環噻唑黴素生物合成功能基因簇的製作方法

2024-04-06 05:21:05

專利名稱：環噻唑黴素生物合成功能基因簇的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程技術領域的基因簇，具體是一種環噻唑黴素生物合成功 能基因簇。
背景技術：
硫肽類抗生素是一類通常由微生物次級代謝產生的多肽類抗生素，具有如下結 構特點(Chem Rev(2005) 105，685 714)富含經高度修飾且含硫的大環形多肽；在空間 結構的中心位置是一個被三位或者四位噻唑環取代的含氮雜環(如吡啶和脫水哌啶)；在 這個中心雜環的周圍分布著眾多被修飾過的異分子間形成的環狀胺基酸殘基，包括噻唑， 噁唑，脫氫胺基酸。除了諸多的結構共性之外，大多數硫肽類抗生素的生物活性也有共同 的特點幾乎對革蘭氏陰性菌沒有毒性，而是通過幹擾蛋白質的合成來抑制革蘭氏陽性 菌的生長。具體到醫學和農業領域的應用上來說，硫肽類抗生素所覆蓋的領域非常的廣 泛硫連絲菌素thiostr印ton能夠抑制核糖體合成蛋白(J Mol Biol (1998) 276，391 404)，還能誘導變鉛鏈黴菌中TipA蛋白的大量合成(J Bacteriol (1989) 171，1459 1466)；環噻唑黴素cyclothiazomycin則是一種具有潛在應用前景的腎素抑制劑(renin inhibitor)，同時對水稻胡麻等農作物致病真菌也有殺滅作用(J Antibiot (1991) 44, 582-8 ；Bioorg MedChem(2006) 14，8259-70)；在硫肽類抗生素這個大家族中，有相當多 的成員對各種高耐藥性致病菌株都有抑制作用，包括MRSA(methicil 1 in-resistant Staphylococcus aureus), PRSP(penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae) 禾口 VRE(vancomycin-resistant enterococci)(Chem Rev(2005) 105, 685 714 ；Chem Biol (2009) 16，141 147)。在細菌細胞內部，普通的L型胺基酸殘基，是通過何種方式經由哪些酶類催化， 進行哪些生物化學反應，形成分子間的芳香環從而構建出複雜的空間結構，最終表現出 各種不同的生物活性硫肽類抗生素正是引發這一系列有趣問題的經典代表，一直以來， 有機化學家們都致力於在實驗室中人工合成這種高度修飾的多肽(Angew Chem Int Ed Engl (2007) 46，7930 7954)。相較之下，生物學家們對之生物合成途徑的研究成果就要匱 乏的多，這與之在醫藥農業領域的應用潛力極不相稱。很長時間以來，對於硫肽類抗生素體 內合成的研究都僅僅止步於體內餵養實驗的範圍內(J. Am. Chem. Soc. (1993) 115，7992 8001 ;J. Am. Chem. Soc. (1996) 118,11363 11368 ;Bioorg Med Chem(1996)4，1135 1147)，直到最近兩年，隨著多個核糖體合成肽類抗生素基因簇的克隆和報導，隨著基因組 測序的進行，越來越多的可能編碼硫肽類抗生素合成酶的基因簇出現在科學家的視線裡 (Proc NatlAcad Sci U S A (2008) 105，5879 5884)，為此類抗生素分子合成機制的深入 研究奠定了一定的基礎。同時也為基於生物合成機制開展生物工程的實踐探索打開了通 道。環噻唑黴素(cyclothiazomycin，CLT)是一種較為特別的硫肽類抗生素，它的結 構特點非常鮮明唯一擁有三環結構的硫肽(unique tricyclic structure)，且在中心pyridine環的取代基團上，CLT並沒有典型硫肽的2-和3-噻唑環取代，而是代之以丙氨 酸衍生出來的分子間環形殘基(R-)，游離的羧基端也因為碳硫鍵的存在而呈現出半游離狀 態，且分子內並非都是還原狀態的噻唑環，而是包含了 3個噻唑環和3個噻唑啉。環噻唑 黴素具有相當的抑制人體腎素的活性，且對很多農作物真菌病也有殺滅作用，所以環噻唑 黴素的應用潛力相當大。通過DNA重組技術可以對抗生素化學結構進行改造，提高效價、 擴大抗菌譜、降低毒性，同時對調節基因的遺傳工程改造還可以提高抗生素的產量，這方 面的先驅Hopwood等利用來自不同鏈黴菌菌株的結構基因轉移產生出新的雜合的抗生素 (Nature (1985) 314，642 644)。抗生素生物合成的相關基因，包括結構基因，抗性基因以 及調節基因一般都成簇存在(Annu. Rev. Microbiol. (1989) 43，173 206)。環噻唑黴素的 生物合成方面的研究未見任何報導。經對現有技術的文獻檢索發現，尚未見到與本發明的環噻唑黴素生物合成基因簇 有
關的報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種環噻唑黴素生物合成功能基因 簇、重組載體及宿主。本發明的基因簇包含了環噻唑黴素生物合成的所有遺傳元件，實現了 環噻唑黴素的生物合成。本發明是通過以下的技術方案實現的本發明涉及一種環噻唑黴素生物合成基因簇，該基因簇包含分別編碼如下胺基酸 序列的17個基因，所述胺基酸序列具體為=SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQID NO : 16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18。進一步地，所述環噻唑黴素生物合成基因簇包含如下17個基因，所述17個基因的 鹼基序列具體為(I)SEQ ID NO :1 第 16526 16705 位所示鹼基序列、(2) SEQ ID NO :1 第 14372 16411 位所示鹼基序列、(3) SEQ ID NO :1 第 16870 18555 位所示鹼基序列、(4) SEQ ID NO :1第1邪93 2O533位所示鹼基序列、(5) SEQ ID NO :1 第 11730 14354 位所示鹼基序列、(6) SEQ ID NO :1 第 10733 11755 位所示鹼基序列、(7) SEQ ID NO :1第％01 IO625位所示鹼基序列、(8) SEQ ID NO 1第4875 5妨2位所示鹼基序列、(9) SEQ ID NO 1第4404 4了36位所示鹼基序列、(IO)SEQ ID NO :1 第 20695 21204 位所示鹼基序列、(Il)SEQ ID NO :1 第 1857 2747 位所示鹼基序列、(12) SEQ ID NO :1 第 6629 9424 位所示鹼基序列、(13) SEQ ID NO :1 第 2829 4262 位所示鹼基序列、(14) SEQ ID NO :1 第 5867 6442 位所示鹼基序列、
(15) SEQ ID NO 1 第 21712 22153 位所示鹼基序列、(16) SEQ ID NO :1 第 1182 1541 位所示鹼基序列、(17) SEQ ID NO :1 第 21248 21601 位所示鹼基序列。所述環噻唑黴素生物合成基因簇的鹼基序列如SEQ ID NO=I所示。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明得到的基因簇通過異源表 達的方式在異源宿主變鉛青鏈黴菌1326中實現了環噻唑黴素的生產，異源表達生測抑菌 圈和發酵物提取物的質譜檢測都證實了該基因簇在異源宿主中的功能性，也即其包含了環 噻唑黴素生物合成的所有遺傳元件。


圖1為環噻唑黴素的化學結構圖；圖2為環噻唑黴素的生物活性測定結果圖；圖3為10-22發酵物甲醇提取物的Q-TOF檢測的離子流圖；圖4為圖3的離子流提取放大以及同位素豐度示意圖；圖5為環噻唑黴素分子的簡單示意圖；圖6為二級質譜分析圖；圖7為環噻唑黴素基因簇的結構圖；圖8為異源表達定位出環噻唑黴素的完整合成基因簇圖；圖9為異源表達的1326: :pJTU4892發酵提取物質譜分析圖；圖10為環噻唑黴素生物合成途徑示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1環噻唑黴素生物合成功能基因簇的獲得本實施例中的環噻唑黴素生物合成功能基因簇的序列如SEQ ID NO :1所示，得到該基因簇的步驟如下步驟一，環噻唑黴素產生菌吸水鏈黴菌10-22總DNA的提取接種10-22至TSBY(10. 3%蔗糖)培養基於含有彈簧的三角瓶中30°C培養48h。 離心收集菌體,重懸於 5ml SET 緩衝液中(75mM NaCl, 25mM EDTA pH8. 0,20mM Tris-HCl ρΗ7· 5)。加入100 μ 1溶菌酶溶液(50mg/ml)，置37°C約60分鐘。溶菌後然後加入140 μ 1 蛋白酶K溶液(20mg/ml)混均勻，再加600 μ 1 10% SDS，通過顛倒混勻，置55°C溫浴2h，期 間偶爾顛倒幾次。再加入2ml 5M NaCl，徹底混勻，冷卻置37°C後，加入5ml氯仿，於室溫輕 輕混勻。20°C、4500g離心15分鐘。轉移上清至新管中，加入0. 6倍體積的異丙醇顛倒混 勻，約3分鐘後用玻棒挑取至含70%乙醇的新管中洗滌，重複2次，空氣中乾燥，溶解在TE 中。
步驟二，吸水鏈黴菌10-22菌基因組文庫的構建(1)吸水鏈黴菌10-22總DNA的部分酶解和大片段DNA的回收 將提取的10-22總DNA用Sau3AI部分酶解，用1 %低熔點瓊脂糖凝膠，在裝有0. 5 倍 TBE 電泳緩衝液的脈衝場電泳(Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE, Bio-Rad) 中分離。回收約40kb大小的DNA片段。用熱敏的鹼性磷酸酶(APex Heat-Lab i 1 e AlkalinePhosphatase, EPICENTRE Biotechnologies 公司)處理是末端去磷酸化，供和載 體的連接及包裝轉染用。(2)連接和包裝將處理好的10-22基因組DNA (大小約40kb)和經BamHI酶切並用CIAP處理的柯 斯質粒PHZ1358按照1 1分子數比例用T4連接酶(NEB公司)連接。將在冰上溶解的噬
(MaxPlax Lambda Packing Extracts, EPICENTRE Biotechnologies ^W]) 加入連接產物中，混勻，避免產生氣泡，短暫離心，在30°C中溫浴90分鐘，再加入另一份包 裝蛋白，繼續溫浴90分鐘後加入噬菌體稀釋緩衝液(Phage Dilution Buffer, lOOmM NaCl, IOmM MgCiaOmM Tris-HCl ρΗ8· 3)至 lml，並加入 25 μ 1 氯仿，4°C保存。(3)轉染與保存將大腸桿菌EPI300(見表2-1)培養至OD6tltl = 0. 8 1. 0作為感受態菌，可在4°C 保存72h。將包裝產物與感受態菌混合，37°C溫浴20分鐘後塗含阿伯拉抗生素的LB平板。 37°C培養過夜。挑取單克隆至含抗生素的LB培養基96孔板中繼續培養18小時，加入滅菌 的甘油至終濃度20%，於-70°C中保存。步驟三，基因組文庫的篩選採用PCR的方法從基因組文庫中篩選所需要的柯斯質粒。為篩選基因組文庫，從 每個板的96孔孔中取出等量菌液混合，接種培養，提取質粒為一個模板進行PCR篩選，在得 到的陽性平板中，從每排的12個孔中取出等量菌液混合，接種培養，提取質粒為一個模板 進行PCR篩選。然後在那些陽性的排中進行單個的PCR篩選，直至篩出所有陽性克隆。步驟四，環噻唑黴素生物合成基因簇分析在異源宿主1326 (Antimicrob Agents Chemother (1992) 36 (5) 1119 ？ 124)中一 系列表達載體的實驗結果表明，環噻唑黴素基因簇主要由兩大部分組成，一部分是負責環 噻唑黴素框架結構形成的8個蛋白CltB/C/D/E/F/G/M/N，另一部分則是一些輔助抗生素合 成的因子，包括轉錄調節因子、轉運蛋白，以及可能幫助基因簇發生水平遷移的轉座酶等。在環噻唑黴素的合成基因簇中，有一個巨大的操縱子(operon) :cltD/C/A/B/E/ F/G，這一特徵和其他已知基因簇的硫肽類抗生素非常相像(Chem Biol (2009) 16，141 147)，和其他同樣也是核糖體合成的多肽類抗生素的基因分布也相當類似(Proc Natl Acad SciU S A (2008) 105，5879 5884)；考慮到在原核生物中，一個操縱子編碼的產物在 空間分布上聚合在一起的可能性很大，故而可認為這6個蛋白組成一個大的合酶系統，將 前體肽CltA包圍在其中，對其進行翻譯後修飾，這個後修飾的過程包括固定CLT前體、Ser 和Thr的脫水、Cys脫水環化形成噻唑啉、進一步脫水形成噻唑、中心位置吡啶環的合成、遊 離的羧基端硫酯鍵的形成、前導肽的切除和最終產物的釋放。在CLT的基因簇中發現了兩個調節蛋白，CltH/P，這在已報導的硫肽類抗生素基因 簇中的唯一的(Chem Biol (2009) 16，141 147 ；Proc Natl Acad Sci U S A(2009) 106 (8)，2549 2553)。其中CltH隸屬於LuxR轉錄調節因子家族，與多烯類抗生素nystatin 生物合成基因簇中的正調節因子NysI有32%的同源性(J Bacteriol (2004) 186 (5), 1345-54)。CltP則與一個屬於XRE家族的DNA結合蛋白/轉錄調節因子有43%的同源 性。CltO是基因簇中唯一的一個轉運蛋白，也是目前已知硫肽基因簇中唯一一個轉運 蛋白，它包含一個糖轉運家族的結構域(a sugar-transport family domain)，但是無 法判斷出明顯的底物識別區域，該區域在Iantibiotic前體肽的延伸過程中是必需的 (Biochemistry (2008) 47 (28)，7352 7363)。CLT生物合成基因簇還有一個很特徵，在其中 散布著4個轉座酶，其中有兩對，Cltl/L以及CltQ/L，正好分別將主體框架合成酶(I和L) 以及所有的合成酶(Q和L)包圍在其中。這種在硫肽類抗生素中罕見的現象說明CLT的生 物合成基因簇很可能部分或者全部都源自種屬間的水平基因轉移。步驟五，環噻唑黴素生物合成途徑推導通過基於精確的異源表達的基因簇組成蛋白分析以及CltM/N的缺失表達突變株 產素分析，我們對環噻唑黴素的合成途徑推導見圖10，首先應該是各個胺基酸殘基自身的 脫水和環化。其中，CltE和CltF負責了 Ser和Thr脫水生成Dha和Dhb (見圖5中的反 應c)，這個過程在Iantibiotics的生物合成途徑中已有報導。CltB和CltC則與MccB17， streptolysin S(Proc Natl Acad Sci U S A(2008)105，5879 5884)和thiocillins(Proc Natl AcadSci U S A (2009) 106 (8)，2549 2553)基因簇中負責胺基酸殘基間異源環合成 的酶同源。而CltB中，兩個不同的domain則很可能在噻唑類環形成的過程中扮演不同的 角色DFU181在空間上固定住前體肽，YcaO則將目標殘基進行脫水環化(見圖10中的反應 a) οCltC也包含了兩個domain，兩個都屬於mcbC-like domain家族，從環噻唑黴素中 噻唑啉和噻唑環的分布特徵來看，很可能兩個domain特異識別一對並排的噻唑啉為底物， 而僅有其中一個domain對N端的噻唑啉催化使之脫氫生成噻唑，而保持另一個C端的噻唑 啉還原狀態不變(見圖10中的反應b)。如此往復，造成了環噻唑黴素分子結構中不尋常的 噻唑啉和噻唑並存的狀態(見圖10中的數字標識8)。 硫肽類抗生素的結構特徵之一就是取代吡啶或者是脫水哌啶(Chem Rev(2005) 105,685 714)，那麼在CLT的合成過程中，哌啶很有可能扮演一個中間 產物的角色。體外實驗已經證明一個分子間異源的DA反應(an intramolecular hetero-Diel-Alder reaction)能夠合成一個哌啶環(見圖10中的反應d)。同源性比 較分析揭示了 CltD也是一個雙結構域組成的蛋白，值得注意的是，其N端與一個肽酶(a putative peptidase M14, carboxyp印tidase Α)有41%的相似性。這個肽酶結構域的發 現在硫肽基因簇中尚屬首次，它表明LP的切除很可能由該亞基來完成。而CltD的C端則 被YcaO家族結構域佔據，這個前文中已經討論被認為是環化脫水酶的一個亞基，因此我們 推測該結構域在吡啶的形成中也執行類似的功能即將參與哌啶形成的幾個胺基酸殘基固 定在一個相鄰的位置上進行DA反應成環後再脫水，從而生成了一個脫水哌啶的中間產物 9(見圖10)。在Thio和thiocillins的基因簇功能探討中，LP的切除普遍都被認為是成 熟抗生素合成的最後一步，而在CLT的生物合成中，由於兩種不同功能的結構域共存於一 個ORF中，因此我們相信這個肽鏈剪切過程發生在吡啶的合成過程中。CltG與已知蛋白沒 有明顯的同源性，在這裡可能是催化LP被切除後的脫氨基過程(見圖10中的反應e)。
CLT的化學結構中還有另一個不尋常的硫醚鍵存在，它是由脫水的S5和C18兩個殘基組成，跟Iantibiotics中常見的β位硫醚鍵不同，這裡是C18上的硫元素和S5上α 位的碳原子之間形成的叔碳硫醚鍵(tertiary thioester)(具體見圖1)。在Iantibiotic 的生物合成過程中，分子間的硫醚鍵是由Cys上的硫通過麥可加成(Michael Addition) 的方式加到摺疊後處於臨近位置的Ser和Thr上的β位碳上去的[Org Lett (2007) 9 (17), 3343-6]。CLT中這個α位上的硫醚鍵很可能源自β位的硫醚鍵，是通過一個重排反應生 成的(見圖10中的反應g)。基因簇中的CltN與EthD有34 %的序列同源性，EthD是一個能夠將石油汙 染物乙基叔丁基醚(ETBE)降解的細胞色素P-450基因簇中一個必需的蛋白。在EthD 缺失的情況下，基因簇中的其他基因不能夠回補一株ETBE缺陷菌株的降解活性(J Bacteriol (2001) 183 (22)，6551-7)。雖然EthD的生物學功能並沒有解釋清楚，但是它參與 的反應中出現了叔丁基的身影，這給了我們一些啟示CltN很可能就是負責重排生成這個 叔碳硫醚鍵的催化蛋白。而與之共處於一個操縱子之中的CltM，則可能就是參與到上述的 麥可加成中的蛋白(見圖10中的反應f)。與前面討論的大分子蛋白不同，無論是CltM 還是CltN都是小分子酶，都沒有類似YcaO的固定結構域，這意味著已經完成吡啶合成後的 未成熟CLT已經正確摺疊到合適的位置，使得S5和C18得以相鄰，以供上述兩個蛋白完成 催化叔碳硫醚鍵形成的功能。經過上述後修飾過程，成熟的環噻唑黴素被切掉前提肽後結 合到轉運蛋白CtlO上，運輸至胞外執行抗菌功能。步驟六，環噻唑黴素生物合成基因簇中基因的製備以環噻唑黴素生物合成基因簇的序列SEQ ID NO 1為模板，設計引物，採用PCR方 法可分別得到如下17個基因(1)負責環噻唑黴素前體多肽生物合成的結構基因1個cltA ；所述基因cltA， 位於SEQ ID NO :1的第16526 16705位；編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :2所示；功 能編碼環噻唑黴素前體肽。PCR擴增引物序列為F (5 』 ATGGAGAAGGAACTCGTCCT 3 』)和 R (5，TCAGCAGCAACAGCACGAGCA 3，)，擴增條件為 95 °C 5 分鐘，95°C 30 秒 60 °C 30 秒 72 °C 30 秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(2)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltB，位於SEQ ID NO 1的第14372 16411位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 3所示；功能編碼NADH氧化酶，該氧化酶負責 催化噻唑啉脫氫生成噻唑。PCR擴增引物序列為F (5 』 GTGACCGTGACCGACACCGCCGC3，)和 R(5，TCACGGGAACGGGTGCGG3，)，擴增條件為 95°C 5 分鐘，95°C 30 秒 64°C 30 秒 72°C 90 秒共 30個循環，最後72 °C 5分鐘。(3)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltC，位於SEQ ID NO 1的第16870 18555位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :4所示；功能編碼環化肽酶，該酶負責催化中央 吡啶的環化和前導鏈的切除。PCR擴增所用引物序列為F(5』GTGGCCGACGCGGACGCCGACA 3』) 和 R(5，TCACCATGTCAGCGGCAT3，)，擴增條件為 95°C 5 分鐘，95°C 30 秒 64°C 30 秒 72°C 90 秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(4)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltD，位於SEQ ID NO 1的第18593 20533位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :5所示；功能編碼胺基酸(絲氨酸/蘇氨酸) 脫水酶的核苷酸序列，該酶負責催化絲氨酸和蘇氨酸的脫水。PCR擴增所用引物序列為F (5，ATGGCCGTGACAATCGCCAGA 3，)和 R (5，CTAGTCATCGAGGACCACGAC 3，)，擴增條件為 95 °C 5 分鐘，95°C 30秒62 °C 30秒72 °C 120秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(5)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltE，位於SEQ ID NO 1的第11730 14354位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :6所示；功能編碼胺基酸脫水酶的核苷酸序列， 該酶負責催化絲氨酸和蘇氨酸的脫水。PCR擴增所用弓I物序列為F (5 』 ATGACCGAGAACCACACCA 3，)禾口 R(5『 TCAAGCGGGCCGCTGTCGTTCT 3，)，擴增條件為 95°C 5 分鐘，95°C 30 秒 62°C 30 秒 720 C 180秒共30個循環，最後72°C 5分鐘。(6)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltF，位於SEQ ID NO :1的第 10733 11755位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 7所示；功能編碼脫氨基酶的核苷 酸序列，該酶負責催化完成形成吡啶的最後一個脫氨基步驟。PCR擴增所用引物序列為 F(5『 ATGCCGGAGAACGACAGC 3，)和 R(5，TCACGAGGCGGCCAGTGCCT 3，)，擴增條件為 95°C 5 分 鍾，95°C 30秒64°C 30秒72 °C 40秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(7)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltG，位於SEQ ID NO :1的第 9501 10625位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :8所示；功能編碼LuxR家族的 轉錄調節蛋白，該酶參與了環噻唑黴素合成的調節過程。PCR擴增所用引物序列為 F (5，GTGGCACCGTGGGCCGAG 3，)禾口 R(5，TCAGCCGGCTCCGCCGGC 3，)，擴增條件為 95°C 5 分 鍾，95°C 30秒68 °C 100秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(8)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltM，位於SEQ ID NO=I的第4875 5462位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :14所示；功能編碼的蛋白該酶參與了環噻 唑黴素中硫醚鍵的形成。PCR擴增所用引物序列為F (5 』 GTGCGCTGCGACTTCCGGT 3 』)和 R(5『TCATCGACGACACGGTTCA 3，)，擴增條件為 95°C 5 分鐘，95°C 30 秒 64°C 30 秒 72°C 30 秒 共30個循環，最後72°C5分鐘。(9)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltN，位於SEQ ID NO=I的第4404 4736位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :15所示；功能編碼類似ETBE降解相關蛋白 (Ethyltert-butyl ether degradation EthD)，該酶可能參與了環噻唑黴素中硫醚鍵的形 成。PCR 擴增所用弓丨物序列為 F (5，ATGATCATTACGCTCAAGC 3，)和 R (5，TCATCGGCCGTCGATGACT 3，)，擴增條件為95°C 5分鐘，95°C 30秒58°C 30秒72°C 30秒共30個循環，最後72°C 5分 鍾。(10)負責環噻唑黴素翻譯後修飾的酶基因cltJ，位於SEQ ID NO 1的第20695 21204位，編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 11所示；功能環氧化物水解酶，該酶可能參與 了環噻唑黴素中硫醚鍵的形成。PCR擴增所用引物序列為F(5』 ATGCGCCGGCACCGCTCGA 3』) 禾口 R (5，CTACCTCGACCGGACGAT 3，)，擴增條件為 95 °C 5 分鐘，95°C 30 秒 60 °C 30 秒 72 °C 30 秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(11)負責環噻唑黴素生物合成的調節基因cltP，位於SEQ ID NO 1的第1857 2747位；編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO :17所示；功能XRE family轉錄調節因子，該因子 參與了環噻唑黴素合成的調節過程。PCR擴增所用弓I物序列為F (5』 ATGATCGTTGCCATGGCGGA 3，)禾口 R(5『 TCAGGTTGCTGCAAGCAGGTGC 3，)，擴增條件為 95°C 5 分鐘，95°C 30 秒 62°C 30 秒 72 0C 50秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(12)負責環噻唑黴素生物合成的調節基因cltH，位於SEQ ID NO 1的第6629 9424位；編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 9所示；功能LuxR家族的轉錄調節蛋白。PCR 擴增所用引物序列為 F(5』 ATGATCGTTGCCATGGCGGA 3』)和 R(5』 TTGACCTCAGTCGATCGAATCG 3，)，擴增條件為95°C 5分鐘，95°C 30秒62°C 30秒72°C 150秒共30個循環，最後72°C 5 分鐘。(13)環噻唑黴素生物合成後負責產物運輸的轉運蛋白基因cltO，位於SEQ ID NO 1的第2829 4262位；編碼的蛋白的序列如SEQ ID NO 16所示；功能轉運蛋白，負責環 噻唑黴素生成後的外運過程。PCR擴增所用弓I物序列為F (5 』 GTGAGTGCATGCAACGGACCT 3 』) 禾口 R (5，TCAATCGAGTGCCTCCGT 3，)，擴增條件為 95 °C 5 分鐘，95°C 30 秒 62 °C 30 秒 72 °C 90 秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(14)轉座酶基因cltl，位於SEQ ID NO :1的第5867 6442位；編碼 的蛋白的序列如SEQ ID NO :10所示；功能轉座酶。PCR擴增所用引物序列為 F (5，ATGGGCCGCCTGCGCGTT3，)和 R (5，TCATCCGTCCGTGCCCGCC 3，)，擴增條件為 95 °C 5 分 鍾，95°C 30秒68 °C 60秒30個循環，最後72 °C 5分鐘。(15)轉座酶基因cltL，位於SEQ ID NO :1的第21712 22153位；編碼的蛋白的 序列如SEQ ID NO :13所示；功能IS1648轉座酶，該酶可能參與了基因簇的水平轉移。PCR 擴增所用引物序列為 F(5，GTGAGTAACGGGCGTTGC 3，)和 R(5，TCAAGGCGGACCGATGTG 3，)，擴 增條件為95 °C 5分鐘，95°C 30秒68 °C 40秒共30個循環，最後72 °C 5分鐘。(16)轉座酶基因cltQ，位於SEQ ID NO 1的第1182 1541位；編碼的蛋白的序 列如SEQ ID NO :18所示，功能轉座酶，該酶可能參與了基因簇的水平轉移。PCR擴增所用 引物序列為 F(5，ATGGAGGCGATCCGGGTGC 3』)和 R(5』 TCACGCCCACATCAGTAG 3』)，擴增條件 為95°C 5分鐘，95°C 30秒63°C 30秒72°C 40秒共30個循環，最後72°C 5分鐘。(17)氮還原酶基因cltK，位於SEQ ID NO 1的第21248 21601位；編碼的蛋白 的序列如SEQ ID NO :12所示；功能氮還原酶(nitroreductase)家族蛋白。PCR擴增所用 引物序列為 F(5，ATGGACGTATATGAGGCCGT 3』)和 R(5』 TCAAGGTAGCGATCTTCCT 3』)，擴增條 件為95°C 5分鐘，95°C 30秒60°C 30秒72°C 40秒共30個循環，最後72°C 5分鐘。實施例2環噻唑黴素生物合成功能基因簇功能的驗證步驟一，吸水鏈黴菌10-22及變鉛青鏈黴菌1326異源生產株的培養將吸水鏈黴菌10-22及變鉛青鏈黴菌1326異源生產株(Antimicrob Agents Chemother (1992) 36 (5) :1119 1124)接種於SFM固體培養基平板上，30°C培養5 7天， 用打孔器將培養物打成菌塊備用。將PDA固體培養基平板上活化的吸水黴素生物學活性測 定指示灰黴菌(Botrytis cinerea Persoon)菌絲體收集到0. 5ml無菌水中混勻打碎，均勻 混於60°C左右尚未凝固的PDA培養基中，混勻後倒板，在合適的位置上放置待測的鏈黴菌 菌塊，30°C培養48h後觀察結果，結果見圖2。步驟二，環噻唑黴素的快速提取取培養7天的固體發酵物，用兩倍體積的甲醇浸泡過夜，並將浸泡液以15000g離 心10分鐘2次，用無水硫酸鈉去水，然後用真空旋轉蒸發儀將其旋幹，再以等體積甲醇將 剩餘物重新溶解，樣品用0. 2微米的一次性過濾器過濾，進行質譜檢測。利用LC-ES-Q-TOF 對環噻唑黴素進行高精度質譜檢測分析，LC-ES-Q-TOF分析採用的是安捷倫公司Agilent1200 系統，柱子規格為 2· IX 30mm C18 reverse-phase column (Agilent Co.CA)，流速為 0. 3ml/min。A泵溶液為10%的乙腈溶液(含0. 1 %甲酸)，B泵溶液為含0. 甲酸的乙腈。 梯度洗脫條件是，0 10分鐘內溶液B的濃度從0 90%。質譜檢測是通過安捷倫公司的 6530Accurate-Mass Q-TOF質譜檢測儀；二級質譜是採用指定靶點依賴的模式進行。檢測 結果見圖3，圖4將圖3的離子流峰進行放大後得到的一價和二價正離子的分布以及同位素 峰圖。二級質譜的具體結果和分析見圖5和圖6。異源表達菌株的CLT質譜分析結果見圖 9。
步驟三，異源表達雙功能質粒載體的構建本實施例中用於異源表達載體的構建採用酶切連接的方法。因為構建文庫所用 的柯斯質粒(PHZ1358)是一種大腸桿菌鏈黴菌的穿梭質粒，具有在鏈黴菌中遺傳不穩定 的特點，在非抗性選擇的條件下，質粒極容易丟失，所以不適合用於異源表達。本實施例採 用的是以PSET152為載體，將基因組文庫中篩選到的負責環噻唑黴素生物合成的柯斯質 粒酶切，連接到經相應限制性內切酶酶切的PSET152載體上見圖8，構建了載體pJTU4891 和pJTU4892。pJTU4894是作為基因缺失質粒構建的，採用了 PCR-Targeting的方法在將 PJTU4891轉化至含有pIJ790質粒的大腸桿菌BW25113中(E. coli BW25113/pIJ790)中制 備成感受態細胞，以通過PCR擴增的pIJ779或pIJ778中含有的aac基因(帶有與目的替 換基因兩側同源的尾端)DNA進行電轉化，得到基因置換質粒pJTU4894。所有的異源表達載 體構建成功後都轉化到大腸桿菌ET12567中以消除DNA甲基化影響，然後用接合轉移的方 法轉化變鉛青鏈黴菌1326。步驟四，環噻唑黴素的異源表達確定了一個完整的生物合成基因簇從吸水鏈黴菌10-22基因組文庫中用基於環化脫水酶的保守序列設計的引物篩 選得到兩個陽性cosmids，其中含有較長插入片段的一個質粒14E6測序後進行後續的分 析。將14E6用XbaI和EcoRI雙酶切後與穿梭載體pSET152雙酶切後的片段連接，構 建出含有27kb插入序列的重組質粒PJTU4891，將之通過大腸桿菌ET12567介導轉入異源宿 主變鉛青鏈黴菌1326中，對照是空載體pSET152轉入1326。生測實驗表明pJTU4891使得 1326具有了抑制灰黴菌的活性，作為對照的含空載體菌株則沒有活性(圖7，8)。這一結果表明27kb的插入片段中包含了完整的環噻唑黴素生物合成基因簇。在 此克隆的基礎上，進一步構建了多個衍生質粒，確認一段22kb的序列包含了基本最小化的 環噻唑黴素生物合成基因簇。其中含有最小基因簇的PJTU4892在1326中的表達產物質譜 分析如圖9。序列表上海交通大學環噻唑黴素生物合成功能基因簇18PatentIn version 3. 3134982DNA
Streptomyces hygroscopicus 10-221ggatcttttccgctgcataa ccctgcttcg gggtcattat agcgattttt tcggtat atc60catcctttttcgcacgatat acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac tttccttggt120gtatccaacg gcgtcagccg ggcaggatag gtgaagtagg cccacccgcg agcgggtgtt180ccttcttcactgtcccttat tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct gctctgcgag240gctggccggctaccgccggc gtaacagatg agggcaagcg gatggctgat gaaaccaagc300caaccaggaa gggcagccca cctatcaagg tgtactgcct tccagacgaa cgaagagcga360ttgaggaaaa ggcggcggcg gccggcatga gcctgtcggc ctacctgctg gccgtcggcc420agggctacaaaatcacgggc gtcgtggact atgagcacgt ccgcgagctg gcccgcatca480atggcgacctgggccgcctg ggcggcctgc tgaaactctg gctcaccgac gacccgcgca540cggcgcggttcggtgatgcc acgatcctcg ccctgctggc gaagatcgaa gagaagcagg600acgagcttggcaaggtcatg atgggcgtgg tccgcccgag ggcagagcca tgactttttt660agccgctaaaacggccgggg ggtgcgcgtg attgccaagc acgtccccat gcgctccatc720aagaagagcgacttcgcgga gctggtgaag tacatcaccg acgagcaagg caagaccgat780ccccggggacctgcaggtcg actctagagg atcgtgtgga agttccgtac cgggacggcc840tggcgggatgtgcctgagcg gtacgggccg tgggccacgc tgtacacccg ttttcgccgg900tgggcggcggacggcacgtt cgaacggatg ctccgcgccg cgcagtcccg ggtcgacgcc960gtcggtgacatcgactggct ggtgtcggtc gactccacca tcgtccgcgc ccaccagcat1020gccgccggtgctcgaaaagg gggctccgca gcccagctct cgggcgctcc cgaggcggcc1080tgaccagcaagattcacctg gcctgcgacg gtgccggccg cccgctcgcc ttcatcgtca1140cgggcggcaacgccaacgac tgcacccagt tctccgctgt gatggaggcg atccgggtgc1200cccgcccaggcccggggcgg ccccgggtgc ggccctcgca cgtcctgggc gacaagggct1260acagctccagggcgatccgc agctggctgc gtcggcgcgg gatcagccac accattcccg1320agcgagccgatcaggtccgc aaccggctga accgcggcag ccgtggcgga cggcccccgg1380ccttcgaccgcgacacctac aagcggcgca acgtggtgga acggtgcttc aacaagctga1440agcagtggcgcggcatcgcc acccggtacg acaagaccac cgagtcctac caagcagccg1500tcaccctcgcagccctactg atgtgggcgt gacgtttgac gacaggacct aggcccaggt1560gccgtccgccgaccagcggc gatgccgttc agagaccgtc ttccaggccc cgtagcgttc1620cggcaggtcacgccacggga caccggtgcg gacccggaac aggatcccgt tgaccaccct1680gcgatggtcgctccaccggc ctcgccgacg gcccgccgag ggcagatgcg attcgagtag1740cgaccactcgcgattcgtca gatcgccgac ccatgccccg tccaacgagc aaccggtcgg1800agagtcacatgatccgtcgg acagtgcctg gccgcgggcc tcgaccggcc tcctcaggtt1860gctgcaagcaggtgccgcac acgcgcaggg ccgtcgatgg tgccgcgggc gatgcggtgg1920gccagctcttcgagccgttc ctgggtcgtg cgatccgccg gttggtacac gacgacgcgg1980gtacggggattctcctctag cagcagggtg atggcgcgca cggacaggct gccgacgtgc2040cgtgaccggatgcgcttcac acgtccgggc tcggtggaca catccgcctg ctcccacagg2100cgcacgaacagcggtgactc ctcgcggagc cgggccagca acggcgccca cgccggatcg2160gtgaccgactcgccgtggta cgcgcgcagt ttggccacga cggccgcgca ttcctgttcg2220
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49
權利要求
一種環噻唑黴素生物合成基因簇，其特徵在於，該基因簇包含分別編碼如下胺基酸序列的17個基因，所述胺基酸序列具體為SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18。
2.一種根據權利要求1所述的環噻唑黴素生物合成基因簇，其特徵在於，該基因簇包 含如下17個基因，所述17個基因的鹼基序列具體為⑴SEQIDNO1 第 16526 16705位所示鹼基序列、(2) SEQIDNO1 第 14372 16411位所示鹼基序列、(3) SEQIDNO1 第 16870 18555位所示鹼基序列、(4) SEQIDNO1 第 18593 20533位所示鹼基序列、(5) SEQIDNO1 第 11730 14354位所示鹼基序列、(6)SEQIDNO1 第 10733 11755位所示鹼基序列、(7) SEQIDNO1第9501 10625位所示鹼基序列、(8)SEQIDNO1第4875 5462位所示鹼基序列、(9)SEQIDNO1第4404 4736位所示鹼基序列、(10)SEQID NO :1第20695 21204位所示鹼基序列、(11)SEQID NO :1第1857 2747位所示鹼基序列、(12)SEQID NO :1第6629 9424位所示鹼基序列、(13)SEQID NO :1第2829 4262位所示鹼基序列、(14)SEQ ID NO :1第5867 6442位所示鹼基序列、(15)SEQID NO :1第21712 22153位所示鹼基序列、(16)SEQID NO :1第1182 1541位所示鹼基序列、(17)SEQID NO :1第21248 21601位所示鹼基序列。
3.根據權利要求2所述的環噻唑黴素生物合成基因簇，其特徵在於，該基因簇的鹼基 序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
一種基因工程技術領域的環噻唑黴素生物合成功能基因簇、重組載體及宿主；本發明涉及一種環噻唑黴素生物合成基因簇，該基因簇包含分別編碼如SEQ ID NO2～SEQ ID NO18所示胺基酸序列的17個基因；本發明還涉及一種包含該基因簇的重組載體；本發明還包含一種包含該基因簇的宿主。本發明的基因簇包含了環噻唑黴素生物合成的所有遺傳元件，實現了環噻唑黴素的生物生產。
文檔編號C12N15/11GK101838642SQ20091031159
公開日2010年9月22日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者王絳, 賀新義, 鄧子新, 黃曦 申請人:上海交通大學