一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法及其應用的製作方法

2023-10-12 00:00:49 3

一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法及其應用，屬於新型納米功能材料與生物傳感器【技術領域】。其特徵在於：（1）銅摻雜二氧化鈦Cu@TiO2的製備；（2）雙功能標記物-二抗孵化物Cu@TiO2-Ab2的製備；（3）雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備及分析應用。本發明雙功能標記物構建的免疫傳感器優點在於識別快速、靈敏度高、檢測限低、成本低、便於操作，能實現多種腫瘤標誌物的高靈敏、特異性、快速準確檢測。
【專利說明】一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於功能化納米材料、免疫分析及生物傳感【技術領域】，具體涉及一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]自上世紀80年代，電化學傳感器的研究與開發呈現出突飛猛進的局面。近年來，隨著納米材料科學和微電子技術的快速發展，納米技術、生命科學、生物技術、電分析技術和表面科學等領域的交叉融合，各種新原理、新材料和新工藝的廣泛採用，電化學傳感器不斷湧現並進入實際應用。
[0003]免疫傳感器是將免疫學方法和分析化學相結合的生物傳感器，通過抗原與抗體的特異性結合，使得它具有靈敏度高、選擇性好、快速及操作簡便等優點。
[0004]標記物是電化學免疫傳感器的重要結構組成部分。由於免疫反應中的抗原抗體本身不具有氧化還原特性，因此不能在電化學檢測中產生信號實現定量和定性分析。研製性能優異的標記物，用以標記抗原或抗體，成為實現高靈敏檢測的關鍵所在。
[0005]納米材料在光電方面的特殊性質，使其被廣泛用於傳感器件的製作。某些納米材料具有大的比表面積，常被用作載體來固定抗原或抗體。其中，自身具有良好氧化還原能力的材料，可以用來作為電化學反應的信號源；而具有催化能力的材料，可以用其催化過氧化氫實現間接定量。因此在製備標記物的過程中利用納米材料的特性能夠達到良好的效果。
[0006]石墨烯具有比表面積大，催化性能好，能高效吸附固載生物分子及增強電子傳遞等優點。二氧化鈦(TiO2)納米材料具有不同的形貌和晶型結構，在光催化、傳感器、電池及其他領域具有廣泛的應用。它具有比表面積大、成本低廉、生物相容性好、製備簡單等優點，能夠穩定的固載抗體。已有研究結果顯示金屬離子摻雜的二氧化鈦在光催化降解環境汙染物方面具有良好的效果，而在傳感器的製備中還未曾出現過。
[0007]本發明利用石墨烯增強電極的電子傳遞能力並將銅摻雜二氧化鈦作為一種新型標記物，提供了一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法，實現了在兩種電化學檢測技術下對一種分析物的靈敏分析。

【發明內容】

[0008]本發明的目的之一是提供一種雙功能標記物的製備方法。
[0009]本發明的目的之二是將所製備的雙功能標記物應用於免疫傳感器的製備。
[0010]本發明的目的之三是利用所製備的免疫傳感器，通過兩種電化學技術對分析物進行檢測。
[0011]本發明的技術方案，包括以下步驟。
[0012]1.一種雙功能標記物-二抗孵化物的製備方法，包括以下步驟:
(I)二氧化鈦納米材料的製備
將2 mL鈦酸丁酯加入4(T50 mL乙二醇中，室溫攪拌6?8 h製成混合物，將該混合物加入150~170 mL的丙酮中，加2~3 mL水，劇烈攪拌廣2 h，離心分離，用乙醇清洗2~4次，50°C乾燥，製得二氧化鈦前驅體；將0.1 g 二氧化鈦前驅體分散到20 mL水中，攪拌條件下加熱回流廣2 h;再經過離心分離，乙醇清洗2~4次，50°C乾燥，製得二氧化鈦納米材料，備用。
[0013](2)銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2的製備
將I g 二氧化鈦納米材料加到40 mL、10 mo 1.L-1的NaOH溶液中，攪拌2~3 h，裝入聚四氟乙烯的反應釜中，12(Tl40°C加熱18~24 h，取出並冷卻至室溫，用8~12mL、0.1 mo l.L-1HCl溶液攪拌處理，超純水洗滌至中性，60°C下乾燥，得到處理過的二氧化鈦納米材料；
將乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化學計量比2:1的比例混合製得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，將0.8g上述處理過的二氧化鈦納米材料加到50 mL製得的Cu(en)2(0H)2溶液中，攪拌1~2 h,得到藍色物質，離心分離，用水清洗數次後，在40(T500°C下煅燒得到黃色粉末銅摻雜二氧化鈦 CuiTiO20
[0014](3)雙功能標記物的製備 將0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基矽烷、80 mL甲苯，在氮氣保護下，120°C攪拌回流4飛h，用甲苯和超純水各清洗2~4次，5(T60°C下乾燥，製得氨基功能化銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2,即雙功能標記物；
所述的雙功能標記物，其功能一是利用二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應產生的信號用方波伏安法對分析物進行檢測；二是利用二氧化鈦上的銅離子對催化H2O2產生的信號，採用計時電流法對分析物進行檢測。
[0015](4)雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的製備
將I mg雙功能標記物和0.5 mL、質量分數為2.5%的戊二醛混合，振蕩f 2 h，離心，傾倒上層溶液，加入0.4~0.6 mL、ρΗ7.0~7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3~5 μL分析物的二抗Ab2，振蕩10~12 h後離心分離，用pH 7.0-7.8的PBS溶液定容至I mL，製得雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置於4°C冰箱中備用。
[0016]2.一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法，包括如下步驟:
(1)將:3~5μ LU.5^2.5 mg.mr1超聲處理分散均勻的石墨烯，滴塗在玻碳工作電極表面，自然晾乾；
(2)分別將:3~5μL的8~12.mL-1分析物的一抗(Ab1)滴塗在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中乾燥；
(3)滴塗2~4μL、80-?20 Pg 的牛血清白蛋白於(2)中得到的工作電極表面，置於4°C冰箱中直至乾燥，超純水清洗後，置於4°C冰箱中晾乾；
(4)取3~5μL上述製備的雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴塗於電極表面上，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種雙功能標記物構建的免疫傳感器。
[0017]上述製備方法製備的免疫傳感器，用於分析物的檢測，包括如下步驟:
(I)用方波伏安法對分析物進行檢測
1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS緩衝溶液中進行測試;
2)掃描電壓範圍從-0.4~0.4 V，電勢階躍為5 mV,頻率25 Hz，振幅25 mV ；
3)二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應在0.0 V附近產生信號，根據所得電流強度與分析物濃度之間的線性關係，繪製工作曲線；
(2)用計時電流法對分析物進行檢測
1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.0~6.0的PBS緩衝溶液中進行測試;
2)在0.0--0.5 V的檢測電壓下，每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol.L-1 H2O2，記錄電流變化；
3)二氧化鈦上的銅離子對H2O2具有催化作用，能將H2O2催化轉變為H2O,同時產生電流變化，根據所得電流強度與分析物濃度之間的線性關係，繪製工作曲線；
4.上述所述分析物選自以下之一:癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，免疫球蛋白E(IgE)，免疫球蛋白G (IgG), α-L-巖藻糖苷酶(AFU)，前列腺特異性抗原(PSA)，CA15-3，CA125，CA 19-9, CA724，CA242，人絨毛膜促性腺激素(HCG)，乳腺癌易感基因(BRCA1 )，鱗狀細胞癌抗原(SCC)、細胞角蛋白19片斷(Cyfra21-1)，組織多肽抗原(TPA)，神經元特異性烯醇化酶(NSE)。
[0018]本發明的有益成果
(1)製備CuOTiO2標記抗體的孵化物，銅摻雜二氧化鈦作為一種新型標記物，利用二氧化鈦大的比表面積和良好的生物相容性可以負載更多的抗體，增大了傳感器電流響應；
(2)使用了CuOTiO2製備標記物，可用兩種電化學方法檢測。二氧化鈦上摻雜的銅離子可以通過自身氧化還原反應，在方波伏安法下產生電信號實現檢測，另外銅離子可以催化過氧化氫產生信號，用計時電流法記錄下信號改變，以此實現兩種方法的檢測。
[0019](3)線性範圍與檢測限。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
1.一種雙功能標記物-二抗孵化物的製備方法，包括以下步驟:
(1)二氧化鈦納米材料的製備
將2 mL鈦酸丁酯加入40 mL乙二醇中，室溫攪拌6 h製成混合物，將該混合物加入150mL的丙酮中，加2 mL水，劇烈攪拌I h，離心分離，用乙醇清洗2次，50°C乾燥，製得二氧化鈦前驅體；將0.1 g 二氧化鈦前驅體分散到20 mL水中，攪拌條件下加熱回流I h ;再經過離心分離，乙醇清洗2次，50°C乾燥，製得二氧化鈦納米材料，備用；
(2)銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2的製備
將I g 二氧化鈦納米材料加到40 mL、10 molL-1的NaOH溶液中，攪拌2 h，裝入聚四氟乙烯的反應釜中，120°C加熱18 h，取出、冷卻至室溫，用8 mL、0.1 mo I.L-1 HCl溶液攪拌處理，超純水洗滌至中性，60°C下乾燥，得到處理過的二氧化鈦納米材料；
將乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化學計量比2:1的比例混合製得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，將0.8g上述處理過的二氧化鈦納米材料加到50 mL製得的Cu (en) 2 (OH) 2溶液中,攪拌I h,得到藍色物質，離心分離，用水清洗數次後，在400°C下煅燒得到黃色粉末銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2;
(3)雙功能標記物的製備將0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基矽烷、80 mL甲苯，在氮氣保護下，120°C攪拌回流4 h，用甲苯和超純水各清洗2次，50°C下乾燥，製得氨基功能化銅摻雜二氧化鈦CuiTiO2,即雙功能標記物；
所述的雙功能標記物，其功能一是利用二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應產生的信號用方波伏安法對分析物進行檢測；二是利用二氧化鈦上的銅離子對催化H2O2產生的信號，採用計時電流法對分析物進行檢測；
實施例2
1.一種雙功能標記物-二抗孵化物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
(1)二氧化鈦納米材料的製備
將2 mL鈦酸丁酯加入50 mL乙二醇中，室溫攪拌8 h製成混合物，將混合物加入170mL的丙酮中，加3 mL水，劇烈攪拌2 h，離心分離，用乙醇清洗4次，50°C乾燥，製得二氧化鈦前驅體；將0.1 g 二氧化鈦前驅體分散到20 mL水中，攪拌條件下加熱回流2 h ;再經過離心分離，乙醇清洗4次，50°C乾燥，製得二氧化鈦納米材料，備用；
(2)銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2的製備
將I g 二氧化鈦納米材料加到40 mLUO mo IL-1的NaOH溶液中，攪拌3 h，裝入聚四氟乙烯的反應釜中，140°C加熱24 h，取出、冷卻至室溫，用12 mL、0.1 mo I.L—1 HCl溶液攪拌處理，超純水洗滌至中性，60°C下乾燥，得到處理過的二氧化鈦納米材料；
將乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化學計量比2:1的比例混合製得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，將0.8g上述處理過的二氧化鈦納米材料加到50 mL製得的Cu (en) 2 (OH) 2溶液中，攪拌2 h,得到藍色物質，離心分離，用水清洗數次後，在500°C下煅燒得到黃色粉末銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2;
(3)雙功能標記物的製備
將0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基矽烷、80 mL甲苯，在氮氣保護下，120°C攪拌回流6 h，用甲苯和超純水各清洗4次，60°C下乾燥，製得氨基功能化銅摻雜二氧化鈦CuiTiO2,即雙功能標記物；
所述的雙功能標記物，其功能一是利用二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應產生的信號用方波伏安法對分析物進行檢測；二是利用二氧化鈦上的銅離子對催化H2O2產生的信號，採用計時電流法對分析物進行檢測；
實施例3
1.一種雙功能標記物-二抗孵化物的製備方法，包括以下步驟:
(1)二氧化鈦納米材料的製備
將2 mL鈦酸丁酯加入45 mL乙二醇中，室溫攪拌7 h成為混合物，將混合物加入160mL的丙酮中，加2.5 mL水，劇烈攪拌1.5 h，離心分離，用乙醇清洗3次，50°C乾燥，製得二氧化鈦前驅體；將0.1 g 二氧化鈦前驅體分散到20 mL水中，攪拌條件下加熱回流1.5 h ;再經過離心分離，乙醇清洗3次，50°C乾燥，製得二氧化鈦納米材料，備用；
(2)銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2的製備
將I g 二氧化鈦納米材料加到40 mLUO mo I.L—1的NaOH溶液中，攪拌2.5 h，裝入聚四氟乙烯的反應釜中，130°C加熱20 h，取出、冷卻至室溫，用10 mL、0.1 mo I.L—1 HCl溶液攪拌處理，超純水洗滌至中性，60°C下乾燥，得到處理過的二氧化鈦納米材料；將乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化學計量比2:1的比例混合製得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，將0.8g上述處理過的二氧化鈦納米材料加到50 mL製得的Cu (en)2 (OH)2溶液中，攪拌Ih,得到藍色物質，離心分離，用水清洗數次後，在450°C下煅燒得到黃色粉末銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2;
(3)雙功能標記物的製備
將0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基矽烷、80 mL甲苯，在氮氣保護下，120°C攪拌回流5 h，用甲苯和超純水各清洗3次，55°C下乾燥，製得氨基功能化銅摻雜二氧化鈦CuiTiO2,即雙功能標記物；
所述的雙功能標記物，其功能一是利用二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應產生的信號用方波伏安法對分析物進行檢測；二是利用二氧化鈦上的銅離子對催化H2O2產生的信號，採用計時電流法對分析物進行檢測；
實施例4
雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的製備
將I mg雙功能標記物和0.5 mL、質量分數為2.5%的戊二醛混合，振蕩I h，離心，傾倒上層溶液，加入0.4 mL、pH7.0的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 μL分析物的二抗Ab2,振蕩10 h後離心分離，用pH 7.0的PBS溶液定容至I mL，製得雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置於4 °C冰箱中備用。
[0021]實施例5
雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的製備
將I mg雙功能標記物和0.5 mL、質量分數為2.5%的戊二醛混合，振蕩2 h,離心，傾倒上層溶液，加入0.6 mL、pH7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入5 μL分析物的二抗Ab2,振蕩12 h後離心分離，用pH 7.8的PBS溶液定容至I mL，製得雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置於4 °C冰箱中備用。
[0022]實施例6
雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的製備
將I mg雙功能標記物和0.5 mL、質量分數為2.5%的戊二醛混合，振蕩1.5 h，離心，傾倒上層溶液，加入0.5 mL、pH7.5的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入4 μL分析物的二抗Ab2,振蕩11 h後離心分離，用pH 7.5的PBS溶液定容至I mL，製得雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置於4 °C冰箱中備用。
[0023]實施例7
一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法
(1)將3μ L、l.5 mg.ml/1超聲處理分散均勻的石墨烯,滴塗在玻碳工作電極表面，自然晾乾；
(2)分別將3PL的8.mL-1分析物的一抗Ab1滴塗在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中乾燥；
(3)滴塗2μL、80的牛血清白蛋白於(2)中得到的工作電極表面，置於4°C冰箱中直至乾燥，超純水清洗後，置於4°C冰箱中晾乾；
(4)取3μL上述製備的雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴塗於電極表面上，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種雙功能標記物構建的免疫傳感器。[0024]實施例8
一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法
(1)將5μ L、2.5 mg.ml/1超聲處理分散均勻的石墨烯,滴塗在玻碳工作電極表面，自然晾乾；
(2)分別將5PL的12分析物的一抗Ab1滴塗在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中乾燥；
(3)滴塗4μL、120 Pg.mL—1的牛血清白蛋白於(2)中得到的工作電極表面，置於4°C冰箱中直至乾燥，超純水清洗後，置於4°C冰箱中晾乾；
(4)取5μL上述製備的雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴塗於電極表面上，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種雙功能標記物構建的免疫傳感器。
[0025]實施例9
一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法
(1)將4μ L>2.0 mg.ml/1超聲處理分散均勻的石墨烯,滴塗在玻碳工作電極表面，自然晾乾；
(2)分別將4PL 的10分析物的一抗Ab1滴塗在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中乾燥；
(3)滴塗3μL,ΙΟΟ Pg.ml/1的牛血清白蛋白於(2)中得到的工作電極表面，置於4°C冰箱中直至乾燥，超純水清洗後，置於4°C冰箱中晾乾；
(4)取4μL上述製備的雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴塗於電極表面上，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種雙功能標記物構建的免疫傳感器。
[0026]實施例10
用方波伏安法對分析物進行檢測
(1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS緩衝溶液中進行測試;
(2)掃描電壓範圍從-0.4^0.4 V，電勢階躍為5 mV,頻率25 Hz，振幅25 mV ；
(3)二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應在0.0 V附近產生信號，根據所得電流強度與分析物濃度之間的線性關係，繪製工作曲線。
[0027]實施例11
用計時電流法對分析物進行檢測
(1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS緩衝溶液中進行測試;
(2)在0.0--0.5 V的檢測電壓下，每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol ?ab1 H2O2，記錄電流變化；
(3)二氧化鈦上的銅離子對H2O2具有催化作用，能將H2O2催化轉變為H2O,同時產生電流變化，根據所得電流強度與分析物濃度之間的線性關係，繪製工作曲線。
[0028]實施例12
按照實施例1~9進行操作，分析物選癌胚抗原(CEA)，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為3 pg ?πι^^δΟ ng ^mL4,檢測限為1.46 pg *mL_1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為0.6 pg ?πι^^δΟ ng-mL4,檢測限為0.24 pg-mL—1。分析物選甲胎蛋白(AFP)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為5 pg -mL-^60ng.mL—1，檢測限為1.3 pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為2pg.mL-1 ~60 ng.mL-1,檢測限為 0.54 pg.mL'
[0029]實施例13
按照實施例1~9進行操作，分析物選免疫球蛋白G (IgG)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為0.1 pg/mL^lOO ng/mL,檢測限為0.052 pg ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為0.01 pg/mL^100 ng/mL，檢測限為0.0043 pg分析物選免疫球蛋白E (IgE)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為0.5Pg.mdOO ng.mL—1，檢測限為0.18 pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為 0.1 pg.mdOO ng.mL—1,檢測限為 0.048 pg.mL'
[0030]實施例14
按照實施例1~9進行操作，分析物選a -L-巖藻糖苷酶(AFU)，時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性 範圍為15 pg.mL-^10.0 ng.mL—1，檢測限為4.5 pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為5.0 pg.mL-^10.0 ng.!!^1，檢測限為1.6 pg.mL、
[0031]實施例15
按照實施例1~9進行操作，分析物選前列腺特異性抗原(PSA)，時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為20 pg.md0.0 ng.mL—1,檢測限為6.1 pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為5.0 pg.mL-^40.0 ng.!!^1，檢測限為1.4 pg.mL、
[0032]實施例16
按照實施例1、進行操作，分析物選CA15-3，CA125，CA 19-9, CA724，CA242時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍分別為10 pg*mL^40 ng^mL—1，檢測限可達到3.1 pg ;用計時電流法對分析物進行檢測,體系的線性範圍為5 pg ?mL^^O ng ?mL—1,檢測限可達到1.2 pg.mL'
[0033]實施例17
按照實施例1~9進行操作，分析物選乳腺癌易感基因(BRCAl)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為10 pg.mL-^15 !^?!!!!^，檢測限為〗』pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為4.0 pg.mL-^15 ng.mL—1，檢測限為1.3pg* Inr10分析物選鱗狀細胞癌抗原(SCCA)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為20 pg.mdO ng.mL—1,檢測限為6.0 pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為8.0 pg.mdO ng.mL—1，檢測限為2.1 pg.mL'
[0034]實施例18
按照實施例1~9進行操作，分析物選人絨毛膜促性腺激素(HCG)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為40 pg.mdO ng.mL—1,檢測限為8.2 pg.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為10 pg.mL-^20 ng.mL—1，檢測限為2.6Pg.mL 1O[0035]實施例19
按照實施例1、進行操作，分析物選細胞角蛋白19片斷(Cyfra21-1)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為0.5 ng*mL^20 ng -mL'檢測限為0.12 ng-mr1 ；用計時電流法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為0.1 ng.mL-^20 ng.!!^1，檢測限為
0.032 ng.mL 1 ο
[0036]實施例20
按照實施例1、進行操作，分析物選神經元特異性烯醇化酶(NSE)時，用方波伏安法對分析物進行檢測，體系的線性範圍為5.0 ng.mL-^80 ng.mL—1，檢測限為1.3 ng.mL—1 ;用計時電流法對分析物進行檢測，體系線性範圍為1.0 ng.mL-^80 ng.mL—1，檢測限為0.24ng.mL、
【權利要求】
1.一種雙功能標記物-二抗孵化物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)二氧化鈦納米材料的製備 將2 mL鈦酸丁酯加入4(T50 mL乙二醇中，室溫攪拌6~8 h製成混合物，將混合物加入150^170 mL的丙酮中，加疒3 mL水，劇烈攪拌廣2 h，離心分離，用乙醇清洗2~4次，50°C乾燥，製得二氧化鈦前驅體；將0.1 g 二氧化鈦前驅體分散到20 mL水中，攪拌條件下加熱回流1-2 h;再經過離心分離，乙醇清洗2~4次，50°C乾燥，製得二氧化鈦納米材料，備用； (2)銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2的製備 將I g 二氧化鈦納米材料加到40 mLUO mo I.l-1的NaOH溶液中，攪拌2~3 h，裝入聚四氟乙烯的反應釜中，12(Tl40°C加熱18~24 h，取出、冷卻至室溫，用8~12 mL、0.1mo I.l-1 HCl溶液攪拌處理，超純水洗滌至中性，60°C下乾燥，得到處理過的二氧化鈦納米材料； 將乙二胺(en)和Cu (OH) 2以化學計量比2:1的比例混合製得Cu (en) 2 (OH) 2溶液，將0.8g上述處理過的二氧化鈦納米材料加到50 mL製得的Cu(en)2(0H)2溶液中，攪拌1~2 h,得到藍色物質，離心分離，用水清洗數次後，在40(T500°C下煅燒得到黃色粉末銅摻雜二氧化鈦 CuiTiO2 ； (3)雙功能標記物的製備 將0.25 g Cu@Ti02、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基矽烷、80 mL甲苯，在氮氣保護下，120°C攪拌回流4飛h，用甲苯和超純水各清洗2~4次，5(T60°C下乾燥，製得氨基功能化銅摻雜二氧化鈦CuOTiO2,即雙功能標記物； 所述的雙功能標記物，其功能一是利用二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應產生的信號用方波伏安法對分析物進行檢測；二是利用二氧化鈦上的銅離子催化H2O2產生的信號，採用計時電流法對分析物進行檢測； (4)雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2的製備 將I mg雙功能標記物和0.5 mL、質量分數為2.5%的戊二醛混合，振蕩f 2 h，離心，傾倒上層溶液，加入0.4~0.6 mL、ρΗ7.0~7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3~5 μL分析物的二抗(Ab2)，振蕩10~12 h後離心分離，用pH 7.0-7.8的PBS溶液定容至I mL，製得雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,置於4°C冰箱中備用。
2.一種雙功能標記物構建的免疫傳感器的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)將:3-5μ LU.5^2.5 mg.mr1超聲處理分散均勻的石墨烯，滴塗在玻碳工作電極表面，自然晾乾； (2)分別將:3-5μL的8~12.mL-1分析物的一抗Ab1滴塗在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中乾燥； (3)滴塗2~4μL、80-?20 Pg 的牛血清白蛋白於(2)中得到的工作電極表面，置於4°C冰箱中直至乾燥，超純水清洗後，置於4°C冰箱中晾乾； (4)取3~5μL權利要求1製備的雙功能標記物-二抗孵化物CuOTiO2-Ab2,滴塗於電極表面上，置於4 °C冰箱中晾乾，製得一種雙功能標記物構建的免疫傳感器。
3.根據權利要求2所述的製備方法製備的免疫傳感器，其特徵在於，用於分析物的檢測，包括如下步驟: (I)用方波伏安法對分析物進行檢測1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS緩衝溶液中進行測試; 2)掃描電壓範圍從-0.4~0.4 V，電勢階躍為5 mV,頻率25 Hz，振幅25 mV ； 3)二氧化鈦上的銅離子發生氧化還原反應在0.0 V附近產生信號，根據所得電流強度與分析物濃度之間的線性關係，繪製工作曲線； (2)用計時電流法對分析物進行檢測 1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 4.0-6.0的PBS緩衝溶液中進行測試; 2)在0.0--0.5 V的檢測電壓下，每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol.1/1 H2O2，記錄電流變化； 3)二氧化鈦上的銅離子對H2O2具有催化作用，能將H2O2催化轉變為H2O,同時產生電流變化，根據所得電流強度與分析物濃度之間的線性關係，繪製工作曲線。
4.根據權利要求1和權利要求3所述的分析物，其特徵在於，所述分析物選自以下之一:癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，免疫球蛋白E (IgE)，免疫球蛋白G (IgG), a-L-巖藻糖苷酶(AFU)，前列腺特異性抗原(PSA)，CA 15-3, CA125，CA 19-9, CA724，CA242，人絨毛膜促性腺激素(HCG)，乳腺癌易感基因(BRCA1)，鱗狀細胞癌抗原(SCC)、細胞角蛋白19片斷(Cyfra21-1),組織多肽抗原(TPA)，神經元特異性烯醇化酶(NSE)。
【文檔編號】G01N33/53GK103913565SQ201410171321
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月26日 優先權日:2014年4月26日
【發明者】魏琴, 張森, 杜斌, 龐雪輝, 馬洪敏, 吳丹 申請人:濟南大學