刺激生物源甲烷從含烴地層中生成的方法

2023-12-12 22:06:52

專利名稱：刺激生物源甲烷從含烴地層中生成的方法
刺激生物源甲烷從含烴地層中生成的方法
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發明背景
本發明總的來說涉及來自含烴地層(諸如煤層)的本土的產甲烷微生物及其限定 的聚集體的分子表徵；並且更具體地涉及來自這樣的微生物的環境基因組數據的分析， 以及使用刺激劑來提高甲烷的轉化和回收的這樣的數據和微生物的用途，所述刺激劑是 通過確定在烴到甲烷的轉化涉及的途徑中的酶的存在而鑑定的。
煤層氣(CBM)是在煤藏中通過生物或生熱產生的天然氣的來源。CBM的生物 源生成是在多種微生物種群中微生物新陳代謝和用隨後的電子流降解煤的結果。CBM的 熱源生成是當溫度升至產生甲烷的微生物能夠存活的水平以上時後來在煤化中發生的沉 積的有機物或油的熱裂解的結果。在煤床中，來自上覆巖石和周圍水的壓力促使CBM結 合到煤的表面並被吸收進入煤的固體基質中，作為微孔和割理(煤中的天然裂隙)中的遊 離氣體，作為在水中溶解的氣體，作為在煤中的煤顯微成分(maceral)(包含煤塊的有機 成分)、微孔和割理表面上由分子引力維持的吸附氣體，並且作為煤的分子結構內的吸附 氣體。
煤是具有不同程度的滲透性的沉積巖，具有主要存在於割理中的甲烷。在煤中 的這些裂隙充當允許CBM流動的主要通道。為開採CBM，將外包鋼孔鑽入煤層，由於 通向表面的孔而使壓力下降或使小量的水從煤床泵出(排水)。CBM在水中具有非常低 的溶解度並且當壓力下降時容易分離，允許CBM從水中分離以管道輸出井。之後CBM 被輸送至壓縮站並進入天然氣管道。
CBM代表在美國產生的天然氣的重要部分，估計提供約10%的天然氣供給或約 1.8萬億立方英尺(TCF)。國際儲量提供用於未來的CBM生產的巨大的機會。位於科 羅拉多州和新墨西哥州的聖胡安煤田Man Juan Basin)是最多產的地區之一。基於這些巨 大的CBM儲藏庫，在CBM回收上最小的改進能夠因此導致礦井的生產顯著增加，並且 因此，正在研製各種方法以提高CBM從煤層中回收。
純物理的介入可以包括優化鑽孔方法和壓裂方法。其他改進方法包括直接應 用外部因素到煤床上。這些外部因素包括，例如注射氣體，諸如氮氣(見，例如 Shimizu, S., Akiyama, M., Naganuma, T., Fujioka, M., Nako, M.禾口 Ishijima， Y.2007.Molecular characterization of microbial communities in deep coal seam groundwater of northern Japan (在日本北部的深煤層的地下水中微生物群落的分子表徵).Geobiology 5(4) 423-433 ；美國專利第4,883,122號)和CO2 (見，例如美國專利第5,402,847號)； 以及注射熱的流體，諸如水或蒸汽(見，例如美國專利第5,072,990號)。多種方法旨在物 理地(見，例如美國專利第5,014,788號)或化學地(見，例如美國專利第5,865,248號) 增加煤床層的滲透性。
最近，正研製改進的方法以提高從現存礦井中生物源甲烷的生成。美國專利第5,424,195號公開了使用原位或在含煤基質上培養的微生物的聚生體以生物學方法將 煤轉化成甲烷。PCT/GB2006/004443 (W02007/060473)公開了生成和使用地下微生 物的培養物的方法。PCT/US2006/039352(W02008/041990)公開了通過引入注射流體 刺激生物源生成的方法和系統，所述注射流體通過本土微生物促進非液態烴層的厭氧生 物降解。PCT/US2007/080161(W02008/042888)公開了包含原位加熱非液態烴層以允 許甲烷的生物源生成的方法。美國專利第7,426,960號公開了刺激具有提高的氫含量的 代謝產物生物源生成的方法，包含將水注入開口中以分散其中的微生物聚生體。美國 專利第6^43,535號公開了通過使用由分析地層的成分獲得的信息並表徵聚生體的微生 物來刺激在含烴的地下地層中的微生物聚生體活性以將烴轉化成甲烷的工藝。雖然美 國專利第6,M3,535號考慮比較分離的微生物與已知的微生物以建立相對於這些已知生 物體的系統發生身份，但該專利沒有公開來自聚生體中產甲烷細菌的編碼將煤生物轉化 成甲烷涉及的酶的特定基因的鑑定或使用，或鑑定新穎刺激劑的酶分析的使用。美國 專利申請公開號2008/(^89816公開了用於在厭氧環境下將微生物引入至含碳物質的工 藝和用於增加生物源烴的生成的工藝，包括改良的地層水的使用。美國專利申請公開 號2008/(^99635公開了用產甲烷聚生體從含碳物質中刺激甲烷生成的方法。美國專利 申請公開號2009/0023612公開了增加燃料氣體從含碳物質中生物源生成的方法，包括 使用包括假單胞菌屬(Pseudomonas)的物種在內的厭氧聚生體。美國專利申請公開號 2009/0023611公開了用於從複合烴中生物源生成甲烷的分離的微生物聚生體，包含熱袍 菌屬(Thermotoga)的物種。美國專利申請公開號2008/(^86855公開了增加具有提高的氫 含量的物質生成的方法，該方法包括引入包括分離的棕色熱氣單胞菌ahermacetogenium phaeum)培養物在內的聚生體。美國專利第7,416,879號公開了刺激地質層中棕色熱 氣單胞菌的生物學活性的方法，該方法包括將改良劑加至地層。美國專利申請公開號 2008/0182318公開了用於生物源甲烷生成的分離的微生物聚生體，包括脫硫單胞菌屬 (Desulforomonas)的物種。美國專利申請公開號2007/(^95505公開了刺激在包括含碳物 質的地質層中具有提高的氫含量的代謝產物的生物源生成的方法，該方法包括提供含磷 化合物給其中的微生物。美國專利申請公開號2007/(^61843公開了刺激在包括含碳物質 的地質層中具有提高的氫含量的代謝產物的生物源生成的方法，該方法包括提供氫和含 磷化合物給其中的微生物。PCT/US2006/031723(W02007/022122)公開了用於提高生物 源甲烷生成的系統，該系統包括改良CBM水和其他含微生物介質、減少硫酸鹽還原反應 的競爭以及提高有機物濃度。
甲烷的生物源生成是成功分解複雜的大分子、多環、木質素來源的有機物的多 個可能的酶促途徑的產物。例如，木質素降解酶可包括過氧化物酶(錳過氧化物酶、木 質素過氧化物酶等)、酚氧化酶(漆酶)、水解酶、酯酶及氧化酶(見，例如，Fakoussa， R.M.和 Hofrichter，Μ. 1999.Biotechnology and Microbiology of Coal Degradation (煤降解的 生物工藝學和微生物學).Appl.Microbiol.Biotechnol.52 25-40)。一旦發生最初的破裂， 與脫甲基化和環破裂、芳香部分和脂族部分的氧化以及隨後的發酵途徑和產甲烷途徑有 關的酶便牽涉其中。相信在含烴地層中存在的微生物(包括產甲烷生物)是專性厭氧微 生物。
本領域中尚存在有效地刺激含烴地層(諸如煤)中的生物源生成和提高現存礦井的CBM生產率的需要。本發明不僅提供用於鑑定和使用在地層環境中存在的微生物的方 法，而且提供用於在確定與導致甲烷生成的代謝途徑有關的特定基因產物的存在之後鑑 定特定介入物(諸如能夠被引入所述環境中以提高甲烷的生物源生成的刺激劑)的方法。
發明簡述
本發明提供了鑑定和使用在含烴地層中用於甲烷的生物源生成的刺激劑和酶的 方法和工藝。發明方法包括使用獲自含烴地層中鑑定的多種微生物的核酸信息來鑑定基 因產物，所述基因產物是在所述微生物中存在的、能夠在由烴源起始並導致甲烷生成的 多種途徑中起作用的酶。見，例如

圖1。
在第一方面，本發明提供了鑑定在含烴地層中增加甲烷的生物源生成的刺激劑 的方法，該方法包括(a)從來源於含烴地層環境的一種或多種微生物中獲得核酸序列； (b)確定所述核酸序列的一種或多種基因產物的存在，其中所述基因產物是烴到甲烷的轉 化涉及的途徑中的酶；以及(c)鑑定當提供給所述含烴地層中的一種或多種微生物時增 加甲烷生成的所述酶的底物、反應物或輔因子。
在一個實施方案中，通過選擇在作為唯一碳源的煤上生長的能力，富集來自含 烴地層的一種或多種微生物。
在另一個實施方案中，上述步驟(C)包括在體外以多於一個濃度測試一種或多種 底物、反應物或輔因子以便在包含從所述含烴地層分離的至少一種微生物的培養系統中 監測和優化甲烷的生成，此外其中所述培養系統提供煤作為唯一碳源。
在一個優選的實施方案中，至少一種微生物是能夠將烴轉化成選自由以下組 成的組的產物的細菌物種或古細菌物種氫、二氧化碳、乙酸鹽、甲酸鹽、甲醇、甲 胺和產甲烷的底物；降解烴的細菌物種；產甲烷的細菌物種或產甲烷生物的古細菌物 種。在另一優選的實施方案中，這種微生物是選自由假單胞菌屬(Pseudomonas)、 弓形桿菌屬(Arcotiacter)、脫硫單胞菌屬(Desulftiromonas)、暗桿菌屬(Pelotiacter)、 脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺旋體屬(Spirochaeta)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、 索氏菌屬ahauera)、梭菌屬(Clostridium)、無膽甾原體屬(Acholeplasma)、磁螺菌 屬(Magnetospirillum)和硫磺單胞菌屬Mulfurospirillum)組成的屬組的細菌物種； 或選自由甲烷葉菌屬(Methanolobus)、甲烷卵圓形菌屬(Methanocalculus)和泉古菌 (Crenarcheaota)門的成員組成的組的古細菌物種。
在一個可選的實施方案中，步驟(c)是用限定的微生物聚集體進行的，所述限定 的微生物聚集體將來自含烴地層的單菌株微生物的培養物與另一種單菌株微生物的至少 一種其他的限定的培養物相組合，以致所述限定的微生物聚集體的成員協同作用以生成 甲烷；並且此外其中所述培養系統提供煤作為唯一的碳源。優選的限定的微生物聚集體 包含選自由假單胞菌屬、弓形桿菌屬、脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、脫硫弧菌屬、螺旋體 屬、丹毒絲菌屬、索氏菌屬、梭菌屬、無膽甾原體屬、磁螺菌屬、硫磺單胞菌屬；甲烷 葉菌屬、甲烷卵圓形菌屬和泉古菌門的成員組成的屬組的至少兩種微生物物種。
在多種實施方案中，含烴地層選自由煤、泥煤、褐煤、油頁巖、油地層、傳統 的黑油、粘性油、油砂和焦油砂組成的組。在優選的實施方案中，地層是在煤層或煤床 中的煤。
在多種實施方案中，與烴到甲烷的轉化有關的酶選自由過氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶(etherase)、氧化酶、固氮酶、 纖維素酶、澱粉酶、葡聚糖酶、普魯蘭酶(pullanase)、還原酶、歧化酶、加氧酶、單加 氧酶、雙加氧酶、過氧化氫酶、氫化酶和羧化酶組成的組。在優選的實施方案中，酶選 自由加氧酶、單加氧酶和雙加氧酶組成的組。
在多種實施方案中，底物、反應物或輔因子選自由含硫化合物、含氮化合物、 含磷化合物、微量元素、電子受體、電子供體、滷素、金屬、醇、有機酸、烷、烯、 炔、芳香化合物、胺、醚、醛、酮、硫醇、乙酸鹽、芳香烴和氣體組成的組。在優選的 實施方案中反應物是氧氣。
在第二方面，本發明提供了用於提高含烴地層中甲烷的生物源生成的方法，所 述方法包括弓I入通過第一方面的任何上述方法鑑定的刺激劑至含烴地層中。
在一個實施方案中，該工藝引入氧氣至所述含烴地層中。在優選的實施方案 中，含烴地層是煤。
在第三方面，本發明提供用於提高含烴地層中甲烷的生物源生成的方法，所述 方法包括調節選自由以下組成的組的酶過氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水 解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶、氧化酶、固氮酶、纖維素酶、澱粉酶、葡聚糖酶、普 魯蘭酶、還原酶、歧化酶、加氧酶、單加氧酶、雙加氧酶、過氧化氫酶、氫化酶和羧化 酶。
在可選的實施方案中酶在含烴地層中現存的微生物中存在，或被引入至含烴地 層中。在之後的實施方案中，酶是通過引入表達所述酶的微生物至所述含烴地層中而被 引入。在一個實施方案中，被引入的表達所述酶的微生物是通過修飾來源於所述含烴地 層的微生物而製備的重組微生物。在另一個實施方案中，表達所述酶的微生物是合成的 微生物。
在第四方面，本發明提供了鑑定用於煤到甲烷的轉化的限定的微生物聚集體的 方法，該方法包括(a)從來源於煤環境的一種或多種微生物中獲得核酸序列；(b)鑑定 所述核酸序列的一種或多種基因產物的存在，其中所述基因產物是煤到甲烷的轉化涉及 的途徑中的酶；(c)製備來自所述煤環境的所述一種或多種微生物的單菌株的培養物，其 中單菌株微生物包含所述一種或多種基因產物；以及(d)將所述培養的單菌株微生物與 另一種單菌株微生物的至少一種其他的限定培養物相組合以提供限定的微生物聚集體； 其中所述限定的微生物聚集體的成員協同作用以生成甲烷。
在一個實施方案中，提供了通過上述發明方法鑑定的用於煤到甲烷轉化的限定 的微生物聚集體。
在另一個實施方案中，該方法還包括(e)提供底物、反應物或輔因子給增加甲烷 生成的所述限定的微生物聚集體。
在優選的實施方案中，限定的微生物聚集體包括選自由假單胞菌屬、弓形桿菌 屬、脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、脫硫弧菌屬、螺旋體屬、丹毒絲菌屬、索氏菌屬、梭菌 屬、無膽甾原體屬、磁螺菌屬、硫磺單胞菌屬；甲烷葉菌屬、甲烷卵圓形菌屬和泉古菌 門的成員組成的屬組的至少兩種微生物的物種。
在第五方面，本發明提供了用於通過將由本文描述的發明方法鑑定的限定的微 生物聚集體引入至煤床中來提高從煤中生物源生成甲烷的工藝。
在優選的實施方案中，這樣的工藝包括將如上鑑定的限定的微生物聚集體連同 所述底物、反應物或輔因子引入至煤床中。
附圖簡述
圖1圖示了在煤到甲烷的轉化中的多種潛在的酶途徑。
圖2A和圖2B圖示了代表性的生成甲烷的富集培養物在培養10天和30天之後 的細菌分類學組成和古細菌分類學組成。
圖3圖示了通過來自宏基因組的RecA基因序列分析的在地層水的代表性樣品中 細菌的多樣性。
圖4圖示並比較了在地層水、生成甲烷的富集培養物和基因組被測序的兩種個 別菌株的代表性樣品中加氧酶的圖譜。
圖5圖示並比較了在代表性的儲庫(reservoir)樣品和生成甲烷的富集培養物樣品 中加氧酶的圖譜。
圖6圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中氧化應激反應酶的圖譜。
圖7圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中產甲烷酶的圖譜。
圖8圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中酯酶的圖譜。
圖9圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中解糖酶(saccharaolytic enzyme)的圖譜。
圖10圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中氫化酶的圖譜。
圖11圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中氮固定蛋白的圖譜。
圖12圖示並比較了在代表性的儲庫樣品、 品中脫氮蛋白的圖譜。
圖13圖示了用多種電子受體和氧氣刺激之後通過限定的微生物聚集體增加的甲 烷生成。
圖14圖示了用氫氣和乙酸鹽刺激之後通過限定的微生物聚集體增加的甲烷生 成。
圖15圖示了用甘油或三甲胺刺激之後通過限定的微生物聚集體增加的甲烷生 成。
圖16圖示了用於經由再注入的地層水引入外部因素諸如酶或刺激劑以增加甲烷 生成的工藝。
發明詳述
本發明提供了通過使用培養的來源於地層的微生物來刺激含烴地層(諸如煤層 和煤層氣礦井)中生物源甲烷的生成的新穎方法和工藝。從存在於含烴地層中的定居微 生物種群獲得的基因組信息被用以鑑定和刺激與烴到甲烷的轉化有關的多種途徑中涉及 的酶，該酶存在於在地層中的一種或多種微生物中或優選地與鑑定的刺激劑一起被引入生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣 生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣 生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣 生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣 生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣 生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣 生成甲烷的富集培養物樣品和礦井樣地層中。
本發明的方法提供分步的方法以鑑定用於增加甲烷的生物源生成的刺激劑和/ 或DMA。本文提供的實施例顯示了增加甲烷生成的刺激劑的成功鑑定中的分步方法。 簡言之，在本文提供的實施例中，地層水樣品收集自聖胡安煤田的煤層氣礦井，先前的 研究顯示該煤層氣礦井具有7千萬年的年齡，是由與地表層分離產生的並且無地下參與 事件的證據。水可從井口、隔離池(分離罐)或儲池(reservoir tank)收集，因為這些水 樣品是最容易得到的物質。之後經由光學顯微鏡目測含有活微生物的這些水樣品並且使 用地層水作為礦物基質培養微生物。微生物的培養物富含使用煤作為唯一碳源的生成甲 烷的微生物。電子受體，諸如硝酸鹽、硫酸鹽或鐵-磷酸鹽的多種組合作為用於微生物 呼吸的刺激劑被測試。之後使用氣相色譜篩選微生物富集物的甲烷生成。使用系統發生 的標記物來分析培養的微生物群落組成以鑑定優勢的微生物群，並且將若干微生物獨立 培養成純培養物(解褶合)以研究它們的酶譜、新陳代謝和降解煤的能力。群落可以用 合理的方式(重組)重建和建造以優化從煤生成甲烷，從而產生設計的複合微生物生態系 統或限定的微生物聚集體(DMA)。
在由於增加甲烷從煤中的生物源生成而作為刺激劑的氧氣的鑑定中能夠看到 本發明的方法的力量。通過在樣品的基因組分析中鑑定大量的加氧酶、單加氧酶和雙 加氧酶的存在，氧氣被鑑定為刺激劑。由於微生物來源於厭氧環境，所以這些酶的鑑 定是未預期的。細菌的芳香烴雙加氧酶是多組分酶系統，其通過甲苯雙加氧酶添加雙 氧至芳基核(aromatic nucleus)以形成芳烴順式二醇，用於將苯氧化成順_1，2-二羥環 己-3，5-二烯(苯順式二醇)(Gibson，D.T., Cardini, G.E., Maseles, F.C., Kallio, R.E.Incorporation of oxygen-18 into benzene by Pseudomonas putida (氧氣-18 通過惡臭假單 胞菌摻入苯).Biochemistry. 1970.9 : 1631-1635)。在基因組分析、生成甲烷的富集物以及 分離的假單胞菌屬菌株中檢測的其他類型的加氧酶與兒茶酚2，3-雙加氧酶有關。兒茶 酚雙加氧酶是執行兒茶酚的氧化裂解的金屬蛋白酶。這類酶將雙氧摻入底物。兒茶酚雙 加氧酶屬於氧化還原酶類別並擁有若干不同的底物專一性，該酶包括兒茶酚1，2-雙加 氧酶(EC 1.13.11.1)、兒茶酚2，3-雙加氧酶(EC 1.13.11.2)以及原兒茶酸3，4-雙加氧 酶(EC 1.13.11. 。兒茶酚雙加氧酶的活性位點最經常包含鐵，但是含錳的形式也是已 知的。由加氧酶催化的反應將釋放能夠用於微生物生長的能量，並且作為這種生長的結 果，能夠被其他物種同化的其他代謝產物將被生成。
由於已經報導需氧菌株在推定的厭氧環境，諸如油藏中茁壯生長，所以氧氣可 言旨是在地下的相關氣體(Nazina 等人.The phylogenetic diversity of aerobic organotrophic bacteria from the Dagang high temperature oil field (來自 Dagang 高溫油田的需氧的有機營養 菌的系統發生多樣性).2007.MiCrobiology 74: 343-351)。然而，這些方法沒有描述作用 的機制或方式、以及調節或控制潛在的生物工藝的能力，並且響應於這樣的刺激的微生 物群落由於無這樣的知識而受限制。
微生物的來源和它們的表徵
如本文所使用的，術語「含烴地層」是指從中可生成甲烷的任何烴源，包括但 不限於煤、泥煤、褐煤、油頁巖、油地層、傳統的黑油、粘性油、油砂和焦油砂。在 本文討論的多種實施方案中，含烴地層或甚至含烴地層的環境可包括但不限於油頁巖、煤、煤層、廢煤、煤衍生物、褐煤、泥煤、油地層、焦油砂、烴汙染的土、石油渣、鑽 屑及類似物，並且甚至可能包括除油頁巖、煤、煤層、廢煤、煤衍生物、褐煤、泥煤、 油地層、焦油砂、烴汙染的土、石油渣、鑽屑及類似物以外的那些狀況或甚至周圍環 境。在某些實施方案中，本發明可提供有時被稱為原位含烴地層環境或原位甲烷生成環 境的原位含烴地層。實施方案可包括有時被稱為異位含烴地層環境或異位甲烷生成環境 的異位含烴地層。原位可指其中含烴來源可能是在它們的原始來源位置中的地層或環 境，例如，原位環境可包括地下地層。異位可指其中含烴地層已經從它的原始位置移除 的地層或環境並且也許甚至可存在於生物反應器、異位反應器、礦井、地面以上結構和 類似地點。作為非限制性實例，生物反應器可指支持生物活性環境的任何裝置或系統。
使用煤作為示例性的含烴地層，有許多本土微生物的資源，其在能夠被分析的 烴到甲烷的轉化中發揮作用。煤是由若干組煤顯微成分或主要的有機物類型組成的複雜 有機物，煤顯微成分和主要的有機物類型在不同類型的沉積環境(諸如泥煤沼澤或泥煤 溼地)中累積。煤顯微成分組分以及因此的煤組分在個別的煤床內橫向地和縱向地改 變。一旦微生物被鑑定為含有在轉化步驟涉及的途徑中的酶，由本發明的方法鑑定的 不同的限定的微生物聚集體或刺激劑可能在特定的煤顯微成分組上更好地起作用，並且 因此每種煤床對於何種類型的微生物和刺激劑在煤的原位生物轉化上最有效可能是唯一 的。
在地下有許多與煤和其他富含有機物的沉積物相伴隨的自然存在的微生物。隨 著時間的推移，這些微生物物種在地下通過自然選擇的過程在代謝地下有機物上可能已 經變得非常有效。細菌相對快的適應於地區的環境狀況暗示收集自煤田或個別煤層的微 生物可能在遺傳上是獨特的。一旦被收集，這些微生物能夠如本文所描述的在實驗室培 養物中生長以評價和確定提高和/或限制煤轉化為甲烷的因素。在一些情況下，關鍵的 營養素或微量元素可能缺失，並且這種限制因素的添加可顯著地增加甲烷的生成。當細 菌被除去營養素時，便發生生理改變，而且如果飢餓狀態持續，所有的代謝系統中止功 能並且細菌經歷代謝停滯。當環境狀況改變時，細菌可恢復並再次建立有活力的種群。 因此，有可能在富含有機物的沉積物中的一些細菌已經達到代謝停滯狀態並且添加的營 養素是激活本發明之下的種群的全部所需。通過具體地分析在這樣的種群中出現的酶， 我們能夠鑑定正由這些微生物種群的一個或多個成員進行的刺激煤到甲烷的轉化涉及的 代謝途徑的方法。
來自地下的厭氧菌能夠用若干不同的方法收集，該方法包括(1)生成的或取樣 的地層水、(2)鑽屑、(3)側壁巖芯樣品、(4)整個巖芯樣品、以及(5)加壓的整個巖芯樣 品。雖然加壓的巖芯樣品可提供收集有活力的微生物種群的最好機會，但是我們已經發 現來自地層水的微生物種群的收集已經提供存在的微生物種群的代表性樣品。產甲烷生 物是專性厭氧微生物，但通過形成多細胞塊能夠在氧氣存在下保持活力達M小時之多。 另外，在充氧的系統中缺氧的/還原的微環境能夠潛在地將厭氧菌的活力延至更長。在 一些情況下，收集並放置在厭氧密封的容器中的鑽屑會含有能夠在幾小時內將煤轉化成 甲烷的微生物，從而給出錯誤的氣體含量測量結果。
我們已經優化了就地收集的方法以提供其中厭氧微生物種群的最適回收。本發 明包括用先前由PCT申請第PCT/US2008/057919(W02008/116187)號描述的方法無氧地10收集微生物種群，以及培養定居在含烴地層環境中(諸如地層水礦井或煤層氣礦井)的本 土微生物。
本文提供的方法還給予在遺傳上改變微生物的機會。通過鑑定在定居微生物內 的酶功能以及可用於增加甲烷生成的刺激劑，我們能夠使用該信息以便從遺傳上改造具 有能夠束縛於刺激並增加甲烷生成的能力的微生物。用本文描述的方法選擇的微生物富 含有效地代謝煤和其他富含有機物的底物的能力。一旦在這些富集的培養物上進行酶分 析，我們就能夠優化靶向的刺激劑和/或遺傳工程改造的細菌。增加甲烷從礦井生成的 多種可能性包含將鑑定的刺激劑、鑑定的微生物、限定的生物體的聚集體、遺傳修飾的 生物體或其任意組合弓I入至地層。
根據本發明的方法，本土微生物被鑑定並且之後被刺激以便將烴轉化為甲烷。 在地層中天然存在的微生物是優選的，因為已知它們能夠在地層環境中存活並茁壯生 長，而且應該提供開始於烴水解直至產甲烷作用的多種途徑的酶組分。然而，本發明不 限於本土微生物的使用。當分析本土微生物的酶譜時，將這種信息與外源微生物的酶譜 相結合可能是有利的。這種信息可能來源於已知的微生物，優選那些適合於在地下地層 中生長、並且通過類比具有類似潛在的酶過程的微生物。
如本文所使用的，術語「限定的微生物聚集體」或「DMA」是指多於一種微生 物的培養物，其中有意地結合或選擇不同的菌株以優化烴到甲烷的轉化。微生物的聚集 體是「限定的」，這樣使得在任一時間點我們能夠通過使用遺傳方法(諸如本文所描述 的16S分類法)確定種群的成員。DMA不必隨時間推移保持靜止，但是可進化為優化烴 水解和甲烷生成的培養物流。優選地，DMA被製備以提供具有烴到甲烷的途徑中的強大 酶譜的微生物。DMA可包括2種或任意組合的多種微生物以提供能夠將烴轉化成任何導 致甲烷和/或任何產甲烷的物種的產生的中間產物的細菌物種或古細菌物種。例如，在 DMA中可能存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種的生物 體。DMA的成員在它們之中或與含烴地層中存在的微生物一起協同作用來生成甲烷。
術語「微生物」旨在包括細菌生物體和古細菌生物體，以及相關的真菌、酵母 和黴菌。應理解細菌和古細菌大體上是能夠降解烴並且將所生成的產物轉化成甲烷的微 生物的代表。微生物的類別之間的分界線不總是清楚的，尤其在細菌和真菌之間。因 此，優選的是使用術語微生物來包括能夠將烴轉化成甲烷的所有微生物，而無論通常使 用的分類可能是什麼。然而，這些微生物中，通常被分類為細菌和古細菌的那些是優選 的。如果外源的細菌和古細菌被用於本文描述的方法中，那麼其他微生物諸如真菌、酵 母、黴菌及類似物也能夠被使用。
如本文所使用的，術語「厭氧微生物」是指能夠在具有比對流層空氣少的游離 氧(例如，按摩爾計，少於約18%的游離氧)的大氣中生存和生長的微生物。厭氧微生 物包括能夠在游離氧濃度按摩爾計少於約10%、或按摩爾計少於約5%、或按摩爾計少 於約2%、或按摩爾計少於約0.5%的大氣中發揮功能的生物體。
如本文所使用的，術語「兼性厭氧菌」是指能夠在具有高濃度或低濃度的游離 氧的環境中代謝或生長的微生物。
烴轉化為甲烷需要產甲烷生物的積極參與。如本文所使用的，「產甲烷生 物」是指從代謝過程中生成甲烷的專性或兼性厭氧微生物。樣品內產甲烷生物的存在指示原位甲烷地層的高可能性。產甲烷生物通常被分為四個主要的微生物組甲烷杆 菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌屬(MethanomicrolDacteria)及親緣菌、甲烷火菌目 (Methanopyrales)和甲烷球菌目(Methanococcales)。所有的產甲烷微生物被認為使用相同的生化元件來合成甲烷。產甲烷作用伴隨由含金屬的酶催化的一系列化學反應。一個 途徑是通過一次加一個氫原子來將CO2還原成CH4(CC)2-還原的甲烷生成)。另一個途 徑是乙酸鹽和單碳化合物(除甲烷外)發酵成甲烷(乙酸發酵，或乙酸分解的產甲烷作 用)。在所有已知的產甲烷途徑中的最後步驟是使用稱為甲基還原酶的酶將甲基還原成 甲烷。由於甲基還原酶的存在對所有產甲烷生物而言是常見的，因此它是產甲烷的微生 物的確定的特徵。用於鑑定產甲烷生物的存在的優選方法是直接測試生成甲基還原酶需 要的產甲烷生物基因。可選擇地，產甲烷生物的存在能夠通過使用本領域熟練的技術人 員已知的技術(一般來說本文指的是16S分類法)比較回收的16S rDNA與古細菌的16S rDNA文庫來確定。
產甲烷生物的類別除其他之外包括甲烷桿菌目、甲烷微菌目、甲烷火菌目、 甲烷球菌目、及鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta)(例如，嗜熱鬃毛甲烷菌(Methanosaeta thermophila))。 產甲烷生物的具體實例包括熱自參甲烷桿菌(Methanobacter thermoautotorophicus)和沃氏甲烷桿菌(Methanobacter wolfeii)。產甲烷生物也可通過醇 (例如，甲醇)、胺(例如，甲胺)、硫醇(例如，甲烷硫醇)、和/或硫化物(例如， 二甲基硫化物)的代謝轉化生成甲烷。這些產甲烷生物的實例包括來自以下屬的產甲 烷生物甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)(例如，巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)、嗜熱甲烷八疊球菌(Methanosarcina thermophila)、西西里甲烷八疊球菌 (Methanosarcina siciliae)、食酸甲燒八疊球菌(Methanosarcina acidovorans)、馬氏甲燒 W疊球菌(Methanosarcina mazeii)、弗裡西亞甲燒疊球菌(Methanosarcinafrisius))； 甲烷葉菌屬(例如，孟買甲烷葉菌(Methanolobus bombavensis)、丁達爾甲烷葉菌 (Methanolobus tindarius)、火山甲烷葉菌(Methanolobus vulcani)、泰洛氏甲烷葉菌 (Methanolobus taylorii)、俄勒岡甲烷葉菌(Methanolobus oregonensis))；甲烷嗜鹽菌 屬(Methanohalophilus)(例如，馬氏甲烷嗜鹽菌(Methanohalophilus mahii)、嗜甲基甲 烷嗜鹽菌(Methanohalophiluseuhalobius)；擬甲烷球菌屬(Methanococcoides)(例如， 甲基擬甲燒球菌(Methanococcoides methylutens)、布氏擬甲燒球菌(Methanococcoides burtonii))；和/或地烷烴菌屬(Methanosalsus)(例如，朱麗娜鹽地烷烴菌(Methanosalsus zhiKnaeae))。它們也可能是來自甲烷球形菌屬(例如，顯示將甲醇代謝成甲烷的斯氏甲 燒球形菌(Methanosphaerastadtmanae)和兔甲燒球形菌(Methanosphaeracuniculi))的產甲 烷生物。它們還可能是來自甲烷食甲基菌屬(Methanomethylovoran)(例如，顯示出將甲 醇、二甲基硫化物、甲烷硫醇、一甲胺、二甲胺和三甲胺代謝成甲烷的荷蘭甲烷食甲基 菌(Methanomethylovoranshollandica))的產甲燒生物。
如本文描述的，本發明的一個特徵是從多種環境樣品中獲得的微生物群落適合 於使用如本文提供的基因組工具來研究；另外，微生物種群在實驗室能夠使用本發明的 方法來培養和任選地分離和/或富集。通過在基因組水平應用這些方法，並通過具體地 表徵烴到甲烷的轉化涉及的微生物的酶譜，有可能形成對微生物群落的新陳代謝的根本 性理解，以及更具體地，對地層水和煤層中煤的產甲烷性降解的根本性理解。這樣，我們就能夠闡明每個種群的生態小環境並最終研製能夠產生增加生物甲烷的生成的刺激劑 禾口 /或DMA。
根據本發明的方法鑑定了在含烴地層環境中存在的微生物(本土微生物)、和/ 或在這樣的微生物中存在的酶，並之後對其進行刺激或調節以便將烴轉化成甲烷。在地 層中天然存在的微生物是優選的，因為已知它們能夠在地層環境中存活並茁壯生長。然 而，本發明不限於本土微生物的使用。適合於在地下地層中生長的外源微生物可被鑑 定，或其中的酶可被鑑定，並且在實行本發明的工藝之前、期間或之後這樣的微生物或 這樣的酶可通過已知的注射技術被引入至地層。例如，如果地層僅含有期望的三組分聚 生體的兩種微生物、或僅含有由烴到甲烷的酶途徑的三種期望的酶功能中的兩種，那麼 的缺失的微生物、酶、或這樣的微生物或酶的刺激劑可被注射入地層。微生物，本土的 或外源的，也可以是重組修飾的或合成的生物體。
宏基因組和核酸分析
在本發明中提出一種用於提高甲烷生成的新方法和可能的範例。這包括對基因 組和宏基因組(自然界最基本的生物實體)的描述。通過表徵在甲烷生成位點上總群落 的基因組，也稱為宏基因組，有可能得到對微生物的甲烷生成(包括利用的底物和產生 的中間產物和產物)的基本的理解。而且，通過最終導致指向甲烷的能量級聯的電子傳 遞，不同的種群之間的相互作用和協同效應能夠被闡明。與基因組結果相結合的培養數 據暗示地下的微生物種群以及由此氣體的生成能夠通過介入來刺激，所述介入包括導致 甲烷的生成增加的補充的底物、反應物或生長因子和/或特定的微生物接種。本發明的 方法和自其獲取的結果代表了地下微生物學結合分離菌株的宏基因組學、微生物培養和 基因組分析的首次研究。結果顯示為了形成綜合的生態系統理解這些學科的相互依賴是 必要的。
如本文所使用的，術語「宏基因組」或「宏基因組學」是指來自環境樣品、代 表在該樣品中存在的所有微生物譜的遺傳物質以及這種遺傳物質的分析。宏基因組學在 本領域也被稱為「群體基因組學」或「環境基因組學」。通常，宏基因組學包含核酸測 序和從環境回收的生物體種群的總DNA的分析，例如，回收自一個樣品中的所有微生物 的混合的DNA而不必培養微生物種群自身的單個成員的菌株。
—般而言，首先分離來自整個微生物群落的DNA，即宏基因組，並且之後使用 基因特異性引物(通常是16S通用引物)和PCR技術擴增。接著，通過若干技術純化片 段，並且之後將其連接到分子載體(例如，質粒DNA)中，並且作為克隆過程的一部分轉 化到細菌(通常是大腸桿菌)中以產生大量分離的DNA片段。個別細菌克隆的培養物用 於分離個別克隆(重組的質粒DNA)，並且之後使用靶特異性引物對這些克隆測序。之 後將得到的DNA序列與分子基因資料庫中已知菌株的DNA序列相比較。在大多數情況 下，如果與具有已知生理特徵和生態特徵的已知微生物有接近的匹配，那麼能夠推斷出 微生物的身份。
通常，通過本領域已知的任何方法將DNA與環境DNA分離，並且之後將其剪 切成用於構建DNA克隆文庫的片段。克隆文庫可以是小的插入片段文庫或中等插入片段 (2-15 的插入片段大小)的文庫或大插入片段的細菌人工染色體(BAC)文庫或F黏粒 (fosmid)文庫(高達150kb的插入片段大小)，這些文庫可以用隨機或靶向方式測序。
宏基因組的進一步分析包括確定系統發生多樣性是不依賴培養物的16S rRNA分 析(被稱為16S分類法)以及還包括鑑定宏基因組中感興趣的基因的序列分析。在隨機 測序方法中，隨機選擇克隆並進行末端測序，並且得到的序列通過匹配重疊序列而被組 裝成較大的連續片段(「毗連序列群」)。得到的數據是不同長度的毗連序列群以及較 短的未組裝的片段。完整測序的「參考」基因組的可用性可協助緊密相關的基因組的組 裝過程。在完整測序的「參考」基因組不存在時，毗連序列群可以基於它們的G+C含 量、密碼子使用、序列範圍、短n-mer(核苷酸頻率)、以及允許它們被劃分到能夠被視 作「種」的組的其他參數而被指定為各種「Mn」。之後使用多種方法從這些序列數據 預測編碼序列(CDS，基因)。經常在隨機測序方法中，鑑定的基因可能不歸屬於特定的 微生物物種(即，無分類學或系統發生學的隸屬)，雖然如此，這些基因代表總體微生物 群落的能力並可能揭示它們的環境的特徵。在「靶向」測序方法中，對於期望基因的存 在(例如，通過PCR擴增)或基因功能的存在(通過功能測定)首先篩選克隆。對靶向 的大插入片段的克隆進行整體測序允許恢復完整操縱子的可能性，例如，那些編碼代謝 途徑的操縱子。
常見的方法是靶向具有提供系統發生信息的基因(諸如16S rRNA)的F黏粒。 在稱為「系統發生的錨定(phylogenetic anchoring)」的該方法中，如果檢測16S rRNA基因，那麼整體上對F黏粒插入片段測序，由此允許我們將基因組DNA序列指定為具體的 種系型。該方法有助於將推測的功能基因(從側翼插入片段序列預測的)納入種系發生 (rRNA)。擁有過程特異性基因或生物標記物基因的F黏粒(例如，對於在正研究的環境 中可能佔優勢的過程，像甲烷氧化或脫氮)也可被靶向測序以便擴展關於這些過程的途 徑的信息。通過聯合隨機方法和靶向方法，感興趣的基因(例如，來自未知種系型的16S rRNA基因)或從隨機測序階段鑑定的新穎基因可用於篩選和靶向用於測序的其他克隆， 或者可用於鑑定連接的克隆並擴展基因組範圍。
在一個具體的比較分析中，從宏基因組和/或其中代表性的微生物鑑定的基 因能夠與已知的蛋白家族比較以確定編碼烴到甲烷的轉化涉及的途徑中的酶的基因產 物的存在。例如，Pfam資料庫是蛋白質家族的大集合，每一個蛋白質家族由多重序 列比對和隱馬爾可夫模型(HMM)代表。蛋白質一般由一個或多個通常稱為結構域的 功能區域組成。結構域的不同組合產生在自然界中發現的範圍多樣的蛋白。因此鑑 定蛋白內存在的結構域能夠提供對它們的功能的洞察。見，Pfam蛋白家族資料庫 R.D.Finn, J.Tate, J.Mistry, P.C.Coggill, J.S.Sammut, H.R.Hotz, G.Ceric，K.Forslund， S.R.Eddy, E.L.Sonnhammer 禾口 A.Bateman, Nucleic Acids Research (2008) Database Issue 36 D281-D2880通過將基因組信息與Pfam資料庫比較，本文提供的方法提供在宏基因 組、微生物個體菌株、DMA、或其任意組合中存在的酶的功能的概貌。
刺激劑的鑑定
如本文所使用的，術語「刺激劑」是指能夠在含烴地層中用於增加或刺激甲烷 的生物源生成的任何因子。優選地，刺激劑對於在烴到甲烷的轉化涉及的途徑中包含的 酶來說是底物、反應物或輔因子。在某些情況下，刺激劑被加入以調節在含烴地層的現 存微生物中存在的酶(通過任何方法增加、降低或調節)。在某些情況下，刺激劑可以是 酶自身、微生物(例如，表達酶或另一種蛋白以調節相關的酶的微生物、或通過重組或合成產生的這樣的微生物)、或限定的微生物聚集體。在任何情況下，刺激劑的功能是通 過增加微生物的活性水平或生長水平來促進現有的生產，或通過一種方法增加、降低或 調節在烴到甲烷的轉化涉及的途徑中包含的酶的酶活性以便優化甲烷從含烴地層的最後 生成。
刺激劑可提供在含烴環境中並非最佳表現或起作用的任何酶的提高、替代或加 入。目標是由烴到甲烷的途徑的優化和/或完成。一般地這需要酶的表現或表達能夠 將烴轉化成諸如氫氣、二氧化碳、乙酸鹽、甲酸鹽、甲醇、甲胺或其他任何產甲烷的底 物的酶和產甲烷的酶的微生物的表現。酶的總的範疇包括能夠水解低階煤、煤解聚、厭 氧或需氧降解多環芳烴、同型產乙酸和產甲烷(包括氫營養的或CO2還原的和乙酸分解 的)的酶，以及為實現烴到甲烷的轉化的這些酶的任意組合。提供這樣的功能的酶可包 括，例如，過氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚 酶、氧化酶、固氮酶、纖維素酶、澱粉酶、葡聚糖酶、普魯蘭酶、還原酶、歧化酶、加 氧酶、單加氧酶、雙加氧酶、過氧化氫酶、氫化酶和羧化酶。
刺激劑的實例包括冷凍乾燥的微生物，諸如產甲烷生物、互養生物(syntroph)、 發酵微生物和/或水解微生物；或者可具有包含如氮、磷、鉀、維生素、痕量金屬、酵 母提取物、含硫化合物、含氮化合物、含磷化合物、微量元素、電子受體、電子供體、 滷素、金屬、醇、有機酸、烷、烯、炔、芳香化合物、胺、醚、醛、酮、硫醇、乙酸 鹽、芳香烴和氣體的這樣的化合物的化學性質的刺激劑、底物、反應物或輔因子。
一旦酶通過本發明的方法鑑定，則該酶的合適的底物、反應物或輔因子能夠被 鑑定。
具體的刺激劑包括，例如，酵母提取物、NH4C1、NaNO3> K2HPO4^輔酶Μ、 Ρ04、減去磷酸鹽的維生素混合物、痕量金屬、02、H2,含磷化合物、乳酸、礦物改良劑 (諸如氯化物、銨、磷酸鹽、鈉、鉀、鎂和鈣)、金屬改良劑(諸如Mn、Fe、Co、Zn、 Cu、Ni、Se、W或Mo)、維生素改良劑(諸如吡哆醇(pyridoxime)、硫胺素、核黃素、 鈣、泛酸、硫辛酸(thioctia acid)、對氨基苯甲酸、煙酸、維生素B12、生物素、葉酸和 巰基庚烷磺酸(mecaptoheptanesulfonic acid)、丙酮酸、烷基醇、甲醇、乙醇、2-丙醇、 2，3 丁二醇、香子蘭酸鹽(vanillate)、甘氨酸、半胱氨酸、甲酸鹽、乙醇胺以及3，4， 5-三甲氧基苯甲酸酯、水改良劑、甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、private、NaCL,纖維素、 礦物質溶液、肉桂酸、苯甲酸、DNG、alasan,肥料組分、殼多糖、殼聚糖、氯酸鹽、高 氯酸鹽、以及它們的任何組合。
刺激劑的摻入增加甲烷生成
本發明的方法和工藝能夠容易地被用於現場應用和從任何含烴地層(諸如煤) 原位或異位甲烷生成的提高。有若干能夠用於原位甲烷生成的本領域已知的注射技術的 方法或組合。由本發明的方法鑑定的刺激劑、DMA或微生物能夠被直接注入地層的裂 隙中。裂隙定位、目前原位應力的方向、儲庫(煤和/或頁巖)幾何學以及局部結構是 要考慮的因素。例如，在煤床中有兩個主要的網絡構造(稱為割理)，名為面割理(face cleat)系統和端割理(butt cleat)系統。面割理經常是在側向上更連續的和更易滲透的，但 是端割理(其與面割理形成鄰接關係)的連續性和滲透性較低。在煤層氣礦井的刺激期 間，次生裂隙(induced fracture)與允許更多地使用儲庫的原生面割理(primary face cleat)15交叉。然而，當目前原位應力的方向於垂直面割理時，則應力的壓力關閉面割理，由此 降低滲透率，但是與此同時原位壓力增加了端割理系統的滲透率。在這些狀況下，次生 裂隙垂直於端割理方向，提供了更好地使用儲庫中的天然裂隙系統的機會。注射礦井和 生產油井的幾何學、以及無論是否水平的隔室(cell)被用於通向儲庫，主要依據於局部地 質條件和水文條件。
如在常規油井和煤氣井中的煤層氣的水力劈裂刺激的目的是產生與天然存在的 儲庫的裂隙網絡相連接的次生裂隙網絡。由本發明的方法鑑定的刺激劑、DMA或微生物 能夠在壓力下被引入天然存在的裂隙和人工次生裂隙中以驅使混合物進入深入儲庫中的 天然存在的裂隙中以使生物轉化率和效力最大化。在儲庫的劈裂刺激期間，可將砂支撐 劑(sandpropant)和多種化學物質通過鑽機在高壓下泵入地層。
可以在劈裂刺激的同時和/或在水力劈裂產生之後將刺激劑、DMA或微生物注 入儲庫中。當地下厭氧狀態被重建時，預期大多數原位微生物應用發生在劈裂刺激和完 井液的移除之後。然而，在原位微生物和劈裂的同時刺激下，在無氧狀況或低氧狀況下 刺激流體的使用是優選的，以使在儲庫中的厭氧狀況被維持、或在刺激後能夠被容易地 獲取。在同時刺激的過程中需氧菌的注入將導致氧氣的快速消耗並返回到厭氧狀況。
在一些情況下，改變煤、碳質頁巖或富含有機物的頁巖用於生物轉化的預處理 流體可與劈裂流體一起使用。然而，用於促進有機物的原位生物轉化的優選的方法是在 水力劈裂刺激和隨後的礦井衝洗之後在壓力和厭氧條件下注入刺激劑、DMA或微生物。
如圖16中所描繪那樣，可以通過將地層水再引入至地下來引入由本發明的方法 鑑定的刺激劑、DMA或微生物。簡言之，將甲烷和地層水從礦井套管(well casing) 1泵 入隔離池2 (也被稱為分離罐)以便從水中移出氣體。地層水被存儲在儲池3中，從儲池 3中地層水能夠被推進到固結地點或被引導再注入至地下。之後刺激劑、DMA或微生物 會被加至製備池4並與回收的地層水相混合。之後可使用壓氣機5或加壓系統將地層水 中的刺激劑、DMA或微生物引入至地下。
在地層水中存在的原位溶解氧可能不被煤層中的微生物得到並因此變成增加甲 烷生成的限制因素。刺激劑、DMA或微生物的引入、或氣體、液體、凝膠或固體的輸送 能夠提供適合於增加甲烷的環境，包括與氧捆綁的能夠有氧降解烴的菌株。例如，在一 個示例性實施方案中，由合適的本土菌株(諸如假單胞菌屬)以每毫升IO7個細胞的細胞 數目組成的接種物能夠與由可被用作營養素的有機底物(諸如甘油)組成的凝膠相混合， 所述營養素通過能夠被產甲烷生物使用的代謝產物(包括氫氣)的發酵和分泌來刺激生 長。一旦凝膠被同化，它將緩慢釋放最適的量的氧，這些氧進而將被具有需氧降解烴能 力的菌株使用。這些改良劑和結果產生的新陳代謝將刺激電子流向甲烷，生成與同一煤 層的未被幹預的對照礦井相比更高的量和產量。這對具有需氧或厭氧生長能力的菌株是 尤其有利的，並能夠使它們的新陳代謝適應於烴的降解。在一個獨立的實施方案中，具 有高濃度溶解氧的地層水被注入礦井中以便分配加氧酶催化反應所需的一些氧氣。能夠 通過用機械系統(諸如推進器(impeller))充氣或其他機制將氧氣溶解在地層水中。可選 地，能夠使用中間機制將氧氣引入至厭氧環境。例如，氯酸鹽能夠被用作產生氧氣釋放 的電子受體，所述氧氣釋放是通過在宏基因組分析中均存在的酶氯酸鹽還原酶和亞氯酸 鹽歧化酶進行的。
在可選的實施方案中，基於顆粒的方法能夠用於在分散(fracing)過程中分配刺 激劑、DMA或微生物(總稱為介入劑)。目標是引入這些介入劑以便產生甲烷生成的可 持續增加。改進的遞送系統將介入劑注入深達礦井裂紋中並確保按時間釋放的部署。例 如，礦井介入劑可被配製為在分散過程中使用的砂粒上的按時間釋放的包衣或者配製為 隨時間緩慢溶解的硬顆粒；大小被考慮為與在分散工藝中使用的砂粒大致相同，並能夠 在加至胍爾豆膠溶液(稱為支撐劑)之前被一起混合。在任一種形式中，一旦支撐劑和顆 粒被泵入礦井中並被加壓，包覆的砂粒或與砂混合的硬顆粒在礦井裂隙中被注入壓力， 保持它們開放以利於氣體或油的釋放。因為以不同於一些藥劑的時間釋放的方式配製介 入劑，所以化合物和/或微生物將緩慢溶解，並分散到周圍的地層水中以及分散到推測 其中粘附細菌定居的煤割理(或在油的情況下為細巖石裂隙)中。以這種方式，溶解的 介入劑持續地刺激煤到甲烷的生物源轉化。製劑能夠被製成經小時、天、周或月的時間 釋放介入劑以便優化甲烷刺激工藝。包衣或顆粒能夠在不存在氧氣的情況下製備以便於 維持苛性厭氧微生物的活力，或者它們也能夠包含刺激甲烷生成的氣體。
提供下列實施例來圖示、但不限制本發明。
實施例1
來自煤層氣礦井的生成甲烷的微生物的取樣和富集
自位於美國科羅拉多州的聖胡安煤田的煤層氣礦井中的儲池收集200L體積的地 層水並且自隔離池收集20L體積的地層水。之後用Imm至45 μ m的一系列無菌篩過濾 水樣以移除與地層水一起的大塊的煤和油。然後將子樣品轉移到IL無菌瓶中並使用便攜 式罐和玻璃吸管用N2噴洗。之後用丁基膠塞(butyl stopper)密封無菌瓶並用於接種。
將由礦物基質和作為碳源的粗煤組成的培養基分配至具有5ml培養物和0. 作 為唯一碳源的煤的Hungate導管。
用於產甲烷富集物和純培養物的培養基組成
每IL無菌製備的水
NH4Cl 0.5g
KH2PO4 0.75g
K2HPO4 1.5g
商品化(ATCC)維生素和微量元素溶液各IOmL
以Iatm滅菌15-30分鐘，並然後從儲液中加入
酵母提取物0.05%終濃度
Na2Sx9H20 3mM 終濃度
半胱氨酸-HCl 3mM終濃度
以Iatm滅菌15-30分鐘，並然後從儲液中加入
用於產甲烷的適當的碳源和能量源
氣體混合物CO2 H2/20 80 高達 2atm
在一些培養物中，使用由硝酸鈉(IOmM)、硫酸鈉(IOmM)和磷酸鐵(IOmM)組 成的電子受體的混合物來刺激厭氧呼吸和厭氧生長。通過將所有組分分配到厭氧培養室 中來無氧地製備培養基，厭氧培養室具有5% H2、5% CO2並被用N2平衡的氣氛。其他 的培養物包括高壓滅菌煤的使用。培養基的製備中不使用還原劑，諸如硫化鈉或半胱氨17酸。通過用注射器和先前用N2衝洗三次的針從IL樣品瓶無氧地收集Iml樣品而在現場 直接接種樣品。在30°C孵育接種的管並將其運輸到實驗室。生長几周之後，用顯微鏡監 測樣品的生長並且通過氣相色譜法測量甲烷的生成。選擇富集物在作為唯一碳源的煤上 生長的能力和它們的甲烷生成。在不含電子受體的培養物中檢測到最高甲烷濃度。在連 續轉移原代富集物六次後，甲烷的生成貌似是可再現的和可拓展的，一致地產生3%的頂 部空間(head space)。隨後將選擇用於進行表徵的群落轉移至血清瓶中並且在30°C下在 10天和30天之間在頂部空間中以約3%持續產生甲烷。實施例2來自煤層氣礦井的微生物群落和富集的生成甲烷的微生物群落的表徵用從地層水和富集物中存在的煤中有效地分離核酸的優化的方法從地層水樣中 提取總群落DNA。基因組文庫使用多重方法從儲池水樣構建以評估潛在的偏倚並有效地 捕獲總的微生物群體，包括細菌、古細菌和真核生物。先前對儲池的基因組分析揭示了 與諸如土壤或表層海洋水的環境相比相對較低的複雜性。值得注意地，不存在真核細胞 是令人震驚的。在基因組數據中有對應於變形菌門(Proteobacteria)、弓形桿菌屬和產金 菌門(Chrysiogenes)的兩種主要的細胞系譜，它們的基因組可以由群落DNA重新組裝。 它們的代謝可能與油和其他烴的降解及亞砷酸鹽的呼吸有關。DNA的製備

將篩選至大小小於45 μ m的水用孔徑為3 μ m、0.8 μ m和0.1 μ m的一系列串聯 連接的膜過濾。從濾器裝置收集膜，在-20°C下與Tris-EDTA緩衝液一起冷凍並運輸到 實驗室。如下從膜中提取DNA。將濾器在過量體積的裂解緩衝液(50mM NaCL 50mM Tris pH 8.0、50mM EDTA、5% SDS> 4%聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(8000)、0.5M葡萄糖、200mM β-巰基乙醇、IOmM腈脒、IOmM抗壞血酸、20 μ g/ml 二苯甲醯胺和100 μ g/ml酵母 tRNA)中在旋轉輪上以室溫浸泡45分鐘。自每個樣品收集上清液並且通過向每個樣品加 入五個1/8」和一個3/8」不鏽鋼珠以及Ig 0.5mm玻璃珠並在Geno/Grinder 2000中以每 分鐘1500衝程(stroke)振蕩樣品4分鐘來破碎細胞。將氯化鈉加入至每個樣品達0.8M， 一次用酚_氯仿、一次用氯仿萃取樣品並將其在異丙醇中沉澱。作為過濾的替代，首先通過在4°C以10,OOOrpm離心30分鐘來沉澱地層水，將 上清液移入新的容器，細胞/碎片團粒懸浮在裂解緩衝液並且用如上述的相同方式純化 DNA。通過下列步驟從上清液中回收殘餘的生物物質加入聚乙二醇800達10%，在 4°C孵育過夜並之後在4°C以10,OOOrpm離心30分鐘，將團粒懸浮於裂解緩衝液並重複上 述的純化實驗方案。將從純化獲取的DNA溶解在少量的IOmM Tris pH 8.0、ImM EDTA 中並通過光譜法和凝膠電泳分析。基因組文庫的製備通過使用裝備有標準剪切組件的Genomic Solutions GeneMachines HydroShear將
來自上述微生物庫的宏基因組DNA剪切至I-Skb的平均大小來構建基因組文庫。使用本 領域已知的標準程序將DNA在瓊脂糖凝膠上按大小選擇、接合到DNA銜接子並連接到 中等拷貝(medium-copy)的大腸桿菌克隆載體。通過電穿孔法將連接產物轉化至大腸杆 菌，挑取隨機克隆，使其在Iml培養物中生長並提取質粒DNA。使用Sanger法對每個克隆雙向測序。序列分析地層水(儲池)的分類學多樣性通過比較16S基因序列來分析，該16S基因序列直接地來自宏基因組(來自環境文庫的序列)的或者通過由用於宏基因組文庫構建的 DNA樣品來擴增16S基因序列。這些分析揭示群落由古細菌和細菌組成而無真核細胞存 在。之後將單個的宏基因組讀數進行專有生物信息注釋流水線(bioinformatic annotation pipeline)，該生物信息注釋流水線首先鑑定所有大於50個胺基酸的開放閱讀框 (ORF)。為指定每個ORF的推定的功能，首先將它們針對多重序列比對的現有收集物進 行PFAM、TIGRFAM和SUPERFAM家族分析並使用HMMER軟體進行用於相應的蛋白 家族的隱馬爾科夫模型(Hidden Markov model)分析。另外，針對GenBank中的非冗餘 蛋白資料庫，使用BLASTp來比較從宏基因組鑑定的蛋白。之後檢索自這個流水線產生 的注釋並且進行宏基因組儲池、生成甲烷的富集培養物和分離的菌株之間的比較。分析 揭示了大量的需要氧的基因諸如雙加氧酶(硝基丙烷、植烷醯輔酶A、甲苯、聯苯基2， 3_ 二醇及雙萜類化合物)和單加氧酶(P450、烷、氨和2，4-二氯)。與需氧酶一起的 還有大量幫助包括抵抗氧的酶，諸如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、玉紅氧還蛋白、和 硫氧還蛋白。使用細菌域和古細菌域(後者包含產甲烷生物)的16S基因序列從分類學上分析 生成甲烷的富集物。在培養的第10天和30天通過下列步驟來分析群落擴增來自群落 的這種片段，通過將16S片段克隆至載體創建16S片段的文庫，將它們轉化到大腸桿菌中 並如上所述對克隆的片段測序。之後將這些序列與公開的資料庫相比較以查看最相近的 培養親緣菌。如在圖2A中顯示的，在10天之後細菌的多樣性佔優勢的是假單胞菌屬、 脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、脫硫弧菌屬相關的生物體，並且在第10天或30天螺旋體屬、 丹毒絲菌屬、索氏菌屬、梭菌屬、無膽甾原體屬和磁螺菌屬豐富程度次之。如在圖2B中 顯示的，在第10天古細菌群體中佔優勢的是產甲烷生物甲烷葉菌屬，並且在第30天，出 現了甲烷卵圓形菌屬和未表徵的泉古菌門。圖3圖示了如通過來自宏基因組的RecA基因 序列分析的那樣在代表性的地層水樣品中的細菌多樣性。井口樣品_細菌的16S分類法的代表網球菌屬(Dictyoglomus)浮黴狀菌科(Planctomycetaceae)紅色桿菌科(Rubrobacteraceae)熱脫硫弧菌屬(Thermodesulfovibrio)梭菌目(Clostridiales)擬桿菌目(Bacteroidales)Thermacetogenium熱袍菌屬(Thermotoga)積物熱微桿菌屬(Thermosediminibacter)變形菌綱(Deltaproteobacteria)共養單胞菌屬(Syntrophomonas)
擬桿菌門(Bacteroidetes)擬桿菌目(Bacteroidales)熱脫硫L菌門(Termodesulfovibrio)磁桿菌屬(Magnetobacterium)鼠孢菌屬(Sporomusa)脫鐵桿菌科(Deferribacteraceae)熱袍菌屬(Thermotoga)梭菌目(Clostridiales)硫磺單胞菌屬(Sulfurospirillum)Proteiniphilum糞熱桿菌屬(Coprothermobacter)厭氧彎曲菌屬(Anaerosinus)固氮弧菌屬(Azospira)Ceillonellaceae硝化螺旋菌門(Nitrospiracaea)熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium)Ruminococcaceae梭菌屬(Clostridia)Therminocola消化球菌科(Peptococcaceae)梭菌目(Clostridiales)變形菌門(Proteobacteria)青枯菌屬(Ralstonia)Ruminococcaceae擬桿菌(Bactersidales)丙酸桿菌禾鬥(Propionibacteriaceae)絲桿菌(Niastella)沙雷氏菌(Serratia)熱脫硫弧菌屬(Thermodesulfovibrio)絲桿菌(Niastella)金黃桿菌屬(Chryseobacterium)史密斯氏菌屬(Smithella)Y —變形菌綱(Gammaproteobacteria)磁桿菌屬(Magnetobacterium)Proteiniphilum螺旋體科(Spirochaetaceae)古細菌的16S分類法的代表-產甲烷作用熱變形菌綱(Thermoprotei) 甲燒絲菌屬(Methanothrix)
甲烷泡菌屬(Methanofollis)甲燒桿菌屬(Methanobacterium)甲烷微菌目(Methanomicrobiales)甲燒粒菌屬(Methanocorpusculum)除硫球菌目(Desulfurococcales)菌株的分離 使用功能富集物和環境樣品通過環境微生物的分室培養(compartmentalized cultivation) (EMCC,如在 PCT/US2008/057919，W02008/116187 中描述的)或標準方法 諸如瓊脂管混菌法(agar shake)進行單個菌株的分離。EMCC法通過將細胞懸液包封入凝 膠微滴(GMD)並在30°C有氧培養而進行。細胞形成菌落，將菌落分選到無菌培養基上 以用於繼代培養。之後通過16S分析所得的細胞培養物以鑑定獨特的菌株。後一方法包 括熔化的瓊脂，在該熔化的瓊脂上施加來自系列稀釋物的細胞懸液。之後將管密封並用 風尤02或壓:02替代頂部空間並培養直至細胞開始形成菌落，挑取菌落並繼代培養。之 後將選擇的分離菌株厭氧培養，它們中的一些具有有氧或厭氧生長的能力。為分離來自生成甲烷的富集物的單個菌株，然後將100 μ 1的樣品稀釋並接種到 具有瓊脂和煤的Hungate管以形成菌落並提供對特定的系譜的分離。另外，將富集物包封 並且有氧地培養以用於形成小菌落，用高速細胞分選儀將這些小菌落排列到96孔板上。 這些分離的努力產生了之後使用16S基因序列鑑定的菌株(如在圖2Α和2Β中顯示的)。 從這種最初的生成甲烷的富集物中，培養了假單胞菌屬、脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、脫 硫弧菌屬、索氏菌屬、無膽甾原體屬和短小甲烷卵圓形菌(Methanocalculuspumilus)的 單個菌株。之後單個菌株能夠在功能富集培養物中被重構成群落作為限定的微生物聚集 體。一些分離的菌株還被用於基因組測序以便鑑定酶的降解中涉及的基因和途徑。例 如，假單胞菌屬菌株顯示出一些PAH降解涉及的加氧酶，諸如3-苯丙酸雙加氧酶、烷磺 酸單加氧酶和兒茶酚2，3-雙加氧酶亦在其中。分離的細胞培養物-16S分類法
權利要求
1.一種鑑定在含烴地層中增加甲烷的生物源生成的刺激劑的方法，所述方法包括(a)從來源於含烴地層環境的一種或多種微生物中獲得核酸序列；(b)確定所述核酸序列的一種或多種基因產物的存在，其中所述基因產物是在烴到甲 烷的轉化中涉及的途徑中的酶；以及(c)鑑定當提供給所述含烴地層中的一種或多種微生物時增加甲烷生成的所述酶的底 物、反應物或輔因子。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種微生物通過根據在作為唯一碳源的 煤上生長的能力的篩選而被富集。
3.如權利要求1所述的方法，其中步驟(C)包括以多於一種濃度體外測試一種或多種 底物、反應物或輔因子以在包含從所述含烴地層分離的至少一種微生物的培養系統中監 測和優化甲烷的生成，而且其中所述培養系統提供煤作為唯一的碳源。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述至少一種微生物是能夠將烴轉化成選自由氫、 二氧化碳、乙酸鹽、甲酸鹽、甲醇、甲胺和產甲烷的底物組成的組的產物的細菌物種或 古細菌物種；產甲烷的細菌物種；或產甲烷的古細菌物種。
5.如權利要求3所述的方法，其中所述至少一種微生物是選自由假單胞菌屬、弓形杆 菌屬、脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、脫硫弧菌屬、螺旋體屬、丹毒絲菌屬、索氏菌屬、梭 菌屬、無膽甾原體屬、磁螺菌屬和硫磺單胞菌屬組成的屬的組的細菌物種；或是選自由 甲烷葉菌屬、甲烷卵圓形菌屬和泉古菌門的成員組成的組的古細菌物種。
6.如權利要求1所述的方法，其中步驟(C)包括以多於一種濃度體外測試一種或多種 底物、反應物或輔因子以在包含限定的微生物聚集體的培養系統中監測和優化甲烷的生 成；其中所述限定的微生物聚集體將來自含烴地層的微生物單菌株的培養物與另一種微 生物單菌株的至少一種其他的限定的培養物相組合，使得所述限定的微生物聚集體的成 員協同作用以生成甲烷；並且此外其中所述培養系統提供煤作為唯一的碳源。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述限定的微生物聚集體包括選自由以下組成的屬 的組的至少兩種微生物物種假單胞菌屬、弓形桿菌屬、脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、脫 硫弧菌屬、螺旋體屬、丹毒絲菌屬、索氏菌屬、梭菌屬、無膽甾原體屬、磁螺菌屬、硫 磺單胞菌屬；甲烷葉菌屬、甲烷卵圓形菌屬和泉古菌門的成員。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述含烴地層選自由煤、泥煤、褐煤、油頁巖、油 地層、傳統的黑油、粘性油、油砂和焦油砂組成的組。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述酶選自由過氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、 漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶、氧化酶、固氮酶、纖維素酶、澱粉酶、葡聚 糖酶、普魯蘭酶、還原酶、歧化酶、加氧酶、單加氧酶、雙加氧酶、過氧化氫酶、氫化 酶和羧化酶組成的組。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述酶選自由加氧酶、單加氧酶和雙加氧酶組成 的組。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述底物、反應物或輔因子選自由含硫化合物、 含氮化合物、含磷化合物、微量元素、電子受體、電子供體、滷素、金屬、醇、有機 酸、烷、烯、炔、芳香化合物、胺、醚、醛、酮、硫醇、乙酸鹽、芳香烴和氣體組成的組。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述底物、反應物或輔因子是氧。
13.一種用於在含烴地層中提高甲烷的生物源生成的方法，所述方法包括將由權利要 求1所述的方法鑑定的刺激劑引入所述含烴地層中。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述方法包括將氧引入所述含烴地層中。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述含烴地層是煤。
16.—種用於在含烴地層中增加甲烷的生物源生成的方法，所述方法包括調節選自 由過氧化物酶、酚氧化酶、醇氧化酶、漆酶、水解酶、糖基水解酶、酯酶、醚酶、氧化 酶、固氮酶、纖維素酶、澱粉酶、葡聚糖酶、普魯蘭酶、還原酶、歧化酶、加氧酶、單 加氧酶、雙加氧酶、過氧化氫酶、氫化酶和羧化酶組成的組的酶。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述酶在所述含烴地層中的現存微生物中存在。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述酶被引入所述含烴地層中。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述酶通過將表達所述酶的微生物引入所述含 烴地層中而被引入。
20.根據權利要求19所述的方法，其中表達所述酶的所述微生物是通過修飾來源於所 述含烴地層的微生物而製備的重組的微生物。
21.根據權利要求19所述的方法，其中表達所述酶的所述微生物是合成的微生物。
22.—種鑑定用於煤到甲烷的轉化的限定的微生物聚集體的方法，所述方法包括(a)從來源於煤環境的一種或多種微生物獲得核酸序列；(b)確定所述核酸序列的一種或多種基因產物的存在，其中所述基因產物是在煤到甲 烷的轉化中涉及的途徑中的酶；(C)製備來自所述煤環境的所述一種或多種微生物的單菌株的培養物，其中所述微生 物的單菌株含有所述一種或多種基因產物；以及(d)將所述培養的微生物單菌株與另一種微生物單菌株的至少一種其他的限定的培養 物相組合以提供限定的微生物聚集體；其中所述限定的微生物聚集體的成員協同作用以生成甲烷。
23.—種限定的微生物聚集體，其由權利要求22所述的方法鑑定，用於煤到甲烷的轉化。
24.如權利要求22所述的方法，所述方法還包括(e)提供底物、反應物或輔因子給增加甲烷生成的所述限定的微生物聚集體。
25.如權利要求22所述的方法，其中所述限定的微生物聚集體包括選自由以下組成的 屬的組的至少兩種微生物物種假單胞菌屬、弓形桿菌屬、脫硫單胞菌屬、暗桿菌屬、 脫硫弧菌屬、螺旋體屬、丹毒絲菌屬、索氏菌屬、梭菌屬、無膽甾原體屬、磁螺菌屬、 硫磺單胞菌屬；甲烷葉菌屬、甲烷卵圓形菌屬和泉古菌門的成員。
26.—種用於增加甲烷從煤的生物源生成的方法，所述方法包括將由權利要求22所述 的方法鑑定的限定的微生物聚集體引入煤床中。
27.—種用於增加甲烷從煤的生物源生成的方法，所述方法包括將由權利要求22所述 的方法鑑定的限定的微生物聚集體連同所述底物、反應物或輔因子一起引入煤床中。
全文摘要
本發明描述了鑑定在含烴地層中用於甲烷的生物源生成的刺激劑的方法。方法包括用於確定基因產物(即是在烴到甲烷的轉化涉及的多種途徑中的酶)的微生物核酸序列信息的使用。由本發明的方法鑑定的酶和刺激劑能夠例如通過添加至煤層和煤層氣井在用於提高生物源甲烷的生成的工藝中使用。
文檔編號E21B43/22GK102027195SQ200980116909
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月12日 優先權日2008年5月12日
發明者E·J·馬瑟, G·V·託萊多, J·C·文特爾, T·H·理察森, U·斯汀吉爾 申請人:合成基因組股份有限公司