一株硝酸鹽還原假單胞菌菌株2-E及其應用、產品和方法與流程

2024-04-16 04:22:05

一株硝酸鹽還原假單胞菌菌株2-e及其應用、產品和方法
技術領域
1.本發明屬於微生物應用技術領域，具體涉及一株硝酸鹽還原假單胞菌菌株2-e及其應用、產品和方法。


背景技術：

2.青枯病由羅爾斯通氏菌(ralstonia spp.)侵染引起，是作物重要的土傳病害。羅爾斯通氏菌寄主範圍廣泛，能侵染400多種作物，在香蕉、番茄、馬鈴薯、菸草上為害較重。菸草青枯病主要由假茄科羅爾斯通氏菌(r.pseudosolanacearum)侵染引起，該病在我國長江流域及其以南各煙區普遍發生。盧燦華、劉俊瑩、馬俊紅等於2019年發表的「雲南省菸草青枯病病原多樣性初探」([c].中國植物病理學會2019年學術年會論文集,2019:381.)一文已探明該病在雲南省12個州市的43個區(縣)有發生，其中文山、臨滄、紅河、普洱煙區發病較重。雖然菸草青枯病為害較重，但因抗病資源匱乏，加之無化學防治的特效藥，該病一直是制約菸草產量和品質提升的重要因素。
[0003]
生物防治因其對環境友好而受到廣泛關注。我國已針對菸草青枯病開發註冊9種生防菌，主要為螢光假單胞菌、解澱粉芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等殺菌劑，多數菌劑具有拮抗羅爾斯通氏菌的能力。其中假單胞菌在多種作物土傳病害生物防治中得到廣泛應用，是較為理想的生防菌。我國已報導的菸草青枯病生防假單胞菌的相關專利主要包括：副黃假單胞菌(p.parafulva)dw15(cn114934001a)、韓國假單胞菌(p.koreensis)clp-23(cn111705016a)和clp-7(cn106916764a)、螢光假單胞菌(p.fluorescens)lsw-4(cn114854627a)、產氮假單胞菌(p.azotoformans)clp-10(cn111778183a)、皺紋假單胞菌(p.corrugata)s58(cn110408578a)、防衛假單胞菌(p.protegens)clp-6(cn108570433a)；複合菌劑主要有3株假單胞菌(p.lurida)fgd5-2、(p.koreensis)hch2-3和(p.rhodesiae)mtd4-1組合(cn112920965a)，細黃鏈黴菌(streptomyces microflavus)cgmcc 12841、微白黃鏈黴菌(s.albidoflavus)cgmcc 12842、鏈黴菌(s.pratensis)cgmcc 12843和1株銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)組合(cn106754563a)。
[0004]
目前尚無硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)在菸草青枯病防治中的應用的相關報導。


技術實現要素：

[0005]
基於本領域現有技術存在的上述空白，本發明提供一種硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e、其應用、產品與方法。
[0006]
本發明的技術方案如下：
[0007]
一株硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e，其特徵在於，其保藏編號為cctcc no：m 2019919。
[0008]
保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e在防治青枯病方面的應用。
[0009]
所述青枯病指菸草青枯病，由假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃羅爾斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引發的疾病。
[0010]
硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e不通過拮抗或抑制茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃羅爾斯通氏菌(ralstonia syzygii)來防治青枯病。
[0011]
一種菌劑，其特徵在於，包括：保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e。
[0012]
所述的菌劑還包括：輔料。
[0013]
所述的菌劑的劑型選自：發酵液、粉劑、懸乳劑。
[0014]
一種防治青枯病的方法，其特徵在於，保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e防治青枯病。
[0015]
採用菌濃度為10
7-109cfu/ml的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e的發酵稀釋液或菌濃度為10
7-10
10
cfu/ml的菌粉懸浮液對發病植株進行灌根處理。
[0016]
所述發病植株指：由茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃羅爾斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引發青枯病的菸草植株。
[0017]
本發明提供一株硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)，命名為2-e。經鑑定為硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)的一個株系，是從植煙土壤中分離得到，已於2019年11月27日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc，地址為：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學，中國典型培養物保藏中心，郵編：430072)，其保藏編號為cctcc no：m 2019919。
[0018]
本發明的有益效果如下：
[0019]
1、防病機理不同：常規青枯病生防菌篩選是通過室內平板拮抗初篩選、溫室生測復篩選，而本發明中的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)2-e的防效評價時不以拮抗效果為評價指標，直接以控病能力為指標，經平板拮抗能力測定發現生防菌2-e對羅爾斯通氏菌的無抑菌能力，說明生防菌2-e的控病機理與傳統的拮抗菌不同，可能通過生態位競爭、誘導植株抗病、調節根際微生物群落等機制防病；
[0020]
2、不產生抗藥性：生防菌2-e對羅爾斯通氏菌生長無抑制能力，說明生防菌2-e發揮控病作用不以產生抗生素為主。因此在田間施用生防菌2-e防治菸草青枯病時不會產生羅爾斯通氏菌對生防菌2-e或菌株代謝產物的耐受性，施用生防菌2-e具有較好的安全性；
[0021]
3、豐富生防資源：菸草青枯病生防菌以芽孢菌、假單胞菌、鏈黴菌為主，無硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)在菸草青枯病生物防治中的報導，本發明涉及的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)2-e為菸草青枯病的防治提供新的生防資源。
[0022]
本發明的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)2-e的保藏信息如下：
[0023]
保藏編號：cctcc no：m 2019919；
[0024]
分類命名：pseudomonas nitritireducens 2-e；
[0025]
保藏日期：2019年11月27日；
[0026]
保藏單位：中國典型培養物保藏中心；
[0027]
保藏地址：中國、武漢、武漢大學。
附圖說明
[0028]
圖1為本發明實驗例1的硝酸鹽還原假單胞菌2-e培養48h的菌落形態圖。
[0029]
圖2為本發明實驗例3的基於全基因組構建的系統發育樹圖。
[0030]
圖3為本發明實驗例5的粉劑2-e防治菸草青枯病的效果。
[0031]
圖4為本發明實驗例6的硝酸鹽還原假單胞菌2-e與羅爾斯通氏菌對峙培養菌落形態對比圖。
具體實施方式
[0032]
下面結合具體實驗例和附圖對本發明的技術方案做進一步詳細說明，但本發明並不局限於以下技術方案。
[0033]
生物材料的來源
[0034]
一、實驗例2、實驗例4和實驗例5使用的菸草材料為公知公用的菸草品種紅花大金元，由申請人實驗室保存，也可商購獲得。
[0035]
二、試驗例2使用的假茄科羅爾斯通氏菌(r.pseudosolanacearum)rs已完成基因組測序，序列提交至genbank資料庫，bioproject number為prjna594457，genbank assembly accession號為gca_018243235.1，該菌已於2022年7月14日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為gdmcc 1.3533。
[0036]
三、實驗例4使用的6株羅爾斯通氏菌：
[0037]
蒲桃羅爾斯通氏菌(r.syzygii)llrs-1為「can-hua lu,jun-ying li,meng-ge mi,et al.complete genome sequence of ralstonia syzygii subsp.indonesiensis strain llrs-1,isolated from wilted tobacco in china.phytopathology,2021,111:12:2392-2395)」一文中記載的llrs-1菌株。
[0038]
茄科羅爾斯通氏菌(r.solanacearum)fqy_4為「cao yi,tian baoyu,liu yanxia,et al.genome sequencing of ralstonia solanacearum fqy_4,isolated from a bacterial wilt nursery used for breeding crop resistance.genome announcements,2013,1(3):e00125-13.」一文中記載的fqy_4菌株。
[0039]
假茄科羅爾斯通氏菌(r.pseudosolanacearum)bsrs-1、pejg01均為申請人實驗室保存的菌株，申請人承諾自本發明申請日起20年內免費向公眾發放用於驗證本發明的效果。
[0040]
三、實驗例5使用的假茄科羅爾斯通氏菌(r.pseudosolanacearum)qbrs-1，為申請人實驗室保存，申請人承諾自本發明申請日起20年內免費向公眾發放用於驗證本發明的效果。
[0041]
本發明實驗例採用的培養基及培養育苗方法
[0042]
一、採用的培養基
[0043]
lb液體培養基包含1％胰蛋白腖、0.5％酵母浸出物、1％氯化鈉和0.5％蔗糖；
[0044]
cg培養基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白腖；
[0045]
cga含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白腖、1.5％瓊脂；
[0046]
ttc培養基含1％蛋白腖、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％瓊脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(ttc)。
[0047]
二、漂浮育苗
[0048]
以感病菸草品種紅花大金元為生測對象，漂浮育苗培育煙苗至4～5葉期。
[0049]
三、病原菌培養
[0050]
從-80℃超低溫冰箱活化羅爾斯通氏菌rs於ttc培養基[1％蛋白腖、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％瓊脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(ttc)]表面，置於28℃恆溫培養箱培養36～48h；
[0051]
挑取具有較寬白邊、流動性較強、中間呈粉紅色或淺紅色稀液狀的典型菌落，接種於盛有100ml cg液體培養基(1％蛋白腖、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物)的三角瓶內，置於28℃225r/min恆溫振蕩培養24h；
[0052]
取100μl稀釋至10-7
，取100μl 10-5
、10-6
、10-7
稀釋液塗布ttc平板，並於48h後觀察菌落形態及計數菌落數，計算培養的菌液含有的菌體量。
[0053]
第1組實施例、本發明的菌株2-e
[0054]
本組實施例提供一株硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e，其特徵在於，其保藏編號為cctcc no：m 2019919。
[0055]
任何利用、使用、銷售、許諾銷售、生產、製備、培養、擴繁、發酵保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e的行為均落入本發明的保護範圍。
[0056]
本領域技術人員根據本發明的教導和啟發，出於實際生產需要，結合微生物工藝領域常用技術手段選擇合適的輔料加以調配，將本發明保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e製成各種符合各類符合工藝生產要求的劑型產品，例如，粉劑、片劑、液體劑等。
[0057]
本文中，發明內容、具體實施方式部分記載的生防菌、硝酸鹽還原假單胞菌2-e、2-e、菌株2-e、2-e菌株、硝酸鹽還原假單胞菌均指：本發明的保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e。
[0058]
第2組實施例、本發明的菌株2-e的應用
[0059]
本組實施例提供保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e在防治青枯病方面的應用。
[0060]
在一些實施例中，所述青枯病指菸草青枯病，由假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃羅爾斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引發的疾病。
[0061]
在另一些實施例中，硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e不通過拮抗或抑制茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃羅爾斯通氏菌(ralstonia syzygii)來防治青枯病。
[0062]
第3組實施例、本發明的菌劑
[0063]
本組實施例提供一種菌劑。本組所有的實施例都具備如下共同特徵：所述菌劑包括：保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e。
[0064]
在進一步的實施例中，所述菌劑還包括：輔料。
[0065]
在更具體的實施例中，所述藥用輔料選自：溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、潤溼劑、滲透壓調節劑、穩定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏合劑、整合劑、滲透促進劑、ph值調節劑、緩衝劑、增塑劑、表面活性劑、發泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保溼劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑、反絮凝劑、助濾劑、釋放阻滯劑等。
[0066]
在具體的實施例中，劑型為粉劑。
[0067]
本發明的菌劑劑型不限於粉劑，本領域技術人員根據本發明的教導和啟發，出於實際生產需要，結合微生物工藝領域常用技術手段(例如，《製劑技術百科全書》、《藥物製劑技術》等)，選擇合適的輔料加以調配，將本發明保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e製成各種符合各類符合工藝生產要求的其他劑型產品，例如，片劑、液體劑、噴霧劑、顆粒劑等。
[0068]
第4組實施例、本發明防治青枯病的方法
[0069]
本組實施例提供一種防治青枯病的方法。本組所有的實施例都具備如下共同特徵：保藏編號為cctcc no：m 2019919的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e防治青枯病。
[0070]
在優選的實施例中，採用菌濃度為10
7-109cfu/ml的硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)菌株2-e的發酵稀釋液或菌濃度為10
7-10
10
cfu/g的菌粉懸浮液對發病植株進行灌根處理。
[0071]
在具體的實施例中，所述發病植株指：由茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科羅爾斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃羅爾斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引發青枯病的菸草植株。
[0072]
實驗例1、菌株獲取
[0073]
一、誘集、分離與培養
[0074]
將土壤樣品去除雜質和較大的塊狀物後，裝入直徑120mm的玻璃培養皿中，土層厚度約為1.5cm，用蒸餾水採用滴定瓶將土壤潤溼；
[0075]
製備微生物誘集裝置：首先在直徑50mm、孔徑為0.45μm的微孔濾膜邊緣塗布膠水，將不鏽鋼平底墊圈置於微孔濾膜上；然後向墊圈內腔加入3ml固體培養基(1.2％結冷膠和1.0％維生素)；再用膠水塗布金屬墊圈上表面，蓋上另一孔徑為0.45μm微孔濾膜；
[0076]
將微生物誘集裝置置於(1)中溼潤的土壤上，輕輕壓實裝置，確保微孔濾膜與土壤充分接觸，再用剩餘土壤將裝置完全覆蓋，並用蒸餾水採用滴定瓶再次潤溼土壤；
[0077]
蓋好培養皿，用封口膜將培養裝置封好，並置於30℃培養箱培養7d，期間觀察土壤溼度，若土壤溼度低則用無菌水補足；
[0078]
從培養箱中取出經過誘集的培養裝置，將固體培養基搗碎，加入3ml無菌水放置10min後，梯度稀釋至10-4
；
[0079]
取10-4
、10-5
菌液塗布於寡營養培養基cn(含0.1％酪蛋白胺基酸，0.1％營養肉湯，1.5％瓊脂)，每個梯度塗布5皿，於超淨工作檯吹乾，並置於30℃培養箱中培養7d；
[0080]
二、實驗結果：
[0081]
通過上述實驗，從cn培養皿上挑取再次劃線於cn培養基，獲得純菌2-e；挑取2-e的單一菌落接種於盛有2.5ml lb液體培養基(1％胰蛋白腖、0.5％酵母浸出物、1％氯化鈉和0.5％蔗糖)的試管，置於28℃225r/min恆溫振蕩培養48h，其菌落形態如圖1所示；
[0082]
實驗例2、生防菌2-e防治菸草青枯病的防效評價
[0083]
防效評價分為室內生測初篩選、復篩選，具體操作如下：
[0084]
步驟s1，生測初篩
[0085]
煙苗處理：漂浮育苗法培育煙苗至4～5葉期，用苗前1d從育苗池中取出備用煙苗晾乾漂盤，次日用無菌刀片在煙苗根部距煙株中心1.5cm的兩側造傷，將煙苗分為試驗組和對照組，每組2株煙苗；
[0086]
生防菌預處理：將試驗組接種1ml供試細菌，以接接種lb培養液培養基的煙苗設為對照組；
[0087]
煙苗懸根培養：在28℃恆溫人工氣候室內的培養架上放置一張尺寸比培育煙苗的漂浮盤略大的厚塑料布，並在塑料布的4角和中心共放置5個一次性培養皿作為支撐，將漂浮盤置於其上培養1d，其間分早、中、晚三次用噴水器具澆水，澆水量以漂盤孔內的水不下滴為宜；
[0088]
病原菌接種：生防菌預處理1d後，對試驗組和對照組接種0.5ml羅爾斯通氏菌rs 10倍稀釋液，在28℃恆溫人工氣候室內繼續培養15～20d，其間分早、中、晚三次用噴水器具澆水保溼；
[0089]
觀察記錄：觀察試驗組和對照組發病情況，當對照組發病率＞80％時，記錄實驗組煙株發病情況，煙株健康記為1，煙株發病但未枯死賦值為0.5，煙株枯死賦值為0，每株供試細菌處理的煙株的數值為兩株煙株賦值的總和，選擇供試細菌中賦值最高的菌株為潛力生防菌，用於室內復篩選。
[0090]
步驟s2，生測復篩
[0091]
步驟s2生測復篩，除以下試驗不同外，其餘操作步驟與步驟s1生測初篩相同。
[0092]
1)供試菌株為步驟s1生測初篩獲得的潛力生防菌；
[0093]
2)生測復篩中增加處理煙株數量，處理組和對照組均處理8株煙苗；
[0094]
3)分別於接種羅爾斯通氏菌後10、20d調查各處理組煙株的病害發生情況，如表1所示。
[0095]
表1.生長室內生防菌2-e防治菸草青枯病的效果
[0096][0097][0098]
試驗結果：結果表明，在初篩選中，經生防菌2-e處理的兩株煙株兩株均健康，故賦值2.0；在溫室復篩選中，接種10、20dpi分別有8、5株煙株健康，而對照處理的煙株僅有4和2
株健康。上述結果說明2-e具有較好的防治效果，可用作溫室大棚盆栽評價其防效。
[0099]
實驗例3、菌株鑑定與保藏
[0100]
一、菌株鑑定
[0101]
常規細菌鑑定參照文獻《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)。
[0102]
採用biolog gen iii板分析生防菌2-e的化合物代謝特徵。
[0103]
分子鑑定方法如下：細菌基因組dna的提取試劑盒，方法參見試劑盒說明書。用通用引物f27/r1492 pcr擴增16s rdna序列，常規條件擴增，擴增產物經膠回收後，連接於載體peazy-t5 zero載體，熱激轉化大腸桿菌感受態細胞dh5α，挑取菌落以m13f/m13r為引物進行菌落pcr鑑定。陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。運用ezbiocloud資料庫(https://www.ezbiocloud.net/)，分析與生防菌2-e相近的模式種，初步確認菌株的屬一級分類地位如圖1所示。
[0104]
進一步地，運用基因組測序技術獲取菌株的全基因組。運用type資料庫進行比對，計算專利菌株與親緣關係最近的種的dddh值，最終確定菌株的分子分類地位，如圖2所示。
[0105]
綜合形態學和分子生物學特徵，確定生防菌的分類地位。
[0106]
實驗結果記錄如下：
[0107]
1、培養特性與形態特徵：
[0108]
生防菌2-e在na培養基於28℃培養，36h即可見圓形菌落形成，菌落初期淺，後期淡黃色，3d後菌落表面形成褶皺。生防菌2-e在半固體遊動性培養基smm(每升含有0.l g葡萄糖、胰蛋白腖0.l g、乙二胺四乙酸二鈉0.038g、10ml ph 7.0磷酸緩衝液)上遊動能力較強。生防菌2-e在lb液體培養基中於16～35℃條件下均能生長。挑取菌株置於顯微鏡下鏡檢，細菌呈杆狀，鞭毛較少，極生。細菌革蘭氏染色呈陰性。
[0109]
3、化合物代謝特徵：
[0110]
gen iii鑑定結果表明，生防菌2-e能利用的碳源：d-果糖、奎寧酸、d-果糖-6-磷酸、l-丙氨酸、糖質酸、n-乙醯-β-d-甘露糖胺、d-松二糖、n-乙醯神經氨酸、d-甘露醇、丙酸、l-精氨酸、α-d-乳糖、蜜二糖、乙醯乙酸、吐溫40、α-羥基-丁酸、β-羥基-d,l丁酸、l-蘋果酸、n-乙醯-d-葡糖胺、肌醇、d-果糖、d-天冬氨酸、l-鼠李糖、d-麥芽糖、d-山梨醇、l-組胺、l-焦穀氨酸、d-葡糖酸、3-甲醯葡糖、l-果糖、l-半乳糖醛酸內酯、d-絲氨酸、l-乳酸、d-阿拉伯醇、d-半乳糖醛酸、β-甲醯-d-葡糖苷、甲酸、檸檬酸、α-酮-丁酸、乙酸、p-羥基-苯乙酸、d-乳酸甲酯、溴-丁二酸、丙酮酸甲酯、d-蘋果酸、α-酮-戊二酸、γ-氨基-丁酸；不能利用的碳源有糊精、粘液酸、蔗糖、d-甘露糖、d-半乳糖、葡糖醛醯胺、n-乙醯-d-半乳糖胺、明膠、d-纖維二糖、果膠、d-海藻糖、d-水楊苷、蜜三糖、α-d-葡糖、d-葡糖-6-磷酸、d-葡糖醛酸、氨基乙醯-l-脯氨酸、l-穀氨酸、龍膽二糖、肌苷、l-天冬氨酸、l-絲氨酸、甘油、水蘇糖；生防菌2-e能在含有四唑藍、d-絲氨酸、1％ nacl、醋竹桃黴素、利福黴素sv、萘啶酮酸、鹽酸胍、四唑紫、氯化鋰、亞碲酸鉀、丁酸鈉、氨曲南的化學敏感條件下生長，而不能在含有1％乳酸鈉、林肯黴素、硫酸四癸鈉、萬古黴素、二甲胺四環素、梭鏈孢酸、溴酸鈉的條件下生長。
[0111]
3、菌株的分子鑑定：
[0112]
16s rdna序列分析表明生防菌2-e與假單胞菌屬細菌相似性較高。其中，生防菌2-e與硝酸鹽還原假單胞菌(pseudomonas nitritireducens)模式菌wzbfd3-5a2
t
相似性最
高，為99.85％；其次為p.nicosulfuronedens lam1902
t
(99.45％)，與克氏假單胞菌(p.knackmussii)b13
t
的序列相似度為98.97％。經基因組測序分析，獲得生防菌2-e的全長基因組。經type(strain)genome server(https://tygs.dsmz.de/)資料庫分析，結果表明生防菌2-e與硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)種內的兩株菌相似性最高，與模式菌wzbfd3-5a2
t
和nbrc12694的dna分子雜交值分別為92.5％和90.0％(dddh4)，大於新種的鑑定閾值70.0％；p.nicosulfuronedens lam1902
t
、p.humi cca1
t
與生防菌2-e的dddh4次之，為42.5％；生防菌2-e與其他假單胞菌的dddh4值小於40％。基於基因組序列構建生防菌2-e及其近緣種的系統發育樹，結果表明生防菌2-e與硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)的標準菌株wzbfd3-5a2
t
和nbrc 12694的親緣關係最近，三者聚為一支(圖2)。上述結果說明生防菌2-e為硝酸鹽還原假單胞菌。
[0113]
表2. 2-e與假單胞菌屬細菌的基因組相似性比較分析
[0114][0115][0116]
二、硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)2-e的保藏
[0117]
通過上述鑑定結果，確認生防菌2-e為硝酸鹽還原假單胞菌(p.nitritireducens)的一個株系，命名為2-e，並將該菌株送保藏，其保藏信息如下：
[0118]
保藏編號：cctcc no：m 2019919；
[0119]
分類命名：pseudomonas nitritireducens 2-e；
[0120]
保藏日期：2019年11月27日；
[0121]
保藏單位：中國典型培養物保藏中心；
[0122]
保藏地址：中國、武漢、武漢大學。
[0123]
實驗例4、菌株在菸草青枯病防治中的應用
[0124]
試驗設置：於溫控28～30℃溫室大棚進行，試驗設置羅爾斯通氏菌處理組、對照組(澆灌等體積lb培養基+自來水)，每處理3次重複，每重複10株煙株；
[0125]
供試菌株培養：室內篩選獲得的生防菌用lb液體培養基(1％胰蛋白腖、0.5％酵母浸出物、1％氯化鈉和0.5％蔗糖)培養，在225r/min 30℃搖培48h；試驗選擇實驗室保存的來自雲南省玉溪市(llrs1)、臨滄市(bsrs1)、普洱市(pejg01)及福建省(fqy-4)的4株羅爾
斯通氏菌為病原菌，病原羅爾斯通氏菌用cg液體培養基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白腖)培養，在225r/min 30℃搖培24h；
[0126]
煙苗移栽：採用漂浮育苗方式培育的煙苗，煙苗為二次剪葉的煙苗，約培育50d，移栽時將紅壤與有機質按3:1混勻後移栽煙苗；
[0127]
接種：移栽後將250ml生防菌發酵液稀釋25倍，每株煙灌根200ml稀釋液(2-e菌濃度為108cfu/ml)，以等體積lb稀釋液處理對照組；次日將cg培養基搖陪24h的羅爾斯通氏菌稀釋100倍，每株煙接種100ml羅爾斯通氏菌稀釋液，接種方式也為灌根，羅爾斯通氏菌稀釋液的菌濃度為107cfu/ml。
[0128]
調查統計：接種後每7d調查一次病情指數，共調查5次。菸草青枯病的發病率、病情指數和防治效果按下式計算：發病率＝發病植株/調查植株總數
×
100％；病情指數＝[σ(病情級數
×
此級菌株數)/(最高級數
×
總株數)]
×
100；防治效果＝(對照病情指數－處理病情指數)/對照病情指數
×
100％。病情指數按照中華人民共和國菸草行業標準菸草病害分級及調查方法調查(gb/t 23222-2008)，病害分級如下：全株無病為0級，病側二分之一以下葉片凋萎為1級，病側二分之一至三分之二葉片凋萎為3級，病側三分之二以上葉片凋萎為5級，病株葉片全部凋萎為7級，病株基本枯死為9級。
[0129]
試驗結果：結果表明經2-e菌株處理的煙株在觀察期內病情指數均低於對照組，且菌劑2-e對不同地理來源的供試羅爾斯通氏菌均有防治效果，防效在18.04～74.74％，其中對來自玉溪(llrs-1)的羅爾斯通氏菌防治效果最佳，達74.74％；生防菌2-e對來自臨滄(bsrs-1)的羅爾斯通氏菌防效次之，為49.15％。生防菌2-e對來自雲南省玉溪市(llrs-1)、臨滄市(bsrs-1)、普洱市(pejg01)以及福建羅爾斯通氏菌(fqy_4)的羅爾斯通氏菌的防效均優於對照藥劑噻菌銅。上述結果說明生防菌2-e對雲南省不同地理來源的羅爾斯通氏菌具有較好的防治效果，防效優於對照藥劑(表3)。
[0130]
表3.生防菌2-e對不同羅爾斯通氏菌的防治效果
[0131][0132]
實驗例5、生防菌劑2-e對菸草青枯病的溫室防效評價
[0133]
實驗例5除以下試驗及結果不同外，其餘操作步驟與實驗例4相同。
[0134]
1、種子液培養：分別挑取一環生防菌接種於含有500ml種子培養液(蛋白腖10.0g/l、牛肉浸膏3.0g/l、氯化鈉5.0g/l、瓊脂15.0g/l，ph 7.0)的500ml離心管內，置於28℃恆溫搖床培養15h。
[0135]
2、發酵：將生防菌的種子液按1：100比例轉接至含有150l發酵培養基中發酵(葡萄糖20g/l，豆粕粉25g/l，酵母膏4g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，ph 7.3)。發酵工藝參數如下：(1)滅菌：空消條件為：0.15mpa，123℃，1h；實消條件為：0.15mpa，123℃，35min；(2)接種：滅菌完成培養液溫度下降至37℃時開始接種，接種比例為菌種/培養液1:100；(3)發酵控制：轉速保持120r/min至發酵結束；通氣量：保持15m3/h時保持至發酵結束；整個過程保持罐壓在0.05mpa；因設備原因允許通氣量在短時間內浮動。溫度：整個發酵過程保持溫度在37℃，上下可浮動0.5℃。發酵時間：運行發酵42h。
[0136]
3、物理吸附制粉：將發酵液進行離心，收集離心菌體作為原料按1:1的質量比與硅藻土混合併添加佔混合物料總質量5
‰
的蔗糖作為營養物質，將混合物料置於陰涼乾燥通風處晾乾，當水分含量達10％左右，進行粉碎後製得2-e粉劑(15.58億cfu/g)。
[0137]
4、防治：每棵煙苗施用2.5g菌劑，即，2-e粉劑兌水50ml製得的菌濃度為0.78億cfu/ml的菌粉懸浮液灌根，每重複15株，設置3次重複，設置清水為對照；次日接種羅爾斯通氏菌qbrs-1，每株0.1od；每周調查一次病害等級，計算病情指數。
[0138]
試驗結果：如圖3，隨著接種天數的增加，對照組病情逐漸加重，而菌劑2-e處理的煙株發病較輕，在接種後24d時病情指數曲線下面積為91.11
±
50.48，而對照組則為473.00
±
48.72。以病情指數曲線下面積計算，菌劑2-e處理組的防效為80.74％，具有較好的防效。
[0139]
實驗例6、生防菌2-e拮抗羅爾斯通氏菌的效果
[0140]
採用平板對峙培養法，測量菌株的抑菌帶。操作步驟如下：將cg培養基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白腖)培養24h的羅爾斯通氏菌梯度稀釋至10-4；取100μl稀釋液置於cga(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白腖、1.5％瓊脂)培養基表面，用塗布株塗布均勻，置於超淨工作吹乾；挑取單菌落接種於含有羅爾斯通氏菌bsrs-1、llrs-1、qbrs-1、rs的培養基表面，培養2～3d後觀測各菌株的抑菌情況，有抑菌效果的菌株用四點法對峙培養並測量菌株的抑菌圈和抑菌帶(圖4)。
[0141]
試驗結果：結果表明生防菌2-e對羅爾斯通氏菌bsrs-1、llrs-1、qbrs-1、rs均無拮抗作用，說明該生防菌可能通過非拮抗的生態位和營養競爭、誘導抗性、調節根際微生態結構而發揮作用。
[0142]
表4.生防菌2-e對不同羅爾斯通氏菌的拮抗能力
[0143]
羅爾斯通氏菌抑菌圈/cm抑菌帶/cmbsrs-10.000.00llrs-10.000.00qbrs-10.000.00rs0.000.00