獲得雙鏈核酸形成信息的方法

2023-05-27 17:24:51

專利名稱：：獲得雙鏈核酸形成信息的方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於獲得雙鏈核酸形成信息的方法。更具體地，本發明涉及一種簡單且以高靈敏度來獲得雙鏈核酸形成信息的方法。
背景技術：
：通過測量來自標記在核酸上的螢光染料、結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間用於發射螢光的螢光染料等的螢光來檢測雜交、雙鏈核酸等的技術(在下文中，稱作"螢光檢測技術")，早已在諸如DNA印跡(Southernblotting)、蛋白質印跡(Northernblotting)、DNA微陣列和實時PCR的分子生物學的各種領域中實際應用。上述螢光檢測技術包括這樣的方法，首先將螢光標記的靶核酸鏈添加到固定了探針核酸鏈的相互作用區(反應區)以進行雜交，用預定的溶液衝洗相互作用區，然後檢測來自靶核酸鏈的螢光。通過該方法，可以確定具有與探針核酸鏈互補的鹼基序列的核酸是否存在於靶核酸鏈中，即，可以獲得有關特定基因的表達的信息、關於微生物的基因組DNA的數量信息等。該方法用於DNA印跡、蛋白質印跡、DNA微陣列等中。此外，採用的第二種技術是例如通過使用稱作"嵌入劑(intercalator)"(其插入(嵌入)在雙鏈核酸中的互補鹼基對之間並發射螢光)的螢光染料來檢測雜交的技術。該檢測技術具有的優點在於，並不需要針對每種基因的專用探針，可以減少實驗成本。該方法用於實時PCR等中。近年來，通過使用特異性螢光探針來檢測靶基因的擴增的方法已經投入實際使用。例如，根據使用在5'端用螢光染料修飾並且在3'端用能夠淬火螢光染料的螢光的猝滅劑物質修飾的探針核酸鏈("TaqManTM"探針)的方法，可以通過測量由於進行聚合酶反應的而與猝滅劑分開的螢光染料所發出的螢光來檢測靶基因的擴增。日本專利公開第Hei11-290098號公開了一種雙鏈核酸的檢測方法，其包括測量由9-偶氮吖啶衍生物與雙鏈核酸的相互作用引起的螢光特性的變化。在日本專利公開第2005-291703號中公開的是含(a_核酸殘基)的肽的螢光試劑，所述肽包含分別用螢光嵌入基團(fluorescentintercalationgroups)取代的兩個以上a-核酸殘基。具體公開了包含螢光嵌入基團的用於檢測雙鏈核酸的螢光試劑。在與雙鏈核酸接觸後，螢光試劑分子中的螢光嵌入基團嵌入在雙鏈核酸中的鹼基對之間，使得由螢光試劑分子中的螢光嵌入基團引起的猝滅被消除從而導致螢光強度的增加。這種增加使得可以檢測雙鏈核酸。日本專利公開第2001-245699號公開了一種核酸的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟使探針(其由用能量供體和能量受體標記的單鏈多核苷酸構成)與標記的核酸之間形成雜交體(hybrid)，以及通過在形成雜交體之前與之後之間照射雷射來檢測能量供體或能量受體的螢光發射的變化，並且基於螢光發射的變化檢測是否發生雜交體的形成來檢測耙核酸。3然而，上述螢光檢測技術伴隨的問題在於，對於適用的相互作用系統有限制，並且不能獲得充分的靈敏度。具體而言，第一種技術需要在雜交後衝洗並除去螢光標記的靶核酸鏈。因此，探針核酸鏈需要被固定在預定的相互作用區，從而第一種技術不可能用於在溶液中的雜交等。第二種技術並不需要衝洗和消除嵌入劑，因此也可以用於檢測溶液中的雜交等。然而，該第二種技術伴隨的缺點在於，由於釋放到溶液中的嵌入劑、插入在副產的雙鏈核酸中的鹼基對之間的嵌入劑的螢光檢出等，所以背景信號較大，靈敏度未必很高。第三種技術需要設計兩種類型的對檢測靶特異性的探針，使得這些探針並排雜交。因此該第三種技術伴隨的缺點在於，這些探針的設計很難導致高成本。因此，本發明作為其主要目的提供了一種通過檢測螢光來獲得雙鏈核酸形成信息的方法，該方法簡單，可適用於各種相互作用系統，並且特徵在於具有低背景信號的高檢測靈敏度。
發明內容為了解決上面描述的技術問題，本發明首先提供了一種用於獲得與第一核酸鏈和第二核酸鏈(其具有與第一核酸鏈互補的鹼基序列)之間的雙鏈核酸的形成有關的信息的方法，該方法包括檢測與探針的螢光有關的信息，所述探針由標記在第一核酸鏈上的標記螢光染料以及結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間以允許與螢光染料進行能量轉移的嵌入劑構成。根據該方法，利用在探針分子之間的螢光共振能量轉移(FRET)，檢測螢光時可以減小背景信號。本發明方法中的探針可以包括至少包含能夠將吸收光而獲得的激發能提供給另一螢光染料的激發靶螢光染料，以及能夠通過從該另一螢光染料接收激發能而發螢光的檢測靶螢光染料的多個螢光染料的組。本發明中的嵌入劑可以是猝滅螢光染料的猝滅劑。通過使用猝滅劑作為嵌入劑，可以基於螢光的猝滅來檢測雙鏈核酸的形成。在根據本發明的方法中，對相互作用系統沒有特別的限制。例如，第一核酸鏈的末端可以固定在相互作用區的表面。本發明還提供了一種用於獲得關於雜交的信息的方法，該方法至少包括以下步驟使雜交在標記有螢光染料的第一核酸鏈與第二核酸鏈(具有與第一核酸鏈互補的鹼基序列)之間進行；加入嵌入劑，該嵌入劑可以結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間以允許與螢光染料進行能量轉移；以及檢測與螢光染料和嵌入劑的螢光有關的信息。本發明還提供了一種用於獲得與具有與探針核酸鏈互補的鹼基序列的核酸鏈的數量有關的信息的方法，該方法包括檢測與探針的螢光有關的信息，該探針由標記在探針核酸鏈上的標記螢光染料以及結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間以允許與螢光染料進行能量轉移的嵌入劑組成。現在將對本發明中的術語進行描述。本文所用的術語"螢光共振能量轉移(FRET)"是指這樣的現象，即，當作為供體的螢光染料與作為受體的另一螢光染料之間的距離在大約lnm至10nm時，供體的激發使能量轉移至受體，並且然後受體被激發。根據本發明的方法，通過既不需要多種類型的核酸鏈的螢光標記或也不需要衝洗步驟的簡單過程，可以減少背景信號並以高檢測靈敏度獲得雙鏈核酸形成信息。此外，無需限制相互作用系統也可以獲得關於雙鏈核酸形成的信息。圖1是根據本發明的第一實施方式的用於獲得與雙鏈核酸形成有關的信息的方法的概念圖。圖2示出了在本發明的第一實施方式中螢光染料組的螢光光譜的示意圖。圖3是根據本發明的第二實施方式的用於獲得與雙鏈核酸形成有關的信息的方法的概念圖。圖4示出了在根據本發明的第二實施方式中螢光染料組的螢光光譜的示意圖。圖5是根據本發明的第三實施方式的用於獲得與雙鏈核酸形成有關的信息的方法的概念圖。圖6是關於本發明的實施例1和比較例1的螢光光譜。圖7是關於本發明的實施例2的螢光光譜。圖8是關於本發明的實施例3的螢光光譜。圖9是關於本發明的實施例4的螢光光譜。圖10是關於本發明的實施例5的螢光光譜。圖11是關於本發明的實施例的螢光光譜。具體實施例方式在下文中，將參照附圖對用於實施本發明的優選實施方式進行描述。然而，應當注意到，在下文中待描述的實施方式是以舉例方式的本發明的代表性實施方式，並且本發明的範圍不應解釋成限於這些實施方式。圖1是根據本發明的第一實施方式的概念圖，並且示出了本發明中的第一核酸鏈Nl、第二核酸鏈N2、標記螢光染料XI和嵌入劑X2。本發明中的"探針"在此實施方式中由標記螢光染料XI和嵌入劑X2構成。在下文中，將對根據本發明方法的第一實施方式進行描述。在根據本發明的方法中，使雜交在用標記螢光染料X1標記的第一核酸鏈N1與第二核酸鏈(其具有與第一核酸鏈N1互補的鹼基序列)之間進行(參見圖l(l))。接著，將嵌入劑X2加入到相互作用系統中(參見圖1(2))。嵌入劑X2結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間，並且通過螢光共振能量轉移ET將激發能提供給標記螢光染料X1。通常，當嵌入劑X2的發光波長和標記螢光染料X1的激發波長範圍重疊時，嵌入劑X2將激發能提供給標記螢光染料XI。將作為激發靶螢光染料的嵌入劑X2的激發波長AExx2的激發光Pl照射到相互作用系統上，並且針對作為檢測靶螢光染料的標記螢光染料X1檢測在螢光檢測波長AEmxl的螢光F1(參見圖1(3))。由於嵌入劑X2的發光波長範圍不同於標記螢光染料X1的螢光檢測波長AEmxl，5因此來自嵌入劑X2的AEn^螢光的強度此時足夠低。標記螢光染料X1的激發波長範圍也不同於嵌入劑X2的激發波長AEx^，使得即使在照射AEx。的激發光Pl時，標記螢光染料XI也基本上不被激發，並且由標記螢光染料X1的直接激發發射的螢光強度足夠低。因此，基本上沒有檢測到背景信號。當第二核酸鏈N2並不存在於相互系統中，並且沒有形成雙鏈核酸時，構成探針的標記螢光染料X1與嵌入劑X2之間的螢光共振能量轉移ET的發生概率足夠低，這是因為標記螢光染料XI和嵌入劑X2隨機地存在於相互作用系統中(參見圖1(3)(a))。因此，當第二核酸鏈N2並不存在於相互作用系統中並且沒有形成雙鏈核酸時，基本上沒有在AEmxl檢測到螢光。另一方面，當在第一核酸鏈N1與第二核酸鏈N2之間形成了雙鏈核酸時，嵌入劑X2結合或者插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間。結果，構成探針的嵌入劑X2和標記在第一核酸鏈N1上的標記螢光染料X1彼此接近至足以發生螢光共振能量轉移ET的距離(參見圖1(3)(b))。在這種狀態下將嵌入劑X2的激發波長AExx2的光Pl照射在相互作用系統上時，在標記螢光染料X1與嵌入劑X2之間發生螢光共振能量轉移ET，使得激發的嵌入劑X2的能量轉移至標記螢光染料X1。當發生螢光共振能量轉移ET時，激發的嵌入劑X2失活，並且使標記螢光染料XI發螢光。因此，來自標記螢光染料X1的AEmxl的螢光F1被檢測到。隨著彼此接近定位的標記螢光染料XI和嵌入劑X2的分子對的數量變得更大，換句話說，形成的雙鏈核酸分子的數量變得更大，則螢光共振能量轉移ET的發生概率增加，結果，螢光F1的強度增大。通過檢測螢光Fl的強度可以獲得與系統中的雙鏈核酸的形成有關的信息。如果螢光F1的強度與系統中雙鏈核酸的量之間的對應關係已經被預先確定，則在系統中形成的雙鏈核酸的量可以由螢光F1的強度來確定。使用第一核酸鏈N1作為探針，由此，通過本發明的方法可以獲得關於參與雙鏈核酸形成的第二核酸鏈的量的信息。在下文中將對此實施方式的細節進行描述。對第一核酸鏈N1的類型沒有特別限制，可以使用DNA、RNA、寡核苷酸等。第一核酸鏈N1可以位於任何相互作用區。當在實時PCR等中採用時，其可以允許存在於溶液中。當在DNA微陣列等中採用時，其末端可以被固定在相互作用區表面上。對適於標記第一核酸鏈N1的標記螢光染料X1的類型沒有特別限制，只要其通過螢光共振能量轉移ET從嵌入劑X2接收激發能並發射它即可。例如，可以使用"LightCyclerTMRed610"、"LightCyclerRed640"、"WellRedD2"、"Cy5"等。根據本發明，僅螢光標記第一核酸鏈N1就足夠了。因此，與需要標記多種核酸鏈的方法或需要對一個探針進行多種標記的方法相比，可以極其容易地獲得關於雙鏈核酸形成的信息。對第二核酸鏈N2的類型等沒有特別限制，只要其具有與第一核酸鏈N1互補的鹼基序列即可。類似於第一核酸鏈Nl，第二核酸鏈N2可以是DNA、RNA、寡核苷酸等。具體而言，第二核酸鏈N2可以是可與第一核酸鏈Nl在例如DAN微陣列等中雜交的靶核酸鏈，或者可以是可通過PCR，在例如實時PCR等中產生的擴增產物。對嵌入劑X2的類型沒有特別限制，只要嵌入劑X2的發光波長範圍與標記螢光染料X1的激發波長範圍重疊即可。嵌入劑X2的發光波長範圍與標記螢光染料X1的激發波長範圍之間的重疊越大，螢光共振能量轉移ET的發生概率越高。作為嵌入劑X2的具體實例，例如，嵌入劑可以根據標記螢光染料X1的類型適當地選自"SYmGreenl"、"YOYO-l"、"LCGreenlTM"等。在本發明中，對構成探針的螢光染料的數量沒有特別限制。儘管在此實施方式中使用了單一種類的螢光染料作為嵌入劑X2，但是僅要求嵌入劑X2至少具有將通過光的吸收而獲得的激發能提供給另一螢光染料的激發靶螢光染料，因此可以包含兩種以上的螢光染料。具體而言，可以包含例如從激發靶螢光染料(ET1)接收激發能，然後將由此接收的激發能提供給標記螢光染料X1(ET2)的螢光染料。與僅使用激發靶螢光染料和檢測靶螢光染料相比(參見圖2的上圖)，包括這樣的螢光染料可以加寬激發光的波長與螢光的檢測波長之間的波長差，因此可以減少背景信號(參見圖2中的下圖)。對螢光F1的檢測方式沒有特別限制。例如，可以使用螢光顯微鏡、螢光計、微陣列掃描儀、實時PCR系統等。圖3是根據本發明的第二實施方式的方法的概念圖。省略了關於與第一實施方式中類似要素的描述，並且將不同要素進行描述。應當注意到，圖中的符號X3在此實施方式中表示嵌入劑，並且本發明中的"探針"在此實施方式中由標記螢光染料X1和嵌入劑X3組成。在此實施方式中，待加入到相互作用系統中的嵌入劑X3結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間，並且通過螢光共振能量轉移ET從標記螢光染料XI接收激發能。通常，當嵌入劑X3的激發波長範圍和標記螢光染料X1的發光波長範圍重疊時，嵌入劑X3從標記螢光染料XI接收激發能。在此實施方式中，將作為激發靶螢光染料的標記螢光染料X1的激發波長AExxl的激發光P2照射在相互作用體統上，並且檢測到作為檢測靶螢光染料的嵌入劑X3的螢光檢測波長AEmx3的螢光F2(參見圖3)。由於標記螢光染料XI的發光波長範圍不同於嵌入劑X3的螢光檢測波長AEmx3，因此來自標記螢光染料X1的AEn^的螢光強度此時足夠低。嵌入劑X3的激發波長範圍也不同於標記螢光染料X1的激發波長入Ex^使得即使照射AExxl的激發光P2時，嵌入劑X3基本上也不被激發，並且通過嵌入劑X3的直接激發發出的螢光強度足夠低。因此，沒有檢測到顯著的背景信號。當第二核酸鏈N2並不存在於相互作用系統中，並且沒有形成雙鏈核酸時，在構成探針的標記螢光染料X1與嵌入劑X3之間的螢光共振能量轉移ET的發生概率足夠低，這是因為標記螢光染料X1與嵌入劑X3隨機地存在於相互作用系統中(參見圖3(a))。因此，當第二核酸鏈N2並不存在於相互作用系統中並且沒有形成雙鏈核酸時，在AEn^處基本上沒有檢測到螢光。另一方面，當在第一核酸鏈N1與第二核酸鏈N2之間形成了雙鏈核酸時，嵌入劑X3結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間。結果，構成探針的嵌入劑X3和標記在第一核酸鏈N1上的標記螢光染料X1彼此接7近到使得螢光共振能量轉移ET足以發生的距離(參見圖3(b))。在這種狀態下，將標記螢光染料XI的激發波長AExxl的光P2照射到相互作用系統上時，在標記螢光染料X1與嵌入劑X3之間發生螢光共振能量轉移ET，使得激發的標記螢光染料X1的能量轉移到嵌入劑X3。當發生螢光共振能量轉移ET時，激發的標記螢光染料XI失活，並且使嵌入劑X3發螢光。因此，檢測到來自嵌入劑X3的AEn^的螢光F2。隨著彼此接近定位的標記螢光染料XI和嵌入劑X3的分子對的數量變得更大，換句話說，形成的雙鏈核酸分子的數量變得更大，則螢光共振能量轉移ET的發生概率增加，結果，螢光F2的強度增加。因此，通過檢測螢光F2的強度可以檢測與系統中雙鏈核酸的形成有關的信息。通過檢測AEmx3的螢光F2的同時檢測標記螢光染料XI的螢光檢測波長AExxl的螢光F2'，可以同時獲得關於並不與嵌入劑X3發生螢光共振能量轉移ET的標記螢光染料X1的信息，也就是不與第二核酸鏈N2形成雙鏈核酸的第一核酸鏈N1的信息(參見圖3(c))。根據AE&螢光F2'與AEn^螢光F2的螢光強度的比率，可以確定在第一核酸鏈Nl與第二核酸鏈N2之間形成的雙鏈核酸的百分比。在下文中，將對關於此實施方式的細節進行描述。對適於標記第一核酸鏈Nl的標記螢光染料XI的類型沒有特別限制，只要其能通過螢光共振能量轉移ET將通過吸收激發光P2而獲得的激發能提供給嵌入劑X3即可。例如，可以使用FITC等。對嵌入劑X3的類型沒有特別限制，只要嵌入劑X3的激發波長範圍與標記螢光染料X1的發光波長範圍重疊即可。嵌入劑X3的激發波長範圍與標記螢光染料X1的發光波長範圍之間的重疊越大，則螢光共振能量轉移ET的發生概率越高。作為嵌入劑X3，嵌入劑可以根據標記螢光染料X1的種類適當地選自例如"T0T0-3"、"T0-PR0-3"、"Y0Y0-3"、"Y0-PR0-3"等。在本發明中，對構成探針的螢光染料的數量沒有特別限制。儘管在此實施方式使用了單一種類的螢光染料作為嵌入劑X3，但是僅要求嵌入劑X3至少具有從另一螢光染料接收激發能並發螢光的檢測靶螢光染料，因此可以包含兩種以上螢光染料。具體而言，可以包含例如這樣的螢光染料，其通過螢光共振能量轉移ET(ET1)從作為激發靶螢光染料的標記螢光染料XI接收激發能，然後將該能量提供給檢測靶螢光染料(ET2)。與僅使用激發靶螢光染料和檢測靶螢光染料相比(參見圖4中的上圖)，包括這樣的螢光染料可以加寬激發光的波長與螢光的檢測波長之間的波長差，因此可以減少背景信號(參見圖4中的下圖)。圖5圖解示出了根據本發明的方法的第三實施方式。省略了關於與第一實施方式中類似要素的描述，並且將對不同要素的細節進行描述。應當注意到，圖中的符號X4在此實施方式中表示嵌入劑，並且本發明中的"探針"在此實施方式中由標記螢光染料XI和嵌入劑X4組成。在此實施方式中，待加入到相互作用系統中的嵌入劑X4結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間，並且通過螢光共振能量轉移ET從標記螢光染料XI接收激發能以猝滅標記螢光染料X1。應當注意到，對適於標記第一核酸鏈N1的標記螢光染料X1的種類沒有特別限制，只要其能通過螢光共振能量轉移ET將通過吸收激發光P3而獲得的激發能提供給嵌入劑X4並且被猝滅即可，並且對嵌入劑X4的種類沒有特別限制，只要其通過螢光共振能量轉移ET接收標記螢光染料X1的激發能以猝滅標記螢光染料X1即可。在此實施方式中，將作為激發靶螢光染料的標記螢光染料X1的激發波長AExxl的激發光P3照射在相互作用系統上，並且檢測到標記螢光染料X1的檢測波長AExxl的螢光F3(參見圖5)。當第二核酸鏈N2並不存在於相互作用系統中並且沒有形成雙鏈核酸時，在標記螢光染料X1與嵌入劑X4之間螢光共振能量轉移ET的發生概率足夠低，這是因為標記螢光染料X1與嵌入劑X4隨機地存在於相互作用系統中(參見圖5(a))。因此，當第二核酸鏈N2並不存在於相互作用系統中並且沒有形成雙鏈核酸時，標記螢光染料X1沒有被猝滅並且檢測到AEmxl的螢光F3。另一方面，當在第一核酸鏈N1與第二核酸鏈N2之間已經形成雙鏈核酸時，嵌入劑X4結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間。結果，結合或插入在雙鏈核酸中的鹼基對之間的嵌入劑X4與標記在第一核酸鏈Nl上的標記螢光染料X1彼此接近到使得螢光共振能量轉移ET足以發生的距離(參見圖5(b))。在這種狀態下將標記螢光染料XI的激發波長AExxl的光P3照射到相互作用系統上時，在標記螢光染料X1與嵌入劑X4之間發生螢光共振能量轉移ET，使得激發的標記螢光染料X1的能量轉移到嵌入劑X4。當發生螢光共振能量轉移ET時，激發的標記螢光染料X1失活並被猝滅。因此，沒有檢測到AEmxl的螢光F3。隨著彼此接近定位的標記螢光染料XI和嵌入劑X4的分子對的數量變得更大，換句話說，形成的雙鏈核酸分子的數量變得更大，螢光共振能量轉移ET的發生概率增加，因此，螢光F3的強度降低。因此，通過檢測螢光F3的強度可以獲得與系統中雙鏈核酸的形成有關的信息。如果螢光F3的強度與並不形成雙鏈核酸的第一核酸鏈N1的量之間的關係被預先確定，則在系統中不形成雙鏈核酸的第一核酸鏈N1的量可以由螢光F3的強度確定。實施例在下文中，將基於實施例來詳細地描述本發明，然而本發明將並不限於以下實施例。首先證實可以通過根據本發明的方法來獲得雙鏈核酸的形成信息。〈實施例1〉向包含用螢光染料"LightCyclerRed640"(RocheDiagnosticsK.K.的產品)螢光標記的18mer鹼基序列的核酸鏈N1的溶液中加入包含具有與核酸鏈Nl互補的鹼基序列的核酸鏈N2的溶液和"SYBRTmGreenI"，接著混合。在95。C下將所得的混合物加熱1分鐘，然後在2(TC下培養5分鐘之後，通過將激發波長設置在作為"SYBRTMGreenI"的激發波長的498nm處，利用螢光光譜計來測量螢光光譜。在測量期間，控制相互作用溶液(反應液，interactionsolution)以保持在20。C。實驗條件示於表l中。表1溶液組成lOOmMNaCl10mMNa3P040.ImMEDTADNA濃度Nl:lilMN2:1ilMDNA序列Nl:CGAAGTGCAGGGCAGATCN2:GATCTGCCCTGCACTTCG嵌入劑"SY服GreenI"(CAMBREXBioScienceRocklandlnc.，Cat.#50513)10，000-倍稀釋螢光計"HITACHIF-4500M0DEL"螢光分光光度計測量模式波長掃描掃描模式螢光光譜激發波長498.Onm螢光發射開始波長450.Onm螢光發射終止波長800.Onm掃描速度240nm/min激發狹縫(slit):2.5nm螢光狹縫2.5nm光電倍增管電壓700V響應0.5s〈比較例1>使用未螢光標記的核酸鏈N1，進行與實施例1中類似的實驗。實施例1和比較例1的螢光光譜示於圖6中。在比較例1的螢光光譜中證實的來自"SYBRTMGreenI"的螢光(520nm)在實施例1的螢光光譜中幾乎沒有檢測到。而是出現標記在核酸鏈N1上的"LightCyclerRed640"的螢光(640nm)。在實施例1中，"SYBirGreenI"作為嵌入劑結合或插入在形成在核酸鏈Nl與N2之間的雙鏈核酸中的鹼基對之間，因此，足以接近標記在核酸鏈N1上的"LightCyclerRed640"。推測由於在該狀態下作為嵌入劑的"SYBRTMGreenI"的激發，在嵌入劑與標記在核酸鏈N1上的"LightCyclerRed640"之間發生FRET，並且檢測到"LightCyclerRed640"的螢光。根據上述結果，證實了，通過根據本發明的方法可以獲得關於雙鏈核酸的信息。接著，證實了通過根據本發明的方法背景信號的減少是可行的。〈實施例2〉向包含未螢光標記的核酸鏈N1的溶液中加入包含不與核酸鏈N1形成雙鏈核酸的核酸鏈N3(鹼基序列TGCCCACTATTAAGGAAGG)的溶液和"SYBRTmGreenI"，並且測量螢光光譜。諸如溶液組成的實驗條件與實施例1中類似地設定。實施例2的螢光光譜示於圖7中。可以理解，儘管沒有形成雙鏈核酸，但是識別到"SYBRTMGreenl"的發光波長(520nm)的螢光，並且觀察到背景信號。由於背景信號在520nm處達到最大，然後逐漸隨著波長偏移而減少，因此認為在根據本發明的方法中檢測靶螢光染料的選擇使背景信號減少。然後通過改變適於標記核酸鏈N1的螢光染料的種類進行螢光強度的比較。與實施例1中類似地進行雜交和螢光光譜的測量。用於各個實施例的條件示於表2中。tableseeoriginaldocumentpage11實施例3至6的螢光光譜分別示於圖8至11中。比較圖8圖11的螢光光譜，檢測靶螢光染料的發光強度以實施例3、實施例4、實施例5和實施例6的次序降低，其中實施例3最高。比較在各個實施例中採用的檢測靶螢光染料，可以了解，隨著採用的檢測靶螢光染料的激發波長越接近於"SYBRTMGreenI"的發光波長，螢光強度越強。根據上述結果，可以推測，隨著激發靶螢光染料的發光波長與檢測靶螢光染料的激發波長之間的重疊變大，FRET的發生概率增加，結果，檢測靶螢光染料的螢光強度增加。工業實用性利用根據本發明的方法，使得可以獲得關於雙鏈核酸的形成信息以及關於在諸如DNA印跡、RNA印跡、DNA微陣列、實時PCR、ICAN、LAMP、TRC等的各種系統中核酸的量的信息。尤其是，根據本發明的方法是一種很簡單的方法，既不需要螢光標記多種核酸鏈也不需要洗滌步驟，減少了背景信號，並且能夠以高檢測靈敏度獲得雙鏈核酸形成的信息，因此工業上是很有用的。權利要求一種用於獲得與第一核酸鏈和具有與所述第一核酸鏈互補的鹼基序列的第二核酸鏈之間的雙鏈核酸的形成有關的信息的方法，所述方法包括檢測與探針的螢光有關的信息，所述探針由標記在所述第一核酸鏈上的標記螢光染料以及結合或插入在所述雙鏈核酸的鹼基對之間以允許與所述螢光染料之間的能量轉移的嵌入劑組成。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述探針由多個螢光染料的組構成，所述多個螢光染料的組至少包括能夠將已經通過吸收光獲得的激發能提供給另一螢光染料的激發靶螢光染料以及能夠通過從所述另一螢光染料接收所述激發能而發螢光的檢測靶螢光染料。3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述嵌入劑是猝滅所述標記螢光染料的猝滅劑。4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一核酸鏈的末端固定在相互作用區的表面。5.—種用於獲得關於雜交的信息的方法，所述方法包括至少進行以下步驟使所述雜交在標記有螢光染料的第一核酸鏈和具有與所述第一核酸鏈互補的鹼基序列的第二核酸鏈之間進行，加入嵌入劑，所述嵌入劑能夠結合或插入在所述雙鏈核酸的鹼基對之間以允許與所述螢光染料之間的能量轉移，以及檢測與所述螢光染料和所述嵌入劑的螢光有關的信息。6.—種用於獲得關於具有與探針核酸鏈互補的鹼基序列的核酸鏈的量的信息的方法，所述方法包括檢測與探針的螢光有關的信息，所述探針由標記在所述探針核酸鏈上的標記螢光染料以及結合或插入在所述雙鏈核酸的鹼基對之間以允許與所述螢光染料之間的能量轉移的嵌入劑組成。全文摘要本發明提供了一種通過檢測螢光來獲得與雙鏈核酸形成有關的信息的方法，該方法簡單，可適用於各種相互作用系統，並且特徵在於高檢測靈敏度和減少的背景信號。本發明具體提供了一種用於獲得與雙鏈核酸形成有關的信息的方法，該方法包括檢測與探針的螢光有關的信息，該探針由標記在核酸鏈上的標記螢光染料以及結合或插入在所述雙鏈核酸中的鹼基對之間以允許利用螢光染料進行能量轉移的嵌入劑組成。文檔編號G01N33/53GK101772573SQ20088010214公開日2010年7月7日申請日期2008年7月14日優先權日2007年8月14日發明者阿部友照申請人:索尼公司