重組人睫狀神經營養因子突變體及其製備方法
2023-10-12 00:00:44
專利名稱：重組人睫狀神經營養因子突變體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白和其製備方法，具體涉及重組人睫狀神經營養因子(簡稱hCNTF)突變體及其製備方法，更具體的說，本發明涉及用乳糖誘導hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中高效可溶表達、並從中加以分離純化的方法，以及通過該方法製備的hCNTF突變體。
背景技術：
睫狀神經營養因子(CNTF)最初是從雞的睫狀體中提取出來的，可維持雞副交感神經節的存活，並因此而得名。CNTF基因最早於1989年得以克隆和表達。天然CNTF是一個由200個胺基酸殘基組成的蛋白質，無分子內二硫鍵，無分泌信號，無糖基化位點，其高級結構預測和IL-6、LIF等有相似的螺旋框架結構。CNTF具有多種功能，能促使多種神經細胞的存活，是第一個發現能夠維持體內和離體脊髓運動神經元的存活及突起生長的神經營養因子，CNTF還具有肌肉營養作用，在神經系統發育、分化和神經損傷修復中具有非常重要的作用，可用於製備治療哺乳動物中樞神經損傷、外周神經損傷、周圍神經疾病等的藥物。
對於重組蛋白在大腸桿菌中的表達來說，lac啟動子是常用的啟動子，IPTG對該啟動子具有高的誘導性，但因其高成本和潛在的毒性，使其在大規模生產上的應用受到極大的限制。乳糖代替IPTG用作誘導劑不僅能夠消除上述限制，而且可以達到接近IPTG誘導的表達水平。目前，人們通常在向培養液中添加乳糖作為誘導劑後，以乳糖作為目標蛋白表達階段的主要碳源。由於乳糖在細菌體內的作用機制和特點，誘導後在較高細胞密度情況下以乳糖作為基因工程菌的主要碳源最終導致菌體終濃度不高和菌體收穫量偏低。
目前，本領域中大腸桿菌表達CNTF多以包涵體形式，當外源基因在大腸桿菌中高效表達時，表達產物往往在細胞內聚集在一起，形成大小0.5～1μm的折光小體，即包涵體。例如，馬紅雨等(馬紅雨，朱美才，蔡慶，佔志，CNTF工程菌培養及產物純化.中國生物製品學雜誌，2001年，Vol.14，No.3)利用工程菌DH5α/pBV220CNTF進行了CNTF的表達研究，其為包涵體形式的表達。杭州九源基因工程有限公司的中國發明申請No.02136033.2中通過計算機輔助設計，對hCNTF的基因進行修飾改造，獲得突變型hCNTF基因的cDNA，人工合成該cDNA，構建重組質粒，轉化大腸桿菌，經全自動發酵罐高密度表達得到hCNTF的包涵體表達。另外US6602687中公開的重組hCNTF在大腸桿菌中也是以包涵體形式表達。
雖然包涵體表達一般表達量較高，但包涵體形成後，包涵體內大部分成分，這些蛋白質的一級結構是正確的，但沒有經過正確摺疊形成天然的高級結構，因而缺乏生物學活性，需要增加變性、復性步驟恢復其天然構象。蛋白質的復性問題目前仍是生物工程中的一個難點，復性工作量大，復性率低，成本高。如US6602687中實施例所述，按照估算的表達水平和溼菌體總濃度計算，每克溼菌體理論上可得到15～45mgCNTF，但是經過包涵體變性復性以及純化後，最終純品收穫量僅為每克溼菌體6mgCNTF。
李鴻均等(李鴻鈞，馬雁冰，蘇婷等.人睫狀神經營養因子克隆、表達、純化及其生物活性.中國生物製品學雜誌，2002年Vol.15，No.3)研究重組表達質粒PBV220-CNTF在大腸桿菌BL21中獲得了非融合的穩定高效表達，通過薄層掃描分析，目的蛋白約佔菌體總蛋白的45％，在超聲上清與沉澱中均有表達的hCNTF，約60％以可溶形式存在，並對可溶上清進行了簡單的一步陽離子交換層析純化，這是本領域現有技術中唯一提到重組人CNTF以可溶形式表達的報導。目前尚沒有以可溶上清為原料、以大量製備高純度和高活性重組人睫狀神經營養因子為目的的純化方法。
因此，本領域迫切需要開發以低成本、高產率為目的製備重組人睫狀神經營養因子的方法，所述的製備包括重組人睫狀神經營養因子的表達、分離和純化。
發明內容
因此，本發明的一個目的是提供可溶性表達高活性重組hCNTF的方法。其中所述的可溶性和高活性是通過下述突變實現的hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的穀氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個胺基酸；或這些突變的組合。C末端胺基酸優選去除13或15個。所述的突變組合優選第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的穀氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個胺基酸的組合。
本發明的另一個目的是提供高活性重組hCNTF的誘導表達方法。其中所述的誘導表達是通過加入乳糖誘導後再加入葡萄糖作為主要碳源實現的。其中加入乳糖的終濃度為1.5-2.5％，優選為2％，誘導約1～4小時，優選2～2.5小時後再緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，並控制培養溫度為25～28℃，控制培養液中溶解氧值為10％～15％。
本發明的另一個目的是提供高活性重組hCNTF的分離純化方法，其包括20％～45％硫酸銨分級鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過濾純化，獲得的純度大於98％。
在本發明的一個實施方案中，製備可溶性hCNTF的方法包括下列步驟(a)將hCNTF突變體基因序列克隆入表達載體以得到重組載體，並導入大腸桿菌中，生成含有重組載體的基因工程菌；(b)培養基因工程菌至OD600＝12～14時，加入乳糖，誘導hCNTF突變體在基因工程菌中可溶性表達；(c)誘導後，向培養液中緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，並控制培養液中溶解氧值為10％～15％，繼續培養；(d)待基因工程菌的OD600＝20-30時，收穫菌體，並將菌體破碎得到破菌液；(e)純化破菌液，得到純化產品。
在本發明的一個優選實施方案中，上述的大腸桿菌是大腸桿菌BL21(DE3)。
在本發明的另一個優選實施方案中，所述的hCNTF突變體中涉及的突變選自hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的穀氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個胺基酸；或這些突變的組合。
在本發明的一個更優選的實施方案中，C末端胺基酸優選去除13或15個。
在本發明的另一個更優選實施方案中，所述的突變組合優選第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的穀氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個胺基酸的組合。
在本發明的一個優選實施方案中，所述的菌體破碎使用高壓均質機進行，條件為800bar，2個循環。
在本發明的一個優選實施方案中，步驟(d)中基因工程菌的OD600＝25。
在本發明的一個優選實施方案中，步驟(e)中對破菌液依次進行20％～45％硫酸銨分級鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過濾純化，得到純化產品。
在本發明的一個優選實施方案中，所述的疏水層析填料是Butyl Sepharose 4 FastFlow或Phenyl Sepharose 4 Fast Flow，在層析過程中使用含有硫酸銨的緩衝液平衡層析柱，上樣後，先用含硫酸銨的緩衝液洗脫雜峰，再用不含硫酸銨的緩衝液洗脫活性峰。在本發明的一個更優選的實施方案中，上述的平衡緩衝液含有的硫酸銨濃度範圍是0.5～1mol/L；洗雜峰緩衝液含有的硫酸銨濃度範圍是0.2～0.3mol/L；緩衝液是Tris-HCl，濃度範圍是10～50mmol/L，pH值是7.0～9.0。
在本發明的一個優選實施方案中，所述的陰離子交換層析填料是Q SepharoseFast Flow或DEAE Sepharose Fast Flow，層析過程中使用含有鹽的緩衝液平衡層析柱，上樣後，先用含鹽的緩衝液洗脫雜峰，再用含更高鹽濃度的緩衝液洗脫活性峰。在本發明的一個更優選的實施方案中，使用的緩衝液是Tris-HCl緩衝液，濃度為20～50mmol/L，pH值是7.5～8.5。在本發明的一個更優選實施方案中，緩衝液中含有的鹽為氯化鈉，第一步洗脫雜峰的緩衝液中含有的氯化鈉濃度是0.02～0.05mol/L，第二步洗脫活性峰的緩衝液中含有的氯化鈉濃度是O.13～0.2mol/L。
在本發明的另一個實施方案中，本發明hCNTF突變體的製備方法在陰離子交換層析和凝膠過濾層析步驟之間還包括通過硫酸銨沉澱濃縮活性蛋白溶液的步驟。
在本發明的一個優選的實施方案中，所述凝膠過濾層析的填料是Superdex 75prep grade或Sephacryl S-200 High Resolution，使用磷酸鹽緩衝液進行平衡和洗脫，濃度是5～50mmol/L，pH值是7.0～8.5。
此外，本發明還涉及根據上述的方法製備的具有生物活性的hCNTF突變體。
圖1所示為搖瓶培養條件下重組hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中以IPTG誘導表達；1號至7號樣品依次為未誘導破菌液上清，誘導1小時後破菌液上清，誘導2小時後破菌液上清，誘導3小時後破菌液上清，誘導4小時後破菌液上清，誘導4小時後破菌液沉澱，誘導4小時後的全菌液，每條泳道均為等量發酵原液處理後得到的樣品。M為蛋白分子量標準，條帶從大到小依次為116kD、66kD、45kD、34kD、25kD、18kD、14kD。如無特殊說明，以下附圖的SDS-PAGE電泳均使用同樣的蛋白分子量標準。
圖2所示為搖瓶培養條件下重組hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中以乳糖誘導表達；1號至8號樣品依次為未誘導破菌液上清，誘導1小時後破菌液上清，誘導2小時後破菌液上清，誘導3小時後破菌液上清，誘導4小時後破菌液上清，誘導5小時後破菌液上清，誘導6小時後破菌液上清，誘導6小時後的全菌液，每條泳道均為等量發酵原液處理後得到的樣品。M為蛋白分子量標準。
圖3所示為發酵罐培養條件下重組hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中以乳糖誘導表達。1號至9號樣品依次為誘導後1～9小時取樣的破菌液上清圖4所示為純化過程所得主要組分的SDS-PAGE(13.5％)電泳分析結果，考馬斯亮藍染色，樣品順序為1破菌液上清；2經20％硫酸銨沉澱的破菌液上清，3經20％-45％硫酸銨沉澱的破菌液上清；4經20％-45％硫酸銨沉澱的破菌液上清；5Butyl疏水層析目標峰；6Q陰離子交換層析目標峰；7Superdex 75凝膠過濾層析目標峰；M蛋白分子量標準。1～7電泳泳道上樣量分別為30μg、30μg、8μg、40μg、20μg、17μg、15μg。
圖5所示為最終純品SDS-PAGE電泳圖片及純度分析結果。SDS-PAGE電泳中的1、2號泳道上樣量分別為10μg，15μg，M為與圖4相同的蛋白分子量標準。其後的圖表是根據電泳圖片，由UVP公司提供的LabwarksTMAnalysis Software軟體分析電泳泳道中目標蛋白含量得到的結果。
圖6為根據實施例6的生物活性測定方法所得到的劑量-效應曲線。
具體實施例方式
在本說明書的上下文中，除非特別指明，否則本說明書所用的任何技術術語具有本領域普通技術人員在本領域中通常理解的含義，而未註明具體條件的實驗方法是按照常規實驗方法，如金冬雁等譯，分子克隆實驗指南第二版，科學出版社，北京，1992；汪家政等，蛋白質技術手冊，科學出版社，北京，2001；朱厚礎等譯，蛋白質純化與鑑定實驗指南，科學出版杜，北京，1999；和李育陽主編，基因表達技術，科學出版社，北京，2000所述的方法進行的；或按照安瑪西亞公司所建議的操作說明書進行。
在本發明的一個實施方案中，首先對天然存在的hCNTF胺基酸序列進行突變，以獲得更穩定、活性更高、能夠以可溶性方式表達的hCNTF突變體。所述的突變選自hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的穀氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個胺基酸；或這些突變的組合。
其中，第17位的半胱氨酸被所列的胺基酸取代後，可以避免分子間的二硫鍵，歸於實驗結果為有更好的穩定性，在生理的pH、溫度下更利於活性作用的發揮，對製備藥劑是有意義的。
hCNTF第63位的穀氨酸所列的胺基酸取代後，突變體蛋白會更強烈地在體外刺激神經細胞的存活與分化，在體外表現為活性檢測指標更好，而在體內表現為動物模型的實驗結果的提高。
hCNTF第64位的組氨酸所列的胺基酸取代後，突變體蛋白體內的生物活性有了顯著提高。
hCNTF的C末端的一端胺基酸去除後，優選去除13和15個胺基酸後，突變體蛋白在生理狀態下有更好溶解度和穩定性。
在上述的突變中，優選將涉及第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的穀氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個胺基酸的突變組合，同時具備上述三種突變的hCNTF突變體，稱為hCNTF-TS，這種組合在一定程度上可以集合其各突變體的優點，能夠在穩定性、生物活性較天然胺基酸序列的hCNTF分子有顯著的提高。
在本發明中所用的術語「突變體或hCNTF突變體」除非特別指出，即指含有上述突變位點或其組合的hCNTF分子，其均是以天然的hCNTF胺基酸序列(GenBank號GI25952136)為突變對象。獲得上述突變體的方法是本領域技術人員所公知的。
將外源基因序列插入合適的表達載體並導入大腸桿菌的方法是本領域的技術人員所公知的，例如參見金冬雁等譯，分子克隆實驗指南第二版，科學出版社，北京，1992。得到含有重組載體的菌株後，在37℃下用LB等培養對菌株進行培養，當細菌生長到一定密度後(如，OD＝0.6時)，可以向培養基中添加一定濃度(如1mmol/L)IPTG或(如2％)乳糖，細菌在誘導物的誘導下，可以大量表達hCNTF及突變體蛋白，我們獲得這些細菌樣品，就可以對hCNTF及突變體蛋白進行提純和研究。
在本發明的說明與實施方案中，關於蛋白純度和含量的估算，如無特殊說明，均是以SDS-PAGE電泳圖片為分析對象，使用電泳圖片分析軟體計算得來的，該類軟體是公眾可以得到或購買的(如UVP公司提供的LabworksTM分析軟體)。
在本發明的一個實施方案中，使用乳糖，優選使用2％的乳糖作為誘導劑誘導重組hCNTF的可溶性表達。由於乳糖誘導的關鍵是誘導時培養液中葡萄糖的濃度要足夠低[7]，因此在誘導期間，乳糖既作為重組蛋白表達的誘導劑，又作為主要碳源。但是，考慮到乳糖作為碳源會限制菌體的終濃度和菌體收穫量，使菌體終濃度和菌體收穫量偏低，另外，作為碳源，乳糖的價格較為昂貴，生物利用率又較低，從而造成生產成本提高。因此，本發明在誘導一段時間之後，優選在誘導約2～2.5小時後緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，並控制培養溫度為25～28℃，控制培養液中溶解氧值為10％～15％，使儘可能多的目標蛋白以可溶形式表達。
結果，乳糖誘導一段時間後添加葡萄糖和其他氮源不但可以大幅提高菌體收穫量，而且絲毫不影響目標蛋白的可溶表達。目標蛋白90％以上形成可溶表達，可溶表達量(可溶性的目的蛋白在所有可溶性菌體蛋白中佔的比例)達到20％左右。
在發酵罐中放大培養實驗中，本發明採用半合成培養基，誘導前通過流加碳源(如葡萄糖)和氮源補充液(如胰蛋白腖、酵母提取物和酪蛋白水解物)，在菌體濃度達到OD600＝12～14時，加入終濃度為2％的乳糖進行誘導，停止流加碳源補充液，繼續流加氮源補充液。誘導後間隔2～2.5小時，恢復流加碳源補充液。整個培養過程中控制pH值6.6～7.0，誘導前溶解氧值30％～50％，溫度37℃，誘導後溶解氧值5％～20％，誘導後開始流加碳源補充液後控制溫度20～30℃。更優選地，整個培養過程中控制pH值6.8，誘導前溶解氧值40％，誘導後溶解氧值10％～15％，誘導後開始流加碳源補充液後控制溫度25～28℃。通過適時調整流加補充液的流加速度，控制細菌比生長速率(比生長速率的定義參見張元興編著，生物反應器工程，P37，華東理工大學出版社，2001年)在誘導前為0.2～0.3h-1，誘導後為0.05～0.15h-1。誘導後6小時收穫菌體，細菌密度可達OD600＝25左右，溼菌體產量50g/L，90％以上的目標蛋白形成可溶性表達，可溶表達量為20％左右(圖2)。
將發酵收穫的菌體破碎得到破菌液，然後對破菌液依次進行硫酸銨分級鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過濾純化，得到純度高並具有生物活性的重組人睫狀神經營養因子。
將發酵收穫的溼菌體按1∶10的比例，用PBS或者Tris-HCl緩衝液重懸菌體，經過高壓均質機破菌，高壓均質機破菌條件優選在800bar的壓力下，破菌2個循環。
對破菌液進行的硫酸銨分級鹽析以除去菌體碎片及大部分雜蛋白，硫酸銨分級鹽析優選20％～45％分級沉澱。
疏水層析填料為Butyl Sepharose 4 Fast Flow，還可以是Phenyl Sepharose 4 FastFlow，使用的含有0.5～1mol/L硫酸銨的10～50mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡層析柱，緩衝液的pH值是7.0～9.0，然後用平衡緩衝液溶解硫酸銨分級沉澱樣品，樣品上疏水層析柱後，先用含0.2～0.3mol/L硫酸銨的10～50mmol/L Tris-HCl，pH7.0～9.0的緩衝液洗脫雜峰，再用不含硫酸銨的10～50mmol/L Tris-HCl，pH7.0～9.0的緩衝液洗脫活性峰。
陰離子交換層析填料是Q Sepharose Fast Flow，還可以是DEAE Sepharose FastFlow，在陰離子交換層析中使用的平衡緩衝液是Tris-HCl緩衝液，濃度為20～50mmol/L，緩衝液的pH值是7.5～8.5，經過疏水層析的活性峰電導率較低，直接上陰離子交換層析柱，上樣後，先用含鹽的緩衝液洗脫雜峰，再用含更高鹽濃度的緩衝液洗脫活性峰，緩衝液選用Tris-HCl緩衝液，濃度為20～50mmol/L，緩衝液的pH值是7.5～8.5，緩衝液含有的鹽可以是氯化鈉，也可以是硫酸鈉、硫酸銨，優選氯化鈉，第一步洗脫雜峰的緩衝液中含有的氯化鈉濃度是0.02～0.05mol/L，第二步洗脫活性峰的緩衝液中含有的氯化鈉濃度是0.13～0.2mol/L。
在陰離子交換層析後使用硫酸銨沉澱方法濃縮活性峰，上用濃度為5～50mmol/L、pH值7.5～8.5的磷酸鹽緩衝液平衡了的凝膠過濾層析柱，凝膠過濾層析填料是Superdex 75 prep grade，還可以是Sephacryl S-200 High Resolution，使用濃度為5～50mmol/L、pH值7.0～8.5的磷酸鹽緩衝液洗脫得到目標蛋白CNTF。
實施例下面將結合附圖，通過優選的實施例來說明本發明的優選實施例。但應該理解，這些實施例僅是為了說明本發明，並不對本發明的保護範圍具有任何限制。本發明的實質和保護範圍僅由附加的權利要求書加以限制。
實施例1獲得表達hCNTF突變體的基因工程菌我們通過RT-PCR反應從人血細胞克隆到天然CNTF基因序列，並經過突變得到下列hCNTF突變體序列SEQ ID NO.1catatggctt tcacagagca ttcaccgctg acccctcacc gtcgggacctcgcaagccgc tctatctggc tagcaaggaa gattcgttca gacctgactgctcttacgga atcctatgtg aagcatcagg gcctgaacaa gaacatcaacctggactctg cggatgggat gccagtggca agcactgatc gttggagtgagctgaccgag gcagagcgac tccaagagaa ccttcaagct tatcgtaccttccatgtttt gttggccagg ctcttagaag accagcaggt gcattttaccccaaccgaag gtgacttcca tcaagctata catacccttc ttctccaagtcgctgccttt gcataccaga tagaggagtt aatgatactc ctggaatacaagatcccccg caatgaggct gatgggatgc ctattaatgt tggagatggtggtctctttg agaagaagct gtggggccta aaggtgctgc aggagctttcacagtggaca gtaaggtcca tccatgacct tcgtttcatt tcttctcatcagactgggta ataaggatcc其中下劃線部分catatg和ggatcc依次為NdeI和BamHI酶切位點，陰影部分atg和taataa依次為基因表達的起始密碼子和終止密碼子。該突變體序列為前述突變方法的優選組合，即與天然hCNTF基因相比，為第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的穀氨酸替換為精氨酸並去除C末端15個胺基酸的突變組合(hCNTF-TS)，利用該序列上的NdeI和BamHI限制性內切酶位點克隆入pET32a(+)原核表達質粒的NdeI(691)和BamHI(198)位點(參見Novagen公司質粒圖譜)，獲得重組表達載體質粒，將該載體質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態，得到能夠表達hCNTF突變體的工程菌，表達的突變體與天然hCNTF比較，第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的穀氨酸替換為精氨酸，C末端去除15個胺基酸。該工程菌已經於2005年3月22日在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢大學，郵編430072)進行了生物保藏，保藏編號為CCTCC NOM205025。
實施例2IPTG誘導工程菌表達重組hCNTF突變體取甘油管凍存的重組基因工程菌BL21(DE3)，按0.2％的接種量接入新鮮LB抗性培養基中(含Amp 100μg/ml)，過夜培養。將活化的種液按1％的接種量轉接到裝有200ml LB培養基的500ml三角瓶中，280rpm，37℃培養至OD600＝0.6左右時，以終濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導，再繼續培養4小時，結果90％以上的目標蛋白形成可溶性表達，可溶表達量為20～25％。(圖1)。
實施例3乳糖誘導重組hCNTF突變體在搖瓶條件下的高效可溶表達取甘油管凍存的基因工程菌BL21(DE3)，按0.2％的接種量接入新鮮LB抗性培養基中(含Amp 100μg/ml)，過夜培養。將活化的種液按1％的接種量轉接到裝有200mlLB培養基的500ml三角瓶中，280rpm，37℃培養至OD600＝0.6左右時，加入終濃度為2％的乳糖溶液，220rpm，25℃繼續培養6小時，3000g離心力，10分鐘離心收穫菌體。秤取溼菌體重量，以50mmol/L的Tris-HCl緩衝液按1∶20的比例重懸菌體。超聲波破菌後，破菌液以20,000g離心力，10分鐘離心，取出上清，沉澱以等體積的緩衝液重懸，分別將破菌液上清，沉澱和收穫的菌體並行進行SDS-PAGE，結果90％以上的目標蛋白形成可溶性表達，可溶表達量為20％左右。圖2為誘導後各時期的重組hCNTF突變體的表達。
實施例4乳糖誘導重組hCNTF突變體在發酵罐放大培養條件下的高效可溶表達取甘油管凍存的基因工程菌BL21(DE3)，劃線接種LB抗性斜面，37℃培養12～18小時後取出置4℃保存。將一支斜面菌種轉入裝有400ml種子培養液的三角瓶中，280rpm，37℃培養至OD600＝1.5左右。種子培養液為LB培養基。
14L全自動發酵罐中，裝入7L發酵培養基。發酵培養基組成為Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L，酪蛋白水解物2g/L，Na2HPO4·12H2O14g/L，KH2PO44g/L，(NH4)2HPO42g/L。其中胰蛋白腖和酵母提取物為OXOID產品，酪蛋白水解物為國產生化試劑，其餘為國產分析純試劑。培養基以121℃，25分鐘實罐滅菌。滅菌完畢待培養基冷卻後，接入400ml培養好的種子液，控制pH6.8，溶氧值40％，溫度37℃，溶氧值由攪拌轉速和通氣量級聯。3.5小時後，向發酵罐內同時流加碳源補充液和氮源補充液，通過適時調整碳源補充液和氮源補充液的流加速度，使細菌比生長速率控制在0.2hr-1左右。其中碳源補充液組成為葡萄糖200g/L，MgSO4·7H2O10g/L；氮源補充液組成為胰蛋白腖40g/L，酵母提取物20g/L，酪蛋白水解物10g/L，MgSO4·7H2O 10g/L。
培養至OD600＝12～14時，向發酵罐內一次性加入30％的乳糖溶液，使其終濃度為2％，此時暫停碳源補充液的流加，調整溶氧值為20％。2～2.5小時後，恢復流加碳源補充液，控制細菌比生長速率0.05～0.15hr-1，調整培養溫度25～28℃，溶氧值1O～15％。繼續培養6小時後放罐，細菌終濃度達到OD600＝25左右，溼菌體產量50g/L。將溼菌體按1∶10的比例，以50mmol/L的Tris-HCl緩衝液重懸菌體，以高壓均質機在800bar的壓力下，破菌2個循環。取破菌液小樣，20000g離心力，10分鐘離心，取出上清液，沉澱以等體積的緩衝液重懸，分別將破菌液上清，沉澱和收穫的菌體一併行SDS-PAGE。結果90％以上的目標蛋白形成可溶性表達，可溶表達量為20％左右。圖3為誘導後各時期的重組hCNTF突變體的表達。
實施例5重組hCNTF突變體的分離和純化將發酵收穫的溼菌體按1∶10的比例，以50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液重懸菌體，以高壓均質機在800bar的壓力下，破菌2個循環。先將破菌液加硫酸銨至20％飽和度，10,000g離心40min，取出上清，向20％上清中繼續加入硫酸銨至45％飽和度，hCNTF沉澱析出，10,000g離心25min，棄上清，回收沉澱。用含0.6mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液重懸沉澱，離心或經0.45μm微孔濾膜過濾後，以流速10ml/min上用含0.6mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液平衡好了的XK50/30 Sepharose Butyl 4Fast Flow柱，先用含0.6mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液洗流穿至280nm吸收曲線接近平穩，再用含0.2mol/L硫酸銨的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液洗脫約1.5個柱床體積，出現一個雜峰，然後用20mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液洗脫，收集洗脫峰，此即目標峰，用適量的去離子水或1mol/L的NaCl調節電導率至0.35～0.4ms/cm，以流速10ml/min上用50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液平衡好了的XK26/20 Sepharose Q Fast Flow柱，先用含0.04mol/L NaCl的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液洗脫約1.5個柱床體積，出現一個雜峰，再用含0.14mol/L NaCl的50mmol/L的Tris-HCl pH8.0緩衝液洗脫，收集洗脫峰，此即目標峰，冰浴磁力攪拌加入固體硫酸銨至60％飽和度，離心收集沉澱。用少量20mmol/L的PB pH8.0緩衝液重懸，以流速2ml/min上經20mmol/L的PB pH8.0緩衝液平衡好了的XK26/100 Superdex 75柱，用20mmol/L的PB pH8.0緩衝液洗脫，收集活性峰，此即hCNTF突變體純品，經SDS-Page電泳分析，純度大於98％，其濃度用lowry定蛋白法檢測為2.7mg/ml。
實施例6重組CNTF突變體的活性檢測本實施例中重組CNTF突變體活性檢測的方法參見本申請人在與本申請的同一天提交的、題目為「定量測定睫狀神經營養因子相關因子的方法」的專利申請，其通過引用併入本文。
簡言之，用含100IU/ml的青黴素、100μg/ml鏈黴素和4mmol/L穀氨醯胺的高糖DMEM培養基稀釋上述實施例5中獲得的重組hCNTF突變體蛋白樣品，最高濃度為3000倍稀釋，以下使用9000倍稀釋、27000倍稀釋等作3倍梯度稀釋，共10個稀釋樣品。如上述專利申請中的方法獲取雞胚背根神經節細胞。用含2％血清的高糖DMEM培養基稀釋神經細胞液至50000個細胞/ml，加入到鼠尾膠原包被的96孔細胞培養板中，每孔100微升。待神經細胞貼壁2小時後吸棄含血清的培養基，每孔加入含不同濃度CNTF的高糖DMEM培養基100微升，每個稀釋度做3個重複孔，另外取3孔加入不含樣品的同樣配製的高糖DMEM培養基作為陰性對照，放置於溫度37℃、二氧化碳濃度5％、飽和水蒸氣的培養箱中培養48小時。依次吸盡各孔中培養液，棄去。每孔各加入200微升PBS緩衝液(0.058mol/L Na2HPO4，0.017mol/LNaH2PO4，0.068mol/L NaCl，pH7.4)，靜置1分鐘後依次吸盡各孔中PBS，棄去。往各孔中依次加入100微升1mg/ml pNPP底物液(稱取一定量的pNPP，按比例加入包含0.1mol/L乙酸鈉pH6.0，0.2％Triton X-100，1mmol/L EDTA的緩衝液將其完全溶解。臨用前配製，1小時內使用)，放37℃。待4小時後，每孔各加入10微升1mol/LNaOH，混合均勻。室溫放置10分鐘後，於BIO-TEK酶標儀405nm處讀取吸光度值，如下表所示。根據獲得的數據作如圖6所示的劑量-效應曲線，確定樣品的半數有效劑量ED50，並確定活性為1.63×107單位/ml，比活性為6.05×106單位/mg。
綜上所述，由上述發酵和分離純化工藝獲得的重組CNTF突變體蛋白能夠促進體外原代培養的雞胚背根神經節細胞存活，並具有明顯的量效關係。
權利要求
1.一種製備hCNTF突變體的方法，包括下列步驟(a)將hCNTF突變體基因序列克隆入表達載體以得到重組載體，並導入大腸桿菌中，生成含有重組載體的基因工程菌；(b)培養基因工程菌至OD600＝12～14時，加入乳糖，誘導hCNTF突變體在基因工程菌中可溶性表達；(c)誘導後，向培養液中緩慢加入葡萄糖作為主要碳源，並控制培養液中溶解氧值為10％～15％，繼續培養；(d)待基因工程菌的OD600＝20-30時，收穫菌體，並將菌體破碎得到破菌液；(e)純化破菌液，得到純化產品。
2.根據權利要求1的方法，其中所述的hCNTF突變體中涉及的突變選自hCNTF第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸；第63位的穀氨酸替換為精氨酸；第64位的組氨酸替換為丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30個胺基酸；或這些突變的組合。
3.根據權利要求2的方法，其中所述的C末端胺基酸去除13或15個。
4.根據權利要求2或3的方法，其中所述的突變組合為第17位的半胱氨酸替換為丙氨酸、第63位的穀氨酸替換為精氨酸和C末端去除15個胺基酸的組合。
5.根據權利要求1的方法，其中步驟(b)的誘導過程進行1～6小時。
6.根據權利要求1的方法，其中步驟(b)中加入乳糖的終濃度為1.5-2.5％。
7.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)中控制培養溫度為25～28℃。
8.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)中基因工程菌的OD600＝25。
9.根據權利要求1的方法，其中步驟(e)中對破菌液依次進行20％～45％硫酸銨分級鹽析、疏水層析、陰離子交換層析及凝膠過濾純化，得到純化產品。
10.根據權利要求9的方法，其中所述的疏水層析填料是Butyl Sepharose 4 Fast Flow或Phenyl Sepharose 4 Fast Flow，在層析過程中使用含有硫酸銨的緩衝液平衡層析柱，上樣後，先用含硫酸銨的緩衝液洗脫雜峰，再用不含硫酸銨的緩衝液洗脫活性峰。
11.根據權利要求10的方法，其中的平衡緩衝液含有的硫酸銨濃度範圍是0.5～1mol/L；洗雜峰緩衝液含有的硫酸銨濃度範圍是0.2～0.3mol/L；緩衝液是Tris-HCl，濃度範圍是10～50mmol/L，pH值是7.0～9.0。
12.根據權利要求9的方法，其中的陰離子交換層析填料是Q Sepharose Fast Flow或DEAE Sepharose Fast Flow，層析過程中使用含有鹽的緩衝液平衡層析柱，上樣後，先用含鹽的緩衝液洗脫雜峰，再用含更高鹽濃度的緩衝液洗脫活性峰。
13.根據權利要求12的方法，使用的緩衝液是Tris-HCl緩衝液，濃度為20～50mmol/L，pH值是7.5～8.5。
14.根據權利要求12或13的方法，緩衝液中所含的鹽為氯化鈉，第一步洗脫雜峰的緩衝液中含有的氯化鈉濃度是0.02～0.05mol/L，第二步洗脫活性峰的緩衝液中含有的氯化鈉濃度是0.13～0.2mol/L。
15.根據權利要求9的方法，其在陰離子交換層析和凝膠過濾層析步驟之間還包括通過硫酸銨沉澱濃縮活性蛋白溶液的步驟。
16.根據權利要求9的方法，所述凝膠過濾層析的填料是Superdex 75 prep grade或Sephacryl S-200 High Resolution，使用磷酸鹽緩衝液進行平衡和洗脫，濃度是5～50mmol/L，pH值是7.0～8.5。
17.根據權利要求1～16中任意一項所述的方法製備的純度大於98％，並具有生物活性的hCNTF突變體。
全文摘要
本發明涉及重組蛋白和其製備方法，具體涉及重組人睫狀神經營養因子(簡稱hCNTF)突變體及其製備方法，更具體的說，本發明涉及用乳糖誘導hCNTF突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中高效可溶表達、並從中加以分離純化的方法，以及通過該方法製備的hCNTF突變體。
文檔編號C12N15/12GK1687413SQ20051006619
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者朱俊銘, 雷繼軍, 李清雄, 王革非, 餘永恆, 張曉林, 張光勳, 文力 申請人:梁亮勝