一種具有草甘膦耐性的基因及其應用的製作方法

2023-10-09 04:55:14 3

一種具有草甘膦耐性的基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有草甘膦耐性的基因及其應用。該基因的核苷酸序列為SEQIDNO：1、SEQIDNO：3或SEQIDNO：5及其保持抗草甘膦活性的突變基因，以及編碼的蛋白質胺基酸序列分別為SEQIDNO：2、SEQIDNO：4或SEQIDNO：6及其在第280到294位的保守區1、第416到433位的保守區2中胺基酸突變，利用該來自於植物的具有草甘膦耐性的基因及其突變製備抗/耐草甘膦植株，可以明顯的顯示出抗/耐草甘膦效果，這為培育抗/耐草甘膦除草劑作物提供了新的選擇，增加抗/耐草甘膦除草劑轉基因技術的多樣性，從而降低了抗/耐除草劑轉基因技術的生態風險。
【專利說明】—種具有草甘膦耐性的基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物分子生物學與植物遺傳工程領域，具體地說，本發明涉及一種植物源抗/耐草甘膦基因以及該基因編碼的蛋白質，並且對其進行人工改造，提供一種人工突變獲得高抗草甘膦基因突變體的方法以及基因突變後獲得的植物源高抗/耐草甘膦基因。通過遺傳轉化的方法使該基因在植物中表達而使植物獲得對草甘膦的抗性能力，從而可以利用草甘膦於作物田間選擇性地防除雜草。本發明也可以運用在作物育種、植物細胞培養的篩選。
【背景技術】
[0002]自從1946年開始使用2，4_D，化學除草劑已走過60多年的歷程，為全球糧食生產和農業現代化做出了巨大貢獻(Powels and Yu, 2010)。其中草甘膦(N-(膦羧基甲基)甘氨酸)是迄今為止最為重要、應用最為廣泛和最優秀的除草劑(Duke and Powles, 2008)。自1974年美國孟山都公司開發草甘膦以來，由於其具有廣譜、低毒、安全、無土壤殘留的特點，迅速佔據了世界除草劑的主導地位。草甘膦毒性作用機理主要是竟爭性抑制EPSP合酶即5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，該酶廣泛存在於真菌、細菌、藻類、高等植物體內，但不存在於動物體內。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似物，二者的分子式極為相似，它能與PEP競爭性結合EPSP合酶，形成EPSP合酶.3_磷酸莽草酸(S3P).草甘膦的複合物，阻斷EPSP的合成，從而阻斷芳香族胺基酸的合成，導致植物死亡。而草甘膦無選擇性地殺死作物和雜草，限制了它在農業生產上的使用，同時也給農業生產帶來了巨大的損失。自1996開始，抗草甘膦轉基因作物(如大豆、玉米、棉花和油菜)研製和商業化，才使得草甘膦被廣泛應用於農作物田雜草的防除(Powles，2008)。目前，草甘膦已成為生產量最大的農藥品種，佔全球農藥市場的近20%，年銷售超過20億美元。許多研究者通過多種方法來選育抗草甘膦的作物新品種。
[0003]目前通過基因工程培育抗`草甘膦植物是最有效的獲取抗性作物的手段。基因工程方法多採用細菌來源的抗性EPSP合成酶基因，該基因的產物與草甘膦結合活性下降而不能被其競爭抑制，保證了植物芳香族胺基酸的正常合成。常用的抗性基因來源有鼠沙門氏菌、根癌農桿菌、大腸桿菌、假單胞菌等。許多研究者利用這些抗性基因，採用基因工程的方法獲得了表達細菌EPSP合成酶的轉基因植物表現對草甘膦的抗性(Sost and Amrherin,1990; Blackburn and Boutin, 2003; Maskellj 1998; Gallo and Irvine, 1996; Zhouet al., 1995; Mannerlof et al., 1997; Penaloza et al., 1995; Zboinska et al.,1992)，其中轉基因抗草甘膦大豆已在美國、巴西等國家大面積栽種。但這些來源於細菌的抗性基因作物作為食品或食品原料，其安全性一直是爭論的焦點。
[0004]在植物中也發現了由於EPSP合酶單個胺基酸位點突變造成其對草甘膦具有抗藥性。牛筋草(Eleusine indica)對草甘膦的抗性提高了 8?12倍，在於其EPSPS第106位腦氨酸變成了絲氨酸或蘇氨酸(Prol06Ser/Thr) (Baerson et al.., 2002; Ng et al.,2003);抗草甘膦的瑞士黑麥草(Lolium rigidum)不同種群的EPSPS的106位脯氨酸有2種不同突變,被蘇氨酸或丙氨酸取代(Prol06Thr/Ala) (Wakelin and Preson, 2006; Yuet al., 2007) ;EPSP合酶第182位胺基酸由脯氨酸(P)變成了絲氨酸(S)是多花黑麥草(Lolium multiflorum)種群的草甘膦抗性機制之一(Gonzdilez-Torralva, 2012)。通過這些有效位點的基因突變，降低了 EPSPS對草甘膦的親和性，從而增強了雜草對草甘膦的抗性。
[0005]同時，對抗草甘膦雜草EPSPS基因研究證實，雜草對草甘膦的抗藥性大多是由胺基酸突變造成的極性變化所致。抗草甘膦牛筋草和瑞士黑麥草EPSPS編碼基因106位非極性脯氨酸分別突變為極性絲氨酸和蘇氨酸(Baerson, 2002; Wakelin and Preston,2006);抗草甘膦瑞士黑麥草和田旋花EPSPS基因的101位分別由非極性脯氨酸和非極性苯丙氛酸突變為極性絲氛酸(Simarmata and Penner, 2008; Zhang et al., 2011)。氛基酸極性的改變，可能會影響EPSP合酶與草甘膦的親和性。
[0006]孟山都公司已經對抗草甘膦牛筋草的EPSPS基因申請了專利保護。但是為了提高轉基因農作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產應用中仍然需要新的抗/耐草甘膦基因和以此為基礎的抗/耐草甘膦植物。相對於細菌等來源的抗草甘膦基因，植物來源的進化抗性或天然抗性基因，在培育抗/耐草甘膦除草劑作物後的生態環境和食品安全風險要低於其它生物類別的異源基因，提高民眾心理的認可。

【發明內容】

·[0007]本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺陷，提供一種基於自然界的植物天然耐性為基礎，經過前期對大量植物進行的草甘膦耐性篩選得到的新的抗/耐草甘膦基因，並且對其進行改良得到一系列突變基因，利用這些基因可以用來產生轉基因抗草甘膦植物，也可作為植物細胞培育中的篩選標記。
[0008]為了達到上述目的，本發明提供了三種具有草甘膦耐性的基因(LS-EPSPS)LsEPSPSU LsEPSPS2 和 LsEPSPS3，核苷酸序列分別為 SEQ ID NO:U SEQ ID NO:3 和 SEQID NO:5。
[0009]本發明還提供了一種抗/耐草甘膦蛋白質多肽，該抗/耐草甘膦蛋白質多肽的胺基酸序列為SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或與上述胺基酸序列相比具有不小84%相同性的胺基酸序列。
[0010]SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO:6 分別表示為 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5編碼的胺基酸序列。這三種胺基酸序列均包含四個特異性位點，麥冬中為144m, 184i, 232a以及273m，土麥冬和闊葉土麥冬中為146m，186i，234a以及275m，相當於大腸桿菌EPSP合酶胺基酸序列中70、107、153以及192位。
[0011]胺基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6表示的蛋白質多肽包括信號肽和成熟蛋白兩部分。
[0012]本發明還提供一種通過突變獲得保持有抗草甘膦能力的突變基因的方法，該方法包括以下步驟:
(I)獲得突變基因，所述突變基因編碼的蛋白質胺基酸序列SEQ ID NO:7(此序列為SEQID N0:4去除信號肽後的胺基酸序列)的第280到294位(保守區I)和第416到433位(保守區2)胺基酸序列至少各發生一個胺基酸突變；(2)然後通過草甘膦篩選突變基因，從而選擇高抗草甘膦的突變基因。
[0013]其中突變基因採用易錯傾向PCR、定點突變、人工合成技術或者其他基因突變技術獲得。
[0014]通過上述方法，本發明提供了一種具有草甘膦耐性的基因，基因編碼的蛋白質的胺基酸序列在SEQ ID NO:7的第280到294位的保守區1、第416到433位的保守區2中至少各發生一個胺基酸突變。特別在保守區I和保守區2個至少引入I個或者I個以上如下位點的特變:保守區1:1)第284位賴氨酸；2)第285位苯丙氨酸；3)第289位亮氨酸；保守區2:1)第416位纈氨酸；2)第421位精氨酸；3)第422位天冬氨酸；4)第424位甘氨酸；5)第425位半胱氨酸。
[0015]本發明同時也提供一種抗草甘膦的突變基因，其編碼的蛋白質在以下兩個保守區域至少各發生一個胺基酸突變。保守區1:1)第284位胺基酸由賴氨酸變為精氨酸；2)第285位胺基酸由苯丙氨酸變為酪氨酸；3)第289位胺基酸由亮氨酸變為組氨酸；保守區2:I)第416位胺基酸由纈氨酸變為穀氨酸；2)第421位胺基酸由精氨酸變為甘氨酸；3)第422位胺基酸由天冬氨酸變為纈氨酸；4)第424位胺基酸由甘氨酸變為半胱氨酸；5)第425位胺基酸由半胱氨酸變為酪氨酸。
[0016]本發明進一步提供一種具有草甘膦耐性的蛋白質，其第280到294位的胺基酸序列為SEQ ID N0:8-SEQ ID NO: 14中的任意一種，第280到294位的胺基酸序列為SEQ IDN0:15-SEQ ID N0:28 中的任意一種。
[0017]本發明還提供了一種具有草甘膦耐性的蛋白質，該蛋白質的胺基酸序列為SEQ IDNO:29-SEQ ID NO:52 中的任意一種。
[0018]本發明還提供了核苷.酸序列為編碼上述蛋白質多肽的基因。
[0019]利用上述具有草甘膦耐性基因的核酸序列，可以用來人工引入一個或多個變異，然後通過草甘膦篩選變異分子，而獲得保持有抗/耐草甘膦能力的變異分子。例如利用低保真PCR的方法可以產生很多LSEPSPS的變異分子，而這些變異分子可以通過草甘膦篩選獲得繼續保持或增強有抗/耐草甘膦能力的變異分子。上述具有抗/耐草甘膦的LS-EPSPS基因LsEPSPSl、LsEPSPS2和LsEPSPS3及其獲得的保持有草甘膦耐性的突變基因LSE-EPSPS統稱為抗/耐草甘膦基因(LSEPSPS)。
[0020]本發明還提供了能夠與上述蛋白質多肽結合的抗體。
[0021]利用本發明的基因編碼的胺基酸序列，可設計和人工添加信號肽序列以有利於在植物中的表達。
[0022]利用本發明的基因編碼的胺基酸序列，可以設計和人工合成密碼子優化的有利於在植物中表達的核酸序列。例如Campbell和Gowri (1990)的報導(PlantPhysiology, 92:1-11)。
[0023]本發明還提供了一種包含上述抗/耐草甘膦基因的表達載體，所述表達載體為原核表達載體或植物轉化質粒。
[0024]構建包含表達構件的原核表達載體時，表達構件包括啟動子和抗/耐草甘膦基因，載體質粒可以是PET系列、pMAL-p2X或pRSET-A等。在原核生物表達系統中，啟動子可以是T7噬菌體啟動子或者Iac (乳糖啟動子)、trp (色氨酸啟動子)、PL和PR( λ噬菌體的左向和右向啟動子)以及tac (乳糖和色氨酸的雜合啟動子)等強啟動子。[0025]利用上述抗/耐草甘膦基因進一步構建包含表達構件的植物轉化質粒時，表達構件包括啟動子，帶有葉綠體信號肽的抗/耐草甘膦基因和終止子。在轉化單子葉植物時啟動子可以是玉米Ubiqut in啟動子,或者水稻Act in啟動子,或者其他啟動子。而終止子可以是根據根癌農桿菌終止子或者其他終止子。抗/耐草甘膦的LSE-EPSPS基因在5』端連接一個在同一個表達閱讀框內表達的編碼信號肽的DNA片段,這個信號肽可以引導LSEPSPS蛋白質進入葉綠體。這個信號肽可以是Rubisco的亞基的信號肽(de castro Silva Filho1996 Plant Mol.Biol.30: 767 一 780 )，或者植物 EPSPS 信號肽(Archer 1990 J? Bioenerg.Biomemb.22 ( b ): 789 — 8 10 )，或者其他能使 EPSPS 發揮功能的信號肽，或者無信號肽。這個表達構件可以通過農桿菌(如Agrobacterium菌株LAB 4404 )轉入整合到植物的基因組中，穩定遺傳和表達。
[0026]本發明還提供了包含上述抗/耐草甘膦基因的植物細胞，以及包含該植物細胞的抗/耐草甘膦植株。
[0027]本發明還提供了上述抗/耐草甘膦基因在製備抗/耐草甘膦植株方面的用途，以及上述抗/耐草甘膦基因作為植物轉基因篩選標記的用途。
[0028]利用抗/耐草甘膦基因製備抗/耐草甘膦植株，可通過含有LSEPSPS表達構件的植物轉化質粒獲得。植物轉化的方法和步驟各種植物有所不同，同種植物不同的品種也可能有所不同。但是植物轉化的技術和方法是已知和成熟的。通常通過農桿菌或基因槍導入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質體。然後用不同濃度的草甘膦培養基進行篩選培養。再進行分化而獲得轉化芽，經過生根培養基培養就可以獲得可以種植的種苗。也可以通過花粉介導法，通過農桿菌導入植物的花粉從而獲得轉基因的種子。更進一步，草甘膦可以噴施在轉化苗及其後代篩選除去未轉化植株和後代分離失去LSEPSPS基因的植株。具體可通過以下步驟製備:
(1)利用DNA重組技術，構建含有所述抗/耐草甘膦基因的植物轉化質粒；
(2)將步驟(I)中構建的植物轉化質`粒通過基因槍或農桿菌浸染方法或花粉介導法導入植物組織，利用草甘膦培養基篩選含有抗/耐草甘膦基因的植物細胞；
(3)將步驟(2)中篩選的植物細胞進行分化獲得轉化芽，經過生根培養獲得植物種苗，從而得到所述抗/耐草甘膦植株。
[0029]植物可選取水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、馬鈴薯、甘薯、穀子、高粱、大麥、油菜、甘蔗、菸草、草坪草(狗牙根、結縷草、黑麥草、早熟禾、暖地大葉草、剪股穎、海濱雀稗)或牧草(紫苜蓿、紅三葉草、雀稗)、蔬菜(青菜、白菜、黃瓜、芹菜、辣椒、茄子)、花卉(月季、康乃馨、菊花)。
[0030]抗/耐草甘膦基因作為植物轉基因篩選標記時，通過已知的分子克隆技術可以使LSEPSPS在植物細胞中表達，通常構建一個在植物中表達的表達構件。這個表達構件包括啟動子、帶有葉綠體信號肽的LSEPSPS和終止子。這個表達構件可作為篩選標誌被克隆到植物轉化質粒。植物轉化質粒通常還含有目的基因和其他DNA序列。植物轉化質粒可以通過基因槍或農桿菌浸染方法或花粉介導法導入植物組織，而含有合適濃度的草甘膦培養基則可以選擇性地殺死沒有導入質粒DNA的植物細胞，從而選擇含有LSEPSPS目的基因的植物細胞。
[0031]本發明適用於所有植物，包括雙子葉和單子葉植物。[0032]本發明相比現有技術具有以下優點:本發明基於自然界的植物天然耐性為基礎，經過前期大量植物對草甘膦的耐性篩選，代替依賴於在長期草甘膦環境中生存的植物或微生物的抗性生物型篩選，發現了百合科麥冬草的草甘膦耐藥性，並利用易錯傾向PCR技術進行基因改造使其獲得更高的草甘膦抗性，為培育抗/耐草甘膦除草劑作物提供了新的選擇，增加抗/耐草甘膦除草劑轉基因技術的多樣性，從而降低了抗/耐除草劑轉基因技術的生態風險；再則，由於本發明的基因是植物本身來源，在培育抗/耐草甘膦除草劑作物後的生態環境和食品安全風險要低於不同生物類別的異源基因，提高民眾認可。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0034]實施例1.麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的草甘膦抗性實驗
選取長勢均勻的麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬，進行噴霧處理。草甘膦濃度設置為0、375、750、1500、3000、6000、12000、24000a1.g/ha，試驗按照設計用量處理供試植物材料，每一處理重複四次。噴藥後觀察植株受損傷程度，每周調查並記錄藥害等級，繪製抑制率曲線並進行Logistic回歸分析，計算ED50值。重複三次。結果發現，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬的草甘膦抗性分別是一般植物的4.73、5.06和5.8倍。
[0035]實施例2.EPSPS基因的克隆
以麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬總RNA反轉錄產物為模板，利用EPSPS基因保守序列設計引物，進行RT-PCR反應，將擴增得到的片段克隆至pMD19-T載體中，進行測序及BLAST。
[0036]得到保守區的序列後，再通過RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術，進行EPSP合成酶基因的全長克隆。以接頭引物AP進行麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬RNA的反轉錄，利用已經得到的基因.保守區序列設計基因特異性引物，並與3』端的特異引物進行RT-PCR 反應。
[0037]根據已經得到的目的基因片段，利用TdT末端轉移酶法進行5』端的克隆。設計基因特異性引物反轉錄後進行單引物的擴增，然後純化擴增產物，用dCTP和TdT對純化的擴增產物加尾，使用錨定引物進行PCR擴增帶有dC尾的產物，最後使用巢式重新擴增初步PCR產物。將擴增得到的序列進行克隆測序。
[0038]最後，將保守區、3』端序列，5』端序列進行拼接，獲得麥冬草EPSPS基因的cDNA的全長序列。麥冬基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1，並命名為LsEPSPSl，其編碼的胺基酸為SEQ ID NO: 2 ;土麥冬EPSPS基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 3，並命名為LsEPSPS2，其編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO: 4 ;闊葉土麥冬EPSPS基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:5，並命名為LsEPSPS3，其編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO: 6。
[0039]實施例3.麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSPS基因編碼胺基酸序列的分析比對 通過MAGA軟體分析比較了與麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶一致性較高的約260
條EPSP合酶胺基酸序列，發現麥冬、土麥冬與闊葉土麥冬的EPSP合酶的胺基酸序列與其他植物相比存在四處特異的胺基酸，分別是144m，184i，232a以及273m (序列編號根據麥冬EPSP合酶胺基酸序列SEQ ID NO: 2，相當於大腸桿菌EPSP合酶的70、107、153及192位，土麥冬和闊葉土麥冬中為146m，186i，234a以及275m)，這些位點的胺基酸在麥冬、土麥冬與闊葉土麥冬中均保守，但在其他植物的相同位點均不存在。正是由於這些胺基酸的存在導致了麥冬、土麥冬與闊葉土麥冬對草甘膦的耐藥性。
[0040]144和273位的Met中含有甲硫基一SCH3，其他胺基酸中均不含有，可能由於甲硫基的存在導致EPSP合酶結構發生改變。
[0041 ] 184位的IIe與其他植物中的Val和Thr相比，R基團多一個一CH2—，可能由於一CH2—的增加致使同一位點所需的空間體積增大，使得與草甘膦的結合的空間位阻增大。
[0042]232位的Ala與其他植物中的Val相比，少了兩個一CH3，使得R基團長度和空間位阻都減少，可能造成EPSP合酶結構發生改變。
[0043]將麥冬的EPSP合酶的胺基酸序列洪516個胺基酸)進行二級結構預測，並與已知的EPSP合酶主鏈圖進行比較，發現整個胺基酸部位總共有12個螺旋(除信號肽)，第144位甲硫氨酸位於第2和第3個螺旋的轉角處，大約處於第3區；第184位異亮氨酸位於第3個螺旋上;第232位丙氨酸位於第4和第5螺旋的第2個摺疊處；第273位甲硫氨酸位於第5和第6個螺旋的摺疊處。
[0044]144Met與草甘膦結合位點22Lys以及S3P結合位點23Ser、27Arg較為接近；184Ile與草甘膦結合位點96Gly、94Asn同處於第三個螺旋上，其增加的主鏈長度可能會使草甘膦結合的空間位阻增大從而降低草甘膦與EPSP合酶的親和性；232Ala與124Arg很接近；273Met與其空間構像可能會影響169Ser、170Ser、171Gln以及197Ser都處於第5個結構域。這四個位點均處於底物與酶的結合有關的區域，此四個胺基酸的變化，可能導致EPSP合酶結構的變化，使·其與底物的結合程度發生變化，從而導致草甘膦的耐藥性。
[0045]實施例4.錯誤傾向PCR突變擴增
根據已知的土麥冬的EPSPS基因設計引物，並以此為模板，進行錯誤傾向PCR致突變反應，體系總體積IOOul:1OX致突變PCR緩衝液10L1，IOXdNTP混合物10 ul，引物各10 ul, MnC1210ul,模板lOul，TaqDNA聚合酶lul，超純水39ul.將混合好的反應體系以IOul分裝入印pendorf管中進行PCR循環反應，反應條件為:94°C變性5 min, 94°C變性I min, 50°C退火I min, 72°C延伸I min, 72°C延伸10 min.30個循環後，110%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色後對其進行紫外分析檢測.用Promega公司DNA純化試劑盒回收瓊脂糖上PCR產物.擴增得到約1300bp的目的片段。
[0046]實施例5.重組質粒的構建及陽性克隆菌株的篩選及鑑定
用SphI和HindIII限制性酶分別切割PQE80L質粒載體和PCR突變產物，得到具有粘性末端的基因片段(大小分別約為4.7 kb和1.3kb)，將酶切後的基因片段用T4連接酶連接，再進行感受態細胞E.coli轉化.挑取將能在含草甘膦lOOmmol/L培養基上生長的菌落，進行質粒的提取，並再次轉化E.coli，使得原本在lOOmmol/L草甘膦培養基上不能生長的大腸桿菌獲得草甘膦抗性。經測序得到該核苷酸序列為SEQ ID N0:29-SEQ ID NO:52。
[0047]實施例6.高抗草甘膦LSE-EPSPS胺基酸序列突變位點的分析
在lOOmmol/L草甘膦上能夠正常生長的克隆可能包含一個抗草甘膦性能比原始基因LS-EPSPS更加高的突變體。因此測定了實施例2獲得的抗草甘膦克隆的突變區域的核苷酸序列，結果發現這此基因在保守區I (從第280到294號胺基酸)和保守區2 (從第416到433號胺基酸)的突變結果如下:
表I EPSP合酶胺基酸序列保守區突變情況_保守區域I序列I突變情況
280-294 280GGDVKFAEVLEKMG294A_K284R, F285Y, L289H_
416-433 |416VPVTIRDPGCTRKTFPD433Y |v416E, R421G, D422V, G424C, C425Y
實施例7.保守區胺基酸突變功能驗證
為了驗證保守區280-294以及416-433區域的突變位點是否導致草甘膦抗性，本發明通過定點突變的方法獲得一系列的突變基因，並將其導入大腸桿菌，在含有lOOmmol/L草甘膦培養基上37°C培養48h，觀察生長情況，對能夠正常生長的突變基因進行統計，結果發現，草甘膦抗性蛋自質的第280到294位的胺基酸序列為SEQ ID N0:8-SEQ ID NO: 14中的任意一種，第280到294位的胺基酸序列為SEQ ID N0:15-SEQ ID N0:28中的任意一種。符合上述條件的蛋白質具有草甘膦抗性。
[0048]實施例8.LS-EPSPS和LSE-EPSPS基因在大腸桿菌中的表達
LS-EPSPS基因克隆在載體PET-28a中並轉入大腸桿菌BL21(DE3)獲得轉基因菌株。轉基因菌株的閱讀框在PET系統的T7啟動子的控制下而獲得表達。
[0049]轉LS-EPSPS-PET菌株和轉PET_28a菌株(空載體，對照)在LB中培養，當OD6tltl達到0.6時，分別將轉基因菌株和PET-28a在37°C含Kan的LB液體培養基中生長至OD值0.4左右，1%的接種量接入草甘膦濃度分別為0、1500、3000、4500、6000、7500、9000、10500以及12000mg/L的含Kan的LB液體培養基中，同時加IPTG至終濃度為I mmol/L，12?16h後測OD值，從而得到轉基因菌株和PET-28a在不同草甘膦濃度下的生長曲線並進行Logistic回歸分析，實驗結果發現在7500和9000mg/L濃度下，轉LS-EPSPS-PET菌株的0D% (0D值佔對照的百分比)值約為70%和60%，而轉PET-28a菌株的0D%僅為對照的20%和1%，說明在7500和9000mg/L濃度下，轉LS-EPSPS基因菌株對草甘膦的抗性大大高於空載菌株。根據Logistic方程，轉LS-EPSPS基`因菌株的ED5tl值也大大高於空載體PET_28a。這些說明LS-EPSPS基因具有抗/耐草甘膦能力。
[0050]用EcoRI和HindiII限制性酶分別切割pET_28a質粒載體和PCR突變產物LSE-EPSPS基因，得到具有粘性末端的基因片段(大小分別約為5.81*和1.3 kb),將酶切後的基因片段用T4連接酶連接，再進行感受態細胞BL21(DE3)轉化，獲得重組菌株，重組菌株的閱讀框在PET系統的T7啟動子的控制下而獲得表達。分別用5ml含有50 u g /mlKan 的 LB 液體培養基培養轉化子 BL21 (LSE-EPSPS), BL21 (LS-EPSPS)，以 200rpm，37°C 空氣浴的條件至細胞濃度達108/ml,以1%的接種量,轉接到新鮮的含有50 u g /ml Kan的LB液體培養基中，200rpm、37°C繼續培養至OD6tltl=0.75時，加入IPTG至I mmol/L以誘導重組蛋白的合成。在前述條件下，繼續培養3小時。離心收取菌體,採用Laemmli所述的方法，先用SDS-PAGE樣品緩衝液重懸菌體，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質。電泳完畢，用20%的考馬氏亮藍染色。
[0051]實施例9.EPSP合成酶粗提物的製備
分別用5ml含有50 u g /ml Kan的LB液體培養基培養轉化BL21 (LSE-EPSPS)，BL21 (LS-EPSPS)，以200rpm，37°C空氣浴的條件至細胞濃度達10%1，以1%的接種量，轉接到新鮮的含有50 u g /ml Kan的LB液體培養基中，200rpm、37°C繼續培養至OD6tltl=0.75時，加入IPTG至ImM以誘導重組蛋白的合成。在前述條件下，繼續培養3小時。離心收取菌體。用緩衝液A (50mM Tris-Cl, 0.1mM DTT, pH 7.2)重懸菌體。細胞懸液置_70°C凍結，再在室溫中重融。然後用Fluko公司的乳化機處理細胞懸液使其破壁。以12000rpm離心30分鐘，棄去細胞碎片。上清液即為EPSP合成酶粗提物，可用於有關該酶的各項指標的測定。
[0052]實施例10.離體EPSP合酶活性測定
稱取麥冬、土麥冬、闊葉土麥冬以及野生擬南芥幼苗0.5 g，加150 ml提取緩衝液A[100mmol/L 的 Tris pH 7.5,1 mmol/L 的 EDTA、10% (V/ V)的甘油、I mg/L 的 BSA、10 mmol/L 的維生素 C(Vc)、1 mmol/L 的苯脈(benzamidine)、5 mmol/L 的 DTT、20 mg/ml PVPP],研磨勻漿，用6層紗布過濾，12000rpm、4°C下離心20 min,上清液為EPSP合酶的粗酶液。40 μ I酶促反應體系(50 mmol/L 的 HEPES pH7.5、1 mmol/L 的(NH4) 6MQ7024、I mmol/L 的 PEP、2 mmol/L 的 S3P、1 mg/L 的 BSA，草甘膦濃度設置為 0、100、200、500、800、1000 以及 2000umol/L)於25°C下預熱5 min,加入10 μ I酶液,25 °C下酶促反應15min,迅速放入沸水中停止酶促反應，冷卻至室溫，再參照Lanzetta和Alvarez (1979)的方法加800 μ I孔雀石綠鹽酸鹽顯色反應30min，後再加100 μ I 34%的檸檬酸鈉溶液，30min後於660 nm的分光光度計上測定0D660值。結果發現，野生型擬南芥EPSP合酶活性在500 umol/L時出現明顯的下降，麥冬EPSP合酶活性在800 umol/L時出現明顯的下降，土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶活性在1000 umol/L時才出現明顯的下降。進行Logistic回歸分析並計算ED5tl值,擬南芥、麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶的ED5tl值分別為560、860、1090以及1070umol/L，由此可見，麥冬、土麥冬和闊葉土麥冬EPSP合酶的活性明顯高於野生型擬南芥。
[0053]實施例11.真核表達載體的構建
一般地含有35S啟動子的植物表達載體比較適合外源基因向雙子葉植物的轉移，啟動效率很強，容易在轉基因後代中轉錄和表達，但35S啟動子不適合在單子葉植物中發揮作用；單子葉轉基因植物主要使用actin、emu、ubquitin promoter三種啟動子,它們來源於單子葉植物，比較適合外源基因向單子葉植物的轉移。終止子較常用的是胭脂鹼合成酶基因終止子N0S，標記基因.可以是新黴素磷酸轉移酶(npt II )、氯黴素乙醯轉移酶基因(cat)、螢光素酶基因(luc)、綠色螢光蛋白基因(gfp)或者β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)等等。以植物表達載體PBI121-LSEPSPS的構建為例:利用DNA重組技術，將LSEPSPS基因克隆至植物表達載體PBI121中，通過酶切、電泳鑑定LSEPSPS基因已成功構建到植物表達載體PBI121中；然後將重組質粒PBI121-LSEPSPS通過凍融法導入根癌農桿菌EHA105中，Kan平板篩選陽性克隆，生長的單菌落進行PCR鑑定，證明重組質粒已轉入根癌農桿菌EHA105中。對於不同的植物可選擇不同的表達載體，也可對其進行重組和改造，例如替換或增加啟動子、終止子或標記基因。
[0054]實施例12.轉基因擬南芥的抗性鑑定
用花序浸染法轉化野生型擬南芥，將LS-EPSPS基因和人工合成LSE-EPSPS相似序列以及由於低保真PCR擴增得到的變異的LSE-EPSPS基因構建好PBI121-LSEPSPS的植物表達載體並用凍融法轉入農桿菌EHA105,製備好已轉化了相應質粒的農桿菌菌液IOml,在轉化前ld，轉入大瓶培養過夜，第2d取出使用時菌液的0D_應當在1.2到1.6之間。室溫下5000r/m離心15min,棄上清液,將農桿菌沉澱懸浮於相應體積的滲透培養基中，使0D_在
0.8左右。將上述農桿菌懸浮液注人噴霧器中，對準植物的地上部分進行噴灑，直到植株上有水珠滴下時為止。用保鮮膜將這些植物(T0代植物)罩起來以保持溼度，置入培養室中培養，2到3d後可去掉保鮮膜，轉化後Iw左右方可澆水。繼續培養至植物成熟，收種子(Tl代)放在乾燥環境中Iw左右，進行轉化子的篩選。將成功轉化的植株進行抗性鑑定，其具備草甘膦抗性，可以作為轉基因篩選標記。
[0055]將篩選獲得轉基因擬南芥植株，以非轉基因和轉LS-EPSP基因的擬南芥組培苗的莖作為外植體在進行愈傷組織的誘導，培養基為6-BA2.0mg/L和NAA0.lmg/L的MS培養基。在愈傷生長2?3周後，進行草甘膦處理。將通過Kan抗性篩選的轉基因抗性愈傷組織和野生愈傷組織分別接種到草甘膦的濃度為O mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L和1000mg/LMS培養基中，然後於25°C，16h/8h進行光、暗交替培養，兩周後統計結果。對照擬南芥愈傷組織在草甘膦濃度為50 mg/L時，已變黃並逐步壞死。而轉基因擬南芥愈傷組織在600mg/L時仍可以正常生長，當濃度達800mg/L時生長才受到抑制，褐化變黃。
[0056]實施例13.轉變基因抗/耐草甘膦油菜的獲得
目前常用的轉基因方法主要有農桿菌介導轉化法、雷射微束穿刺法、PEG法、電擊法、微注射法和花粉介導法。以花粉介導法為例介紹轉基因抗/耐草甘膦油菜的獲得。
[0057]進入油菜盛花期後，選取主莖或一次分枝上10?15個I?2 d內將要開放的花蕾徒手去雄，並摘除所選莖或分枝上其他花蕾，然後套袋。同時在同一品種中選取第2天將開放的花序進行套袋，以備第2天取粉用。翌日上午當天開放的套袋植株的花粉約0.4g，懸浮在25 ml 7.5%的蔗糖溶液中，進行第I次超聲波處理，然後在溶液中加入20 μ g含EPSPS基因的質粒DNA進行第2次超聲波處理。第2次處理後，在溶液中加入10 μ L 1/10000(ff/V)硼酸，然後用處理過的花粉授在前一天去雄的油菜柱頭上，套袋並掛牌，同時標註授粉花蕾數。授粉後5?6 d去袋，使處理的授粉株充分發育。採收種子。
[0058]實施例14.轉基因抗/耐草甘膦玉米的獲得
在溫室對受體材料以7 d 為周期分期播種，玉米試材按試驗需要進行控制授粉，授粉後10?13 d，取玉米幼胚作為轉化受體。用次氯酸鈉消毒玉米棒後，剝出幼胚(剝幼胚時要謹慎，不要創傷胚)，用侵染液(加AS)清洗幼胚4遍，然後加入一定濃度的農桿菌菌液，放置10?30 min，取出後用滅菌濾紙吸乾，放到共培養培養基上，在25°C (黑暗)共培養2?5山然後將幼胚轉移到靜息培養基，在28°C條件下暗培養7 d。侵染和共培養環節菌液濃度0D500=0.3?0.5，侵染時間10 min)、共培養時間3 d。從靜息培養基上把幼胚移入含有草甘膦的抗性篩選培養基上，暗培養。先在含10 mg/L除草劑低選擇壓下培養14 d,再經過80 mg/L除草劑高壓選擇，第3次篩選濃度加大至160 mg/L。每次繼代注意淘汰呈褐色和水潰化的愈傷組織，並把生長正常的愈傷組織用鑷子夾碎，分開選擇培養。在繼代篩選過程中注意經常觀察發現汙染或農桿菌復出的立即移出，未汙染材料繼續培養。另外，經常把出現褐化汙染的組織塊剔出或轉移好的未被汙染的組織塊到新的相同培養基上。組織塊膨大後，經常把大塊組織剝小，連續繼代篩選3次後，將選擇到的抗性愈傷組織轉到再生I培養基上，恢復培養15 d或更長時間(暗培養)。再將抗性愈傷組織轉到再生II培養基上發芽，培養條件為28°C，每日3 000 Ix光強下，光照12 h。待再生的玉米植株長到3片葉時，可將幼苗分移植到含生根培養基的瓶中，在室內培養。當幼苗長出較粗的根後，將幼苗從罐頭瓶中取出，用水衝淨培養基，移栽於混有營養土和蛭石(I: 3)的小花盆中，當玉米又長出2?3片新葉時，可將其移入大田或大花盆中，待長出三四葉後提取葉片DNA進行PCR檢測。確定含有轉入的LSEPSPS基因。[0059]實施例15.轉基因抗/耐草甘膦棉花的獲得
大量提取植物表達載體質粒DNA，選擇次日將開放的花蕾進行自交。由於棉花是常異交植物，天然異交率在10%左右，因而外來花粉往往會造成品種間的混雜。在開花前一天，可見花冠快速伸長，黃色或乳白色的花冠呈指狀突出於花蕾，次日即開放成為花朵。選擇這樣的花蕾，於指狀花冠的前端用細線紮緊，並將細線的另一端繫於鈴柄，作為收穫時的標記；在開花後20-24h左右即次日，選擇果枝和花位較好的幼子房作為轉化對象。一般選擇每個果枝的第一和第二個果節位的花朵進行轉基因操作。這些果節上的棉鈴一般成鈴率較高，有利於收穫較多的種子；用50田微量進樣器作為微注射的工具。每次使用前和使用後，應以淡洗滌劑清洗，再用蒸餾水漂清；注射時，摘除或剝去花瓣，抹平花柱。在剝除花瓣時，注意不能損傷幼子房的表皮層，以免增加脫落率；用右手持微量注射器，左手輕扶摘除花瓣後的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進針至子房長度的約三分之二處，並後退至約三分之一處。
[0060]花粉管通道法轉化得到的棉花種子(T0代)收穫後於在溫室盆栽幼苗，在2-3葉期，以草甘膦胺鹽水劑噴灑棉花葉片(草甘膦施用量1000克/公頃)。一周後觀察植株生長狀況，拔除葉片表面有退綠斑點的植株。為獲得高抗草甘膦的轉基因棉株可連續進行3次篩選，時間間隔為10-14天。生長正常的被認為是獲得抗性基因的植株。共獲得3株。
[0061]實施例16.轉基因抗/耐草甘膦菸草的獲得
農桿菌活化；共培養:將侵染過的葉塊擺放在鋪有2層濾紙的菸草芽分化培養基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L)上，25oC暗培養4天；抗性芽的篩選:將經過共培養的菸草外植體轉移到抗性芽篩選培養基(MS+ IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L +KanlOO mg/L +Carb500mg/L)上，2-3周後即可生芽。生根:待抗性芽長到Icm左右時，將其轉移到生根培養基(MS+KanlOO mg/L +Carb500mg/L)上，I-2周後即有不定根形成。將菸草無菌苗移溫室栽，長有6-8片真葉時，分別塗摸I %。、2 %。、3 %。、4%。、5 %。、6 %。濃度的早甘勝除早劑(商品名為農達Roundup) ο繼續培養兩周觀察菸草的草甘膦抗性,敏感的植株葉片出現黃花,而抗性植株生長正常，共獲得了 5株。
[0062]實施例17.轉基因抗/耐草甘膦黃瓜的獲得
菌株培養:從平板上挑取含構建好的植物表達載體的根癌農桿菌單菌落接種於5 mlLB+50 mg/L卡那黴素(Kan)的培養液中，於28°C，200 r/min條件下培養16h後，轉接到新鮮的90 ml LB+50 mg/L卡那黴素的培養液中，在同樣的條件下繼續培養至對數生長期時(4-5h，OD 0.8-1.2)，用液體MS洗滌3次後，重懸於MS液體培養基中，使其OD值為0.2-0.3即可用於轉化。愈傷組織誘導和植株再生:將黃瓜種子浸入75%的乙醇中處理30 S，再用次氯酸鈣溶液處理15 min，無菌水衝洗5次，播種在發芽培養基上，25°C黑暗萌發。取萌發2-3天的黃瓜子葉，切成5 _方塊，與處於對數生長期經MS培養基適當稀釋的農桿菌(含有LSEPSPS基因)共浸染一定時間，將浸染後的外植體置於再生培養基上，24-25°C暗培養2天，再轉至含羧苄青黴素和一定濃度草甘膦的誘芽培養基，24-25°C暗培養2-3周，進行愈傷組織分化。由子葉產生的愈傷組織獲得的抗性芽，轉至1/2MS培養基(含羧苄青黴素和一定濃度草甘膦)獲得轉化植株。
[0063]實施例18.轉基因抗/耐草甘膦月季的獲得
月季成熟小葉外植體葉背朝下接種到添加了 2，4-D0.5mg/L和pCAP3.0mg/L的愈傷組織誘導培養基上，光照條件下培養20d。將繼代20?30d的新鮮愈傷組織置於農桿菌菌液(0D600=0.8)中侵染20min，，然後倒出愈傷組織，在無菌濾紙上適當晾乾後接入含IOOuMAS、改良1/2MS鹽類的共培養培養基中，25°C黑暗條件下共培養，用EHA105浸染的培養物共培養3?4d，以愈傷組織周圍農桿菌長至肉眼可見菌落時為好。共培養結束後，愈傷組織用無菌水清洗I?2遍,在無菌濾紙上晾乾後接入含70mg/L潮黴素和300mg/L頭孢黴素的選擇培養基，25°C黑暗條件下選擇培養，2?3周繼代一次，進行抗性愈傷的選擇和增殖。對選擇3個月的抗性愈傷組織進行⑶S反應檢測，一團抗性愈傷組織上的不同部分呈現深藍色，淺藍色或無藍色反應，表現為明顯的嵌合體。PCR檢測，抗性愈傷組織中能擴增出目的片段。對抗性愈傷組織進行擴繁，然後進行再生植株的誘導和檢測。
[0064]實施例19.轉基因抗/耐草甘膦狗牙根的獲得
狗牙根莖節的分生能力強，選用含莖節長約0.5?1.0 cm的莖段為外植體。用自來水洗淨表面，70%酒精浸泡30s，無菌水衝洗3次，0.1%氯化汞消毒lOmin，無菌水衝洗3次。取滅菌過的濾紙，吸乾表面水分，接種於誘導培養基。愈傷組織的誘導以含2，4-D2mg/L+NAA3mg/L+6-BA0.2mg/L的MS培養基。繼代培養2周，然後轉移至含6_BA3mg/L+KT4.0mg/LMS分化培養基。置於28°C、16h光照、光10?30uEm-2s_l的人工氣候室分化，每2周以相同培養基繼代I次。將分化的小植株接於含NAA0.3mg/L的MS生根培養基，經2周生根培養後移至不含激素的1/2MS培養基壯苗，爾後移栽。取0D600?0.5的農桿菌菌液，25°C浸泡lOmin，用滅過菌的濾紙吸去多餘菌液，放入MS誘導培養基，暗條件共培養2d，然後用含Carb500mg/L的無菌水清洗愈傷。50mg/L潮黴素用作篩選物質,經3輪篩選,再生的植株苗長約15cm時轉移至溫室煉苗2周，成活後進行⑶S組織化學染色和PCR鑑定，獲得了陽性植株，移栽在網室自然生長。
[0065]實施例20.抗LSEPSPS單克隆抗體的製備
將含有LSEPSPS基因的重組單克隆表達菌落置於LB培養液(含有Kan 50mg/L)中，37°C，300rpm培養，至細菌生長達到對數生長晚期後，加入終濃度為0.025mmol/L的IPTG，22°C低溫誘導表達8h，離心`10000rpm，10min，收集菌體，加入蛋白上樣緩衝液，煮沸5min，進行12%SDS — PAGE鑑定，使之在大腸桿菌BL21 (DE3)中獲得高效表達。將製備的菌體經過超聲破碎之後，以4°C，12000rpm離心20分鐘，收集上清，進行親合層析純化。採用純化的重組EPSPS抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟B淋巴細胞小鼠骨髓瘤細胞SP2/0在聚乙二醇(PEG)作用下進行融合，通過ELISA篩選穩定分泌抗LSEPSPS的單克隆雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞株注入小鼠腹腔，生的腹水中含有高效價的單克隆抗體。用飽和硫酸銨法純化腹水IgG。
[0066]實施例21.變異來源和蛋白表達來源LSEPSPS分子的草甘膦抗性鑑定 LSEPSPS可以用來人工引入單個或多個變異而獲得保持有抗草甘膦能力的LSEPSPS變
異分子。例如利用低保真PCR的方法可以產生很多LSEPSPS變異分子，而這些變異分子可以通過草甘膦篩選獲得繼續保持有抗草甘膦能力的LSEPSPS變異分子。密碼子具有簡併性:除了甲硫氨酸和色氨酸外，每一個胺基酸都至少有兩個密碼子。這樣可以在一定程度內，使胺基酸序列不會因為某一個鹼基被意外替換而導致胺基酸錯誤。LSEPSPS基因翻譯得到的胺基酸序列推導其編碼的鹼基序列，會得到多條與LSEPSPS相似的序列，此序列亦具有草甘膦抗性。將人工合成LSEPSPS相似序列以及由於低保真PCR擴增得到的變異的LSEPSPS基因構建好PBI121-LSEPSPS的植物表達載體並用凍融法轉入農桿菌EHA105，製備好已轉化了相應質粒的農桿菌菌液IOml,在轉化前Id,轉入大瓶培養過夜,第2d取出使用時菌液的OD6tltl應當在1.2到1.6之間。室溫下5000r/m離心15min，棄上清液，將農桿菌沉澱懸浮於相應體積的滲透培養基中，使0D_在0.8左右。將上述農桿菌懸浮液注人噴霧器中，對準植物的地上部分進行噴灑，直到植株上有水珠滴下時為止。用保鮮膜將這些植物(T0代植物)罩起來以保持溼度，置入培養室中培養，2到3d後可去掉保鮮膜，轉化後Iw左右方可澆水。繼續培養至植物成熟，收種子(T1代)放在乾燥環境中Iw左右，進行轉化子的篩選。將成功轉化的植株進行抗性鑑定，其具備草甘膦抗性，可以作為轉基因篩選標記。
[0067]顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或.聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種具有草甘膦耐性的基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO=USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5o
2.一種具有草甘膦耐性的蛋白質多肽，該蛋白質多肽的胺基酸序列為SEQ ID Ν0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6。
3.一種具有草甘膦耐性的基因，該基因的核苷酸序列為編碼權利要求2所述蛋白質多肽的核苷酸序列。
4.一種具有草甘膦耐性的基因，其特徵在於:所述基因編碼的蛋白質的胺基酸序列在SEQ ID NO:7的第280到294位的保守區1、第416到433位的保守區2中至少各發生一個胺基酸突變；所述保守區I中的胺基酸突變優選發生在第284位、第285位、第289位；所述保守區2中的胺基酸突變優選發生在第416位、第421位、第422位、第424位、第425位；所述胺基酸突變最優為:第284位胺基酸突變為精氨酸，第285位胺基酸突變為酪氨酸，第289位胺基酸突變為組氨酸，第416位胺基酸突變為穀氨酸，第421位胺基酸突變為甘氨酸，第422位胺基酸突變為纈氨酸，第424位胺基酸突變為半胱氨酸，第425位胺基酸突變為酪氨酸。
5.一種具有草甘膦耐性的蛋白質，其特徵在於:所述蛋白質的胺基酸序列的第280到294位的保守區I為SEQ ID NO:8_14中任意一種，第416到433位的保守區2為SEQ IDNO:15-28中任意一種，其餘胺基酸序列同胺基酸序列SEQ ID NO:7 ;或所述蛋白質的胺基酸序列優選為SEQ ID NO:29-52中任意一種。
6.一種具有草甘膦耐性的基因，該基因的核苷酸序列為編碼權利要求5所述蛋白質的核苷酸序列。
7.包含權利要求1、3、4或6所述基因的表達載體，所述表達載體為原核表達載體或植物轉化質粒。
8.權利要求1、3、4或6所述基因在製備抗/耐草甘膦植株方面的用途。
9.根據權利要求8所述基因在製備抗/耐草甘膦植株方面的用途，其特徵在於:包括以下步驟: (1)利用DNA重組技術，構建含有所述基因的植物轉化質粒； (2)將步驟(I)中構建的植物轉化質粒通過基因槍或農桿菌浸染方法或花粉介導法導入植物組織，利用草甘膦培養基篩選含有所述基因的植物細胞； (3)將步驟(2)中篩選的植物細胞進行分化獲得轉化芽，經過生根培養獲得植物種苗，從而得到所述抗/耐草甘膦植株。
10.權利要求1、3、4或6所述基因作為植物轉基因篩選標記的用途。
【文檔編號】C12N9/10GK103436547SQ201310396762
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2012年9月6日
【發明者】強勝, 毛嬋娟, 陳世國, 戴偉民, 宋小玲 申請人:南京農業大學