細胞內傳遞的製作方法

2023-05-30 16:41:46 2

細胞內傳遞的製作方法
【專利摘要】能夠在細胞膜中造成擾動的微流體系統，該系統包括定義腔室的微流體通道，該通道被設置使得懸浮在緩衝液中的細胞可從其中穿過，其中，所述微流體通道包括一種使細胞變形的收縮部分，其中，該收縮部分的直徑為細胞直徑的函數。
【專利說明】細胞內傳遞
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2011年10月17日遞交的美國臨時申請第61/548，013號的優先權和2012年8月17日遞交的美國臨時申請第61/684，301號的優先權，其每一篇的內容通過引證在此併入本文。
[0003]聯邦贊助研究聲明
[0004]根據美國國立衛生研究院授權的Grant5RCl EB011187-02，本發明至少部分的被政府支持。政府享有本發明的特定權利。
【背景技術】
[0005]許多製藥公司主要致力於研發小分子藥物。
[0006]之所以被稱為小分子藥物是由於這些藥物相對小的分子尺寸，這使其能夠在體內自由擴散達到其靶點。這些分子還可以滑過其他作為極大阻礙的不可滲透的細胞膜。然而新一代的基於蛋白、DNA或者RNA的治療劑不能容易的穿過細胞膜，因此需要進行細胞修飾來加速傳遞。
[0007]已經建立起來的方法使用化學或者電脈衝破壞細胞膜並將材料傳遞進入細胞質。合適的細胞內是研 、發開和實施下一代治療劑中至關重要的步驟。
[0008]現有的方法常常難以開發並很難對其特定的應用產生高度專一性。因此，現有技術無法合適的解決許多臨床上重要的細胞型(例如幹細胞和免疫細胞)所具有的問題。因此，對更穩定並更精確地技術存在需要，以期解決現代生物/醫學研究的需要。

【發明內容】

[0009]本發明基於一種出乎意料的發現，即，受控制的損傷，例如，使細胞經歷收縮、快速拉伸、快速壓縮、或者高剪切速率的脈衝，會導致細胞將分子從周圍的培養基中吸收入細胞質。因此，本發明的特徵在於一種含載體的微流體平臺，用於直接將材料傳遞到真核細胞細胞質，所述材料例如化合物或者組合物。該裝置可有效作為一種靈活的並且廣泛應用的實驗室工具，用於將理想的分子傳遞靶細胞。使用這裡所描述的方法將分子傳遞入細胞是成比例的，例如，與細胞通過收縮和/或壓力的速度呈線性比例的或者單調比例的。例如，在幾秒內將50微升的細胞懸浮液通過該裝置。通量範圍在I個細胞/每秒每通道(或更少)至超過1000個細胞/每秒每通道之間。儘管細胞速度可以高達lOm/s (或更高)，但一般通過收縮的細胞速度包括IOmm/秒到500mm/秒。其他的通道可以平行放置從而增加系統的總通量。
[0010]分子的吸收是基於擴散的，而不是基於胞吞作用，即，通過本裝置的途徑之後，有效載荷(被傳遞到細胞中的化合物)存在於細胞質中而不在於核內質中。在細胞被處理之後，只有很少的或者沒有所述有效載荷存在於核內質中。例如，大分子比小分子吸收的慢。受控制的細胞拉伸和細胞在收縮過程中的運動速度導致靶分子優先傳遞，同時保持細胞的存活能力和完整性。在處理之後，細胞存活率在70-100%，例如，通常在處理之後存活率為90%。與此相比，之前的只使用高剪切速率傳遞幾秒鐘或者幾毫秒的方法會使細胞在處理之後具有很差的存活能力。與之前的技術相比，本發明的方法當細胞經歷收縮時，使細胞在非常短的時間內(大約100微秒)經受範圍在100-1000帕的剪切脈衝。但是本發明的技術與之前的技術是完全不同的。在本發明的技術中，優選細胞在經歷收縮時發生完整的機械變形，與現有技術相比，這可以強化不同的剪切力。在優選的實施方案中，細胞不經歷電流。在另一個實施方案中，使用結合的方式處理，例如，使用這裡描述的裝置實現機械變形，並在之後或者之前進行電穿孔(一種滲透轉染，其中使用電流在細胞膜上產生臨時的孔，從而允許核酸或者大分子進入)。
[0011]有效載荷是需要傳遞入細胞中的化合物或者組合物。例如，有效載荷可以包括蛋白質、螢光染料、量子點、碳納米管、RNA分子、DNA分子、抗原或者其他大分子，納米顆粒和物質的組合物。
[0012]分子向細胞的傳遞受到裝置收縮幅度、收縮部分長度、進入區域的地理結構和裝置通道寬度的影響。優選的，導管收縮部分的寬度是直徑不超過4微米，導管收縮部分的長度優選在40-50微米。收縮部分的長度通常不會超過90微米。收縮部分的直徑與被處理的細胞類型有關。如下所述，該直徑小於細胞直徑(例如，是細胞直徑的20-99%)。許多細胞直徑在5-15微米之間，例如，樹突細胞直徑是7-8微米。例如，當處理單個細胞時，收縮部分的直徑是4.5、5、5.5、6或者6.5微米。在其他實施例中，處理人類卵子的收縮部分尺寸/直徑在6.2微米和8.4微米範圍內，雖然也可以使用更大或者更小的收縮部分(人類卵細胞的直徑大約是12微米)。在另一個實施例中，使用直徑在12微米到17微米之間的收縮部分處理胚胎(例如，2-3個細胞的簇)。
[0013]所述裝置和方法能夠有效的用於疫苗研發和使用專門的抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)生產。例如，通過以下來進行刺激抗原呈遞的方法:將樹突狀細胞經歷受控制的損傷，例如短時間 的收縮或者高剪切力的脈衝，並且將樹突狀細胞與包括靶向抗原的溶液相接觸。這種方法與之前的刺激方法相比能夠產生高度活化的抗原呈遞細胞。將樹突狀細胞或者其他抗原呈遞細胞驅動穿過包含收縮部分的裝置(因此細胞經受快速拉伸)，然後在含有有效載荷(例如，抗原)的溶液中培養細胞進行疫苗生產。在細胞快速變形之後，將細胞浸入含有一種或者更多種抗原的細胞培養基中，但是細胞在快速變形事件/過程之前、之中，和/或之後也可以與抗原相接觸。
[0014]選擇性的，可在流動的緩衝液中使用表面活性劑(例如，0.1-10%重量/重量，例如，泊洛沙姆、來自動物的血清、白蛋白)。分子向細胞中的傳遞不受表面活性劑是否存在的影響，然而，選擇性的，表面活性劑選擇性的減少裝置在操作期間的堵塞。
[0015]所述裝置由矽、金屬(例如，不鏽鋼)、塑料(例如，聚苯乙烯)、陶瓷或者任何其他適合蝕刻微米級結構特徵的材料組成，並且包括一個或者更多個供細胞流通的通道或者導管。矽尤其合適，這是由於使用這種材料很好的建立了微光柵方法，因此，它比較容易製備新的裝置、改變的設計等等。另外，與其他柔軟的底物(比如，聚二甲基矽氧烷(PDMS))相t匕，矽的硬度更具有優勢，例如，更高的傳遞速率。例如，所述裝置包括2個、10個、20個、25個、45個、50個、75個、100個或者更多的通道。通過蝕刻矽微製備該裝置。使用壓力移動，例如，推動細胞穿過通到或者導管。細胞驅動器可以提供這種壓力。細胞驅動器包括，例如，壓力泵、氣瓶、壓縮機、真空泵、注射器、注射泵、蠕動泵、手動注射器、移液管、活塞、毛細管驅動和重力。作為通道的替代，細胞可以以網或者緊密放置的盤子的方式穿過收縮部分。在任意情況下，細胞穿過的收縮部分的寬度是被處理細胞在其自然無壓力狀態下寬度或者直徑的20-99%。溫度會影響組合物的吸收並影響生存能力。所述方法在室溫下(例如，20°C )、生理溫度(例如，39°C )下，比生理溫度更高的溫度或者更低的溫度(例如，4°C )下，或者在這些示例性的溫度之間的範圍內進行。
[0016]通過收縮、拉伸、和/或高剪切率脈衝對細胞進行受控制的傷害，隨後在傳遞溶液中培養細胞，所述傳遞溶液包括希望引入細胞中的化合物或者分子。受控制的傷害特點是在細胞膜上的小損傷，例如，直徑為200納米。在通過收縮部分造成的損傷結束後幾分鐘是細胞的恢復時間。傳遞時間是1-10分鐘或者更久，例如，15分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘或更久，在室溫下操作時，2-5分鐘是最佳時間。在傳遞溶液中培養的時間越長不一定會增加吸收。例如，數據顯示，五分鐘後，幾乎沒有材料被細胞吸收。
[0017]因此，本發明為向細胞傳遞藥物領域長時間存在的問題提供了一種解決辦法，並且為之前的方法中存在的缺陷提供了解決方法。 [0018]關於向真核細胞傳遞的材料，細胞可以被分為兩種主要類型:
[0019]I)易於傳遞(ETD)的細胞:絕大多數的化學品和病毒方法屬於此類。易於傳遞的細胞通常沒有直接的臨床關聯性。
[0020]2)難於傳遞(DTD)的細胞:聞度臨床相關性。傳遞技術的進步能夠極大的促進新型治療劑的發展。這類細胞包括幹細胞、初級細胞和免疫細胞。由於在未來幾年新型的RNA、幹細胞和蛋白基治療劑得到了極大的動力，可以預計DTD傳遞市場會快速發展。
[0021]雖然也可以對易於傳遞的細胞使用相同的技術，但這裡描述的技術被證實對DTD研究領域尤其有效。此外，此方法還促進了不能用其他方法傳遞入易於傳遞的細胞或者難於傳遞的細胞中的材料(例如，量子點、碳納米管和抗體)的傳遞。
[0022]總之，在一個方面，本發明的實施方式能夠提供一種可以造成細胞膜擾動的微流體系統，該系統包括定義腔室的微流體通道，該通道被設置使得懸浮在緩衝液中的細胞可從其中穿過，其中，所述微流體通道包括一種收縮部分，其中，該收縮部分的直徑是細胞直徑的函數
[0023]本發明的實施方式還可以提供一種或者一種以上的如下特徵。所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99%。所述通道的橫切面選自如下所組成的組中:圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。所述收縮部分包括入口部分、中心點和出口部分。所述入口部分定義了收縮角度，其中所述收縮角度最好能減少通道堵塞。所述微流體系統進一步包括一系列平行安置的微流體通道，例如，2個、5個、10個、20個、40個、45個、50個、75個、100個、500個、1000個或者更多的通道
[0024]總之，在另一個方面，本發明的實施方式還可以提供一種將化合物傳遞入細胞的方法，該方法包括，提供處於懸浮液中的細胞或者將細胞或者有效載荷懸浮在溶液中，將溶液穿過包括收縮部分的微流體通道，所述收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數，將細胞通過所述收縮部分從而對細胞實施壓力，造成細胞足夠的擾動，從而使有效載荷通過，並且在通過收縮部分後，在溶液中培養細胞一段被預設的時間。
[0025]本發明的實施方式還可以提供一種或者一種以上如下特徵。所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99%。所述通道的橫切面選自如下所組成的組中:圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。通過溶液包括從收縮部分的入口部分、中心點和出口部分通過所述溶液。該方法進一步包括通過調整入口部分的收縮角度減少微流體通道的堵塞。該方法包括從平行安置微流體通道中通過所述溶液。
[0026]總之，在依舊另一個方面，本發明的實施方式還可以提供一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括，提供處於溶液中的細胞或者將細胞懸浮在溶液中，將溶液穿過包括收縮部分的微流體通道，所述收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數，將細胞通過所述收縮部分從而對細胞實施壓力，造成細胞擾動，並且在通過收縮部分後，在含有有效載荷的溶液中培養細胞一段被預設的時間，其中，所述擾動應足夠大從而使有效載荷穿過。
[0027]本發明的實施方式還可以提供一種或者一種以上如下特徵。所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99%。所述通道的橫切面選自如下所組成的組中:圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。「通過溶液」包括從收縮部分的入口部分、中心點和出口部分通過所述溶液。該方法進一步包括通過調整入口部分的收縮角度減少微流體通道的堵塞。「通過溶液」包括從一系列串聯或並聯排列的微流體通道中通過溶液。「培養」包括培養細胞0.0001秒到20分鐘(或者更長時間)。壓力是剪切力和壓縮力中的一種。
[0028]總之，在依舊另一個方面，本發明的實施方式還可以提供一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括，提供處於溶液中的細胞或者將細胞懸浮在溶液中，使細胞變性從而在細胞膜上造成擾動，並在細胞變形後在含有有效載荷的溶液中培養所述細胞。
[0029]本發明的實施方式還可以提供一種或者一種以上如下特徵。「使細胞變形」包括使細胞變形 I μ s 到 10ms，例如，10 μ s、50y S、100 μ s、500y s 和 750 μ S。培養 0.0001 秒到20分鐘，例如，培養I秒、30秒、90秒、270秒和900秒。
[0030]本發明不同的實施方式可以提供一種或者一種以上的如下性能。與現有技術相t匕，能夠實現更準確和成規模化的傳遞。材料可以自動被傳遞入細胞中。可以將材料(例如蛋白質、RNA、siRNA、肽、DNA和滲透性染料)植入細胞(例如胚胎幹細胞)或者誘導多能幹細胞(iPSCs)、初級細胞或者永生細胞系。可以根據不同的細胞類型修改這裡所述的裝置和方法，還可以根據被處理的細胞制定收縮部分的尺寸。這裡的方法和裝置可以提供明顯的優勢。例如，與現有技術相比，本發明技術可以降低現有系統中的實驗噪音。材料通過一種細胞群落的傳遞量是持續的。細胞可以被單獨處理而不必成批處理。本發明還介紹了一種相當獨特的機會來將各種各樣的納米顆粒和蛋白質傳遞進入細胞質。而現有的方法在進行此功能時是非常不可靠或者是無效的。
[0031]關於傳遞敏感型有效載荷，例如，蛋白質(尤其是大蛋白質，例如，大於30kDa、50kDa、100kDa、150kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa 或更大)、量子點、或其他對電敏感或者容易被電破壞的有效載荷可以被可靠地傳遞如細胞並且保持所述敏感型有效載荷的完整性和活性。因此，本發明的裝置和方法與現存技術(例如電穿孔)相比具有明顯的優勢，電穿孔使有效載荷組合物受電擊(因此破壞有效載荷)並導致降低的細胞存活率(例如，在電穿孔後通常有505或者更多的細胞死亡)。快速拉伸/變形方法的另一個優勢在於幹細胞或者前體細胞被隨機選擇吸收有效載荷，並不改變被處理細胞的分化狀態或者活性。除了向細胞的細胞質中傳遞組合物用於治療(例如，疫苗生產)之外，該方法還可以用於引入分子，例如，向被標記的胞內結構(例如細胞器)中引入包括可檢測標記物的大分子，或者向被標記的胞內成分中引入包括可檢測標記物的大分子用於診斷或者成像。[0032] 本發明不同的實施方式可以提供一種或者一種以上的如下性能。可以將DNA遞送至用於遞送劑量的細胞中，例如，幹細胞，初級細胞、免疫細胞等等。也可以實現非常大的質粒(甚至整個染色體)的傳遞。本發明還可以很容易的實現向細胞定量傳遞已知量的基因構建物，從而研究所關心基因的表達水平及其對濃度的敏感性。已知量的DNA序列與已知量的能提高DNA重組的酶一起傳遞，從而實現更簡單/更有效的穩定傳遞，實現同源重組、點特異性突變。這裡所描述的方法和裝置還可以有效用於定量傳遞RNA進行更有效的/結論性研究。將小幹擾性RNA傳遞進入細胞的細胞質中也可以很容易的實現。
[0033]本發明不同的實施方式可以提供一種或者一種以上的如下性能。可以將RNA傳遞入細胞中，從而使RNA在不需要脂質體的情況下靜止。已知量的RNA分子和已知量的Dicer分子一起傳遞，從而使RNA能夠標準地、有效地在不同的情況下通過多重細胞系。可以將mRNA弓丨入細胞來研究轉錄後水平上的基因表達規則。已知量的RNA標記物可用於研究RNA和細胞的半衰期。還可以實現通用的蛋白傳遞。已知量的標記蛋白質可以被傳遞從而研究其在細胞中的半裳期。還可以完成標記蛋白質向研究的蛋白位點的傳遞。已知量的標記蛋白可以被傳遞從而研究胞內環境下蛋白質-蛋白質之間的相互作用。還可以實現標記的抗體向活細胞中的傳遞進行免疫染色和螢光基的蛋白質印跡。
[0034]本發明不同的實施方式還可以提供一種或者一種以上的如下臨床和研究性能。可以實現將藥物定量傳遞入細胞模型中進行改善的篩選的劑量研究。本發明還可以發展成一種高通量篩選細胞質中蛋白活性從而幫助識別蛋白治療劑或者了解疾病發病機理的方法。由於現有的蛋白傳遞方法沒有效果，已經嚴重限制了這些應用。本發明的裝置和技術可以有效將藥物在細胞內傳遞到特定的循環血液細胞(例如，淋巴細胞)亞組，糖向細胞中的高通量傳遞可以改善細胞的低溫儲藏，尤其是卵母細胞的低溫儲藏，可以通過引入蛋白質、mRNA、DNA和/或生長因子來改善靶細胞分化作用，基因或者蛋白材料的傳遞可以引起細胞的再進化，從而產生iPS細胞，將DNA和/或重組酶傳遞到胚胎幹細胞中可以改善轉基因幹細胞系，將DNA和/或重組酶傳遞到受精卵中可以發展成轉基因器官、DC細胞活化、誘導的多能幹細胞產生和幹細胞分化，還可以實現納米顆粒傳遞以進行診斷和/或機理研究，以及還可以實現引入量子點。還可以使用這裡介紹的裝置和方法修飾在整形手術中使用的皮膚細胞。
[0035]使用傳遞抗原和/或免疫刺激分子的方法刺激抗原呈遞作用會產生抗原呈遞細胞，例如，樹突狀細胞，同時與常用的刺激方法相比，上述方法能夠改善活性水平，因此導致增加的T細胞和B細胞介導的針對靶抗原的免疫作用水平。因此，這種方法可以被用作活化免疫系統響應癌症或者感染的方法。
[0036]為了實現篩選、成像和診斷目的，在標記細胞的方法中使用本發明的裝置。通過使細胞經歷受控制的損傷或者將細胞與包括可檢測的標記物的溶液相接觸來進行標記細胞的方法，其中，所述損傷包括短時間收縮或者高剪切率的脈衝。所述可檢測的標記物包括螢光分子、放射性核素、量子點、金納米顆粒或者磁珠。
[0037]在本發明之前，對幹細胞進行處理以引入外源組合物是非常困難的。這裡描述的裝置和方法，例如，使幹細胞或者前體細胞(例如，誘導的多能幹細胞(iPSCs))通過收縮的通道，不會誘導分化，但是會可靠地誘導組合物被吸收到細胞中。例如，分化因子被誘導進入這些細胞中。在引入的因子被吸收之後，所述細胞按照引入的因子控制的分化途徑進行分化，將所述因子引入所述細胞時所使用的方法不會造成任何困難。
[0038]除了單個細胞之外，非常大的細胞，例如卵細胞(直徑大約為200微米)、細胞簇，例如包括2-3個細胞的胚胎也可以被處理來吸收目標組合物。調整孔徑尺寸從而使收縮部分寬度正好小於簇的尺寸。例如，通道的寬度是細胞簇寬度的20-99%。
[0039]分離/純化細胞或者細胞簇，或者富集需要的細胞類型。在本發明方法中使用的樹突狀細胞或者其他細胞(例如免疫細胞，比方說巨噬細胞、B細胞、T細胞或者幹細胞，比如胚胎幹細胞或者iPS)被純化或者富集。例如,通過再起細胞表面標記物上表達或者其他可識別的特徵分離或者富集細胞。通過其表達整合素、CDllc或其他可識別的細胞表面標記物的方法來識別並分離樹突狀細胞。關於這些細胞，術語「分離的」是指細胞基本上不含有其他細胞類型或者其天然存在的細胞材料。
[0040]例如，當某一特定組織或者表型的細胞樣品佔整個細胞群落的60%時，該細胞樣品室「基本上純」的。優選的，所述比例是細胞群落的至少75%、更優選是至少90%，最優選是至少99%或者100%。通過合適的標準方法測定細胞純度，例如，通過螢光激活的細胞分類法(FACS)。
[0041]有效載荷組合物，例如多核苷酸、多肽或者其他試劑是純化的和/或分離的。具體的，如這裡所使用的，當使用重組技術生產、使用化學前體或其他化學品化學合成時，「分離的」或者「純化的」核酸分子、多核苷酸、或者蛋白質是基本上不含有其他細胞材料或者培養基的。純化的化合物的重量佔所關心的化合物總重量的至少60% (乾重)，優選的，所述比例是佔所關心的化合物重量的至少75%、更優選的是至少90%，並且最優選的是至少99%。例如，純化的化合物佔所關心化合物總重量的至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、98%、99%或者1 00% (重量/重量)。通過合適的標準方法測量純度,例如,通過柱狀色譜法、薄層色譜法、或者高效液相色譜法(HPLC)分析。純化的或者分離的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA))不含有其天然存在狀態側鏈上的基因或者序列。分離的或者純化的核酸分子的實施例包括:(a) 一種DNA，這種DNA的一部分是天然存在的基因DNA分子，但是在其側鏈上不含有天然存在的器官基因組分子兩端的側鏈核酸序列；(b)整合入質粒的核酸或者整合入原核或者真核細胞基因組DNA的核酸，所得的分子與所有天然存在的載體或者基因組DNA完全不同；(c)單獨的分子，例如cDNA，基因組片段、聚合酶鏈式反應(PCR)所得的片段、或者限制性片段；和(d)重組核苷序列，作為雜合基因(即，編碼融合蛋白的基因)的一部分。本發明分離的核酸分子進一步包括合成的分子以及任何具有改變的化學結構和/或具有修飾的骨架結構的核酸。
[0042]懸浮溶液是任意生理緩衝液或者溶液,或者細胞-相容性緩衝液或者溶液。例如，懸浮溶液是細胞培養基或者磷酸鹽緩衝鹽水。有效載荷是相同的或者不同的懸浮溶液，可以包括需要傳遞到細胞內部的組合物。
[0043]該裝置的優點包括不需要對理想的有效載荷進行修飾並且不需要將有效載荷暴露於電磁場或者其他形式的外力中。關於電穿孔，這種方法會損傷蛋白質並不能有效傳遞。這裡描述的方法不存在這個重要問題；本發明的方法尤其適合於傳遞敏感的有效載荷，例如，蛋白質，尤其是大蛋白質(例如，40kDa-70kDa，或者分子量達到120、130、150、200KDa以上)，大的核酸構建物(例如質粒及其他構建物，包括lkb、2kb、5kb或更多的核酸聚合物，甚至整個染色體)6、大化合物，以及量子點(例如，直徑在12納米)或其他已知對電敏感並在與電接觸時容易受到損傷的材料。例如，當與電場接觸時，納米顆粒上的表面配體或者量子點會被損傷或者被充電，從而導致顆粒聚集，限制/消除其功能。受控制的損傷方法的另一個優點在於將細胞與傳遞組合物接觸一定的時間。尤其對於蛋白質來講，由於蛋白質對蛋白酶、溫度和電敏感，與之前的方法相比，本方法在處理後將細胞與有效載荷溶液相接觸相對短的時間。所述裝置的微流體性能還需要更小的工作體積從而保存寶貴的原材料和/或細胞。該裝置還可以與現有的傳遞方法，例如電穿孔結合使用，或者與脂質體結合使用，與各個方法單獨使用相比，這種結合會產生顯著提高的傳遞效果。
[0044]被傳遞的有效載荷的功能活性與流體剪切力成反比，也就是說，對細胞膜實施的物理壓力(例如拉伸細胞膜)能夠比剪切更好的調節有效載荷的吸收。傳統的納米顆粒傳遞方法會使更多的材料進入細胞的胞內環境；然而與這裡所描述的方法相比，傳統方法會降低被傳遞的材料的活性，這是由於傳統方法會使被傳遞的材料在核內體中產生多價螯合作用。這裡描述的方法產生直接向細胞質傳遞的化合物/組合物，從而較少量的有效載荷被傳遞入細胞，但由於他們容易接近其他細胞質組分，被傳遞的分子保持了更大量的功能活性。例如，之前用於傳遞納米顆粒的方法會傳遞2-10被的材料進入細胞，但是，由於被傳遞的材料在核內體中發生多價螯合作用，被傳遞的細胞只有很少的功能活性或者沒有功能活性。通過避免內涵體，本發明的裝置和方法能夠克服現有細胞內傳遞方法所存在的問題。
[0045]其他優勢和特徵包括處理的時間規格和細胞速度比之前的方法要快很多。此外，其他方法不象這裡所述的方法一樣擠壓細胞，例如，收縮部分的尺寸(直徑)由細胞的尺寸(直徑)決定(是細胞直徑的％)。這種快速、有力但是半抽打式、擠壓或者形變會導致細胞更好的吸收「直接至細胞液」的有效載荷。細胞突然發生形變，也就是說，形變基本上在I微秒到I毫秒之間發生。通常，細胞過度形變產生的外力會致死細胞，而同時，如果外力不足，不會產生細胞擾動。因此，本發明的主題內容提供了一種方法和系統，所述方法和系統能夠產生足夠的外力誘導短時間擾動，但不會產生造成永久擾動的外力也不會致死細胞。 [0046]上面所述的任意方法都可以在試管中、體外或者或體內進行。對於體內應用，所述裝置可以被植入血管腔，例如，在內嵌的血管支架中。在閱讀了隨後的附圖、詳細說明和權利要求之後，會更容易理解本發明的這些性能以及其他性能，以及本發明本身。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1a是微流體系統的示意圖。在經過收縮部分後將細胞暴露於傳遞材料(有效載荷)。
[0048]圖1b是微流體系統的示意圖。在整個過程中，通過將細胞懸浮在包括傳遞材料(有效載荷)的溶液中將細胞與傳遞材料(有效載荷)相接觸(例如，在穿過所述收縮部分之前或者之後將所述細胞與傳遞材料相接觸)。
[0049]圖2A是微流體系統的一個實施方案的示意圖。
[0050]圖2B是微流體系統的示意圖，描述了深度、寬度和長度。
[0051]圖3是微流體系統的示意圖。
[0052]圖4是一種示意圖，顯示細胞壁上的擾動。
[0053]圖5是微流體系統的照片。
[0054]圖6是微流體系統的照片。[0055]圖7是微流體系統的照片。
[0056]圖8a_8b是圖，顯示了微流體系統所獲得的示例性結果。
[0057]圖9是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0058]圖10是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0059]圖11是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0060]圖12是微流體系統的示意圖。
[0061]圖13是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0062]圖14是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0063]圖15是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0064]圖16a_16f是微流體系統的示例性示意圖。
[0065]圖17是使用微流體系統的方法的流程圖。
[0066]圖18a_18b是圖，顯示了使用微流體系統處理過的細胞所獲得的示例性結果。
[0067]圖19是覆蓋傳輸和共聚螢光圖，顯示了使用本發明的主題內容與量子點(QDs) —起處理的細胞的z切面共聚螢光圖
[0068]圖20A顯示了使用本發明的主題內容方法將聚咪唑基配體(PIL)塗布的量子點傳遞進入HeLa細胞細胞質的傳遞效率。通過流式細胞儀測定細胞存活率> 80%。
[0069]圖20B顯示了使用本發明的主題內容傳遞平QD535後HeLa細胞的存貨率，所述存活率是碘化丙啶染色之後使用流式細胞儀測定的。
[0070]圖21顯示了構建物設計，吸收和在各種介質中的穩定性。
[0071]圖22k顯示了被處理的細胞和參照細胞的活細胞共焦顯微鏡照片。
[0072]圖22B顯示了在綠和紅通道中，被處理的細胞強度隨時間的變化。
[0073]圖23顯示了流式細胞儀測定的平均細胞螢光度和存活率。
[0074]圖24顯示了在使用本發明裝置處理IOnM量子點溶液之後，細胞的細胞質中未聚集的單個量子點的落射螢光圖，以及自體螢光性的三個量子點的閃爍軌跡。
[0075]圖25顯示了一種實驗結果，證明傳遞行為取決於細胞速度和收縮部分設計。
[0076]圖26顯示了當傳遞太平洋藍共軛的3kDa右旋糖苷之後，使用共焦顯微鏡測量的不同水平線的HeLa細胞的掃描圖。
[0077]圖27顯示了簡化的2D擴散模型，該模型刺激材料被動擴散通過被打孔的細胞膜。
[0078]圖28顯示了材料的雙重傳遞結果。
[0079]圖29顯示了與siRNA、蛋白質和納米顆粒傳遞有關的數據。
[0080]圖30顯示了本發明主題內容穿過細胞性的能力。
[0081]圖31顯示了納米材料和抗體傳遞的數據。
[0082]圖32顯不了蛋白質傳遞應用。
[0083]圖33是示例性細胞類型的表，其中，有效載荷被成功傳遞。
[0084]圖34的圖描述了一種系統，在此系統中，使用微流體裝置處理父母血液，從而傳遞例如大分子的有效載荷。
[0085]圖35顯示了使用10μ I η-6μ ι η裝置傳遞傳遞有效載荷的人胚胎幹細胞的傳
遞效率和存活率。
[0086]圖36顯示了使用本發明主題內容直接傳遞融合再編碼蛋白質之後鼠和人iPSC細胞系的產生和定性
[0087]圖37描述了初級蛋白再編碼結果，並描述了 iPSC克隆株中人胚胎幹細胞標記物0ct4、SSEA-4、Tra-60、Tra-80、鹼性磷酸酶(AP)的表達。
[0088]圖38描述了一種裝置，通過光刻印刷技術在此裝置的收縮部分兩端整合入電極進行修飾，並且通過Au沉積向通道內引入局部電場，從而將細胞變形與電穿孔相結合。
[0089]圖39描述了微流體系統其他的實施方案，其中進入部分的收縮角度為90度。
[0090]圖40A和40B顯示了圖2A所描述的示例性實施方案中的裝置和圖39中所描述的示例性實施方案中的裝置的存活率和傳遞功效的比較。
[0091]圖41顯示了通過⑶45的Alexa488抗體測量的活化的T細胞的⑶45表達。在CD45靜止RNA存在的情況下使用裝置處理細胞，會顯示較低的螢光強度峰值，因此顯示極低的⑶45基因表達。
[0092]圖42顯示了一些示例性的應用領域，例如再生性藥物、免疫；成像和傳感；和癌症疫苗和癌症研究。
[0093]圖43A和圖43B是一種參照群落和一種細胞群落的流式細胞儀的強度直方圖，所述參照群落接觸與級聯藍 共軛的3kDa的右旋糖苷，所述細胞群落受到30 μ ι η-6μ ι η裝置的處理然後與3kDa的右旋糖苷接觸。
[0094]圖44是棒狀圖顯示了在使用微流體系統和相關方法處理之後，人胚胎幹細胞中GFP的降低。
【具體實施方式】
[0095]本發明的實施方案提供了對細胞實施預先確定時間的受控制的變形，在細胞膜上造成擾動，從而將材料傳遞到細胞中的技術。所述變形可以通過如下方式產生，例如，機械壓力或者剪切力造成的壓力。在一個實施例中，微流體系統包括一種結構，這種結構能夠通過小規模(例如，體積在毫升以下，例如微升、納升或者皮升)的幾何限制流體來控制和/或操作流體。所述微流體系統能夠將任意有效載荷傳遞入細胞中。該系統由一個或者更多個供細胞通過的微流體通道組成，所述通道包括一種收縮部分。優選的，所述細胞通過懸浮在液態介質中的微流體通道，被壓力驅使穿過系統。當細胞通過收縮部分時，細胞膜被擾動，造成細胞膜短時間的破壞並使周圍介質中所含有的有效載荷被吸收。收縮部分是靶細胞尺寸的函數，但是優選的與細胞直徑相同或者比細胞直徑小。可以平行放置和/或串聯放置多個收縮部分。擾動細胞指的是細胞的破壞，這種破壞允許細胞外的材料進入細胞(例如，洞、撕裂、空腔、細縫、孔、破裂、縫隙、穿孔)。通過這裡所描述的方法產生的擾動(例如孔或者洞)不是由蛋白亞基組裝形成多聚體孔結構(例如由補體或者細菌溶血素)而產生的。其他的實施方案也在本發明所描述的主題內容範圍內。
[0096]關於圖1-3，微流體系統5包括定義了管狀腔體的通道10。所述微流體管道10包括收縮部分15，該收縮部分被設置成每次只有單個靶細胞20可以通過。優選的，細胞20懸浮在溶液緩衝液25中通過通道10，所述緩衝液25中還含有傳遞材料30，但是傳遞材料也可以在細胞20通過收縮部分15之後被加入到溶液緩衝液25中。當細胞20達到並通過收縮部分15時，收縮部分15對細胞20施加壓力(例如，機械壓力)，壓縮細胞20 (例如，示作細胞20D。收縮部分15向細胞施加的壓力造成細胞膜(即，細胞202)擾動(例如，圖4顯示的洞)。一旦細胞通過收縮部分15，細胞20開始通過孔吸收溶液緩衝液25種的材料，包括傳遞材料30 (即，細胞203)。細胞膜經過一段時間後恢復，優選的，至少一部分傳遞材料30被捕獲在細胞內部。
[0097]收縮部分15的構造可以定製從而控制細胞20的收縮，因此，控制向細胞20施加的力。
[0098]優選的，收縮部分15包括入口部分35、中心點40和出口部分45。例如，收縮部分15的直徑可以是變化的，從而調節對細胞施加的力(和所述力被施加/釋放的速度)，並且，收縮部分15的長度也是變化的從而調節對細胞施加力的時間。在某些結構中，不需要細胞的物理收縮，只是簡單的將細胞與非常高的剪切速率和/或壓縮速率相接觸，就可以產生理想的擾動。通常這與微流體系統的外部直徑無關，並且內直徑和外直徑的比率可以是變化的(例如，大於5)。
[0099]中心點40的直徑可以是細胞20直徑的函數。優選的，中心點40與細胞20直徑相同或者小於細胞20直徑(例如，是細胞直徑的20-99% )。優選的，中心點40的直徑是細胞直徑的60% -70%，但是，最佳的中心點直徑可以根據應用和/或細胞類型變化。在之前的實驗中，中心點40示例性的直徑是5-6微米和7-8微米。中心點40的直徑可以大於細胞20的直徑，但是被設置成能夠對細胞20產生壓力脈衝(例如，剪切力).這種壓力可以對細胞20實施並不使其接觸通道10的壁。可以使用已知的方法測量剪切力(例如，Journal of Applied Physics27,1097(1956) ；Murphey et al.)。
[0100]入口部分 35的收縮角度(例如，圖2A所示)可以是變化的(例如，直徑減少的速度)。優選的，所述收縮角度能夠最小化細胞通過時系統5的阻塞。出口部分45的角度也可以是變化的。例如，出口部分45的角度被設計以減少非層流的湍流/渦流的可能性(例如，角度為1-80度)。入口部分35的壁和/或出口部分45的壁優選是直的，但是也可以是其他形狀(例如所述牆壁是曲面的)。
[0101]通道10、入口部分35、中心點40和出口部分45的橫截面是可以變化的。例如，各種橫截面可以是圓形的、橢圓形的、狹長的裂縫、正方形、六角形、三角形等等。中心點40的長度也可以變化，並可以調節來改變當細胞20通過收縮部分15時所受到的壓力。在給定的流速下，較長的收縮部分15 (例如，更長的中心點40)會對細胞20施加更長時間的壓力。通道10、入口部分35、中心點40和出口部分45的寬度是可以變化的。例如，可以調節寬度來提供更緊的收縮並因此以與收縮寬度方面的變化相同的方式提高傳遞。裝置設計時改變寬度和長度，並可以在製備裝置時決定設備的寬度和長度，例如，通過光刻法中使用的鉻掩模。在整個通道內寬度可以是均勻的，並且可以在製備時通過深反應性離子蝕刻步驟確定通道的寬度。所述寬度可以是，例如，15微米-20微米。如這裡所使用的，裝置尺寸由一系列表示長度、寬度的數字和收縮的數字(例如，30 μ m-60 μ m5表示裝置的長度為30微米，寬度為5微米和5個收縮部分)組成。
[0102]細胞20穿過通道10的速率也是可以變化的，從而控制傳遞材料30向細胞20的傳遞。例如，調節細胞20穿過通道10的速度可以改變對細胞施加壓力的時間，並且可以改變對細胞施加壓力的速度(例如，緩慢施加或者快速施加)。細胞20以至少0.lmm/s的速度穿過系統5,例如，以0.lmm/s-5m/s,優選以10mm/s到500mm/s的速度通過系統，當然，也可以其他速度通過。在一些實施方案中，細胞20以大於5m/s的速度通過。[0103]可以用不同的材料製備通道10，例如，矽、玻璃、陶瓷、晶體物質、非晶體物質和聚合物(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS、環烯烴共聚物(COC)等等)。優選的，製備過程是以乾淨的空間為基礎的，並且可以使用，例如，幹蝕亥IJ、溼蝕亥IJ、光刻印刷術、注塑成型、雷射燒蝕、SU-8掩膜等等方法。一個示例性的通道10的長度大約是40-50微米，沒有收縮的部分直徑大約為50微米，收縮部分直徑大約為4-8微米。優選的，通道10的長度足夠短以避免堵塞。也可以使用其他尺寸。
[0104]圖39描述了本發明微流體的另一種實施方式。在次實施方案中，通道10包括預備入口部分50，該部分不收縮細胞20。延長的通道部分55為入口部分55提供了 90度的收縮角度(即圖2A中的α )。
[0105]圖40Α 和40Β是兩張圖，顯不了兩種不例性實施方案存活率和傳遞效率方面的比較。標記4000指的是使用圖2Α所示的實施方案時的測量值，而4010指的是當使用圖39所示的實施方案時的測量值。在相同的速度和操作壓力下，圖39所示的實施方案已經顯示具有較高的傳遞效率和存活率。儘管具有與圖2Α條件相似的剪切速率、細胞速度和處於壓力下的時間。
[0106]一些參數會影響傳遞材料30傳遞到細胞20。例如，收縮部分15的尺寸、操作的流體速度(例如細胞通過收縮部分15的時間)、傳遞材料30在溶液緩衝液25中的濃度、和細胞20在收縮後進入溶液緩衝液25中恢復/培養的時間長度會影響傳遞材料30向細胞20中的傳遞。其他能夠影響傳遞材料30向細胞20中的傳遞的參數包括細胞20在收縮部分15中的速度、收縮部分20的剪切率、垂直於流體速度的速度分量、細胞壓縮速率和收縮時間。這些參數可以被設計從而控制傳遞材料30的傳遞。溶液緩衝液25的組合物(例如，鹽濃度、血清濃度等等)也可以影響傳遞材料30的傳遞。當細胞20穿過收縮部分15時，由收縮部分15產生的變形/壓力使細胞短時間內損傷造成材料穿過所述擾動部分形成被動擴撒。在一些實施方案中，細胞20隻在很小的一段時間內發生形變，在100微秒級別，從而最小化激發細胞信號傳導機制細胞凋亡途徑的機會，當然其他時間也是可以的(例如，範圍在納秒至幾小時)。最初的觀察說明在細胞20通過收縮部分15之後幾分鐘的時間內傳遞材料30被細胞20所吸收。
[0107]通過多種方法可以驅動細胞20穿過通道10。例如，在入口側用泵施壓(氣體鋼瓶或者壓縮器)、在出口部分用真空泵抽真空、通過小管的毛細作用、和/或者系統5可以通過重力。還可以使用基於流體系統的位移(例如，注射泵、蠕動泵、手動移液器或者移液管、活塞等等)。通過單一通道10的示例性流體速率在I微升每秒的級別。另外，溶液緩衝液25可以包括一個或者一個以上的潤滑劑(水或者其他表面活性劑)，從而減少或者消除通道10的堵塞並改善存活率。
[0108]對系統5進行控制以保證傳遞材料30傳遞進入細胞群落的傳遞量是持續的。例如，系統5可以使用收縮後的對流傳遞機制，該機制能夠使傳遞材料30撞擊細胞20的滲透性細胞膜。通過控制二級流的流動速率，可以優選的控制向細胞中傳遞的傳遞材料30的量。另外，在細胞膜恢復期間控制傳遞材料30在溶液緩衝液25中的濃度也可以改善傳遞材料30向細胞群落中的傳遞。優選的，系統5完全在機械系統中操作，不使用電場和/或化學試劑，當然，也可是使用其他結構(例如，電傳感器和/或光學傳感器被用於測量細胞性質，例如，螢光性)。[0109]另外，優選的，系統5的傳遞不依賴於被傳遞的材料類型。例如，使用相同的系統可以傳遞蛋白質、RNA和DNA而不需要進行任何修飾。
[0110]在具有某些細胞20的結構中，細胞20在一種或者一種以上溶液中培養，目的是使傳遞材料被細胞所吸收。例如，在傳遞之前，細胞20可以在去聚合作用的溶液(例如，Lantrunculin A0.1微克/毫升)中被培養I小時從而使肌動蛋白細胞骨架去聚合。作為一種額外的實施例，在傳遞前，細胞可以在10微摩的秋水仙鹼(Sigma公司)中培養2小時，從而使微管網絡結構去聚合化。傳遞DNA時，這種方法會幫助獲得基因表達。
[0111]關於圖5，顯示了系統5的平行結構的照片。系統5可以包括任意數量的平行通道。優選的，由於在系統5中加入了其他的平行通道，系統5的整體產量增加。圖6顯示了系統5的平行結構的照片，該系統在每個通道10的入口處包括過濾器。另外，圖6還顯示了收縮部分15的結構，所述收縮部分15包括具有多個臺階的入口部分35。關於圖7，圖7顯示了另一種系統5的原型照片。如圖7的顯示，包括培養孔的原型尺寸大約為I英寸xl/4英寸xl/4英寸。系統5其他的結構還可以包括分選器、預處理/後處理模塊，和/或傳感器模塊(例如，光學傳感器、電學傳感器和磁傳感器)。
[0112]如下面根據實施例中所更為詳細的介紹，微流體系統和相關的方法具有廣泛的應用。圖42是一種示意圖，描述了一些應用領域的實施例。例如，本發明的主題內容可以用於再生醫學，從而使細胞能夠重組和幹細胞分化。本發明的主題內容可以用於免疫領域，例如通過向樹突狀細胞、單核細胞、T細胞、B細胞和其他淋巴細胞傳遞來實現抗原呈遞和免疫活性的強化/抑制。進一步的，改善量子點、碳納米管和抗體向靶細胞中的傳遞對成像和傳感是有益的。另外，本發明的主題內容可以在癌症疫苗和研究中應用，例如，用於循環腫瘤細胞(CTC)Fenix和淋巴治療。本方法還提供了一種魯棒的平臺，用於篩選能夠治療疾病或者控制細胞行為的 活性siRNA和小分子化合物。
[0113]這一概念已經被其原型成功的解釋了，在其原型中，引入細胞20來吸收溶液緩衝液25中存在的細胞膜可滲透性染料(例如，分子量在3kDa到2MDa之間的螢光染料)、DNA、蛋白質、RNA、納米管或者納米顆粒。在處理後，細胞20能夠恢復並增值，同時保留被傳遞的材料72小時。在此系統中試驗了 11種不同的細胞類型，包括圖33中所列出的，因此說明了本系統對於不同的細胞型都可以表現出強有力的效果。圖33是一種表，包括了本發明主題內容可以成功應用的細胞類型。使用單通道10測量的平均細胞通量大約為5000-20000細胞/秒，測量的平均傳遞效率為96%，並且測量的細胞存活率為95%。所有的實驗都在室溫條件下進行。但是，在某些技術中，溫度可以是變化的。例如，所述方法可以在室溫條件下(例如，20°C )進行，生理條件下(例如，39°C )進行，高於生理溫度、或者降低的溫度下(例如，4°C)進行，或者在這些例舉的溫度之間進行。在降低的溫度下(即通過冷凍、冰浴或者其他已知的技術是溫度基本上接近4°C )進行本發明的方法能夠出乎意料的改善傳遞效率和細胞存活率。因此，可以調節溫度來影響組合物的傳遞和細胞存活率。
[0114]如圖8a_b所示，提高細胞穿過收縮部分15的速度能夠增加傳遞材料30的傳遞百分比和傳遞效率。據發現，傳遞效率隨著細胞速度線性變化，並且存在一種依賴於劑量的反應。
[0115]在圖9中，在通過收縮部分15之後將細胞置於溶液緩衝液25中培養，培養時間會全面影響傳遞材料30向細胞20中傳遞的百分比。但是，據顯示在培養一段時間之後(大約2-3分鐘)，傳遞百分比基本上不再改變。根據這個數據可以相信細胞20通過收縮部分15之後造成的細胞20上的擾動在細胞20通過收縮部分15之後大約5分鐘的時間內被修正。另外，作為參考，對照組的相應時間是I分鐘。
[0116]如圖10所示，據觀察，細胞20多次通過收縮部分15會影響整體傳遞百分比，但是會對細胞20的整體存活率產生負影響。為了產生這個數據，使細胞通過收縮部分15、收集、然後在大約I分鐘內再次通過裝置一次。
[0117]據觀察，在細胞20被擾動的時間裡(例如，在通過收縮部分15之後)，通過擾動可以提取細胞內的材料。因此，已經發現，當細胞20被擾動時，材料可以進出細胞20，。這個性質證明系統5可以被用作對細胞內材料取樣的方法同時不會使細胞裂解。優選的，細胞膜的擾動會使大分子從細胞質中流出，因此可以用作細胞質組合物的探針。
[0118]如圖11所示，在綠色螢光蛋白質(GFP)靜止siRNA(Ambion公司，美國)存在的情況下處理穩定表達綠色螢光蛋白質(GFP)的HeLa細胞，然後使用FACS (FACS Canto II，BD生物技術公司，美國)在48小時進行螢光分析.圖11的結果顯示與市售試劑(例如Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美國))的結果相比，基因表達降低了 40%以上。圖11還顯示了陰性siRNA (Scrambled siRNA)參照物,如圖所示,這個降低並不是由變形過程本身產生的。
[0119]如圖13-14所示，擠壓尺寸會影響傳遞材料30的整體傳遞效率。例如，圖13_14顯示了當操作壓力變化時(例如，通過改變收縮部分15的長度和/或寬度)，整體傳遞效率在某些程度上也發生改變(圖14顯示了不同條件下量子點(納米顆粒)的傳遞)。而且，如圖18a-18b所示，估計的細胞速度會影響傳遞材料30的整體存活率和整體傳遞效率。例如，圖18a顯示了隨著操作速度的變化，整體傳遞速率在某些程度上發生變化。另外，圖18b顯示了隨著操作速度的 變化，細胞的存活率在某些程度上也發生變化。這些圖顯示收縮部分長度的變化會提高傳遞並最小程度的影響存活率。另外，與小分子相比，大分子在收縮之後以較低的速度進行細胞。這裡所描述的細胞內傳遞方法是「通用的」，適用於多種不同類型的材料和細胞。進一步的，該裝置產生的細胞膜破壞的一般尺寸至少為-100納米，但是，其他尺寸的破壞也是可能的。
[0120]如圖12所示，在一個實施方案中，可以通過控制溶液緩衝液25和細胞質的濃度梯度來預計性的控制傳遞材料的量。可以使用局部傳遞方法，在局部傳遞方法中，在細胞20通過收縮制孔之後，將細胞20暴露於濃縮的大分子雲。但是，這些局部傳遞方法應該考慮估計的擾動回復時間，從而確保適當的功能。在實施過程中可以向將高濃度有效載荷傳遞到細胞膜附近的通道裡垂直加入「微管」(如圖6A所示)。優選的，所述微管可以位於收縮部分15中和/或位於收縮部分15附近。這種方法通過對流提供擴散性的傳遞機制，因此能夠獲得更準確的細胞裝載和更高的濃度。優選的，當細胞20處於收縮部分15的高濃度區域時發生所述注射。由於不需要在緩衝液中維持高濃度，這種局部化的技術能夠更為有效的保存傳遞材料的有效性。
[0121]關於圖16a，可以使用一系列微型圓柱100對細胞20施加壓力造成擾動。在此實施過程中，細胞20被迫使通過收縮的管陣列從而將壓力實施到細胞20上。
[0122]關於圖16b，使用壓縮板105對細胞20施加壓力從而造成擾動。在此實施過程中，控制壓縮板105以向細胞20施加預先確定時間的壓力。設置壓縮板105從而使一個或者兩個板能夠運動，對細胞20施加壓力。還可以提供額外組的壓縮板105以基本上包圍細胞20.[0123]關於圖16c，緩衝添加劑115 (或者與細胞表面相連的大塊材料)可以被用於刺激擠壓細胞20穿過收縮部分15，收縮部分15的直徑大於細胞20的直徑。例如，可以通過緩衝添加劑的幹擾作用刺激收縮。緩衝添加劑115的實施例包括微米顆粒或者納米顆粒(例如，聚合物基的、脂質基的、陶瓷基的、金屬基的)。用細胞結合配位體(例如抗體、DNA序列、肽、或者小分子)標記這些顆粒，當然，這並不是必須的。
[0124]關於圖16d，使用磁珠120來壓縮細胞20。例如，可以使用磁力和/或靜電力向細胞20施加力，或者在圖16e的情況下,來推動細胞20。優選的,對細胞20施加的力足夠造成擾動。
[0125]關於圖16f，以能夠對細胞20造成壓力(或者快速短時間剪切力)的方式控制多個液體流125。例如，射出多個液體流從而使其相互接近或者相互撞擊。由於細胞20穿過多個液體流125，可以對細胞施加力從而造成細胞20的細胞膜上的擾動。作為選擇，細胞可以從狹窄的裂縫狀的管中射出來加速傳遞。
[0126]系統5可以是一種獨立的系統，例如圖7的顯示，當然，也可以是其他結構。例如，系統5可以被植入病人體內進行局部細胞內傳遞,和/或在一種機器中被體外整合,用於在將細胞放回病人體內之前對細胞進行處理。
[0127]為了實現這裡描述的傳 遞優勢，所述系統的微流體性質使本領域技術人員能夠通過練習精確控制不同的傳遞條件、預處理過程和隨後的細胞定性。例如，所述系統可以被螢光活化的細胞分選器(FACS)串聯應用。這可以實現在一個相同的系統中對細胞進行實時傳遞和分選。還可以使用多種預處理和分選後試驗技術，從而開發持續的、高通量試驗用於藥物篩選和診斷。
[0128]通過將靶細胞參照群落與有效載荷以及被微流體系統處理的群落相接觸，從而確定有效載荷向靶細胞的傳遞效率。在相同的傳遞溶液中，在相同的濃度下處理參照樣品以及被裝置處理的細胞，並使其維持至少相同的時間。為了補償表面結合、內吞作用以及其他作用例如自體螢光性，定義傳遞區域從而最多1-5%的活參照細胞落入此區域。因此，樣品的傳遞效率對應於位於此傳遞區域內活細胞的百分比。例如，圖43A是一種參照群落的流式細胞儀的強度直方圖，所述參照群落接觸與級聯藍共軛的3kDa的右旋糖苷，圖43B是細胞群落的流式細胞儀的強度直方圖，所述細胞群落受到30 μ I r η -6 μ ι η裝置的處理然後與3kDa的右旋糖苷接觸。圖43A和43B中未塗陰影的區域是上述定義的傳遞區域。
[0129]在操作中，關於圖17，進一步的參考圖1-3，用於實施細胞內傳遞系統5的工藝過程1000包括如圖所示的各個步驟。但是，工藝過程1000隻是示例性的，不是限制性的。可以通過例如添加、刪除、改變或者重排各個步驟的方法改變工藝過程1000。
[0130]在步驟1005，將細胞20單獨與傳遞材料懸浮在溶液緩衝液25中。通常，細胞濃度在IO4到IO9細胞/毫升的範圍內。傳遞材料的濃度在10毫克/毫升至0.1微克/毫升的範圍內。
[0131]在使用理想的設置進行傳遞之前或者傳遞完成後馬上將傳遞材料加入細胞緩衝液中，所述理想的設置使損傷/孔在1-5分鐘內保持開放。溶液緩衝液由許多鹽類、糖類、生長因子、動物衍生物或者其他適合細胞增殖、維持細胞健康或者誘導細胞信號傳導途徑的成分所組成。其他的材料也可以加入溶液緩衝液25中。例如，可以向溶液緩衝液25中加入表面活性劑(即，共聚物)和/或大塊材料。
[0132] 在步驟1010，包括細胞20和傳遞材料30的溶液緩衝液25通過系統5的通道10。所述溶液緩衝液25通過重力作用穿過通道10，或者可以被其他方法所輔助。例如，可以再通道10的入口側對溶液緩衝液25施加壓力(例如，使用氣瓶和/或壓縮器)，和/或在通道10的出口側使用真空泵施加真空。另外，還可以使用基於位移的流體系統。
[0133]隨著單個細胞通過收縮部分15，收縮部分15的固體結構暫時性的對細胞20施加力，造成細胞20細胞膜的擾動，例如產生孔，從而將傳遞材料30傳遞到細胞20的內部。可以通過調節收縮部分15的尺寸、細胞20穿過收縮部分15的速度、和/對通過調整收縮部分15的形狀來改變對細胞20實施壓力的量和時間。在一個結構中，大約5，000-20，000個細胞/秒穿過收縮部分15，並且每個細胞被收縮大約100微秒。
[0134]系統5可以包括一個或者更多個通道10。例如,系統5包括50-100個通道10,這些通道10平行排列。使用平行排列的結構可以減少一個或者更多個通道10中發生堵塞的情況，並且增加系統5的總通量。另外，系統5還包括一種或者一種以上的相互串聯的通道。
[0135]在步驟1015，當細胞20通過收縮部分15之後，通過將細胞靜置在溶液緩衝液25中培養/恢復細胞。在此過程中，細胞20會通過細胞膜上出現的擾動來吸收一些溶液緩衝液25中存在的傳遞材料30。這種吸收的一個機理是基於擴散的，由於大分子的吸收速率比小分子的吸收速率要慢。優選的，細胞20在溶液緩衝液25中培養/恢復大約2-5分鐘，當然，也可以是其他時間。在此時間內，細胞20在溶液緩衝液25中培養/恢復，細胞20內的材料也可能從細胞內釋放到溶液緩衝液25中。在培養/恢復期間，可以控制某些條件以確保傳遞材料30的傳遞量持續穿過細胞群落。例如，收縮後可以使用對流傳遞機制將傳遞材料撞擊進入正在培養中/恢復中的細胞。
[0136]選擇性的，在步驟1020中，細胞經過培養/恢復之後，洗滌細胞從而除去溶液緩衝液。優選的，在經過一段時間使之前發生的擾亂恢復之後進行洗滌，當然，洗滌液可以在其他時間進行從而控制被細胞吸收的傳遞材料30的量。
[0137]實施例1-功能性工程納米顆粒的傳遞
[0138]工程納米顆粒具有很大的潛力能夠作為活細胞成像工具、治療劑分子傳遞試劑或者甚至作為通過使用外部手段(例如光場或者磁場)操控活細胞的方法(Howarth，Μ.，et al.Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on livingcells (用作活細胞成像受體的單價小尺寸量子點).Nature Methods5, 397-399 (2008))。但是，許多這些潛在應用需要將納米材料傳遞到細胞的細胞質中。大多數納米顆粒，例如QDs，需要被聚合物鈍化使納米顆粒能夠溶解在水性媒介物中，這常常會妨礙納米顆粒被動擴散穿過細胞膜。
[0139]由於缺少專業儀器以及低通量，同時電穿孔使QD在細胞內沉積，所以納米顆粒的微注射被認為是不可實現的。因此，目前大多數嘗試將量子點傳遞入細胞質的方法都依賴於細胞對量子點的內吞作用並且不被內含體吞噬。在本發明主題之前，不可能以滿意的方式、成規模的方式將量子點傳遞到細胞質中。本發明的系統為之前方法所存在的傳遞問題提供了解決方案。
[0140]所述微流體系統可以與新近報導的新一代生物相容性QDs相結合((Liu，W.，et al.Compact biocompatible quantum dots via RAFT-mediated synthesis ofimidazole-based random copolymer ligand(通過RAFT-介導的咪唑基隨機共聚物配體壓縮生物相容性量子點).JACS132，472-483 (2010))。在實施例1中使用的量子點塗布有聚咪唑配位體，該配位體由多重金屬螯合的咪唑基團和多重水溶解性鈍化的聚(乙烯基)乙二醇(PEG)組成。
[0141]為了向細胞質傳遞量子點，將細胞分裝在含有量子點的PBS緩衝液中。用移液管將細胞-量子點溶液移入微流體裝置，然後在持續的壓力下使溶液穿過通道，隨後進行5分鐘的培養時間。在培養時間結束後，尚心分尚過量的量子點。對於參照群落，將細胞-量子點溶液防止在微流體系統中，然後使細胞暴露於量子點溶液足夠長的時間從而允許細胞質內傳遞方法實施。
[0142]圖19是傳輸和共聚螢光圖像的疊加，隨後是使用本發明主題內容完成的經過傳遞量子點處理的細胞的z切面共聚螢光圖像。圖19顯示(上圖)剛剛處理(即，傳遞)完成之後和(下圖)在37°C和5%的二氧化碳中培養48小時後。擴散染色方式被限制在細胞質中，並且納米顆粒顯示不會進入細胞核(細胞內黑色區域)。標尺是10微米。圖19顯示了用量子點塗布的、特定的不含有聚咪唑基的配位體的照片，這種配位體除去通過聚乙二醇基團提供生物相容性之外沒有其他功能。共聚螢光照片顯示了在流過微流體裝置被分離的圓形HeLa細胞在細胞不同的z切面具有擴散性的細胞質QD染色(圖19，上圖)。在37°C和5%的二氧化碳中培養細胞並吸附48小時之後所述擴散性染色依然存在(圖19，下圖)。在48小時，擴散性量子點螢光變暗淡，可能是由於細胞分解(圖19)。量子點(水力直徑-13納米)以-10，000細胞/秒的通量被傳遞到-40%活細胞群中。圖20A顯示了使用本發明主題內容將塗布有PIL的量子點傳遞到HeLa細胞的細胞質中的傳遞效率。通過流式細胞劑測定的細胞存活率大於80%。圖20B顯示了使用本發明主題名稱將平QD535傳遞到HeLa細胞後的 存活率，這是使用碘化丙啶染色並使用流式細胞儀測定的。使用流式細胞儀、對共聚圖片的擴散染色測定被處理的細胞的存活率，細胞吸附的能力與量子點向活細胞的細胞質中的傳遞相一致。
[0143]為了確定這些螢光確實是由被傳遞到細胞質中的量子點產生的而不是由被內含體捕獲的量子點產生的，將納米顆粒設計為其發射曲線隨著其與細胞質的還原環境之間的相互作用而變化。細胞質中還原電勢為-260到-220mV，並且最初是通過維持三肽穀胱甘肽的高濃度(5-1OmM)來產生的。
[0144]因此，通過測定QD-染料構建物的螢光強度來確定被傳遞的納米顆粒的位置和化學可進入性，其中，當與細胞質環境相接觸時，所述構建物的發射曲線發生變化。QD-染料被構建，從而包含發綠光的QD (透射率=541納米)，該QD作為能量供體提供碳氧-X-若丹明(Rox)染色(透射率=610納米),通過還原性二硫鍵共軛。
[0145]圖21顯示了在不同介質中構建物的設計、吸光度和穩定性。2100是與染料共軛前和塗布QD前PIL的示意圖(左圖)，以及所得的量子點-二硫鍵-碳氧-X-若丹明(Rox)構建物的示意圖(右圖)(圖片沒有成比例顯示)。2110是量子點-二硫鍵-碳氧-X-若丹明(Rox)構建物的吸收光譜。在實驗過程中，488納米和405納米下的激發會產生獨有的光吸收。2120是在37°C下和5%的二氧化碳條件下全培養基中QD向碳氧-X-若丹明(Rox)傳遞的構建物螢光能量的穩定性，說明在胞外環境下二硫鍵沒有裂解。圖2130顯示了細胞內還原性穀胱甘肽造成的二硫鍵裂解，如QD螢光性的恢復所示。2140顯示了通過使用非硫醇基還原性三(2-羧乙基)膦處理後產生的量子點螢光性的恢復，進一步證實了二硫鍵的裂解。
[0146]整合入PIL的硫醇基與硫醇化的碳氧-X-若丹明(Rox)形成二硫鍵。當平均每量子點有13個碳氧-X-若丹明(Rox)時，純化的構建物的吸光廣譜具有量子點和碳氧-X-若丹明(Rox) (2120)的吸光特徵，有效的退火QD螢光性(2130)。在細胞質中，該構建物可以作為一種特定還原環境不可逆的傳感器。當在488納米(顯微鏡)或者405納米(流式細胞計)下用雷射選擇性的刺激量子點同時維持二硫鍵的完整，所述構建物經歷螢光性共振能量傳遞(FRET)，從而碳氧-X-若丹明(Rox)發射紅色光。在溶液實驗中，細胞還原性穀胱甘肽裂解二硫鍵，釋放碳氧-X-若丹明(Rox)染料並且恢復量子點的螢光性(2140)。非硫醇基還原性三(2-羧乙基)膦還可以恢復量子點的螢光性，這說明碳氧-X-若丹明(Rox)從量子點表面的釋放不是由穀胱甘肽產生的PIL位移造成的。由於PIL上長聚乙二醇產生的空間位阻，一些二硫鍵被阻礙，並且由於染料和量子點表面之間會產生非常少量的非特異性相互作用，因此碳氧-X-若丹明(Rox)螢光性可能不會完全消失。
[0147]通過流式細胞計和共焦顯微鏡測定的構建物螢光曲線的變化證實量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox)構建物傳遞到細胞質中。當暴露於還原性細胞質環境中時，二硫鍵的裂解破壞量子點向染料的螢光性共振能量傳遞(FRET)過程。因此，隨著獨有的量子點激發，量子點通道的螢光性隨著時間增加而碳氧-X-若丹明(Rox)通道的螢光性隨著時間減少。在含有高濃度的量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox)的溶液中用微流體裝置處理活HeLa細胞，培養5分鐘，然後在加入細胞培養基(即被處理的細胞)之前洗滌除去過量的量子點。不用微流體裝置處理參照細胞，而是與量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox) —起培養參照細胞5分鐘，然後在加入細胞培養基之前進行洗滌。使用共焦顯微鏡和流式細胞計觀 察被處理的細胞和參照細胞的碳氧-X-若丹明(Rox)和量子點通道螢光性。
[0148]圖22A和圖22B顯示了活細胞共焦顯微照片和顯示細胞質染色的螢光強度分析和量子點表面的化學可進入性。圖22A顯示了被處理的細胞(上圖)和參照細胞(下圖)的圖像。只有被處理的細胞顯示出擴散性綠螢光表象。標尺為10微米。圖22b顯示了綠通道和紅通道中強度作為時間函數的變化。由於在每個時間點η < 20，通過校準O小時時間點來糾正總平均螢光性的波動。
[0149]在共焦顯微鏡下，擴散的螢光性穿過被處理細胞的細胞質從強烈的紅色轉變為強烈的綠色(如圖22Α所示)。參照細胞圖像顯示細胞膜外有一些非特異性結合，如環裝螢光所示，並且綠色通道的信號沒有增加。該作用與細胞質二硫鍵可預期的降解相一致，所述降解會減少螢光性共振能量傳遞(FRET)作用。在圖22Β中，所述線狀圖顯示了，在被傳遞的螢光物質中，通過校準總螢光性修正細胞與細胞之間的差異後，被處理的細胞和參照細胞和自體螢光性細胞的每個細胞中平均量子點和碳氧-X-若丹明(Rox)通道強度。對於被處理的細胞，圖像顯示了培養2-4小時內的圖像，其中量子點的螢光性上升超過碳氧-X-若丹明(Rox)的螢光性。有趣的是，9小時後被處理的細胞碳氧-X-若丹明(Rox)信號穩定維持於自體螢光水平之上。這與溶液實驗結果相一致，其中，一些螢光性共振能量傳遞(FRET)在減少後殘留。所觀察到的對比著色和量子點信號的增加以及碳氧-X-若丹明(Rox)信號的減少有力的證實了細胞質傳遞和隨後的二硫鍵裂解。通過對碳氧-X-若丹明(Rox)進行螢光性共振能量傳遞(FRET)淬火參照細胞中的量子點螢光性，其表象無法與自身螢光相區分。在較早的時間點所述參照細胞顯示一些碳氧-X-若丹明(Rox)螢光性超過其自身螢光性，然後穩定的下降。這回在量子點-S-S-碳氧-X-若丹明(Rox)和細胞表面產生非特異性的相互作用，隨後將所述構建物再溶解於所述培養基中。
[0150]圖23顯示了流式細胞儀測定的平均細胞螢光強度和存活率。2300是每個細胞的QD平均螢光強度(左圖)和碳氧-X-若丹明(Rox)的平均螢光強度(右圖)，說明只有在被處理的細胞中QD螢光強度增加。在24小時時間點，被處理細胞核參照細胞的碳氧-X-若丹明(Rox)螢光強度處於自體螢光水平。2310是一種直方圖，在QD通道(左圖)和碳氧-X-若丹明(Rox)通道(右圖)顯示了被處理的細胞和參照細胞在選定的時間點螢光強度的分布。據估計，細胞群的至少35%發生量子點傳遞。灰色區域用於指導眼睛在螢光強度直方圖峰上運動。2320顯示了使用碘化丙啶測量的參照細胞和被處理細胞的存活率。
[0151]如圖23所示的流式細胞儀測定方法證實量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox)構建物可以與細胞質環境發生相互作用。記錄所有活細胞的流式細胞儀測量結果，包括被傳遞的細胞(-35%的被處理細胞群)和未被傳遞的細胞。2100顯示了被處理細胞和參照細胞的平均螢光強度。最開始，被處理細胞的QD螢光性上升，在大約9小時時出現峰值，然後逐步下降，這與參照細胞的QD螢光相反，參照細胞的QD螢光維持在自體螢光水平。這與被處理的細胞內部QD和染料之間二硫鍵橋聯的細胞質內還原相一致，隨後通過細胞分裂稀釋螢光構建物。被處理細胞和參照細胞的碳氧-X-若丹明(Rox)螢光強度剛開始比較高，然後在最初的2小時內開始下降。這種下降造成顆粒(該顆粒在培養過程中結合在細胞表面)再溶解於培養基中。由於被處理的細胞群中也存在未傳遞細胞，因此被處理細胞群的平均碳氧-X-若丹明(Rox)螢光強度與參照細胞群的螢光強度相似。在被處理的細胞群中存在的被傳遞細胞和未被傳遞的細胞可以被2310中顯示的量子點和碳氧-X-若丹明(Rox)強度的直方圖區分。隨著時間的增加，被處理細胞的螢光直方圖變成雙峰，但是參照細胞的直方圖還是單峰。被處理細胞群亞組的QD螢光強度隨著時間上升，這進一步說明被處理和被傳遞的細胞中FRET過程的破壞。由於結合細胞膜構建物被重新溶解在培養基中，碳氧-X-若丹明(Rox)螢光全面下降，但是被處理細胞群亞組還維持碳氧-X-若丹明(Rox)螢光性。這與共聚顯微照片中觀察到的QD-S-S-Rox鍵的不完全還原相一致。在所有時間點，使用碘化丙啶染色進行測定，被處理的細胞群的存活率在參照細胞存活率的10%之間(2130)。相對於參照組，細胞存活率>90%，這與作為替換的方法，例如電穿孔和基於聚合物的方法相比更受歡迎，作為替換的方法在處理後的存活率低至40-60%。
[0152]圖24顯示了在使用本發明裝置處理IOnM量子點溶液之後，細胞的細胞質中未聚集的單個量子點的落射螢光圖(上圖)，以及自體螢光性的三個量子點(被標記為2400、2410和2420)的閃爍軌跡。由於長時間的採集(500ms)，QD閃爍軌跡是非二元的。標尺為10微米。
[0153]量子點傳遞平臺通過傳遞未聚集的量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox)構建物實現單個細胞成像，所觀察到的發射間歇性與單個量子點一致。在此實驗中，量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox)構建物被傳遞到細胞質中，隨後進行10小時的培養並在落射螢光顯微鏡中成像。10小時的培養時間確保來自細胞質內部的量子點的螢光通過二硫鍵的還原被恢復；落射螢光顯微鏡用於確保足夠的光子被收集。當細胞在低量子點濃度下(圖24)被這裡所描述的主題內容處理時可以觀察到一些閃爍的量子點。2400、2410和2420顯示了閃爍量子點在細胞質中的強度軌跡，由於長時間的採集(500ms)，量子點閃爍軌跡是非二元的。在採集時間內(大約I分鐘)，轉化細胞的運動微乎其微。這些數據說明使用本發明主題內容將量子點作為螢光標記傳遞後可以觀察到細胞質內的單個細胞的情況。
[0154]實施例1顯示了使用本發明主題內容的實施方案將納米顆粒傳遞到細胞質中。通過觀察量子點-二硫化物-碳氧-X-若丹明(Rox)被細胞內還原劑裂解，顯示納米顆粒表面與細胞質成分相互作用。 [0155]本發明主題內容的實施方案確保量子點高通量傳遞到細胞質中同時不產生細胞穿透或者內體逃逸的配位體，並維持細胞存活率和量子點完整性。傳遞效率為35%，這一效率可以進一步通過增加微流體收縮部分的數量、改變收縮部分尺寸、或者增加處理循環數而增加。與大多數現有的細胞穿透肽或者正電荷輔助傳遞方法不同，本發明主題內容不需要將細胞內傳遞處理方法和細胞質蛋白靶向處理方法相結合對相同的納米顆粒實施。
[0156]通過分配前述需要，可以實現交叉反應性關係的緩解、結合方案不平等的反應效率和共軛化學計量學。因此，量子點構建物的設計具有重要的靈活性，為細胞內蛋白標記和跟蹤鋪平道路。該方法可以有效用於傳遞許多複雜設計的螢光納米材料，所述螢光納米材料通過已被證實的蛋白質靶向方案(例如，但是不局限於鏈黴親和素-生物素、滷代標記-氯代烷和分選酶標記)靶向細胞內蛋白質和細胞器。
[0157]在實施例1中，所有化學品都來自於Sigma Aldrich公司並且除非另有說明，已收到時的形式被使用。在乾燥的氮氣條件下，在氧水平少於0.2ppm時用Omn1-Lab VAC手套箱處理空氣敏感材料。所有的溶劑都是光譜性的或者是試劑。使用手持紫外線燈和KMn04在TCL中成像含有芳香族環的化合物。使用茚三酮染色在TCL中成像含有氨基的化合物。在Teledyne Isco Combi Flash Companion進行快速柱狀色譜。從ATCC購買HeLa細胞，然後除非另有明確說明，從Mediatech購買所有細胞培養基材料。
[0158]在實施例1中，1H NMR譜圖被記錄在Bruker DRX401NMR譜儀上。在BrukerDaltonics APEXIV4.7FT-1CR-MS上進行MS-ESI。使用HP8453 二極體陣列分光光度計記錄紫外-可見光吸收光譜。使用BioTek Synergy4微板閱讀器記錄光致發光光譜和吸收光譜。使用AgilentllOO系列HPLC/GPC系統在DMF溶液中確定聚合物分子量，使用三個串聯的PL膠柱(103、104、105A)和窄聚乙烯標準品。在Varian ProStar Prep HPLC系統中純化染料衍生物。用GE Healthcare公司的裝載有S印hadexTM G-25M的Η)_10柱純化修飾的聚合物。離心純化配位體交換的量子點然後用Millipore Amicon Ultra30K切斷離心過濾膜透析，然後在裝配有自組裝Superdex20010/100玻璃柱的AKTAprime Plus色譜系統(Amersham Biosciences 公司)上進行 GFC。在 LSR Fortessa (BD Biosciences 公司)上進行流式細胞儀測定。
[0159]在實施例1中，CdSe核具有478納米的第一吸收峰，使用之前報導的方法(I)合成這種CdSe核。總的來說，將0.4微摩(54.1毫克)的Cd0、0.8毫摩(0.2232克)TDPA、
9.6毫摩(3，72) TOPO放置在25毫升圓底燒瓶中。在160°C下對溶液脫氣I小時，然後在氬氣下加熱到300°C直到CdO溶解，並且形成乾淨的均相溶液。隨後，在160°C下將上述溶液放置到真空中，除去演化產生的水。在氬氣條件下將溶液重新加熱到360°C然後快速加入TOP-Se溶液(在1.5毫升的TOP中含有1.5毫升的1.5M TOP-Se)直到產生第一吸收峰為478納米的CdSe核。
[0160]通過之前報導的方法(2)的修飾方法將CdS殼沉積在CdSe核上。通過反覆用丙酮從己烷中沉澱來分離核，然後在油胺(3毫升)和十八碳烯出毫升)混合物溶劑中升溫至180°C。然後以4毫升/小時的速度持續的引入Cd和S前體溶液。Cd前體由在十八碳烯(1.5毫升)和TOP (3毫升)的溶劑混合物中0.33毫摩油酸Cd和0.66毫摩油胺組成。S前體由在6毫升TOP中的0.3毫摩爾的六甲基二矽硫醚[(TMS) 2S]組成。總共加入3個單層，每個Cd和S產生一種量子點，所述量子點在541納米有發射，並且當在辛烷中稀釋的時候量子點產量為60%。使用文獻(3)中記載的CdSe核的消光係數計算CdSe (CdS)的消光係數並假定在塗布步驟有95%的CdSe核被保留。
[0161]在實施例1中，使用光刻印刷術和深度反應性離子蝕刻技術製備矽晶片。清潔(用H2O2和H2SO4)所得蝕刻的矽晶片除去殘渣，氧化產生玻璃表面並在切成單獨包裝的裝置之前結合高硼矽晶片。然後在使用前分別檢查每個裝置的缺陷。
_2] 實施例2-大分子的傳遞
[0163]大分子的細胞內傳遞是治療應用和研究應用的關鍵步驟。納米顆粒調節的DNA和RNA傳遞可以有效用於例如基因治療，而蛋白傳遞可用於在臨床和實驗室中影響細胞功能。其他材料，例如小分子、量子點或者金納米顆粒可以被傳遞到細胞液中，其用途可包括癌症治療、細胞內標記和單細胞追蹤。
[0164]為了說明該技術的多功能性，模型右旋糖酐分子被傳遞到一些細胞型中:DC2.4樹突狀細胞，新生人包 皮成纖維細胞(NuFF)和小鼠胚胎幹細胞(mESC)，獲得的傳遞效率分別高達55%、65%和30%。最初的實現還顯示在初級淋巴細胞、巨噬細胞和來自小鼠的樹突狀細胞中實現了成功的傳遞。此外，本技術不會產生過度的細胞毒性或者也不會誘導幹細胞分化作用。的確，甚至在最高的實驗速度下所有的細胞型具有超過60%的存活率。對於上述細胞型應預先設計最優裝置和操作條件。
[0165]圖25顯示了實驗結果，證實傳遞情況取決於細胞速度和收縮部分涉及。收縮部分尺寸由數字表示(例如，10微米-6微米*5)，其中第一個數字表示收縮部分長度，第二個數字表示收縮部分寬度，第三個數字(如果存在的話)表示每個通路中串聯的收縮部分數目。在2500顯示了傳遞效率，在2510顯示了處理後18小時的細胞存活率(使用流式細胞儀測定)，該存活率被表示為細胞速度(40微米-6微米(ο)、20微米-6微米(□)和10微米-6微米(Λ)裝置設計)的函數。在用30微米-6微米裝置中，初始人成纖維細胞(□)、DC2.4樹突狀細胞(ο)和小鼠胚胎幹細胞(mESC) ( Λ )的2520傳遞效率和2530細胞存活率(通過流式細胞儀測定)被證明是速度的函數。在傳遞後18小時分析人成纖維細胞和樹突狀細胞。在傳遞完成後I小時分析小鼠胚胎幹細胞(mESC)。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。
[0166]圖26顯示了在共焦顯微鏡下測定的，在傳遞由太平洋藍共軛的3kDa右旋糖酐之後，HeLas細胞不同水平面的掃描2600。掃描從上向下進行，然後從左到右進行，其中，左上方ζ =6.98微米，右下方的ζ =-6.7微米。標尺為6微米。在2610顯示了 10微米-6微米(□ )、20微米-6微米(ο)、30微米-6微米(Λ )和40微米-6微米(O)裝置的活細胞傳遞效率。時間軸表示從在於目標傳遞溶液相接觸之前，開始對細胞進行處理時經過的時間。所有的結果都是在處理後18小時通過流式細胞儀來測定的。在2620，使用未處理的細胞相對於參照細胞的自體螢光性校準被傳遞的細胞群體的平均強度。在連續的處理循環中，向細胞中傳遞螢光素共軛的70kDa右旋糖酐(水平線)和太平洋藍共軛3kDa右旋糖酐(對角線)(循環I和循環3)並從細胞中除去(循環2)。參照表示只與傳遞溶液相接觸但是沒有被本裝置處理的細胞。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。
[0167]之前描述的基於納米顆粒和細胞穿透肽(CPP)的傳遞技術揭示了細胞內途徑，所顯示的證據排除了內吞作用對本發明主題內容傳遞機制的影響。在2600，圖26顯示了使用太平洋藍共軛的3KDa右旋糖苷處理的細胞的共聚顯微照片，其擴散性的細胞質染色與內吞作用方法所預計的點狀特點相反。另外，當傳遞實驗在4°C下進行時，該溫度會使內吞作用最小化，而對於所實驗的兩個有效載荷(3KDa和70KDa的右旋糖苷)來講，傳遞效率受溫度影響很小。這些數據顯示，內吞作用不可能對本系統的傳遞承擔責任。
[0168]確定傳遞動力學隨時間變化的特徵。在不存在傳遞材料的情況下使用本發明主題內容傳遞材料，隨後在處理後預定的時間間隔將細胞暴露於太平洋藍標記的3KDa右旋糖苷中。在此方法中，由於細胞通過收縮部分造成其細胞膜的破壞，但是在我們將其暴露於被標記的右旋糖苷之前，沒有發生可檢測到的傳遞。因此，在每個時間點的傳遞效率會影響處理後細胞維持多孔性時間長度的百分比。本發明捕獲孔形成/關閉動力學。所述結果顯示，無論裝置是如何設計的，幾乎90%的傳遞發生在處理後第I分鐘(2610)。所觀察到的時間尺度證實孔形成假設，隨著對細胞膜作用的修復，動力學報導了在造成損傷後大約30秒發生細胞膜修復。相反，內 吞作用推薦的時間尺度，例如納米顆粒和CPP介導的傳遞機制大約是以小時為單位的。
[0169]由於材料通過細胞膜上孔的傳遞時擴散性的，在整個孔存在的時間內，材料可以被傳遞進入細胞或者傳遞出來。
[0170]另一方面，內吞作用或者收縮機制必須是單向的，即，僅促使材料被傳遞進入細胞中。為了說明材料向細胞膜中的雙向傳遞，進行包括3個傳遞循環的實驗。在第一個循環中，在3kDa右旋糖酐和70kDa右旋糖苷存在的情況下處理細胞，在右旋糖苷溶液中培養5分鐘，然後用磷酸緩衝液洗滌2次。留下三分之一的樣品，隨後待用。在第二循環中，用裝置再次處理留下的洗滌細胞，但是這次不含有任何傳遞材料，並繼續培養5分鐘。將該樣品的一半留出待用。在第三循環中，用裝置處理第二循環留出的細胞，處理條件與第一循環的處理條件相同(即，在右旋糖苷存在的情況下)，培養5分鐘然後用磷酸緩衝液洗滌2次。在試驗完成後，用流式細胞儀對細胞進行18小時的分析。校準的螢光強度的變化說明右旋糖酐在第一循環網狀擴散入細胞，在第二循環從細胞中出來，在第三循環中再次進入細胞(2620)。這些結果與擴散傳遞機制相一致。
[0171]圖27顯示了一種簡單的,2D擴散模型,該模型是COMSOL Multiphysics軟體包開發的，顯示了材料通過被動擴散進入成孔的細胞膜中。COMSOL Multiphysics是COMSOL公司開發的一種有限元分析求解器和仿真軟體/FEA軟體包，適用於多種物理和設計應用，尤其是耦合現象或者多物理場。在2700，材料的傳遞/損失被表示為細胞膜擴散性的函數。當成孔時，所感興趣的材料處於緩衝液中(□)或者處於細胞中(ο)時，模擬結果說明材料向細胞中的傳遞/損失百分比是細胞膜擴散性的函數。在2710代表了模擬系統的圖像和當材料從緩衝液傳遞到細胞中去時，通過細胞膜的濃度梯度圖像
[0172]利用顆粒擴散進入細胞質和從細胞質中出來的文學價值，圖26的實驗數據/結果定性地再現作為物質傳遞唯一方式的擴散作用。而且，通過將實驗數據與此模型相擬合，該技術將緩衝液中10-40%的傳遞材料傳遞到細胞質中。通過比較，用於傳遞蛋白質的CPP方法據估計只能向細胞中傳遞0.1 %的緩衝液材料。
[0173]顆粒尺寸(或者流體力學半徑)影響其擴散性及其進入細胞膜上具有特定孔徑的孔的能力。因此，這一參數會影響孔形成/擴散機制中的傳遞效率。在一系列實驗中，實驗有效載荷是3kDa、10kDa、70kDa、500kDa和2MDa的右旋糖苷與螢光素或者太平洋藍共軛，傳遞這些有效載荷，另外，據估計其分子量為3.1MDa的螢光素標記的質粒也被傳遞。根據其分子量相似性選擇模型分子作為所關心的傳遞材料。例如，3kDa_10kDa的右旋糖苷與一些短肽或者siRNA具有相似的尺寸，而70kDa-2MDa範圍內的模擬大多數蛋白質和一些小納米顆粒的尺寸。
[0174]圖28顯示了材料雙重傳遞的結果。在2800顯示了，對於使用太平洋藍共軛的3KDa右旋糖苷(口)處理的、使用螢光素共軛的70kDa右旋糖苷(ο)處理的和2MDa右旋糖苷處理的HeLa細胞來講，活細胞傳遞效率是速度的函數。使用10微米_6微米X 5晶片來進行本實驗。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。2810和2820顯示了未處理的(紅色)、以700mm/s的速度處理的(綠色)和以500mm/s的速度處理的(橙色)以及以300mm/s的速度處理的(亮藍色)、或者僅僅暴露於傳遞材料(參照，深藍色)的HeLa細胞的流式細胞儀數據重疊的直方圖。所述傳遞材料由太平洋藍共軛的3KDa右旋糖苷(2810)和螢光素共軛的70KDa右旋糖苷(2820)組成。
[0175]實驗顯示， 大於70kDa的分子與30kDa右旋糖苷具有具有不同的傳遞曲線(2800)。所述裝置產生雙向傳遞，其中10微米-6微米X 5的裝置在500mm/s下運行，例如，能夠確保90%的活細胞收到3kDa的分子，而大約50%的細胞收到大於70kDa和2MDa的分子。
[0176]對應這些流式細胞儀數據的直方圖顯示3kDa的右旋糖苷傳遞產生2個不同的峰(2810)。在第一亞群中，通過相對於參照物(對於參照物，考慮Omm/s數據點時之前描述的內吞作用和表面結合性)產生的峰位移造成平均螢光強度增加2-6倍，顯示出細胞溫和的傳遞水平。在第二群眾，與參照相比，細胞的平均螢光強度增加20-100倍，顯示了增加的傳遞水平。該作用顯示後一亞群比前一亞群的成孔情況更嚴重，因此能夠使材料的流通增加大約10倍。事實上，由300mm/s、500mm/s和700mm/s的曲線所示,通過增加操作速率增加處理的嚴重性，貌似能夠增加具有提高的傳遞能力的細胞百分比。對於較大的70kDa的右旋糖苷分子可以觀察到相似的特點(2820)。但是由於較低的顆粒擴散性和可能的尺寸排除作用會降低整體傳遞量，這一作用不是那麼明顯。與3kDa情況所觀察到的2-6倍增加相t匕，溫和傳遞的細胞群(第一峰)的平均螢光強度只增加1.5-2倍。這一作用應被認為是2800傳遞數據中的差異，這是由於在大分子情況下，根據這裡的傳遞定義，溫和傳遞細胞群難以與參照群相區別。因此，對於較大的分子，例如70kDa和2MDa右旋糖苷，技術人員主要測定第二個傳遞明顯被提高的細胞群。
[0177]為了確定被快速機械變形作用傳遞到細胞質中的材料是有活性的並且在細胞的細胞質中具有生物可利用性，進行了一系列實驗向能夠表達去穩定性的GFP中傳遞待檢測的有效載荷GFP靜止siRNA (Ambion，美國)。在處理後18小時觀察到劑量依賴型和序列特異性GFP抑制(高達80% )。作為細胞速度和裝置設計的反應，基因抑制與右旋糖苷傳遞實驗相一致，因此較高的速度和多個收縮部分設計會產生更大的基因抑制。在這些實驗中，使用Lipofectamine2000作為陽性參照。在進行這些實驗之前，未對裝置設計和操作參數進行siRNA傳遞最優化。
[0178]圖29顯示了 siRNA、蛋白質和納米顆粒傳遞的數據。在2900中，在5微摩的傳遞濃度下用10微米-6微米X 5晶片傳遞抗-eGFP siRNA之後18小時，在表達趨穩定的GFP的HeLa細胞中，基因抑制被解釋為裝置類型和細胞速度的函數。使用LipOfectamine2000作為陽性參照。在2910中，顯示了螢光素標記的70kDa右旋糖苷和太平洋藍標記的3kDa右旋糖苷進行快速機械變形傳遞和電穿孔傳遞的傳遞效率。在傳遞溶液中每種右旋糖苷類型的濃度是0.1毫克/毫升。在2920中，使用30微米-6微米裝置，螢光素標記的胎牛血清白蛋白(ο)的傳遞效率、太平洋藍共軛的3kDa右旋糖苷傳遞效率(口)和細胞存活率(Δ)被顯示為速度的函數。在2930中顯示了 HeLa細胞的螢光顯微圖，所述HeLa細胞中傳遞了含有Alexa Fluor488標記物的微管蛋白抗體。比例尺為5微米。2940和2950顯示了被10微米-6微米X5裝置處理並靜止I小時後細胞中金納米顆粒(一些由箭頭表示)的投射電子顯微鏡(TEM)照片。比例尺為500納米。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。
[0179]在進一步的實施例中，為之前挑戰的應用開發細胞質傳遞潛在方法，例如，蛋白傳遞和納米顆粒傳遞。為了比較本發明主題內容與商業上可購得的方法的表現，使用3kDa和70kDa的右旋糖酐作為蛋白質模型,使用本發明主題內容和Neon電穿孔系統(Invitrogen)將這些模型傳遞到人類成纖維細胞中。結果顯示，快速機械變形為這些大分子提供7倍增加的或者更多的傳遞效率(2910)。為了使這些方法適用於蛋白傳遞，使用通道直徑為30微米-6微米的裝置向HeLa細胞傳遞螢光素標記的胎牛血清白蛋白(BSA)，傳遞效率高達44%而且活性超 過90% (2920)。在使用30微米-6微米的裝置處理之後，以0.25毫克/毫升的抗體濃度將Alexa Fluor488標記的微管蛋白抗體(Bio Legend公司)傳遞到HeLa細胞中(2930)。擴散染色顯示材料沒有被包裹在內含體中，因此適用於在細胞質中對細胞結構進行活細胞抗體染色。使用該技術還成功傳遞了載脂蛋白E。
[0180]為了傳遞納米顆粒，變形後靜置I小時的細胞的TEM圖像(2940和2950)顯示了塗布有PEG1000的15納米的金納米顆粒的傳遞。金納米顆粒基本上沒有凝集並且沒有被內含體可視的捕獲。在這些圖像中可以觀察到一些細胞質造成的傳遞缺陷。已經證實能夠實現高通量傳遞，量子點向細胞的細胞質中無細胞毒性的傳遞是之前的技術中無法實現的目標。在這些實驗中，具有Rox染色的量子點結合其表面並通過快速機械變形傳遞，在一定時間內進行觀察。數據產生最小的傳遞效果估計為35%，並且經證實，傳遞的量子點位於細胞質中並且對於細胞內環境是化學可接近的。
[0181]當細胞通過微流體系統時，快速使細胞機械變形形成暫時孔。據顯示，擴散細胞質染色(圖26的2600)數據、siRNA功能性數據(圖29的2900)和材料通過成孔細胞膜的雙向運動數據(圖26的2620)支持該機制。確定許多參數，例如收縮尺寸、串聯的收縮部分數目和影響傳遞效果及存活率的細胞速度(圖25)。因此，這些參數可以用於針對不同的應用，根據細胞類型和傳遞材料的尺寸優化裝置設計。
[0182]在實施例2中，這些技術基於微流體系統，所述微流體系統可以被整合入一種大的綜合系統中，這種綜合系統由多個傳遞之前的預處理步驟和處理後的分析或者分類步驟組成。在平均通過速率為10，OOO細胞/秒時，所述傳遞裝置可以，例如，沿著流式細胞儀放置，從而對細胞進行分類或者在傳遞後立即進行其他分析。
[0183]與之前存在的方法相比，這裡描述的裝置、系統和方法提供了很多潛在的優點。與電穿孔方法和微注射方法相似，本發明是一種基於成孔的方法，因此不依賴於外來的材料、不依賴於有效載荷的化學改變或者細胞內途徑。然而，與電穿孔相反，本發明不需要依賴於電場，電場在蛋白質傳遞方面的作用非常有限並會損失一些有效載荷或者產生細胞毒性。事實上，目前的結果顯示在絕大多數應用中具有相對高的存活率，並且敏感的有效載荷，例如量子點，未受損傷。本發明的主題內容在許多領域提供了非常重要的優勢，例如，在標記和追蹤細胞內材料時，被電穿孔作用損傷的量子點是一個重要問題，並且如果使用化學品的話，傳遞方法將被限制在有效的表面化學範圍內。
[0184]實施例2還顯示了本發明的裝置能向細胞質中傳遞蛋白質。數據和模型估計表明與之前的方法(例如使用細胞穿透肽或者電穿孔方法)相比，本發明的主題內容可以向每個細胞中多傳遞10-100倍的材料。這種改善的傳遞率能提供一種更好的方法用於基於蛋白質的細胞重排，例如，在所述細胞重排中，轉錄因子向細胞液中的傳遞是研發可靠的iPSc生產方法主要障礙。通過傳遞各種關心的蛋白質/肽，技術人員還可以使用本發明主題內容研究疾病機制。事實上，本發明主題內容可以被用於高通量篩選肽文庫，這是由於，與大多數CPP或者基於納米顆粒的技術所不同，本發明主題內容對蛋白質結構和化學不敏感，不依賴胞吞作用途徑，並且不影響蛋白質功能。
[0185]由於本發明主題內容具有傳遞初級細胞的能力，因此通過快速機械變形完成的細胞質傳遞可以用作一種活體外治療機制。在本方法中，在病人體外使用本發明裝置處理來自病人血液或者其他組織的靶細胞，然後再重新放置於人體內。此方法具有增加的蛋白質或者納米顆粒治療劑 傳遞效率並且比現有的技術更安全，這是由於，本發明不需要潛在的毒性載體粒子並且能夠減緩任何與網狀內皮組織清除率和去靶點傳遞有關的副作用。
[0186]在實施例2中，使用光刻印刷法和深活性離子蝕刻技術在微組裝設備中製備基於矽的裝置。在此過程中，用六甲基二矽氮烷(HMDS)處理厚度為450微米的6"矽片，以3000rpm的速度旋轉塗敷光致抗蝕劑(0CG934，FujiFilm公司)60秒，通過鉻掩模暴露於紫外燈(EVl-EVG)中，並具有收縮部分管道設計，並在AZ405 (AZ電子材料)溶液中延長100秒。在90°C下烘焙20分鐘，使用深活性離子蝕刻(SPTS技術公司)蝕刻晶片到預定的深度(例如，在本實施例中，15微米)。在完成蝕刻過程之後，使用Piranha方法(過氧化氫和硫酸)除去殘餘的光致抗蝕劑。為了蝕刻進入孔(即，入口和出口)，用不同的掩膜在晶片對邊(即，不包括蝕刻通道的一邊)重複進行上述過程，所述掩膜上包括進入孔圖案和較厚的光致抗蝕劑AZ9260(AZ電子材料公司)。
[0187]使用含氧血漿和RCA淨化作用除去任何殘留的雜質。在晶片與Pyrex晶片亞電化學鍵合之前使用溼氧化作為產生100-200納米二氧化矽，然後切成單獨的裝置。在使用前分別檢查每個裝置的缺陷。
[0188]在進行實驗之前，將裝置固定在支持物上，該支持物含有入口存儲器和出口的存儲器(Firstcut公司設計生產)。使用丁 -腈橡膠-O-環(McMaster-Carr公司)將這些存儲器與裝置相連，提供合適的密封。使用特氟隆槽將進口存儲器與壓力調節系統相連，從而提供必需的驅動力，推動材料通過裝置。實施例2可以調節壓力使之高達70psi。
[0189] 在含有10%胎兒牛血清(FBS)(亞特蘭大生物科學公司)和I %青黴素鏈黴素(Mediatech公司)的高葡萄糖Dubelco修飾的基礎培養基(DMEM，Mediatech公司)中培養實施例2中包括HeLa(ATCC)、表達綠色螢光蛋白質(GFP)的HeLa、和DC2.4 (ATCC)細胞的細胞培養物。在含有15% FBS的高葡萄糖DMEM中培養初級人成纖維細胞(NuFF) (Globalstem公司)。在培養器中，37°C下、5%的二氧化碳中保存細胞。當使用的時候，用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Mediatech公司)處理粘附細胞5_10分鐘，使粘附細胞懸浮。
[0190]在由85%敲除的DMEM、15%胎牛血清、ImM的穀氨醯胺、0.1mM的β巰基乙醇和I %非必需胺基酸代替的1000單位/毫升白血病抑制因子(LIF) (Millipore公司，美國)組成的培養基中，小鼠胚胎幹細胞(mESC)在小鼠胚胎成纖維細胞(Chemicon)上生長。使用0.25%的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸使細胞每2-3天傳代一次。當用裝置進行處理時，小鼠胚胎幹細胞(mESC)能夠重新形成菌落並在處理2周之後仍然維持正常的形態。
[0191]為了進行實施例2中的實驗，首先要將細胞懸浮在理想的傳遞緩衝液(生長培養基、磷酸質緩衝鹽水(PBS)中，或者補充有3% FBS和1% F-68普盧蘭尼克(Sigma公司)的PBS中，然後與所需傳遞材料相混合，放入裝置入口存儲器中。該存儲器與壓縮空氣管道相連，壓縮空氣管道被一種調節器控制並且使用選擇的壓力(0-70psi)驅使流體通過裝置。然後從出口存儲器收集被處理的細胞。處理後在進行下一步處理之前，在室溫下、傳遞緩衝液中培養細胞5-20分鐘確保孔閉合。
[0192]在實施例2中，在比較不同大小的右旋糖苷傳遞效果的實驗或者比較蛋白質與右旋糖苷傳遞效果的實驗中，可以將所關心的分子共同傳遞，即，使用相同的實驗、使用相同的細胞群體，在相同的裝置上傳遞，根據其螢光標記相區分。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。
[0193]為了傳遞螢光標記的右旋糖苷分子(Invitrogen公司)或者載脂蛋白Ednvitrogen公司)，按照上面的描述進行實施例2的實驗，從而傳遞緩衝液中分別包括
0.1-0.3毫克/毫升的右旋糖苷或者I毫克/毫升的載脂蛋白E。
[0194]為了傳遞螢光素共軛的BSA(Invitrogen公司)，首先將細胞在含有5毫克/毫升未標記的BSA (Sigma公司)的培養基中在37°C下培養2小時，然後用實施例2的裝置處理，其中所使用的傳遞緩衝液包括I毫克/毫升的螢光素共軛的BSA。所述預培養步驟用於最小化螢光標記的BSA和細胞表面的非特異性結合。
[0195]測定實施例2中的綠色螢光蛋白質(GFP)抑制，測量結果為相對於未處理參照物，細胞群落平均螢光強度減少的百分比。通過將I微克siRNA與I微升Lipofectamine2000試劑在100微升的磷酸緩衝液中結合，製備Lipofectamine2000+siRNA粒子。在室溫下培養20分鐘後，向每個試驗孔中加入20微升的混合物，所述試驗孔中包括20000個細胞和100微升的培養基。在分析之前，與所述顆粒一起培養細胞18小時。
[0196]在實施例2中，通過將硫醇末端，1000分子量的聚乙二醇(PEG)共軛到納米顆粒表面製備金顆粒，然後通過離心作用(10，OOOrcf進行30分鐘)洗滌4此去掉過度的PEG，將所得材料懸浮在磷酸緩衝液中，最後濃度為100納摩。為了反映GNP向HeLa細胞中的傳遞，將細胞懸浮在含有3% FBS、I % F-68普盧蘭尼克和47nM GNP的磷酸緩衝液中；用10微米-6微米X 5的裝置處理並固定在含有2.5% (重量/體積)戊二醛、3% (重量/體積)多聚甲醛、和5.0% (重量/體積)蔗糖的二甲次胂酸鈉緩衝液(pH7.4).在固定一整夜之後，將細胞再次固定在包括1% (重量/體積)0s04的巴比妥-醋酸緩衝液中I小時。然後用含有0.5%醋酸雙氧鈾的巴比妥-醋酸緩衝液(pH6.0)對全體細胞染色整夜，脫水並嵌入Spurr樹脂中。使用鑽石刀在Reichert Ultracut E(Leica)上切成厚度為70納米厚的薄片。用EM410電子顯微鏡(Phillips)檢查薄片。
[0197]在實施例2中，在Neon電穿孔系統(Invitrogen公司)中，使用螢光素標記的70kDa右旋糖苷和太平洋藍標記的3kDa右旋糖苷轉染新生人成纖維細胞(NuFF)。按照使用說明，隨後洗滌細胞然後將其懸浮在適當的緩衝液中。使用10微升tip處理細胞，濃度為10細胞/毫升，右旋糖苷濃度為0.1毫克/毫升。使用如下三個狀態:1) 一個20毫秒的1700V的脈衝；2)三個10毫秒的1600V的脈衝；3)兩個20毫秒的1400V的脈衝。使用說明書推薦狀態I和狀態3作為eGFP質粒轉染人成纖維細胞的最優條件，傳遞效率分別為84%和 82%。
[0198]在實施例2的共焦圖像中，在800轉每分的條件下離心樣品4分鐘然後在成像前使用磷酸緩衝液洗滌2-3次。在裝備有Cl共焦附加單位和60倍水浸沒透鏡的NikonTE2000-U倒置顯微鏡中獲取活細胞的共焦圖像。使用405納米的雷射激發螢光樣品然後用標準DAPI過濾器(尼康)檢測。
[0199]在實施例2的螢光顯微 術中，在800轉每分的條件下離心樣品4分鐘然後在成像前使用磷酸緩衝液洗漆2-3次。用裝備有Neofluar透鏡(Zeiss)的Axiovert200 (Zeiss)倒置顯微鏡成像。通過X_citel20Q萊燈(Lumen Dynamics公司)激發突光。所述顯微鏡裝備有Hamamatsu C4742-95照相機(Hamamatsu公司)並用ImageJ(NIH)分析圖像。
[0200]在實施例2的流式細胞儀中，在傳遞試驗後，為了分析細胞，使用磷酸緩衝液洗滌細胞2-3次(在96孔板中，每孔> 100微升)。然後重新懸浮在含有3% FBSU % F-68普盧蘭尼克和10微克/毫升碘化丙啶的磷酸緩衝液(Sigma公司)中。在裝配有高通量取樣機器人的LSR Fortessa (BD生物科學公司)或者FACSCanto (BD生物科學公司)上分析細胞。用405納米和488納米雷射激發所需的螢光團。使用695納米長的通道並分別使用530/30和450/50過濾器檢測碘化丙啶(活/死染色)、螢光素和太平洋藍染色信號。使用FACS Diva (BD生物科學公司)和FlowJo (FlowJo)軟體分析數據。
[0201]實施例3-幹細胞和免疫細胞
[0202]蛋白質、納米顆粒、siRNA、DNA和碳納米管被成功的傳遞到11種不同的細胞類型，包括胚胎幹細胞和免疫細胞。實際上，本發明的裝置和方法能夠將結構多樣性材料及其可用性傳遞到難以轉染的初級細胞中，這表明本發明的方法在研究和臨床上有廣泛的應用。
[0203]在實施例3中，每個裝置由45個相同的平行排列的微流體通道組成，該通道包括一個或者一個以上收縮部分，蝕刻在矽晶片上並用硼矽酸玻璃層密封。每個收縮部分的寬度和長度(下面會進行更詳細的描述)分別在4-8微米和10-40微米。實施例3的裝置通常以20，000個細胞/秒的通過速率操作，每個裝置能產生將近一百萬個被處理的細胞，然後由於堵塞，所述裝置發生故障。選擇平行通道的設計來增加處理量，同時確保對細胞進行均勻的處理，這是由於一個通道的堵塞或者缺陷不會影響相鄰通道的流動速度(所述裝置可以在恆定的壓力下操作)。在使用前，可以首先將該裝置連接到鋼接觸面，所述鋼接觸面與矽裝置的進口和出口存儲器相連接。然後將細胞和需要傳遞的材料的混合物放入進口存儲器並在進口處。然後用壓力調節器調節進口存儲器的壓力並驅使細胞通過所述裝置。然後從出口存儲器收集被處理的細胞。
[0204]已經識別出能夠影響傳遞效率的參數(參見，例如上述實施例2),這些參數包括細胞速度、收縮部分尺寸和收縮部分數目(從而改變細胞所受到的剪切力和壓縮率)。例如，具有膜不可滲透性太平洋藍標記的3kDa的右旋糖苷分子向活HeLa細胞的傳遞效率隨著穿過不同收縮部分設計的細胞速度單調增加(例如，圖25的2500)。收縮部分尺寸還影響傳遞；在所有操作速度下，將收縮部分長度從20微米增加到40微米幾乎使傳遞效率增加兩倍(例如，圖25的2500)，並且對存活率由最小的影響(例如，圖25的2510)。減少收縮部分寬度會獲得類似的作用。增加串聯的收縮部分數目也可以增加傳遞效率，因此，在所有的細胞速度下，串聯有5個10微米長度收縮部分的裝置的工作性能比只有單個10微米、20微米或者40微米長度設計的裝置的工作性能要好(例如，圖25的2500和2510).在這些數據中，Omm/s數據點相當於參照情況，因此細胞與其他樣品經歷相同的處理但是不通過裝置，因此反應了胞吞作用或者表面結合效應。
[0205]為了研究本發明技術的多用性，評價本發明技術向一些細胞型傳遞模型右旋糖苷分子的能力，所述細胞型傳統上是難以轉染的，尤其是免疫細胞和幹細胞。由於螢光標記的70kDa和3kDa右旋糖苷分別與許多蛋白質和siRNA分子具有相似的尺寸，便於用流式細胞儀檢驗並且由於他們是帶負電的，可以最小化表面結合效應，因此，在這些實驗中使用螢光標記的70kda和3kDa右旋糖苷。
[0206]圖30顯示了在不同的細胞型中使用本發明的主題內容。3000顯示了傳遞效率，以及用30微米-6微米裝置向新生人成纖維細胞(NuFF)傳遞3kDa和70kDa右旋糖苷後新生人成纖維細胞(NuFF)的存活率。3010顯示了用10微米-4微米裝置處理脾中分離的鼠樹突狀細胞，向其中 傳遞3kDa和70kDa的右旋糖苷。3020顯示了鼠胚胎幹細胞的傳遞效率和存活率，所述細胞被10微米-6微米裝置處理從而傳遞3kDa和70kDa的右旋糖苷。3030顯示了 3kDa右旋糖苷向B細胞(⑶19+)、T細胞(TCR-B+)和巨噬細胞(⑶IIb)中的傳遞效率，3040顯示了 70kDa右旋糖苷向B細胞(⑶19+)、T細胞(TCR-B+)和巨噬細胞(⑶Ilb)中的傳遞效率，所述細胞通過離心作用從全小鼠血液中分離，並被30微米-5微米和30微米-5微米χ5裝置以1000mm/s的速率處理。分別用太平洋藍和螢光素分離3kDa和70kDa的右旋糖苷。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。
[0207]使用各種裝置設計將右旋糖苷傳遞到新生人包皮成纖維細胞(NuFF) (3000)、初級鼠樹突狀細胞(3010)和胚胎幹細胞(3020)中。這些實驗最小程度的損傷細胞存活率(<25%) (3000、3010和3020)並且，鼠胚胎幹細胞的結果表明該方法不會誘導分化作用。在進一步的研究中，通過離心作用從血液中分離白血球(血塊黃層)並用本發明裝置處理。通過抗體染色區分B細胞、T細胞和巨噬細胞，結果顯示3kDa和70kDa右旋糖苷都被成功的傳遞了 (3030和3040).[0208]為了顯示本發明主題內容在解決目前傳遞方法存在的挑戰的能力，在可能的應用上進行一系列實驗，所述應用包括細胞再生和碳微管基傳感。除了使用下面描述的特殊材料之外，本發明主題內容顯示能夠成功傳遞許多被實驗的有效載荷，例如，載脂蛋白E、牛血清白蛋白和綠色螢光蛋白質(GFP)-質粒。
[0209]圖31顯示了納米顆粒和抗體傳遞數據。3100顯示了使用10微米_6微米x 5裝置傳遞太平洋藍標記的3kDa右旋糖苷和Cy5標記的包覆DNA的碳納米管的傳遞效率和細胞存活率。3110顯示了用拉曼散射覆蓋的亮場細胞圖像，在G帶(紅色)中，顯示了碳納米管向被處理的細胞中的傳遞(左側)和胞吞作用(右側)。刻度尺為2微米。3120顯示了在傳遞了太平洋藍標記的3kDa右旋糖苷(中間組)和Alexa Fluor488標記的抗微觀蛋白抗體(右組)18小時之後，HeLa細胞的螢光顯微照片。刻度尺為3微米。3130顯示了用10微米-6微米X 5裝置，以500mm/s的速率處理傳遞Alexa Fluor488標記的抗微管蛋白抗體後，HeLa細胞的傳遞效率和存活率。將不同抗體濃度下的傳遞效率和100微克/毫升胞吞作用和未處理細胞相比較。
[0210]通過流式細胞儀(3100)和拉曼光譜測定法(3110)證實碳納米管(DNA低聚核苷酸包覆)被成功傳遞了。還可以使用本技術傳遞微管蛋白抗體(3120和3130)，產生細胞的擴散分布，這與細胞質傳遞相一致。上述材料使用目前方法難以傳遞到細胞的細胞質中，並且每個材料通常要求一種專門的修飾來促進傳遞。在實施例3中，使用相同的條件設置，在10微米-6微米X 5的裝置中將所有四種材料傳遞到HeLa細胞中。
[0211]蛋白質向初級細胞中的有效傳遞能夠用於一些治療應用。細胞再編碼問題是之前CPP-基蛋白質傳遞方法所 無法解決的。圖32顯示了蛋白質傳遞應用。在3200顯示了使用細胞滲透性肽與10微米-6微米裝置將c-Myc，Klf-4，Oct-4和Sox_2傳遞到新生人包皮成纖維細胞(NuFF)的蛋白質印記。
[0212]四個蛋白質的每個都具有9個精氨酸(9R)基團，從而促進吸收。裂解柱對應細胞蛋白質的內含物，將內含物洗滌並裂解，同時，soup柱對應介質環境中的蛋白質。3210顯示了使用10微米-4微米裝置向脾分離的樹突狀細胞傳遞太平洋藍標記的3KDa右旋糖苷和Alexa Fluor488標記的卵清蛋白的傳遞效率和存活率。所有的數據點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。
[0213]檢測向人成纖維細胞中傳遞四種示例性轉錄因子(0ct4、Sox2、c_Myc和Klf-4)的能力並將此能力與CPP方法的能力相比較(3200)。結果顯示，除了不依賴於胞吞作用(胞吞作用會使大多數材料被內含體捕獲)之外，由快速機械變形產生的傳遞對4種蛋白都產生明顯更高的傳遞效率。這一結果與前述此景作用相一致，結果顯示，與CPP相關的蛋白傳遞相比，本發明主題內容的傳遞效果好10-100倍。
[0214]樹突狀細胞(DC)的抗原呈遞是可以顯示本發明主題內容優勢的另一個領域。研究員已經開發了用於在樹突狀細胞MHC類I受體上表達抗原的方法，從而引入潛在的細胞毒性T細胞反應。本發明的主題內容具有直接的臨床應用，例如，依靠抗原蛋白質的細胞質傳遞製備癌症疫苗，這是由於MHC類I呈遞在細胞質蛋白中幾乎是不存在的。通過加速材料向細胞質中的直接傳遞，本發明主題內容可以用作一種平臺，產生對某一抗原的體內細胞毒性T細胞反應。為了說明這一能力，Alexa488標記的卵清蛋白作為模型抗原蛋白質被成功傳遞到來自於脾的鼠樹突狀細胞中(3210)。儘管在該細胞型中有較高的胞吞作用，但是與胞吞作用參照(Omm/s)相比，該裝置顯著的增加了傳遞效率。而且，根據細胞傳遞機制將傳遞材料傳遞到細胞質中，該特點對於抗原傳遞尤其重要，這是由於細胞質壓力對於呈遞MHC類I抗原是至關重要的。
[0215]實施例3的系統是一種可以實施的研究工具，該工具能夠傳遞碳納米管、金納米顆粒和抗原(圖31)-三種難以使用現有技術傳遞的材料。本發明主題內容通過促進活細胞結構/蛋白質的抗體和量子點染色，以及使碳納米管作為細胞質分子探針或者化學傳感器，顯著地擴大了探針進入細胞內方法的能力。作為一種魯棒的蛋白質傳遞方法，本發明的方法可以用作肽/蛋白質文庫的高通量篩選，這是由於，與大多數CPP或者納米顆粒基技術不同，本發明對蛋白質結構和化學不敏感，不依賴與胞吞途徑，不影響蛋白質的功能性。
[0216]另外，本發明主題內容可以有效用於治療(圖32)。例如，從血液或其他組織中分離病人的靶細胞，用本發明裝置處理傳遞理想的治療劑，然後重新引入人體。這種方法利用治療劑大分子增加的傳遞效率，並且由於不需要使用細胞毒性載體顆粒並且消除了潛在的與網狀內皮組織清除和脫靶點有關的副作用，本發明主題內容比現有的技術更加安全。
[0217]實施例4-個性化的癌症疫苗
[0218]目前大分子細胞內傳遞的挑戰在於不能更好的理解疾病機理和實施新型治療方式。儘管近期在傳遞技術上已經取得一些進展，但是對病人衍生的細胞處理還是存在挑戰，並且目前的方法通常依賴於有毒的電場或者外源物質。本發明的微流體平臺和有關的系統和方法依賴於細胞的機械變形來加速傳遞。這種受控制的物理方法為之前描述的挑戰領域提供答案，例如蛋白質基細胞再編碼和量子點傳遞。
[0219]影響細胞行為的最有效和最直接的方法是向細胞的細胞質中傳遞活性試劑。因此，大分子的細胞內傳遞在研究和發展中發揮著至關重要的作用，可以在從藥物傳遞到生物化學過程治療應用研究的範圍內使用。但是現有的方法具有局限性。他們通常在病人衍生(初級)細胞中具有較低的效率，依靠有毒的電場或者外源材料，並且不適用於傳遞結構多樣性材料，例如蛋白質。
[0220]魯棒的傳遞平臺能夠解決這些問題，並能夠在生物研究中帶來顯著地進步，可用作新一代治療劑(例如個性化癌症疫苗)的基礎。例如，向免疫細胞中有效傳遞蛋白質的方法可用作癌症疫苗平臺。
[0221]如上所述，這裡描述的微流體裝置、相關的系統和方法能夠通過快速使細胞通過收縮部分發生變形來加速材料向細胞內的傳遞。所述變形過程造成細胞膜的短時間破壞，因此使材料從周圍緩衝液中被動擴散到細胞質中。由於不需要現有技術方法所依賴的外源材料和電場，本發明方法提供了一種更簡單的魯棒的方法傳遞，產生更少的毒性。因此，該方法能夠用作一種廣泛的平臺進行大分子的細胞內傳遞，並在許多研究和臨床應用(例如，癌症疫苗)中帶來優勢。
[0222]圖34是一種系統示意圖，在此系統中，使用微流體裝置處理病人血液進行大分子傳遞。本發明主題內容的一個實施方案包括一種系統，其中從病人血液中分離的樹突狀細胞(DC)被該裝置處理，體外活化這些樹突狀細胞抵抗特定的癌症抗原並隨後，重新引入病人血液流中。例如，被傳遞的抗原是一種常見的表達抗原，已知與某一特定的基本有關或者與活組織檢查發現 的病人獨有的疾病有關。通過將癌症抗原直接傳遞到樹突狀細胞的細胞質中，本領域普通技術人員可以開發一種MHC-1類抗原呈遞途徑並向病人體內引入有力的細胞毒性T淋巴細胞反應。然後找出被活化的T細胞並破壞所有表達目標抗原的癌症細胞。該平臺可以靈活使用已有的、疾病特異性抗原或者直接從病人腫瘤中衍生出的抗原，這種靈活性使其能夠治療對其他治療劑有抵抗力的病人。事實上，這種方法提供了一種個性化的靶向疾病的反應並具有最小的副作用。這種實施方案可以在典型的醫院實驗室中由訓練有素的技師進行(治療前< I小時)。由於其較小的尺寸和相應的簡單性，還可以使用病人操縱的治療系統。
[0223]已經在鼠模型中顯示了癌症疫苗方法。這種系統被用於成功將卵清蛋白(模型蛋白)傳遞到鼠樹突狀細胞中並進行處理，並且被MHC類I受體上增加的抗原呈遞、SIINFEKL肽所證實。這些被治療的樹突狀細胞促進體外增殖性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。將處理後的樹突狀細胞重新引入動物體內產生體內CTL反應。該裝置可有效向來自人類血液的樹突狀細胞中傳遞抗原。
[0224]這些數據顯示,所述裝置能夠向敏感的初級細胞(包括樹突狀細胞)中傳遞材料，而不引起過多的細胞死亡。因此細胞破壞不是一個重要的問題。通過增加被處理的細胞數目，增加被傳遞的抗原數量he多樣性，和/或共傳遞活化因子(例如脂質聚糖)可以改善免疫反應。在使用本發明裝置處理的細胞中沒有觀察到細胞毒性或者只觀察到很少的細胞毒性，因此本發明不只可行還能夠有效用於治療人類和動物應用。
[0225]實施例5-血液癌症治療
[0226]如實施例4所述，細胞的快速機械變形能夠提高一種魯棒的向樹突狀細胞(DC)傳遞抗原的方法，並且因此可以作為細胞治療平臺。本系統基於一種發現，即細胞的快速機械形變會產生短時間的細胞膜小孔，使周圍培養基中的材料擴散性的傳遞到細胞中。與之前描述過的現有治療所不同，本發明方法不依賴於常規融合蛋白質、抗原交叉呈遞、病毒載體、納米顆粒或者胞吞作用；因此本發明能夠很大的改變體內效率同時減少治療劑消耗。這種基本上不同的方法的靈活性和簡單性為樹突狀細胞的活化提供了寬闊的平臺，所述樹突狀細胞的活化能誘導CD8對多種癌症抗原發生反應。該系統可以靶向血液癌症、例如B細胞淋巴瘤，這對免疫治療更加溫和，而且本系統還能夠靶向一些其他的癌症類型(例如黑素瘤、胰腺癌，等等)並提供一種重要的、個性化的新方法與這些疾病作鬥爭。
[0227]由於抗癌細胞治療法能夠活化病人的免疫系統並產生針對該疾病更為長久的抗原特異性CD8T-細胞反應，因此是一種有吸引力的選擇。相對於化學療法和輻射治療來講這些治療，例如最近獲準的用於治療前列腺癌的Provenge，具有最小的副作用。但是，通過將抗原傳遞到細胞質，發展細胞治療法的一個最大的障礙已經實現合適的抗原呈遞作用。
[0228]傳統上，⑶8效應子反應活化作用與⑶4反應的區別在於通過外源蛋白進入抗原遞呈細胞(例如樹突狀細胞)的位置不同。細胞質中發現的蛋白質誘導CD8反應而胞吞作用捕獲的細胞外蛋白質誘導CD4反應。由於抗原呈遞細胞的交叉呈遞機制是難以捉摸的，本領域技術人員必須研發一種可靠的方法將所需抗原直接傳遞到細胞質中從而利用有效的細胞毒素效應因子CD8反應促進治療。向樹突狀細胞的細胞質中傳遞的魯棒、有效的方法可以被用作一種平臺，誘導對各種癌症類型的免疫反應。
[0229]圖8A和圖11顯示了在HeLa細胞上的實驗，這些實驗顯示了細胞快速的機械變形會在細胞膜上產生短時間損傷/小孔，這能使周圍緩衝液中的材料被動擴散到細胞的細胞質中。這些之前未報到過的現象產生的細胞在處理後是存活的並且可以正常增殖。實現表明與較小的分子相比，較大的分子顯示較低的傳遞速率，因此顯示了擴散機制。使用共焦顯微鏡測定，成功的siRNA傳遞和擴散細胞質染色還表明被傳遞的材料處於細胞質中，並處於一種活性/可接近態。傳統上，傳遞抗原的方法通常在細胞系中可以實施但是不能被翻譯為初級免疫細胞。然而這裡描述的傳遞方法不依賴於胞吞作用途徑或者細胞對外源材料的反應(在不同的細胞型中有很大的差異)，而主要依賴於膜的雙層性質。因此，由於其簡單性和新型途徑，本發明的技術能夠更為平和的用於向各個細胞系和初級免疫細胞中傳遞，並且主要改善抗原呈遞作用。
[0230]根據卵清蛋白傳遞，通過抗體染色分析抗原的MHC I類呈遞和樹突狀細胞成熟。從OT-1和OT-1I TCR轉基因小鼠中收穫的T細胞還可以用於測定響應於卵清蛋白和/或SIINFEKL抗原裝載的CD8和CD4增殖作用。與只使用胞吞作用產生的樹突狀細胞注入相t匕，可以對系統進行優化從而增加CD8的增殖作用。
[0231]用MACS CDllc+分離器(miltenyi Biotec，德國)純化來自B6小鼠脾的初級鼠樹突狀細胞。一種裝置包括6微米通道寬度的收縮部分，該裝置能夠用於使13umHeLa細胞的細胞膜成孔。由於這些樹突狀細胞的尺寸較小，還可以利用通道寬度為3-5微米的微組裝和測試裝置。對現有的光刻印刷法和深活性離子蝕刻技術進行修飾使其能夠有效的生產這些裝置。可以使用螢光標記的右旋糖苷分子作為模型分子，通過FACS評價傳遞效率。隨後，使用卵清蛋白傳遞細胞並用蛋白質印跡實驗證實蛋白質被觸及細胞吸收。
[0232]使用CD80和CD86抗體染色檢驗樹突狀細胞成熟過程顯示本發明快速變形方法誘導細胞成熟。如果認為需要在傳遞後誘導樹突狀細胞成熟過程，可考慮利用細胞外TLR激動劑，例如脂多糖(LPS)。可以將卵清蛋白傳遞給樹突狀細胞，然後用MHC-TSIINFEKL抗體定量抗原呈遞。另外，根據TCR特異性肽的傳遞評價抗原呈遞效率，顯示系統傳遞/呈遞蛋白質或肽的能力。隨後，分別從TCR轉基因OT-1和OT-1I小鼠中收穫⑶8和⑶4T細胞，用CFSE染色並且與卵清蛋白處理的樹突狀細胞共培養5天。兩個子集的T細胞增殖都可以被FACS調節。對裝置設計進行優化從而與傳統的體外方法(例如胞吞作用)相比產生增加的功能性CD8細胞群體水平。
[0233]癌症細胞治療劑的一個目標是實現多方面誘導抗原特異性CD8反應的能力，迄今為止，由於現有傳遞 方法在呈遞抗原方面的低效性或者傳遞方法靈活性不足，所述癌症細胞治療劑被證明是難捉摸的。現有方法存在很多缺點，包括這些方法依賴於有損傷的電場、利用外源材料、蛋白序列修飾和/或胞吞作用途徑來促進抗原傳遞。然而本發明的主題內容提供了一種基本上不同的途徑進行細胞質傳遞，細胞質傳遞不需要受到上述任意一個問題。此外，由於成孔-擴散機理的性質，本發明的方法可以廣泛的用於多種抗原類型並且因此可以解決很多目標癌症。甚至可以使用相同的基質引入其他的信號分子，從而改善樹突狀細胞成熟/活化過程，產生更為有效的T細胞反應。這種廣泛應用的平臺是多用的，並且在作為癌症疫苗的調查中，比任何現有的抗原傳遞/呈遞機制更為魯棒。
[0234]實施例5影響廣泛。考慮到癌症在全國範圍內引起的巨大社會重擔(據估計，2011年美國有570，000死亡)；癌症可能折磨很大比例的人群。被折磨的人群受益於新型細胞治療劑的發展，新型細胞治療劑能夠開發病人免疫系統的效力使之與疾病作鬥爭。本發明主題內容是一種更為有效的、個性化的治療平臺，可以治療多種癌症類型，例如，血液癌症，比方說，白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤以及骨髓及外骨髓增殖的贅生物和脊髓發育不良綜合症。舉例來說，由於他們能夠通過血液循環，本方法尤其適用於治療轉移性癌症。例如，可以通過消化腫瘤活組織切片檢查樣品、將溶解產物傳遞到病人的樹突狀細胞中，然後在將此樹突狀細胞引入人體來治療具有未知抗原決定簇的癌症。這可以活化宿主體內針對多種癌症抗原的T細胞從而實現有效的多靶點治療。這些個性化的方面對患有罕見形式的癌症的人具有尤其重要的意義，由於曝光在惡劣的環境中，現有的治療方法難以治療這些人。通過對個體疾病定製治療方法，本發明方法可以提供及時地、有效的照顧，即使在最具侵略性的病例中，例如多重耐藥性癌症病例。這種基於免疫的治療還可以非常有效的預防轉移(癌症轉移造成90%的癌症相關死亡)，這是由於CD8T細胞可以容易的固定並且毀壞轉移性細胞，而本發明治療方法提供的免疫記憶可以用於預防未來的復發。另外，作為一種研究工具，本發明的方法開啟了抗原過程過程前所未有的機械研究，能夠更好的理解抗原交叉呈遞的過程並因此改善現有/作為替換的免疫活化方法的效率。
[0235]實施例6-細朐再編碼
[0236]幹細胞在目前的再生醫學研究中起到至關重要的作用，尤其在快速發展的組織工程設計領域。iPSCs具有自更新能力、可以分化成任意細胞類型並且具有自體同源性(病人特異性)，因此是更為感興趣的細胞。iPSCs有機會從多功能源中產生多系譜祖細胞，這可以結合成清晰但是相互作用的組織代謝區。此外，這些細胞最終會使人類胚胎幹細胞(hESCs)在臨床應用中不在被需要，從而避免了許多困擾這些細胞類型的道德和倫理上的爭論。而且，病人衍生的iPSC不會產生hESC衍生的免疫排異問題或者最小化hESC衍生的免疫排異問題。因此，目前的研究主要集中在設計有效的、無病毒的、產生大量iPSCs的方法。
[0237]最初，根據4種轉錄因子0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的逆病毒過表達，通過再編碼成年鼠和人成纖維細胞(HFs)到一種可塑性狀態產生iPSCs。這種iPSC不僅在整體基因表達、DNA甲基化和組蛋白修飾方面與ES細胞非常一致，而且還能夠分化成所有三個胚層。雖然iPSC技術在生物醫學研究和細胞基治療中具有巨大的潛力，但為了實現其全部能力必須克服一些主要障礙。例如，大多數iPSC細胞系來自於各種體細胞，通過逆病毒或者慢病毒引入編碼再 編碼因子的基因，病毒載體集合產生成倍的染色體分離，這些中的任意一個都會產生遺傳性功能障礙和/或腫瘤。另外，再編碼的轉基因(尤其是c-Myc和Klf4)與腫瘤發生密切相關，提高了其殘基表達和/或復活作用產生腫瘤的可能性。因此，最近許多實驗室開發了不同的基因組非整合方法，例如腺病毒、附著體載體、mRNAs和微RNA。值得注意地是，已經顯示通過直接將與細胞穿透肽(CPP)融合的四種再編碼因子(0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)直接傳遞產生iPSC。雖然已經報導了通過傳遞大腸桿菌表達的四種CPP融合因子可以產生鼠iPSC，但是據顯示，使用哺乳動物細胞表達的四種CPP融合因子可以產生人iPSC。然而，這些研究顯示蛋白質基再編碼的再編碼效率是非常低的(<0.01%)。由於蛋白質基的再編碼不包括任何類型的遺傳物質(DNA或者RNA)和載體媒介物(病毒或者質粒)，蛋白質的直接傳遞提供了一個最安全的再編碼過程。已經顯示，蛋白質基人iPSCs能夠有效的產生功能性多巴胺神經元，並且不會產生與病毒基因組集合有關的異常性質。使用本發明的傳遞平臺技術，本發明主題內容可以改善蛋白質基再編碼的效率，因此在很大程度上打開了產生臨床上可使用的iPS細胞的可能性。
[0238]而且，本方法能夠通過阻止控制mRNA、質粒和病毒重新編碼中的翻譯和/或轉錄的隨機過程更精確的控制細胞功能。因此，與其他作為替換的方法相比，直接蛋白質傳遞具有兩個基本優點，能夠去除誘變性插入的風險，並能夠更準確的控制高敏感度的再編碼過程。這裡描述的傳遞技術顯示了其以高效率向HF和幹細胞傳遞蛋白質的能力。進行實驗比較本發明技術與現有的細胞穿透肽方法的傳遞能力，實驗結果顯示使用本發明方法的傳遞能力顯著增加(根據模擬結果，傳遞能力可能增加100倍以上)。而且，其物理成孔機制不再需要進行化學修飾或者利用外源化合物，進行化學修飾或者利用外源化合物是其他作為替換的蛋白質傳遞方法所需要的。由於本方法對於被傳遞的材料是不可知論的，小分子、siRNA及其他因子還可以在重新編碼期間共同傳遞。因此，本系統提供了一種獨特的工具，通過直接蛋白質傳遞來誘導細胞重新編碼。這種簡單的作用機制(即，通過小孔擴散)還能使本領域技術人員可以較高準確度預計並控制傳遞量，從而促進最優化研究，改善對重新編碼動力學的理解，並因此極大的提高效率。最後，本領域技術人員可以將這種微流體技術用作醫療器械來產生iPSC，用於臨床組織設計和細胞治療應用。而且，該系統的應用不限於蛋白質傳遞。
[0239]這些技術可以被包括在一種通用的傳遞方法中，用於將大範圍的大分子(DNA、RNA、蛋白質、糖和肽)傳遞到幾乎所有細胞類型中。這能夠適用於所有現有技術使用的應用中。現有的脂質體、納米顆粒和電穿孔-基方法，例如，通常不能轉染某些初級細胞(例如，免疫細胞或者幹細胞)並且不能有效的傳遞蛋白質和納米顆粒(例如量子點)。本發明的新方法還可以傳遞肽，用於治療劑篩選和疾病機理應用，而目前的方法通常需要化學修飾或者密封。本領域技術人員還可以使用本發明的方法進行納米顆粒-基的傳感應用，從而傳遞修飾的量子點進行細胞器標記和機理性疾病研究。
[0240]細胞內傳遞是許多生物研究應用的基礎，包括基因表達原理研究、疾病機制研究，以及在本應用中解決的，iPSC的產生。已經建立的傳遞方法，例如脂質體、聚合納米顆粒和電穿孔方法常常涉及外源化合物用作傳遞工具(或者，對於電穿孔的情況來說是電場)，並且是材料和/或細胞特異性的。例如，Iipofectamine(Invitrogen)可以傳遞DNA和RNA分子(到細胞系子集或者初級細胞)，但是不能形成合適的複合物傳遞蛋白質或者其他大分子。另一方面，雖然電穿孔能夠靶向一系列細胞類型，但是由於電穿孔的高電場會破壞細胞，因此在蛋白質傳遞上的成就非常有限。例如，這使電穿孔非常不適合於iPSC產生過程中要求的多次轉染。膜 穿透肽是另一個主要針對蛋白質的傳遞技術。然而這些基於肽的方法對肽的功能具有不可預知的作用，並且在內涵體中經歷重要的蛋白質降解作用。因此，本發明主題內容描述了一種通用的方法，該方法能夠傳遞大範圍的大分子(DNA、RNA、蛋白質、肽、小分子)，並造成最小的細胞死亡，能夠史無前例的在一個技術平臺上控制細胞功能，從而研究疾病機理，識別大分子治療劑候選物、指導幹細胞的分化作用或者重新編碼，並且使用報導細胞系發展診斷技術。
[0241]這裡描述的微流體裝置可以作為一種廣泛應用的傳遞平臺。作為一種微流體裝置，本發明的裝置能夠精確的控制單個細胞水平的處理條件。既能夠進行單細胞水平的控制也能夠進行大規模處理量，這種特有的結合使本發明的裝置相對於現有傳遞方法處於一種獨有的位置。迄今為止，數據顯示本發明系統能夠向超過11種不同的細胞型中傳遞材料，包括癌細胞系、胚胎幹細胞、初級成纖維細胞和初級淋巴細胞。其機械成孔機制還能夠傳遞預先激發的材料，例如碳納米管和量子點。
[0242]之前的工作使用重組蛋白質產生iPSC，並顯示具有極低的效率(< 0.01% )因此不適用於廣泛的臨床應用。然而這裡提到的裝置、系統和方法顯示他們能夠直接傳遞蛋白質進入細胞質，並且具有較高的效率和最小的細胞死亡，因此通過更有效的傳遞提供了強制機會使重新編碼效率實質上提高。本領域技術人員可以通過直接確定有效蛋白的數量來準確的控制細胞內動力學。另一方面，其他的重新編碼方法(例如，病毒、質粒和mRNA表達)根據隨機效應確定蛋白有效性水平並因此不適於動力學研究。現有重新編碼方法的低效率表明這些過程對隨機變化具有較高的靈敏度並且只有很小範圍的轉錄因子表達水平進行重新編碼。通過直接將蛋白質傳遞到細胞質中，本領域技術人員可以準確的控制蛋白質的有效性並因此更均勻的使用重新編碼所需的具體條件。一旦識別並優化了這些條件，這些條件可以對每個經歷處理的細胞精確複製並因此顯著地改善重新編碼效率。
[0243] 該技術能夠改善多種細胞內傳遞應用。另外，本技術完全使用機械作用的性質因此消除了使用化學試劑或者電場所產生的潛在的複雜因素。數據沒有顯示處理後細胞行為發生任何實質上的變化。因此，本系統是一種魯棒的、高通量、高效率、通用的細胞內傳遞機制，並可以特定的用於重新編碼。
[0244]證據表明，細胞通過收縮部分時發生的快速變形能夠誘導細胞膜上短時間內產生小孔，允許大分子從周圍緩衝液中擴散進入細胞液。本技術已經在11中不同的細胞類型中使用過，包括癌細胞系、初級成纖維細胞、初級淋巴細胞和胚胎幹細胞(不產生分化作用)。一個原型能夠處理大約20，000細胞/秒並且可以處理一定範圍的細胞濃度(IO4-1O8個細胞/毫升)。通過改善實驗方案和晶片設計可以極大的緩解堵塞問題，因此每個裝置在堵塞之前能夠處理大約I百萬個細胞，並可以被清潔循環使用。另外，多通道設計提供了顯著的重複性因此一個通道的堵塞不會影響其他通道的性能。壓力驅動流動(在控制的恆壓下)並且通道的平行設計確保無論晶片中被堵塞的通路的百分比是多少，每個通道都具有均勻的流動曲線。
[0245]所述裝置已經顯示了一種能力，能夠將右旋糖苷分子傳遞到人成纖維細胞和胚胎幹細胞中。圖35顯示了細胞重新編碼的潛在優勢。在3500中顯示了被10微米-6微米裝置處理並傳遞3kDa右旋糖苷後的人胚胎幹細胞的傳遞效率和存活率。在3510，對使用細胞穿透肽向新生人成纖維細胞(NuFF)中傳遞的c-Myc，Klf-4, Oct-4和Sox_2和使用10微米-6微米裝置向新生人成纖維細胞(NuFF)中傳遞的c-Myc, Klf-4, Oct-4和Sox-2進行蛋白質印跡實驗。溶解產物(Ly)柱對應於細胞的蛋白質含量，所述細胞被洗滌並裂解，而顯影劑柱對應於培養基環境中的蛋白質含量。在3520中顯示了在傳遞了重新編碼因子後固定的新生人成纖維細胞(NuFF)的共焦顯微鏡圖像。使用Alexa488共軛的抗FLAG抗體標記所述蛋白質並用DAPI進行核染色。
[0246]而且，將本發明裝置的傳遞效率與目前用來進行蛋白質-基重新編碼的9個精氨酸(CPP)方法相比較。蛋白質印跡實驗結果(3510)顯示被傳遞的c-Myc,Klf4,0ct4和Sox2數量顯著增加。然後共焦顯微鏡檢查法證實這些轉錄因子被成功的固定在細胞核(3520)中。在COMSOL中開發一種簡單的2-D擴散模型,根據尚子從細胞質內外擴散的記載值來模擬傳遞機制。將此模型與實驗數據相擬合，據估計該技術能夠將緩衝液中存在的10-40%的傳遞材料傳遞到細胞質中。相比較而言，用於傳遞蛋白質的CPP方法只能將0.1%的緩衝液材料傳遞到細胞質中，因此，本方法有效的增加的被傳遞的重新編碼材料的量(10-100倍)。而且，確保被傳遞的轉錄因子具有更大的生物利用率。
[0247]圖36通過直接傳遞融合的重新編碼蛋白質顯示了小鼠和人iPSC細胞系的產生的定性。在3600，開始小鼠幹細胞培養(第一圖像)；在進行6個蛋白質治療處理之後的形態(第二圖像)；建立的iPS菌落(第三圖像)和對建立的iPS菌落進行AP染色(第四圖像)。3610顯示了 p-miPSC的ESC標記物免疫染色。用DAPI (藍色)對核染色。在3620中，對0ct4啟動子進行重亞硫酸鹽序列分析顯示p-miPSC-Ι和p-miPSC_2系中幾乎完成了所有次生的重新編碼。開環和閉環分別表示未甲醇化的和甲醇化的CpG。在3630，通過對免疫缺陷型小鼠注射p-miPSCs並對畸胎瘤進行H&E染色分析體內分化能力。所得的包括畸胎瘤的組織顯示所有三個胚層；外胚層(神經管或者表皮)、中胚層(軟骨或者肌肉)和內胚層(呼吸上皮或者腸狀上皮)系譜細胞。在3640，p-miPSC-l (左圖)衍生的嵌合體以及E13.5胎兒的p-miPSC-2(右圖)顯示注射的p-miPSCs中具有高水平的綠色螢光蛋白質(GFP)。在3650到3670，通過直接將CPP融合的四種重新編碼因子從人活組織切片成人的成纖維細胞(3650)中直接傳遞來產生人 iPSC 細胞系、p-hiPSC-01 (3660)和 p-hiPSC-02 (3670)。
[0248]圖37描述了初級蛋白質重新編碼結果。在3700中顯示了成纖維細胞向菌落的形態變化進展。白色箭頭表明潛在的重新編程細胞。紅色箭頭指向聯合iPSCs形成菌落。在3710到3760顯示了在iPSC菌落中表達人胚胎幹細胞標記物0ct4、SSEA-4、Tra_60、Tra-80、鹼性磷酸酶(AP)。在適當的時候，小方塊表示DAPI復染。標尺為100微米。
[0249]由於產生了蛋白質-基人iPSC並對其進行了定性，使用之前的CPP-融合的重新編碼因子生產進一步完全重新編碼的小鼠和人iPSC，然後用所有標準方法進行檢驗，包括次生分析、體內多能性和嵌合體形成(圖36)。然而，就算是使用部分純化的蛋白質，這種重新編碼的效率還是很低的(<0.1%)並且比病毒重新編碼方法花費的時間更長。因此，嘗試使用本發明裝置向人成纖維細胞中傳遞4種重新編碼蛋白質0ct4、Sox2、Klf4、和c_Myc,緩衝液濃度為80微克/毫升。將細胞處理4次，每次傳遞之間間隔48小時。在培養基中培養14-20小時之後，出現第一個重新編碼的hipSC-樣菌落。在這段時間內，由於形成了iPSC菌落並表達了一些hESC標記物，因此可以觀察到成纖維細胞形態上的變化。 [0250]內涵蛋白、細胞膜穴樣內陷和巨胞飲是三種最常見的胞吞內化作用機制。為了檢驗在快速細胞變形之後進行的大分子傳遞中是否涉及胞吞作用，可以使用已知的化學品阻擋這種機制。具體地說，可以使用氯丙嗪抑制內涵蛋白介導的胞吞作用；使用金雀異黃素(genisten)抑制細胞膜穴樣內陷介導的胞吞作用；以及使用5_(N_乙基-N-異丙基)阿米洛利(amirolide) (EIPA)抑制巨胞飲(所有都購自Sigma Aldrich公司)。在處理前,將HeLa細胞與氯丙嗪(10微克/毫升)、金雀異黃素(genisten) (200微摩)和EIPA (25微摩)一起培養2小時。然後對細胞進行快速變形處理，傳遞右旋糖苷、dsRED和dsRED-9R蛋白質。使用螢光激活細胞分類術測定各自的傳遞效率，這些傳遞效率解釋了胞吞抑制作用對CPP和基於裝置的傳遞機制的影響。用共焦顯微鏡檢查法，使用內含體標記物(InvitiOgen)進行共定位實驗，還可以幫助確定螯合進入內涵體中的材料百分比。
[0251]也可以將快速細胞變形系統與其他已經確定的傳遞方法(例如電穿孔)耦合，從而緩和胞吞作用機制。
[0252]收縮部分附近的結合電極可以與變形和電穿孔相耦合，使傳遞作用效率足夠產生與各個方法單獨使用時相比更高的系統性能。另外，可以與一些化學試劑(例如氯化喹啉(Sigma公司))、各種聚合物或者內涵體逃逸肽共傳遞，這種共傳遞可以用於幫助被傳遞的材料在快速細胞變形系統中進行內涵體逃逸。
[0253]隨著細胞穿過收縮部分，細胞經歷短暫的(大約10-100微秒)但是快速的剪切作用和壓縮作用。之前顯示弦向剪切力能夠誘導小孔形成。然而，該系統還誘導機械壓縮。為了評價這些參數，傳遞前，在0.1微克/毫升Lantrunculin A (Invitrogen公司)中培養HeLa細胞和HF細胞I小時使肌動蛋白細胞骨架解聚。
[0254]使用本發明快速變形裝置可以向被處理的細胞群中傳遞螢光標記的右旋糖苷(Invitrogen公司)。在處理前,在10微摩秋水仙鹼(Sigma)中培養細胞2小時解聚微管網絡，在此細胞中重複這些實驗。用螢光激活細胞分類術測定毒素處理的細胞相對於未處理的參照的傳遞效率。小孔形成被認為與細胞相應於給定的幾何形態的變形速率有關。預先用一種裝置研究細胞骨架在抵抗變形中的作用，所述裝置探試細胞變形性從而提供變形率的定量測量值。在此方法中，將電極放置在收縮部分的兩端，隨著細胞通過測定兩個電極之間的電容變化。然後該收縮部分之間的電容變化與細胞轉播時間(即，其形變形率)有關。在上述實驗中，這種裝置的傳遞情況與這些之前的變形研究有關，從而在變形率和成孔效率之間產生一種定量關係。
[0255]與已經公開的定性聲孔作用的研究類似，在處理後，在確定的時間間隔取樣，對固定的樣品進行掃描電子顯微鏡法(SEM)和透射電子顯微法(TEM)直接測量此時間內預計的小孔尺寸和分布。可以在室溫條件下，使用25%的戊二醛溶液(Sigma公司)固定細胞。然後在成像前對細胞樣品進行連續的乙醇洗滌使其脫水。使用環境SEM(ESEM)技術對固定的樣品直接成像。然而，由於這種技術的解析度相對較低(大約200納米)，因此適合於檢測1-0.5微米規格的形態變化或者損傷。如果ESEM不能檢測出任何形態變化，可以用真空蒸發器將該細胞塗布一層1-10納米後的金，從而將分辨度提高到納米規格，這是使用SEM直接觀察更精細的孔結構所需要的。如果SEM不能產生理想結果的話，還可以使用TEM作為替換性的成像技術。這些技術可以使本領域技術人員將局部損傷與傳遞的均勻成孔機制相區別，並測定平均孔徑和分布。將經歷快速細胞變形的細胞中的孔徑和分布與未被處理的細胞的相比較。細胞膜表面上局部的孔分布顯示了損傷模型，而更均勻的分布證實均勻的成孔模型。
[0256]使用COMSOL m ultiphysics軟體構造成孔細胞的三維模型。使用細胞質和緩衝液擴散率已經發表的數據，結合理論研究中得到的合適的孔徑模型，可以產生預計性的傳遞模型。該模型模擬多孔膜，將低擴散率細胞質與高擴散率緩衝區域分離開。在此模型的假設下，在再次密封之前，這些小孔在固定的時間內具有固定的尺寸。通過與MatLab或者其他軟體結合使用可以將動態小孔行為，例如形狀和直徑方面的變化，整合入複雜模型。使用螢光激活細胞分類術和凝膠電泳(例如蛋白質印跡實驗)獲得的實驗數據確定傳遞量的模擬預測。可以使用這些比較調整模型從而使其能夠預計被傳遞的材料的量。這種模型的預計能力可以模擬改變孔徑的作用、孔徑開啟時間的作用和緩衝濃度的作用，因此可以被用作未來科學的指導。
[0257]多物理場模擬(例如，COMSOL或者CFD-ACE)還可以被用於模擬液體通過該裝置的流動。可以使用這些模型更精確的預計流動速度和進口部分、出口部分以及收縮部分的剪切力。這些數據可以用於解釋剪切力和流動速度之間的聯繫，從而更有效的通過收縮部分傳遞。而且，通過構建該裝置更多的模型，可以研究不同通道之間的壓力分布並調整入口部分和出口部分的涉及，從而確保所有的通道在幾乎相同的條件下操作，以改善細胞群體受到的處理的均勻性。
[0258]首先，優化傳遞現象從而增加傳遞效率和細胞存活率。群體均勻性(即向每個細胞傳遞類似量的材料)可以被用作次級優化參數。最初的結果識別出細胞速度、收縮部分長度、收縮部分寬度以及入口部分形狀是敏感的參數。另一方面，培養基組成仿佛不是一個主要因素。可以構建一系列裝置從而系統性改變收縮部分長度和寬度分別至5-50微米和4-8微米。可以使用不同的斜角形成狹窄的收縮部分。螢光激活細胞分類術測定的這些裝置的實驗效率和存活率與上述模型數據有關，從而更好的理解剪切力和收縮部分尺寸的作用。對不同的細胞系重複此過程，不同的細胞系可能對處理的反應不同。該數據可被用於研發具有最有幾何結構和操作參數的裝置，進行特定的細胞(或者特定的細胞子集)傳遞。
[0259]圖38的顯微照片說明了作為選擇的裝置結構。明場顯微照片顯示了將收縮部分和電極結合的準備工作(刻度尺是30微米)。如圖38所述，通過將快速變形現象與電穿孔相耦合來修飾裝置。通過光刻法印刷法和金沉澱法將金電極整合在收縮部分的兩邊，從而向通路中引入局部電場。後續實驗可以確定操作參數值(電場強度、頻率和操作速度)，從而使本發明方法具有改善的性能。本領域技術人員將兩個獨立的成孔機制耦合可以更精確的控制系統並變換多個參數對每種細胞類型都實現最佳的系統性能。
[0260]另外，電場可以被用作驅動力來傳遞較大的帶電分子(例如DNA)，所述較大的帶電分子具有較低的擴散速率。可以為潛在的合作者提供適於使用的可流水線生產的並易於處理的系統版本。使用聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯的注入制模或者熱壓印法提供基於聚合物的裝置。隨後，降低的成本能夠使這些裝置用作可隨意處置的工具，從而改善無菌效果並易於使用。另外，通過簡化管道連接、系統安裝和設置壓力調節器可以提供易於使用的系統。
[0261]將成纖維細胞基於蛋白質的重新編碼入iPS細胞中，並研究重新編碼的參數空間的最佳值。上述研究表示通過將CPP融合的重新編碼因子從人和小鼠組織(圖36)中直接傳遞，可以產生iPSC，並且表明這些蛋白質-1PSC可以分化成功能性細胞(例如，多巴胺神經元)，並且不會產生與病毒iPSC有關的異常表型。然而，由於培養基中許多因子(包括蛋白質)會發生降解作用，不能傳遞，並且由於細胞內含體中的降解，直接蛋白質傳遞的重新編碼效率也非常低(< 0.01% )不適於任何實際應用。通過有效的直接將蛋白質傳遞到細胞質中，這裡描述的微流體裝置可以顯著的增加基於蛋白質的重新編碼效率，從而避免游離蛋白質或者裝入膠囊中的蛋白質傳遞方法常常會遇到的惡劣的體內環境和繁重的內逃逸過程。
[0262]使用微流體基傳遞方法可以加速人iPSC的產生。所述裝置可用於向胚胎人成纖維細胞(HF)中傳遞4個重新編碼蛋白質中的一種或者一種以上(c-Myc (蛋白質，Genbank登記號:NP_002458.2 ；DNA, Genbank 登記號:NM_002467.4)、Klf4(蛋白質，Genbank 登記號:AAH30811.1 ；DNA, Genbank 登記號:NM_004235.4)，0ct4(蛋白質，Genbank 登記號:ADW77326.1 ；DNA, Genbank 登記號:HQ122675.1)，和 SoX2 (蛋白質，Genbank 登記號:NP_003097.1 ；DNA, Genbank 登記號:NM_003106.3)。除了 Yamanaka 四種因子之外(MK0S 是 c-Myc-Klf4-0ct4-SoX2)，一些其他的因子(例如，Lin28(蛋白質，Genbank 登記號:AAH28566.1 ；DNA, Genbank 登記號:NM_024674.4)和 Nanog (蛋白質，Genbank 登記號:AAP49529.1 ；D NA, Genbank 登記號:NM_024865.2)，Esrrb (蛋白質，Genbank 登記號:AAI31518.1 ；DNA, Genbank 登記號:NM_004452.3)，Glisl(蛋白質，Genbank 登記號:NP_671726.2 ；DNA, Genbank 登記號:ΝΜ_147193.2)，和 PRDM44(蛋白質，Genbank 登記號:NP_078780.1 ；DNA, Genbank登記號:ΝΜ_024504.3)以及被識別出能夠提高重新編碼效率。已經充分證明6種因子(MK0S+Lin28和Nanog ；MK0SLN)的哺乳動物表達和提純，並使用報導實驗證實各個因子的生物活性。這些因子可以在大腸桿菌或者哺乳動物細胞中表達。由於大腸桿菌表達的蛋白質缺少後翻譯修飾(例如，磷酸化作用、乙醯化作用和泛素化(ubiquitination))，在哺乳動物細胞(HEK293和cHO)中表達後，可以使用純化的蛋白質。大腸桿菌表達的蛋白質(可以從Stemgent (劍橋，麻省)公司商業上購得)可以用作對比。首先，通過轉染在HEK293細胞中表達的FLAG標記的重新編碼因子可以被重新懸浮在NP40細胞溶解緩衝液中，所述緩衝液包括50mM Tris-HCl，pH值為7.4,250mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸，1% NP-40和蛋白酶抑制劑。離心之後，用平衡的抗FLAGM2瓊脂糖親合凝膠加入收集的可溶部分。用磷酸緩衝液洗滌兩次，加入0.1毫克/毫升FLAG肽(Sigma)洗提所得的FLAG標記蛋白質。
[0263]人成纖維細胞和4或者6個純化的蛋白質的懸浮溶液可以被用於該裝置，並且將被處理的細胞放置於塗布0.1 %明膠並含有調節的hESC培養基的平皿中，培養1、2或3天，隨後進行下一次傳遞循環。在使用本發明微流體裝置重複進行蛋白質傳遞循環(6-16次)後，將被處理的細胞放置在使 用絲裂黴素C處理的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中，並在常規hESC培養基中生長3-4周。在MEF上接種3周後可以觀察到IPSC菌落。產生iPSC的效率可以與使用最初的CPP-融合重組蛋白質進行蛋白質傳遞的效率相比較。如之前所述，按照所有可靠iPSC標準徹底檢查這些iPSC候選物，所述標準包括分子和細胞性質，以及體外和體內多能性。使用4或6種因子會產生具有改善效率的iPSC系。還可以進一步的表達其他因子，例如Esrrb、Glisl和PRDM14，並且在重新編碼實驗中使用這些因子。
[0264]重新編碼的蛋白質和mRNA和/或微RNA可以結合傳遞。所述微流體裝置不僅可以被用於傳遞蛋白質，還可以用於傳遞其他大分子。為了利用這種獨特的性質進行最優的非基因組統一重新編碼，可以結合使用重新編碼因子和信使RNA和/或微RNA。尤其是，只使用微RNA就可以成功的產生iPSC系，這一點非常有意義。實際上，基於Iipofectamine的微RNA轉染可以產生iPSC-樣菌落。由於與重新編碼因子相比，微RNA可能在不同的機制中誘導重新編碼，因此通過本發明微流體裝置將重新編碼蛋白質和微RNA適當的結合在一起，可以進一步提高重新編碼效率。蛋白質和mRNA的結合傳遞能夠顯著的促進重新編碼效率。因此，使用本發明的微流體裝置能夠傳遞最佳結合的蛋白質、mRNA、和/或微RNA。雖然微RNA/mRNA不能提供與蛋白質相等水平的參照，但是本發明裝置的高通量最優化研究能力相對於之前的方法效率具有顯著的增加。
[0265]本發明微流體裝置的獨特性質能夠傳遞各種量的因子，以一種受控制的並可重複的方式。本發明主題內容的優化可以促進一種可靠的、高效的工具的發展，用於將蛋白質傳遞入HF。這可以解釋每種重新編碼因子的最佳傳遞量和頻率。與mRNA、質粒或者病毒方法所不同，本發明系統不依賴於基因表達和/或翻譯的隨機性質來確定轉錄因子的有效細胞內濃度。因此，該裝置能直接將蛋白質傳遞到細胞質中，並將其放置在獨特的位置來精確控制細胞內環境。可以進行一系列傳遞計劃來改變處理頻率(每天一次、每兩天I次或者每3天一次)以及分別改變四個因子每個的蛋白質濃度。尤其是，一些報告顯示高水平的0ct4對於有效的重新編碼非常重要，可以使用不同濃度的0ct4檢測該作用同時保持其他因子的濃度相同。對給定的細胞型評價不同濃度的c-Myc，這是因為在某些情況下已經發現高濃度的c-Myc會產生大多數轉化菌落而不是iPSC。而且，可以檢測更頻繁的處理c-Myc的作用，這是由於在適當的濃度下c-Myc具有非常短的半衰期(大約30分)。
[0266]使用這裡描述的方法促進重新編碼因子短暫處理的優化。每個因子都具有功能作用並且參與重新編碼過程。在至少一個和有些情況下，需要結合這些因子實現理想的重新編碼結果。例如，c-Myc已知能夠抑制分化基因的表達。另外，Klf4已知抑制微RNA let-7,微RNA let-7與分化作用途徑和多能性抑制作用有關。因此，在初始時，根據次最佳條件處理c-Myc和/或Klf4可以暫時調節重新編碼作用。另外，雖然iPSC的產生不需要Nanog，但是本領域已知Nanog對於多能性的最終確定和保持是十分重要的。因此，可以檢測在重新編碼過程末期增加Nanog的作用。而且，檢測連續處理的微RNA和蛋白質並比較各個處理方法之間和同時使用這些處理方法之後的重新編碼效率。由於本發明微流體裝置獨特的性質，所述暫時調節的重新編碼作用是可以實現的，並且對於進一步優化蛋白質的重新編碼是十分重要的。通過將第28天的菌落數除以被處理的HF細胞數來計算重新編碼效率。一旦完成，使用回歸分析推導每個重新編碼因子、其最佳濃度、最佳傳遞頻率/時間的相對重要性，和因此而得到的產生iPSC的最佳方案。每個因子控制傳遞到每個細胞中的蛋白質數量和時間的能力闡明了每個因子在重新編碼過程中的功能顯著性，因此進一步提高了對細胞重新編碼過程和多能性建立的了解。另外，該工作的結果可用於進一步改善裝置設計從而滿足重新編碼的具體需要並最終發展成臨床使用的版本。
[0267]如上所述，使用優化的蛋白質重新編碼方法，本發明方案通常可以被用於病人特異性成人成纖維細胞。由於ESC和iPSC可以有效分化成功能性多巴胺神經元並且以及研究了其移植作用，因此可以從來源於帕金森病人的人成纖維細胞中產生iPSC或iPSC細胞系。一旦產生了 IPSC細胞系並對其定性，這種細胞可以被誘導分化成多巴胺神經元並表徵其細胞、分子、生理學 和電生理學性質。在移植入帕金森氏病動物模型(例如遺傳性ro模型或者aphakia小鼠)之後，在體內檢測多巴胺神經元的功能性。
[0268]基於微流體的蛋白質傳遞可以被用於直接細胞轉化，例如，直接將成纖維細胞轉化成其他細胞類型，例如功能性神經元、肝細胞和血細胞。過去，使用關鍵轉錄因子的病毒表達的操作方法造成重要的染色體分裂和基因突變，從而使開發非病毒、基因組非整合轉化方法的需要更加顯著，例如在這裡描述的直接蛋白質傳遞方法。因此，該裝置可以用基於微流體系統的蛋白質傳遞進行直接細胞轉化。由於有時，某些轉錄因子的哺乳動物表達被激發，使之更易於使用一個或兩個蛋白質因子進行檢驗。然後，有可能使用單個因子(例如，0ct4或者Sox2)將成纖維細胞轉化為另一個細胞歷程,從而分別產生血液或者神經前體。這些蛋白質在純化的形式更易於應用，用於通過基於微流體的蛋白質傳遞進行細胞轉化。
[0269]圖44是條形圖，使用本發明微流體裝置和相關方法對活性siRNA序列和被攪亂的參照進行處理48小時之後，測定綠色螢光蛋白質(GFP)強度，顯示了 HESC中的綠色螢光蛋白質(GFP)抑制作用。圖45A和圖45B顯示了在傳遞了 3kDa藍染料之後的染料強度和人胚胎幹細胞的存活率。
[0270]其他的實施方案也包括在本發明的範圍和精神內。例如，由於軟體的性質，上述功能可以使用軟體、硬體、作業系統、有線通信系統或者任何這些的結合來實施。特徵實施功能也可以物理上位於各個位置，包括被分配的位置，因此所述功能可以在不同的物理地點實施。[0271]請注意一個或者一個以上的參考文獻通過引證在此併入本文。如果任何被併入本文的材料與本發明的公開不一致，則以本發明的公開為準。而且，在需要的情況下，被併入本文的材料應該被忽視從而保證本發明權利要求的準確性。
[0272]而且，儘管 上面對本發明進行了描述，所述描述可以包括不止一個發明。
【權利要求】
1.一種能夠造成細胞膜擾動的微流體系統，該系統包括定義腔室的微流體通道，該通道被設置使得懸浮在緩衝液中的細胞可從其中穿過，其中，所述微流體通道包括一種使細胞變形的收縮部分，其中，該收縮部分的直徑為細胞直徑的函數。
2.根據權利要求1所述的微流體系統，其中，所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99%。
3.根據權利要求2所述的微流體系統，其中，所述收縮部分的直徑基本上是從其中通過的細胞直徑的60%。
4.根據權利要求1所述的微流體系統，其中，選擇所述收縮部分的直徑使其能夠誘導細胞壁發生足夠大的短時間擾動，從而使有效載荷通過。
5.根據權利要求4所述的微流體系統，其中，也可以通過選擇收縮部分的直徑來減少細胞由於變 形導致死亡的可能性。
6.根據權利要求1所述的微流體系統，其中，所述通道的橫切面選自如下所組成的組中:圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。
7.根據權利要求1所述的微流體系統，其中，所述收縮部分包括入口部分、中心點和出口部分。
8.根據權利要求7所述的微流體系統，其中，所述入口部分定義了收縮角度，其中所述收縮角度被最優化從而減少通道堵塞。
9.根據權利要求7所述的微流體系統，其中，所述入口部分定義了收縮角度，其中所述收縮角度被最優化從而改善傳遞和細胞存活率。
10.根據權利要求7所述的微流體系統，其中，所述入口部分定義了90度的收縮部分角度。
11.根據權利要求1所述的微流體系統，進一步包括一系列串聯或者平行排列的微流體通道。
12.根據權利要求1所述的微流體系統，進一步包括一種細胞驅動器。
13.根據權利要求12所述的微流體系統，其中，所述細胞驅動器選自由以下所組成的的組中:壓力泵、氣瓶、壓縮機、真空泵、注射器、注射泵、蠕動泵、手動注射器、移液管、活塞、毛細管驅動和重力。
14.根據權利要求1所述的微流體系統，其中，懸浮在緩衝液中的細胞液體流引導至收縮部分，所述收縮部分的直徑大於從其中通過的細胞的直徑，從而使細胞被液體流預壓縮。
15.—種將化合物或者組合物遞送至細胞中的方法,所述方法包括: 在懸浮溶液中提供一種細胞； 使溶液通過一種微流體通道，所述微流體通道包括使細胞變形的收縮部分； 使細胞通過收縮部分從而對細胞施加壓力，造成足夠大的細胞擾動，允許有效載荷通過；和 細胞通過收縮部分後，在包含有效載荷的溶液中使細胞培養一段預定的時間。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的 20-99%。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述收縮部分的直徑基本上是從其中通過的細胞直徑的60%。
18.根據權利要求15所述的方法，其中，所述通道的橫切面選自如下所組成的組中:圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。
19.根據權利要求15所述的方法，其中，使溶液通過包括使溶液通過收縮部分的入口部分、中心點和出口部分。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，進一步包括通過調整入口部分的收縮角度減少微流體通道的堵塞。
21.根據權利要求19所述的方法，其中，進一步包括通過調整入口部分的收縮角度改善傳遞和細胞存活率。
22.根據權利要求19所述的方法，進一步包括將入口部分的收縮部分角度調整為90 度。
23.根據權利要求15所述的方法，其中，使溶液通過包括使溶液通過一系列經串聯或者並聯排列的微流體通道。
24.根據權利要求15所述的方法，其中，培養包括培養細胞0.0001秒到20分鐘。
25.根據權利要求15所述的方法，其中，使細胞通過收縮部分包括使懸浮在緩衝液中的液體流導入所述收縮部分，所述收縮部分的直徑比從其中穿過的細胞的直徑要大，從而使細胞被液體流預壓縮。
26.根據權利要求15所述的方法，其中，所述壓力是剪切力和壓縮力中的一種。
27.一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括: 將細胞懸浮在溶液中， 使溶液通過一種微流體通道，所述微流體通道包括使細胞變形的收縮部分； 收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數； 使細胞通過收縮部分從而對細胞施加壓力，造成細胞擾動；和細胞通過收縮部分後，在包含有效載荷的溶液中使細胞培養一段被預設的時間，其中，所述細胞擾動足夠大從而使有效載荷通過。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，其中，所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99%。
29.根據權利要求28所述的方法，其中，所述收縮部分的直徑基本上是從其中通過的細胞直徑的60%。
30.根據權利要求27所述的方法，其中，所述通道的橫切面選自如下所組成的組中:圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。
31.根據權利要求27所述的方法，其中，使溶液通過包括使溶液通過收縮部分的入口部分、中心點和出口部分。
32.根據權利要求31所述的方法，進一步包括通過調整入口部分的收縮角度減少微流體通道的堵塞。
33.根據權利要求31所述的方法，其中，進一步包括通過調整入口部分的收縮角度改善傳遞和細胞存活率。
34.根據權利要求31所述的方法，進一步包括將入口部分的收縮部分角度調整為90度。
35.根據權利要求27所述的方法，其中，使溶液通過包括使溶液通過一系列經串聯或者並聯排列的微流體通道。
36.根據權利要求27所述的方法，其中，培養包括培養細胞0.0OOl秒到20分鐘。
37.根據權利要求27所述的方法，其中，所述培養包括培養細胞超過0.0001秒。
38.根據權利要求27所述的方法，其中，所述壓力是剪切力和壓縮力中的一種。
39.一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括: 在溶液中提供一種細胞； 使細胞變形從而在細胞膜上產生擾動；並且 細胞變形後，在含有有效載荷的溶液中培養細胞。
40.根據權利要求39所述的方法，其中，使細胞變形包括使細胞變形I微秒到I毫秒。
41.根據權利要求39所述的方法，其中，所述培養進行0.0001秒到20分鐘。
42.一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括: 提供細胞和有效載荷的懸浮物到溶液中，從而產生一種懸浮液； 使懸浮液通過微流體通道，所述微流體通道被設置為使細胞發生突然和短時間的變形；並在突然和短時間變形後將細胞在懸浮液中培養預定的時間。
43.根據權利要求42所述的方法，其中，使懸浮液通過微流體通道包括:使懸浮液通過微流體通道中的收縮部分；並且收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數。
44.根據權利要求42所述的方法，其中，所述收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數包括設計收縮部分的尺寸使收縮部分的直徑是細胞直徑的20-99%.
45.根據權利要求42所述的方法，其中，使懸浮液通過微流體通道包括:使細胞基本上變形I微秒到I毫秒。
46.一種微流體系統，其與懸浮在溶液中的細胞一起應用並且用於在細胞膜上產生擾動，所述系統包括:一種被配置成能夠造成細胞膜擾動的系統，該系統被配置成能夠通過向細胞施加力使細胞發生突然和短時間的變形，其中，所述擾動足夠大從而允許有效載荷穿過。
47.根據權利要求46所述的微流體系統，其中，所述系統被配置用於通過使用溶合時產生的流體剪切力使細胞發生突然和短時間的變形。
48.根據權利要求46所述的微流體系統，其中，所述系統被配置為通過使用多個微柱使細胞發生突然和短時間的變形。
49.根據權利要求48所述的微流體系統，其中，將所述微柱配置為一種陣列。
50.根據權利要求46所述的微流體系統，其中，所述系統被配置為使用一個或者一個以上可移除的平板使細胞發生突然和短時間的變形。
51.根據權利要求46所述的微流體系統，其中，所述系統被配置為使用大塊材料使細胞發生突然和短時間的變形。
52.根據權利要求46所述的微流體系統，其中，所述系統被配置成使細胞直徑變形成未變形細胞直徑的20-99%。
53.根據權利要求46所述的微流體系統，其中，所述系統被配置成使細胞變形I微秒至I毫秒。
54.根據權利要求15-45中任意一項所述的方法,其中，所述方法用於將DNA、RNA>siRNA或蛋白質傳遞到初級成纖維細胞和幹細胞中進行細胞重新編碼。
55.根據權利要求15-45中任意一項所述的方法，其中，所述方法用於將抗原或者RNA傳遞到初級免疫細胞中。
56.根據權利要求15-45中任意一項所述的方法，其中，所述方法用於將量子點和碳納米管中的至少一個傳遞到靶細胞中對靶細胞成像。
57.根據權利要求15-45中任意一項所述的方法，其中，所述方法用於將藥物傳遞到靶細胞中，並且，其中，所述靶細胞使腫瘤細胞。
58.一種用於將有效載荷傳遞到靶細胞中的方法，該方法包括: 使靶細胞變形從而在靶細胞的細胞膜上產生一個或者一個以上短時間的小孔，所述一個或者一個以上短時間的孔足夠大使有效載荷通過，並且 在含有有效載荷的溶液中將細胞培養一段被預設的時間；其中，所述變形被機械力或者剪切力誘導。
59.一種用於將有效 載荷傳遞到多個靶細胞中的方法，該方法包括: 提供多個靶細胞到懸浮液中； 使包括多個靶細胞的溶液通過多個微流體通道，每個通道包括至少一個使細胞變形的收縮部分，從而誘導每個靶細胞變形，從而產生足夠大的擾動允許有效載荷通過；以及 在細胞通過通道後，使所述多個靶細胞在溶液中培養一段預定時間。
【文檔編號】C12M3/00GK103987836SQ201280060689
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年10月17日 優先權日:2011年10月17日
【發明者】A·沙瑞, A·亞當姆, R·蘭格, K·F·延森 申請人:麻省理工學院