一種好氧條件下篩選非光合高效固碳微生物的方法

2023-10-08 21:46:09 2

專利名稱：一種好氧條件下篩選非光合高效固碳微生物的方法
技術領域：
本發明屬於微生物固定CO2領域，涉及篩選非光合高效固碳微生物的方法。
背景技術：
CO2引發的「溫室效應」所造成的氣候變暖是當前全球面臨的重大環境問題。根據IPCC第4次評估報告指出在最近的一個十年期(1995 2004年)，CO2當量排放的增加速率(每年9. 2億噸CO2當量)比前一個十年期(197(Γ1994年)的排放速率(每年4. 3億噸CO2當量)高得多。中國的「十二五規劃建議草案」顯示我國將CO2減排放在了相當重要的位置上。而在2010年末舉行的坎昆會議上，中國承諾到2020年，單位國內生產總值(GDP) CO2排放將比2005年下降40%-45%。同時CO2又是地球上最豐富的碳資源，可將其轉變為資源和能源。因此，CO2的固定在環境、能源、資源方面都具有重要的意義。當前，在考慮如何減排CO2的前提下，研究CO2的回收與固定，既能有效減少環境中游離的C02，又能將其再生為資源，因此已引起世界各國的廣泛興趣。CO2的固定主要有物理法化學法和生物法，而大多數物理法和化學法都必須接和生物法來最終固定co2。生物法固定CO2主要是依靠植物和自養微生物，傳統上植物的光合作用較為重要也更為人所重視。但地球上存在各種各樣的環境，在植物不能生長的特殊環境和場合(如乾旱貧瘠的沙漠土壤和工業廢氣的捕集場合)，微生物所具有的環境適應性的優勢便顯現出來了，因此從整個生物圈的物質流和能量流來看，微生物固定CO2意義重大。目前公認具有較高固碳效率的微生物主要是光合微生物和化能自養細菌中的氫-氧化細菌。藻類等光合微生物由於在培養過程中，需要光照，以及其不耐熱和高濃度CO2的特性，限制了其實際應用。而氫-氧化細菌雖然不用光照且生長範圍較為寬泛，但其在生長過程中必須提供以高濃度氫氣作為電子供體，因此普通環境條件難以符合其生長要求，同時在實際應用中，供氫氣也存在嚴重的安全隱患。鑑於此，發掘不用光照與供氫的高效固碳微生物，對於實現普通環境條件下的微生物固碳(如土壤環境與吸收工業排放CO2的大型生物反應器中)具有重要意義。海洋在全球碳循環過程中有著重要地位，其每年要吸收2. OGt (lGt=109t)人為排放的CO2，海洋中固碳微生物的研究也一直是全球相關領域專家關注的焦點。為此，我們從全球多個海域(包括全球四大洋，數十個國家和地區)採集水土樣品，通過分離篩選已獲得了多個系列的不用光照與供氫的固碳微生物菌群。但是這些菌群只有在經過長時間的馴化(數個月甚至一年以上)，其固碳效率才會達到一個較高的水平，而且由於這些菌群是由多個菌種組成的，混合微生物尤其是混合自養微生物的菌種保藏是十分困難的，主要是菌種復甦後其固碳效率會有不同程度的下降，這些特點限制了非光合固碳微生物的工業應用，如果利用先使用氫氣培養再用混合電子供體培養的方法，則可在短時間內(8天左右)從海水或海洋沉積物樣品中篩選獲得高效的非光合固碳微生物，從而有效解決這些問題，有利於進一步增強非光合固碳微生物菌群在實際應用中潛在的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明的目的在於為克服現有技術的缺陷而提供一種好氧條件下篩選非光合高效固碳微生物的方法。為實現上述目的，本發明所採用的技術方案是一種好氧條件下篩選非光合高效固碳微生物的方法，包含如下步驟(I)配製自養微生物的培養基；然後在上述培養基中再加入微量兀素溶液；(2)向步驟(I)中得到的含微量元素的培養基中加入海水或海洋沉積物，將含有 的混合固碳菌種的海水或海洋沉積物在好氧條件下使用氫氣培養，得到混合固碳菌種的菌液；( 3 )配製電子供體濃縮液；(4)將步驟(3)中製得的電子供體濃縮液加入到步驟(I)中製得的含微量元素的培養液中；(5)向步驟(4)得到培養基中加入步驟(2)培養得到的混合固碳菌種的菌液，在好氧條件下培養。所述的步驟(I)中自養微生物的培養基包含以下組分0.5-1.0g/L KH2PO4,I. 0-2. 0g/LK2HP04、0. l-o. 2g/L MgSO4 · 7H20、10_30g/LNaCl、O. 001-0. Olg/L CaCl2,0. 0036mmol-0. 036mmol/L 亞鐵離子和 0· 0075-0. 075mol/L NH4+ 離子。所述的亞鐵離子來自FeSO4 · 7H20、FeSO4或FeCl2。所述的NH4+離子來自(NH4) 2S04 或 NH4Cl。所述的微量元素溶液包含I. 68mg/LNa2Mo04 · 2Η20、0· 4mg/LH3B03、I. Omg/LZnSO4 · 7Η20、1· 0mg/LMnS04 · 5Η20、7· 0mg/LCuS04 · 5Η20、1· 0mg/LCoCl2 · 6Η20 或 I. Omg/LNiSO4 · 7Η20中的一種以上。所述的步驟(I)中，每升培養液中加入2ml微量元素溶液。所述的步驟(2)的好氧條件下使用氫氣培養為氣體中氧氣含量為5-20%，氧氣含量優選10%，二氧化碳含量大於0%，二氧化碳含量優選5-30%，進一步優選二氧化碳的含量為10%，氫氣含量為50-90%，氫氣含量優選80% ;培養時間為4-8天。所述的步驟(2)中，海洋沉積物是海洋沉積作用所形成的海底沉積物的總稱，海水 的加入量為25-75mL/L ;海洋沉澱物用量以海洋沉澱物稀釋液計，為25_50mL/L ;海洋沉澱物稀釋液為海洋沉澱物與無菌水製得的O. lg/L的稀釋液。所述的步驟(3)中電子供體選自亞硝酸鹽、硫代硫酸鹽及硫化物中的一種或一種以上。所述的亞硝酸鹽選自NaNO2或KNO2。所述的硫代硫酸鹽選自Na2S2O3或K2S2O3。所述的硫化物選自Na2S或K2S。所述的步驟(3)中，電子供體濃縮液中每種電子供體的濃度為80_200mg/mL。所述的步驟(4)中混合電子供體的用量為，l_15g/L亞硝酸鹽，l_15g/L硫代硫酸鹽或l_15g/L硫化物。所述的步驟(5)中的好氧條件為氣體中氧氣含量為5-25%, 二氧化碳含量大於0%，二氧化碳含量優選5-30%，進一步優選二氧化碳的含量為20%，培養時間為4-8天。
所述的步驟(5)中，每IL步驟(4)得到的培養基中加入25_75mL步驟(2)得到的菌液。本發明的有益效果在於在有氫氣的條件下，先從海水或海洋沉積物中篩選得到非光合固碳微生物，再利用由亞硝酸鹽、硫代硫酸鹽及硫化物組成的混合電子供體系統，培養篩選得到非光合固碳微生物，最後可以得到有較高固碳效率的非光合固碳微生物；經實驗表明，使用本發明方法所獲得的固碳微生物的固碳效率要比連續使用氫氣或混合電子供體篩選得到的固碳微生物分別高出210%和100%。本發明方法所獲得的固碳微生物的固碳效率可達853mg C02/L。表明該方法可在短時間內篩選獲得高效的非光合固碳微生物，可有效應用於固定CO2的過程中，從而實現對CO2的資源化。本發明還具有工藝簡單、可操作性強和具有一定經濟效益的優點。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例I(I)配製培養自養微生物的培養基培養基配方如下(g/L): KH2PO4 (1.0) ; K2HPO4 (2. O) ; MgSO4 · 7H20 (O. 2) ; NaCl (20)和CaCl2(O. 01) ； (NH4)2SO4(O. 038mol/L) ；FeS04 · 7H20(0. 0036mmol/L);在每升上述培養基中再加入2mL的微量元素溶液；微量元素溶液選自包含Na2MoO4·2Η20(1· 68) ;H3BO3(O. 4) ; ZnSO4 ·7Η20(1· O) ;MnSO4 ·5Η20(1. O) ; CuSO4 · 5Η20(7· O) ; CoCl2 · 6Η20(1. O)和 NiSO4 · 7Η20(1· O)，濃度以 mg/L 計；(2)向步驟(I)得到培養基中加入來自澳大利亞、日本或泰國沿海的海洋沉澱物稀釋液；加入量為每IL培養基加25mL海洋沉澱物稀釋液(海洋沉澱物稀釋液為海洋沉澱物與無菌水製得的O. lg/L的稀釋液。)，在好氧條件下使用氫氣培養4天，得到混合固碳菌種的菌液；其中，其中混合氣體由氫氣、氧氣和二氧化碳組成，其中氫氣氧氣二氧化碳=80:10:10，體積比；(3)分別單獨配製之後作為電子供體的NaNO2, Na2S2O3和Na2S的濃縮液，其濃度分別為 80mg/mL ；(4)按照 5. Og/L NaNO2, 5. Og/L Na2S2O3 和 12. 5g/L Na2S 的用量向步驟(I)得到的培養基中加入步驟(3)得到的電子供體濃縮液；(5)將步驟(2)培養4天後得到的固碳微生物菌種的菌液接種於步驟(4)得到培養基中，接種量為每IL培養基加25mL步驟(2)得到的菌液，並在好氧條件下培養4天，其中混合氣體由空氣和二氧化碳組成，其中空氣二氧化碳=90:10，體積比。實施例2(I)配製培養自養微生物的培養基。培養基配方如下(g/L) :KH2PO4 (I. O)
;K2HPO4 (2. O) ; MgSO4 · 7H20 (O. 2) ; NaCl (20)和 CaCl2 (O. 01) ； (NH4)2SO4 (O. 038mol/L)；FeSO4 · 7H20(0. 0036mmol/L)在每升上述培養基中再加入2mL的微量元素溶液。微量元素溶液選自包含Na2MoO4·2Η20(1· 68) ;H3BO3(O. 4) ; ZnSO4 ·7Η20(1· O) ;MnSO4 ·5H20(1. 0) ; CuSO4 · 5Η20(7· 0) ; CoCl2 · 6H20(1. 0)和 NiSO4 · 7Η20(1· 0)，濃度以 mg/L 計；(2)向步驟(I)得到培養基中加入來自南極或北極海域的海水，加入量為每IL培養基加25mL海水樣，在好氧條件下使用氫氣培養4天，得到混合固碳菌種的菌液；其中，其中混合氣體由氫氣、氧氣和二氧化碳組成，其中氫氣氧氣二氧化碳=80:10:10，體積比。(3)分別單獨配製之後作為電子供體的NaNO2, Na2S2O3和Na2S的濃縮液，其濃度分別為 160mg/mL ；(4)按照 4. 6g/L NaNO2, 5. Og/L Na2S2O3 和 12. Og/L Na2S 的用量向步驟(I)得到的培養基中加入步驟(3)得到的電子供體濃縮液；(5)將步驟(2)培養4天後得到的固碳微生物菌群接種於步驟(4)得到培養基中，接種量為每IL培養基加25mL步驟(2)得到的菌液，並在好氧條件下培養4天，其中，其中混合氣體由空氣和二氧化碳組成，其中空氣二氧化碳=90:10，體積比。 實施例3(I)配製培養自養微生物的培養基。培養基配方如下(g/L) :KH2PO4 (I. O)
;K2HPO4 (2. O) ; MgSO4 · 7H20 (O. 2) ; NaCl (20)和 CaCl2 (O. 01) ； (NH4)2SO4 (O. 038mol/L)；FeSO4. 7H20(0. 0036mmol/L)在每升上述培養基中再加入2mL的微量元素溶液。微量元素溶液選自包含Na2MoO4 ·2Η20(1· 68) ; H3BO3 (O. 4) ; ZnSO4. 7Η20(1· O) ; MnSO4 ·5Η20(1. O) ; CuSO4 · 5Η20(7· O) ; CoCl2 · 6Η20(1. O)和 NiSO4 · 7Η20(1· O)，濃度以 mg/L 計；(2)向步驟⑴得到培養基中分別加入來自中國青島、上海、廈門、海南、澳大利亞、泰國普吉、日本仙臺、法國加萊、巴布亞紐幾內亞、南極和北極海水樣品，加入量為每IL培養基加25mL海水樣，在好氧條件下使用氫氣培養4天，得到混合固碳菌種的菌液；其中，其中混合氣體由氫氣、氧氣和二氧化碳組成，其中氫氣氧氣二氧化碳=80:10:10，體積比；(3)分別單獨配製之後作為電子供體的NaNO2, Na2S2O3和Na2S的濃縮液，其濃度分別為 160mg/mL ；(4)按照 4. 6g/L NaNO2, 5. Og/L Na2S2O3 和 12. Og/L Na2S 的用量向步驟(I)得到的培養基中加入步驟(3)得到的電子供體濃縮液；(5)將步驟⑵培養4天後得到的固碳微生物菌群通過離心收集並混合，製成微生物菌體濃縮液後接種於步驟(4)得到培養基中，其接種量為每IL培養基加入75mL菌液，並在好氧條件下培養4天，其中，其中混合氣體由空氣和二氧化碳組成，其中空氣二氧化碳=90:10,體積比。實施例中，均先在好氧條件下使用氫氣培養4天(以下簡稱第一培養周期)，之後再在好氧條件下用混合電子供體培養4天(以下簡稱第二培養周期)，為研究該篩選過程中所獲得的非光合固碳微生物的固碳效率，取經過第二培養周期的樣品，測其培養液中總有機碳濃度，由於初始培養基總有機碳濃度為0，且在培養過程中微生物可以利用的碳源只有CO2這個無機碳源，所以培養基中增加了的總有機碳量都是來自於微生物將CO2固定所得。實施例I的結果表明，分別篩選自3個海域的非光合固碳微生物，其固碳效率平均為58gC-g-1菌體^cT1,對比使用公認的最佳電子供體H2篩選得到的非光合固碳微生物(兩個培養周期內均以H2培養，而不加混合電子供體)，以及用混合電子供體篩選得到的非光合固碳微生物(兩個培養周期內均以混合電子供體培養，而不加H2),本發明的效果要分別高出230%和130%。實施例2的結果中，選取南極或北極海域的海水樣品，使用本發明的方法篩選得到的非光合固碳微生物，其固碳效率要比連續使用氫氣或混合電子供體篩選得到的固碳微生物分別高出210%和100%。實施例3的結果中，第二個培養周期後所獲得的非光合固碳微生物在4天內固定的CO2量達到了 853mg/L。上述實施例表明，經過本發明的方法，可在短時間內獲得有較高固碳效率的非光合固碳微生物。綜上可見，該方法工藝簡單，可操作性強，而且對於來自全球4大洋十多個海域的海水或海洋沉積物樣品均有效，說明該方法對於短時間內篩選獲得非光合高效固碳微生物具有普遍性，可有效利用於微生物固定CO2的過程中，從而實現對CO2的資源化。上述的對實施例的描述是為便於該技術領域的普通技術人員能理解和應用本發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於這裡的實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種好氧條件下篩選非光合高效固碳微生物的方法，其特徵在於包含如下步驟 (1)配製自養微生物的培養基；然後在上述培養基中再加入微量兀素溶液； (2)向步驟(I)得到含微量元素的培養基中加入海水或海洋沉積物，將含有的混合固碳菌種的海水或海洋沉積物在好氧條件下使用氫氣培養，得到混合固碳菌種的菌液； (3)配製電子供體濃縮液； (4)將步驟(3)中製得的電子供體濃縮液加入到步驟(I)中製得的含微量元素的培養液中； (5)向步驟(4)得到培養基中加入步驟(2)培養得到的混合固碳菌種的菌液，在好氧條件下培養。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(I)中自養微生物的培養基包含以下組分0. 5-1. Og/L KH2PO4U. 0-2. Og/L K2HP04、0. 1-0. 2g/L MgSO4 7H20、10_30g/L NaCl、0. 001-0. Olg/L CaCl2,0. 0036mmol-0. 036mmol/L 亞鐵離子和 0. 0075-0. 075mol/LNH4+離子。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的亞鐵離子來自FeSO4.7H20、FeS04*FeCl2 ； 或所述的NH4+離子來自(NH4) 2S04或NH4Cl。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的微量元素溶液包含1.68mg/LNa2MoO4 2H20、0. 4mg/LH3B03、I 0mg/LZnS04 7H20> I. 0mg/LMnS04 5H20、7. Omg/LCuSO4 5H20、1. 0mg/LCoCl2 6H20 或 I. 0mg/LNiS04 7H20 中的一種以上。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(I)中，每升培養液中加入2ml微量元素溶液。
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(2)的好氧條件下使用氫氣培養為氣體中氧氣含量為5-20%,氧氣含量優選10%, 二氧化碳含量大於0%, 二氧化碳含量優選5-30%,進一步優選二氧化碳的含量為10%,氫氣含量為50-90%,氫氣含量優選80% ;培養時間為4_8天。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(2)中，海洋沉積物是海洋沉積作用所形成的海底沉積物的總稱，海水的加入量為25-75mL/L ;海洋沉澱物用量以海洋沉澱物稀釋液計，為25-50mL/L ;海洋沉澱物稀釋液為海洋沉澱物與無菌水製得的0. lg/L的稀釋液。
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(3)中電子供體選自亞硝酸鹽、硫代硫酸鹽及硫化物中的一種或一種以上。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述的亞硝酸鹽選自NaNO2或KNO2； 或所述的硫代硫酸鹽選自Na2S2O3或K2S2O3 ； 或所述的硫化物選自Na2S或K2S。
10.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的步驟(3)中，電子供體濃縮液中每種電子供體的濃度為80-200mg/mL ； 或所述的步驟(4)中混合電子供體的用量為，l_15g/L亞硝酸鹽，l_15g/L硫代硫酸鹽或l_15g/L硫化物； 或所述的步驟(5)中的好氧條件為氣體中氧氣含量為5-25%, 二氧化碳含量大於0%,二氧化碳含量優選5-30%，進一步優選二氧化碳的含量為20%，培養時間為4-8天； 或所述的步驟(5)中，每IL步驟(4)得到的培養基中加入25-75mL步驟(2)得到的菌液。
全文摘要
本發明涉及微生物固定CO2領域，涉及一種好氧條件下篩選非光合高效固碳微生物的方法。其包含如下步驟(1)配製自養微生物的培養基；然後加入微量元素溶液；(2)向步驟(1)得到含微量元素的培養基中加入海水或海洋沉積物，將含有的混合固碳菌種的海水或海洋沉積物好氧條件下使用氫氣培養，得到混合固碳菌種的菌液；(3)配製電子供體濃縮液；(4)將步驟(3)中製得的電子供體濃縮液加入到步驟(1)中製得的含微量元素的培養液中；(5)向步驟(4)得到培養基中加入混合固碳菌種的菌液，在好氧條件下培養。本發明提供的方法可有效促進非光合固碳微生物的固碳效率；本發明還具有工藝簡單、可操作性強和具有一定經濟效益的優點。
文檔編號C12N1/00GK102660460SQ20121014351
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者單伊娜, 席雪飛, 張士萍, 王磊, 胡佳俊, 胡煜 申請人:同濟大學