.25的硼酸緩衝溶液，用0.01M硼酸緩衝溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6和0.8倍，並且在0.1mm比色杯中測量吸光度。圖1顯示吸光係數與濃度成線性比(a253.7＝69/cm×稀釋因子)關係。
將1升含有10g聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90；平均摩爾量360000Da)的0.01M硼酸緩衝溶液和1升含有50g PVP K25(平均摩爾量29000Da)的0.1M硼酸緩衝溶液用相對應的硼酸緩衝溶液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8倍，並且在Schott 0.40mm Ubbelohde毛細管粘度計中於22.8℃下熱態測量稀釋液和緩衝液粘度。從圖2可以看出，粘度隨濃度以非線性比增加。
在0.1M，pH＝9.25的硼酸緩衝溶液中，分別製備出十進位吸光係數a253.7＝2.5/cm且粘度為1cp的劑量測定溶液(0.00852M KI+0.00142M KIO3+1.543g PVP K25/L)、a253.7＝4.5/cm且粘度為1cp的劑量測定溶液(0.01548M KI+0.00258M KIO3+1.543g PVP K25/L)、a253.7＝7.5/cm且粘度為1cp的劑量測定溶液(0.02591M KI+0.00432 M KIO3+1.543gPVP K25/L)，以及a253.7＝10/cm且粘度為1.25cp的劑量測定溶液(0.03478M KI+0.00580M KIO3+1.916g PVP K90/L)，使用如在實施例18中和以上描述的方法，通過在校準器中用薄層比色杯(0.5mm相當於2.5/cm；0.2mm相當於4.5/cm，7.5/cm和10/cm)中的曝光增量記錄校準曲線。使用Morowitz校正因子(Morowitz 1950)來校正含有樣品溶液的薄層比色杯的自吸收。圖3描述了2.5/cm樣品溶液的校準曲線，而圖4描述了4.5/cm、7.5/cm和10/cm樣品溶液的校準曲線。
實施例2在螺旋流通式反應器(helical flow-through-reactor)中的輻照有效劑量確定[167]將裝配了在23mm直徑套筒內11W的UV-C燈的水箱紫外線消毒用浮動浸泡燈(微浮沉子1/0，Aqua Concept有限公司，卡爾斯魯厄，德國)倒置安裝，並且將一個帶卷直徑7/8英寸(2.22cm)、17.5cm長、5mm筒徑和0.63mm壁厚的含氟聚合物盤管，(美國賓夕法尼亞州普利茅斯米挺市Markel公司製造，材料為義大利Bollate市Solvay Solexis S.p.A.公司生產的Hyflon MFA)緊緊纏繞在燈的周圍，使得15cm照射長度被盤管完全利用。當在劑量測定測量開始以前和結束後用去離子水衝洗掉盤管時，使用安裝在盤管中段的帶有日光遮蔽UVC-TLB探測器的Dr.Groebel UV-Elektronik RM-12輻射計核對燈強度。使用一個具有ISM719三滾子泵頭部和壁厚5mm ID×1.5mm壁厚矽橡膠管的Ismatec BVP蠕動泵，以100、200、300、400、500和600ml/min的流量將樣品溶液經由盤管反應器(coiled tube reactor)泵出，並且由367nm處0.2mm比色杯吸光度得到的校準曲線讀出劑量。
表1
UV劑量對回流速率的相關性(＝駐留時間，min/ml)呈線性關係，相關係數R2＞0.999。
實施例3對人血清白蛋白和a1-抗胰蛋白酶進行輻照以用於MFA盤管內基於化學劑量測定和生物劑量測定的病毒滅活[169]用20mM磷酸鹽緩衝的0.15M NaCl溶液(磷酸鹽緩衝鹽水，PBS)稀釋人血清白蛋白(20％)，並且噬菌體Phi-X174溶菌液(～1×109噬菌斑形成單位(PFU)/ml)以1∶100(V/V)的摻入比率添加，得到吸光係數a253.7＝7.5/cm且粘度為1.05cp的蛋白質溶液。該溶液經由如在實施例2中描述的MFA盤管泵出。按照實施例2的方法測量輻照強度(平均強度為11.40mW/cm2)。通過滴定寄主細菌進行連續的十進位稀釋後，確定0.9mL樣品溶液的Phi-X174滴度。從具有至少10個高達200個溶解噬菌斑的陪氏培養皿上計算出滅活率。矯正施用劑量用於輻照強度(輻照度/劑量測定)比率。
表2
從相應的噬菌體滴度可以看出，隨劑量的滅活率達到-0.3369 log10pfu/(mJ/cm2)。
從血漿純化得到人a1抗胰蛋白酶(a1蛋白酶抑制因子，ARALAST)，並且稀釋至吸光係數a253.7＝4.5/cm。噬菌體摻入比率是1∶100(V/V)。平均輻照強度是11.45mW/cm2。矯正施用劑量用於輻照強度(輻照度/劑量測定)比率。抗胰蛋白酶活性通過嗜中性彈性蛋白酶抑制試驗確定。
表3
可見，通過應用流通式(flow-through)輻照工藝用化學劑量測定和生物劑量測定，可以確定完全滅活靶微生物的最低劑量。
實施例4對蘋果汁進行輻照以用於在MFA盤管內基於化學劑量測定的UV巴氏消毒[173]購買巴氏滅菌的蘋果汁(a253.7＝10.1/cm，η＝1.25cp)。麵包酵母(Saccharomycescerevisiae釀酒酵母)是新購買的食品級，並且用100mg新鮮的麵包酵母接種50mL蘋果汁，於37℃下培養3h。該巴氏滅菌蘋果汁中摻入酵母懸浮液(9.5ml懸浮液摻入950mL汁中)，並且以100、150和200ml/min的流速輻照。平均輻照強度是11.46mW/cm2。由實施例2得到的結果插入用於150ml/min的劑量。矯正施用的劑量用於輻照強度(如同實施例2中的輻照度/劑量測定)比率。在環境光下滴定橙色血清瓊脂中的酵母細胞，並且通過50ml未受輻照與輻照汁液37℃下培養72h的發酵試驗測定殘餘的感染性。評價未受輻照的和輻照樣品的香味(中性＝巴氏滅菌蘋果汁)。
表4
從結果可見，通過化學劑量測定可以精確地評價出大於40mJ/cm2的較高劑量對於使對UV-C高度吸收的蘋果汁中大於5log10cfu/ml麵包酵母失去活性來說是必需的。
實施例5使用劑量測定和生物劑量測定用於評價產生泰勒渦流(Taylor vortex)的流通式反應器(flow-through-reactor)流動。
用多至六個低壓水銀燈從側面照射裝配有外石英管(7cm內徑，2.7mM壁厚，13.2cm高)和旋轉的同心內不鏽鋼圓柱(直徑54.85mm)、總容量196.1ml的泰勒旋渦反應器(Taylorvortex reactor)，每個低壓水銀燈安裝在浸沒於同心環形水浴中的石英套筒內，該水浴具有同心內石英窗，並且後面裝配有不鏽鋼反射鏡。向上經過垂直安裝的槽的液體流速可以通過Watson-Marlow 505 U蠕動泵調節。圓柱轉速也可調整。來自恆溫器的冷卻水經由輻照燈封套水浴泵出，以保持燈溫和UV-C輸出基本上恆定。每次改變實驗參數之後，在抽出樣品之前經由槽泵出5個槽體積。
改變流速，同時保持轉速恆定在60rpm。通過實施例2給出的樣品溶液測量UV劑量。在60rpm下，用6個輻照燈測量表5中顯示的下述劑量
表5
在駐留時間(＝1/流速)和劑量之間的相關性是非線性的，表明低流量和高轉速下主動增加的駐留時間分散(如同美國專利6,576,201中的描述，圖7)。
實施例2的樣品溶液(a253.7＝10/cm，h＝1.25cp)是經由槽泵出，並且用6隻輻照燈照射，流速保持恆定，同時改變內圓筒轉速。其結果顯示於表6中。
表6
實施例2的樣品溶液(a253.7＝7.5/cm，η＝1.25cp)是經由槽泵出，並且用6隻輻照燈照射，保持流量恆定在192ml/min，同時改變轉速。然後輻照如在實施例3中描述的摻入細菌-噬菌體的白蛋白溶液，並且測定噬菌體滴度。其結果顯示於表7中。
表7
在改變流量並恆定轉速在60rpm情況下，經由泰勒槽泵出相同的樣品溶液。測量劑量，得出劑量與駐留時間成線性相關。然後輻照如在實施例3中描述的摻入細菌-噬菌體的白蛋白溶液，並且測定噬菌體滴度。在劑量測定和噬菌體輻照期間，測量這6隻輻照燈的平均輻照強度，計算輻照校正因子。其結果顯示於表8中。
表8
在輻照噬菌體期間測定劑量時，需要通過輻照校正因子乘以測定的劑量以計算有效劑量，該輻照校正因子確定是1.011。
表9
從顯示於表9中相應的噬菌體滴度可以看出，得到了-0.2(log10pfu/mL)/(mJ/cm2)的隨劑量的滅活率。
用樣品溶液(a253.7＝2.6/cm，η＝1cp)和僅2隻輻照燈進行類似的實驗。然後輻照相同吸光度和粘度的摻入噬菌體的白蛋白溶液。該輻照校正因子(噬菌體溶液/劑量測定)是0.988。其結果顯示於表10中。
表10
基於相應樣品溶液的劑量測定，用摻入噬菌體的白蛋白溶液(a253.7＝4.5/cm，η＝1.05cp)，在恆定流量192ml/min並且內圓筒轉速可變的情況下進行類似的實驗。在此，從離開槽(由於駐留時間較短，該槽具有較低的劑量)的前面體積中抽出附加的樣品。其結果顯示於表11中。
表11
從通過化學和生物學的劑量測定組合得到的結果可見，可以組合應用這些方法測量出駐留時間分散(如同美國專利6,576,201中的描述，圖7)。
實施例6使用化學劑量測定、生物劑量測定和輻照測量的間歇反應器的有效性[186]一種大規模微生物滅活用光照滅活反應器，其具有一圓柱形石英管(25cm內徑，5mm壁厚，75cm長度)、一平頂蓋和一不鏽鋼滾花的凸出底部，並且裝配有裝填和取樣閥，一套包含三個三槳葉葉輪的堆疊式葉輪攪拌器，並且每個外槳葉邊緣有一刮水片。該反應器四周環繞著10盞水恆溫的UV-C輻照燈(Philips TUV 55W HO)，輻照燈安裝在如在實施例18中描述的輻照燈箱內，每個輻照燈都用Dr.Groebel UVC-SE輻射計傳感器監控。此反應器最大容量是30L。使用輻射計傳感器將每個輻照燈的輻照功率記錄在圖表記錄器上，並且將首次使用的相對輻照功率歸一化地設定為100％。
在30L光照滅活反應器中，在用吸光度和粘度相同的樣品溶液校準劑量測定後，輻照摻入噬菌體Phi X 174的白蛋白溶液(a253.7＝7.1/cm，η＝1.05cp)。攪拌的速度設定為90rpm。如此確定了1.1634mJ/cm2的劑量率，並且每隔2min 8s抽出噬菌體滅活樣品，直到17min 4s，即，劑量增加量為2.48mJ/cm2，直到大約20mJ/cm2的靶劑量。同時地從底部和頂部取樣閥抽出樣品以研究混合的均一性。其結果顯示於表12中。
表12
由大於10pfu/0.9ml_的噬菌體滴度，確定了-0.3940log10pfu/ml)/(mJ/cm2)的最高滅活率和-0.3912log10(pfu/mL)/(mJ/cm2)。-0.3926log10(pfu/ml)/(mJ/cm2)的平均隨劑量的滅活率顯示出優良均一性和有效的混合，並且顯示出與實施例3的-0.3369 log10pfu/(mJ/cm2)以及實施例4的大約-0.2log10pfu/(mJ/cm2)流通式滅活率相比較較窄的劑量分布。相比未衰減的-0.44log10pfu/(mJ/cm2)噬菌體滅活率，由於混合最有效，分批輻照顯示最均一和均勻的微生物UV-C燈曝光。
一種實驗室規模的微生物滅活用光照滅活反應器，其基本上由一具有平麵塑料頂蓋的圓柱形石英容器(7cm內徑，3mm壁厚，13cm高)和一凸出的塑料底部組成，該塑料頂蓋上有取樣閥，並且反應器裝配有具有近壁刮水片(2個葉輪，攪拌速度可調)的堆疊式葉輪攪拌器，用兩個10W低壓水銀燈從側面照射該反應器。該反應器最大容量是450ml。用數字式雙重傳感器-輻射計(Dr.Groebel UV-Elektronik RM21，具有UVC-SE傳感器)將照明強度記錄在計算機上。由生物劑量測定取樣時間間隔乘以化學劑量測定劑量率而得到的輻照劑量增量，再除以在劑量測定校準期間得到的輻照劑量率，計算出在生物劑量測定輻照期間的劑量增量。
在450mL的光照滅活反應器中，按照實施例2的做法，在用相同的樣品溶液進行劑量測定校準後，輻照與實施例3相同的摻入噬菌體的抗胰蛋白酶溶液。劑量率是2.5989(mJ/cm2)/min，並且每隔1min 1s抽出樣品，直到17min 4s。在20mJ/cm2的劑量下，彈性蛋白酶抑制的活性是未輻照溶液的97％。其結果顯示於表13中。
表13
-0.4406log10(pfu/ml)/(mJ/cm2)的隨劑量的滅活率顯示出優良的均一性和有效的混合，並且狹窄的劑量分布顯然引起了與實施例3中描述的直流法的17.34mJ/cm2相比較的下降，下降了-5.53log10pfu/ml，甚至為12.24mJ/cm2。
實施例7通過組合使用化學劑量測定和輻照測量確定30反應器的取決於吸收的輻照源靶光總劑量以確保燈故障下安全可靠的工藝[192]對實施例5中描述的30L反應器(只是裝配了9個帶有反射鏡的可分別地換向恆溫輻照燈)用10種不同的樣品劑量試液和4個輻照燈(a253.7＝3/cm至12/cm，以1/cm增加，η＝1.15cp)驗證，以確定有效劑量率((mJ/cm2)/min)、光輻照劑量率((mJ/cm2)/min)和有效劑量20mJ/cm2必需的照射時間。用電子輻射計監控輻照燈輻照強度並且用圖表記錄器做記錄，並且安裝計數器用來計算在輻照期間來自所有輻射計的信號的總數。當輻射計相加信號隨照射時間增加時，計算出取決於吸收的輻照源光總劑量。輻照光劑量率呈數量級地高於化學劑量率，因為輻射計傳感器接受到實際上未被任何吸收介質衰減的紫外線。用於溶液中有效的給定靶劑量的照射時間例如20mJ/cm2，乘以輻照光劑量率，以計算出取決於吸收的輻照源靶光總劑量，作為輻照參數。其結果顯示於表14中。
表14
由表14可見，輻照燈的取決於吸收的輻照源光總劑量與吸光度線性相關，可用公式Hlamp＝5058.9×a253.7-1413表示，相關係數接近於1，R2＝0.9972。取決於吸收的輻照源靶光總劑量，其本身與強度的任何變化無關，所以對於可靠的輻照工藝來講是理想參數，保證了施用合適的靶劑量。該輻照工藝通過取決於吸收的輻照源光總劑量控制，控制方式是一達到預定的取決於吸收的輻照源靶光總劑量，就關掉輻照燈以終止輻照，其中將靶光總劑量增加至每次吸收都在有效範圍內。
實施例8模擬輻照在取決於吸收的輻照源靶光總劑量控制的輻照工藝期間燈關閉以及正確的在溶液中有效的靶劑量的驗證[194]按照在實施例5中描述的方法輻照30L反應器的樣品溶液(a253.7＝8/cm，η＝1.15cp)。在四個輻照燈之一關掉10min後，並且輻照燈要麼被打開不同的燈替代、要麼不持續輻照並且僅用3隻輻照燈，進行兩次實驗。通過化學劑量測定，測定輻照光劑量率，並且一達到由實施例6中描述的有效性公式計算出的取決於吸收的輻照源靶光總劑量Hlamp＝39058mJ/cm2，就關掉輻照燈，並且抽出樣品以測定溶液中有效的劑量。
在用另一個燈替代輻照燈10min後做的第一次試驗，16min 43s後達到取決於吸收的輻照源光總劑量，並且樣品溶液中測得的劑量是19.7mJ/cm2量。第二實驗沒有輻照燈替代物，19min 55s後達到取決於吸收的輻照源光總劑量，並且樣品溶液中測量的劑量是19.9mJ/cm2。
以達到預定的取決於吸收的輻照源靶光總劑量所需的時間作為照射時間，從該照射時間後測量的有效劑量可見，取決於吸收的輻照源靶光總劑量控制的工藝甚至不靈敏，並且在輻照期間對燈關閉有強烈抵制，因為取決於吸收的輻照源靶光總劑量確保了應用恰當的有效劑量。
實施例9調整樣品溶液以與具有高分子和低分子吸光度的混濁流體的吸光度和濁度相匹配[197]將自然混濁的蘋果汁濾過0.22μm注射濾過器。在253.7nm處未過濾的蘋果汁吸光度是18/cm，而過濾的澄清蘋果汁僅為10.4/cm，二者粘度皆為1.25cp。
在與過濾蘋果汁吸光度和粘度(a253.7＝10.4/cm，η＝1.25cp)匹配的碘化物/碘酸鹽/PVP樣品溶液中，添加膨潤土以匹配混濁蘋果汁的混濁度。濃度2g膨潤土發現增加混濁度7.6/cm。其結果顯示於表15中。
表15
如同圖5中描述的校準曲線表明，混濁溶液的靈敏度僅有輕微降低，這裡吸光度和混濁度使用的都是Morowitz校正因子(Morowitz1950)。對於吸光係數2.6/cm並且粘度1cp(＝1.543g PVP K25/L)的溶液，添加2g膨潤土/L達到總吸光度9.3/cm。如圖5所示，校準曲線中還沒有相應的差異。將100ml澄清和混濁的樣品溶液在一個攪拌的4cm石英試管中進行輻照，該試管插入如在實施例5中描述的相同的中相同燈罩內，用2隻相面對的輻照燈或者1隻輻照燈照射。在40min照射時間期間每4分鐘抽出1ml試樣。在每次輻照期間記錄輻照燈強度，18/cm溶液的第二次輻照照明強度是10.4/cm溶液的第一次輻照的1.0416倍，並且9.3/cm溶液的第二次輻照照明強度是2.6/cm溶液的第一次輻照的0.9928倍。理論上取決於吸光係數倒數1/a的劑量率未顯示出如下預期差異100％對應於10.4/cm並且57％對應於18.0/cm，或者100％對應於2,6/cm並且28％對應於9.3/cm，但替代的差異是(用2隻輻照燈)1.748(mJ/cm2)/min對應於10.4/cm並且1.603(mJ/cm2)/min除以1.0416等於1.539(mJ/cm2)/min，對應於18.0/cm，即，88％對應於具有高分子吸光度的混濁溶液，而(有1隻輻照燈)3.415(mJ/cm2)/min對應於2.6/cm並且1.854(mJ/cm2)/min除以0.9928等於1.868(mJ/cm2)/min，即55％對應於有低分子吸光度的混濁溶液。這表明附加的混濁度使光散射入溶液，可通過化學劑量測定測量。
實施例10高度稀釋的碘化物/碘酸鹽感光計溶液的吸光係數、碘化物/碘酸鹽感光計溶液的劑量測定響應以及通過聚乙烯吡咯烷酮由UV-C產生的三碘化物的穩定性。
將含有0.24M KI和0.04M KIO3的0.01M，pH 9.25的硼酸鹽緩衝液，用0.01M硼酸鹽緩衝液分別稀釋至0.2、0.4、0.6和0.8倍，並且在0.1mm比色杯中測量吸光度。圖6顯示吸光係數與濃度成線性比(a253.7＝69/cm×稀釋因子)關係。
將1升0.01M硼酸鹽緩衝液中含有10g聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90；平均摩爾量360000Da)的溶液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8倍，並且在Schott 0.40mm Ubbelohde毛細管粘度計中於22.8℃下熱態測量稀釋液和緩衝液粘度。從圖7可以看出，粘度隨濃度以非線性比率增加。
製備0.01M，pH 9.25的硼酸鹽緩衝液中含有0.24M KI和0.04M KIO3的儲備溶液的稀釋液，使其在253.7nm處的吸光度為6.1/cm(0.0212M KI+0.0035M KIO3+0.95g PVP K90/L；用於從DEAE葡聚糖凝膠陰離子交換凝膠(Brummelhuis 1980)的凝血酶原複合物洗出液)，和16/cm(0.06M KI+0.01M KIO3+6.25g PVP K90/L；用於2.5％(W/V)的纖維蛋白原溶液)，並且裝入0.2mm比色杯。通過將裝滿測定溶液的比色杯放置在比色杯位置，保持限定的時間，在具有已知發光輻照度的CAMAG TLC燈(Rahn光度計測量)下，進行薄層校準。於367nm下測量吸光度。由圖8可見，吸光度隨使用的表面劑量而增加，並且靈敏度隨KI/KIO3濃度而增加。
在0.01M，pH 9.25的硼酸鹽緩衝液中含有0.06M KI和0.01M KIO3的劑量測定溶液，吸光係數a253.7＝16/cm，並且製備出「相同KI和KIO3」濃度和6.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K90/L的溶液。如上所述，通過將裝滿劑量測定溶液的0.2mm比色杯在CAMAG TLC燈下放置限定的時間而進行薄層校準。於352nm處(僅有KI+KIO3)或者367nm處(KI+KIO3+PVP)測量吸光度。由圖9可見，PVP提高了方法的靈敏度。
實施例11裝有輻照劑量測定溶液的具有固定幾何尺寸間歇式光滅活反應器中的輻照時間測定。
製備出十進位吸光係數a253.7為2.1/cm(0.0072M KI+0.0012M KIO3+0.5g PVP K90/L，用於FVIII濃縮物)、6.1/cm(參見實施例10)、10/cm(0.0346M KI+0.0058M KIO3+1.21g PVP K90/L；用於2％(W/V)免疫球蛋白溶液)和16/cm(參見實施例10)的劑量測定溶液，並且如在實施例6中描述的方法記錄校準曲線。直徑4cm石英試管裝滿100mL劑量測定溶液，在磁力攪拌器上用磁力攪拌棒攪拌，並且在2隻配備有拋光不鏽鋼反射鏡的低壓水銀蒸汽燈之間進行輻照。在預定的間隔，抽出樣品並裝入0.2mm比色杯用於分光光度測定，並且從校準曲線讀出劑量。然後劑量率計算為(mJ/cm2)/min，而劑量率倒數即為每單位劑量的比輻照時間min/(mJ/cm2)。其結果顯示於表16中。並且可以計算出用於表示吸光係數和(具體的)輻照時間之間關係的常數k1t＝k1×a表16
根據吸光係數對比輻照時間進行線性回歸計算，得到線性相關係數R2＝0.989。結果表明，基於薄膜校準的吸光度和經薄層校正的粘度匹配樣品溶液的劑量測定適合於攪拌間歇式光照滅活反應器的驗證。
實施例12在薄層和分批輻照中MWIV和Phi-X174的滅活。
來自細胞培養上清液(～108組織培養感染劑量(TCID50)/mL)的MMV儲備溶液，並且來自大腸桿菌(Escherichia coli)增殖的噬菌體Phi-X174溶菌液(～1×109噬菌斑形成單位(PFU)/mL)用20mM磷酸緩衝液0.15M NaCl(磷酸鹽緩衝鹽水，PBS)稀釋，並且分別取2.5mL，放入32mm聚苯乙烯陪氏培養皿水平振蕩，在CAMAG TLC燈下用不同的UV-C劑量輻照。用帶有日光遮蔽UV-C傳感器的Dr.Groebel RM21輻射計測定樣品表面距離輻照度，並且在分光光度計上測量的溶液自身吸光度用以校正有效積分通量(UV劑量)(Morowitz1950)。通過在寄主細胞培養物和細菌寄主上滴定，分別測定MMV和Phi-X 174滴度。其結果顯示於表17中。
表17
在100ml帶有4cm攪拌棒的石英瓶中裝入80ml摻入MMV或者Phi-X 174的蛋白質溶液(凝血酶原複合物DEAE葡聚糖凝膠洗脫液，a253.7＝6.9/cm)，放置於磁力攪拌器上，攪拌速度～250rpm，並且用CAMAG TLC燈從側面輻照。按照在實施例11中描述的方法，使用樣品溶液(a253.7＝6.9/cm)進行校準。在測量劑量率後計算出的時間間隔抽出病毒或者噬菌體滴定用樣品，並且進行滴定以測定殘存的感染性病毒或者噬菌體滴度。其結果顯示於表18中。
表18
從Phi-X174和MMV滅活率可以推導出它們在253.7nm處對UV-C光的靈敏度是相仿的。因此Phi-X174被用作生物放照量物。還可以清楚地看到，由於有效的混合方法確保了微生物向輻照區域的遷移，間歇攪拌式設備中UV-C吸收液滅活率幾乎是相同的。
實施例13使用劑量測定和生物劑量測定用於攪拌間歇式反應器的優化。
如在實施例6中描述的配備有堆疊式葉輪攪拌器(3個葉輪，可調整攪拌速度)的450ml間歇式反應器(7cm內徑，3mm壁厚，13cm高)，用兩個低壓水銀燈從側面照射，每個燈安裝在兩個同心石英管的封套內，並且在後面配備有不鏽鋼反射鏡。來自恆溫器的冷卻水經由輻照燈封套泵出，以保持燈溫和UV-C輸出常量。
將攪拌速度調節至每分鐘轉60(rpm)(慢攪拌)、150rpm(中快攪拌)和240rpm(快攪拌)。按照如在實施例11中描述的方法，測定用於輻照450ml吸光度和粘度匹配的樣品溶液的UV劑量率，該樣品溶液用於摻入噬菌體的凝血酶原複合物(prothrombin complex)洗脫液(a253.7＝8.0/cm，η＝1.15cp，0,1M硼酸鹽緩衝液中含有27.83mM KI，4.64mM KIO3，1.3g PVP K90/L，pH＝9.25)。研究發現，比在文獻中給出(0.01M)的更高硼酸鹽濃度(≥0.1M)會帶來更高的靈敏度和更好的放射量測定溶液穩定性。輻照摻入噬菌體的凝血酶原複合物洗脫液，並且按照實施例12中描述的方法測定噬菌體滅活情況。作為附加參數，通過使用醯胺水解分析法(amidolytic assay)測量0、10、15、20、25、50、75和100mJ/cm2劑量的凝血因子X(FX)活性。結果是顯示於表19中。
表19
從該實驗可見，通過樣品溶液放射量測定和生物劑量測定，可以優化病毒滅活用間歇式光照滅活反應器，因為兩種驗證方法都給出了混合有效性的結果。也明顯可以看出，在可能的對蛋白質溶液的最高攪拌速度(避免產生泡沫)下，就可以完成最快的微生物滅活。這樣優化的好處是，通過最有效的混合，在靶劑量例如20mJ/cm2處的病毒滅活安全容限達到最高，或者能夠將靶劑量降低為保存蛋白質的附加生物活性。
實施例14用於使用化學劑量測定、生物劑量測定和輻照測量的凝血酶原複合物洗脫液分批輻照的驗證和過程監控。
如在實施例6中描述的30L病毒滅活用光照滅活反應器，其帶有三個三槳葉葉輪且每個外槳葉邊緣具有刮水片的堆疊式葉輪攪拌器，四周環繞著10盞水恆溫的UV-C輻照燈(Philips TUV 55W HO)，安裝在如在實施例18中描述的恆溫器燈箱內，每個等都用Dr.Groebel UVC-SE輻射計傳感器監控。使用輻射計傳感器將每個輻照燈的輻照燈功率記錄在圖表記錄器上，並且將首次使用的相對輻照燈功率歸一化地設定為100％。
將29.5L凝血酶原複合物洗脫液與來源於E.coli的Phi X-174溶菌液(～4×109pfu/mL)摻合。所得溶液吸光係數為a253.7＝6.0/cm。使用如在實施例11中描述的吸光度和粘度匹配的樣品溶液，在病毒滅活進行試驗之前，測定反應器劑量率，該樣品溶液為在0.1M、pH＝9.25的硼酸緩衝溶液中含有20.87mM KI、3.48mM KIO3和1.304g PVP K90/L。在90rpm的攪拌速度下劑量率是1.3435(mJ/cm2)/min，並且輻照燈劑量率是第一次噬菌體輻照的98.5％。測定出用於靶劑量20mJ/cm2的輻照時間是14min，並且假定劑量率基本上恆定。為證實燈功率作為誤差源的影響，第三次輻照採用28℃至24.5℃，使燈溫較低，從而降低燈功率至大約最大功率的90％。按照實施例12中描述的方法，測定Phi-X174的滅活速率(基於假定劑量率恆定)，並且表示為(log(pfu/ml))/(mJ/cm2)。其結果顯示於表20中。
表20
由上表可見，燈功率是一個間歇輻照過程參數，並且要將劑量測定的劑量率和生物劑量測定的滅活率兩者都歸一化為燈功率。
實施例15基於由劑量測定和輻照測定得到的輻照測量靶劑量對蛋白質溶液間歇輻照的過程設計。
按照實施例6中描述的450ml光照滅活反應器用於驗證劑量率和輻照時間，輻照樣品溶液的吸光係數是6.0/cm、7.0/cm、8.0/cm、9.0/cm和10.0/cm。200rpm下攪拌450ml體積的樣品。打開輻照燈，並且通過在3、6、9、12、15、18、21和24min時抽樣樣品溶液的測量而測定劑量率。通過連接到電腦上的雙頭輻射計監控並記錄照明強度。
圖10顯示，開燈3分鐘後照明強度達到最大值，並且使用的劑量在第一個3分鐘期間低於接下來的3分鐘時段內使用的基本上恆定的劑量增量。圖11顯示了隨著Y軸表示的誤差恆定在零以下而相應的劑量增量。因此，將劑量率公式的Y軸常量加上靶劑量(20mJ/cm2)，得到校正的增加的靶劑量，通過增加的靶劑量除以劑量率而計算出輻照時間，並且計算在輻照時間內測量出的1秒間隔內的輻照強度(mW/cm2)總和，得到隨吸光係數的靶輻照燈劑量(mJ/cm2)。其結果顯示於表21中。可以計算出常量k2Q＝k2×a表21
從上表可見，輻照測量的靶輻照燈劑量隨著吸光係數以線性比(R2＝0.996)增加。
實施例16用於抗壞血酸測定作為防止光變性保護劑的UV-C吸收效果的劑量測定補償。
在FEIBA DEAE葡聚糖凝膠G50洗脫物(18.2mg蛋白質/ml)中、添加抗壞血酸鈉至濃度1mmol/L。添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液的a253.7處吸光係數是16/cm，而未添加抗壞血酸的洗脫液為7.3/cm。
對於化學劑量測定，製備出在0.1M、pH＝9.25的硼酸鹽緩衝液中含有0.0254M KI、0.0042M KIO3和1.61g PVP K90/L的樣品溶液(a253.7＝7.3cm)，以及在0.1M、pH＝9.25硼酸鹽緩衝液中含有0.06M KI、0.01M KIO3和1.61g PVP K90/L的樣品溶液(a253.7＝16/cm)，用0.2mm薄層比色杯記錄校準曲線，並且在有1盞輻照燈(a253.7＝7.3/cm，劑量率1.41(mJ/cm2)/min)和2盞輻照燈(a253.7＝16/cm，劑量率1.33(mJ/cm2)/min)的如實施例11中描述的間歇光照滅活反應器中輻照110ml樣品溶液。將110ml未添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液和添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液都進行各個劑量率的輻照，並且在5；10；15；20；25；30和35mJ/cm2處抽出樣品。按照實施例13的方法測定凝血因子X(FX)活性。結果是顯示於表22中。
表22
從上表可見，在未添加抗壞血酸和添加抗壞血酸的FEIBA洗脫液之間FX滅活速率(UFX/(mJ/cm2))沒有相關差異。因此，本身為高度UV-C吸收的抗壞血酸未發揮對FX蛋白質的光保護作用。這就表明，這樣的因添加物而增加的UV-C吸光度可以容易地通過所述吸光度匹配的化學劑量測定得到補償。
實施例17用燈強度和量子產額穩定化的以及曝光時間受控制的校準器校準輻照劑量溶液。
對於薄層比色杯中輻照劑量溶液可再現和精確的曝光量，將開槽於水恆溫夾套的比色杯安裝到單鏡頭反射式照相機門樞背板上，並且在此背板內銑出一個窗口，以便透過照相機快門曝光比色杯。照相機鏡頭卡口安裝在水恆溫的石英玻璃夾套內含有低壓水銀蒸汽燈的燈罩法蘭上。
用外循環水自動調溫器控制輻照燈恆溫溫度，在最大UV-C輸出點操作輻照燈。比色杯槽溫度設定在Rahn(1997)限定的所給碘化物/碘酸鹽光度計量子產額範圍內，並且用外循環水低溫保持器控制。該照相機快門設定為1秒曝光時間，並且使用連接到電腦音效卡擴音器塞子上的光電二極體，測定快門精度。結果發現快門維持1.000±0.002s的正常曝光時間。
對於比色杯入射窗的有效輻照度測定，將吸收完全所有入射光的0.6M碘化物/0.1M碘酸鹽的感光計溶液(Rahn 1997)裝入0.2mm的比色杯中，在自動調溫器比色杯槽內遞增曝光1、2和3s，以確保基本上恆定的量子產額。在曝光以前，將分光光度計352nm處的吸光度設定為零，並且在每次曝光步驟以後，在分光光度計上測量352nm的吸光度增加值。從吸光度增量、三碘化物濃度、從隨溫度而變的量子產額、入射光子的數量，以及從光電能量和比色杯橫截面積，計算出輻照度E。因此這樣就能由曝光時間t(秒)時的吸光度增量Dabs、比色杯表面A(cm2)和比色杯體積V(L)、光程長度d處的消光係數e(264.5相應於0.01cm)、能量W/einstein(在253.7nm處)＝471528J、以及21℃時＝0.7545的量子產額Φ(Rahn1997)，根據公式E＝(Δabs×V×W×1000)/(e×A×Φ×t)，計算出E(mW/cm2)。因此，在1s曝光時間後，0.0392的吸光度增量對應於0.9262mW/cm2的輻照度，在累積2s以後，0.0781的累積吸光度增量對應於0.9227mW/cm2，並且在3s以後，0.1170的累積吸光度增量對應於0.9215mW/cm2。平均輻照度是0.9235mW/cm2，而標準偏差是0.0020mW/cm2，表明通過電子控制快門的校準，曝光量非常精確。
將相當於UV-C吸光度a253.7＝6.5/cm並且粘度1.16cp的輻照劑量溶液裝入0.2mm比色杯，並且曝光由3s增加到75s。每次曝光量增加之後，以未受輻照溶液作為空白對照讀出吸光度增量。得到的校準曲線與二階方程相關，367nm處吸光度取決於曝光量積分通量H。
其結果顯示於表23中。
吸光度(367nm，0.2mm)＝A×H2+B×H+C表23
相關係數R2接近於1，顯示出通過電子控制快門的方法記錄的校準曲線之精確。該二階方程具有另外的優點，即對於吸收值測定例如如同在實施例18中描述的劑量率測量，可以容易地計算出差不多符合此公式的溶液。校準曲線也可以分割，並且可以計算每個部分的二階方程，以得到儘可能接近於1的相關係數R2。這種校準器實施例如圖12所示。
實施例18可用在實施例2、4-6、13和14中描述的反應器中的紫外燈溫度穩定性[226]將Philips TUV55 HO輻照燈(55W，直徑28mm，長900mm)安裝在具有不鏽鋼室(1)的輻照燈箱(圖13)內，燈箱內含有三個同心恆溫封套石英玻璃筒(3)中的輻照燈(2)，使得恆溫水流入在石英玻璃套筒(3)和不鏽鋼壁(1)間的空隙。每個輻照燈都由Dr.GroebelUVC-SE輻射計傳感器(4)監控，由PT100探針(5)測量溫度。不鏽鋼室正視圖上有石英玻璃窗，穿過該窗將UV-C燈光輻照到反應容器上。石英管內徑為30mm並且壁厚為3mm。水以6L/min的流量從循環低溫恆溫器泵出。溫度從15℃增加到30℃，並且每上升大約0.50℃間隔，測量一次光強度。其結果顯示於表24中。
表24
在27℃時達到最大光強度，該溫度作為溫和的溫度不會過度加熱產品，與冷卻水溫度必須在大約40℃的直接恆溫相反。通過增加在輻照燈表面和恆溫封套內管之間的空隙和水流量，在保證最大輻照燈UV-C強度方面，甚至更低的溫度也可以有效果。在這樣一種自動調溫輻照燈周圍，或者緊接其後，可以操作每個類型的流通式反應器或者間歇式反應器，而沒有因加熱、特別是過熱而損害產品的危險。
參考文獻表[228]Anderle H，Matthiessen HP，Spruth M，Kreil T，Schwarz H-P，Turecek PLAssessment of theefficacy of virus inactivation by UV-C treatment of therapeutic proteins.Proceedings(CD-ROM)ofthe 2nd International Congress on Ultraviolet Technologies，International Ultraviolet Association，Vienna，July 9-11，2003(CD-ROM published by and available from the International UltravioletAssociation，P.O.Box 1110，Ayr，ON，Canada NOB 1 E0，http//www.iuva.org)[229]Bayha HDie Ultraviolett-Entkeimung von Flüssigkeiten geringer Strahlen-durchlssigkeit(The ultraviolet disinfection of liquids with low radiation transmission).Zeitschrift für Hygiene 135(1952)，1-26[230]Benesi EDesign of a centrifugal filmer for the ultraviolet irradiation of liquids.GeneralMotors Engineering Journal 3(1956)，2-8[231]Bering E，Meyer HMethoden zur Messung der Wirksamkeit violetter undUV-Strahlenquellen (Methods for the measurement of the effectiveness of violet and ultravioletradiation sources).Strahlentherapie 1(1912)，189-207. Bitton G，Henis Y，Lahav NEffect of several clay minerals and humic acid on the survival ofKlebsiella aerogenes exposed to ultraviolet irradiation.Applied Microbiology 23(1972)，5870-874[233]Bolton JRUltraviolet principles and applications.EPA Newsletter 66(1999)，9-36[234]Bolton JR，Linden KGStandardization of methods for fluence(UV dose)determination inbench-scale UV experiments.Journal of Environmental Engineering 129(2003)，3209-215[235]Brauer H-D，Schmidt RA new reusable chemical actinometer for UV irradiation in the 248-334 nm range.Photochemistry and Photobiology 37(1983)，5587-591. Brooks SCThe kinetics of inactivation of complement by light.Journal of GeneralPhysiology 3(1920)169-123[237]Brummelhuis HGJPreparation of the prothrombin complex.InMethods of plasma proteinfractionation，edited by Curling JM，LondonAcademic Press，1980，p.117-128. Bowen EJThe chemical aspects of light，2nd revised edition，OxfordClarendon Press 1949[239]Cabaj A，Sommer RMeasurement of ultraviolet radiation with biological dosemeters.Radiation Protection and Dosimetry 91(2000)，1-3139-142 Caillet-Fauquet，Di.Giambattista M，Draps M-L，Sandras F，Branckaert T，de Launoit Y，LaubRContinuous-flow UVC irradiationa new，effective，protein activity-preserving system forinactivating bacteria and viruses，including erythrovirus B19.J.Virol.Meth.118(2004)131-139[241]Calvert JG，Rechen HJLPrecision actinometry at low light intensities with malachite greenleucocyanide.Journal of the American Chemical Society 74(April 20，1952)，2101-2103. Cortelyou JR，McWhinnie MA，Riddiford MSl Semrad JEThe effects of ultravioletirradiation on large populations of certain water-borne bacteria in motion.II.Some physical factorsaffecting the effectiveness of germicidal ultraviolet irradiation.Applied Microbiology 2(1954)，269-273[243]Dainton FS，Sills SAUse of nitrous oxide to discriminate between various forms ofhydrogen atoms existing in aqueous solutions of potassium iodide irradiated with ultraviolet light.Nature 186(June 11，1960)879[244]Delia Contrada JInvention could revolutionize decontamination and purification of liquids.University at Buffalo Reporter 35(27)，March 25，2004，online editionhttp//www.buffalo.edu/reporter/vol35/vol35no27/articles/PatraPumD.html，accessed May 10，2004[245]Erdmann KVersuche zur Aufhebung der koagulierenden Wirkungen von ultraviolettem Lichtund von Rntgenstrahlen auf Euglobulin mit Strahlen-Schutzstoffen.Protoplasma 45(1956).3293-314[246]Favaro G.Actinometryconcepts and experiments.InDrugsPhotochemistry andPhotostability，Special Publications of the Royal Society of Chemistry 225(1998)，295-304. FDA(Food and Drug Administration，US Department of Health and Human Services)Kinetics of microbial inactivation for alternative food processing technologies.Washington，DC2000.http//vm.cfsan.fda.gov/～comm/ift-uv.html[248]Fisher GJ，LeBlanc JC，Johns HEA calorimetric determination of the quantum yield for theionization of malachite green cyanide by ultraviolet radiation.Photochemistry and Photobiology 6(1967)，757-767. Forney LJ，Pierson JAOptimum photolysis in Taylor-Couette flow.American Institute ofChemical Engineers Journal 49(2003)3727-733[250]Gauglitz G.Modern chemical actinometry.EPA Newsletter(November 1983)，49-53[251]Gauglitz G，Hubig SAzobenzene as a convenient actinometerevaluation values for UVmercury lines and for the N2 laser lines.Journal of Photochemistry 15(1981)，255-257. Gauglitz G，Hubig SChemical actinometry in the UV by azobenzene in concentrated solutiona convenient method.Journal of Photochemistry 30(1985)，121-125. Gauglitz G，Hubig SPhotokinetische Grundlagen modemer chemischer Aktinometer(Photokinetic bases of modem chemical actinometers).Zeitschrift für Physikalische Chemie，NeueFolge 139(1984)，237-246. Habel K，Sockrider BTA continuous flow method of exposing antigens to ultravioletradiation.Journal of Immunology 56(1947)，273-279[255]Harrington WO，Hills CHReduction of the microbial population of apple cider by ultravioletradiation.Food Technology 22(1968)，117-120[256]Hiatt CWPhotodynamic inactivation of viruses.Transactions of the New York Academy ofScience 23(1960)，66-78[257]Kirk AD，Namasivayam CErrors in ferrioxalate actinometry.Analytical Chemistry 55(1983)，2428-2429. Koutchma T，Keller S，Chirtel S，Parisi BUltraviolet disinfection of juice products in laminarand turbulent flow reactors.Innovative Food Science and Emerging Technologies 5(2004)，2179-189[259]Koutchma T，Adhikari CEffectiveness of the UV disinfection of juice.IUVA News 4(2002)，521-23. Kuhn HJ，Braslavsky SE，Schmidt RChemical actinometry.Pure Applied Chemistry 61(1989)2187-210. Mack SD，Albrecht JJ.Litchfield JH.Parker MEStudies on the cold sterilization of liquidfood using mercury radiation.II.Apple juice.Food Research 24(1959)，383-391[262]Morowitz HJAbsorption effects in volume irradiation of microorganisms.Science 111(1950)，229-230[263]Oppenheimer F，Benesi E，Taylor ARThe ultraviolet irradiation of biological fluids inthin-flowing films.American Journal of Public Health 49(1959)，7903-923[264]Quails RG，Johnson JDBioassay and dose measurement in UV disinfection.Applied andEnvironmental Microbiology 45(1983)3872-877[265]Rahn RO，Stefan Ml，Bolton JR，Goren E，Shaw P-S，Lykke KRQuantum yield of theiodide/iodate chemical actinometerdependence on wavelength and concentration.Photochemistryand Photobiology 78(2003)，2146-152[266]Rahn RO，Xu P，Miller SLDosimetry of room-air germicidal(254nm)radiation usingspherical actinometry.Photochemistry and Photobiology 70(1999)，3314-318[267]Rahn ROPotassium iodide as a chemical actinometer for 254nm radiationuse of iodate asan electron scavenger.Photochemistry and Photobiology 66(1997)，4450-455[268]Rahn ROUse of potassium iodide as a chemical actinometer. Photochemistry andPhotobiology 58(1993)，6874-880[269]Rideal EK，Roberts RThe photochemistry of native proteins.Proceedings of the RoyalSociety AA205391-408.1951. Sczechowskii JG，Koval CA，Noble RDA Taylor vortex reactor for heterogeneousphotocatalysis.Chemical Engineering Science 50(1995)203163-3173[271]Schulz CR，Cervantes P，and Laplace CDevelopment of a flow-through actinometry monitorfor dose measurements in UV disinfection reactors.Conference Prooceedings(on CD-ROM)of theInternational Ultraviolet Association′s lst International Congress on Ultraviolet Technologies，Washington DC.June 15-16.2001. Wang J，Mauser A，Chao S-F，Remington K，Treckmann R，Kaiser K，Pifat D，Hotta JVirusinactivation and protein recovery in a novel ultraviolet-C reactor.Vox Sanguinis 86(2004)230-238[273]Wright HB and Sakamoto GUV Dose required to achieve incremental log inactivation ofbacteria，viruses，and protozoa.Trojan Technologies，London ON/Canada，2001. Zheleznova NV.Determination of the light flow intensity of uviol-type bactericidal lamps.Trudy lnstituta lmeni Pastera 52(1979)133-135[275]本發明附加的優點、特徵和改進對於本領域技術人員而言是很容易理解的。因此，本發明的保護範圍不限於上述細節、有代表性的設備、此處所顯示和描述的內容。因此，在不背離附後的權利要求所限定的本發明構思精神或範圍情況下，可以做出多種改進和等效替換。
在此引用的所有參考文獻，包括所有公開的內容以及所有美國和國外專利及專利申請在內，都已具體並完全地引入本發明作為參考。說明書和實施例的意圖應認為僅具有示範性，本發明的真正保護範圍和精神通過權利要求書的記載予以表明。
權利要求
1.一種用於確定從一個或多個光源發出的單色或多色光滅活生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測量所述單色或多色光對於劑量測定溶液的影響，其中所述滅活在流通式反應器中進行。
2.如權利要求1所述的方法，包括測量在所用光滅活波長下單色或多色光對於與生物液體的吸光度、或與生物液體的吸光度和粘度相匹配的劑量測定溶液的影響，上述測量是基於採用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對薄層內的劑量測定溶液進行輻照以施加一能夠導致可測量的物理量或化學量發生變化的規定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長度薄到在規定時間內只能吸收預定輻照度的入射光部分，ii)在對光輻照反應器中劑量測定溶液輻照期間或之後，讀取與這些測到的量的變化相應的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進行，反之亦然。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，沿著所述光程長度，100％或以下的所述入射光被吸收。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，沿著所述光程長度，50％或以下的所述入射光被吸收。
5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述規定通量可以通過改變規定輻照度和/或通過改變規定時間來改變，所述規定時間由流通式反應器中生物液體的流速確定。
6.如權利要求1所述的方法，進一步包括，在對輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進行輻照之前和之後，或者之前、期間和之後，通過滴定所述存活微生物的數量來確定劑量分布。
7.如權利要求1所述的方法，進一步包括在輻照過程中對一個或多個光源的強度進行監測，以確定輻照劑量。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述光在紫外區。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，劑量測定溶液包含從下列中選取的試劑或試劑組合碘化鹼金屬鹽、碘化鹼土金屬鹽、碘化銨、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸鹼金屬鹽、苯甲酸鹼土金屬鹽、苯甲酸銨、過二硫酸鹼金屬鹽、過二硫酸鹼土金屬鹽、過二硫酸銨、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤土、雲母、蒙脫石、囊脫石、鋰榮脫石、高嶺石、多水高嶺石、地開石、粘土礦物、白堊、矽石、煅制二氧化矽、重晶石、石膏、滑石、氧化鎂、氧化鋁、氯氧化鉍、氧化鋅、硫酸鹼土金屬鹽、碳酸鹼土金屬鹽、磷酸鹼土金屬鹽、羥基磷酸鹼土金屬鹽、滷代磷酸鹼土金屬鹽、不溶性矽酸鹽、不溶性矽酸鋁鹽、不溶性碳酸鹽、不溶性硫酸鹽、不溶性磷酸鹽、不溶性羥基磷酸鹽、滷代磷酸鹽、全氟烴或其衍生物、全氟羧酸或其鹽、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀感光計。
11.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀/聚乙烯吡咯烷酮感光計。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的苯甲酸鈉感光計。
13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的過二硫酸鉀/叔丁醇感光計。
14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物選自下述種構成的組原核生物界種、原核生物界種的孢子、真菌界種、真菌界種的孢子、原核細胞、真核細胞以及病毒。
15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述病毒選自下述構成的組微小病毒、微小鼠病毒、犬微小病毒、牛微小病毒、豬微小病毒、貓微小病毒、環形病毒、圓環形病毒、微小RNA病毒、噬肝性病毒A型肝炎病毒、以及腦脊髓炎病毒、阿內羅病毒、腸道RNA病毒、微小病毒DNA噬菌體，以及光滑病毒RNA噬菌體。
16.如權利要求1所述的方法，是與至少一種其他滅菌和/或微生物滅活方法聯合使用。
17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物液體包含至少一種添加劑，以減少對生物液體生物活性的破壞和/或喪失。
18.如權利要求1所述的方法，是與用液體去垢劑處理同時進行。
19.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，用以滅活生物液體中微生物的光的有效劑量是指滅活生物液體中至少99.9％的存活微生物的劑量。
20.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物液體選自如下液體構成的組乳、乳清、乳製品、來源於乳的製品、果汁、來源於果汁的製品、蔬菜汁、來源於蔬菜的製品、原生植物汁、轉基因植物汁、配製飲料、加工飲料、發酵飲料、酒精飲料、血液、血漿、血漿組分、血清、來自於血液的液體、來自於血清的液體、來自於血漿的液體、包含蛋白組分的液體、脊髓液、腦液、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核細胞培養上清、真核細胞培養上清、原核細胞裂解液、真核細胞裂解液、外用治療性液體、經腸道治療性液體、非腸道治療性液體、外用美容液體、診斷用液體。
21.一種用於確定從一個或多個光源發出的單色或多色光用以滅活非透明生物液體中微生物的有效劑量的方法，包括測量在所用光滅活波長下單色或多色光對於與生物溶液的濁度、與生物溶液的濁度和吸光度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物溶液的濁度和吸光度以及粘度、與生物溶液的吸光度、或與生物溶液的粘度和吸光度相匹配的劑量測定溶液的影響，上述測量是基於採用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對薄層內的劑量測定溶液進行輻照以施加一能夠導致可測量的物理量或化學量發生變化的規定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長度薄到在規定時間內只能吸收預定輻照度的入射光部分，ii)在對光輻照反應器中劑量測定溶液輻照期間或之後，讀取與這些測到的量的變化相應的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進行，反之亦然。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，沿著所述光程長度，100％或以下的所述入射光被吸收。
23.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，沿著所述光程長度，50％或以下的入射光被吸收。
24.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，在流通式反應器中對所述生物液體進行滅活，所述規定通量可以通過改變規定輻照度和/或通過改變規定時間來改變，所述規定時間由流通式反應器中生物液體的流速確定。
25.如權利要求21所述的方法，進一步包括，在對輻照之前或期間、或者之前及期間摻合了存活微生物的生物液體進行輻照之前和之後，或者之前、期間和之後，通過滴定所述存活微生物的數量來確定劑量分布。
26.如權利要求21所述的方法，進一步包括在輻照過程中對一個或多個光源的強度進行監測，以確定輻照劑量。
27.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述光在紫外區。
28.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，劑量測定溶液包含從下列中選取的試劑或試劑組合碘化鹼金屬鹽、碘化鹼土金屬鹽、碘化銨、尿苷磷酸水溶液、苯甲酸鹼金屬鹽、苯甲酸鹼土金屬鹽、苯甲酸銨、過二硫酸鹼金屬鹽、過二硫酸鹼土金屬鹽、過二硫酸銨、叔丁醇、聚乙烯吡咯烷酮、膨潤土、雲母、蒙脫石、囊脫石、鋰榮脫石、高嶺石、多水高嶺石、地開石、粘土礦物、白堊、矽石、煅制二氧化矽、重晶石、石膏、滑石、氧化鎂、氧化鋁、氯氧化鉍、氧化鋅、硫酸鹼土金屬鹽、碳酸鹼土金屬鹽、磷酸鹼土金屬鹽、羥基磷酸鹼土金屬鹽、滷代磷酸鹼土金屬鹽、不溶性矽酸鹽、不溶性矽酸鋁鹽、不溶性碳酸鹽、不溶性硫酸鹽、不溶性磷酸鹽、不溶性羥基磷酸鹽、滷代磷酸鹽、全氟烴或其衍生物、全氟羧酸或其鹽、以及聚乙烯聚吡咯烷酮。
29.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀感光計。
30.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的碘化鉀-碘酸鉀/聚乙烯吡咯烷酮感光計。
31.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的苯甲酸鈉感光計。
32.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含稀釋的過二硫酸鉀/叔丁醇感光計。
33.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述劑量測定溶液包含導致混濁的試劑。
34.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述微生物選自下述種構成的組原核生物界種、原核生物界種的孢子、真菌界種、真菌界種的孢子、原核細胞、真核細胞以及病毒。
35.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述病毒選自下述構成的組微小病毒、微小鼠病毒、犬微小病毒、牛微小病毒、豬微小病毒、貓微小病毒、環形病毒、圓環形病毒、微小RNA病毒、噬肝性病毒A型肝炎病毒、以及腦脊髓炎病毒、阿內羅病毒、腸道RNA病毒、微小病毒DNA噬菌體，以及光滑病毒RNA噬菌體。
36.如權利要求21所述的方法，是與至少一種其他滅菌或微生物滅活方法聯合使用。
37.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述生物液體包含至少一種添加劑，以減少對生物液體生物活性的破壞和/或喪失。
38.如權利要求21所述的方法，是與用液體去垢劑處理同時進行。
39.如權利要求25所述的方法，其特徵在於，用以滅活生物液體中微生物的光的有效劑量是指滅活生物液體中至少99.9％的存活微生物的劑量。
40.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，在流通式反應器中對所述生物液體進行滅活。
41.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述生物液體選自如下液體構成的組乳、乳清、乳製品、來源於乳的製品、果汁、來源於果汁的製品、蔬菜汁、來源於蔬菜的製品、原生植物汁、轉基因植物汁、配製飲料、加工飲料、發酵飲料、酒精飲料、血液、血漿、血漿組分、血清、來自於血液的液體、來自於血清的液體、來自於血漿的液體、包含蛋白組分的液體、脊髓液、腦液、淋巴液、唾液、精液、尿液、原核細胞培養上清、真核細胞培養上清、原核細胞裂解液、真核細胞裂解液、外用治療性液體、經腸道治療性液體、非腸道治療性液體、外用美容液體、診斷用液體。
42.一種紫外光滅活流通式反應器，其中一個或者多個光源被封套恆溫器包裹，恆溫並基本透明的液體流過所述封套恆溫器以移去來自輻照燈的熱量，從而保證幾乎不變的燈光強度。
43.如權利要求42所述的流通式反應器，其特徵在於，所述流通式反應器選自下述類型構成的組重力驅動的產薄膜型、渦流主動混合流型、離心驅動的產薄膜型、盤管型、擋板管狀型、靜止混合管狀型、渦流靜止性混合流管型、層疊管型、渦流管型。
44.一種通過控制發自單個或多個光源的單色或多色光的光輻照總劑量以有效滅活間歇式反應器中存在於生物液體中的微生物的方法，包括如下步驟a)基於滅活生物液體中的微生物時的單色或者多色光的有效輻照劑量，確定取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量、在間歇式反應器中有效滅活微生物所需要的光輻照劑量速率和輻照時間；b)在滅活間歇式反應器中生物液體中的微生物期間，記錄光輻照劑量速率和輻照時間；c)基於步驟b)的測量計算取決於吸收的輻照源光輻照總劑量；d)將步驟c)中測得的取決於吸收的輻照源光輻照總劑量與步驟a)中得到的取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量進行比較；和e)一旦取決於吸收的輻照源光輻照總劑量等於或大於取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量，則中斷對生物液體進行曝光。
45.如權利要求44所述的控制取決於吸收的輻照源靶光輻照總劑量的方法，其特徵在於，繼續進行所述方法，直到取決於吸收的輻照源光總劑量基本上等於取決於吸收的輻照源靶光總劑量，而不管輻照光劑量速率的變化和/或中間至少一個或者多個光源突然關閉。
46.如權利要求44所述的方法，其特徵在於，通過測量所述單色或多色光對於劑量測定溶液的影響來確定有效劑量，包括測量在所用光滅活波長下單色或多色光對於與生物溶液的濁度、與生物溶液的濁度和吸光度、與生物溶液的濁度和粘度、與生物溶液的濁度和吸光度以及粘度、與生物溶液的吸光度、或與生物溶液的吸光度和粘度相匹配的劑量測定溶液的影響，上述測量是基於採用下述步驟i)和ii)的光輻照劑量校正完成的i)對薄層內的劑量測定溶液進行輻照以施加一能夠導致可測量的物理量或化學量發生變化的規定通量(光輻照劑量)，所述薄層的光程長度薄到在規定時間內只能吸收預定輻照度的入射光部分，ii)在對光輻照反應器中劑量測定溶液輻照期間或之後，讀取與這些測到的量的變化相應的輻照劑量，其中步驟i)可以在步驟ii)之前進行，反之亦然。
47.如權利要求44所述的方法，其特徵在於，使用至少一種電子輻射計、至少一種圖表記錄器和/或至少一種計數器來記錄所述輻照光劑量速率和所述輻照時間。
全文摘要
本發明涉及一種確定從一個或者多個光源發出的單色光或者多色光用以滅活存在於生物體液特別是非透明液體中微生物的有效劑量的方法。另外，本發明液提供了一種滅活存在於流通式反應器中生物液體所含微生物的方法。而且，本發明有利地提供了一種具有一個或者多個熱穩定光源的流通式反應器。本發明還進一步提供了一個控制從一個或多個光源發出的單色或者多色光的光輻照總劑量從而有效滅活間歇反應器中微生物的方法。
文檔編號G01N23/00GK101065154SQ200580034827
公開日2007年10月31日 申請日期2005年8月4日 優先權日2004年8月24日
發明者海因茨·安德利, 皮特·馬西森, 漢斯·皮特·施瓦茨, 皮特·圖雷切克, 託馬斯·克萊爾, 丹尼爾·R·博格斯 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司