經修飾的人類生長激素的製作方法

2023-06-16 23:38:36 6

專利名稱：經修飾的人類生長激素的製作方法
技術領域：
本發明涉及經至少一個非天然編碼的胺基酸修飾的生長激素多肽。
背景技術：
生長激素(GH)超基因家族(Bazan，F.Immunology Today 11350-354(1990)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Ihle，J.N.(1996)SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINERECEPTORS)代表一組具有類似結構特徵的蛋白質。此蛋白質家族中的每個成員皆包含一個四螺旋束，在圖1中顯示其一般結構。雖然在此家族中仍有較多成員有待於鑑別，但是其中的一些成員包括以下蛋白質生長激素、催乳激素、胎盤催乳質、促紅細胞生成素(EPO)、血栓形成素(TPO)、白細胞間介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亞單位)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫狀神經營養因子、白血病抑制因子、α幹擾素、β幹擾素、γ幹擾素、ω幹擾素、τ幹擾素、ε幹擾素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和心肌營養素-1(CT-1)(「GH超基因家族」)。儘管GH超基因家族的成員一般具有有限的胺基酸或DNA序列一致性，但它們具有類似的二級和三級結構。共有的結構特徵使基因家族的新成員容易被鑑別。在圖2、圖3、圖4和圖5中分別顯示家族成員hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的一般結構。
人類生長激素(hGH)為GH超基因家族成員之一。人類生長激素參與正常人類生長發育的許多調節。此種天然存在的單鏈垂體激素由191個胺基酸殘基組成且具有約22kDa的分子量。hGH展現眾多生物效應，尤其包括線性生長(體質形成，somatogenesis)、泌乳、巨噬細胞的活化以及類胰島素效應和致糖尿病效應(Chawla，R.等人，Ann.Rev.Med.34519-547(1983)；Isaksson，O.等人，Ann.Rev.Physiol，47483-499(1985)；Hughes，J.與Friesen，H.，Ann.Rev.Physiol，47469-482(1985))。
hGH的結構已為我們所熟知(Goeddel，D.等人，Nature 281544-548(1979))，並且已通過X射線結晶學求解出hGH的三維結構(de Vos，A.等人，Science 255306-312(1992))。所述蛋白質具有緊湊的球狀結構，包含四個兩親α螺旋束，其被稱為自N端開始的由環連接的A-D。hGH還含有四個半胱氨酸殘基，其參與形成兩個分子內二硫鍵C53與C165配對且C182與C189配對。此激素不被糖基化且已在大腸桿菌(E.coli)中以分泌型表達(Chang，C等人，Gene 55189-196(1987))。
許多天然存在的hGH突變體已得以鑑別。這些突變體包括hGH-V(Seeburg，DNA1239(1982)；美國專利第4,446,235號、第4,670,393號和第4,665,180號，其以引用的方式併入本文中)和含有hGH的殘基32-46的缺失的20-kDa hGH(Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta 925314(1987)；Lewis，U.等人，J. Biol.Chem.，2532679-2687(1978))。此外，已經報導由轉錄後、翻譯後、分泌、代謝加工和其它生理過程產生的眾多hGH變異體(Baumann，G.，Endocrine Reviews 12424(1991))。
hGH的生物效應源自其與特定細胞受體的相互作用。此激素為包括胎盤催乳質和催乳激素的同源蛋白質的家族成員。然而，在家族成員之中，hGH為不尋常的，原因在於它呈現廣泛的種特異性且與經克隆的體因性(somatogenic)受體(Leung，D.等人，Nature330537-543(1987))或催乳激素受體(Boutin，J.等人，Cell 5369-77(1988))相結合。基於結構和生物化學研究，已經提出催乳結合域和體因性結合域的功能圖(Cunningham，B.與Wells，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.883407(1991))。hGH受體為造血/細胞因子/生長因子受體家族的成員，所述家族包括一些其它生長因子受體，諸如，白細胞間介素(IL)-3、白細胞間介素-4和白細胞間介素-6受體、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)受體、促紅細胞生成素(EPO)受體以及G-CSF受體。參見，Bazan，Proc.Natl.Acad.SciUSA 876934-6938(1990)。細胞因子受體家族的成員含有四個保守的半胱氨酸殘基和色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸基序，其剛好位於跨膜區外。保守序列被認為與蛋白質之間的相互作用有關，參見，例如，Chiba等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.184485-490(1992)。hGH與其受體(hGHbp)胞外域之間的相互作用為最為良好理解的激素-受體相互作用之一。高解析度X射線結晶數據(Cunningham，B.等人，Science，254821-825(1991))已經顯示，hGH具有兩個受體結合部位且使用分子上的獨特部位依序地與兩個受體分子相結合。將兩個受體結合部位稱為部位I與部位II。部位I包括螺旋D的羧基末端和螺旋A的部分以及A-B環，而部位II涵蓋螺旋A的氨基端區和一部分螺旋C。GH與其受體的結合以部位I首先結合而依序發生。接著，部位II嚙合第二GH受體，導致受體二聚和引起對激素產生細胞反應的細胞內信號傳遞路徑的活化。已將G120R取代引入部位II中的hGH突變蛋白能與單個hGH受體結合，但不能使兩個受體發生二聚化。突變蛋白估計可能通過佔據受體部位但不使細胞內信號傳遞路徑活化而在體外充當hGH拮抗劑(Fuh，G.等人，Science 2561677-1680(1992))。
重組hGH被用作治療劑且已得到批准用於治療許多適應症。hGH缺乏會導致(例如)侏儒症，此病症已經通過激素的外源性投藥而得到十多年的成功治療。除hGH缺乏以外，hGH還已被批准用於治療腎衰竭(在兒童中)、特納氏綜合症(Turner′s Syndrome)和AIDS患者的惡病質。近期，食品和藥物管理局(FDA)已批准將hGH用於治療非GH依賴性身材矮小。目前也正在對hGH用於治療老年人的老齡化、虛弱、短腸綜合症和充血性心力衰竭進行調查研究。hGH治療的靶向群體包括患有特發性身材矮小(ISS)的兒童和具有類GHD症狀的成年人。
目前，重組hGH是作為日用可注射產品來出售，其中目前市場上有五種主要產品HumatropeTM(Eli Lilly Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)。然而，使用生長激素作為治療劑的重大挑戰是，蛋白質在活體內的半衰期短，且因此它必須通過每日的皮下注射來投予以獲得最大療效(MacGillivray 等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.811806-1809(1996))。大量努力集中於通過降低生產成本、使將藥投予患者更容易、改善功效和安全性概況以及產生將提供競爭性優勢的其它性質來改善hGH促效劑和拮抗劑的投藥的方法上。舉例而言，Genentech與Alkermes以前出售Nutropin DepotTM，一種hGH的儲庫型(depot)配方，其用於兒科生長激素缺乏症。雖然儲庫型配方允許較低頻率的投藥(每2-3周一次而非每日一次)，但它也伴有諸如生物利用率下降和注射部位處疼痛的不良副作用，並於2004年被撤出市場。近期，另一種產品PegvisomantTM(Pfizer)也已得到FDA的批准。PegvisomantTM為hGH的基因工程化類似物，它起著被指示用於治療肢端肥大症的高選擇性生長激素受體拮抗劑的作用(van der Lely等人，The Lancet 3581754-1759(2001))。儘管PegvisomantTM中的一些胺基酸側鏈殘基用聚乙二醇(PEG)聚合物得到衍生，但所述產品仍要每日投予一次，此表明藥劑學性質不為最佳的。除聚乙二醇化和儲庫型配方之外，包括hGH吸入劑型和口服劑型的其它投藥途徑正處於臨床前和臨床研製的早期階段，且均尚未獲得FDA的批准。因此，對展現生長激素活性但也提供較長血清半衰期以及(因而)更好的hGH最佳治療水平和增長的治療半衰期的多肽存在需求。
親水性聚合物聚(乙二醇)(簡寫為PEG)的共價連接為一種增加包括蛋白質、肽的許多生物學活性分子，且尤其為疏水性分子的水溶性、生物可用性，增加其血清半衰期，增加其治療半衰期，調節其免疫原性，調節其生物活性或延長其循環時間的方法。已將PEG廣泛地用於藥品中，用在人工移植物上，且用於其中生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性為很重要的其它應用中。為使PEG的所要性質最佳化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態必須足夠高，以賦予通常與PEG聚合物連接有關的有利特性(諸如，增加的水溶性和循環半衰期)，同時不會對母體分子的生物活性產生不利影響。
PEG衍生物常常通過反應性化學官能團(諸如，賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基)、N端和碳水化合物部分連接於生物活性分子。蛋白質和其它分子常具有可用於聚合物連接的有限數量的反應性部位。通常，最適合於通過聚合物連接來修飾的部位在受體結合中發揮著重要作用，並且是保持分子的生物活性所必需的。從而，將聚合物鏈不加選擇地連接至生物活性分子上的這些反應性部位常常會導致聚合物修飾分子的生物活性顯著下降或甚至完全喪失。R.Clark等人，(1996)，J.Biol.Chem，27121969-21977。為形成具有賦予靶分子所要優勢的足夠聚合物分子量的結合物，現有技術方法通常涉及眾多聚合物臂與分子的隨機連接，進而增加了母體分子生物活性降低或甚至完全喪失的危險性。
形成用於使PEG衍生物與蛋白質連接的基因座的反應性部位是為蛋白質結構所支配的。包括酶的蛋白質是由各種α-胺基酸序列所組成，所述α-胺基酸具有一般結構H2N--CHR--COOH。一個胺基酸的α氨基部分(H2N--)與一鄰近胺基酸的羧基部分(--COOH)連接以形成醯胺鍵，所述醯胺鍵可表示為--(NH--CHR--CO)n--，其中下標「n」可能為數百或數千。由R表示的片段可含有用於保持蛋白質生物活性並用於連接PEG衍生物的反應性部位。
舉例而言，在胺基酸賴氨酸的情況下，在ε位置以及α位置上存在有--NH2基團。ε--NH2在鹼性pH條件下可自由反應。用PEG使蛋白質衍生化的領域中的許多技術已經貫注於研製用以連接至存在於蛋白質中的賴氨酸殘基ε--NH2部分的PEG衍生物。「Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation」，Nektar MolecularEngineering Catalog，2003，第1-17頁。然而，這些PEG衍生物都具有共同局限性，即它們不能被選擇性地定位於存在於蛋白質表面上的常為無數個的賴氨酸殘基之中。在例如存在於酶活性部位中的賴氨酸殘基對蛋白質活性為很重要的狀況下，或在賴氨酸殘基在調節蛋白質與其它生物分子的相互作用中起作用的狀況下，如在受體結合部位的狀況下，此種局限性可為重大局限性。
現有蛋白質PEG化方法的第二個且同等重要的複雜性為，PEG衍生物可與除了那些所希望的殘基以外的殘基發生不希望有的副反應。組氨酸含有結構上表示為--N(H)--的反應性亞氨基部分，但與ε--NH2反應的許多化學反應性物質也可與--N(H)--反應。類似地，胺基酸半胱氨酸的側鏈具有結構上表示為-SH的游離巰基。在一些情況下，針對於賴氨酸的ε--NH2的PEG衍生物也會與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應。此可產生PEG衍生化生物活性分子的複雜異質混合物，並且冒有破壞所靶向生物活性分子的活性的危險。將希望研製PEG衍生物，其允許將化學官能團引入蛋白質內的單個部位處，所述化學官能團接著將使一種或一種以上PEG聚合物能夠與生物活性分子在蛋白質表面上明確且可預測的特定部位處選擇性地偶合。
除賴氨酸殘基之外，此項技術中的大量努力已針對於靶向其它胺基酸側鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N端)的活化PEG試劑的研製。參見，例如，美國專利第6,610,281號，其以引用的方式併入本文中；和「Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation」，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17頁。可使用定點突變和所屬領域中已知的其它技術，將半胱氨酸殘基以部位選擇性方式引入蛋白質的結構中，且所得游離巰基部分可與具有硫醇反應性官能團的PEG衍生物反應。然而，這種方法是複雜的，原因在於游離巰基的引入會使所得蛋白質的表達、摺疊和穩定性複雜化。因而，將希望擁有一種將化學官能團引入生物活性分子中的方法，其使一種或一種以上PEG聚合物能夠與蛋白質選擇性地偶合，而同時與巰基和通常存在於蛋白質中的其它化學官能團相容(即，不在不希望有的副反應中與巰基和通常存在於蛋白質中的其它化學官能團發生嚙合)。
如從所屬領域的抽樣可見，這些已被研製用於連接蛋白質的側鏈(特別為連接賴氨酸胺基酸側鏈上的--NH2部分和半胱氨酸側鏈上的-SH部分)的衍生物中有許多已被證明在其合成和使用中是有問題的。一些衍生物與蛋白質形成不穩定的鍵，所述鍵易於發生水解且因此分解、降解或不然在水相環境中(諸如，在血流中)為不穩定的。一些衍生物形成較穩定的鍵，但在鍵形成之前易發生水解，此意謂PEG衍生物上的反應性基團可能會在可連接蛋白質之前失活。一些衍生物有一些毒性且因此較不適於在活體內使用。一些衍生物反應太慢以至於實際上不適用。一些衍生物通過與產生蛋白質活性的部位相連接而導致蛋白質活性的喪失。一些衍生物對其將連接的部位不為特異性的，此也會導致所要活性的喪失且導致缺乏結果的再現性。為克服與用聚(乙二醇)部分修飾蛋白質有關的挑戰，已經研製出穩定性更佳(例如，美國專利第6,602,498號，其以引用的方式併入本文中)或可與分子和表面上的硫醇部分發生選擇性反應(例如，美國專利第6,610,281號，其以引用的方式併入本文中)的PEG衍生物。顯然，在所屬領域中需要在生理環境中為化學惰性的直到要求發生選擇性反應以形成穩定化學鍵為止的PEG衍生物。
近期，已經報導蛋白質科學領域中的一種全新技術，其有希望克服與蛋白質部位特異性修飾相關的很多局限性。具體來說，已經將新的組分添加到原核生物大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli，E.coif)(例如，L. Wang等人，(2001)，Science292498-500)與真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae，S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science301964-7(2003))的蛋白質生物合成機器中，所述機器已經使非遺傳編碼的胺基酸能夠於活體內併入蛋白質中。使用所述方法，已經將許多具有新穎化學、物理或生物學性質的新胺基酸(包括光親和標記和光致異構化胺基酸、光致交聯胺基酸(參見，例如，Chin，J.W.等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9911020-11024；和Chin，J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.1249026-9027)、酮基胺基酸、含重原子的胺基酸和糖基化胺基酸)響應於琥珀密碼子TAG有效地且以高保真度併入大腸桿菌和酵母中的蛋白質中。參見，例如，J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society1249026-9027；J.W.Chin與P.G. Schultz(2002)，ChemBioChem3(11)1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America9911020-11024；和L. Wang與P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，11-11。所有文獻的全文是以引用的方式併入。所述研究已經證明，有可能選擇性地和照慣例地引入蛋白質中不存在的化學官能團(諸如，酮基、炔基和疊氮部分)，所述化學官能團對於20種常見的遺傳編碼的胺基酸中存在的所有官能團而言為化學惰性的且可能用來有效地和選擇性地發生反應以形成穩定的共價鍵。
將非遺傳編碼的胺基酸併入蛋白質中的能力允許引入能提供天然存在的官能團(諸如，賴氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價值替代物的化學官能團。已知一些化學官能團對於20種常見的遺傳編碼的胺基酸中存在的官能團而言為惰性的但可完全且有效地發生反應以形成穩定的鍵。舉例而言，在所屬領域中已知疊氮基和乙炔基在催化量的銅存在下於水性條件下發生胡氏根(Huisgen)[3+2]環加成反應。參見，例如，Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.673057-3064；和Rostovtsev等人(2002)Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599。通過將疊氮部分引入蛋白質結構中，舉例而言，我們能夠併入對於蛋白質中存在的胺基、巰基、羧酸基和羥基而言為化學惰性的但也可順利地和有效地與乙炔部分反應以形成環加成產物的官能團。重要的是在不存在乙炔部分的情況下，疊氮部分在其它蛋白質側鏈存在下和在生理血條件下仍為化學惰性的且無反應性。
本發明尤其致力於解決與GH多肽活性和製造相關的難題，並也致力於製造具有改良生物學或藥理學性質(諸如，改良治療半衰期)的hGH多肽。

發明內容
本發明提供包含一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的GH超基因家族成員，包括GH(例如，hGH)多肽。
在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含一種或一種以上翻譯後修飾。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽與連接子、聚合物或生物活性分子相連接。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽與雙官能聚合物、雙官能連接子或至少一個另外的GH(例如，hGH)多肽相連接。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物相連接。在一些實施例中，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸是以連接子與水溶性聚合物相連接或是通過鍵與水溶性聚合物相連接。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為雙官能聚合物。在一些實施例中，所述雙官能聚合物與第二多肽相連接。在一些實施例中，所述第二多肽為GH(例如，hGH)多肽。
在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含至少兩個與包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物相連接的胺基酸。在一些實施例中，至少一個胺基酸為非天然編碼的胺基酸。
GH(例如，hGH)的各區可如下說明，其中中間行表示hGH中的胺基酸位置。
螺旋A 螺旋B 螺旋C 螺旋D[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]N端 A-B環 B-C環 C-D環 C端在一些實施例中，在如下對應於hGH二級結構的一個或一個以上下列區域中的任何位置處1-5(N端)、6-33(螺旋A)、34-74(螺旋A與螺旋B之間的區域，A-B環)、75-96(螺旋B)、97-105(螺旋B與螺旋C之間的區域，B-C環)、106-129(螺旋C)、130-153(螺旋C與螺旋D之間的區域，C-D環)、154-183(螺旋D)、184-191(C端)(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)，將一個或一個以上非天然編碼的胺基酸併入。在其它實施例中，在選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用非天然編碼的胺基酸取代殘基1-5、32-46、97-105、132-149和184-191(來自hGH SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)中的一個或一個以上下列位置中位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(SEQ IDNO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置30、74、103(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在包括(但不限於)下列位置的這些位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、1 5、1 6、1 9、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，在所述位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，在所述位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。
人類GH拮抗劑包括(但不限於)在位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127處具有取代或在位置1處具有添加(即，在N端)或其任何組合(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1、3或任何其它GH序列中的相應胺基酸)的那些拮抗劑。
在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的親和力相比較時調控GH(例如，hGH)多肽對GH(例如，hGH)多肽受體的親和力的取代、添加或缺失。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的穩定性相比較時使GH(例如，hGH)多肽穩定性增加的取代、添加或缺失。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含選自由下列各取代組成的群組的胺基酸取代hGH SEQ ID NO2中的F10A、F10H、F10I；M14W、M14Q、M14G；H18D；H21N；G120A；R167N；D171S；E174S；F176Y、1179T或其任何組合。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的免疫原性相比較時調控GH(例如，hGH)多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的血清半衰期或循環時間相比較時調控GH(例如，hGH)多肽的血清半衰期或循環時間的取代、添加或缺失。
在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的水溶性相比較時使GH(例如，hGH)多肽水溶性增加的取代、添加或缺失。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的溶解性相比較時使宿主細胞中產生的GH(例如，hGH)多肽的溶解性增加的取代、添加或缺失。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的表達或合成相比較時使宿主細胞中的GH(例如，hGH)多肽表達增強或使活體外合成增強的取代、添加或缺失。在一些實施例中，hGH多肽包含胺基酸取代G120A。包含這種取代的hGH多肽保持促效劑活性且使宿主細胞中的表達水平保持或提高。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含當與相應無取代、添加或缺失的GH(例如，hGH)的蛋白酶抗性相比較時使GH(例如，hGH)多肽的蛋白酶抗性增強的取代、添加或缺失。
在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽中的胺基酸取代可以天然存在或非天然存在的胺基酸進行，其限制條件為至少一個取代是以非天然編碼的胺基酸進行。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含羰基、乙醯基、氨基氧基、肼基、醯肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸具有如下結構， 其中n為0-10，R1為烷基、芳基、經取代的烷基或經取代的芳基；R2為H、烷基、芳基、經取代的烷基和經取代的芳基；且R3為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，且R4為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含氨基氧基。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含醯肼基。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含肼基。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸殘基包含氨基脲基。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸殘基包含疊氮基。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸具有如下結構， 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基、經取代的芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含炔基。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸具有如下結構，
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基或經取代的芳基；X為O、N、S或不存在；m為0-10，R2為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，多肽為GH(例如，hGH)多肽促效劑、部分促效劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向促效劑。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽促效劑、部分促效劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向促效劑包含與水溶性聚合物連接的非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽促效劑、部分促效劑、拮抗劑、部分拮抗劑或反向促效劑包含非天然編碼的胺基酸和一種或一種以上翻譯後修飾、連接子、聚合物或生物活性分子。在一些實施例中，與水溶性聚合物相連接的非天然編碼的胺基酸存在於GH(例如，hGH)多肽的部位II區域(包含AC螺旋束表面、螺旋A的氨基末端區域和一部分螺旋C的蛋白質區域)內。在一些實施例中，包含與水溶性聚合物相連接的非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽通過防止GH(例如，hGH)多肽拮抗劑與第二個GH(例如，hGH)多肽受體分子相結合而防止GH(例如，hGH)多肽受體發生二聚。在一些實施例中，用非甘氨酸的胺基酸取代SEQ ID NO2(hGH)中的G120。在一些實施例中，用精氨酸取代SEQ IDNO2中的G120。在一些實施例中，用非天然編碼的胺基酸取代SEQ ID NO2中的G120。在一些實施例中，與水溶性聚合物相連接的非天然編碼的胺基酸存在於GH(例如，hGH)多肽的受體結合區內或幹擾GH(例如，hGH)多肽的受體結合。
本發明還提供經分離的核酸，其包含在嚴格條件下與SEQ ID NO21或22雜交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一個選擇密碼子。在一些實施例中，所述選擇密碼子是選自由下列密碼子組成的群組琥珀密碼子、赭石(ochre)密碼子、蛋白石密碼子、單一密碼子、稀有密碼子、五鹼基密碼子和四鹼基密碼子。
本發明還提供製備與水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包含使包含非天然編碼的胺基酸的經分離的GH(例如，hGH)多肽與包含可與所述非天然編碼的胺基酸反應的部分的水溶性聚合物接觸。在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸對於水溶性聚合物具有反應性，所述水溶性聚合物另外對於20種常見胺基酸中的任一種卻不具有反應性。在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸對於連接子、聚合物或生物活性分子具有反應性，所述連接子、聚合物或生物活性分子另外對於20種常見胺基酸中的任一種卻不具有反應性。
在一些實施例中，通過使包含含羰基的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽與包含氨基氧基、肼基、醯肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反應製得與水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)多肽。在一些實施例中，通過醯胺鍵使氨基氧基、肼基、醯肼基或氨基脲基與聚(乙二醇)分子相連接。
在一些實施例中，通過使包含羰基的聚(乙二醇)分子與包含含氨基氧基、肼基、醯肼基或氨基脲基的非天然編碼的胺基酸的多肽反應製得與水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)多肽。
在一些實施例中，通過使包含含炔基的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽與包含疊氮部分的聚(乙二醇)分子反應製得與水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)多肽。在一些實施例中，通過醯胺鍵使疊氮基或炔基與聚(乙二醇)分子相連接。
在一些實施例中，通過使包含含疊氮基的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽與包含炔部分的聚(乙二醇)分子反應製得與水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)多肽。在一些實施例中，通過醯胺鍵使疊氮基或炔基與聚(乙二醇)分子相連接。
在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有在約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子具有在0.1kDa與50kDa之間的分子量。
在一些實施例中，聚(乙二醇)分子為分枝聚合物。在一些實施例中，聚(乙二醇)分枝聚合物的各枝具有在1kDa與100kDa之間或在1kDa與50kDa之間的分子量。
在一些實施例中，與GH(例如，hGH)多肽相連接的水溶性聚合物包含聚亞烷基二醇部分。在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸殘基包含羰基、氨基氧基、醯肼基、肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸殘基包含羰基部分且水溶性聚合物包含氨基氧基、醯肼、肼或氨基脲部分。在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸殘基包含炔部分且水溶性聚合物包含疊氮部分。在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸殘基包含疊氮部分且水溶性聚合物包含炔部分。
本發明還提供包含含非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽和醫藥學上可接受的載劑的組合物。在一些實施例中，使非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物相連接。
本發明還提供包含編碼GH(例如，hGH)多肽的多聚核苷酸的細胞，所述多聚核苷酸包含選擇密碼子。在一些實施例中，所述細胞包含用於將非天然編碼的胺基酸取代入GH(例如，hGH)多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本發明還提供製備包含非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包含在一定條件下培養包含編碼GH(例如，hGH)多肽的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的細胞以允許GH(例如，hGH)多肽表達；和純化來自所述細胞和/或培養基的GH(例如，hGH)多肽。
本發明還提供使GH(例如，hGH)多肽的治療半衰期、血清半衰期或循環時間延長的方法。本發明也提供調控GH(例如，hGH)多肽的免疫原性的方法。在一些實施例中，所述方法包含用非天然編碼的胺基酸取代天然存在的GH(例如，hGH)多肽中的任何一個或一個以上胺基酸和/或使所述GH(例如，hGH)多肽與連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子相連接。
本發明還提供用有效量的本發明的GH(例如，hGH)分子治療需要這種治療的患者的方法。在一些實施例中，所述方法包含將治療有效量的包含GH(例如，hGH)多肽和醫藥學上可接受的載劑的醫藥組合物投予所述患者，所述GH(例如，hGH)多肽包含非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，使非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物相連接。
本發明還提供包含SEQ ID NO1、2、3中所示的序列或任何其它GH多肽序列(除至少一個胺基酸被非天然編碼的胺基酸取代以外)的GH(例如，hGH)多肽。在一些實施例中，使所述非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物相連接。在一些實施例中，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含羰基、氨基氧基、醯肼基、肼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。在一些實施例中，在選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用非天然編碼的胺基酸取代來自SEQ ID NO3(hGH)的殘基1-5、82-90、117-134和169-176。
本發明還提供包含醫藥學上可接受的載劑和GH(例如，hGH)多肽的醫藥組合物，所述GH(例如，hGH)多肽包含SEQ ID NO1、2、3中所示的序列或任何其它GH多肽序列，其中至少一個胺基酸被非天然編碼的胺基酸取代。在一些實施例中，所述非天然編碼的胺基酸包含糖類部分。在一些實施例中，通過糖類部分使水溶性聚合物與所述多肽相連接。在一些實施例中，通過糖類部分使連接子、聚合物或生物活性分子與GH(例如，hGH)多肽相連接。
本發明還提供包含通過共價鍵與GH(例如，hGH)多肽在單個胺基酸處相連接的水溶性聚合物的GH(例如，hGH)多肽。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，共價地與水溶性聚合物連接的胺基酸為存在於所述多肽中的非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，於SEQ ID NO 2的位置35、92、143或145處用非天然編碼的胺基酸取代。
本發明提供包含至少一個連接子、聚合物或生物活性分子的GH(例如，hGH)多肽，其中通過以核糖體作用併入所述多肽中的非天然編碼的胺基酸的官能團使所述連接子、聚合物或生物活性分子與所述多肽相連接。在一些實施例中，所述多肽被單PEG化。本發明也提供包含與一個或一個以上非天然編碼的胺基酸連接的連接子、聚合物或生物活性分子的GH(例如，hGH)多肽，其中以核糖體作用在預先選定的部位處使所述非天然編碼的胺基酸併入所述多肽中。
在另一實施例中，包含一個或一個以上非天然存在的胺基酸的hGH多肽與另一包括(但不限於)PEG的分子的結合由於與所述非天然胺基酸結合所利用的獨特化學反應而提供大體上純的hGH。包含一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的hGH與另一諸如PEG的分子的結合可與在結合步驟之前或之後執行的其它純化技術一起執行以提供大體上純的hGH。
本發明進一步提供一種含有通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)的激素組合物，其中所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，所述GH為諸如至少約80％與SEQ ID NO2相同的序列的人類生長激素(hGH)；在一些實施例中，所述序列為SEQ ID NO2的序列。所述GH可包括一個或一個以上非天然編碼的胺基酸(NEAA)，諸如包括羰基(例如，酮基)的NEAA，諸如為對乙醯苯丙氨酸的NEAA。在一些實施例中，所述肟鍵是在NEAA與水溶性聚合物之間。所述GH可在對應於SEQID NO2的位置35的位置處經對乙醯苯丙氨酸取代。在一些實施例中，所述水溶性聚合物包括一個或一個以上聚乙二醇(PEG)分子。所述PEG可為線性的，例如，分子量在約0.1kDa與約100kDa之間或在約1kDa與約60kDa之間或在約20kDa與約40kDa之間或為約30kDa的線性PEG。在一些實施例中，所述PEG為分枝PEG，例如，分子量在約1kDa與約100kDa之間或在約30kDa與約50kDa之間或為約40kDa的分枝PEG。在一些實施例中，通過複數個共價鍵使GH與複數個水溶性聚合物相連接，其中至少一個共價鍵為肟鍵。在這些實施例中的一些實施例中，所述GH為人類生長激素(GH，例如，hGH)，例如序列有至少約80％與SEQ ID NO2相同的GH(例如，hGH)；在一些實施例中所述序列為SEQ ID NO2的序列。在GH(例如，hGH)與複數個水溶性聚合物相連接的一些實施例中，所述GH包含複數個NEAA。
在一些實施例中，本發明提供一種含有包含SEQ ID NO2序列的GH(例如，hGH)的GH組合物，其中通過肟鍵使GH(例如，hGH)與30kDa線性PEG相連接，且其中所述肟鍵是與在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處取代的對乙醯苯丙氨酸形成。
在一些實施例中，本發明提供一種含有通過肟鍵與至少一個線性PEG相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列且含有至少一個在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處取代的NEAA殘基1-5、6-33、34-74、75-96、97-105、106-129、130-153、154-183和184-191。在一些實施例中，在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用NEAA取代位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192(即，在蛋白質的羧基端)。在一些實施例中，在一個或一個以上選自由殘基位置35、92、131、134、143和145組成的群組的位置處用NEAA取代。在一些實施例中，在一個或一個以上選自由殘基位置30、35、74、92、103、143和145組成的群組的位置處用NEAA取代。在一些實施例中，在一個或一個以上選自由殘基位置35、92、143和145組成的群組的位置處用NEAA取代。在一些實施例中，在位置35處用NEAA取代。在一些實施例中，至少一個NEAA為對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，PEG的分子量在約0.1kDa與約100kDa之間，或在約1kDa與約60kDa之間，或在約20kDa與約40kDa之間，或為約30kDa。
在其它實施例中，本發明提供一種製備通過肟鍵與水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)的方法，其包含使包含含羰基的NEAA的GH(例如，hGH)在適於形成肟鍵的條件下與PEG羥基胺接觸。所述NEAA可含有酮基，例如，羰基。NEAA可為對乙醯苯丙氨酸。在含有對乙醯苯丙氨酸的一些實施例中，在GH(例如，hGH)中對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置處用所述對乙醯苯丙氨酸取代。在一些實施例中，PEG羥基胺為單甲氧基PEG(MPEG)羥基胺。在一些實施例中，MPEG羥基胺為線性的，例如約20-40kDa或約30kDa的線性MPEG。在一些實施例中，MPEG羥基胺為線性30kDa單甲氧基-PEG-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯鹽酸鹽。在一些實施例中，通過將(i)編碼GH(例如，hGH)的核酸(其中所述核酸已被修飾以便為NEAA併入提供選擇密碼子)和(ii)NEAA引入一有機體中來製得包含NEAA的GH(例如，hGH)，所述有機體的細胞機器能夠響應於(i)核酸的選擇密碼子將NEAA併入蛋白質中。在一些實施例中，形成肟鍵的反應條件包括將MPEG與GH(例如，hGH)混合以產生MPEG-GH(例如，hGH)混合物，其中MPEGGH(例如，hGH)的比為約5至10，pH為約4至6；和在室溫下將所述MPEG-GH(例如，MPEG-hGH)混合物輕柔攪拌約10至50小時。在一些實施例中，所述方法進一步包括將GH(例如，hGH)純化(例如)至純度為至少約99％。
細胞機器包括(但不限於)正交tRNA和/或氨醯基tRNA合成酶。
在其它實施例中，本發明提供一種含有激素組合物與醫藥學上可接受的賦形劑的醫藥組合物，所述激素組合物包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素，其中所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，GH為例如為hGH的GH。在一些實施例中，GH包含NEAA。在一些實施例中，水溶性聚合物包含PEG，諸如線性PEG。在一些實施例中，PEG為約30kDa的線性PEG，且GH為在對應於SEQ ID NO2的胺基酸35的位置處經對乙醯苯丙氨酸取代的GH(例如，hGH)，且在對乙醯苯丙氨酸與PEG之間形成肟鍵。
在一些實施例中，本發明提供一種通過將有效量的激素組合物投予需要治療的個體進行治療的方法，所述激素組合物含有通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，GH為hGH。在一些實施例中，GH包含NEAA。在一些實施例中，水溶性聚合物包含PEG，諸如線性PEG。在一些實施例中，PEG為約30kDa的線性PEG，且GH為在對應於SEQ ID NO2的胺基酸35的位置處經對乙醯苯丙氨酸取代的hGH，且在對乙醯苯丙氨酸與PEG之間形成肟鍵。在一些實施例中，所治療的個體為人類。在一些實施例中，所治療的個體患有兒科生長激素缺乏症、特發性身材矮小、兒童期發作的成年人生長激素缺乏症、成年期發作的成年人生長激素缺乏症或繼發性生長激素缺乏症。在一些實施例中，GH為hGH。在一些實施例中，GH包含NEAA。在一些實施例中，水溶性聚合物包含PEG，諸如線性PEG。在一些實施例中，PEG為約30kDa的線性PEG，且GH(例如，hGH)是在對應於SEQID NO2的胺基酸35的位置處經對乙醯苯丙氨酸取代，且在對乙醯苯丙氨酸與PEG之間形成肟鍵。
在一些實施例中，本發明提供一種通過將有效量的激素組合物投予需要治療的個體進行治療的方法，所述激素組合物包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述水溶性聚合物為線性聚合物，且其中以每周僅一次、每兩周一次或每月一次的頻率投予所述激素組合物。在一些實施例中，所述聚合物為PEG。在一些實施例中，所述GH包含NEAA。在一些實施例中，通過肟鍵使所述聚合物與所述GH相連接。
在一些實施例中，本發明提供一種包含GH(例如，hGH)的激素組合物，其中當經皮下投予哺乳動物時所述GH(例如，hGH)的平均血清半衰期為至少約12小時。在一些實施例中，GH(例如，hGH)包含NEAA。在一些實施例中，所述激素組合物進一步含有水溶性聚合物，諸如，PEG，例如，線性PEG。
在一些實施例中，本發明提供一種包含與PEG相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中當經皮下投予哺乳動物時所述GH(例如，hGH)的平均血清半衰期為包含無PEG的GH(例如，hGH)的組合物的血清半衰期的至少約7倍。


圖1顯示四螺旋束蛋白的一般結構圖。
圖2顯示四螺旋束蛋白生長激素(GH)的一般結構圖。
圖3顯示四螺旋束蛋白促紅細胞生成素(EPO)的一般結構圖。
圖4顯示四螺旋束蛋白幹擾素α-2(IFNα-2)的一般結構圖。
圖5顯示四螺旋束蛋白粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的一般結構圖。
圖6顯示考馬斯(Coomassie)亮藍染色SDS-PAGE，其展示在以下位置中的各個位置處包含非天然編碼的胺基酸對乙醯苯丙氨酸的hGH的表達Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143或K145。
圖7，A圖和圖7，B圖顯示包含非天然編碼的胺基酸的hGH(B圖)和野生型hGH(A圖)在IM9細胞中的生物活性的圖。
圖8顯示展示包含非天然編碼的胺基酸的hGH的產生的考馬斯亮藍染色SDS-PAGE，所述hGH是通過PEG(5kDa、20kDa和30kDa)與其的共價連接而PEG化。
圖9顯示展示包含非天然編碼的胺基酸的hGH的多種PEG化形式在IM9細胞中的生物活性的圖。
圖10，A圖-此示hGH的一級結構，其中指示胰蛋白酶裂解部位並且用箭頭說明非天然的胺基酸取代F92pAF(根據Becker等人Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4)326-337修改所得的圖)。圖10，B圖-顯示由包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH多肽產生的肽(標記為A)、由包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽產生的肽(標記為B)和由WHO rhGH產生的肽(標記為C)的疊加的胰蛋白酶圖。圖10，圖C-顯示來自B圖的峰9的放大。
圖11，A圖和B圖顯示經純化的PEG-hGH多肽的考馬斯亮藍染色SDS-PAGE分析。
圖12顯示hGH二聚體分子在IM9細胞中的生物活性的圖。
圖13，A圖-顯示測量通過具有G120R取代的hGH拮抗劑使pSTAT5磷酸化的IM-9檢定數據的圖。圖13，B圖-顯示測量通過具有在相同位置處(G120)併入的非天然胺基酸的hGH多肽使pSTAT5磷酸化的IM-9檢定數據的圖。
圖14顯示表明圖13，B圖中所示的hGH拮抗劑的二聚體在IM-9檢定中也缺乏生物活性的圖。
圖15顯示比較包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH多肽與未PEG化的hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的圖。
圖16顯示比較包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的圖。
圖17顯示比較包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的圖。一次向大鼠投予2.1mg/kg。
圖18，A圖-顯示在投予單劑量的包含非天然編碼的胺基酸(位置35、92)的PEG化hGH多肽後對大鼠體重增加的影響的圖。圖18，B圖-顯示在投予單劑量的包含非天然編碼的胺基酸(位置35、92)的PEG化hGH多肽後對循環血漿IGF-1水平的影響的圖。圖18，C圖-顯示在投予單劑量的包含非天然編碼的胺基酸(位置92、134、145、131、143)的PEG化hGH多肽後對大鼠體重增加的影響的圖。圖18，D圖-顯示在投予單劑量的包含非天然編碼的胺基酸(位置92、134、145、131、143)的PEG化hGH多肽後對循環血漿IGF-1水平的影響的圖。圖18，E圖-顯示比較包含非天然編碼的胺基酸(位置92、134、145、131、143)的PEG化hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的圖。
圖19顯示直鏈、30kDa的單甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯鹽酸鹽的結構圖。
圖20顯示說明經氨基甲酸酯連接的氧基氨基衍生化PEG的合成的圖。
圖21呈現可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的含PEG試劑的說明性、非限制性實例。
圖22呈現合成可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的含PEG試劑的說明性、非限制性實例。
圖23呈現合成可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的基於醯胺的含羥胺PEG試劑的說明性、非限制性實例。
圖24呈現合成可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的基於氨基甲酸酯的含PEG試劑的說明性、非限制性實例。
圖25呈現合成可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的基於氨基甲酸酯的含PEG試劑的說明性、非限制性實例。
圖26呈現合成可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的簡單的含PEG試劑的說明性、非限制性實例。
圖27呈現可用來修飾非天然胺基酸多肽以形成含PEG、經肟連接的非天然胺基酸多肽的含分枝PEG試劑的說明性、非限制性實例和一種所述試劑修飾基於羰基的非天然胺基酸多肽的用途。
圖28呈現說明每周用安慰劑或劑量增加的PEG-ahGH或每天用安慰劑或健豪寧(Genotropin)治療的切除垂體大鼠中的IGF-1血漿濃度的圖。
圖29呈現說明每周用安慰劑或PEG-ahGH或每天用安慰劑或健豪寧治療的切除垂體大鼠中的脛骨長度的圖。
圖30呈現說明每周用安慰劑或PEG-ahGH或每天用安慰劑或健豪寧治療的切除垂體大鼠中的體重變化百分比的圖。
圖31呈現說明第0天和第7天經皮下投予的PEG-ahGH的血漿濃度與時間的關係的圖。
圖32呈現說明以皮下或靜脈內單劑量投予的PEG-a(met)hGH的血漿濃度與時間的關係的圖。
具體實施例方式
定義應了解，本發明不受限於本文中所描述的特定方法、實驗方案、細胞系、構建物和試劑，並且因而可能發生變化。也應了解，本文中所使用的術語僅是為了描述特定實施例，而不是用來限制本發明的範疇，本發明的範疇將僅受限於隨附權利要求書。
除非上下文另有明確說明，否則如本文中和隨附權利要求書中所使用的單數形式「一」和「所述」包括複數含義。因此，例如，提及一個(種)「hGH」是提及一個(種)或一個(種)以上如此的蛋白質且包括所屬領域的技術人員已知的其等效物，等等。
除非另有說明，否則本文中所使用的所有科技術語具有與本發明所屬領域的技術人員的通常理解相同的含義。雖然在本發明的實踐或測試中可使用與本文所描述的那些類似或等效的任何方法、裝置和物質，但現在描述的是優選方法、裝置和物質。
本文中所提及的所有公開案和專利是以引用的方式併入本文中，以達到描述和揭示(例如)在所述公開案中加以描述、可能與當前描述的發明結合使用的構建物和方法的目的。所提供的本文中論述的公開案僅為其在本申請案的申請日期之前的揭示案。本文在任何方面皆不應解釋為承認本發明者無權由於現有發明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。
術語「大體上純化的」指的是如下GH(例如，hGH)多肽，在以重組方法產生的GH(例如，hGH)多肽的情況下，其可大體上或基本上不含有通常伴有如見於在其天然存在的環境(即，天然細胞或宿主細胞)中的蛋白質或與所述蛋白質發生相互作用的組分。可大體上不含有細胞物質的GH(例如，hGH)多肽包括汙染蛋白質低於約30％、低於約25％、低於約20％、低於約15％、低於約10％、低於約5％、低於約4％、低於約3％、低於約2％或低於約1％(以乾重計)的蛋白質製劑。當GH(例如，hGH)多肽或其變異體是通過重組方法由宿主細胞產生時，蛋白質可以細胞乾重的約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約5％、約4％、約3％、約2％或約1％或更低百分比的量存在。當GH(例如，hGH)多肽或其變異體是通過重組方法由宿主細胞產生時，蛋白質可以約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更低的細胞乾重的量存在於培養基中。因而，如由本發明的方法產生的「大體上純化的」GH(例如，hGH)多肽可具有至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％的純度，特別地為具有至少約75％、80％、85％的純度，且更特別地為具有至少約90％的純度、至少約95％的純度、至少約99％或更大值的純度，所述純度是通過諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛細管電泳的適當方法來測定。
「重組宿主細胞」或「宿主細胞」指的是包括不管用何種方法(例如，直接吸收、轉導、f接合或此項技術中已知的產生重組宿主細胞的其它方法)插入的外源性多聚核苷酸的細胞。所述外源性多聚核苷酸可作為非整合載體，例如質粒，得以維持，或者，可整合到宿主基因組中。
如本文所使用的術語「培養基」包括任何培養基、溶液、固體、半固體或硬質支撐物，其可支撐或含有任何宿主細胞和細胞內含物，所述宿主細胞包括細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)宿主細胞。因而，所述術語可涵蓋宿主細胞已生長於其中的培養基，例如，GH(例如，hGH)多肽已被分泌到其中的培養基，包括增殖階段之前或之後的培養基。所述術語還可涵蓋諸如在GH(例如，hGH)多肽為細胞內產生的且使宿主細胞溶解或分裂以釋放出GH(例如，hGH)多肽的情況下，含有宿主細胞溶胞物的緩衝液或試劑。
如本文中關於蛋白質重摺疊所使用的「還原劑」是定義為使巰基維持在還原狀態且使分子內或分子間的二硫鍵還原的任何化合物或物質。合適的還原劑包括(但不限於)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和還原型穀胱甘肽。所屬領域的技術人員易於了解，多種還原劑適用於本發明的方法和組合物中。
如本文中關於蛋白質重摺疊所使用的「氧化劑」是定義為能夠從正被氧化的化合物移去電子的任何化合物或物質。合適的氧化劑包括(但不限於)氧化型穀胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘇糖醇(oxidized erythreitol)和氧氣。所屬領域的技術人員易於了解，多種氧化劑適用於本發明的方法中。
如本文中所使用的「變性劑」是定義為將引起蛋白質發生可逆的解摺疊的任何化合物或物質。變性劑的強度將由特定變性劑的性質和濃度所決定。合適的變性劑可為離液劑、去汙劑、有機溶劑、水可混溶性溶劑、磷脂或兩種或兩種以上所述試劑的組合。合適的離液劑包括(但不限於)尿素、胍和硫氰酸鈉。可用的去汙劑可包括(但不限於)強力去汙劑(諸如，十二烷基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如，吐溫(Tween)或粹通(Triton)去汙劑)、N-十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl))、溫和非離子型去汙劑(例如，毛地黃皂苷)、溫和陽離子型去汙劑(諸如，N-2，3-(二油醯氧基)-丙基-N，N，N-三甲銨)、溫和離子型去汙劑(例如，膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)或兩性離子型去汙劑(包括(但不限於)磺基甜菜鹼(Zwittergent，兩性洗滌劑)、3-(3-膽醯胺丙基)二甲胺基-1-丙烷硫酸鹽(CHAPS)和3-(3-膽醯胺丙基)二甲胺基-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPSO))。諸如乙腈、低碳烷醇(特別為C2-4烷醇，諸如，乙醇或異丙醇)或低碳烷二醇(特別為C2-4烷二醇，諸如，乙二醇)的有機水可混溶性溶劑可用作變性劑。可用於本發明的磷脂可為天然存在的磷脂(諸如，磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸和磷脂醯肌醇)或合成的磷脂衍生物或變體(諸如，二己醯基磷脂醯膽鹼或二庚醯基磷脂醯膽鹼)。
如本文中所使用的「重摺疊」描述就二硫鍵而言使含有二硫鍵的多肽從不恰當的摺疊或解摺疊狀態轉變為天然或恰當的摺疊構象的任何過程、反應或方法。
如本文中所使用的「共摺疊」特別指的是採用至少兩條彼此間相互作用的多肽並使解摺疊或不恰當摺疊的多肽轉變為天然、恰當摺疊的多肽的重摺疊過程、反應或方法。
如本文中所使用的「生長激素」或「GH」，不管其生物活性如何且此外不管其採用何種合成或製造方法(包括(但不限於)在活體外、在活體內通過核酸分子的顯微注射而重組(無論自cDNA、基因組DNA、合成DNA產生還是自其它形式的核酸產生)的方法、合成方法、轉基因方法和基因活化方法)，其都應包括具有生長激素的至少一種生物活性的那些多肽和蛋白質，所述生長激素來自任何哺乳類動物(包括(但不限於)人(hGH)、牛(bGH)、豬)和其它牲畜或家畜(包括(但不限於)雞)，且包括其GH類似物、GH同功異型物、GH模擬物、GH片段、雜交GH蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚體、同源物、糖基化型變異體、變異體、剪接變異體和突變型蛋白。
術語「hGH多肽」涵蓋包含一個或一個以上的胺基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。示範性取代包括(例如)天然hGH的位置41處賴氨酸的取代或位置176處苯丙氨酸的取代。在一些情況下，如果取代是在位置41處，那麼取代物可為異亮氨酸或精氨酸殘基，或如果位置為176，那麼取代物為酪氨酸殘基。位置F10可經(例如)A、H或I取代。位置M14可經(例如)W、Q或G取代。其它示範性取代包括任何包含(但不限於)下列各取代的取代或其組合R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；R167E、D171S、E174S、F176Y；F10A、M14W、H18D、H21N；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、E174S、F176Y、I179T；F10H、M14G、H18N、H21N；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、T175T、I179T；或F10I、M14Q、H18E、R167N、D171S、I179T。參見，例如，美國專利第6,143,523號，其以引用的方式併入本文中。
已對天然存在的hGH中多個胺基酸位置上的示範性取代進行了描述，其包括增強促效劑活性、增強蛋白酶抵抗性、使多肽轉化為拮抗劑等等的取代且由術語「hGH多肽」所涵蓋。
促效劑GH(例如，hGH)序列包括(例如)包含以下修飾的天然存在的hGH序列H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、I179T。參見，例如，美國專利第5,849,535號，其以引用的方式併入本文中。另外的促效劑hGH序列包括H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S；H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S；或H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A。參見，例如，美國專利第6,022,711號，其以引用的方式併入本文中。包含H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A取代的hGH多肽提高在部位I對hGH受體的親和力。參見，例如，美國專利第5,854,026號，其以引用的方式併入本文中。蛋白酶抗性增強的hGH序列包括(但不限於)在C-D環內包含一個或一個以上的胺基酸取代的hGH多肽。在一些實施例中，取代包括(但不限於)R134D、T135P、K140A和其任何組合。參見，例如，Alam等人(1998)J.Biotechnol.65183-190。
人類生長激素拮抗劑包括(例如)在G120處具有取代(例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)且有時進一步包括以下取代H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A的那些人類生長激素拮抗劑。參見，例如，美國專利第6,004,931號，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，hGH拮抗劑在區域106-108或127-129中包含至少一個取代，此使得GH可充當拮抗劑。參見，例如，美國專利第6,608,183號，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，hGH拮抗劑包含與水溶性聚合物相連接的存在於hGH分子的部位II結合區域中的非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，hGH多肽進一步包含以下取代H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、I179T，且一取代在G120處(參見，例如，美國專利第5,849,535號)。
對於完整全長的天然存在的人類GH胺基酸序列以及成熟的天然存在的GH胺基酸序列和天然存在的突變體來說，分別參見本文中的SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQID NO3。在一些實施例中，本發明的GH多肽(例如，hGH多肽)大體上與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或生長激素多肽的任何其它序列相同。舉例來說，在一些實施例中，本發明的GH多肽(例如，hGH多肽)有至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或至少約99％與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或生長激素多肽的任何其它序列相同。在一些實施例中，本發明的GH多肽(例如，hGH多肽)有至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或至少約99％與SEQ ID NO2相同。大量天然存在的hGH突變體已得以鑑別。這些突變體包括hGH-V(Seeburg，DNA 1239(1982)；美國專利第4,446,235號、第4,670,393號和第4,665,180號，其以引用的方式併入本文中)和含有hGH的殘基32-46的缺失的20-kDa hGH(SEQ ID NO3)(Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta 925314(1987)；Lewis，U.等人，J. Biol.Chem.，2532679-2687(1978))。在Igout，A.等人，NucleicAcids Res.17(10)3998(1989)中對胎盤生長激素進行了描述。此外，已經報導由轉錄後、翻譯後、分泌、代謝加工和其它生理過程產生的眾多hGH變異體，其包括蛋白水解分裂成的變異體或2鏈變異體(Baumann，G.，Endocrine Reviews 12424(1991))。在Lewis，U.J.等人，J. Biol.Chem.2523697-3702(1977)、Brostedt，P.和Roos，P.，Prep.Biochem.19217-229(1989)中描述了通過Cys-Cys二硫鍵直接連接的hGH二聚體。編碼hGH突變體和突變hGH多肽的核酸分子已為我們所熟知且包括(但不限於)在美國專利第5,534,617號、第5,580,723號、第5,688,666號、第5,750,373號、第5,834,250號、第5,834,598號、第5,849,535號、第5,854,026號、第5,962,411號、第5,955,346號、第6,013,478號、第6,022,711號、第6,136,563號、第6,143,523號、第6,428,954號、第6,451,561號、第6,780,613號和美國專利申請公開案2003/0153003中所揭示的那些核酸分子，所述參考案以引用的方式併入本文中。
hGH的商業製劑是以下列名稱出售HumatropeTM(Eli Lilly Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)。
術語「hGH多肽」也包括天然存在hGH的醫藥學上可接受的鹽和前藥以及鹽的前藥、多晶型物、水合物、溶劑化物、生物活性片段、生物活性變異體和立體異構體，以及天然存在的hGH的促效劑、模擬物和拮抗劑變異體和其多肽融合物。在氨基端、羧基端或兩端包含另外的胺基酸的融合物都為術語「hGH多肽」所涵蓋。示範性融合物包括(但不限於)(例如)甲硫氨醯基生長激素(其中甲硫氨酸與由缺乏分泌信號肽或其部分的hGH的成熟形式的重組表達產生的hGH的N端相連接)、用於純化目的的融合物(包括(但不限於)與聚組氨酸或親和性抗原決定基形成的融合物)、與血清白蛋白結合肽形成的融合物和與血清蛋白(諸如，血清白蛋白)形成的融合物。以引用的方式併入本文中的美國專利第5,750,373號描述一種選擇對於其相應受體分子具有改變的結合性質的新穎蛋白質(諸如，生長激素)和抗體片段變異體的方法。所述方法包含使編碼所關注的蛋白質的基因與絲狀噬菌體M13的基因III外殼蛋白的羧基端結構域融合。
各種參考文獻揭示通過聚合物結合或糖基化作用來修飾多肽。術語「hGH多肽」包括與聚合物(諸如，PEG)結合且可包含半胱氨酸、賴氨酸或其它殘基的一個或一個以上另外的衍生形式的多肽。此外，hGH多肽可包含連接子或聚合物，其中所述連接子或聚合物所結合的胺基酸可為根據本發明的非天然胺基酸，或可利用此項技術中已知的技術(諸如與賴氨酸或半胱氨酸偶合)與天然編碼的胺基酸結合。
已對hGH多肽的聚合物結合作用進行了報導。參見，例如，美國專利第5,849,535號、第6,136,563號和第6,608,183號，其以引用的方式併入本文中。美國專利第4,904,584號揭示PEG化賴氨酸缺失的多肽，其中至少一個賴氨酸殘基已經缺失或經任何其它胺基酸殘基取代。WO 99/67291揭示一種使蛋白質與PEG結合的方法，其中蛋白質上的至少一個胺基酸殘基缺失且在足以實現與蛋白質結合的條件下使蛋白質與PEG接觸。WO99/03887揭示屬於生長激素超家族的多肽的PEG化變異體，其中半胱氨酸殘基已經由位於多肽指定區中的非必需胺基酸殘基取代。WO 00/26354揭示一種產生變應原性降低的糖基化多肽變異體的方法，所述糖基化多肽變異體當與相應母體多肽相比較時，其包含至少一個另外的糖基化作用部位。以引用的方式併入本文中的美國專利第5,218,092號揭示對粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽的修飾，以便當與天然多肽相比較時引入至少一條另外的碳水化合物鏈。
術語「hGH多肽」也包括糖基化hGH以及(但不限於)在任何胺基酸位置處發生糖基化的多肽、N-連接或O-連接糖基化形式的多肽。含有單核苷酸變化的變異體也被視為hGH多肽的生物活性變異體。此外，也包括剪接變異體。術語「hGH多肽」也包括通過化學方式連接或表達為融合蛋白的任何一種或一種以上GH(例如，hGH)多肽或任何其它多肽、蛋白質、碳水化合物、聚合物、小分子、連接子、配位體或任何類型的其它生物活性分子的GH(例如，hGH)多肽雜二聚體、同源二聚體、雜多聚體或同源多聚體，以及含有(例如)特異性缺失或其它修飾但仍保持生物活性的多肽類似物。
除非另有說明(即，當說明比較是基於SEQ ID NO1、3或其它hGH序列時)，否則對本文中描述的GH(例如，hGH)中的胺基酸位置的所有提及是基於SEQ ID NO2中的位置。所屬領域的技術人員將認識到，對應於SEQ ID NO1、2、3或任何其它GH序列中的位置的胺基酸位置可在任何其它GH(例如，hGH)分子(諸如，GH，或hGH融合物、變異體、片段等)中容易地得到識別。舉例而言，諸如BLAST的序列比對程序可用來比對和鑑別在蛋白質中對應於SEQ ID NO1、2、3或其它GH序列中的位置的特定位置。本文中就SEQ ID NO1、2、3或其它GH序列而言加以描述的胺基酸的取代、缺失或添加也是用來指本文中描述或此項技術中已知的GH或hGH融合物、變異體、片段等中的相應位置上的取代、缺失或添加，且顯然由本發明所涵蓋。
術語「hGH多肽」或「hGH」涵蓋包含一個或一個以上的胺基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。本發明的hGH多肽可包含用一個或一個以上天然胺基酸進行的修飾連同一個或一個以上非天然胺基酸的修飾。已對天然存在的hGH多肽中多個胺基酸位置上的示範性取代進行了描述，所述示範性取代包括(但不限於)調控hGH多肽的一種或一種以上生物活性(諸如(但不限於)增強促效劑活性、增加多肽的溶解性、降低蛋白酶敏感性、使多肽轉化為拮抗劑等)的取代，且術語「hGH多肽」涵蓋所述示範性取代。
人類GH拮抗劑包括(但不限於)在位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127處具有取代或在位置1處具有添加(即，在N端)或其任何組合(SEQ ID NO2，SEQ ID NO1、3或任何其它GH序列中的相應胺基酸)的那些拮抗劑。在一些實施例中，hGH拮抗劑在區域1-5(N端)、6-33(螺旋A)、34-74(螺旋A與螺旋B之間的區域，A-B環)、75-96(螺旋B)、97-105(螺旋B與螺旋C之間的區域，B-C環)、106-129(螺旋C)、130-153(螺旋C與螺旋D之間的區域，C-D環)、154-183(螺旋D)、184-191(C端)中包含至少一個取代，此使得GH可充當拮抗劑。在其它實施例中，非天然編碼的胺基酸的示範性併入部位包括在螺旋A的氨基端區域和一部分螺旋C之內的殘基。在另一實施例中，用諸如對疊氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然編碼的胺基酸取代G120。在其它實施例中，將上面列出的取代與使得hGH多肽成為hGH拮抗劑的另外取代組合。舉例而言，在本文中所鑑別的位置中的一位置處用非天然編碼的胺基酸取代，且同時在G120處引入取代(例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)。在一些實施例中，hGH拮抗劑包含與水溶性聚合物相連接的存在於hGH分子受體結合區中的非天然編碼的胺基酸。
在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽進一步包含調控GH或hGH多肽的生物活性的添加、取代或缺失。舉例而言，添加、取代或缺失可調控GH(例如，hGH)的一種或一種以上的性質或活性。例如，添加、取代或缺失可以調控對GH(例如，hGH)多肽受體的親和力，調控(包括(但不限於)增強或減弱)受體二聚化，穩定受體二聚體、循環半衰期，調控治療半衰期，調控多肽穩定性，調控通過蛋白酶進行的裂解，調控劑量，調控釋放或生物利用率，促進純化，或改善或改變特定投藥途徑。同樣地，GH(例如，hGH)多肽可包含改善多肽的檢測(包括(但不限於)GFP)、純化或其它特性的蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合域(包括(但不限於)FLAG或聚組氨酸)或其它基於親和力的序列(包括(但不限於)FLAG、聚組氨酸、GST等)或連接分子(包括(但不限於)生物素)。
術語「hGH多肽」也涵蓋已連接的同源二聚體、雜二聚體、同源多聚體和雜多聚體，其包括(但不限於)直接通過非天然編碼的胺基酸側鏈與相同或不同的非天然編碼的胺基酸側鏈相連接或者與天然編碼的胺基酸側鏈相連接或者間接通過連接子相連接的那些同源二聚體、雜二聚體、同源多聚體和雜多聚體。示範性連接子包括(但不限於)小分子有機化合物、具有多種長度的水溶性聚合物(諸如，聚(乙二醇)或聚葡聚糖)或具有各種長度的多肽。
「非天然編碼的胺基酸」指的是一種並非為20種常見胺基酸之一或吡咯賴氨酸或硒代半胱氨酸的胺基酸。可與術語「非天然編碼的胺基酸」同義使用的其它術語為「非天然胺基酸」和」非天然存在的胺基酸」。術語「非天然編碼的胺基酸」也包括(但不限於)通過天然編碼的胺基酸(包括(但不限於)20種常見胺基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)的修飾(例如，翻譯後修飾)而出現但不是其自身通過翻譯複合物而天然併入生長多肽鏈中的胺基酸。所述非天然存在的胺基酸的實例包括(但不限於)N-乙醯氨基葡萄糖基-L-絲氨酸、N-乙醯氨基葡萄糖基-L-蘇氨酸和O-磷酸化酪氨酸。
「氨基端修飾基團」指的是可與多肽的氨基端相連接的任何分子。同樣地，「羧基端修飾基團」指的是可與多肽的羧基端相連接的任何分子。末端修飾基團包括(但不限於)各種水溶性聚合物、肽或諸如血清白蛋白的蛋白質或使肽的血清半衰期延長的其它部分。
術語「官能團」、「活性部分」、「活化基團」、「離去基團」、「反應性部位」、「化學反應性基團」和「化學反應性部分」在此項技術中和在本文中是用來指分子的獨特、可確定的部分或單元。在化學技術中所述術語的意義有些相同且在本文中用來表示執行某些功能或具有一些活性且與其它分子易發生反應的分子的部分。
術語「鍵」或「連接子」在本文中是用來指通常由於化學反應而形成且通常為共價鍵的基團或鍵。水解穩定的鍵意謂在水中大體上為穩定的且在有效pH值下(包括(但不限於)在生理條件下)於一段長期時間內(或許甚至無限期地)不與水發生反應的鍵。水解不穩定或可降解的鍵意謂在水中或在水溶液(包括例如血液)中可降解的鍵。酶促不穩定或可降解的鍵意謂可被一種或一種以上的酶降解的鍵。如此項技術中所理解，PEG和相關聚合物可以在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上的末端官能團之間的連接子基團中包括可降解的鍵。舉例而言，通過PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應而形成的酯鍵一般在生理條件下水解而釋放出試劑。其它水解可降解的鍵包括(但不限於)碳酸酯鍵；由胺與醛反應產生的亞胺鍵；通過醇與磷酸酯基團反應而形成的磷酸酯鍵；為醯肼與醛的反應產物的腙鍵；為醛與醇的反應產物的縮醛鍵；為甲酸酯與醇的反應產物的原酸酯鍵；通過包括(但不限於)在聚合物(諸如，PEG)末端的胺基與肽的羧基形成的肽鍵；和通過包括(但不限於)在聚合物末端的亞磷醯胺基團與寡核苷酸的5′羥基形成的寡核苷酸鍵。
術語「生物活性分子」、「生物活性部分」或「生物活性劑」當在本文中使用時意謂可影響生物系統、路徑、分子的任何物理性質或生化性質或者與生物體(包括(但不限於)病毒、細菌、噬菌體、轉座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物和人類)有關的相互作用的任何物質。詳細來說，如本文中所使用的「生物活性分子」包括(但不限於)意欲用於診斷、治癒、緩解、治療或預防人類或其它動物的疾病或另外可增強人類或動物的身體或精神的良好狀態的任何物質。生物活性分子的實例包括(但不限於)肽、蛋白質、酶、小分子藥物、硬藥、軟藥、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質體、微粒和膠粒。適於供本發明使用的生物活性劑的類別包括(但不限於)藥物、前藥、放射性核素、顯影劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、抗炎藥劑、抗腫瘤劑、心血管劑、抗焦慮劑、激素、生長因子、甾族藥劑、源自微生物的毒素等等。
「雙官能聚合物」指的是包含兩個離散官能團的聚合物，所述官能團能夠特定地與其它部分(包括(但不限於)胺基酸側基)反應以形成共價鍵或非共價鍵。具有一個可與特定生物活性組分上的基團反應的官能團和另一個可與第二生物組分上的基團反應的基團的雙官能連接子可用來形成包括第一生物活性組分、雙官能連接子和第二生物活性組分的結合物。用於使各種化合物與肽相連接的許多程序和連接子分子是已知的。參見，例如，歐洲專利申請案第188,256號、美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4,680,338號和第4,569,789號，其以引用的方式併入本文中。「多官能聚合物」指的是包含兩個或兩個以上離散官能團的聚合物，所述官能團能夠特定地與其它部分(包括(但不限於)胺基酸側基)反應以形成共價鍵或非共價鍵。雙官能聚合物或多官能聚合物可為任何所要長度或分子量，且可加以選擇以提供與GH(例如，hGH)分子相連接的一個或一個以上的分子之間的特定所要的間隔或構象。
在取代基是通過其從左到右書寫的常規化學式來說明的情況下，其同樣涵蓋將由從右到左來書寫結構而得到的化學上相同的取代基，例如，結構-CH2O-等同於結構-OCH2-。
術語「取代基」包括(但不限於)「非幹擾性取代基」。「非幹擾性取代基」為產生穩定化合物的那些基團。合適的非幹擾性取代基或基團包括(但不限於)滷基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12環烷基、C3-C12環烯基、苯基、經取代的苯基、甲苯甲醯基、二甲苯基、聯苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亞磺醯基、C1-C10烷基磺醯基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m為1至8)、芳基、經取代的芳基、經取代的烷氧基、氟烷基、雜環基、經取代的雜環基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C1-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中各m為1至8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其鹽的基團等等。如本文中所使用的各R為H、烷基或經取代的烷基、芳基或經取代的芳基、芳烷基或烷芳基。
術語「滷素」包括氟、氯、碘和溴。
術語「烷基」，除非另有說明，否則其單獨地或作為另一取代基的一部分是意謂可為完全飽和的、單不飽和的或多不飽和的且可包括具有指定碳原子數(即，C1-C10意謂1至10個碳原子)的二價和多價基團的直鏈或支鏈或環狀烴基或其組合。飽和烴基的實例包括(但不限於)如下基團甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和異構體等等。不飽和烷基為具有一個或一個以上的雙鍵或三鍵的基團。不飽和烷基的實例包括(但不限於)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基和高碳同系物與異構體。除非另有說明，否則術語「烷基」也意欲包括下面較詳細定義的那些烷基衍生物，諸如「雜烷基」。將限於烴基的烷基稱為「純烷基」。
術語「亞烴基」，其單獨地或作為另一取代基的一部分是意謂源自烷烴的如下(但不限於)由結構-CH2CH2-與-CH2CH2CH2CH2-所例示的二價基團且進一步包括下面描述為「雜亞烴基」的那些基團。通常，烷基(或亞烴基)將具有1至24個碳原子，那些具有10個碳原子或更少碳原子的基團為本文所述的方法和組合物的特殊實施例。「低碳烷基」或「低碳亞烴基」為一般具有8個或更少碳原子的鏈較短的烷基或亞烴基。
術語「烷氧基」、「烷基氨基」和「烷基硫基」(或硫基烷氧基)是以其常規意義使用，且分別指的是通過氧原子、氨基或硫原子與分子的其餘部分相連接的那些烷基。
術語「雜烷基」，除非另有說明，否則其單獨地或與另一術語組合是意謂包含確定的碳原子數和至少一個選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子的穩定的直鏈或支鏈或環狀烴基或其組合，其中氮原子和硫原子視需要可被氧化且氮雜原子視需要可被季銨化。雜原子O、N和S以及Si可置於雜烷基的任何內部位置處或置於烷基與分子的其餘部分相連接的位置處。實例包括(但不限於)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個雜原子可為連續的，諸如，-CH2-NH-OCH3與-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，術語「雜亞烴基」，其單獨地或作為另一取代基的一部分是意謂源自雜烷基的如下(但不限於)由-CH2-CH2-S-CH2-CH2-與-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示的二價基團。對於雜亞烴基而言，相同或不同的雜原子也可位於鏈的任一端或兩端(包括(但不限於)亞烴基氧基、亞烴基二氧基、亞烴基氨基、亞烴基二氨基、氨基氧基亞烴基等等)。此外，對於亞烴基與雜亞烴基連接基團而言，連接基團的式的書寫方向並不意味著連接基團的定向。例如，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-與-R′C(O)2-。
術語「環烷基」和「雜環烷基」，除非另有說明，否則其單獨地或與其它術語組合是分別表示「烷基」與「雜烷基」的環狀形式。因而，環烷基或雜環烷基可包括飽和、部分不飽和與完全不飽和的環鍵。另外，對雜環烷基而言，雜原子可位於雜環與分子的其餘部分相連接的位置。環烷基的實例包括(但不限於)環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等等。雜環烷基的實例包括(但不限於)1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。另外，所述術語涵蓋雙環和三環結構。類似地，術語「雜環亞烴基」，其單獨地或作為另一取代基的一部分是意謂源自雜環烷基的二價基團，且術語「環亞烴基」，其單獨地或作為另一取代基的一部分是意謂源自環烷基的二價基團。
如本文中所使用的術語「水溶性聚合物」指的是可溶於水性溶劑中的任何聚合物。水溶性聚合物與GH(例如，hGH)多肽的連接可導致如下改變包括(但不限於)相對於未修飾形式來說，血清半衰期得到延長或調控，或治療半衰期得到延長或調控，免疫原性得到調控，諸如聚集體與多聚體形成的物理締合特性得到調控，改變受體結合，和改變受體二聚化或多聚化。水溶性聚合物可具有其自身的生物活性或可不具有其自身的生物活性，並且可以用作連接子將GH(例如，hGH)與其它物質(包括(但不限於)一種或一種以上的GH(例如，hGH)多肽或一種或一種以上的生物活性分子)連接。合適的聚合物包括(但不限於)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述在美國專利第5,252,714號中，所述專利以引用的方式併入本文中)、單甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚胺基酸、二乙烯基醚順丁烯二酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯醯胺、葡聚糖、包括硫酸葡聚糖的葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纖維素和纖維素衍生物(包括(但不限於)甲基纖維素和羧甲基纖維素)、澱粉和澱粉衍生物、多肽、聚亞烷基二醇和其衍生物、聚亞烷基二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和α-β-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺等等或其混合物。所述水溶性聚合物的實例包括(但不限於)聚乙二醇與血清白蛋白。
如本文中所使用的術語「聚亞烷基二醇」或「聚(烯烴二醇)」指的是聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。術語「聚亞烷基二醇」和/或「聚乙二醇」涵蓋線性和分枝聚合物且平均分子量在0.1kDa與100kDa之間。舉例而言，在諸如Shearwater Corporation的目錄「Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications」(2001)的商業供應商的商品目錄中列舉了其它示範性實施例。
除非另有說明，否則術語「芳基」意謂多不飽和芳族烴取代基，其可為單環或稠合在一起或共價連接的多環(包括(但不限於)1至3環)。術語「雜芳基」指的是含有1至4個選自N、O和S的雜原子的芳基(或環)，其中氮原子和硫原子視需要可被氧化且氮原子視需要可被季銨化。雜芳基可通過雜原子與分子的其餘部分相連接。芳基與雜芳基的非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基與雜芳基環系統中各者的取代基是選自下面所述的可接受取代基的群組。
為了簡便起見，術語「芳基」當與其它術語(包括(但不限於)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)組合使用時包括如上所定義的芳基和雜芳基。因而，術語「芳基烷基」意欲包括芳基與烷基相連接的那些基團(包括(但不限於)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，其包括碳原子(包括(但不限於)亞甲基)已經為(例如)氧原子(包括(但不限於)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等等)所置換的那些烷基。
上面各術語(包括(但不限於)「烷基」、「雜烷基」、「芳基」和「雜芳基」)意欲包括所示基團的經取代的形式和未經取代的形式。下面提供各類基團的示範性取代基。
烷基和雜烷基(包括常稱為亞烴基、烯基、雜亞烴基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基和雜環烯基的那些基團)的取代基可為多種選自(但不限於)以下基團的基團中的一個或一個以上的基團-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-滷素、-SiR′R″R、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，數量在0至(2m′+1)範圍內變化，其中m′為所述基團中的碳原子總數。R′、R″、R和R″″各自獨立指的是氫、經取代或未經取代的雜烷基、經取代或未經取代的芳基(包括(但不限於)經1-3個滷素原子取代的芳基)、經取代或未經取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。舉例而言，當本發明的化合物包括多個R基團時，如同當R′、R″、R和R″″基團中的多個基團存在時其各自是獨立地加以選定的那樣，各個R基團也是獨立地加以選定的。當R′和R″與同一氮原子相連接時，它們可與所述氮原子組合形成5元環、6元環或7元環。舉例而言，-NR′R″意欲包括(但不限於)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據對取代基的上面論述，所屬領域的技術人員將了解，術語「烷基」意欲包括包含與非氫基團相鍵結的碳原子的基團，諸如滷烷基(包括(但不限於)-CF3和-CH2CF3)和醯基(包括(但不限於)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
類似於關於烷基所述的取代基，芳基和雜芳基的取代基可變化且是選自(但不限於)以下基團滷素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-滷素、-SiR′R″R、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R)-NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟基(C1-C4)烷氧基和氟基(C1-C4)烷基，數量在0至芳族環系統上的可用價總數範圍內變化；且其中R′、R″、R和R″″是獨立選自氫、烷基、雜烷基、芳基和雜芳基。舉例而言，當本發明的化合物包括多個R基團時，如同當R′、R″、R和R″″基團中的多個基團存在時其各自是獨立地加以選定的那樣，各個R基團也是獨立地加以選定的。
如本文中所使用的術語「經調控的血清半衰期」意謂經修飾的hGH的循環半衰期相對於其未修飾形式的正性或負性變化。血清半衰期是通過在投予hGH後的各個時間點採集血液樣本並測定各個樣本中的分子濃度來測量。血清濃度與時間的相互關係使得血清半衰期可計算。希望延長的血清半衰期具有至少約兩倍，但是(例如)在其能提供令人滿意的給藥方案或避免毒性效應的情況下較小的延長可能是有用的。在一些實施例中，延長量為至少約三倍、至少約五倍或至少約十倍。
如本文中所使用的術語「經調控的治療半衰期」意謂治療有效量的經修飾的hGH的半衰期相對於其未修飾形式的正性或負性變化。治療半衰期是通過在投藥後的各個時間點測量分子的藥物動力學和/或藥效性質來測量。希望延長的治療半衰期能提供特定有益的給藥方案、特定有益的總劑量或避免不良效應。在一些實施例中，延長的治療半衰期由增強的效能、修飾分子與其靶點的增強或減弱的結合、通過酶(諸如，蛋白酶)進行的分子分解的增強或減弱，或未修飾分子的另一參數或作用機理的增強(加)或減弱(小)而產生。
術語「分離」當應用於核酸或蛋白質時，其表示所述核酸或蛋白質不含有至少一些在天然狀態下與其締合的細胞組分，或表示所述核酸或蛋白質已經被濃縮到大於其在活體內或活體外產生的濃度的水平。其可呈均態。被分離的物質可呈乾燥狀態或半乾狀態，或者處於溶液(包括(但不限於)水溶液)狀態。其可為包含另外的醫藥學上可接受的載劑和/或賦形劑的醫藥組合物的組分。純度和均質性通常是使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜的分析化學技術來測定。為存在於製劑中的最主要物質的蛋白質是大體上純化的。具體來說，被分離的基因是從側接基因並編碼不同於所關注的基因的蛋白質的開放閱讀框分離。術語「純化的」表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中產生實質上為一條的帶。確切地說，其可以意謂核酸或蛋白質的純度為至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更大純度。
術語「核酸」指的是呈單股鏈形式或雙股鏈形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸和其聚合物。除非特別限制，否則術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參考核酸相似的結合性質並且以類似於天然存在的核苷酸的方式代謝。除非另有特別限制，否則所述術語也指的是包括PNA(肽核酸)、用於反義技術中的DNA的類似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等等)的寡核苷酸類似物。除非另外指出，否則特定的核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限於)簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指示的序列。特別地，簡併密碼子取代可以通過產生如下序列而達成，其中一個或一個以上選定的(或全部)密碼子的第三位置由混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J. Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」 在本文中可交換使用以用來指胺基酸殘基的聚合物。即，針對多肽的描述同樣適用於肽的描述和蛋白質的描述，並且反之亦然。所述術語適用於天然存在的胺基酸聚合物以及其中一個或一個以上的胺基酸殘基為非天然編碼的胺基酸的胺基酸聚合物。如本文中所使用的術語涵蓋具有任何長度的胺基酸鏈，其包括全長蛋白質，其中胺基酸殘基是通過共價肽鍵連接。
術語「胺基酸」指的是天然存在的和非天然存在的胺基酸，以及以類似於天然存在的胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然編碼的胺基酸為20種常見的胺基酸(丙氨酸、精氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)和吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸。胺基酸類似物指的是具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，即，具有與氫、羧基、氨基和R基團鍵結的α碳的化合物，諸如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。所述類似物具有經修飾的R基團(諸如，正亮氨酸)或經修飾的肽主鏈，但保持與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。
胺基酸在本文中可以通過其通常已知的3字母符號或者通過由IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission推薦的1字母符號來提及。同樣地，核苷酸可以通過其通常被接受的單字母代碼來提及。
「經保守修飾的變異體」適用於胺基酸和核酸序列。對於特定的核酸序列來說，「經保守修飾的變異體」指的是編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸，或在核酸不編碼胺基酸序列時，指的是基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡併，許多功能相同的核酸編碼任何指定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因而，在丙氨酸是由密碼子來確定的每一個位置處，所述密碼子能夠被改變成所描述的任何對應密碼子而不改變所編碼的多肽。所述核酸變化是「靜止變化」，其為一種保守修飾的變化。本文中編碼多肽的每一個核酸序列也描述核酸的每一種可能的靜止變化。所屬領域的技術人員將認識到，核酸中的各個密碼子(除通常僅為甲硫氨酸的密碼子的AUG和通常僅為色氨酸的密碼子的TGG外)能被修飾以產生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各種靜止變化隱含在所描述的各個序列中。
關於胺基酸序列，所屬領域的技術人員將認識到，改變、添加或除去所編碼序列中的單個胺基酸或小百分比的胺基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或添加是一種「保守修飾的變化」，其中所述改變引起胺基酸的缺失、胺基酸的添加或化學性質相似的胺基酸對胺基酸的取代。提供功能相似的胺基酸的保守取代表對於所屬領域的技術人員來說是已知的。如此的經保守修飾的變異體是除本發明的多態變異體、種間同系物和等位基因之外的變異體並且不排除本發明的多態變異體、種間同系物和等位基因。
提供功能相似的胺基酸的保守取代表對於所屬領域的技術人員來說是已知的。以下八組各含有為彼此的保守取代的胺基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天門冬氨酸(D)、穀氨酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(參見，例如，Creighton，ProteinsStructures and Molecular Properties，W H FreemanCo.；第二版(1993年12月))在兩個或兩個以上核酸或多肽序列的情況下，術語「相同」或百分比「同一性」指的是兩個或兩個以上為相同的序列或子序列。當在比較窗口上或指定區域上比較和比對最大對應性時，如使用以下序列比較算法(或所屬領域的技術人員可利用的其它算法)中的一種算法或通過手工比對和目視檢查而測得，如果序列具有為相同的胺基酸殘基或核苷酸的百分比(即，在規定區域上有至少約60％的同一性、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或至少約99％的同一性)，那麼所述序列就是「大體上相同的」。此定義也指的是測試序列的互補序列。同一性可存在於長度為至少約50個胺基酸或核苷酸的區域上，或存在於長度為75-100個胺基酸或核苷酸的區域上，或在未規定時，跨越多聚核苷酸或多肽的整個序列。
對於序列比較來說，通常一個序列充當與測試序列相比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機中，(必要時)指定子序列坐標並且指定序列算法程序參數。可使用默認的程序參數，或可指定替代性參數。序列比較算法隨後基於程序參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。
如本文中所使用的「比較窗口」包括涉及具有選自由20到600、通常為約50到約200、更通常為約100到約150組成的群組中的任何一毗連位數的區段，其中在兩個序列被最佳比對後，可將一序列與具有相同毗連位數的參考序列相比較。用於比較的序列比對方法對於所屬領域的技術人員來說是已知的。用於比較的最佳序列比對，可包括(但不限於)通過Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2482c的局部同源性算法，通過Needleman和Wunsch(1970)J. Mol.Biol.48443的同源性比對算法，通過Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′I.Acad.Sci.USA 852444的尋找相似性方法，通過這些算法的計算機化實施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通過手工比對和目視檢查(參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))來進行。
適合用於測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個實例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分別被描述於Altschul等人(1997)Nuc.Acids Res.253389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410中。用於執行BLAST分析的軟體可通過能在www.ncbi.nlm.nih.gov網址得到的National Center for Biotechnology Information而公開獲得。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用於核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M＝5、N＝-4和兩股鏈的比較作為默認值。就胺基酸序列來說，BLASTP程序使用字長為3和期望值(E)為10作為默認值，並且BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)使用比對值(B)為50、期望值(E)為10、M＝5、N＝-4和兩股鏈的比較作為默認值。BLAST算法通常是在「低複雜度」濾波器關閉時執行。
BLAST算法也執行兩個序列之間的相似性的統計分析(參見，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一種量度為最小和概率(P(N))，其表示兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配將偶然發生的概率。舉例而言，如果在測試核酸與參考核酸的比較中的最小和概率小於約0.2，或小於約0.01，或小於約0.001，那麼視所述核酸與參考序列相似。
短語「選擇性地(或特異性地)與……雜交」指的是當一特定核苷酸序列存在於複雜混合物(包括(但不限於)總細胞或文庫DNA或RNA)中時，在嚴格雜交條件下，分子僅與所述核苷酸序列結合、複合或雜交。
短語「嚴格雜交條件」指的是在如此項技術中已知的低離子強度和高溫條件下，使DNA、RNA、PNA或其它核酸模擬物或其組合的序列進行雜交。通常，在嚴格條件下，探針將與核酸的複雜混合物(包括(但不限於)總細胞或文庫DNA或RNA)中的其靶子序列雜交，但不與所述複雜混合物中的其它序列雜交。嚴格條件是序列依賴性的並且在不同情況下將為不同的。較長的序列特別在較高的溫度下雜交。核酸雜交的廣泛指南可見於Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，「Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid assays」(1993)中。通常，將嚴格條件選定為比在確定的離子強度、pH值下的特定序列的熱力學熔點(Tm)低約5-10℃。Tm是在平衡狀態下50％與靶互補的探針與靶序列雜交(因為在Tm下靶序列過量存在，所以在平衡狀態下佔用50％的探針)時的溫度(在確定的離子強度、pH值和核酸濃度下)。嚴格條件可以是在7.0到8.3的pH值下，鹽濃度小於約1.0M鈉離子，通常為約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)並且對於短探針(包括(但不限於)10到50個核苷酸)來說，溫度為至少約30℃且對於長探針(包括(但不限於)大於50個核苷酸)來說，溫度為至少約60℃的那些嚴格條件。嚴格條件也可以通過添加諸如甲醯胺的去穩定劑來實現。對於選擇性雜交或特異性雜交來說，正信號可以為至少2倍背景雜交，視需要為10倍背景雜交。示範性嚴格雜交條件可如下50％甲醯胺、5X SSC和1％SDS，在42℃下培育，或5X SSC、1％SDS，在65℃下培育，並在65℃下，在0.2X SSC和0.1％SDS中洗滌。所述洗滌可執行5、15、30、60、120或120分鐘以上。
如本文中所使用的術語「真核生物」指的是屬於真核生物種系發生域(phylogeneticdomain Eucarya)的生物體，諸如，動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥等)、纖毛蟲、植物(包括(但不限於)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微粒子蟲目、原生生物等。
如本文中所使用的術語「非真核生物」指的是非真核有機體。舉例而言，非真核有機體可屬於真細菌(包括(但不限於)大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、嗜熱細菌(Thermus thermophilics)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、螢光假單胞菌( Pseudomonas fluorescens)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等)種系發生域，或古菌(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、橫川病毒(Methanobacterium thermoautotrophicum)、諸如沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferax volcanii)和嗜鹽桿菌種(Halobacterium species)NRC-1的嗜鹽桿菌屬(Halobacterium)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜熱菌敏捷氣熱菌(Aeuropyrum pernix)等)種系發生域。
如本文中所使用的術語「受檢者」指的是動物，在一些實施例中為哺乳動物，並且在其它實施例中為人類，其為治療、觀察或實驗的對象。
如本文中所使用的術語「有效量」指的是所投予的經修飾的非天然胺基酸多肽的量，其在某種程度上將減輕正治療的疾病、病症或失調症的一種或一種以上的症狀。可投予含有本文所述的經修飾的非天然胺基酸多肽的組合物來用於預防性、增強性和/或治療性的治療。
術語「增強」意謂增加或延長所要效果的效力或持續時間。因此，就增強治療劑的效果來說，術語「增強」指的是在效力或持續時間方面，增加或延長其它治療劑對系統所起的效果的能力。如本文中所使用的「增強有效量」指的是足以增強所要系統中另一治療劑的效果的量。當用於患者時，有效用於此用途的量將視疾病、失調症或病症的嚴重程度和病程、先前治療、患者的健康狀況和對藥物的反應以及治療醫師的判斷而定。
如本文中所使用的術語「經修飾」指的是對指定多肽所作的任何改變，諸如，改變多肽的長度、多肽的胺基酸序列、化學結構、共翻譯修飾或翻譯後修飾。術語「(經修飾的)」形式意謂所討論的多肽視需要被修飾，即，所討論的多肽可被修飾或不被修飾。
術語「經翻譯後修飾的」指的是天然或非天然胺基酸在其已經併入多肽鏈中後對所述胺基酸所作的任何修飾。所述術語涵蓋(僅舉例來說)共翻譯的活體內修飾、共翻譯的活體外修飾(諸如，在無細胞翻譯系統中)、翻譯後的活體內修飾和翻譯後的活體外修飾。
在預防性應用中，將含有經修飾的非天然胺基酸多肽的組合物投予易於患上特定疾病、失調症或病症或者不然冒有患上特定疾病、失調症或病症的危險的患者。將所述量定義為「預防有效量」。在此種用途中，精確的量也視患者的健康狀態、體重等等因素而定。所屬領域的技術人員對通過常規實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)來確定所述預防有效量有充分了解。
術語「經保護的」指的是防止化學反應性官能團在某些反應條件下發生反應的「保護基」或部分的存在。保護基將視被保護的化學反應性基團的類型而變化。舉例而言，如果化學反應性基團是胺或醯肼，那麼保護基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學反應性基團是硫醇，那麼保護基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學反應性基團是諸如丁酸或丙酸的羧酸的基團，或羥基，那麼保護基可為苯甲基或諸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。此項技術中已知的其它保護基，包括諸如Nvoc和MeNvoc的對光不穩定的基團，也可以用於本文所述的方法和組合物中或與本文所述的方法和組合物一起使用。此項技術中已知的其它保護基也可以用於本文所述的方法和組合物中或與本文所述的方法和組合物一起使用。
僅舉例來說，封端基/保護基可以選自下列基團。
其它保護基是描述於Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第三版，John Wiley Sons，New York，NY，1999中，所述參考文獻全文以引用的方式併入本文中。
在治療應用中，將含有經修飾的非天然胺基酸多肽的組合物投予已患有疾病、病症或失調症的患者，其量足以治癒或至少在某種程度上抑制疾病、失調症或病症的症狀。將所述量定義為「治療有效量」，並且其將視疾病、失調症或病症的嚴重程度和病程、先前治療、患者的健康狀況和對藥物的反應以及治療醫師的判斷而定。所屬領域的技術人員對通過常規實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)來確定所述治療有效量有充分了解。
術語「治療」是用來指預防性和/或治療性治療。
本文提供的非天然編碼的胺基酸多肽可以包括經同位素標記的化合物，其具有一個或一個以上的為具有不同於自然界中常見的原子質量或質量數的原子質量或質量數的原子所置換的原子。能併入本發明化合物中的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分別諸如為2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文所述的某些經同位素標記的化合物，例如將諸如3H和14C的放射性同位素併入其中的那些化合物，可用於藥物和/或基質組織分布分析。另外，用諸如氘(即，2H)的同位素來取代能提供某些由於較高代謝穩定性而導致的治療優勢，例如，延長的活體內半衰期或降低的劑量需求。
包括(但不限於)非對映異構體、對映異構體和其混合物的所有異構體被視為本文所述的組合物的一部分。在另外或其它實施例中，非天然編碼的胺基酸多肽在投予有需要的生物體後發生代謝而產生代謝物，隨後所述代謝物用於產生所要效果，包括所要治療效果。在其它或另外實施例中的是非天然編碼的胺基酸多肽的活性代謝物。
在一些情況下，非天然編碼的胺基酸多肽可以呈互變異構體形式存在。此外，本文所述的非天然編碼的胺基酸多肽可以非溶劑化形式以及與諸如水、乙醇等等的醫藥學上可接受的溶劑一起形成的溶劑化形式存在。溶劑化形式也被視為在本文中有揭示。所屬領域的技術人員將認識到，本文中的一些化合物可以若干互變異構形式存在。所有所述互變異構形式被視為本文所述的組合物的一部分。
除非另有說明，否則採用屬於此項技術技能範圍的質譜分析、NMR、HPLC、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術和藥理學的常規方法。
實施方式I.引言在本發明中提供包含至少一個非天然胺基酸的GH(例如，hGH)分子。在本發明的某些實施例中，具有至少一個非天然胺基酸的GH(例如，hGH)多肽包括至少一種翻譯後修飾。在一個實施例中，所述至少一種翻譯後修飾包含利用所屬領域的技術人員已知的適用於特定反應性基團的化學方法將包含第二反應性基團的包括(但不限於)以下物質的分子與包含第一反應性基團的至少一個非天然胺基酸相連接標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光致交聯劑、放射性核素、細胞毒素化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白質或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反義多聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米粒子、自旋標記、螢光團、含金屬的部分、放射性部分、新穎官能團、共價地或非共價地與其它分子相互作用的基團、光籠鎖部分(photocaged moiety)、光化輻射可激發部分、光敏異構化部分、生物素、生物素的衍生物、生物素類似物、併入重原子的部分、可化學裂解的基團、可光致裂解的基團、伸長的側鏈、經碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經同位素標記的部分、生物物理學探針、發磷光的基團、化學發光基團、電子密集基團、磁性基團、插入基團、發色團、能量轉移劑、生物活性劑、可檢測的標記、小分子、量子點、納米傳導物、放射性核苷酸、放射性傳導物、中子俘獲劑或上述物質的任何組合或任何其它所要的化合物或物質。舉例而言，所述第一反應性基團為炔基部分(包括(但不限於)在炔丙基有時也被稱為乙炔部分時，在非天然胺基酸對炔丙基氧基苯丙氨酸中)且所述第二反應性基團為疊氮基部分，且利用[3+2]環加成化學方法。在另一個實施例中，第一反應性基團為疊氮基部分(包括(但不限於)在非天然胺基酸對疊氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反應性基團為炔基部分。在本發明的經修飾的GH(例如，hGH)多肽的某些實施例中，使用包含至少一種翻譯後修飾的至少一個非天然胺基酸(包括(但不限於)含有酮基官能團的非天然胺基酸)，其中所述至少一種翻譯後修飾包含糖類部分。在某些實施例中，翻譯後修飾是在活體內於真核細胞中或於非真核細胞中進行。
在某些實施例中，蛋白質包括至少一種通過一種宿主細胞在活體內進行的翻譯後修飾，其中所述翻譯後修飾一般不通過另一種宿主細胞類型來進行。在某些實施例中，蛋白質包括至少一種通過真核細胞在活體內進行的翻譯後修飾，其中所述翻譯後修飾一般不通過非真核細胞來進行。翻譯後修飾的實例包括(但不限於)糖基化作用、乙醯化作用、醯化作用、脂質修飾、棕櫚醯化作用、棕櫚酸酯添加、磷酸化作用、糖脂鍵修飾等等。在一個實施例中，翻譯後修飾包含通過GlcNAc-天門冬醯胺鍵使寡糖與天門冬醯胺相連接(包括(但不限於)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等等情況)。在另一個實施例中，翻譯後修飾包含通過GalNAc-絲氨酸鍵、GalNAc-蘇氨酸鍵、GlcNAc-絲氨酸鍵或GlcNAc-蘇氨酸鍵使寡糖(包括(但不限於)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸相連接。在某些實施例中，本發明的蛋白質或多肽可包含分泌序列或定位序列、抗原決定基標籤、FLAG標籤、聚組氨酸標籤、GST融合物等等。分泌信號序列的實例包括(但不限於)原核分泌信號序列、真核分泌信號序列、5′最佳化以用於細菌表達的真核分泌信號序列、新穎分泌信號序列、果膠酸裂合酶分泌信號序列、OmpA分泌信號序列和噬菌體分泌信號序列。分泌信號序列的實例包括(但不限於)STII(原核)、Fd GIII和M13(噬菌體)、Bgl2(酵母)和源自轉座子的信號序列bla。
所關注的蛋白質或多肽可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或10個或10個以上非天然胺基酸。所述非天然胺基酸可為相同的或不同的，例如，在蛋白質中可存在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同的非天然胺基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上不同的部位。在某些實施例中，存在於蛋白質的天然存在的形式中的至少一個(但少於總數)的特定胺基酸經非天然胺基酸取代。
本發明提供基於包含至少一個非天然編碼的胺基酸的GH超基因家族成員(特別為hGH)的方法和組合物。將至少一個非天然編碼的胺基酸引入GH超基因家族成員中可使得涉及(包括(但不限於))與一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的特定化學反應但不與通常存在的20種胺基酸反應的結合化學作用得以應用。在一些實施例中，包含非天然編碼的胺基酸的GH超基因家族成員通過非天然編碼的胺基酸的側鏈與諸如聚乙二醇(PEG)的水溶性聚合物相連接。本發明提供一種用PEG衍生物選擇性地修飾蛋白質的高效方法，其涉及響應於選擇密碼子將非遺傳編碼的胺基酸(包括(但不限於)含有在20種天然併入的胺基酸中不存在且包括(但不限於)酮部分、疊氮部分或乙炔部分的官能團或取代基的那些胺基酸)選擇性併入蛋白質中，和隨後用反應性適當的PEG衍生物來修飾那些胺基酸。一旦併入後，接著就能通過利用所屬領域的技術人員已知的適用於存在於非天然編碼的胺基酸中的特定官能團或取代基的化學方法來修飾胺基酸側鏈。多種已知的化學方法適用於本發明將水溶性聚合物併入蛋白質中。所述方法包括(但不限於)分別使包括(但不限於)乙炔或疊氮衍生物發生胡氏根[3+2]環加成反應(參見，例如，Padwa，A.，在Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)，Trost，B.M.編，Pergamon，Oxford，第1069-1109頁中；和Huisgen，R.，在1，3-Dipolar CycloadditionChemistry，(1984)， Padwa，A.編，Wiley，New York，第1-176頁中)。
因為胡氏根[3+2]環加成方法涉及環加成反應而不是親核取代反應，所以能以非常高的選擇性對蛋白質進行修飾。其反應可以在室溫、水性條件下通過將催化量的Cu(I)鹽添加到反應混合物中而以極佳的區域選擇性(1，4＞1，5)進行。參見，例如，Tomoe等人，(2002)J.Org.Chem.673057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599；和WO 03/101972。可以通過[3+2]環加成反應加入到本發明的蛋白質中的分子包括具有合適官能團或取代基的幾乎任何分子，包括(但不限於)疊氮基或乙炔衍生物。這些分子可以分別加入到具有乙炔基的非天然的胺基酸(包括(但不限於)對炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有疊氮基的非天然的胺基酸(包括(但不限於)對疊氮基苯丙氨酸)中。
由胡氏根[3+2]環加成反應得到的五元環在還原環境下一般不可逆，且在水性環境下於長期時間內具有抗水解穩定性。因此，多種物質的物理和化學特性可用本發明的活性PEG衍生物在要求高的水性條件下來修飾。甚至更為重要的是因為疊氮部分和乙炔部分相互間是特異性的(且例如不與20種常見的遺傳編碼的胺基酸中的任一種胺基酸反應)，所以能以非常高的選擇性在一個或一個以上的特定部位上對蛋白質進行修飾。
本發明也提供具有一個或一個以上的乙炔部分或疊氮部分的PEG衍生物和相關親水性聚合物的具水溶性和水解穩定性的衍生物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物對與已響應於選擇密碼子選擇性地引入蛋白質中的疊氮部分偶合具有高度選擇性。同樣地，含有疊氮部分的PEG聚合物衍生物對與已響應於選擇密碼子選擇性地引入蛋白質中的乙炔部分偶合具有高度選擇性。
更明確地說，疊氮部分包含(但不限於)烷基疊氮部分、芳基疊氮部分和該等疊氮部分的衍生物。只要維持乙炔特異反應性，烷基疊氮部分和芳基疊氮部分的衍生物可以包括其它取代基。乙炔部分包含烷基乙炔部分和芳基乙炔部分和各自的衍生物。只要維持疊氮特異反應性，烷基乙炔部分和芳基乙炔部分的衍生物可以包括其它取代基。
本發明提供具有各種官能團、取代基或部分的物質與包括(但不限於)以下物質的其它物質的結合物標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光致交聯劑；放射性核素；細胞毒素化合物；藥物；親和標記；光親和標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螫合劑；輔助因子；脂肪酸；碳水化合物；多聚核苷酸；DNA；RNA；反義多聚核苷酸；糖類；水溶性樹枝狀聚合物；環糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；螢光團、含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；共價地或非共價地與其它分子相互作用的基團；光籠鎖部分；光化輻射可激發部分；光敏異構化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素類似物；併入重原子的部分；可化學裂解的基團；可光致裂解的基團；伸長的側鏈；經碳連接的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；有毒部分；經同位素標記的部分；生物物理學探針；發磷光的基團；化學發光基團；電子密集基團；磁性基團；插入基團；發色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測的標記；小分子；量子點；納米傳導物；放射性核苷酸；放射性傳導物；中子俘獲劑；或上述物質的任何組合，或任何其它所要化合物或物質。本發明也包括具有疊氮部分或乙炔部分的物質與具有相應乙炔部分或疊氮部分的PEG聚合物衍生物的結合物。舉例來說，含有疊氮部分的PEG聚合物可在蛋白質中含有具有乙炔官能團的非遺傳編碼的胺基酸的位置處與生物活性分子相偶合。PEG與生物活性分子相偶合的鍵接包括(但不限於)胡氏根[3+2]環加成鍵接。
此項技術中已充分確定PEG可用於修飾生物材料的表面(參見，例如，美國專利第6,610,281號；Mehvar，R.，J.Pharm Pharm Sci.，3(1)125-136(2000)，其以引用的方式併入本文中)。本發明也包括包含具有一個或一個以上的反應性疊氮部位或乙炔部位的表面和一種或一種以上本發明的通過胡氏根[3+2]環加成鍵接與所述表面相偶合的含疊氮部分或乙炔部分的聚合物的生物材料。生物材料和其它物質也可通過不同於疊氮鍵接或乙炔鍵接的鍵接(諸如，通過包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的鍵接)與疊氮或乙炔活化的聚合物衍生物相偶合以使疊氮部分或乙炔部分可用於隨後反應。
本發明包括一種合成本發明的含疊氮部分和含乙炔部分的聚合物的方法。在含疊氮部分的PEG衍生物的情況下，疊氮部分可直接與聚合物的碳原子相鍵結。或者，含疊氮部分的PEG衍生物可以通過使在一個末端具有疊氮部分的鍵接劑與常規的活化聚合物相連接來製備以便使所得的聚合物在其末端具有疊氮部分。在含乙炔部分的PEG衍生物的情況下，乙炔部分可以直接與聚合物的碳原子相鍵結。或者，含乙炔部分的PEG衍生物可以通過使在一個末端具有乙炔部分的鍵接劑與常規的活化聚合物相連接來製備以便使所得的聚合物在其末端具有乙炔部分。
更明確地說，在含疊氮部分的PEG衍生物的情況下，具有至少一個活性羥基部分的水溶性聚合物發生反應而產生在其上具有更具反應性的部分(諸如，甲磺酸鹽、三氟乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽或滷素離去基團)的經取代聚合物。含有磺醯基酸滷化物、滷素原子和其它離去基團的PEG衍生物的製備和使用對於所屬領域的技術人員來說是已知的。所得的經取代的聚合物接著發生反應而在聚合物的末端以疊氮部分取代所述更具反應性的部分。或者，具有至少一個活性的親核或親電子部分的水溶性聚合物與在一個末端具有疊氮部分的鍵接劑反應以便在PEG聚合物與鍵接劑之間形成共價鍵並且使疊氮部分位於聚合物的末端。包括胺、硫醇、醯肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等等的親核和親電子部分對於所屬領域的技術人員來說是已知的。
更明確地說，在含乙炔部分的PEG衍生物情況下，具有至少一個活性羥基部分的水溶性聚合物發生反應而由含有乙炔部分的前體置換滷素或其它活化的離去基團。或者，具有至少一個活性的親核或親電子部分的水溶性聚合物與在一個末端具有乙炔部分的鍵接劑反應以便在PEG聚合物與鍵接劑之間形成共價鍵並且使乙炔部分位於聚合物的末端。在有機合成部分中和在PEG衍生物的製備和使用中滷素部分、活化的離去基團、親核和親電子部分的使用對於所屬領域的技術人員而言是充分確定的。
本發明也提供一種對蛋白質進行選擇性修飾以將其它物質(包括(但不限於)水溶性聚合物，諸如，PEG和PEG衍生物，其含有疊氮部分和乙炔部分)加入到經修飾的蛋白質中的方法。含疊氮部分和乙炔部分的PEG衍生物可用於改變生物相容性、穩定性、溶解性和缺乏免疫原性較為重要的表面和分子的性質，而同時提供使PEG衍生物與蛋白質相連接的比此項技術中先前已知的手段更具選擇性的手段。
II.生長激素超基因家族以下蛋白質包括由生長激素(GH)超基因家族的基因所編碼的那些蛋白質(Bazan，F.，Immunology Today 11350-354(1990)；Bazan，J.F.Science 257410-413(1992)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Ihle，J.N.，SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINERECEPTORS(1996))生長激素、催乳激素、胎盤催乳質、促紅細胞生成素(EPO)、血栓形成素(TPO)、白細胞間介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亞單位)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫狀神經營養因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、α幹擾素、β幹擾素、ε幹擾素、γ幹擾素、ω幹擾素、τ幹擾素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和心肌營養素-1(CT-1)(「GH超基因家族」)。可預期此基因家族的另外成員將在將來通過基因克隆和定序來鑑別。儘管GH超基因家族的成員一般具有有限的胺基酸或DNA序列同一性，但是其具有類似的二級和三級結構。共有的結構特徵使基因家族的新成員容易被鑑別並且使本文所述的非天然的胺基酸方法和組合物得以類似地加以應用。考慮到GH超基因家族的成員之間的結構同源性程度，可以利用本發明將非天然編碼的胺基酸併入GH超基因家族的任何成員中。此蛋白質家族中的每個成員皆包含一個四螺旋束，在圖1中顯示其一般結構。在圖2、圖3、圖4和圖5中分別顯示家族成員hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的一般結構。
包括G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314435(1992)；Zink等人，Biochemistry 338453(1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K.等人，Science 1541779-1782(1991)；Walter等人，J. Mol.Biol 2241075-1085(1992))、IL-2(Bazan，J.F.和McKay，D.B.，Science 257410-413(1992))、IL-4(Redfield等人，Biochemistry 3011029-11035(1991)；Powers等人，Science 2561673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人，Nature 363172-176(1993))的大量細胞因子的結構已經通過X射線衍射和NMR研究加以確定並且儘管缺乏顯著的一級序列同源性，但是其顯示就GH結構而言有驚人的保守性。基於建模和其它研究，IFN被認為是此家族的成員(Lee等人，J.Interferon Cytokine Res.15341(1995)；Murgolo等人，Proteins 1762(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 41453(1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274661(1997))。基於建模和突變研究，EPO被認為是此家族的成員(Boissel等人，J. Biol.Chem.26815983-15993(1993)；Wen等人，J.Biol.Chem.26922839-22846(1994))。現認為所有上述細胞因子和生長因子構成一個大的基因家族。
除具有相似的二級和三級結構之外，此家族的成員共有的性質為其必定使細胞表面受體發生寡聚化以激活細胞內信號傳遞路徑。包括(但不限於)GH和EPO的一些GH家族成員與單一類型的受體相結合併且使其形成同源二聚體。包括(但不限於)IL-2、IL-4和IL-6的其它家族成員與多於一種類型的受體相結合併且使所述受體形成雜二聚體或高級聚集體(Davis等人，(1993)，Science 2601805-1808；Paonessa等人，(1995)，EMBO J.141942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995))。突變研究已顯示，這些其它的細胞因子和生長因子如同GH含有多個受體結合部位，通常為2個受體結合部位，並且依序結合其同源受體(Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939471-9476)。如同GH，這些其它的家族成員的主要受體結合部位主要存在於4個α螺旋和A-B環中。參與受體結合的螺旋束中的特定胺基酸在家庭成員之間不相同。與GH超基因家族的成員相互作用的大部分細胞表面受體在結構上是相關的並且構成第二個大的多基因家族。參見，例如，美國專利第6,608,183號，其以引用的方式併入本文中。
從GH超基因家族的各個成員的突變研究中得到的一般結論是連接α螺旋的環一般不趨向於涉及到受體結合中。特別是，短B-C環顯現對於多數(如果不是所有的話)的家族成員的受體結合來說為非必需的。為此，在GH超基因家族的成員中，B-C環可以經如本文所述的非天然編碼的胺基酸取代。A-B環、C-D環(和GH超家族的幹擾素/IL-10樣成員的D-E環)也可以經非天然存在的胺基酸取代。接近螺旋結構A並且遠離最後螺旋結構的胺基酸也不趨向於涉及到受體結合中並且也可以是用於引入非天然存在的胺基酸的部位。在一些實施例中，在包括(但不限於)A-B、B-C、C-D或D-E環的前1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或7個以上的胺基酸的環結構內的任何位置處用非天然編碼的胺基酸取代。在一些實施例中，在A-B、B-C、C-D或D-E環的後1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或7個以上的胺基酸內用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
包括(但不限於)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12 p35、IL-13、IL-15和β幹擾素的GH家族的某些成員含有N-連接和/或O-連接的糖。蛋白質中的糖基化作用部位幾乎完全存在於環區域中而不存在於α螺旋束中。因為環區域一般不涉及到受體結合中並且因為其是用於糖基團的共價連接的部位，所以其可以是用於將非天然存在的胺基酸取代引入蛋白質中的有用部位。在蛋白質中包含N-連接和O-連接的糖基化作用部位的胺基酸可以是非天然存在的胺基酸取代的部位，原因在於這些胺基酸是表面暴露的。因此，天然蛋白質能容許在這些部位可有龐大的糖基團與蛋白質相連接並且糖基化作用部位趨向於位於遠離受體結合部位處。
有可能在將來發現GH超基因家族的其它成員。GH超基因家族的新成員可以通過對預測蛋白質序列的計算機輔助二級和三級結構分析以及通過經設計用來鑑別與特定靶相結合的分子的選擇技術而鑑別。GH超基因家族的成員通常具有4個或5個通過非螺旋狀胺基酸(環區域)連接的兩親螺旋結構。蛋白質可以在其N端含有疏水性信號序列以促進細胞分泌。這些後來發現的GH超基因家族的成員也包括在本發明中。相關申請案是2005年8月18日公開為WO 05/074650的標題為「Modified Four Helical BundlePolypeptides and Their Uses」的國際專利申請案，其以引用的方式併入本文。
因此，提供生長激素超基因家族的描述，僅僅是出於說明性目的並且僅為實例，而並非為對本文所述的方法、組合物、策略和技術的範圍的限制。此外，在本申請案中提及GH多肽旨在使用這一通用術語作為任何GH超基因家族成員的實例。因此，應了解本文中關於hGH多肽或蛋白質所述的修飾和化學作用能同樣地適用於GH超基因家族的任何成員，包括本文中特定列出的那些成員。
III.供本發明使用的一般重組核酸方法在本發明的許多實施例中，將使用重組方法來分離、克隆且常常為用來改變編碼所關注的GH(例如，hGH)多肽的核酸。將所述實施例用於(包括(但不限於))蛋白質表達或在源自GH(例如，hGH)多肽的變異體、衍生物、表達盒或其它序列的產生期間使用所述實施例。在一些實施例中，將編碼本發明的多肽的序列可操縱地連接到異源啟動子。宿主細胞中hGH的分離和GH的產生是在例如美國專利第4,601,980號、第4,604,359號、第4,634,677號、第4,658,021號、第4,898,830號、第5,424,199號、第5,795,745號、第5,854,026號、第5,849,535號、第6,004,931號、第6,022,711號、第6,143,523號和第6,608,183號中加以描述，所述專利以引用的方式併入本文中。
編碼包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽的核苷酸序列可以是基於包括(但不限於)具有SEQ ID NO2(hGH)中所示的胺基酸序列的母體多肽的胺基酸序列來合成的，並且接著改變核苷酸序列以便實現相關胺基酸殘基的引入(即，併入或取代)或除去(即，缺失或取代)。核苷酸序列可以便利地根據常規方法通過定點突變而被修飾。或者，核苷酸序列可以通過化學合成來製備，包括(但不限於)通過使用寡核苷酸合成器(其中寡核苷酸是基於所要多肽的胺基酸序列而設計)並且優先選擇在將產生重組多肽的宿主細胞中有利的那些密碼子來製備。舉例而言，一些編碼部分所要多肽的小寡核苷酸可以通過PCR、連接或連接鏈式反應來合成和裝配。參見，例如，Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88189-193(1991)；美國專利第6,521,427號，其以引用的方式併入本文中。
本發明利用重組遺傳學領域中的常規技術。揭示用於本發明的一般方法的基本文章包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人編，1994)。
描述分子生物學技術的一般文章包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular CloningTechniques.Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(「Sambrook」)和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人編，Current Protocols，a jointventure between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley Sons，Inc.(經由1999年加以補充)(「Ausubel」)。這些文章描述突變，載體、啟動子的使用和許多其它關於(包括(但不限於))基因或多聚核苷酸的產生的相關主題，所述基因或多聚核苷酸包括用於產生包括非天然胺基酸的蛋白質的選擇密碼子、正交tRNA、正交的合成酶和其配對。
本發明中使用各種類型的突變用於各種目的，包括(但不限於)產生新穎的合成酶或tRNA，使tRNA分子突變，使編碼合成酶的多聚核苷酸突變，產生tRNA庫，產生合成酶庫，產生選擇密碼子，使編碼非天然胺基酸的選擇密碼子插入所關注的蛋白質或多肽中。所述突變包括(但不限於)定點突變、隨機點突變、同源重組、DNA改組或其它回歸突變方法、嵌合構建、使用含尿嘧啶的模板的突變、寡核苷酸定向突變、經硫代磷酸酯修飾的DNA突變、使用缺口雙鏈DNA的突變等等或其任何組合。其它合適方法包括點錯配修復、使用修復缺陷宿主菌株的突變、限制-選擇和限制-純化、缺失突變、通過總基因合成的突變、雙鏈斷裂修復等等。包括(但不限於)涉及嵌合構建的突變也包括在本發明中。在一個實施例中，突變可通過天然存在的分子或已改變或突變的天然存在的分子的已知信息來加以指導，所述信息包括(但不限於)序列、序列比較、物理性質、二級、三級或四級結構、晶體結構等等信息。
本文中所見的文章和實例描述這些程序。其它信息見於以下公開案和其中引用的參考文獻中Ling等人，Approaches to DNA mutagenesisan overview，Anal Biochem.254(2)157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57369-374(1996)；Smith，In vitromutagenesis，Ann.Rev.Genet.19423-462(1985)；Botstein Shortle，Strategies andapplications of in vitro mutagenesis，Science2291193-1201(1985)；Carter，Site-directedmutagenesis，Biochem.J.2371-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，在Nucleic Acids Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.MJ.編，Springer Verlag，Berlin)(1987)中；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithoutphenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods inEnzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities，Science242240-245(1988)；Zoller Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis using M13-derived vectorsan efficient and general procedure for theproduction of point mutations in any DNA fragment，Nucleic Acids Res.106487-6500(1982)；Zoller Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clonedinto M13 vectors，Methods in Enzymol.100468-500(1983)；Zoller Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesisa simple method using two oligonucleotide primersand a single-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA，Nucl.Acids Res.138749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.138765-8785(1985)；Nakamaye Eckstein，Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenests，Nucl.Acids Res.149679-9698(1986)；Sayers等人，5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.16791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presenceof ethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16803-814；Kramer等人，The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.129441-9456(1984)；Kramer Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154350-367(1987)；Kramer等人，Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，Nucl.Acids Res.167207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutationsa gapped duplex DNA procedure withoutenzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.166987-6999(1988)；Kramer等人，Difierentbase/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNAmismatch-repair system of E.coli，Cell38879-887(1984)；Carter等人，Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl.Acids Res.134431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Methods in Enzymol.154382-403(1987)；Eghtedarzadeh Henikoff，Use ofoligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.145115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning ofa gene coding for the ribonuclease Sprotein，Science2231299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outersegment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.146361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesisan efficient method for generation of multiplemutations at defined sites，Gene34315-323(1985)；Grundstrm等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis，Nucl.AcidsRes.133305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repairin plasmids of Escherichia coliamethod for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering for unusual environments，CurrentOpinion in Biotechnology4450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19456-460(2001)；W.P.C.Stemmer，Nature370，389-91(1994)；和I.A.Lorimer，I.Pastan，NucleicAcids Res.23，3067-8(1995)。有關許多上述方法的其它詳細描述可見於Methods inEnzymology第154卷中，其也描述對使用各種突變方法的故障查找排除問題的有效控制。
(例如)用於例如使合成酶庫突變或改變tRNA的本發明的突變的寡核苷酸通常是根據Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.22(20)1859-1862，(1981)所述的固相亞磷醯胺三酯方法，如Needham-VanDevanter等人，Nucleic Acids Res.，126159-6168(1984)中所述(例如)使用自動合成器而化學合成。
本發明也涉及通過正交tRNA/RS對在活體內將非天然胺基酸併入的真核宿主細胞、非真核宿主細胞和生物體。宿主細胞是用本發明的多聚核苷酸或包括本發明的多聚核苷酸的構建物(包括(但不限於)本發明的載體，其可例如為克隆載體或表達載體)而加以基因改造(包括(但不限於)轉化、轉導或轉染)。舉例而言，將正交tRNA、正交tRNA合成酶和待衍生化的蛋白質的編碼區域可操縱地連接到在所要宿主細胞中起作用的基因表達控制元件。載體可(例如)呈質粒、粘質粒、噬菌體、細菌、病毒、裸露的多聚核苷酸或結合的多聚核苷酸形式。載體是通過包括以下方法的標準方法引入細胞和/或微生物中電穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，5824(1985))、由病毒載體感染、在小珠或粒子的基質中或在表面上具有核酸的小粒子的高速彈道滲透作用(Klein等人，Nature327.70-73(1987))和/或諸如此類。
經改造的宿主細胞可在常規營養培養基中培養，所述營養培養基在適當時為了諸如篩選步驟、活化啟動子或選擇轉化體的活性而加以改質。可視需要將這些細胞在轉基因生物體中培養。包括(但不限於)關於細胞分離和培養(例如，關於隨後的核酸分離)的其它有用參考文獻包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of BasicTechnique，第3版，Wiley-Liss，New York和其中所引用的參考文獻；Payne等人(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid SystemsJohn Wiley Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；FundamentalMethods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)和Atlas和Parks(編)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。
將靶核酸引入細胞中的一些熟知的方法是可利用的，其中的任何方法可用於本發明中。這些方法包括使接受者細胞與含有DNA的細菌原生質體融合、電穿孔、拋射體轟擊和用病毒載體進行感染(下文中進一步討論)等。細菌細胞可用來增大含有本發明的DNA構建物的質粒的數量。使細菌生長到對數期並且細菌中的質粒可通過此項技術中已知的各種方法來分離(參見，例如，Sambrook)。此外，用於從細菌中純化質粒的試劑盒是市售的(參見，例如，均來自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；來自Stratagene的StrataCleanTM；和來自Qiagen的QIAprepTM)。然後對經分離和純化的質粒進一步加以處理以產生用來轉染細胞或併入相關載體中以感染生物體的其它質粒。典型的載體含有轉錄和翻譯終止子、轉錄和翻譯起始序列以及啟動子(可用於調節特定靶核酸的表達)。載體視需要包含基因表達盒，所述表達盒含有至少一個獨立的終止子序列、允許盒在真核生物或原核生物或兩種生物中複製的序列(包括(但不限於)穿梭載體)和適於原核系統和真核系統的選擇標記物。載體適於在原核生物、真核生物或兩種生物中複製和整合。參見，Gillam Smith，Gene881(1979)；Roberts等人，Nature，328731(1987)；Schneider，E.等人，Protein Expr.Purif.6(1)10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger (所有同上)。可用於克隆的細菌和噬菌體的目錄(例如)由ATCC提供，例如由ATCC出版的The ATCC Catalogue ofBacteria and Bacteriophage(1992)Ghema等人(編)。關於定序、克隆和分子生物學的其它方面的其它基本程序和基礎的理論觀點也見於Watson等人(1992)RecombinantDNA(第2版)Scientific American Books，NY中。此外，基本上任何核酸(和幾乎任何經標記的核酸，無論是標準物還是非標準物)可為從各種商業來源中的任何來源定購的常規物或標準物，所述商業來源諸如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX，可在www.mcrc.com上獲得)、The Great American Gene Company(Ramona，CA，可在www.genco.com上獲得)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，可在www.expressgen.com上獲得)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和許多其它商業來源。
(a)選擇密碼子本發明的選擇密碼子擴展蛋白質生物合成機器的遺傳密碼子框架。舉例而言，選擇密碼子包括(但不限於)單一的三鹼基密碼子、無義密碼子(諸如包括(但不限於)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA)的終止密碼子)、非天然密碼子、4個或4個以上鹼基密碼子、稀有密碼子等等。所屬領域的技術人員容易了解，能被引入所要基因或多聚核苷酸中的選擇密碼子的數量範圍較寬，包括(但不限於)在編碼至少部分hGH多肽的單一多聚核苷酸中，存在1個或1個以上、2個或2個以上、3個或3個以上、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上的選擇密碼子。
在一個實施例中，方法涉及使用選擇密碼子，其為用於在細胞中活體內併入一個或一個以上非天然胺基酸的終止密碼子。例如，產生識別包括(但不限於)UAG的終止密碼子的O-tRNA，並且通過O-RS以所要的非天然胺基酸使其發生氨基醯化。天然存在的宿主的氨醯基-tRNA合成酶不能識別此O-tRNA。常規的定點突變能用來在所關注的多肽中的關注部位處引入包括(但不限於)TAG的終止密碼子。參見，例如，Sayers，J.R.等人(1988)，5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis.Nucleic Acids Res，16791-802。當O-RS、O-tRNA和編碼所關注的多肽的核酸在活體內結合時，非天然胺基酸是響應於UAG密碼子而得以併入以得到在指定位置處含有非天然胺基酸的多肽。
非天然胺基酸的活體內併入能在不顯著幹擾真核宿主細胞的情況下完成。舉例而言，因為UAG密碼子的抑制功效視包括(但不限於)琥珀抑制tRNA的O-tRNA與真核釋放因子(包括(但不限於)eRF)(其與終止密碼子相結合併且引發生長中的肽從核糖體釋放)之間的競爭而定，所以抑制功效可通過(包括(但不限於))增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表達水平來調節。
非天然胺基酸也能由稀有密碼子編碼。例如，當活體外蛋白質合成反應中的精氨酸濃度降低時，已經證明稀有的精氨酸密碼子AGG有效於通過經丙氨酸醯化的合成tRNA插入Ala。參見，例如，Ma等人，Biochemistry，327939(1993)。在此種情況下，合成tRNA與作為較少物質存在於大腸埃希氏桿菌中的天然存在的tRNAArg競爭。一些生物體不使用所有的三聯體密碼子。藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定的密碼子AGA已經被用於在活體外轉錄/翻譯提取物中插入胺基酸。參見，例如，Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.，254685(1997)。可產生本發明的組分以在活體內使用這些稀有密碼子。
選擇密碼子也包含擴展密碼子，包括(但不限於)4個或4個以上鹼基密碼子，諸如4個、5個、6個或6個以上鹼基密碼子。四鹼基密碼子的實例包括(但不限於)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等等。五鹼基密碼子的實例包括(但不限於)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等等。本發明的特徵包括基於移碼抑制使用擴展密碼子。4個或4個以上鹼基密碼子可使包括(但不限於)一個或一個以上非天然胺基酸插入相同蛋白質中。例如，在具有反密碼子環(例如，具有至少8-10個核苷酸的反密碼子環)的突變O-tRNA(包括(但不限於)特定移碼抑制tRNA)存在下，4個或4個以上鹼基密碼子可被讀取為單個胺基酸。在其它實施例中，反密碼子環可解碼包括(但不限於)至少四鹼基密碼子、至少五鹼基密碼子或至少六鹼基密碼子或至少六個以上鹼基密碼子。因為存在256種可能的四鹼基密碼子，所以可在相同細胞中使用4個或4個以上鹼基密碼子編碼多個非天然胺基酸。參見，Anderson等人，(2002)Exploring the Limitsof Codon and Anticodon Size，Chemistry and Biology，9237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic CodeSelection of Efficient Suppressors of Four-base Codons andIdentification of″Shifty″Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307755-769。
舉例而言，使用活體外生物合成方法，4-鹼基密碼子已經被用來將非天然胺基酸併入蛋白質中。參見，例如，Ma等人，(1993)Biochemistry，327939；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12134。通過兩個經化學醯化的移碼抑制tRNA使用CGGG和AGGU同時將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物活體外併入抗生蛋白鏈菌素中。參見，例如，Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12112194。在活體內研究中，Moore等人研究了具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，並且發現四聯體UAGA能通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13到26％的效率解碼，同時在0或-1框架中很少發生解碼。參見，Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298195。在一個實施例中，基於稀有密碼子或無義密碼子的擴展密碼子可用於本發明中，其可減少在其它不需要的部位的錯義讀取和移碼抑制。
對指定的系統來說，選擇密碼子還可包括天然三鹼基密碼子中的一種，其中內源性系統不使用(或很少使用)天然鹼基密碼子。舉例而言，所述系統包括缺乏能識別出天然三鹼基密碼子的tRNA的系統和/或其中三鹼基密碼子是稀有密碼子的系統。
選擇密碼子視需要包括非天然鹼基對。這些非天然鹼基對進一步擴展現有的遺傳字母表。一個額外的鹼基對使三聯體密碼子的數目從64增加到125。第三鹼基對的性質包括穩定的和選擇性的鹼基配對、通過聚合酶以高保真度有效地酶促併入DNA中以及在新生的非天然鹼基對合成後有效的連續引物延伸。可適合於方法和組合物的非天然鹼基對的描述包括(例如)Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating aminoacid analogues intoprotein，Nature Biotechnology，20177-182。也參見Wu，Y.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.12414626-14630。其它相關公開案列於下文中。
對活體內使用來說，非天然核苷為膜可透過的並且被磷酸化而形成相應的三磷酸鹽。此外，增加的遺傳信息是穩定的並且不會被細胞酶破壞。Benner和其他人早先嘗試利用不同於典型的沃森-克裡克(Watson-Crick)對中的那些模式的氫鍵鍵合模式，其中最值得注意的實例是iso-Ciso-G對。參見，例如，Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc，1118322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，34333；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4602。這些鹼基一般而言在某種程度上與天然鹼基錯配並且不能酶促地複製。Kool和同事證明，鹼基之間的疏水性堆積相互作用能代替氫鍵鍵合以促使鹼基對的形成。參見，Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4602；和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36，2825。在致力於開發滿足所有上述要求的非天然鹼基對的過程中，Schultz、Romesberg和同事已系統地合成了一系列非天然疏水性鹼基並對其作了研究。發現PICSPICS自身配對比天然鹼基對穩定，並且可有效地通過大腸埃希氏桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段(Klenow fragment，KF)併入DNA中。參見，例如，McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，12111585-6；和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，1223274。3MN3MN自身配對能通過KF以足以達成生物功能的效率和選擇性來合成。參見，例如，Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，1228803。然而，兩個鹼基充當進一步複製的鏈終止子。最近，已經發展出可用來複製PICS自身配對的突變DNA聚合酶。此外，可複製7AI自身配對。參見，例如，Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，1237439。還已研製出新穎的金屬鹼基配對DipicPy，其在結合銅(II)後形成穩定的配對。參見，Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，12210714。因為擴展密碼子和非天然密碼子本質上與天然密碼子正交，所以本發明的方法可以利用這種性質來產生其正交tRNA。
翻譯旁路系統也可用來將非天然胺基酸併入所要多肽中。在翻譯旁路系統中，大的序列被併入基因中但不被翻譯成蛋白質。序列含有充當誘導核糖體跳過序列並且在插入物的下遊恢復翻譯的提示的結構。
在某些實施例中，本發明的方法和/或組合物中的所關注的蛋白質或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包含至少1個選擇密碼子、至少2個選擇密碼子、至少3個選擇密碼子、至少4個選擇密碼子、至少5個選擇密碼子、至少6個選擇密碼子、至少7個選擇密碼子、至少8個選擇密碼子、至少9個選擇密碼子、10個或10個以上選擇密碼子。
編碼所關注的蛋白質或多肽的基因可使用所屬領域的技術人員所熟知和本文中描述的方法而發生突變以包括(例如)一個或一個以上用於併入非天然胺基酸的選擇密碼子。舉例而言，使所關注的蛋白質的核酸突變而包括供以併入一個或一個以上非天然胺基酸的一個或一個以上選擇密碼子。本發明包括任何所述變異體，其包括(但不限於)突變體，(例如)包括至少一個非天然胺基酸的任何蛋白質形式。同樣地，本發明也包括相應的核酸，即，具有編碼一個或一個以上非天然胺基酸的一個或一個以上選擇密碼子的任何核酸。
可以容易地使編碼所關注的蛋白質(諸如hGH多肽)的核酸分子發生突變以在多肽的任何所要位置處引入半胱氨酸。半胱氨酸被廣泛地用來將反應性分子、水溶性聚合物、蛋白質或各種其它分子引入到所關注的蛋白質上。適用於將半胱氨酸併入多肽的所要位置中的方法對於所屬領域的技術人員來說是已知的，諸如描述於以引用的方式併入本文中的美國專利第6,608,183號中的那些方法和標準突變技術。
IV.非天然編碼的胺基酸有種類繁多的非天然編碼的胺基酸適合用於本發明中。可將任何數量的非天然編碼的胺基酸引入GH(例如，hGH)多肽中。一般說來，相對於20種常見的、遺傳編碼的胺基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)而言，引入的非天然編碼的胺基酸大體上為化學惰性的。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包括可有效地和選擇性地與在20種常見胺基酸中不存在的官能團(包括(但不限於)疊氮基、酮基、醛基和氨基氧基)反應以形成穩定的結合物的側鏈官能團。舉例而言，因為疊氮官能團和炔官能團選擇性地發生反應形成胡氏根[3+2]環加成產物，所以包括含有疊氮基官能團的非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽可與含有炔部分的聚合物(包括(但不限於)聚(乙二醇))或第二多肽反應而形成穩定的結合物。
α-胺基酸的一般結構說明如下(式I)。
非天然編碼的胺基酸通常為具有上面所列的式的任何結構，其中R基團是不同於20種天然胺基酸中所用取代基的任何取代基，並且可以適用於本發明中。因為本發明的非天然編碼的胺基酸通常僅在側鏈的結構上不同於天然胺基酸，所以非天然編碼的胺基酸與包括(但不限於)天然或非天然編碼的胺基酸的其它胺基酸形成醯胺鍵，所述醯胺鍵是以與其在天然存在的多肽中形成的方式相同的方式來形成。然而，非天然編碼的胺基酸具有使其與天然胺基酸區別開的側鏈基團。舉例而言，R視需要包含烷基-、芳基-、醯基-、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼基、氰基-、滷基-、醯肼基、烯基、炔基、醚基、硫醇基、硒基-、磺醯基-、硼酸基、酉朋酸基、磷酸基、膦醯基、膦基、雜環基、烯酮基、亞胺基、醛基、酯基、硫代酸基、羥胺基、氨基等等或其任何組合。可適用於本發明的其它所關注的非天然存在的胺基酸包括(但不限於)包含可光活化的交聯劑的胺基酸、經自旋標記的胺基酸、發螢光的胺基酸、結合金屬的胺基酸、含金屬的胺基酸、放射性胺基酸、具有新穎官能團的胺基酸、共價地或非共價地與其它分子相互作用的胺基酸、光籠鎖和/或可光敏異構化的胺基酸、包含生物素或生物素類似物的胺基酸、諸如經糖取代的絲氨酸的糖基化胺基酸、經其它碳水化合物修飾的胺基酸、含酮的胺基酸、包含聚乙二醇或聚醚的胺基酸、經重原子取代的胺基酸、可化學裂解和/或可光致裂解的胺基酸、當與天然胺基酸比較時具有伸長側鏈(包括(但不限於)聚醚或長鏈烴，包括(但不限於)大於約5個或大於約10個碳)的胺基酸、經碳連接的含糖胺基酸、氧化還原活性胺基酸、含氨基硫代酸的胺基酸和包含一個或一個以上有毒部分的胺基酸。
可以適用於本發明並且可用於與水溶性聚合物反應的示範性非天然編碼的胺基酸包括(但不限於)具有羰基、氨基氧基、肼、醯肼、氨基脲、疊氮化物和炔反應性基團的那些胺基酸。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包含糖類部分。所述胺基酸的實例包括N-乙醯基-L-氨基葡萄糖基-L-絲氨酸、N-乙醯基-L-氨基半乳糖基-L-絲氨酸、N-乙醯基-L-氨基葡萄糖基-L-蘇氨酸、N-乙醯基-L-氨基葡萄糖基-L-天門冬醯胺和O-氨基甘露糖基-L-絲氨酸。所述胺基酸的實例也包括其中胺基酸與糖類之間的天然存在的N-鍵或O-鍵為自然界中不常見的共價鍵(包括(但不限於)烯烴鍵、肟鍵、硫醚鍵、醯胺鍵等等)所置換的實例。所述胺基酸的實例也包括不常見於天然存在的蛋白質中的糖類，諸如2-脫氧-葡萄糖、2-脫氧半乳糖等等。
本文所提供的許多非天然編碼的胺基酸可購自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(a division of EMD Biosciences，Darmstadt，Germany)或Peptech(Burlington，MA，USA)。不能購得的那些胺基酸是視需要根據本文中所提供的或使用所屬領域的技術人員已知的標準方法來合成。有關有機合成技術，例如參見Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，A部分和B部分，1990，PlenumPress，New York)。又參見美國專利申請公開案2003/0082575和2003/0108885，其以引用的方式併入本文中。除含有新穎側鏈的非天然胺基酸之外，可以適用於本發明的非天然胺基酸也視需要包含經修飾的主鏈結構，包括(但不限於)如由式II和式III的結構所說明，
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可為相同或不同且通常包含S或O，並且R和R′視需要為相同或不同的且通常是選自上文關於式I的非天然胺基酸所述的R基團的相同組成列項以及氫。舉例而言，本發明的非天然胺基酸視需要包含如由式II和式III所說明的氨基或羧基上的取代。這種類型的非天然胺基酸包括(但不限於)α-羥酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸酯，包括(但不限於)具有對應於常見的20種天然胺基酸的側鏈或非天然側鏈的那些胺基酸。此外，在α-碳處的取代視需要包括(但不限於)諸如D-穀氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等等的L-胺基酸、D-胺基酸或α-α-二取代的胺基酸。其它結構替代物包括諸如脯氨酸類似物以及3、4、6、7、8和9元環脯氨酸類似物的環狀胺基酸、諸如經取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸的β胺基酸和γ胺基酸。
許多非天然胺基酸是基於諸如酪氨酸、穀氨醯胺、苯丙氨酸等等的天然胺基酸，並且適用於本發明。酪氨酸類似物包括(但不限於)對位取代的酪氨酸、鄰位取代的酪氨酸和間位取代的酪氨酸，其中經取代的酪氨酸包含(包括(但不限於))酮基(包括(但不限於)乙醯基)、苯甲醯基、氨基、肼基、羥胺基、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烴基、飽和或不飽和烴基、O-甲基、聚醚基團、硝基、炔基等等。此外，也涵蓋經多取代的芳基環。可以適用於本發明的穀氨醯胺類似物包括(但不限於)α-羥基衍生物、γ-取代的衍生物、環狀衍生物和經醯胺取代的穀氨醯胺衍生物。可以適用於本發明的苯丙氨酸類似物的實例包括(但不限於)對位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸和間位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括(但不限於))羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛基、疊氮基、碘基、溴基、酮基(包括(但不限於)乙醯基)、苯甲醯基、炔基等等。可以適用於本發明的非天然胺基酸的特定實例包括(但不限於)對乙醯基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙醯基-GlcNAcβ-絲氨酸、L-Dopa、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對疊氮基-L-苯丙氨酸、對醯基-L-苯丙氨酸、對苯甲醯基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦醯基絲氨酸、膦醯基酪氨酸、對碘苯丙氨酸、對溴苯丙氨酸、對氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸和對炔丙基氧基-苯丙氨酸等等。可以適用於本發明的各種非天然胺基酸的結構的實例是提供於(例如)標題為「In vivoincorporation of unnatural amino acids.」 的WO2002/085923中。就其它甲硫氨酸類似物來說，也可參見Kiick等人，(2002)Incorporationof azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudingerligation，PNAS9919-24，其以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，提供包括非天然胺基酸(諸如，對-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的GH(例如，hGH)多肽的組合物。也提供包含對-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸且包括(但不限於)蛋白質和/或細胞的各種組合物。一方面，包括對-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然胺基酸的組合物進一步包括正交tRNA。非天然胺基酸可(包括(但不限於)共價地)與正交tRNA相鍵結，其包括(但不限於)通過氨基-醯基鍵共價地與正交tRNA相鍵結，共價地與正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH相鍵結等等。
經由可併入蛋白質中的非天然胺基酸的化學部分向蛋白質提供各種優點和處理。舉例而言，酮基官能團的獨特反應性允許以許多含肼或含羥胺試劑中的任何一種試劑在活體外和在活體內對蛋白質作選擇性修飾。重原子非天然胺基酸(例如)可用於定相X射線結構數據。使用非天然胺基酸部位特異性地引入重原子也為重原子提供選擇位置的選擇性和靈活性。光反應性非天然胺基酸(包括(但不限於)具有二苯甲酮和芳基疊氮化物(包括(但不限於)苯基疊氮化物)側鏈的胺基酸)(例如)容許蛋白質的有效活體內和活體外光致交聯。光反應性非天然胺基酸的實例包括(但不限於)對疊氮基苯丙氨酸和對苯甲醯基苯丙氨酸。具有光反應性非天然胺基酸的蛋白質因此可通過光反應性基團的激發-提供瞬時控制而隨意地交聯。在一個實例中，非天然胺基酸的甲基可經同位素標記的(包括(但不限於))甲基取代，所述同位素標記的(包括(但不限於))甲基作為(包括(但不限於))與核磁共振和振動光譜學一起使用的局部結構和動力學的探針。炔基或疊氮基官能團(例如)允許通過[3+2]環化加成反應用分子選擇性地修飾蛋白質。
在氨基端併入多肽中的非天然的胺基酸可包含為不同於20種天然胺基酸中所用取代基的任何取代基的R基團，和不同於通常存在於α-胺基酸(參見式I)中的NH2基團的第二反應性基團。類似的非天然胺基酸可在羧基端併入，其具有不同於通常存在於α-胺基酸(參見式I)中的COOH基團的第二反應性基團。
本發明的非天然胺基酸可以加以選擇或設計而提供在20種天然胺基酸中難以獲得的其它特徵。舉例而言，非天然胺基酸可以視需要加以設計或選擇而改變所述非天然胺基酸併入到其中的蛋白質的生物學性質。舉例而言，以下性質可以視需要通過使非天然胺基酸包含於蛋白質中而改變毒性、生物分布、溶解性、穩定性(例如，熱穩定性、水解穩定性、氧化穩定性、抗酶促降解穩定性等等)、提純和處理的容易性、結構性質、光譜性質、化學和/或光化性質、催化活性、氧化還原電位、半衰期、與其它分子(例如，共價地或非共價地)發生反應的能力等等。
非天然胺基酸(含有羰基、類羰基、掩蔽的羰基、受保護的羰基和羥胺基)的結構和合成在一些實施例中，本發明提供一種通過肟鍵與水溶性聚合物(例如，PEG)相連接的GH(例如，hGH)。
許多類型的非天然編碼的胺基酸適合於形成肟鍵。這些胺基酸包括(但不限於)含有羰基、二羰基或羥胺基的非天然編碼的胺基酸。所述胺基酸是描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號和第60/639,195號(標題為「Compositions containing，methods involving，and uses of non-natural amino acids and polypeptides」，2004年12月22日申請)中，所述申請案的全文以引用的方式併入本文中。所述胺基酸也描述於美國專利申請案第60/696,210號、第60/696,302號和第60/696,068號(標題為「Compositionscontaining，methods involving，and uses of non-natural amino acids and polypeptides」，2005年7月1日申請)中，所述申請案的全文以引用的方式併入本文中。非天然編碼的胺基酸也描述於2002年4月19日申請的美國專利申請案第10/126,931號和2002年4月19日申請的美國專利申請案第10/126,927號中，所述申請案的全文以引用的方式併入本文中。
本發明的一些實施例利用在一個或一個以上位置處經胺基酸對乙醯苯丙氨酸取代的GH(例如，hGH)多肽。對-乙醯基-(+/-)-苯丙氨酸和間-乙醯基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述於以引用的方式併入的Zhang，Z.，等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中。其它含羰基或二羰基的胺基酸可由所屬領域的技術人員類似地來製備。此外，在美國專利申請案第10/126,931號的圖4、圖24-34和圖36-39中提供包括在本文中的非天然胺基酸的非限制性示範性合成，所述申請案的全文以引用的方式併入本文中。
具有親電子反應性基團的胺基酸容許發生各種反應而與分子相連接，尤其通過親核加成反應與分子相連接。所述親電子反應性基團包括羰基(包括酮基和二羰基)、類羰基(其具有與羰基(包括酮基和二羰基)相似的反應性且在結構上與羰基相似)、掩蔽的羰基(其可容易地轉化為羰基(包括酮基和二羰基))或受保護的羰基(其在去保護後具有與羰基(包括酮基和二羰基)相似的反應性)。所述胺基酸包括具有式(IV)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(RR′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；J為
或 R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；各R″獨立地為H、烷基、經取代的烷基或保護基，或當一個以上R″基團存在時，兩個R″視需要形成雜環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；R3和R4中的各者獨立地為H、滷素、低碳烷基或經取代的低碳烷基，或R3和R4或兩個R3基團視需要形成環烷基或雜環烷基；或者-A-B-J-R基團一起形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、受保護的羰基(包括受保護的二羰基)或掩蔽的羰基(包括掩蔽的二羰基)的二環或三環環烷基或雜環烷基；或者-J-R基團一起形成包含至少一個羰基(包括二羰基)、受保護的羰基(包括受保護的二羰基)或掩蔽的羰基(包括掩蔽的二羰基)的單環或二環環烷基或雜環烷基；其限制條件為當A為亞苯基並且各R3為H時，B是存在的；和當A為-(CH2)4-並且各R3為H時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；和當A和B不存在並且各R3為H時，R不為甲基。
此外，包括具有式(V)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；其限制條件為當A為亞苯基時，B為存在的；和當A為-(CH2)4-時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-；和當A和B不存在時，R不為甲基。
此外，包括具有式(VI)的結構的胺基酸， 其中B為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基。
此外，包括以下胺基酸 其中所述化合物視需要為氨基受保護的群組、羧基受保護的化合物或其鹽。此外，可將以下非天然胺基酸中的任一種併入非天然胺基酸多肽中。
此外，包括以下具有式(VII)的結構的胺基酸，
其中B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；且n為0到8；其限制條件為當A為-(CH2)4-時，B不為-NHC(O)(CH2CH2)-。
此外，包括以下胺基酸 和
其中所述化合物視需要為氨基受保護的化合物，視需要為羧基受保護的化合物，視需要為氨基受保護且羧基受保護的化合物，或其鹽。此外，可將這些非天然胺基酸和以下非天然胺基酸中的任一種併入非天然胺基酸多肽中。
此外，包括以下具有式(VIII)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且
R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸。此外，包括以下具有式(IX)的結構的胺基酸， B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；其中各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基。
此外，包括以下胺基酸
，其中所述化合物視需要為氨基受保護的化合物，視需要為羧基受保護的化合物，視需要為氨基受保護且羧基受保護的化合物，或其鹽。此外，可將這些非天然胺基酸和以下非天然胺基酸中的任一種併入非天然胺基酸多肽中。
此外，包括以下具有式(X)的結構的胺基酸， 其中B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；且n為0到8。
此外，包括以下胺基酸 和 其中所述化合物視需要為氨基受保護的化合物，視需要為羧基受保護的化合物，視需要為氨基受保護且羧基受保護的化合物，或其鹽。此外，可將這些非天然胺基酸和以下非天然胺基酸中的任一種併入非天然胺基酸多肽中。
除單羰基結構之外，本文所述的非天然胺基酸可包括諸如二羰基、類二羰基、掩蔽的二羰基和受保護的二羰基的基團。
舉例而言，包括以下具有式(XI)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸。
此外，包括以下具有式(XII)的結構的胺基酸， B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；
R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；其中各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基。
此外，包括以下胺基酸 和 其中所述化合物視需要為氨基受保護的化合物，視需要為羧基受保護的化合物，視需要為氨基受保護且羧基受保護的化合物，或其鹽。此外，可將這些非天然胺基酸和以下非天然胺基酸中的任一種併入非天然胺基酸多肽中。
此外，包括以下具有式(XIII)的結構的胺基酸， 其中B為可選的，並且當存在時為選自由下列各基團組成的群組的連接子低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、低碳雜亞烴基、經取代的低碳雜亞烴基、-O-、-O-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S-、-S-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-S(O)k-(其中k為1、2或3)、-S(O)k(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)-、-C(O)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(S)-、-C(S)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)-、-NR′-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)CO-(亞烴基或經取代的亞烴基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基；且n為0到8。
此外，包括以下胺基酸 和 其中所述化合物視需要為氨基受保護的化合物，視需要為羧基受保護的化合物，視需要為氨基受保護且羧基受保護的化合物，或其鹽。此外，可將這些非天然胺基酸和以下非天然胺基酸中的任一種併入非天然胺基酸多肽中。
此外，包括以下具有式(XIV)的結構的胺基酸，
其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；X1為C、S或S(O)；並且L為亞烴基、經取代的亞烴基、N(R′)(亞烴基)或N(R′)(經取代的亞烴基)，其中R′為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括以下具有式(XIV-A)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；L為亞烴基、經取代的亞烴基、N(R′)(亞烴基)或N(R′)(經取代的亞烴基)，其中R′為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括以下具有式(XIV-B)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；L為亞烴基、經取代的亞烴基、N(R′)(亞烴基)或N(R′)(經取代的亞烴基)，其中R′為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括以下具有式(XV)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；X1為C、S或S(O)；且n為O、1、2、3、4或5；且各CR8R9基團上的R8和R9各自是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、烷氧基、烷基胺基、滷素、烷基、芳基，或其中任何R8和R9可一起形成＝O或環烷基，或其中任何基團與鄰近的R8基團可一起形成環烷基。
此外，包括以下具有式(XV-A)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；n為0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基團上的R8和R9各自是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、烷氧基、烷基胺基、滷素、烷基、芳基，或其中任何R8和R9可一起形成＝O或環烷基，或其中任何基團與鄰近的R8基團可一起形成環烷基。
此外，包括以下具有式(XV-B)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；n為0、1、2、3、4或5；且各CR8R9基團上的R8和R9各自是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、烷氧基、烷基胺基、滷素、烷基、芳基，或其中任何R8和R9可一起形成＝O或環烷基，或其中任何基團與鄰近的R8基團可一起形成環烷基。
此外，包括以下具有式(XVI)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；X1為C、S或S(O)；且L為亞烴基、經取代的亞烴基、N(R′)(亞烴基)或N(R′)(經取代的亞烴基)，其中R′為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括以下具有式(XVI-A)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；L為亞烴基、經取代的亞烴基、N(R′)(亞烴基)或N(R′)(經取代的亞烴基)，其中R′為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括以下具有式(XVI-B)的結構的胺基酸，
其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；R為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；L為亞烴基、經取代的亞烴基、N(R′)(亞烴基)或N(R′)(經取代的亞烴基)，其中R′為H、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括具有式(XVII)的結構的胺基酸， 其中A為可選的，並且當存在時為低碳亞烴基、經取代的低碳亞烴基、低碳環亞烴基、經取代的低碳環亞烴基、低碳亞鏈烯基、經取代的低碳亞鏈烯基、亞炔基、低碳雜亞烴基、經取代的雜亞烴基、低碳雜環亞烴基、經取代的低碳雜環亞烴基、亞芳基、經取代的亞芳基、雜亞芳基、經取代的雜亞芳基、亞烷芳基、經取代的亞烷芳基、亞芳烷基或經取代的亞芳烷基；
M為 其中(a)表示與A基團的鍵結，且(b)表示與相應羰基的鍵結，R3和R4是獨立地選自H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基，或R3和R4或兩個R3基團或兩個R4基團視需要形成環烷基或雜環烷基；R為H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；T3為一個鍵、C(R)(R)、O或S，且R為H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸。
此外，包括具有式(XVIII)的結構的胺基酸， 其中M為-C(R3)-、
其中(a)表示與A基團的鍵結，且(b)表示與相應羰基的鍵結，R3和R4是獨立地選自H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基，或R3和R4或兩個R3基團或兩個R4基團視需要形成環烷基或雜環烷基；R為H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；T3為一個鍵、C(R)(R)、O或S，且R為H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；R1為可選的，並且當存在時為H、氨基保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；且R2為可選的，並且當存在時為OH、酯保護基、樹脂、胺基酸、多肽或多聚核苷酸；各Ra是獨立地選自由下列各基團組成的群組H、滷素、烷基、經取代的烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k為1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′，其中各R′獨立地為H、烷基或經取代的烷基。
此外，包括具有式(XIX)的結構的胺基酸， 其中R為H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基；且T3為O或S。
此外，包括具有式(XX)的結構的胺基酸， 其中R為H、滷素、烷基、經取代的烷基、環烷基或經取代的環烷基。
此外，包括以下具有式(XXI)的結構的胺基酸 和 對-乙醯基-(+/-)-苯丙氨酸和間-乙醯基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述於以引用的方式併入的Zhang，Z.等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中。其它含羰基或二羰基的胺基酸可由所屬領域的技術人員類似地來製備。此外，在圖4、圖24-34和圖36-39中提供本文所包括的非天然胺基酸的非限制性示範性合成。
在一些實施例中，對包含非天然胺基酸的多肽進行化學修飾以產生反應性羰基或二羰基官能團。舉例而言，可用於結合反應的醛官能團可以由具有鄰近氨基和羥基的官能團產生。在生物活性分子為多肽的情況下，例如，可在使用高碘酸鹽的溫和氧化裂解條件下使用N端絲氨酸或蘇氨酸(其可以正常地存在或可以通過化學或酶促消化而被暴露)來產生醛官能團。參見，例如，Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3262-268(1992)；Geoghegan，K. Stroh，J.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.2697224-7230(1994)。然而，此項技術中已知的方法只限於肽或蛋白質的N端處的胺基酸。
在本發明中，可以將具有鄰近的羥基和氨基的非天然胺基酸作為「掩蔽的」醛官能團併入多肽中。例如，5-羥基賴氨酸具有與ε胺相鄰的羥基。用於產生醛的反應條件通常包含在溫和條件下添加摩爾過量的偏高碘酸鈉以避免在多肽內的其它部位處發生氧化。氧化反應的pH值通常為約7.0。典型的反應包含將約1.5摩爾過量的偏高碘酸鈉添加到多肽的緩衝溶液中，接著在暗處培育約10分鐘。參見，例如，美國專利第6,423,685號。
羰基或二羰基官能團可以在溫和的條件下於水溶液中選擇性地與含羥胺的試劑發生反應以形成相應的在生理條件下穩定的肟鍵。參見，例如，Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J.Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)。而且，羰基或二羰基的獨特反應性容許在其它胺基酸側鏈存在的情況下進行選擇性修飾。參見，例如，Cornish，V. W.等人，J.Am.Chem.Soc.1188150-8151(1996)；Geoghegan，K.F. Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Mahal，L K.等人，Science2761125-1128(1997)。
非天然胺基酸(含羥胺的胺基酸)的結構和合成美國臨時專利申請案第60/638,418號的全文是以引用的方式併入本文。因而，在美國臨時專利申請案第60/638,418號的V章節(標題為「Non-natural Amino Acids」)、B部分(標題為「Structure and Synthesis of Non-Natural Amino AcidsHydroxylamine-Containing Amino Acids」)中提供的揭示內容完全適用於製備、純化、表徵和使用本文所述的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽和經修飾的非天然胺基酸多肽的方法、組合物(包括式I-XXXV)、技術和策略，所述適用程度就如同所述揭示內容是完全由本文中所提供的那樣。
非天然胺基酸的化學合成適用於本發明的 許多非天然胺基酸是可購得的，(例如)可購自Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)。不能購得的那些胺基酸是視需要根據本文中所提供的或根據各種公開案中所提供的或使用所屬領域的技術人員已知的標準方法來合成。有關有機合成技術，參見，例如，Fessendon和Fessendon的Organic Chemistry(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；和Carey和Sundberg的Advanced Organic Chemistry(第3版，A部分和B部分，1990，Plenum Press，New York)。描述非天然胺基酸的合成的其它公開案包括(例如)標題為「In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids」的WO2002/085923；Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.，38，4660-4669；King，F.E. Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid fromPhthylated Intermediates.J.Chem.Soc，3315-3319；Friedman，O.M. Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人(1988)Absolute Configuration of theEnantiomers of 7-Chloro-4[[-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M. Frappier，F.(1991)Glutamineanalogues as Potential Antimalarials，Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally ConstrainedAmino Acid Analogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D. Rapoport，H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium IonCyclization.J.Org.Chem.501239-1246；Barton等人，(1987)Synthesis of Novelalpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical ChemistiySynthesis of L-andD-alpha-Amino-Adipfc Acids，L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron434297-4308；和Subasinghe等人，(1992)Quisqualic acidanaloguessynthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and theiractivity at a novel quisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.354602-7。也可參見標題為「Protein Arrays」的美國專利公開案第US 2004/0198637號，其是以引用的方式併入本文中。
A.羰基反應性基團具有羰基反應性基團的胺基酸容許發生各種反應而與分子(包括但不限於PEG或其它水溶性分子)相連接，尤其通過親核加成或醇醛縮合反應與所述分子相連接。
示範性含羰基的胺基酸可表示如下， 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基或經取代的芳基；R2為H、烷基、芳基、經取代的烷基和經取代的芳基；並且R3為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，並且R4為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，並且R2為簡單烷基(即，甲基、乙基或丙基)，並且酮部分是位於相對於烷基側鏈的對位上。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，並且R2為簡單烷基(即，甲基、乙基或丙基)，並且酮部分是位於相對於烷基側鏈的間位上。
對-乙醯基-(+/-)-苯丙氨酸和/間-乙醯基-(+/-)-苯丙氨酸的合成是描述於Zhang，Z.等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中，其以引用的方式併入本文中。其它含羰基的胺基酸可由所屬領域的技術人員類似地來製備。
在一些實施例中，對包含非天然編碼的胺基酸的多肽進行化學修飾以產生反應性羰基官能團。舉例而言，可用於結合反應的醛官能團可以由具有鄰近氨基和羥基的官能團產生。在生物活性分子為多肽的情況下，例如，可在使用高碘酸鹽的溫和氧化裂解條件下使用N端絲氨酸或蘇氨酸(其可以正常地存在或可以通過化學或酶促消化而被暴露)來產生醛官能團。參見，例如，Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3262-268(1992)；Geoghegan，K. Stroh，J.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Gaertner等人，J. Biol.Chem.2697224-7230(1994)。然而，此項技術中已知的方法只限於肽或蛋白質的N端處的胺基酸。
在本發明中，可以將具有鄰近的羥基和氨基的非天然編碼的胺基酸作為「掩蔽的」醛官能團併入多肽中。例如，5-羥基賴氨酸具有與ε胺相鄰的羥基。用於產生醛的反應條件通常包含在溫和條件下添加摩爾過量的偏高碘酸鈉以避免在多肽內的其它部位處發生氧化。氧化反應的pH值通常為約7.0。典型的反應包含將約1.5摩爾過量的偏高碘酸鈉添加到多肽的緩衝溶液中，接著在暗處培育約10分鐘。參見，例如，美國專利第6,423,685號，其以引用的方式併入本文中。
羰基官能團可以在溫和條件下於水溶液中與含肼、醯肼、羥胺或氨基脲的試劑選擇性地發生反應以分別形成相應的在生理條件下穩定的腙鍵、肟鍵或縮氨基脲鍵。參見，例如，Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J. Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)。而且，羰基的獨特反應性容許在其它胺基酸側鏈存在的情況下進行選擇性修飾。參見，例如，Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.1188150-8151(1996)；Geoghegan，K.F. Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3138-146(1992)；Mahal，L. K.等人，Science 2761125-1128(1997)。
B.肼、醯肼或氨基脲反應性基團含有親核基團(諸如，肼、醯肼或氨基脲)的非天然編碼的胺基酸容許與各種親電子基團發生反應而形成結合物(包括但不限於與PEG或其它水溶性聚合物反應形成結合物)。
示範性含肼、醯肼或氨基脲部分的胺基酸可表示如下，
其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基或經取代的芳基或不存在；X為0、N或S或不存在；R2為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，並且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。
在一些實施例中，n為4，R1不存在，並且X為N。在一些實施例中，n為2，R1不存在，並且X不存在。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，並且氧原子是位於芳基環上的脂族基團的對位。
含醯肼、肼和氨基脲部分的胺基酸可從商業來源獲得。例如，L-穀氨酸-γ-醯肼可購自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。不可購得的其它胺基酸可由所屬領域的技術人員來製備。參見，例如，美國專利第6,281,211號，其以引用的方式併入本文中。
含有具有醯肼、肼或氨基脲官能團的非天然編碼的胺基酸的多肽可與各種含有醛或其它具有類似化學反應性的官能團的分子有效地並有選擇性地發生反應。參見，例如，Shao，J.和Tam，J.，J.Am.Chem.Soc.1173893-3899(1995)。醯肼、肼和氨基脲官能團的獨特反應性使得其當與20種常見胺基酸上存在的親核基團(包括(但不限於)絲氨酸或蘇氨酸的羥基或賴氨酸和N端的氨基)相比較時對於醛、酮和其它親電子基團具有更顯著的反應性。
C.含有氨基氧基的胺基酸含有氨基氧基(也稱為羥胺基)的非天然編碼的胺基酸容許與各種親電子基團發生反應而形成結合物(包括(但不限於)與PEG或其它水溶性聚合物反應形成結合物)。如同肼、醯肼和氨基脲，氨基氧基的增強的親核性允許其與各種含有醛或其它具有類似化學反應性的官能團的分子有效地並有選擇性地發生反應。參見，例如，Shao，J.和Tam，J.，J.Am.Chem.Soc，1173893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Acc.Chem.Res.34727-736(2001)。儘管與肼基的反應產物為相應的腙，然而肟一般由氨基氧基與含羰基的基團(諸如，酮基)的反應產生。
含有氨基氧基的示範性胺基酸可表示如下， 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基或經取代的芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；Y為C(O)或不存在；R2為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，並且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為1，並且Y存在。一些實施例中，n為2，R1和X不存在，m為0，並且Y不存在。
含有氨基氧基的胺基酸可從易於獲得的胺基酸前體(高絲氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)進行製備。參見，例如，M.Carrasco和R.Brown，J. Org.Chem.688853-8858(2003)。某些含有氨基氧基的胺基酸(諸如，L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸)已從天然來源分離出(Rosenthal，G，Life Sci.601635-1641(1997))。其它含有氨基氧基的胺基酸可由所屬領域的技術人員來製備。
D.疊氮化物和炔反應性基團疊氮化物和炔官能團的獨特反應性使得其極其適用於選擇性修飾多肽和其它生物分子。對一般的反應性化學條件來說，有機疊氮化物(尤其為脂族疊氮化物)和炔通常是穩定的。特別的是，對於天然存在的多肽中存在的20種常見的胺基酸的側鏈(即，R基團)來說，疊氮化物和炔官能團是惰性的。然而，在進入進一步的研究時，顯示出疊氮基和炔基的「彈簧加壓式(spring-loaded)」特性並且其可有選擇地且有效地通過胡氏根[3+2]環加成反應進行反應而產生相應的三唑。參見，例如，Chin J.等人，Science301964-7(2003)；Wang，Q.等人，J. Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Chin，J.W.等人，J. Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)。
因為胡氏根環加成反應涉及選擇性環加成反應(參見，例如，Padwa，A.，在COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷(Trost，B.M.編，1991)，第1069-1109頁中；Huisgen，R.，在1，3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY，(Padwa，A.編，1984)，第1-176頁中)而不是親核取代，所以具有含疊氮化物和炔部分的側鏈的非天然編碼的胺基酸的併入允許所得多肽在非天然編碼的胺基酸的位置處被選擇性修飾。涉及含有疊氮化物或炔部分的GH(例如，hGH)多肽的環加成反應可在室溫、水性條件下通過在催化量的用於將Cu(II)原位還原為Cu(I)的還原劑的存在下添加Cu(II)(包括(但不限於)以催化量的CuSO4形式)而進行。參見，例如，Wang，Q.等人，J. Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Tornoe，C.W.等人，J. Org.Chem.673057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599(2002)。示範性還原劑包括(包括(但不限於))抗壞血酸鹽、金屬銅、奎寧(quinine)、對苯二酚、維生素K、穀胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+和施加的電位。
在一些情況下，其中疊氮化物與炔之間的胡氏根[3+2]環加成反應是所要的，GH(例如，hGH)多肽包含包括炔部分的非天然編碼的胺基酸，並且將與所述胺基酸相連接的水溶性聚合物包含疊氮部分。或者，也可進行相反反應(即，通過胺基酸上的疊氮部分和存在於水溶性聚合物上的炔部分反應)。
疊氮化物官能團也可以選擇性地與含有芳基酯部分的水溶性聚合物發生反應且適當地通過芳基膦部分加以官能化而產生醯胺鍵。芳基膦基使疊氮化物原位還原並且所得胺接著有效地與鄰近的酯鍵發生反應而產生相應的醯胺。參見，例如，E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287，2007-2010(2000)。含有疊氮基的胺基酸可為烷基疊氮化物(包括(但不限於)2-氨基-6-疊氮基-1-己酸)或芳基疊氮化物(對-疊氮基-苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的示範性水溶性聚合物可表示如下， 其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物且R可為H、烷基、芳基、經取代的烷基和經取代的芳基。示範性R基團包括(但不限於)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-滷素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R和R″″各自獨立地指的是氫、經取代的或未經取代的雜烷基、經取代的或未經取代的芳基(包括(但不限於)經1-3個滷素取代的芳基)、經取代的或未經取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基烷基。舉例而言，當本發明的化合物包括多個R基團時，如同當R′、R″、R和R″″基團中的多個基團存在時其各自是獨立地加以選定的那樣，各個R基團也是獨立地加以選定的。當R′和R″與同一氮原子相連接時，其可與所述氮原子相組合形成5元環、6元環或7元環。舉例而言，-NR′R″意欲包括(但不限於)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據對取代基的上面論述，所屬領域的技術人員將了解，術語「烷基」意欲包括包含與非氫基團相鍵結的碳原子的基團，諸如滷烷基(包括(但不限於)-CF3和-CH2CF3)和醯基(包括(但不限於)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
疊氮化物官能團也可以選擇性地與含有硫酯部分的水溶性聚合物發生反應且適當地通過芳基膦部分加以官能化而產生醯胺鍵。芳基膦基使疊氮化物原位還原並且所得胺接著有效地與硫酯鍵發生反應而產生相應的醯胺。含有硫酯和膦部分的示範性水溶性聚合物可表示如下，
其中n為1-10；X可以為O、N、S或不存在，Ph為苯基且W為水溶性聚合物。示範性含炔部分的胺基酸可表示如下， 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基或經取代的芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10，R2為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，並且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X不存在，m為0並且乙炔部分是位於相對於烷基側鏈的對位上。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為1，且炔丙基氧基是位於相對於烷基側鏈的對位上(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些實施例中，n為1，R1和X不存在並且m為0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔部分的胺基酸是可以購得的。舉例而言，炔丙基甘氨酸可以從Peptech(Burlington，MA)購得。或者，含炔部分的胺基酸可根據標準方法來製備。舉例而言，對炔丙基氧基苯丙氨酸可(例如)如Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.12511782-11783(2003)中所述來合成，並且4-炔基-L-苯丙氨酸可如Kayser，B.等人，Tetrahedron 53(7)2475-2484(1997)中所述來合成。其它含炔部分的胺基酸可由所屬領域的技術人員來製備。
示範性含疊氮化物部分的胺基酸可表示如下， 其中n為0-10；R1為烷基、芳基、經取代的烷基、經取代的芳基或不存在；X為O、N、S或不存在；m為0-10；R2為H、胺基酸、多肽或氨基端修飾基團，並且R3為H、胺基酸、多肽或羧基端修飾基團。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X不存在，m為0，並且疊氮部分是位於烷基側鏈的對位上。在一些實施例中，n為0-4，並且R1和X不存在，並且m為0。在一些實施例中，n為1，R1為苯基，X為O，m為2，並且β-疊氮基乙氧基部分是位於相對於烷基側鏈的對位上。
含疊氮化物部分的胺基酸可以從商業來源獲得。舉例而言，4-疊氮基苯丙氨酸可從Chem-Impex International，Inc.(Wood Dale，IL)獲得。對於不可購得的那些含疊氮化物部分的胺基酸來說，疊氮基能使用所屬領域的技術人員已知的標準方法相對容易地製得，包括(但不限於)通過合適離去基團(包括(但不限於)滷化物、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽基團)的置換或通過經適當保護的內酯的開環相對容易地製得。參見，例如，March的Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)。
E.氨基硫醇反應性基團經β-取代的氨基硫醇官能團的獨特反應性使得其極其適用於通過形成噻唑烷對含有醛基的多肽和其它生物分子進行選擇性修飾。參見，例如，J.Shao和J.Tam，J. Am.Chem.Soc.1995，117(14)3893-3899。在一些實施例中，可將經β-取代的氨基硫醇胺基酸併入GH(例如，hGH)多肽中，並接著與包含醛官能團的水溶性聚合物發生反應。在一些實施例中，水溶性聚合物、藥物結合物或其它負載物能通過形成噻唑烷與包含經β-取代的氨基硫醇胺基酸的GH(例如，hGH)多肽相偶合。
非天然胺基酸的細胞吸收細胞的非天然胺基酸吸收是通常在設計和選擇(包括(但不限於))用於併入蛋白質中的非天然胺基酸時所考慮的一個問題。舉例而言，α-胺基酸的高電荷密度暗示這些化合物不太可能為細胞可透過的。天然胺基酸是通過許多基於蛋白質的運輸系統而被吸收到真核細胞中。可進行快速篩選，其評定哪種非天然胺基酸(如果有的話)被細胞吸收。參見，例如，在(例如)標題為「Protein Arrays」的美國專利公開案第US 2004/0198637號(其以引用的方式併入本文中)和Liu，D.R. Schultz，P.G.(1999)Progress toward theevolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States964780-4785中的毒性檢定。雖然吸收容易通過各種檢定來分析，但是設計經受細胞吸收路徑的非天然胺基酸的另一選擇為提供生物合成路徑以在活體內產生胺基酸。
(i)非天然胺基酸的生物合成許多生物合成路徑已經存在於細胞中以用於產生胺基酸和其它化合物。雖然特定的非天然胺基酸的生物合成方法可能在自然界(包括(但不限於)在細胞中)不存在，但是本發明提供所述方法。舉例而言，非天然胺基酸的生物合成路徑是視需要在宿主細胞中通過添加新的酶或改變現有的宿主細胞路徑來產生。其它新的酶視需要為天然存在的酶或人工發展的酶。舉例而言，對氨基苯丙氨酸的生物合成(如標題為「In vivoincorporation of unnatural amino acids」的WO 2002/085923的一個實例中所呈現)依賴於添加來自其它生物體的已知酶的組合。這些酶的基因能通過以包含基因的質粒使細胞轉化而引入真核細胞中。基因當在細胞中表達時提供酶促路徑以合成所要化合物。視需要添加的酶的類型的實例提供於下面實例中。其它的酶序列可見於(例如)基因庫(Genbank)中。也視需要以同樣方式將人工發展的酶添加到細胞中。如此，操縱細胞的細胞器和資源來產生非天然胺基酸。
各種方法可用於產生供生物合成路徑使用或用於發展現有路徑的新穎的酶。例如，視需要將包括(但不限於)如由Maxygen，Inc.開發的遞歸性重組(可在www.maxygen.com上獲得)用於開發新穎的酶和路徑。參見，例如，Stemmer(1994)，Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling，Nature370(4)389-391；和Stemmer，(1994)，DNAshuffling by random fragmentation and reassemblyIn vitro recombination for molecularevolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，9110747-10751。同樣地，視需要將由Genencor開發的DesignPathTM(可在www.genencor.com上獲得)用於代謝路徑工程化，包括(但不限於)用於將用以在細胞中產生O-甲基-L-酪氨酸的路徑工程化。此技術使用新的基因(包括(但不限於)通過功能基因組而鑑別的那些基因)和分子進化與設計的組合而在宿主生物體中重建現有路徑。Diversa Corporation(可在www.diversa.com上獲得)也提供用於快速篩選基因文庫和基因路徑的技術，包括(但不限於)用來產生新的路徑。
通常，通過本發明的工程化生物合成路徑產生的非天然胺基酸是以包括(但不限於)天然細胞量的足以達成有效的蛋白質生物合成但不達到影響其它胺基酸的濃度或耗盡細胞資源的程度的濃度產生。以這種方式在活體內產生的典型濃度為約10mM到約0.05mM。一旦通過包含用以產生特定路徑所要的酶的基因的質粒使細胞轉化並且產生非天然的胺基酸後，活體內選擇就視需要用來進一步優化用於核糖體蛋白合成和細胞生長的非天然胺基酸的產生。
(b)具有非天然胺基酸的多肽可出於包括(但不限於)以下目的的各種目的來進行非天然胺基酸的併入調節蛋白質結構和/或功能的改變，改變大小、酸度、親核性、氫鍵鍵合、疏水性、蛋白酶靶部位的可接近性，靶向一個部分(包括(但不限於)蛋白質陣列的部分)，添加生物活性分子，連接聚合物，連接放射性核素，調控血清半衰期，調控組織穿透率(例如，腫瘤)，調控主動運輸，調控組織、細胞或器官特異性或分布，調控免疫原性，調控蛋白酶抗性等。包括非天然胺基酸的蛋白質能具有增強的或甚至全新的催化性質或生物物理學性質。舉例而言，以下性質視需要可通過使非天然胺基酸包含於蛋白質中而改變毒性、生物分布、結構性質、光譜性質、化學和/或光化性質、催化能力、半衰期(包括(但不限於)血清半衰期)、與其它分子反應(包括(但不限於)共價地或非共價地)的能力等等。包括包含至少一個非天然胺基酸的蛋白質的組合物可用於(包括(但不限於))新穎的療法、診斷法、催化酶、工業酶、結合蛋白質(包括(但不限於)抗體)和(包括(但不限於))蛋白質結構和功能的研究。參見，例如，Dougherty，(2000)UnnaturalAmino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in ChemicalBiology，4645-652。
在本發明的一方面，組合物包括至少一種蛋白質，所述蛋白質具有至少1個非天然胺基酸，包括(但不限於)具有至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個或10個以上的非天然胺基酸。所述非天然胺基酸可為相同的或不同的，包括(但不限於)在蛋白質中可存在包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或10個以上不同的非天然胺基酸的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或10個以上不同的部位。在另一方面，組合物包括存在於蛋白質中的特定胺基酸中的至少一個(但少於全部)經非天然胺基酸取代的蛋白質。對指定的具有多個非天然胺基酸的蛋白質來說，所述非天然胺基酸可為相同的或不同的(包括(但不限於)蛋白質可包括2個或2個以上不同類型的非天然胺基酸，或可包括2個相同的非天然胺基酸)。對指定的具有2個以上非天然胺基酸的蛋白質來說，所述非天然胺基酸可為相同的、不同的或為多個相同種類的非天然胺基酸與至少1個不同的非天然胺基酸的組合。
所關注的具有至少1個非天然胺基酸的蛋白質或多肽是本發明的一特徵。本發明也包括具有至少1個使用本發明的組合物和方法產生的非天然胺基酸的多肽或蛋白質。賦形劑(包括(但不限於)醫藥學上可接受的賦形劑)也可與蛋白質一起存在。
就在真核細胞中產生所關注的具有至少1個非天然胺基酸的蛋白質或多肽來說，所述蛋白質或多肽通常將包括真核生物翻譯後修飾。在某些實施例中，蛋白質包括至少1個非天然胺基酸和至少1種通過真核細胞在活體內進行的翻譯後修飾，其中所述翻譯後修飾並不通過原核細胞進行。舉例而言，翻譯後修飾包括(包括(但不限於))糖基化作用、乙醯化作用、醯化作用、脂質修飾、棕櫚醯化作用、棕櫚酸酯添加、磷酸化作用、糖脂鍵修飾、糖基化作用等等。在一方面，翻譯後修飾包括通過GlcNAc-天門冬醯胺鍵將寡糖(包括(但不限於)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)與天門冬醯胺相連接。參見表1，其列出了真核蛋白質的N-連接的寡糖的一些實例(也可存在其它殘基，表中未顯示)。在另一方面，翻譯後修飾包括通過GalNAc-絲氨酸鍵或GalNAc-蘇氨酸鍵或者GlcNAc-絲氨酸鍵或GlcNAc-蘇氨酸鍵將寡糖(包括(但不限於)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)與絲氨酸或蘇氨酸相連接。
表1通過GlcNAc-鍵合的寡糖的實例

在另一方面，翻譯後修飾包括對前體(包括(但不限於)降鈣素前體、降鈣素基因相關肽前體、前甲狀旁腺激素原(preproparathyroid)激素、前胰島素原、胰島素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin)等)進行蛋白水解加工，裝配到多亞單位蛋白質中或進行大分子裝配，翻譯到細胞中的另一個部位(包括(但不限於)翻譯到諸如內質網、高爾基體(Golgi apparatus)、核、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等的細胞器中，或通過分泌路徑)。在某些實施例中，蛋白質包含分泌序列或定位序列、抗原決定基標籤、FLAG標籤、聚組氨酸標籤、GST融合物等等。以引用的方式併入本文中的美國專利第4,963,495號和第6,436,674號詳細描述了經設計用來改進GH(例如，hGH)多肽的分泌的構建物。
非天然胺基酸的一個優點是其提供可用來添加其它分子的其它化學部分。這些修飾可在真核細胞或非真核細胞中於活體內或於活體外進行。因此，在某些實施例中，翻譯後修飾是通過非天然胺基酸達成。舉例而言，翻譯後修飾可通過親核-親電子反應達成。當前用於選擇性修飾蛋白質的多數反應涉及在親核和親電子反應搭配物之間形成共價鍵，包括(但不限於)α-滷基酮與組氨酸或半胱氨酸側鏈的反應。這些情況下的選擇性是由蛋白質中的親核殘基的數量和可接近性所決定。在本發明的蛋白質中，可採用其它更具有選擇性的反應，諸如在活體外和在活體內的非天然酮基-胺基酸與醯肼或氨基氧基化合物的反應。參見，例如，Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc，1188150-8151；Mahal等人，(1997)Science，2761125-1128；Wang等人，(2001)Science292498-500；Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.1249026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，9911020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，10056-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry，426735-6746；和Chin等人，(2003)Science，301964-7，所有文獻以引用的方式併入本文中。此允許用包括螢光團、交聯劑、糖類衍生物和細胞毒素分子的許多試劑來選擇性地標記幾乎任何蛋白質。也參見標題為「Glycoprotein synthesis」的美國專利第6,927,042號，其以引用的方式併入本文中。包括(但不限於)通過疊氮基胺基酸的翻譯後修飾也可通過施陶丁格(Staudinger)連接(包括(但不限於)用三芳基膦試劑)來進行。參見，例如，Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinantproteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS9919-24。
本發明提供另一種高效的選擇性修飾蛋白質的方法，其涉及響應於選擇密碼子將包括(但不限於)含有疊氮化物或炔基部分的非天然胺基酸遺傳地併入蛋白質中。接著這些胺基酸側鏈可分別通過包括(但不限於)胡氏根[3+2]環加成反應(參見，例如，Padwa，A.，在Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)，Trost，B.M.編，Pergamon，Oxford，第1069-1109頁中；和Huisgen，R.，在1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，(1984)Padwa，A.編，Wiley，New York，第1-176頁中)用包括(但不限於)炔基或疊氮化物衍生物來修飾。因為這種方法涉及環加成而不是親核取代，所以蛋白質可以極高的選擇性來加以修飾。此反應可以在室溫、水性條件下通過將催化量的Cu(I)鹽添加到反應混合物中而以極佳的區域選擇性(1，4＞1，5)進行。參見，例如，Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.673057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.412596-2599。可使用的另一種方法是利用四半胱氨酸基序進行的雙砷化合物上的配合基交換，參見，例如，Griffin，等人，(1998)Science281269-272。
能通過[3+2]環加成加入到本發明的蛋白質中的分子包括具有疊氮化物或炔基衍生物部分的幾乎任何分子。分子包括(但不限於)染料、螢光團、交聯劑、糖類衍生物、聚合物(包括(但不限於)聚乙二醇的衍生物)、光致交聯劑、細胞毒素化合物、親和標記、生物素的衍生物、樹脂、珠粒、第二蛋白質或多肽(或更多)、多聚核苷酸(包括(但不限於)DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物等等。這些分子能分別加入到具有炔基的非天然胺基酸(包括(但不限於)對炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有疊氮基的非天然胺基酸(包括(但不限於)對疊氮基苯丙氨酸)中。
V.包含非遺傳編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽的活體內產生本發明的GH(例如，hGH)多肽可在活體內使用經修飾的tRNA和tRNA合成酶來添加在天然存在的系統中未被編碼的胺基酸或用其進行取代而產生。
用於產生使用在天然存在的系統中未被編碼的胺基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法是描述在(例如)美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)中，所述參考文獻以引用的方式併入本文中。這些方法涉及產生獨立於對翻譯系統來說為內源性的(並且因此有時被稱作「正交的」)合成酶和tRNA而起作用的翻譯機器。通常，翻譯系統包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)。通常，在翻譯系統中O-RS優先地以至少一種非天然存在的胺基酸使O-tRNA氨基醯化，並且O-tRNA識別出至少一種不能被所述系統中的其它tRNA識別出的選擇密碼子。所述翻譯系統因此響應於經編碼的選擇密碼子將非天然編碼的胺基酸插入到系統中產生的蛋白質中，從而將胺基酸「取代」到經編碼的多肽中的位置中。
各種正交tRNA和氨醯基tRNA合成酶已經在所屬領域中被描述用於將特定的合成胺基酸插入到多肽中，並且一般適用於本發明。舉例而言，酮基特異性O-tRNA/氨醯基-tRNA合成酶描述於Wang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10056-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)6735-6746(2003)中。示範性O-RS或其部分是通過多聚核苷酸序列來編碼，並且其包括美國專利申請公開案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的胺基酸序列，各個公開案以引用的方式併入本文中。與O-RS一起使用的相應O-tRNA分子也描述在美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)中，所述公開案以引用的方式併入本文中。
疊氮基特異性O-tRNA/氨醯基-tRNA合成酶系統的實例是描述在Chin，J.W.等人，J. Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)中。對-疊氮基-L-苯丙氨酸的示範性O-RS序列包括(但不限於)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931號)中揭示的核苷酸序列SEQ ID NO14-16和29-32以及胺基酸序列SEQ ID NO46-48和61-64，所述公開案以引用的方式併入本文中。適用於本發明的示範性O-tRNA序列包括(但不限於)如美國專利申請公開案2003/0108885(第10/126,931號)中揭示的核苷酸序列SEQID NO1-3，所述公開案以引用的方式併入本文中。對特定的非天然編碼的胺基酸具有特異性的O-tRNA/氨醯基-tRNA合成酶對的其它實例是描述在美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，所述公開案以引用的方式併入本文中。使含酮基的胺基酸和含疊氮基的胺基酸併入釀酒酵母(S.cerevisiae)中的O-RS和O-tRNA是描述在Chin，J.W.等人，Science 301964-967(2003)中。
已經報導了一些其它的正交對。已描述源自釀酒酵母tRNA和合成酶的穀氨醯胺醯基(參見，例如，Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.964780-4785)、天冬氨醯基(參見，例如，Pastrnak，M.等人，(2000)Helv.Chim.Acta832277-2286)和酪氨醯基(參見，例如，Ohno，S.等人，(1998)J.Biochem.(Tokyo，Jpn.)1 1241065-1068；和Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.982268-2273)系統用於將非天然胺基酸潛在地併入大腸桿菌中。已描述源自大腸桿菌穀氨醯胺醯基(參見，例如，Kowal，A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.982268-2273)和酪氨醯基(參見，例如，Edwards，H.和Schimmel，P.(1990)Mol.Cell.Biol.101633-1641)合成酶的系統適用於釀酒酵母。已將大腸桿菌酪氨醯基系統用於將3-碘基-L-酪氨酸活體內併入哺乳動物細胞中。參見，Sakamoto，K.等人，(2002)NucleicAcids Res.304692-4699。
O-tRNA/氨醯基-tRNA合成酶的使用涉及編碼非天然編碼的胺基酸的特異性密碼子的選擇。雖然能使用任何密碼子，但是通常需要選擇很少或從未用於表達O-tRNA/氨醯基tRNA合成酶的細胞中的密碼子。舉例而言，示範性密碼子包括無義密碼子，諸如，終止密碼子(琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子)；4個或4個以上鹼基密碼子；和很少使用或未曾使用的其它天然3鹼基密碼子。
可使用此項技術中已知的突變方法(包括(但不限於)部位特異性突變、盒式突變、限制性選擇性突變等)將特異性選擇密碼子引入GH(例如，hGH)多聚核苷酸編碼序列中的適當位置中。
用於產生可用來併入非天然編碼的胺基酸的蛋白質生物合成機器組分(諸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS對)的方法是描述在Wang，L.等人，Science 292498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J. Am.Chem.Soc.1249026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 426735-6746(2003)中。用於活體內併入非天然編碼的胺基酸的方法和組合物是描述在美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)中，所述公開案以引用的方式併入本文中。用於選擇適用於生物體的活體內翻譯系統的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也描述於美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)中，所述公開案以引用的方式併入本文中。標題為「SiteSpecific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins」的PCT公開案第WO 04/035743號(其全文以引用的方式併入本文中)描述用於併入酮基胺基酸的正交RS和tRNA對。標題為「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」的PCT公開案第WO 04/094593號(其全文以引用的方式併入本文中)描述用於將非天然編碼的胺基酸併入真核宿主細胞中的正交RS和tRNA對。
用於產生至少一種重組的正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含(a)產生源自於來自第一生物體的至少一種氨醯基-tRNA合成酶(RS)的(視需要為突變體)RS的庫，所述第一生物體包括(但不限於)諸如詹氏甲烷球菌、橫川病毒、嗜鹽桿菌屬、大腸埃希氏桿菌、閃爍古生球菌(A.fulgidus)、激烈火球菌(P.furiosus)、堀越氏火球菌(P horikoshii)、嗜熱菌敏捷氣熱菌(A.pernix)、嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)等等的原核生物，或真核生物；(b)選擇(和/或篩選)RS(視需要為突變體RS)庫的成員，所述成員在非天然編碼的胺基酸和天然胺基酸的存在下使正交tRNA(O-tRNA)氨醯化，從而提供活性(視需要為突變體)RS的集合；和/或(c)選擇(視需要通過負性選擇)集合的活性RS(包括(但不限於)突變RS)，所述活性RS在不存在非天然編碼的胺基酸的情況下優先地使O-tRNA氨醯化，從而提供至少一種重組O-RS；其中所述至少一種重組O-RS優先地以非天然編碼的胺基酸使O-tRNA氨醯化。
在一個實施例中，RS是非活性RS。非活性RS能通過使活性RS突變而產生。舉例而言，非活性RS能通過使至少約1個、至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個或至少約10個或10個以上胺基酸突變成包括(但不限於)丙氨酸的不同胺基酸而產生。
突變RS的庫能使用此項技術中已知的各種技術(包括(但不限於)基於蛋白質三維RS結構的合理設計，或在隨機或合理設計技術中RS核苷酸的突變)來產生。舉例而言，突變RS能通過部位特異性突變、隨機突變、差異產生重組突變、嵌合構建、合理設計和通過本文中所述的或此項技術中已知的其它方法來產生。
在一個實施例中，選擇(和/或篩選)RS(視需要為突變RS)庫的包括(但不限於)在非天然編碼的胺基酸和天然胺基酸的存在下使正交tRNA(O-tRNA)氨醯化的活性成員包括將包括(但不限於)抗生素抗性基因等的正性選擇或篩選標記和(視需要為突變的)RS庫引入多個細胞中，其中所述正性選擇和/或篩選標記包含至少一個包括(但不限於)琥珀密碼子、赭石密碼子或蛋白石密碼子的選擇密碼子；使所述多個細胞在選擇劑的存在下生長；鑑別在選擇和/或篩選劑存在下通過抑制正性選擇或篩選標記中的至少一個選擇密碼子存活(或顯示特異性反應)的細胞，從而提供含有活性(視需要為突變的)RS的集合的正性選定的細胞的子集。視需要可改變選擇和/或篩選劑濃度。
在一方面，正性選擇標記是氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)基因，並且選擇密碼子是CAT基因中的琥珀終止密碼子。視需要地，正性選擇標記是β-內醯胺酶基因，並且選擇密碼子是β-內醯胺酶基因中的琥珀終止密碼子。在另一方面，正性篩選標記包含螢光或發光篩選標記或基於親和力的篩選標記(包括(但不限於)細胞表面標記)。
在一個實施例中，負性選擇或篩選集合的在不存在非天然編碼的胺基酸的情況下優先使O-tRNA氨醯化的活性RS(視需要為突變的)包括將負性選擇或篩選標記與來自正性選擇或篩選的活性(視需要為突變的)RS的集合一起引入第二生物體的多個細胞中，其中所述負性選擇或篩選標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限於)抗生素抗性基因，包括(但不限於)氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)基因)；和鑑別在經非天然編碼的胺基酸和篩選或選擇劑補充的第一培養基中存活或顯示特異性篩選反應但在未經非天然編碼的胺基酸和選擇或篩選劑補充的第二培養基中未能存活或未顯示特異性反應的細胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細胞或經篩選的細胞。舉例而言，CAT鑑別方案視需要在適當的O-RS重組體的確定中起正性選擇和/或負性篩選的作用。例如，視需要在含有具有或不具有一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的CAT(其包含至少一個選擇密碼子)的生長培養盤上複製克隆的集合。因此認為，唯獨在含有非天然編碼的胺基酸的培養盤上生長的群落含有重組O-RS。在一方面，選擇(和/或篩選)劑的濃度是可變化的。在一些方面中，第一生物體和第二生物體是不同的。因此，第一生物體和/或第二生物體視需要包含原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸埃希氏桿菌、真菌、酵母、古菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等。在其它實施例中，篩選標記包含螢光或發光篩選標記或基於親和力的篩選標記。
在另一個實施例中，篩選或選擇(包括(但不限於)負性選擇)集合的活性(視需要為突變的)RS包括使來自正性選擇步驟(b)的活性突變RS的集合分離；將負性選擇或篩選標記和活性(視需要為突變的)RS的集合引入第二生物體的多個細胞中，其中所述負性選擇或篩選標記包含至少一個選擇密碼子(包括(但不限於)包含至少一個選擇密碼子的毒性標記基因，包括(但不限於)核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶(barnase)基因)；和鑑別在未經非天然編碼的胺基酸補充的第一培養基中存活或顯示特異性篩選反應但在經非天然編碼的胺基酸補充的第二培養基中未能存活或未顯示特異性篩選反應的細胞，從而提供具有至少一種重組O-RS的存活細胞或經篩選的細胞，其中至少一種重組O-RS對於非天然編碼的胺基酸來說為特異性的。在一方面，至少一個選擇密碼子包含約2個或2個以上的選擇密碼子。所述實施例視需要可包括其中至少一個選擇密碼子包含2個或2個以上的選擇密碼子和其中第一生物體和第二生物體不同(包括(但不限於)各個生物體視需要為(包括(但不限於))原核生物、真核生物、哺乳動物、大腸埃希氏桿菌、真菌、酵母、古菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等)。此外，一些方面包括其中負性選擇標記包含核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶基因(其包含至少一個選擇密碼子)。其它方面包括其中篩選標記視需要包含螢光或發光篩選標記或基於親和力的篩選標記。在本文中的實施例中，篩選和/或選擇視需要包括篩選和/或選擇嚴格性的變化。
在一個實施例中，產生至少一種重組的正交氨醯基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可進一步包含(d)使至少一種重組O-RS分離；(e)產生第二組源自所述至少一種重組O-RS的O-RS(視需要為突變的)；和(f)重複步驟(b)和(c)直到獲得包含優先使O-tRNA氨醯化的能力的突變O-RS為止。視需要重複步驟(d)-(f)，包括(但不限於)重複至少約兩次。在一方面，第二組源自至少一種重組O-RS的突變O-RS可通過包括(但不限於)隨機突變、部位特異性突變的突變、重組或其組合而產生。
在上述方法中，包括(但不限於)正性選擇/篩選步驟(b)、負性選擇/篩選步驟(c)或正性和負性選擇/篩選步驟(b)和(c)兩者的選擇/篩選步驟的嚴格性視需要包括改變選擇/篩選嚴格性。在另一實施例中，正性選擇/篩選步驟(b)、負性選擇/篩選步驟(c)或正性和負性選擇/篩選步驟(b)和(c)兩者包含使用報導體，其中所述報導體是通過螢光活化細胞分選法(FACS)來檢測或其中所述報導體是通過發光來檢測。視需要地，報導體是在細胞表面上、在噬菌體展示系統等上展示，並且是基於涉及非天然編碼的胺基酸或類似物的親和力或催化活性而選擇。在一個實施例中，突變的合成酶是在細胞表面上、在噬菌體展示系統等上展示。
產生重組的正交tRNA(O-tRNA)的方法包括(a)產生源自於來自第一生物體的至少一種包括(但不限於)抑制tRNA的tRNA的突變tRNA的庫；(b)選擇(包括(但不限於)負性選擇)或篩選所述庫的在不存在來自第一生物體的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的情況下被來自第二生物體的RS氨醯化的(視需要為突變的)tRNA，從而提供tRNA(視需要為突變體)的集合；和(c)選擇或篩選tRNA(視需要為突變體)集合的被所引入的正交RS(O-RS)氨醯化的成員，從而提供至少一種重組O-tRNA；其中所述至少一種重組O-tRNA識別出選擇密碼子並且未被來自第二生物體的RS有效識別出，並且被O-RS優先地氨醯化。在一些實施例中，至少一種tRNA是抑制tRNA且/或包含天然和/或非天然鹼基的單一的3鹼基密碼子，或是無義密碼子、稀有密碼子、非天然密碼子、包含至少4個鹼基的密碼子、琥珀密碼子、赭石密碼子或蛋白石終止密碼子。在一個實施例中，重組O-tRNA具有改善的正交性。應了解，在一些實施例中，O-tRNA視需要可無需修飾即從第二生物體輸入到第一生物體中。在各種實施例中，第一生物體和第二生物體是相同的或不同的，並且視需要是選自(包括(但不限於))原核生物(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、橫川病毒、大腸埃希氏桿菌、嗜鹽桿菌屬等)、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古菌、真細菌、植物、昆蟲、原生生物等。另外，重組tRNA是視需要地被非天然編碼的胺基酸氨醯化，其中所述非天然編碼的胺基酸是在活體內天然地或通過遺傳處理而加以生物合成。視需要將非天然編碼的胺基酸添加到至少第一生物體或第二生物體的生長培養基中。
在一方面，選擇(包括(但不限於)負性選擇)或篩選庫的被氨醯基-tRNA合成酶氨醯化的(視需要為突變的)tRNA(步驟(b))包括將毒性標記基因和(視需要為突變的)tRNA庫引入到來自第二生物體的多個細胞中，其中所述毒性標記基因包含至少一個選擇密碼子(或導致產生毒性劑或靜化劑的基因或對生物體為必需的基因，其中所述標記基因包含至少一個選擇密碼子)；和選擇存活的細胞，其中所述存活的細胞含有包含至少一種正交tRNA或非功能性tRNA的(視需要為突變的)tRNA的集合。舉例而言，存活的細胞可通過使用細胞密度比較率檢定加以選擇。
在另一方面，毒性標記基因可包括2個或2個以上的選擇密碼子。在所述方法的另一個實施例中，毒性標記基因是核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶基因，其中所述核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶基因包含至少一個琥珀密碼子。視需要地，核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶基因可包括2個或2個以上的琥珀密碼子。
在一個實施例中，選擇或篩選(視需要為突變的)tRNA的集合的被所引入的正交RS(O-RS)氨醯化的成員可包括將正性選擇或篩選標記基因連同O-RS和(視需要為突變的)tRNA的集合引入到來自第二生物體的多個細胞中，其中正性標記基因包含抗藥性基因(包括(但不限於)β-內醯胺酶基因，其包含至少一個選擇密碼子，諸如至少一個琥珀終止密碼子)或對生物體為必需的基因或導致毒性劑解毒的基因；和鑑別在包括(但不限於)抗生素的選擇或篩選劑的存在下生長的存活細胞或經篩選的細胞，從而提供具有至少一種重組tRNA的細胞的集合，其中響應於至少一個選擇密碼子，至少一種重組tRNA被O-RS氨醯化並且將胺基酸插入到為正性標記基因所編碼的翻譯產物中。在另一實施例中，選擇和/或篩選劑的濃度是可變化的。
提供用於產生特異性O-tRNA/O-RS對的方法。方法包括(a)產生源自於來自第一生物體的至少一種tRNA的突變tRNA的庫；(b)負性選擇或篩選所述庫的在不存在來自第一生物體的氨醯基-tRNA合成酶(RS)的情況下被來自第二生物體的RS氨醯化的(視需要為突變的)tRNA，從而提供(視需要為突變的)tRNA的集合；(c)選擇或篩選(視需要為突變的)tRNA的集合的被所引入的正交RS(O-RS)氨醯化的成員，從而提供至少一種重組O-tRNA。所述至少一種重組O-tRNA識別出選擇密碼子並且未被來自第二生物體的RS有效識別出，並且優先被O-RS氨醯化。所述方法也包括(d)產生源自於來自第三生物體的至少一種氨醯基-tRNA合成酶(RS)的(視需要為突變的)RS的庫；(e)選擇或篩選突變RS庫的在非天然編碼的胺基酸和天然胺基酸的存在下優先使至少一種重組O-tRNA氨醯化的成員，從而提供活性(視需要為突變的)RS的集合；和(f)負性選擇或篩選所述集合的在不存在非天然編碼的胺基酸的情況下優先使至少一種重組O-tRNA氨醯化的活性(視需要為突變的)RS，從而提供至少一種特異性O-tRNA/O-RS對，其中至少一種特異性O-tRNA/O-RS對包含至少一種對非天然編碼的胺基酸為特異性的重組O-RS和至少一種重組O-tRNA。包括由所述方法產生的特異性O-tRNA/O-RS對。舉例而言，特異性O-tRNA/O-RS對可包括(包括(但不限於))mutRNATyr-mutTyrRS對，諸如，mutRNATyr-SS12TyrRS對、mutRNALeu-mutLeuRS對、mutRNAThr-mutThrRS對、mutRNAGlu-mutGluRS對等等。另外，所述方法包括其中第一生物體和第三生物體是相同的(包括(但不限於)詹氏甲烷球菌)。
用於選擇適用於第二生物體的活體內翻譯系統的正交tRNA-tRNA合成酶對的方法也包括在本發明中。所述方法包括將標記基因、tRNA和從第一生物體分離或得到的氨醯基-tRNA合成酶(RS)引入到來自第二生物體的第一組細胞中；將標記基因和tRNA引入到來自第二生物體的複製細胞組中；和選擇在第一組中存活但在複製細胞組中未能存活的細胞，或篩選顯示特異性篩選反應但在複製細胞組中未產生所述反應的細胞，其中第一組和複製細胞組是在選擇或篩選劑的存在下生長，其中存活細胞或經篩選的細胞包含適用於第二生物體的活體內翻譯系統的正交tRNA-tRNA合成酶對。在一個實施例中，比較和選擇或篩選包括活體內互補檢定。可改變選擇或篩選劑的濃度。
本發明的生物體包含各種生物體和各種組合。舉例而言，本發明的方法的第一生物體和第二生物體可為相同的或不同的。在一個實施例中，生物體視需要為原核生物，包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、橫川病毒、嗜鹽桿菌屬、大腸埃希氏桿菌、閃爍古生球菌(A.fulgidus)、激烈火球菌(P.furiosus)、堀越氏火球菌(P.horikoshii)、嗜熱菌敏捷氣熱菌(A.pernix)、嗜熱棲熱菌等等。或者，生物體視需要包含真核生物，包括(但不限於)植物(包括(但不限於)諸如單子葉植物或雙子葉植物的複雜植物)、藻類、原生生物、真菌(包括(但不限於)酵母等)、動物(包括(但不限於)哺乳動物、昆蟲、節肢動物等)等等。在另一個實施例中，第二生物體是原核生物，包括(但不限於)詹氏甲烷球菌、橫川病毒、嗜鹽桿菌屬、大腸埃希氏桿菌、閃爍古生球菌(A.fulgidus)、嗜鹽桿菌屬、激烈火球菌(P.furiosus)、堀越氏火球菌(P. horikoshii)、嗜熱菌敏捷氣熱菌(A.pernix)、嗜熱棲熱菌等等。或者，第二生物體可為真核生物，包括(但不限於)酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳動物細胞等等。在各種實施例中，第一生物體和第二生物體是不同的。
VI.非天然存在的胺基酸在GH(例如，hGH)多肽中的定位本發明涵蓋將一個或一個以上非天然存在的胺基酸併入GH(例如，hGH)多肽中。一個或一個以上非天然存在的胺基酸可以在不破壞多肽活性的特定位置處併入。此可通過進行「保守性」取代而實現，所述「保守性」取代包括(但不限於)以疏水性胺基酸取代疏水性胺基酸、龐大的胺基酸取代龐大的胺基酸、親水性胺基酸取代親水性胺基酸和/或將非天然存在的胺基酸插入不為活性所需的位置中。
GH(例如，hGH)的各區可如下說明，其中hGH中的胺基酸位置表示於中間一行中(SEQ ID NO2)。
螺旋A螺旋B螺旋C 螺旋D[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]N端 A-BB-C環 C-D環 C端可採用各種生物化學和結構方法來選擇用於在GH(例如，hGH)多肽內以非天然編碼的胺基酸進行取代的所要部位。所屬領域的技術人員易於了解，所述多肽鏈的任何位置是適於選擇的以併入非天然編碼的胺基酸，並且為了任何特定的所要目的或不為任何特定的所要目的，選擇可以基於合理設計或通過隨機選擇進行。選擇所要部位可以用於產生具有任何所要性質或活性的GH(例如，hGH)分子(包括(但不限於)促效劑、超促效劑、反向促效劑、拮抗劑、受體結合調節劑、受體活性調節劑)，用於二聚體或多聚體形成，與天然分子相比較不改變活性或性質，或調節多肽的任何物理性質或化學性質(諸如溶解性、聚集性或穩定性)。舉例而言，可使用此項技術中已知的點突變分析、丙氨酸掃描或同系物掃描法來鑑別GH(例如，hGH)多肽的生物活性所需的多肽位置。參見，例如，Cunningham，B.和Wells，J.，Science，2441081-1085(1989)(鑑別出14個對GH(例如，hGH)生物活性很關鍵的殘基)和Cunningham，B.等人，Science 2431330-1336(1989)(使用同系物掃描突變法鑑別抗體和受體抗原決定基)。美國專利第5,580,723號、第5,834,250號、第6,013,478號、第6,428,954號和第6,451,561號描述通過利用靶物質鑑別影響多肽活性的活性結構域對多肽(諸如，hGH)的結構和功能進行系統分析的方法，所述專利是以引用的方式併入本文中。除通過丙氨酸或同系物掃描突變法而鑑別為對生物活性很關鍵的那些殘基以外的殘基可以為以非天然編碼的胺基酸進行取代的良好候選殘基，此視所尋求的多肽的所要活性而定。或者，鑑別為對生物活性很關鍵的部位也可以為以非天然編碼的胺基酸進行取代的良好候選部位，此也視所尋求的多肽的所要活性而定。另一種替代選擇將為簡單地以非天然編碼的胺基酸在多肽鏈上的各個位置處進行連續取代並且觀察對多肽活性的影響。所屬領域的技術人員易於了解，用於選擇將非天然胺基酸取代到任何多肽中的位置的任何方式、技術或方法適用於本發明。
也可研究含有缺失的hGH多肽的天然存在的突變體的結構和活性以確定可能容許以非天然編碼的胺基酸進行取代的蛋白質區域。關於hGH，參見，例如，Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta，925314(1987)；Lewis，U.等人，J. Biol.Chem.，2532679-2687(1978)。以類似方式，可使用蛋白酶消化和單克隆抗體來鑑別擔負結合hGH受體的hGH區域。參見，例如，Cunningham，B.等人，Science 2431330-1336(1989)；Mills，J.等人，Endocrinology，107391-399(1980)；Li，C.，Mol.Cell.Biochem.，4631-41(1982)(表明殘基134與149之間的胺基酸可缺失而活性不會喪失)。一旦可能不容許以非天然編碼的胺基酸進行取代的殘基已經除去後，就可根據hGH和其結合蛋白質的三維晶體結構來研究在各個剩餘位置上所建議的取代的影響。關於hGH，參見de Vos，A.等人，Science，255306-312(1992)；hGH的所有晶體結構可在蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(包括3HHR、1AXI和1HWG)(PDB，可在www.rcsb.org上獲得)中獲得，所述蛋白質資料庫為含有蛋白質和核酸大分子的三維結構數據的集中式資料庫。如果三維結構數據不可獲得，那麼可以建立研究多肽的二級和三級結構的模型。因此，所屬領域的技術人員可易於鑑別可經非天然編碼的胺基酸取代的胺基酸位置。
在一些實施例中，本發明的GH(例如，hGH)多肽包含一個或一個以上位於不會破壞多肽的螺旋或β摺疊二級結構的蛋白質區域中的非天然存在的胺基酸。
併入非天然編碼的胺基酸的示範性殘基可以是那些排除在可能的受體結合區域(包括(但不限於)部位I和部位II)外的殘基，可以是那些完全地或部分地暴露於溶劑的殘基，那些與鄰近殘基的氫鍵鍵合相互作用最小或與鄰近殘基無氫鍵鍵合相互作用的殘基，可以是那些最低限度地暴露於鄰近反應性殘基的殘基，並且可以是那些在如通過與其受體結合或未結合的hGH的三維的晶體結構、二級、三級或四級結構所預測的高度撓性的(包括(但不限於)C-D環)或結構上剛性的(包括(但不限於)B螺旋)區域中的殘基。
在一些實施例中，在如下對應於hGH二級結構的一個或一個以上下列區域中的任何位置處將一個或一個以上非天然編碼的胺基酸併入對應於來自SEQ ID NO2的1-5(N端)、6-33(螺旋A)、34-74(螺旋A與螺旋B之間的區域，A-B環)、75-96(螺旋B)、97-105(螺旋B與螺旋C之間的區域，B-C環)、106-129(螺旋C)、130-153(螺旋C與螺旋D之間的區域，C-D環)、154-183(螺旋D)、184-191(C端)的位置。在其它實施例中，本發明的GH多肽(例如，hGH多肽)包含至少一個非天然存在的胺基酸，所述非天然存在的胺基酸取代位於GH(例如，hGH)的至少一個區域中的至少一個胺基酸，所述區域是選自由對應於以下區域的區域組成的群組SEQ ID NO2的N端(1-5)、A-B環的N端(32-46)、B-C環(97-105)、C-D環(132-149)和C端(184-191)。在一些實施例中，一個或一個以上非天然編碼的胺基酸是在GH(例如，hGH)的一個或一個以上的以下位置處併入，所述位置對應於位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。
併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位包括對應於以下位置的部位位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。
併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的子集包括對應於以下位置的部位位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187或其任何組合(來自SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。GH(例如，hGH)的晶體結構和其與GH(例如，hGH)受體的相互作用的研究表明這些胺基酸殘基的側鏈是完全地或部分地可為溶劑所接近，並且非天然編碼的胺基酸的側鏈可以遠離蛋白質表面而指向溶劑中。
併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性位置包括對應於以下位置的部位位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、16、139、140、143、145和155或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。GH(例如，hGH)的晶體結構和其與GH(例如，hGH)受體的相互作用的研究表明這些胺基酸殘基的側鏈是完全地暴露於溶劑的並且天然殘基的側鏈指向溶劑中。
併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的子集包括對應於以下位置的部位位置30、74、103或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的另一個子集包括對應於以下位置的部位位置35、92、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的又一個子集包括對應於以下位置的部位位置35、92、131、134、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的又一個子集包括對應於以下位置的部位位置30、35、74、92、103、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ IDNO1或3的相應胺基酸)。併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的又一個子集包括對應於以下位置的部位位置35、92、143、145或其任何組合(來自SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在某些實施例中，併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的部位包括對應於位置35(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)的部位。
在一些實施例中，併入GH(例如，hGH)中的至少一個非天然編碼的胺基酸含有羰基(例如，酮基)。在某些實施例中，併入GH(例如，hGH)中的至少一個非天然編碼的胺基酸是對乙醯苯丙氨酸。在GH(例如，hGH)含有多個非天然編碼的胺基酸的一些實施例中，併入GH(例如，hGH)中的多個非天然編碼的胺基酸是對乙醯苯丙氨酸。在GH(例如，hGH)含有多個非天然編碼的胺基酸的一些實施例中，併入GH(例如，hGH)中的大體上所有的非天然編碼的胺基酸是對乙醯苯丙氨酸。
在一些實施例中，非天然存在的胺基酸是在包括(但不限於)對應於以下位置的位置的一個或一個以上位置處與水溶性聚合物相連接位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物在一定位置處相連接，所述位置包括(但不限於)對應於30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)這些位置中的一個或一個以上位置的位置。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物在一定位置處相連接，所述位置包括(但不限於)對應於35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)這些位置中的一個或一個以上位置的位置。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物在一定位置處相連接，所述位置包括(但不限於)對應於35、92、131、1 34、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)這些位置中的一個或一個以上位置的位置。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物在一定位置處相連接，所述位置包括(但不限於)對應於30、35、74、92、103、145或其任何組合(來自SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)這些位置中的一個或一個以上位置的位置。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物在一定位置處相連接，所述位置包括(但不限於)對應於35、92、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)這些位置中的一個或一個以上位置的位置。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物在對應於(但不限於)位置35(來自SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)的位置處相連接。
在一些實施例中，與GH(例如，hGH)相連接的水溶性聚合物包括一個或一個以上聚乙二醇分子(PEG)。聚合物(例如，PEG)可以是線性或分枝的。通常，用於本發明中的線性聚合物(例如，PEG)可以具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kDa的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。通常，用於本發明中的分枝聚合物(例如，PEG)可以具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。諸如PEG的聚合物在本文中有進一步描述。在某些實施例中，GH(例如，hGH)與水溶性聚合物(例如，PEG)之間的鍵是肟鍵。
本發明的某些實施例涵蓋包括通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的GH(例如，hGH)的組合物，其中所述共價鍵是肟鍵。在一些實施例中，水溶性聚合物為PEG，例如，線性PEG。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的至少一個線性PEG的一些實施例中，所述PEG可以具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kDa的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的線性PEG的某些實施例中，所述PEG具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的至少一個分枝PEG的一些實施例中，所述PEG可以具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的分枝PEG的某些實施例中，所述PEG具有約40kDa的分子量。在一些實施例中，GH為例如hGH的GH，且在這些實施例中的某些實施例中，GH(例如，hGH)具有至少約80％與SEQ ID NO2相同的序列；在一些實施例中，GH(例如，hGH)具有為SEQ ID NO2的序列的序列。在一些實施例中，GH(例如，hGH)含有至少一個非天然編碼的胺基酸；在這些實施例中的一些實施例中，至少一個肟鍵是在非天然編碼的胺基酸與至少一個水溶性聚合物之間。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸含有羰基，諸如，酮基；在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸為對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，對乙醯苯丙氨酸是在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處進行取代。
因此，在一些實施例中，本發明提供一種通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接的GH(例如，hGH)，其中所述共價鍵為肟鍵。在某些實施例中，水溶性聚合物為PEG，且所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kDa的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的線性PEG的某些實施例中，所述PEG具有約30kDa的分子量。在某些實施例中，水溶性聚合物為PEG，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的分枝PEG的某些實施例中，所述PEG具有約40kDa的分子量。
在一些實施例中，本發明提供一種GH(例如，hGH)，其中所述GH(例如，hGH)含有非天然編碼的胺基酸，其中GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，並且其中所述共價鍵為非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物(例如，PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處將非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)中。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kDa的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的線性PEG的某些實施例中，所述PEG具有約30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的分枝PEG的某些實施例中，所述PEG具有約40kDa的分子量。
在一些實施例中，本發明提供一種GH(例如，hGH)，其中所述GH(例如，hGH)含有為含羰基的非天然編碼的胺基酸的非天然編碼的胺基酸，其中GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，並且所述共價鍵為非天然編碼的含羰基的胺基酸與水溶性聚合物(例如，PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，在對應於SEQID NO2的位置35的位置處將非天然編碼的含羰基的胺基酸併入GH(例如，hGH)中。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kD的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的線性PEG的某些實施例中，所述PEG具有約30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的分枝PEG的某些實施例中，所述PEG具有約40kDa的分子量。
在一些實施例中，本發明提供一種含有包括酮基的非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，並且其中所述共價鍵是含有酮基的非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物(例如，PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處將含有酮基的非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)中。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kD的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的線性PEG的某些實施例中，所述PEG具有約30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的分枝PEG的某些實施例中，所述PEG具有約40kDa的分子量。
在一些實施例中，本發明提供一種含有為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)，其中所述GH是通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，並且其中所述共價鍵是對乙醯苯丙氨酸與水溶性聚合物(例如，PEG)之間的肟鍵。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處將對乙醯苯丙氨酸併入GH(例如，hGH)中。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為線性PEG。在這些實施例中，線性PEG具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kD的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的線性PEG的某些實施例中，所述PEG具有約30kDa的分子量。在其中水溶性聚合物為PEG的某些實施例中，所述PEG為分枝PEG。在這些實施例中，分枝PEG具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。在涵蓋通過肟鍵與GH(例如，hGH)相連接的分枝PEG的某些實施例中，PEG具有約40kDa的分子量。
在某些實施例中，本發明提供一種GH(例如，hGH)，其包括SEQ ID NO2，並且其中所述GH(例如，hGH)是在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處經對乙醯苯丙氨酸取代，所述對乙醯苯丙氨酸是通過肟鍵與分子量為約30kDa的線性PEG相連接。
在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置35、92、13 1、134、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置30、35、74、92、103、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置35、92、143、145或其任何組合(來自SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於位置35(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)的位置。在PEG為線性PEG的實施例中，PEG可以具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kD的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。
在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包括SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置30、35、74、92、103、143、145(SEQID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置35、92、131、134、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置30、35、74、92、103、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於以下位置的位置位置35、92、143、145或其任何組合(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，本發明提供一種包括通過肟鍵與至少一個PEG(例如，線性PEG)相連接的GH(例如，hGH)的激素組合物，其中所述GH(例如，hGH)包含SEQID NO2的胺基酸序列，並且其中GH(例如，hGH)含有在一個或一個以上位置處進行取代的至少一個為對乙醯苯丙氨酸的非天然編碼的胺基酸，所述位置包括(但不限於)對應於位置35(來自SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)的位置。在PEG為線性PEG的實施例中，PEG可以具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kD的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。
在一些實施例中，本發明提供一種GH(例如，hGH)，其中所述GH(例如，hGH)含有至少一個非天然編碼的胺基酸，其中GH是通過共價鍵與多個水溶性聚合物(例如，多個PEG)相連接，其中一個或一個以上共價鍵是在至少一個非天然編碼的胺基酸與水溶性聚合物(例如，PEG)之間的肟鍵。GH(例如，hGH)可以與約2-100個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約2-50個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約2-25個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約2-10個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約2-5個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約5-100個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約5-50個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約5-25個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約5-10個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約10-100個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約10-50個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約10-20個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約20-100個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約20-50個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接，或與約50-100個水溶性聚合物(例如，PEG)相連接。可在本文所述的任何位置處將一個或一個以上非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)中。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處將至少一個非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)中。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸包括至少一個為含有羰基的非天然編碼的胺基酸的非天然編碼的胺基酸，例如，含有酮基的非天然編碼的胺基酸，諸如，對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，GH(例如，hGH)包括對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO2的位置35的位置處將對乙醯苯丙氨酸併入GH(例如，hGH)中，其中對乙醯苯丙氨酸是通過肟鍵與聚合物中的一個(例如，PEG中的一個)相連接。在一些實施例中，至少一個水溶性聚合物(例如，PEG)是通過與至少一個非天然編碼的胺基酸的共價鍵而與GH(例如，hGH)相連接。在一些實施例中，所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，多個水溶性聚合物(例如，PEG)是通過與多個非天然編碼的胺基酸的共價鍵而與GH(例如，hGH)相連接。在一些實施例中，至少一個共價鍵為肟鍵；在一些實施例中，多個共價鍵為肟鍵；在一些實施例中，大體上所有的鍵為肟鍵。多個水溶性聚合物(例如，PEG)可為線性聚合物、分枝聚合物或其任何組合。在併入一個或一個以上線性PEG的實施例中，線性PEG具有約0.1kDa到約100kDa的分子量，或具有約1kDa到約60kDa的分子量，或具有約20kDa到約40kDa的分子量，或具有約30kDa的分子量。在併入一個或一個以上分枝PEG的實施例中，分枝PEG具有約1kDa到約100kDa的分子量，或具有約30kDa到約50kDa的分子量，或具有約40kDa的分子量。應了解，採用多個水溶性聚合物(例如，PEG)的實施例一般而言將採用分子量比使用單個PEG的實施例低的所述聚合物。因而，在一些實施例中，多個PEG的總分子量為約0.1-500kDa，或為約0.1-200kDa，或為約0.1-100kDa，或為約1-1000kDa，或為約1-500kDa，或為約1-200kDa，或為約1-100kDa，或為約10-1000kDa，或為約10-500kDa，或為約10-200kDa，或為約10-100kDa，或為約10-50kDa，或為約20-1000kDa，或為約20-500kDa，或為約20-200kDa，或為約20-100kDa，或為約20-80kDa，為約20-60kDa，為約5-100kDa，為約5-50kDa，或為約5-20kDa。
人類GH拮抗劑包括(但不限於)在位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127處具有取代或在位置1處具有添加(即，在N端)或其任何組合(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1、3或任何其它GH序列中的相應胺基酸)的那些拮抗劑。
可將各種非天然編碼的胺基酸取代到或併入GH(例如，hGH)多肽中的指定位置。一般而言，基於GH(例如，hGH)多肽與其受體的三維晶體結構的研究、保守性取代的優選(即，基於芳基的非天然編碼的胺基酸，諸如對乙醯苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸取代Phe、Tyr或Trp)和所屬領域的技術人員希望引入GH(例如，hGH)多肽中的特異性結合化學作用(例如，如果所屬領域的技術人員想要實現與具有炔部分的水溶性聚合物的胡氏根[3+2]環加成作用或與具有又併入膦部分的芳基酯的水溶性聚合物的醯胺鍵形成作用，那麼就引入4-疊氮基苯丙氨酸)，選擇適於併入的特定的非天然編碼的胺基酸。
在一個實施例中，方法另外包括將非天然的胺基酸併入蛋白質中，其中所述非天然的胺基酸包含第一反應性基團；和使蛋白質與包含第二反應性基團的分子(包括(但不限於)標記、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光致交聯劑、放射性核素、細胞毒素化合物、藥物、親和標記、光親和標記、反應性化合物、樹脂、第二蛋白質或多肽或多肽類似物、抗體或抗體片段、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸、DNA、RNA、反義多聚核苷酸、糖類、水溶性樹枝狀聚合物、環糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、納米粒子、自旋標記、螢光團、含金屬的部分、放射性部分、新穎的官能團、共價地或非共價地與其它分子相互作用的基團、光籠鎖部分、光化輻射可激發部分、光敏異構化部分、生物素、生物素的衍生物、生物素類似物、併入重原子的部分、可化學裂解的基團、可光致裂解的基團、伸長的側鏈、經碳連接的糖、氧化還原活性劑、氨基硫代酸、有毒部分、經同位素標記的部分、生物物理學探針、發磷光的基團、化學發光基團、電子密集基團、磁性基團、插入基團、發色團、能量轉移劑、生物活性劑、可檢測的標記、小分子、量子點、納米傳導物、放射性核苷酸、放射性傳導物、中子俘獲劑或上述物質的任何組合或任何其它所要化合物或物質)接觸。所述第一反應性基團與所述第二反應性基團反應以通過[3+2]環加成作用使分子與非天然的胺基酸相連接。在一個實施例中，第一反應性基團是炔基或疊氮基部分，並且第二反應性基團是疊氮基或炔基部分。舉例而言，第一反應性基團是炔基部分(包括(但不限於)在非天然的胺基酸對炔丙基氧基苯丙氨酸中)，並且第二反應性基團是疊氮基部分。在另一個實例中，第一反應性基團是疊氮基部分(包括(但不限於)在非天然的胺基酸對-疊氮基-L-苯丙氨酸中)，並且第二反應性基團是炔基部分。
在一些情況下，將使非天然編碼的胺基酸取代與GH(例如，hGH)多肽內的其它添加、取代或缺失組合以影響GH(例如，hGH)多肽的其它生物特性。在一些情況下，其它添加、取代或缺失可以增加GH(例如，hGH)多肽的穩定性(包括(但不限於)對蛋白水解降解的抗性)或增加GH(例如，hGH)多肽對其受體的親和力。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含選自由下列各取代組成的群組的胺基酸取代SEQID NO2中的F10A、F10H、F10I；M14W、M14Q、M14G；H18D；H21N；G120A；R167N；D171S；E174S；F176Y、I179T或其任何組合。在一些情況下，其它添加、取代或缺失可以增加GH(例如，hGH)多肽的溶解性(包括(但不限於)當在大腸桿菌或其它宿主細胞中表達時)。在一些實施例中，添加、取代或缺失可以增加在大腸桿菌或其它重組宿主細胞中表達後的多肽溶解性。在一些實施例中，除適於併入導致在大腸桿菌或其它重組宿主細胞中表達後的多肽溶解性增加的非天然的胺基酸的部位之外，還選擇適於以天然編碼的或非天然的胺基酸進行取代的其它部位。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽包含另一添加、取代或缺失，其調控對GH(例如，hGH)多肽受體的親和力，調控(包括(但不限於)增強或減弱)受體二聚化，穩定受體二聚體，調控循環半衰期，調控釋放或生物利用率，促進純化，或改善或改變特定投藥途徑。舉例而言，除引入如本文所述的一個或一個以上非天然編碼的胺基酸外，還引入一個或一個以上的以下取代來增加GH(例如，hGH)變異體對其受體的親和力F10A、F10H或F10I；M14W、M14Q或M14G；H18D；H21N；R167N；D171S；E174S；F176Y和I179T。同樣地，GH(例如，hGH)多肽可包含化學或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反應性基團、抗體結合域(包括(但不限於)FLAG或聚組氨酸)或其它基於親和力的序列(包括(但不限於)FLAG、聚組氨酸、GST等)或連接分子(包括(但不限於)生物素)，其改善檢測(包括(但不限於)GFP)、純化、通過組織或細胞膜的運輸、前藥釋放或活化、hGH大小減縮或多肽的其它特性。
在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸的取代產生GH(例如，hGH)拮抗劑。適於併入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的示範性部位的子集包括位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或位置1前的添加(SEQ ID NO2，SEQ ID NO1、3或任何其它GH序列的相應胺基酸)。在一些實施例中，GH(例如，hGH)拮抗劑包含使得GH充當拮抗劑的在以下區域中的至少一個取代1-5(N端)、6-33(螺旋A)、34-74(螺旋A與螺旋B之間的區域，A-B環)、75-96(螺旋B)、97-105(螺旋B與螺旋C之間的區域，B-C環)、106-129(螺旋C)、130-153(螺旋C與螺旋D之間的區域，C-D環)、154-183(螺旋D)、184-191(C端)。在其它實施例中，併入非天然編碼的胺基酸的示範性部位包括在螺旋A的氨基端區域和一部分螺旋C內的殘基。在另一個實施例中，以諸如對-疊氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸的非天然編碼的胺基酸取代G120。在其它實施例中，將上面列出的取代與其它取代組合，使得GH(例如，hGH)多肽成為GH(例如，hGH)拮抗劑。舉例而言，在本文中所鑑別的位置中的一個位置處以非天然編碼的胺基酸取代，且同時在G120處引入取代(例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)。在一些實施例中，GH(例如，hGH)拮抗劑包含與水溶性聚合物相連接的存在於GH(例如，hGH)分子受體結合區域中的非天然編碼的胺基酸。
在一些情況下，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上的胺基酸經一個或一個以上的非天然編碼的胺基酸取代。在一些情況下，GH(例如，hGH)多肽另外包括1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上的一個或一個以上非天然編碼的胺基酸對天然存在的胺基酸的取代。舉例而言，在一些實施例中，GH(例如，hGH)的以下區域中的一個或一個以上殘基經一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代1-5(N端)；32-46(A-B環的N端)；97-105(B-C環)；和132-149(C-D環)；和184-191(C端)。在一些實施例中，GH(例如，hGH)的以下區域中的一個或一個以上殘基經一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代1-5(N端)、6-33(螺旋A)、34-74(螺旋A與螺旋B之間的區域，A-B環)、75-96(螺旋B)、97-105(螺旋B與螺旋C之間的區域，B-C環)、106-129(螺旋C)、130-153(螺旋C與螺旋D之間的區域，C-D環)、154-183(螺旋D)、184-191(C端)。在一些情況下，一個或一個以上非天然編碼的殘基是與一個或一個以上較低分子量的線性或分枝PEG(質量大約5-20kDa或更小)相連接，進而相對於與單個、較高分子量的PEG相連接的物質來說，其使結合親和力增強並且血清半衰期相當。
在一些實施例中，以下GH(例如，hGH)的殘基中至多兩個殘基在以下位置處經一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187。在一些情況下，進行以下成對的取代中的任何取代K38X*和K140X*；K41X*和K145X*；Y35X*和E88X*；Y35X*和F92X*；Y35X*和Y143X*；F92X*和Y143X*，其中X*表示非天然編碼的胺基酸。適於併入兩個或兩個以上非天然編碼的胺基酸的優選部位包括以下殘基的組合位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187。適於併入兩個或兩個以上非天然編碼的胺基酸的特別優選的部位包括以下殘基的組合位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155。
適於將兩個或兩個以上非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)中的優選部位包括以下殘基的組合來自SEQ ID NO2的位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)或其任何組合。
VII.在非真核生物和真核生物中的表達為獲得克隆GH(例如，hGH)多聚核苷酸的高水平表達，所屬領域的技術人員通常將編碼本發明的GH(例如，hGH)多肽的多聚核苷酸亞克隆到表達載體中，所述表達載體含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子，且若對於編碼蛋白質的核酸而言，則其還含有用於翻譯起始的核糖體結合部位。合適的細菌啟動子對所屬領域的技術人員來說是已知的並且描述(例如)於Sambrook等人和Ausubel等人中。
用於表達本發明的GH(例如，hGH)多肽的細菌表達系統可在(包括(但不限於))大腸桿菌、芽胞桿菌種(Bacillus sp.)、螢光假單胞菌、綠膿假單胞菌、惡臭假單胞菌和沙門氏菌屬(Salmonella))中得到(Palva等人，Gene22229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302543-545(1983))。用於所述表達系統的試劑盒是可購得的。用於哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統對所屬領域的技術人員來說是已知的並且也是可購得的。在使用正交tRNA和氨醯基tRNA合成酶(上面所描述)表達本發明的GH(例如，hGH)多肽的情況下，供表達的宿主細胞是基於其使用正交組分的能力加以選擇。示範性宿主細胞包括革蘭氏陽性細菌(Gram-positive bacteria)(包括(但不限於)短小芽胞桿菌(B.brevis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或鏈黴菌屬(Streptomyces))和革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)(大腸桿菌、螢光假單胞菌、綠膿假單胞菌、惡臭假單胞菌菌)以及酵母和其它真核細胞。如本文中所述可使用包含O-tRNA/O-RS對的細胞。
本發明的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供合成包含大量有用的非天然胺基酸的蛋白質的能力。一方面，組合物視需要包括(包括(但不限於))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包含非天然胺基酸的蛋白質，或包括可用活體內蛋白質產生方法(本文中提供有關重組蛋白質產生和純化的詳細資料)獲得的量。另一方面，所述蛋白質視需要是以在包括(但不限於)細胞溶胞產物、緩衝液、醫藥緩衝液或其它液體懸浮液(包括(但不限於)，為包括(但不限於)約1nl到約100L之間的任何數量的體積)中包括(但不限於)每升至少10微克的蛋白質、每升至少50微克的蛋白質、每升至少75微克的蛋白質、每升至少100微克的蛋白質、每升至少200微克的蛋白質、每升至少250微克的蛋白質、每升至少500微克的蛋白質、每升至少1毫克的蛋白質或每升至少10毫克或10毫克以上的蛋白質的濃度存在組合物中。在真核細胞中產生大量(包括(但不限於)，比通常可能以包括(但不限於)活體外翻譯的其它方法所產生的量大的量)的包括至少一個非天然胺基酸的蛋白質是本發明的一特徵。
本發明的真核宿主細胞或非真核宿主細胞提供生物合成包含大量有用的非天然胺基酸的蛋白質的能力。舉例而言，包含非天然胺基酸的蛋白質可以在細胞提取物、細胞溶胞產物、培養基、緩衝液等中的如下濃度產生包括(但不限於)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20毫克/升、至少30毫克/升、至少40毫克/升、至少50毫克/升、至少60毫克/升、至少70毫克/升、至少80毫克/升、至少90毫克/升、至少100毫克/升、至少200毫克/升、至少300毫克/升、至少400毫克/升、至少500毫克/升、至少600毫克/升、至少700毫克/升、至少800毫克/升、至少900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的蛋白質。
I.表達系統、培養和分離GH(例如，hGH)多肽可以在包括(例如)酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞和細菌的許多合適的表達系統中表達。示範性表達系統的描述提供於下文。
酵母如本文所使用的術語「酵母」包括能夠表達編碼GH(例如，hGH)多肽的基因的各種酵母中的任何酵母。所述酵母包括(但不限於)產子囊孢子酵母(內孢黴目(Endomycetales))、產擔子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和屬於不完全菌類(芽生菌目(Blastomycetes))群組的酵母。產子囊孢子酵母分為2個科，蝕精黴科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。後者包含4個亞科，裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母屬(genus Schizosaccharomyces))、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如，畢赤氏酵母屬(genera Pichia)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)和酵母菌屬(Saccharomyces))。產擔子孢子酵母包括擔子菌白冬孢酵母屬(genera Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉菌屬(Filobasidium)和香灰擬鎖擔菌屬(Filobasidiella)。屬於不完全菌類(芽生菌目)群組的酵母分為2個科，擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，擲孢酵母屬(genera Sporobolomyces)和布勒彈孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，念珠菌屬(genus Candida))。
供本發明使用的特別受關注的是以下物種內的物種畢赤氏酵母屬、克魯維酵母菌屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和念珠菌屬，包括(但不限於)巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、顧勒莫蒂畢赤酵母(P.guillerimondii)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克魯維爾酵母(S.kluyveri)、諾本斯酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)、白色念珠菌(C.albicans)、麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)和多型漢遜酵母(H.polymorpha)。
選擇用於表達GH(例如，hGH)多肽的合適酵母是屬於所屬領域的技術人員的技能範圍內。在選擇用於表達的酵母宿主時，合適的宿主可以包括顯示具有(例如)良好的分泌能力、低蛋白水解活性、良好的分泌能力、良好的可溶性蛋白質產生和整體穩健性的那些宿主。酵母一般可從包括(但不限於)以下來源的各種來源獲得Yeast GeneticStock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA)和American Type Culture Collection(「ATCC」)(Manassas，VA)。
術語「酵母宿主」或「酵母宿主細胞」包括可用作或已經用作重組載體或其它轉移DNA的接受者的酵母。所述術語包括已經接受重組載體或其它轉移DNA的原始酵母宿主細胞的子代。應了解，由於偶然的或有意的突變，單一親代細胞的子代在形態學方面或在與原始親代互補的染色體組DNA或總DNA方面可以不必完全相同。與待通過諸如編碼GH(例如，hGH)多肽的核苷酸序列的存在的相關性質表徵的親代十分相似的親代細胞的子代包括在此定義所指的子代中。
已經研製包括染色體外複製子或整合載體的表達和轉化載體用於轉化到許多酵母宿主中。舉例而言，已經研製用於釀酒酵母的表達載體(Sikorski等人，GENETICS(1989)12219；Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)751929)；用於白色念珠菌的表達載體(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6142)；用於麥芽糖假絲酵母的表達載體(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25141)；用於多型漢遜酵母的表達載體(Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)1323459；Roggenkamp等人，MOL.GENETICS AND GENOMICS(1986)202302)；用於脆壁克魯維酵母的表達載體(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)1581165)；用於乳酸克魯維酵母的表達載體(De Louvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154737；Van denBerg等人，BIOTECHNOLOGY(NY)(1990)8135)；用于勒莫蒂畢赤酵母的表達載體(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25141)；用於巴斯德畢赤酵母的表達載體(美國專利第5,324,639號、第4,929,555號和第4,837,148號；Gregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)53376)；用於粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的表達載體(Beach等人，NATURE(1982)300706)；和用於解脂耶羅威亞酵母(Y.lipolytica)的表達載體；用於構巢麴黴(A.nidulans)的表達載體(Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26205-221；和Yelton等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)811470-74)；用於黑黴菌(A.niger)的表達載體(Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4475-479)；用於裡氏木黴(T.reesia)的表達載體(EP 0 244 234)；和用於諸如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)的絲狀真菌的表達載體(WO 91/00357)，各個參考文獻是以引用的方式併入本文中。
酵母載體的控制序列對所屬領域的技術人員來說是已知的，並且包括(但不限於)來自諸如以下基因的基因的啟動子區域醇脫氫酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸異構酶；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可以提供有用的啟動子序列(Miyanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)801)。供酵母宿主使用的其它合適的啟動子序列可以包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)25512073)和諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構酶和磷酸葡糖異構酶的其它糖酵解酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)174900；Hess等人，J.ADV.ENZYMEREG.(1969)7149)的啟動子。對於通過生長條件控制轉錄具有額外優點的可誘導酵母啟動子可以包括醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、與氮代謝相關的降解酶以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區域。適用於酵母表達的合適的載體和啟動子進一步描述於EP 0 073 657中。
酵母增強子也可以與酵母啟動子一起使用。另外，合成的啟動子也可以起酵母啟動子的作用。舉例而言，酵母啟動子的上遊激活序列(UAS)可以與另一酵母啟動子的轉錄激活區域相接合，產生合成的雜交啟動子。所述雜交啟動子的實例包括與GAP轉錄激活區域相連接的ADH調控序列。參見，美國專利第4,880,734號和第4,876,197號，其是以引用的方式併入本文中。雜交啟動子的其它實例包括由與諸如GAP或PyK的糖酵解酶基因的轉錄激活區域組合的ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的調控序列組成的啟動子。參見，EP 0 164 556。此外，酵母啟動子可以包括具有結合酵母RNA聚合酶並且引發轉錄的能力的非酵母源的天然存在的啟動子。
可以包含部分酵母表達載體的其它控制元件包括(例如)來自GAPDH或烯醇酶基因的終止子(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)2561385)。另外，來自2μ質粒源的複製起點適用於酵母。適用於酵母的合適的選擇基因是存在於酵母質粒中的trp1基因。參見，Tschumper等人，GENE(1980)10157；Kingsman等人，GENE(1979)7141。trp1基因為無法在色氨酸中生長的酵母突變菌株提供選擇標記物。同樣地，缺Leu2的酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)是通過帶有Leu2基因的已知質粒來補充。
將外源性DNA引入酵母宿主中的方法對所屬領域的技術人員來說是已知的，並且通常包括(但不限於)用鹼性陽離子處理的完整酵母宿主細胞或原生質球狀體的轉化。舉例而言，酵母的轉化可根據Hsiao等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)763829和Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130946中所述的方法進行。然而，諸如通過核注射、電穿孔或原生質體融合的用於將DNA引入細胞中的其它方法也可以如SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONINGA LAB.MANUAL(2001)中一般所述來使用。接著可以使用所屬領域的技術人員已知的標準技術培養酵母宿主細胞。
用於在酵母宿主細胞中表達異源蛋白質的其它方法對所屬領域的技術人員來說是已知的。一般參見，美國專利公開案第20020055169號、美國專利第6,361,969號；第6,312,923號；第6,183,985號；第6,083,723號；第6,017,731號；第5,674,706號；第5,629,203號；第5,602,034號和第5,089,398號；美國再審專利第RE37,343號和第RE35,749號；PCT公開專利申請案WO 99/07862；WO 98/37208；和WO 98/26080；歐洲專利申請案EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324 274和EP 0 164 556。也參見Gellissen等人，ANTONIEVANLEEUWENHOEK(1992)62(1-2)79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)1853-7，各個參考文獻是以引用的方式併入本文中。
酵母宿主菌株在擴增階段可使用所屬領域的技術人員已知的標準補料分批發酵方法生長於發酵罐中。由於特定酵母宿主的碳利用路徑或表達控制的模式的差異，可對發酵方法加以調適。舉例而言，酵母菌屬酵母宿主的發酵可能需要單一的葡萄糖進料、複合氮源(例如，酪蛋白水解產物)和多次維生素補充。相比之下，甲基營養型酵母巴斯德畢赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量礦物質進料，但僅需要簡單的銨(氮)鹽以獲得最佳生長和表達。參見，例如，美國專利第5,324,639號；Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)995；和Fieschko等人，BIOTECH.BIOENG.(1987)291113，其是以引用的方式併入本文中。
然而，獨立於所採用的酵母宿主菌株，所述發酵方法可以具有某些共有特徵。舉例而言，可在擴增階段將通常為碳的生長限制性營養物添加到發酵罐中以允許最大程度的生長。另外，發酵方法一般採用經設計而含有足夠量的碳、氮、基本鹽、磷和其它微量營養物(維生素、痕量礦物質和鹽等)的發酵培養基。適於供畢赤氏酵母使用的發酵培養基的實例是描述於美國專利第5,324,639號和第5,231,178號中，所述專利以引用的方式併入本文中。
經杆狀病毒感染的昆蟲細胞術語「昆蟲宿主」或「昆蟲宿主細胞」指的是可用作或已經用作重組載體或其它轉移DNA的接受者的昆蟲。所述術語包括已經被轉染的原始昆蟲宿主細胞的子代。應了解，由於偶然的或有意的突變，單一親代細胞的子代在形態學方面或在與原始親代互補的染色體組DNA或總DNA方面可以不必完全相同。與待通過諸如編碼GH(例如，hGH)多肽的核苷酸序列的存在的相關性質表徵的親代十分相似的親代細胞的子代包括在此定義所指的子代中。
用於表達GH(例如，hGH)多肽的合適昆蟲細胞的選擇對所屬領域的技術人員來說是已知的。一些昆蟲物種在此項技術中得到充分的描述並且是可購得的，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇用於表達的昆蟲宿主時，合適的宿主可以包括顯示尤其具有良好的分泌能力、低蛋白水解活性和整體穩健性的那些宿主。昆蟲一般可從包括(但不限於)以下來源的各種來源獲得Insect GeneticStock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA)；和American Type Culture Collection(「ATCC」)(Manassas，VA)。
通常，經杆狀病毒感染的昆蟲表達系統的組分包括轉移載體，通常為細菌質粒，其含有杆狀病毒基因組的片段和用於插入待表達的異源基因的適宜的限制性部位；具有與轉移載體中的杆狀病毒特異性片段同源的序列的野生型杆狀病毒(此允許異源基因在杆狀病毒基因組中的同源重組)；和適當的昆蟲宿主細胞和生長培養基。用於構建載體、轉染細胞、挑取蝕斑、使細胞生長於培養物中等的材料、方法和技術在此項技術中為已知的並且描述這些技術的手冊是可獲得的。
在將異源基因插入轉移載體中後，載體和野生型病毒基因組被轉染到昆蟲宿主細胞中，在所述宿主細胞中所述載體和病毒基因組重組。表達經包裝的重組病毒並且鑑別和純化重組蝕斑。用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法是以來自(例如)Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)的試劑盒形式購得。這些技術一般為所屬領域的技術人員所知並且在以引用的方式併入本文的SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN NO.1555(1987)中進行了全面描述。也參見，RICHARDSON，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGYBACULOVIRUSEXPRESSION PROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；KING和POSSEE，THE BACULOVIRUSSYSTEMA LABORATORY GUIDE(1992)；和O′REILLY等人，BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORSA LABORATORY MANUAL(1992)。
實際上，使用杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的各種異源蛋白質的產生對所屬領域的技術人員來說是已知的。參見，例如，美國專利第6,368,825號；第6,342,216號；第6,338,846號；第6,261,805號；第6,245,528號；第6,225,060號；第6,183,987號；第6,168,932號；第6,126,944號；第6,096,304號；第6,013,433號；第5,965,393號；第5,939,285號；第5,891,676號；第5,871,986號；第5,861,279號；第5,858,368號；第5,843,733號；第5,762,939號；第5,753,220號；第5,605,827號；第5,583,023號；第5,571,709號；第5,516,657號；第5,290,686號；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，所述參考文獻是以引用的方式併入本文中。
適用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的載體在此項技術中是已知的並且包括(例如)源自為不依賴於輔助病毒(helper)的病毒表達載體的杆狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)的昆蟲表達和轉移載體。源自此系統的病毒表達載體一般使用強病毒性多角體蛋白基因啟動子來促使異源基因的表達。一般參見O′Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORSA LABORATORYMANUAL(1992)。
在將外源基因插入杆狀病毒基因組中之前，通常將包含啟動子、前導序列(若有需要時)、所關注的編碼序列和轉錄終止序列的上述組分裝配成中間錯位構建物(轉移載體)。常將中間錯位構建物維持在諸如能夠穩定維持在諸如細菌的宿主中的染色體外元件(例如，質粒)的複製子中。複製子將會具有複製系統，因此允許其得以維持在用於克隆和擴增的合適宿主中。更明確地說，質粒可以含有多角體蛋白多聚腺苷酸化信號(Miller，ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42177)以及用於在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核生物氨苄青黴素(ampicillin)抗性(amp)基因和複製起點。
用於將外源基因引入AcNPV中的一種常用轉移載體是pAc373。也已經設計了許多其它已為所屬領域的技術人員所知的載體，包括(例如)pVL985，其將多角體蛋白起始密碼子從ATG改變成ATT，並且在ATT下遊的32個鹼基對處引入BamHI克隆部位。參見Luckow和Summers，VIROLOGY 17031(1989)。其它可購得的載體包括(例如)PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。
在插入異源基因後，將轉移載體和野生型杆狀病毒基因組共轉染到昆蟲細胞宿主中。用於將異源DNA引入杆狀病毒的所要部位中的方法在此項技術中是已知的。參見，SUMMERS和SMITH，TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETINNo.1555(1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)32156；Luckow和Summers，VIROLOGY(1989)17031。舉例而言，插入可為通過同源雙交換重組插入到諸如多角體蛋白基因的基因中；插入也可為插入到經設計於所要的杆狀病毒基因中的限制性內切酶部位中。參見，Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4)91。
轉染可以通過電穿孔完成。參見，TROTTER和WOOD，39 METHODS INMOLECULAR BIOLOGY(1995)；Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)703501。或者，可使用脂質體以重組表達載體和杆狀病毒轉染昆蟲細胞。參見，例如，Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1)36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)376050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)13570；Schmidt等人，PROTEINEXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12323；Siffert等人，NATURE GENETICS(1998)1845；TILKTNS等人，CELL BIOLOGYA LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10263；Dolphin等人，NATURE GENETICS(1997)17491；Kost等人，GENE(1997)190139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)27122203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37)22376；Reverey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)2704121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)766；和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2)274。可購得的脂質體包括(例如)Cellfectin和Lipofectin(Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。另外，可以使用磷酸鈣轉染。參見，TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)5667；和Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)703501。
杆狀病毒表達載體通常含有杆狀病毒啟動子。杆狀病毒啟動子是任何能夠結合杆狀病毒RNA聚合酶並且引發將編碼序列(例如，結構基因)下遊(3′)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子將具有通常位於最接近於編碼序列的5′端的轉錄起始區域。所述轉錄起始區域通常包括RNA聚合酶結合部位和轉錄起始部位。杆狀病毒啟動子也可以具有稱為增強子的第二域，如果存在，那麼其通常遠離結構基因。此外，表達可為調節型的或為組成型的。
在感染循環的後期充分轉錄的結構基因提供特別有用的啟動子序列。實例包括源自編碼病毒多角體蛋白質的基因(FRIESEN等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和編碼p10蛋白質的基因(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69765)的序列。
將新形成的杆狀病毒表達載體包裝到感染性重組杆狀病毒中，並且隨後可以通過所屬領域的技術人員已知的技術來純化已生長的蝕斑。參見，Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4)91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENTSTATION BULLETIN NO.1555(1987)。
已經研製出用於感染到一些昆蟲細胞中的重組杆狀病毒表達載體。例如，已經研製尤其用於埃及伊蚊(ATCC第CCL-125號)、家蠶(ATCC第CRL-8910號)、黑腹果蠅(ATCC第1963號)、草地夜蛾和粉紋夜蛾的重組杆狀病毒。參見，Wright，NATURE(1986)321718；Carbonell等人，J.VIROL.(1985)56153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)32156。一般參見，Fraser等人，INVITRO CELL.DEV.BIOL.(1989)25225。更明確地說，用於杆狀病毒表達載體系統的細胞系通常包括(但不限於)Sf9(草地夜蛾)(ATCC第CRL-1711號)、Sf21(草地夜蛾)(Invitrogen Corp.，目錄第11497-013號(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉紋夜蛾)和High-FiveTMBTI-TN-5B1-4(粉紋夜蛾)。
用於在杆狀病毒/表達中直接表達和融合表達異源多肽的細胞和培養基是可購得的，並且細胞培養技術對所屬領域的技術人員來說一般是已知的。
大腸桿菌、假單胞菌種和其它原核生物細菌表達技術對所屬領域的技術人員來說是已知的。用於細菌宿主中的各種各樣的載體是可獲得的。載體可以是單拷貝或低度多拷貝或高度多拷貝載體。載體可以用於克隆和/或表達。鑑於關於載體的大量文獻、許多載體的商業可獲性並且還鑑於描述載體和其限制性酶切圖與特徵的手冊，在此不需要廣泛討論。如所熟知的，載體通常涉及供選擇用的標記物，所述標記物可以提供細胞毒素劑抗性、原營養或免疫性。常常存在提供不同特徵的多個標記物。
細菌啟動子是任何能夠結合細菌RNA聚合酶並且引發將編碼序列(例如，結構基因)下遊(3′)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子將具有通常位於最接近於編碼序列的5′端的轉錄起始區域。所述轉錄起始區域通常包括RNA聚合酶結合部位和轉錄起始部位。細菌啟動子也可以具有稱為操縱子的第二域，其可以與RNA合成開始處的鄰近RNA聚合酶結合部位重疊。因為基因阻遏蛋白可以結合操縱子並且進而抑制特定基因的轉錄，所以操縱子容許負調控(可誘導的)的轉錄。組成型表達可以在不存在諸如操縱子的負調控元件時發生。另外，正調控可以通過基因活化蛋白結合序列來達成，如果所述基因活化蛋白結合序列存在，那麼其通常最接近於RNA聚合酶結合序列(5′)。基因活化蛋白的一個實例是分解代謝物活化蛋白(CAP)，其幫助引發lac操縱子在大腸埃希氏桿菌(大腸桿菌，E.coli)中的轉錄[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18173]。經調控的表達因此可以是正性的或負性的，進而增強或減少轉錄。
編碼代謝路徑酶的序列提供特別有用的啟動子序列。實例包括源自諸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)1981056]和麥芽糖的糖代謝酶的啟動子序列。其它實例包括源自諸如色氨酸(trp)的生物合成酶的啟動子序列[Goeddel等人，Nuc.ACIDS RES.(1980)84057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9731；美國專利第4,738,921號；歐洲專利公開案第036 776號和第121 775號，其是以引用的方式併入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)啟動子系統[Weissmann(1981)″The cloning of interferonand other mistakes.″In Interferon 3(I.Gresser編)]、噬菌體λPL[Shimatake等人，NATURE(1981)292128]和T5[美國專利第4,689,406號，其是以引用的方式併入本文中]啟動子系統也提供有用的啟動子序列。本發明的優選方法利用諸如T7啟動子的強啟動子來誘導高水平的GH(例如，hGH)多肽。所述載體的實例對所屬領域的技術人員來說是已知的並且包括來自Novagen的pET29系列和描述在以引用的方式併入本文的WO99/05297中的pPOP載體。所述表達系統在宿主中產生高水平的GH(例如，hGH)多肽，而不會危害到宿主細胞生存能力或生長參數。pET19(Novagen)是在此項技術中已知的另一種載體。
另外，在自然界中不存在的合成啟動子也起細菌啟動子的作用。舉例而言，一個細菌啟動子或噬菌體啟動子的轉錄活化序列可以與另一個細菌啟動子或噬菌體啟動子的操縱子序列相接合，產生合成的雜交啟動子[美國專利第4,551,433號，其是以引用的方式併入本文中]。舉例而言，tac啟動子是受lac阻遏物調控的由trp啟動子和lac操縱子序列組成的雜交trp-lac啟動子[Amann等人，GENE(1983)25167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)8021]。此外，細菌啟動子可包括具有結合細菌RNA聚合酶並且引發轉錄的能力的非細菌來源的天然存在的啟動子。非細菌來源的天然存在的啟動子也能與相容的RNA聚合酶偶合以產生一些基因在原核生物中的高水平表達。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動子系統為經偶合的啟動子系統的實例[Studier等人，J.MOL.BIOL.(1986)189113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)821074]。另外，雜交啟動子也可由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區域組成(EP公開案第267 851號)。
除功能啟動子序列之外，有效的核糖體結合部位也可用於外源基因在原核生物中的表達。在大腸桿菌中，核糖體結合部位被稱為夏那-道格諾(Shine-Dalgarno，SD)序列並且包括起始密碼子(ATG)和定位於起始密碼子的上遊3-11個核苷酸處的長度為3-9個核苷酸的序列[Shine等人，NATURE(1975)25434]。認為SD序列通過SD序列與大腸桿菌16S rRNA的3′端之間的鹼基配對而促進mRNA與核糖體結合[Steitz等人「Geneticsignals and nucleotide sequences in messenger RNA」，在Biological Regulation andDevelopmentGene Expression(R.F.Goldberger編，1979)中]。用弱的核糖體結合部位表達真核生物基因和原核生物基因[Sambrook等人，「Expression of cloned genes inEscherichia coli」，Molecular CloningA Laboratory Manual，1989]。
術語「細菌宿主」或「細菌宿主細胞」指的是可用作或已經用作重組載體或其它轉移DNA的接受者的細菌。所述術語包括已經轉染的原始細菌宿主細胞的子代。應了解，由於偶然的或有意的突變，單一親代細胞的子代在形態學方面或在與原始親代互補的染色體組DNA或總DNA方面可以不必完全相同。與待通過諸如編碼GH(例如，hGH)多肽的核苷酸序列的存在的相關性質表徵的親代十分相似的親代細胞的子代包括在此定義所指的子代中。
用於表達GH(例如，hGH)多肽的合適宿主細菌的選擇對所屬領域的技術人員來說是已知的。在選擇用於表達的細菌宿主時，合適的宿主可以包括顯示尤其具有良好的內含體形成能力、低蛋白水解活性和整體穩健性的那些宿主。細菌宿主一般可從包括(但不限於)以下來源的各種來源獲得Bacterial Genetic Stock Center，Department ofBiophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA)；和American TypeCulture Collection(「ATCC」)(Manassas，VA)。工業發酵/醫藥發酵一般使用源自K菌株(例如，W3110)的細菌或源自B菌株(例如，BL21)的細菌。因為這些菌株的生長參數是十分熟知的和穩固的，所以其是尤其有用的。另外，這些菌株是非致病性的，出於安全性和環境原因這點在商業上很重要。合適的大腸桿菌宿主的其它實例包括(但不限於)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本發明的方法的另一個實施例中，大腸桿菌宿主是蛋白酶負菌株，包括(但不限於)OMP-和LON-。宿主細胞菌株可以是假單胞菌種，包括(但不限於)螢光假單胞菌、綠膿假單胞菌和惡臭假單胞菌。已知命名為菌株MB101的螢光假單胞菌生物型1可用於重組生產並且可用於治療性蛋白質生產工藝。假單胞菌表達系統的實例包括從Dow Chemical Company獲得的作為宿主菌株的系統(Midland，MI，可在www.dow.com上獲得)。以引用的方式併入本文中的美國專利第4,755,465號和第4,859,600號描述假單孢菌菌株作為用於GH(例如，hGH)產生的宿主細胞的用途。
一旦重組宿主細胞菌株已經建立(即，表達構建物已經被引入宿主細胞中並且具有適當的表達構建物的宿主細胞被分離)後，就在適於產生GH(例如，hGH)多肽的條件下培養重組宿主細胞菌株。如易於為所屬領域的技術人員所了解，培養重組宿主細胞菌株的方法將視所利用的表達構建物的性質和宿主細胞的特性而定。通常使用所屬領域的技術人員已知的方法來培養重組宿主菌株。重組宿主細胞通常是培養在含有碳、氮和無機鹽的可吸收源並且(視需要)含有維生素、胺基酸、生長因子和其它所屬領域的技術人員已知的蛋白質培養補充物的液體培養基中。用於培養宿主細胞的液體培養基可以視需要含有用以防止不希望有的微生物生長的抗生素或抗真菌劑和/或包括(但不限於)抗生素(用以選擇含有表達載體的宿主細胞)的化合物。
重組宿主細胞可以分批或以連續形式培養，同時細胞收集(在GH(例如，hGH)多肽細胞內積聚的情況下)或培養物上清液的收集呈分批或連續形式。對在原核宿主細胞中產生來說，分批培養和細胞收集為優選的。
本發明的GH(例如，hGH)多肽通常是在重組系統中表達後被純化。GH(例如，hGH)多肽可以通過此項技術中已知的各種方法從宿主細胞或培養基中加以純化。在細菌宿主細胞中產生的GH(例如，hGH)多肽可能是難溶的或不溶的(呈內含體形式)。在本發明的一個實施例中，可容易地在GH(例如，hGH)多肽中進行胺基酸取代，選擇所述取代是為了利用本文所揭示的方法以及此項技術中已知的那些方法增加重組產生的蛋白質的溶解性。在不溶性蛋白質的情況下，蛋白質可以通過離心從宿主細胞溶胞產物收集並且可以進一步繼之以細胞的均質化。在難溶性蛋白質的情況下，可以添加包括(但不限於)聚乙烯亞胺(PEI)的化合物以誘導部分可溶的蛋白質發生沉澱。所沉澱的蛋白質然後可便利地通過離心分離來收集。可以使用所屬領域的技術人員已知的各種方法使重組宿主細胞破碎或均質化以從細胞內釋放內含體。可以使用包括(但不限於)酶促細胞破碎、超聲處理、杜恩斯(dounce)均質化或高壓釋放破碎的熟知技術進行宿主細胞破碎或均質化過程。在本發明的方法的一個實施例中，使用高壓釋放技術使大腸桿菌宿主細胞破碎以釋放GH(例如，hGH)多肽的內含體。在處理GH(例如，hGH)多肽的內含體時，可有利地使重複的均質化時間縮到最短以使內含體的產量達到最大，而沒有由於諸如增溶、機械剪切或蛋白質水解的因素引起的損失。
接著可以使用此項技術中已知的許多合適的增溶劑中的任何一種使不溶性或所沉澱的GH(例如，hGH)多肽溶解。可以用尿素或鹽酸胍使GH(例如，hGH)多肽溶解。應使所溶解的GH(例如，hGH)多肽的體積最小化以便可以使用便於管理的批量大小來大批產生。此因素在重組宿主可以體積為數千升的批量生長的大規模商業設置中可能是很重要的。另外，當以大規模商業設置來製造GH(例如，hGH)多肽時，尤其是用於人類醫藥用途時，應避免可損壞機器和容器或蛋白質產物本身的苛刻化學品(如果可能的話)。在本發明的方法中已經顯示較溫和的變性劑尿素可用來代替較苛刻的變性劑鹽酸胍而使GH(例如，hGH)多肽內含體溶解。尿素的使用會顯著降低對在GH(例如，hGH)多肽的製造和純化過程中所利用的不鏽鋼設備造成損壞的風險，同時有效地使GH(例如，hGH)多肽內含體溶解。
在可溶性hGH蛋白質的情況下，hGH可以分泌到周質空間中或分泌到培養基中。另外，可溶性hGH可以存在於宿主細胞的細胞質中。在執行純化步驟之前，可能需要將可溶性hGH濃縮。所屬領域的技術人員已知的標準技術可以用來使來自(例如)細胞溶胞產物或培養基的可溶性hGH濃縮。另外，所屬領域的技術人員已知的標準技術可用來使宿主細胞破碎並且從宿主細胞的細胞質或周質空間釋放可溶性hGH。
當GH(例如，hGH)多肽作為融合蛋白產生時，可以將融合序列移除。融合序列的移除可以通過酶促裂解或化學裂解達成。融合序列的酶促移除可以使用所屬領域的技術人員已知的方法達成。用於移除融合序列的酶的選擇將由融合的特性所決定，並且如將易於為所屬領域的技術人員所了解，反應條件將通過酶的選擇來確定。化學裂解可以使用所屬領域的技術人員已知的包括(但不限於)溴化氰、TEV蛋白酶和其它試劑的試劑來完成。經裂解的GH(例如，hGH)多肽可以通過所屬領域的技術人員已知的方法從經裂解的融合序列中純化。如將易於為所屬領域的技術人員所了解，所述方法將由融合序列和GH(例如，hGH)多肽的特性和性質所決定。用於純化的方法可包括(但不限於)尺寸排阻色譜法、疏水性相互作用色譜法、離子交換色譜法或透析或其任何組合。
也可以將GH(例如，hGH)多肽純化以從蛋白質溶液移除DNA。DNA可以通過諸如沉澱或離子交換色譜法的此項技術中已知的任何合適方法移除，也可以通過用諸如(但不限於)硫酸魚精蛋白的核酸沉澱劑產生沉澱而移除。可以使用包括(但不限於)離心或過濾的標準的熟知方法使GH(例如，hGH)多肽與所沉澱的DNA分離。宿主核酸分子的移除在GH(例如，hGH)多肽待用來治療人類的設定中是一個重要因素，並且本發明的方法使宿主細胞DNA降低到醫藥學上可接受的水平。
小規模發酵或大規模發酵的方法也可用於蛋白質表達，包括(但不限於)發酵罐、搖瓶、流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、轉瓶培養系統和攪拌槽式生物反應器系統。這些方法中的每一種方法可以分批方法、進料-分批方法或連續模式方法來執行。
本發明的人類GH多肽一般可使用此項技術中的標準方法回收。舉例而言，培養基或細胞溶胞產物可經離心或過濾以移除細胞殘骸。可以將上清液濃縮或稀釋到所要體積或透濾到合適的緩衝液中以調節製劑供進一步純化。本發明的GH(例如，hGH)多肽的進一步純化包括使GH(例如，hGH)多肽變異體的脫去醯氨基的形式和截短形式與完整形式分離。
可以採用以下示範性程序中的任何程序來純化本發明的GH(例如，hGH)多肽親和色譜法；陰離子或陽離子交換色譜法(使用包括(但不限於)DEAE SEPHAROSE)；矽石色譜法；反相HPLC；凝膠過濾(使用包括(但不限於)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色譜法；尺寸排阻色譜法；金屬螯合色譜法；超濾/透濾法；乙醇沉澱；硫酸銨沉澱；色譜聚焦；置換色譜法；電泳程序(包括(但不限於)製備性等電聚焦)、差異溶解性法(包括(但不限於)硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取法。
本發明的蛋白質，包括(但不限於)包含非天然胺基酸的蛋白質、包含非天然胺基酸的肽、包含非天然胺基酸的蛋白質的抗體、包含非天然胺基酸的蛋白質的結合搭配物等等，可根據所屬領域的技術人員已知的和所使用的標準程序來部分地或大體上純化到均質。因此，本發明的多肽可通過包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沉澱、酸或鹼萃取法、柱色譜法、親和柱色譜法、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水性相互作用色譜法、羥磷灰石色譜法、外源凝集素色譜法、凝膠電泳等的所屬領域的技術人員已知的許多方法中的任何方法來回收和純化。可按需要在製造正確摺疊的成熟蛋白質時使用蛋白質重摺疊步驟。在需要高純度的最終純化步驟中可採用高效液相色譜法(HPLC)、親和色譜法或其它合適的方法。在一個實施例中，將所製造的抗非天然胺基酸(或包含非天然胺基酸的蛋白質或肽)的抗體用作純化試劑，包括(但不限於)用於包含一個或一個以上非天然胺基酸的蛋白質或肽的基於親和力的純化的純化試劑。一旦多肽按需要被部分地純化或純化到均質後，就視需要將其用於多種功用，包括(但不限於)用作檢定組分、治療劑、預防劑、診斷劑、科研試劑和/或用作抗體產生的免疫原。
除本文所提及的其它參考文獻之外，各種純化/蛋白質摺疊方法對所屬領域的技術人員來說是已知的，包括(但不限於)在以下參考文獻中所述的那些方法R.Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology，第182卷Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana，(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；Bollag等人(1996)Protein Methods，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker，(1996)The Protein Protocols HandbookHumana Press，NJ；Harris和Angal，(1990)Protein Purification ApplicationsA Practical ApproachIRL Press atOxford，Oxford，England；Harris和Angal，Protein Purification MethodsA PracticalApproachIRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes，(1993)Protein PurificationPrinciples and Practice，第3版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden，(1998)ProteinPurificationPrinciples，High Resolution Methods and Applications，第2版，Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)，Protein Protocols on CD-ROMHumana Press，NJ；和其中所引用的參考文獻。
在真核宿主細胞或非真核宿主細胞中產生所關注的具有非天然胺基酸的蛋白質或多肽的一個優點是蛋白質或多肽通常將摺疊成其天然構象。然而，在本發明的某些實施例中，所屬領域的技術人員將認識到，在合成、表達和/或純化後，蛋白質或肽可具有與相關多肽的所要構象不同的構象。在本發明的一方面，視需要使所表達的蛋白質變性並且隨後使其復性。此是利用此項技術中已知的方法來實現，包括(但不限於)通過將伴侶蛋白(chaperonin)添加到所關注的蛋白質或多肽中，通過使蛋白質溶解在諸如鹽酸胍的離液劑中，通過利用蛋白質二硫鍵異構酶等來實現。
一般來說，有時需要使所表達的多肽變性和還原並且接著使多肽重摺疊成優選構象。舉例而言，可將胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侶蛋白添加到所關注的翻譯產物中。使蛋白質還原、變性和復性的方法對所屬領域的技術人員來說是已知的(參見，上述參考文獻和Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.，26814065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.，4581-585；和Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.，205263-270)。例如，Debinski等人描述內含體蛋白質在胍-DTE中的變性和還原。蛋白質可在含有包括(但不限於)氧化型穀胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩衝液中重摺疊。可使重摺疊試劑流動或以另外的方式移動以與一種或一種以上多肽或其它表達產物接觸，或反之亦然。
在原核產生GH(例如，hGH)多肽的情況下，如此產生的GH(例如，hGH)多肽可為錯誤摺疊的並且因此缺乏生物活性或具有降低的生物活性。蛋白質的生物活性可以通過「重摺疊」而恢復。一般來說，錯誤摺疊的GH(例如，hGH)多肽是通過使用(例如)一種或一種以上離液劑(例如，尿素和/或胍)和能夠使二硫鍵還原的還原劑(例如，二硫蘇糖醇、DTT或2-巰基乙醇、2-ME)使多肽鏈溶解(其中GH(例如，hGH)多肽也是不溶的)、解摺疊和還原而重摺疊。接著在中等濃度的離液劑下添加氧化劑(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，其使得二硫鍵再形成。GH(例如，hGH)多肽可以使用此項技術中已知的標準方法而重摺疊，諸如在以引用的方式併入本文的美國專利第4,511,502號、第4,511,503號和第4,512,922號中所述的那些方法。GH(例如，hGH)多肽也可以與其它蛋白質共摺疊而形成雜二聚體或雜多聚體。
在重摺疊或共摺疊後，可以對GH(例如，hGH)多肽進行進一步純化。GH(例如，hGH)的純化可以使用所屬領域的技術人員已知的各種技術來實現，所述技術包括疏水性相互作用色譜法、尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、反相高效液相色譜法、親和色譜法等或其任何組合。額外的純化也可以包括使經純化的蛋白質乾燥或沉澱的步驟。
在純化後，GH(例如，hGH)可以通過包括(但不限於)透濾和透析的此項技術中已知的多種方法中的任何方法被交換到不同的緩衝液中和/或被濃縮。以單一純化的蛋白質形式提供的GH(例如，hGH)可以經受聚集和沉澱。
經純化的GH(例如，hGH)可以是至少90％純的(如通過反相高效液相色譜法RP-HPLC或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳SDS-PAGE所測量)或至少95％純的，或至少98％純的，或至少99％或99％以上純的。不管GH(例如，hGH)的純度的確切數值是多少，對用作醫藥產品或用於諸如與水溶性聚合物(諸如，PEG)的結合的進一步處理來說，GH(例如，hGH)是足夠純的。
某些GH(例如，hGH)分子可以在不存在其它活性成分或蛋白質(不同於賦形劑、載劑和穩定劑、血清白蛋白等)時用作治療劑，或其可以與另一種蛋白質或聚合物複合。
一般純化方法各種分離步驟中的任何一步驟可以針對包含GH(例如，hGH)多肽的宿主細胞的細胞溶胞產物、提取物、培養基、內含體、周質空間、宿主細胞的細胞質或其它材料執行，或針對由任何分離步驟得到的任何GH(例如，hGH)多肽混合物執行，所述分離步驟包括(但不限於)親和色譜法、離子交換色譜、疏水性相互作用色譜法、凝膠過濾色譜法、高效液相色譜法(「HPLC」)、反相HPLC(「RP-HPLC」)、擴張床吸附或其任何組合和/或重複，並且可以任何適當的順序執行。
在執行本文所述的技術中所使用的設備和其它必需要材料是可購得的。泵、流分收集器、監測器、記錄器和完整系統可從(例如)Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)和Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)獲得。包括(但不限於)交換基質材料、培養基和緩衝液的色譜材料也可從所述公司獲得。
諸如洗滌和洗脫的本文中所述的柱色譜法中的平衡和其它步驟，可使用諸如泵的專用設備更快速地完成。可購得的泵包括(但不限於)HILOAD泵P-50、蠕動泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
流分收集器的實例包括RediFrac流分收集器、FRAC-100和FRAC-200流分收集器和SUPERFRAC流分收集器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。混合器也是可獲得的以形成pH值和線性濃度梯度。可購得的混合器包括梯度混合器GM-1和線上混合器(In-Line Mixer)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
色譜法過程可以使用任何可購得的監測器來監測。所述監測器可用來搜集如UV、pH值和電導率的信息。檢測器的實例包括監測器UV-1、UVICORDS II、監測器UV-MII、監測器UV-900、監測器UPC-900、監測器pH/C-900和電導率監測器(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。實際上，包括來自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)的各種AKTA系統的完整系統是可購得的。
在本發明的一個實施例中，例如，GH(例如，hGH)多肽可以通過首先使所得的經純化的GH(例如，hGH)多肽在尿素中變性，接著稀釋到含有還原劑(諸如，DTT)的PH值合適的TRIS緩衝液中而還原和變性。在另一個實施例中，使GH(例如，hGH)多肽在濃度範圍為約2M到約9M之間的尿素中變性，接著稀釋到pH值在約5.0到約8.0範圍內的TRIS緩衝液中。然後可培養所述實施例的重摺疊混合物。在一個實施例中，將重摺疊混合物在室溫下培養4小時到24小時。接著可對經還原和變性的GH(例如，hGH)多肽混合物進行進一步分離或純化。
如本文中所述，可對第一GH(例如，hGH)多肽混合物的pH值加以調節，然後執行任何隨後的分離步驟。另外，可以使用此項技術中已知的技術使第一GH(例如，hGH)多肽混合物或其任何隨後的混合物濃縮。此外，可以使用所屬領域的技術人員已知的技術將包含第一GH(例如，hGH)多肽混合物或其任何隨後的混合物的洗脫緩衝液換成適於下一分離步驟的緩衝液。
離子交換色譜在一個實施例中並且作為一可選的、額外的步驟，可針對第一GH(例如，hGH)多肽混合物執行離子交換色譜。一般參見ION EXCHANGECHROMATOGRAPHYPRINCIPLES AND METHODS(目錄第18-1114-21號，AmershamBiosciences(Piscataway，NJ))。可購得的離子交換柱包括HITRAP、HIPREP和HILOAD柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。所述柱利用強陰離子交換劑，諸如，Q SEPHAROSEFast Flow、Q SEPHAROSEHigh Performance和Q SEPHAROSEXL；強陽離子交換劑，諸如，SP SEPHAROSEHigh Performance、SP SEPHAROSEFastFlow和SP SEPHAROSEXL；弱陰離子交換劑，諸如，DEAE SEPHAROSEFast Flow；和弱陽離子交換劑，諸如，CM SEPHAROSEFast Flow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可以在純化過程的任何階段時針對GH(例如，hGH)多肽執行陰離子或陽離子交換柱色譜法，以分離大體上純化的GH(例如，hGH)多肽。陽離子交換色譜步驟可以使用任何合適的陽離子交換基質來執行。可用的陽離子交換基質包括(但不限於)纖維性的、多孔的、無孔的、微粒狀的、珠狀的或交聯的陽離子交換基質材料。所述陽離子交換基質材料包括(但不限於)纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、矽石、聚醚或任何前述材料的複合材料。
陽離子交換基質可以是包括強陽離子交換劑和弱陽離子交換劑的任何合適的陽離子交換劑。強陽離子交換劑可以在寬的pH值範圍內保持離子化狀態並且因而可以能夠在寬的pH值範圍內結合GH(例如，hGH)。然而，弱陽離子交換劑可以隨pH值的變化失去離子化。舉例而言，當pH降低到約pH4或pH5以下時，弱陽離子交換劑可能失去電荷。合適的強陽離子交換劑包括(但不限於)諸如磺丙基(SP)、磺酸甲酯(S)或磺乙基(SE)的帶電官能團。陽離子交換基質可以是優選具有約2.5到約6.0的GH(例如，hGH)結合pH值範圍的強陽離子交換劑。或者，強陽離子交換劑可以具有約pH2.5到約pH5.5的GH(例如，hGH)結合pH值範圍。陽離子交換基質可以是具有約3.0的GH(例如，hGH)結合pH值的強陽離子交換劑。或者，陽離子交換基質可以是優選具有約6.0到約8.0的GH(例如，hGH)結合pH值範圍的強陽離子交換劑。陽離子交換基質可以是優選具有約8.0到約12.5的GH(例如，hGH)結合pH值範圍的強陽離子交換劑。或者，強陽離子交換劑可以具有約pH8.0到約pH12.0的GH(例如，hGH)結合pH值範圍。
在裝載GH(例如，hGH)之前，可以(例如)使用若干柱體積的稀釋的弱酸(例如，4個柱體積的pH值為3的20mM乙酸)來使陽離子交換基質平衡。平衡後，可以添加GH(例如，hGH)，並且可在洗脫大體上純化的GH(例如，hGH)之前又使用諸如弱乙酸或磷酸溶液的弱酸溶液將柱子洗滌一次到若干次。舉例而言，可使用大約2-4個柱體積的pH值為3的20mM乙酸來洗滌柱子。也可以使用用(例如)2-4個柱體積的pH值為5.5的0.05M乙酸鈉或pH值為5.5的與0.1M氯化鈉混合的0.05M乙酸鈉的額外洗滌。或者，利用此項技術中已知的方法，可以使用若干柱體積的稀釋的弱鹼來使陽離子交換基質平衡。
或者，大體上純化的GH(例如，hGH)可以通過使陽離子交換劑基質與具有足夠低的pH值或離子強度的緩衝液接觸來洗脫以將GH(例如，hGH)從基質中置換出來。洗脫緩衝液的pH值可以在pH值約為2.5到pH值約為6.0的範圍內變化。更明確地說，洗脫緩衝液的pH值可以在pH值約為2.5到pH值約為5.5、pH值約為2.5到pH值約為5.0的範圍內變化。洗脫緩衝液可以具有約3.0的pH值。另外，洗脫緩衝液的量可以大幅變化並且將一般在約2個柱體積到約10個柱體積的範圍內。
在GH(例如，hGH)多肽吸附於陽離子交換劑基質後，大體上純化的hGH多肽可以通過使基質與具有足夠高的pH值或離子強度的緩衝液接觸來洗脫以將GH(例如，hGH)多肽從基質中置換出來。可在此使用的用於大體上純化的GH(例如，hGH)多肽的高pH值洗脫的合適緩衝液包括(但不限於)濃度在至少約5mM到至少約100mM的範圍內變化的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、HEPES和MES緩衝液。
反相色譜可以按照所屬領域的技術人員已知的合適方案來執行RP-HPLC以純化蛋白質。參見，例如，Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124217-230(1982)；Rivier等人，J.CHROM.(1983)268112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359391-402。可以針對GH(例如，hGH)多肽執行RP-HPLC以分離大體上純化的GH(例如，hGH)多肽。就這點來說，可以使用具有多種長度(包括(但不限於)至少約C3到至少約C30、至少約C3到至少約C20，或至少約C3到至少約C18)的烷基官能基的經矽石衍生的樹脂。或者，可以使用聚合樹脂。例如，可以使用為苯乙烯聚合物樹脂的TosoHaas AmberchromeCG1000sd樹脂。也可以使用具有多種烷基鏈長度的氰基或聚合樹脂。此外，可以用諸如乙醇的溶劑對RP-HPLC柱進行洗滌。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一個實例。
含有離子配對劑和有機改性劑(諸如，甲醇、異丙醇、四氫呋喃、乙腈或乙醇)的合適洗脫緩衝液可用來將GH(例如，hGH)多肽從RP-HPLC柱上洗脫下來。最常用的離子配對劑包括(但不限於)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲銨、四丁銨和三乙銨乙酸鹽。可以使用一種或一種以上梯度或等度條件來執行洗脫，其中梯度條件經優選以使分離時間縮短並且使峰寬減小。另一種方法涉及使用具有不同溶劑濃度範圍的兩種梯度。可用於本文中的合適洗脫緩衝液的實例可以包括(但不限於)乙酸銨和乙腈溶液。
疏水性相互作用色譜法純化技術可以針對GH(例如，hGH)多肽執行疏水性相互作用色譜法(HIC)。一般參見，HYDROPHOBIC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY HANDBOOKPRINCIPLES AND METHODS(目錄第18-1020-90號)，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)，其是以引用的方式併入本文中。合適的HIC基質可以包括(但不限於)經烷基或芳基取代的基質，諸如，經丁基、己基、辛基或苯基取代的基質，所述基質包括瓊脂糖、交聯瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、纖維素、矽石、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基質；和混合型樹脂，包括(但不限於)聚乙烯胺樹脂或經丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基質。用於疏水性相互作用柱色譜的市售來源包括(但不限於)HITRAP、HIPREP和HILOAD柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。簡單地說，在裝載之前，可以使用所屬領域的技術人員已知的標準緩衝液(諸如，乙酸/氯化鈉溶液或含有硫酸銨的HEPES)來使HIC柱平衡。硫酸銨可以用作裝載HIC柱的緩衝液。在裝載GH(例如，hGH)多肽後，接著可以使用標準緩衝液和條件對柱子進行洗滌以移除不需要的材料但使GH(例如，hGH)多肽保持在HIC柱上。可以用約3個柱體積到約10個柱體積的標準緩衝液(尤其諸如含有EDTA和濃度比平衡緩衝液低的硫酸銨的HEPES緩衝液，或乙酸/氯化鈉緩衝液)來洗脫GH(例如，hGH)多肽。使用(例如)磷酸鉀梯度的遞減線性鹽梯度也可用來洗脫GH(例如，hGH)分子。然後可(例如)通過諸如透濾或超濾的過濾作用將洗脫液濃縮。可以利用透濾來移除用來洗脫GH(例如，hGH)多肽的鹽。
其它純化技術 可以針對第一GH(例如，hGH)多肽混合物或其任何隨後的混合物執行使用(例如)凝膠過濾(GEL FILTRATIONPRINCIPLES AND METHODS(目錄第18-1022-18號，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，其是以引用的方式併入本文中)、羥磷灰石色譜法(合適的基質包括(但不限於)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羥磷灰石(BioRad)、Bio-Gel HTP羥磷灰石(BioRad))、HPLC、擴張床吸附、超濾、透濾、凍乾等的另一個分離步驟以移除任何過量的鹽並且以合適的緩衝液置換之前的緩衝液，以用於下一個分離步驟或甚至用於最終藥物產品的調配。
可以使用所屬領域的技術人員已知的技術在本文所述的各個步驟時監測包括大體上純化的GH(例如，hGH)多肽的GH(例如，hGH)多肽的產率。所述技術也可以用來評估最終分離步驟後的大體上純化的GH(例如，hGH)多肽的產率。舉例而言，可以使用具有各種烷基鏈長度的一些反相高壓液相色譜(諸如，氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC)柱中的任何柱以及陽離子交換HPLC和凝膠過濾HPLC來監測GH(例如，hGH)多肽的產率。
在本發明的特定實施例中，各個純化步驟後的GH(例如，hGH)的產率可以是各個純化步驟的起始物質中的GH(例如，hGH)的至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、至少約99.9％或至少約99.99％。
純度可以使用諸如SDS-PAGE的標準技術來測定或通過使用西方墨點(Westernblot)和ELISA檢定測量GH(例如，hGH)多肽而測定。例如，可以產生抗從陰性對照酵母發酵和陽離子交換回收分離得到的蛋白質的多克隆抗體。抗體也可用來探測汙染宿主細胞蛋白質的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由矽膠粒子組成，其表面帶有C4-烷基鏈。將GH(例如，hGH)多肽與蛋白質性雜質分離是基於疏水性相互作用的強度的差異。使用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度來執行洗脫。製備性HPLC是使用不鏽鋼柱(裝有2.8升到3.2升的Vydac C4矽膠)來執行。羥磷灰石Ultrogel洗脫液是通過添加三氟乙酸而酸化，並且將其裝載到Vydac C4柱上。為進行洗滌和洗脫，使用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集流分並且立即用磷酸鹽緩衝液中和。將在IPC限度內的GH(例如，hGH)多肽流分合併。
DEAE瓊脂糖凝膠(Pharmacia)材料由共價地與瓊脂糖凝膠珠粒表面結合的二乙氨基乙基(DEAE)組成。GH(例如，hGH)多肽與DEAE基團的結合為離子相互作用所介導。乙腈和三氟乙酸通過柱子而不保留。在這些物質已經被洗掉後，通過用低pH值的乙酸鹽緩衝液洗滌柱子來移除痕量雜質。接著用中性磷酸鹽緩衝液洗滌柱子並且用離子強度增加的緩衝液洗脫GH(例如，hGH)多肽。用DEAE瓊脂糖凝膠快速流(DEAESepharose fast flow)裝填柱子。調節柱體積以保證GH(例如，hGH)多肽裝載量在3-10mg GH(例如，hGH)多肽/ml凝膠的範圍內。用水和平衡緩衝液(磷酸鈉/磷酸鉀)洗滌柱子。裝載經合併的HPLC洗脫液流分並且用平衡緩衝液洗滌柱子。然後，用洗滌緩衝液(乙酸鈉緩衝液)洗滌柱子，接著用平衡緩衝液進行洗滌。隨後，用洗脫緩衝液(氯化鈉、磷酸鈉/磷酸鉀)從柱子洗脫GH(例如，hGH)多肽並且根據主洗脫圖以單一流分收集。將DEAE瓊脂糖凝膠柱的洗脫液調節到規定的電導率。將所得的藥物無菌過濾到特氟隆瓶(Teflon bottle)中並且在-70℃下儲存。
可以採用的其它方法包括(但不限於)用以移除內毒素的步驟。內毒素是位於諸如大腸埃希氏菌的革蘭氏陰性宿主細胞的外膜上的脂多糖(LPS)。降低內毒素水平的方法對所屬領域的技術人員來說是所知的並且包括(但不限於)使用矽石支撐物、玻璃粉或羥磷灰石、反相色譜法、親和色譜法、尺寸排阻色譜法、陰離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法、這些方法的組合等的純化技術。可能需要修改或需要其它方法以將諸如共遷移的蛋白質的汙染物從所關注的多肽移除。用於測定內毒素水平的方法對所屬領域的技術人員來說是已知的並且包括(但不限於)鱟阿米巴樣細胞溶胞產物(LimulusAmebocyte Lysate)(LAL)檢定。
多種方法和程序可用來評估包含一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)蛋白質的產率和純度，所述方法和程序包括(但不限於)布拉德福(Bradford)檢定、SDS-PAGE、銀染SDS-PAGE、考馬斯亮藍(coomassie)染色SDS-PAGE、質譜分析(包括但不限於MALDI-TOF)和所屬領域的技術人員已知的用於表徵蛋白質的其它方法。
其它方法包括(但不限於)與蛋白質染色方法結合使用的SDS-PAGE、免疫墨點法(immunoblotting)、基質輔助雷射解吸/電離-質譜分析法(MALDI-MS)、液相色譜/質譜分析法、等電聚焦、分析性陰離子交換、色譜聚焦和圓二色譜。
VIII.替代系統中的表達已經採用一些策略以在非重組宿主細胞、經突變處理的宿主細胞中或在無細胞系統中將非天然的胺基酸引入蛋白質中。這些系統也適用於製造本發明的GH(例如，hGH)多肽。具有反應性側鏈的諸如Lys、Cys和Tyr的胺基酸的衍生化會導致賴氨酸轉化為N2-乙醯基-賴氨酸。化學合成也提供一種併入非天然胺基酸的直接方法。隨著肽片段的酶促連接和天然化學性連接的新近發展，有可能製造較大的蛋白質。參見，例如，P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69923(2000)。化學性肽連接和天然化學性連接是描述在美國專利第6,184,344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO 02/098902和WO 03/042235中，所述參考文獻是以引用的方式併入本文中。將經所要的非天然胺基酸化學性醯化的抑制tRNA加入到能夠維持蛋白質生物合成的活體外提取物中的一般活體外生物合成方法已經被用來將超過100個的非天然胺基酸部位特異性地併入具有幾乎任何尺寸的各種蛋白質中。參見，例如，V.W.Cornish、D.Mendel和P.G. Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1995，34621(1995)；C.J.Noren，S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G. Schultz，A general method forsite-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science244182-188(1989)；和J.D.Bain，C.G. Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosyntheticsite-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.1118013-8014(1989)。已經將寬範圍的官能團引入蛋白質中以用於研究蛋白質穩定性、蛋白質摺疊、酶機制和信號轉導。
開發一種稱為選擇性壓力併入的活體內方法以利用野生型合成酶的雜亂性(promiscuity)。參見，例如，N.Budisa、C.Minks、S.Alefelder、W.Wenger、F.M.Dong、L. Moroder和R.Huber，FASEB J.，1341(1999)。使其中供給細胞特定的天然胺基酸的相關代謝路徑被切斷的營養缺陷型菌株在含有有限濃度的天然胺基酸的基本培養基中生長，同時靶基因的轉錄受到抑制。在靜止生長期開始時，天然胺基酸被耗盡並且為非天然胺基酸類似物所置換。誘導重組蛋白質的表達導致含有非天然類似物的蛋白質的累積。舉例而言，使用這種策略，已經將鄰氟苯丙氨酸、間氟苯丙氨酸和對氟苯丙氨酸併入蛋白質中並且在UV光譜中呈現可容易被鑑別的兩個特徵性肩狀突起，參見，例如，C.Minks、R.Huber、L.Moroder和N.Budisa，Anal.Biochem.，28429(2000)；已經將三氟甲硫氨酸用來置換噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸以便通過19F NMR研究其與殼寡糖配位體的相互作用，參見，例如，H.Duewel、E.Daub、V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，363404(1997)；並且已經將三氟亮氨酸併入以代替亮氨酸，從而導致亮氨酸拉鏈蛋白的熱穩定性和化學穩定性增加。參見，例如，Y.Tang、G. Ghirlanda、W.A.Petka、T.Nakajima、W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew Chem.Int.Ed.Engl.，401494(2001)。此外，將硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸併入各種重組蛋白質中以在X射線結晶分析中促進相的溶解。參見，例如，W.A.Hendrickson、J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，91665(1990)；J.O.Boles、K.Lewinski、M.Kunkle、J.D.Odom、B.Dunlap、L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.，1283(1994)；N.Budisa、B.Steipe、P.Demange、C.Eckerskorn、J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.，230788(1995)；以及N.Budisa、W.Karnbrock、S.Steinbacher、A.Humm、L.Prade、T.Neuefeind、L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol.，270616(1997)。也已將具有烯烴或炔官能團的甲硫氨酸類似物有效地併入，從而允許通過化學方法對蛋白質作另外修飾。參見，例如，J.C.van Hest和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，42868(1998)；J.C.van Hest、K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.，1221282(2000)；以及K.L. Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，569487(2000)；美國專利第6,586,207號；美國專利公開案2002/0042097，其是以引用的方式併入本文中。
這種方法的成功取決於通過氨醯基-tRNA合成酶對非天然胺基酸類似物的識別，一般而言，所述氨醯基-tRNA合成酶需要高選擇性以確保蛋白質翻譯的保真度。擴展這種方法的範圍的一種方式是放寬氨醯基-tRNA合成酶的底物特異性，其已經在有限的情況下得以實現。舉例而言，在大腸埃希氏桿菌苯丙氨醯基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置換Ala294會增大底物結合袋的尺寸，並且導致tRNAPhe被對氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)醯化。參見，M.Ibba、P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，337107(1994)。具有這種突變體PheRS的大腸埃希氏桿菌菌株容許併入對氯苯丙氨酸或對溴苯丙氨酸以取代苯丙氨酸。參見，例如，M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.，364272(1995)；和N.Sharma、R.Furter、P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，46737(2000)。同樣地，顯示靠近大腸埃希氏桿菌酪氨醯基-tRNA合成酶的胺基酸結合部位的點突變Phe130Ser容許重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地得以併入。參見，F. Hamano-Takaku、T.Iwama、S.Saito-Yano、K.Takaku、Y.Monden、M.Kitabatake、D.Soll和S.Nishimura，J.Biol.Chem.，27540324(2000)。
在活體內將非天然胺基酸併入蛋白質中的另一種策略是修飾具有校對機制的合成酶。這些合成酶不能區別結構上與同源天然胺基酸相似的胺基酸並且因此不能活化所述胺基酸。這種錯誤在獨立部位被校正，其使來自tRNA的錯載的胺基酸脫去醯基以維持蛋白質翻譯的保真度。如果合成酶的校對活性喪失，那麼經錯誤活化的結構類似物可以避開編輯功能並且被併入。最近已經用纈氨醯基-tRNA合成酶(ValRS)證明了這種方法。參見，V.Doring、H.D.Mootz、L. A.Nangle、T.L. Hendrickson、V.de Crecy-Lagard、P.Schimmel和P.Marliere，Science，292501(2001)。ValRS可用Cys、Thr或氨基丁酸鹽(Abu)將tRNAVal錯誤氨基醯化；這些非同源胺基酸隨後通過編輯域而被水解。在大腸埃希氏桿菌染色體發生隨機突變後，選擇在ValRS的編輯部位具有突變的突變大腸埃希氏桿菌菌株。這種編輯缺陷型ValRS不正確地用Cys裝載tRNAVal。因為Abu在空間上類似於Cys(Cys的-SH基團經Abu中的-CH3取代)，所以當這種突變大腸埃希氏桿菌菌株在Abu存在下生長時，突變ValRS也將Abu併入蛋白質中。質譜分析顯示，在天然蛋白質中，約24％的纈氨酸在各個纈氨酸位置為Abu所置換。
固相合成和半合成方法也允許用於含有新穎胺基酸的大量蛋白質的合成。例如，參見以下公開案和其中所引用的參考文獻，如下所示Crick，F.H.C.，Barrett，L. Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature，1921227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment，J.Am Chem，88(24)5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches tobiologically active peptides and proteins including enyzmes，Acc Chem Res，2247-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，1093808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptidesbackbone-engineered HIV protease，Science，256(5054)221-225(1992)；Chaiken，I.M.Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochem，11(3)255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.，1(3)151-157(1987)；和Jackson，D.Y.，Burnier，J.，Quan，C.，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligase forTotal Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266(5183)243(1994)。
已經將化學修飾用來在活體外將包括輔助因子、自旋標記和寡核苷酸的各種非天然側鏈引入蛋白質中。參見，例如，Corey，D.R.，Schultz，P.G. Generation of a hybridsequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymaticspecificity，Annu Rev Biochem，54565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemicalmutation of enyzme active sites，Science，226(4674)505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)6392-6401(1968)；Polgar，L. et M.L.Bender.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，883153-3154(1966)；和Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combiningsites，Science，242(4881)1038-1040(1988)。
或者，已經將採用經化學修飾的氨醯基-tRNA的生物合成方法用來在活體外將一些生物物理學探針併入所合成的蛋白質中。參見以下公開案和其中所引用的參考文獻Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，62483-514(1993)；和Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signal sequenceof nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle，Proc.Natl.Acad.Sci，83(22)8604-8608(1986)。
以前已經顯示，可通過將經化學性氨基醯化的抑制tRNA加入到用含有所要琥珀無義突變的基因程序化的蛋白質合成反應中，而在活體外將非天然胺基酸部位特異性地併入蛋白質中。利用這些方法，所屬領域的技術人員可使用特定胺基酸營養缺陷型菌株以關係密切的結構同源物取代許多常見的20種胺基酸(例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸)。參見，例如，Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G. Ageneral methodfor site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244182-188(1989)M.W.Nowak等人，Science268439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural aminoacid into a polypeptide，J.Am Chem Soc，1118013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.1341-51(1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.，第202卷，301-336(1992)；和Mendel，D.，Cornish，V.W. Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.BiomolStruct.24，435-62(1995)。
舉例而言，製備識別終止密碼子UAG的抑制tRNA並且以非天然胺基酸將其化學性氨基醯化。可將常規的定點突變用來在蛋白質基因中的所關注的部位處引入終止密碼子TAG。參見，例如，Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′-3′Exonucleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)791-802(1988)。當使經醯化的抑制tRNA和突變基因在活體外轉錄/翻譯系統中組合時，響應於UAG密碼子將非天然胺基酸併入，得到在指定位置處含有那個胺基酸的蛋白質。使用[3H]-Phe的實驗和用α-羥酸的實驗證明，僅在由UAG密碼子指定的位置處併入所要的胺基酸，並且這種胺基酸不在蛋白質中的任何其它部位併入。參見，例如，Noren等人，同上；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology 10(6)425-432；和Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G. Site-specific incorporation of novel backbonestructures into proteins，Science，255(5041)197-200(1992)。
可以通過包括(但不限於)化學氨基醯化或酶促氨基醯化的任何方法或技術以所要的胺基酸使tRNA氨基醯化。
氨基醯化可以通過氨醯基tRNA合成酶或通過包括(但不限於)核糖酶的其它酶促分子來完成。術語「核糖酶」可與「催化性RNA」互換。Cech和同事(Cech，1987，Science，2361532-1539；McCorkle等人，1987，Concepts Biochem.64221-226)證明了可充當催化劑的天然存在的RNA(核糖酶)的存在。然而，儘管僅已顯示這些天然RNA催化劑可對用於裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但是核糖酶的人為進化的最近發展已經將催化作用的功用(repertoire)擴展到各種化學反應。研究已經鑑別了能在其自身(2′)3′-端上催化氨醯基-RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995 Science 267643-647)和可將胺基酸從一個RNA分子轉移到另一個RNA分子的RNA分子(Lohse等人，1996，Nature 381442-444)。
以引用的方式併入本文中的美國專利申請公開案2003/0228593描述構建核糖酶的方法和其在用天然編碼的和非天然編碼的胺基酸使tRNA發生氨基醯化中的用途。包括(但不限於)核糖酶的可使tRNA氨基醯化的酶促分子的底物固定化形式可以使經氨基醯化的產物的有效親和純化能夠實現。合適的底物的實例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。用於氨基醯化的核糖酶的底物固定化形式的產生和用途是描述在Chemistry andBiology 2003，101077-1084和美國專利申請公開案2003/0228593中，所述參考文獻是以引用的方式併入本文中。
化學性氨基醯化方法包括(但不限於)由Hecht和同事(Hecht，S.M.Acc.Chem.Res.1992，25，545；Heckler，T.G.；Roesser，J.R.；Xu，C；Chang，P.；Hecht，S.M.Biochemistry1988，27，7254；Hecht，S.M.；Alford，B.L.；Kuroda，Y.；Kitano，S.J.Biol.Chem.1978，253，4517)和由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其他人(Cornish，V.W.；Mendel，D.； Schultz，P.G. Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34，621；Robertson，S.A.；Ellman，J.A.；Schultz，P.G.J.Am.Chem.Soc.1991，113，2722；Noren，C.J.；Anthony-Cahill，S.J.；Griffith，M.C.；Schultz，P.G. Science 1989，244，182；Bain，J.D.；Glabe，C.G.；Dix，T.A.；Chamberlin，A.R.J.Am.Chem.Soc.1989，111，8013；Bain，J.D.等人，Nature 1992，356，537；Gallivan，J.P.；Lester，H.A.；Dougherty，D.A.Chem.Biol.1997，4，740；Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996，271，19991；Nowak，M.W.等人，Science，1995，268，439；Saks，M.E.等人，J.Biol.Chem.1996，271，23169；Hohsaka，T.等人，J.Am.Chem.Soc.1999，121，34)提出的避免在氨基醯化中使用合成酶的那些方法，所述參考文獻是以引用的方式併入本文中。所述方法或其它化學性氨基醯化方法可用來使tRNA分子發生氨基醯化。
用於產生催化性RNA的方法可以涉及產生隨機化核糖酶序列的獨立集合、針對所述集合執行定向進化、為所要的氨基醯化活性篩選所述集合和選擇顯示所要的氨基醯化活性的那些核糖酶的序列。
核糖酶可包含有利於醯化活性的基序和/或區域，諸如，GGU基序和U富集區域。舉例而言，已經報導U富集區域可有利於胺基酸底物的識別，並且GGU基序可與tRNA的3′端形成鹼基對。在組合時，GGU基序和U富集區域同時有利於胺基酸和tRNA的同時識別，並且進而助於tRNA的3′端的氨基醯化。
核糖酶可通過使用與tRNAAsnCCCG結合的部分隨機化的r24mini進行活體外選擇，接著通過活性克隆中存在的一致序列的系統工程化而產生。由這種方法獲得的示範性核糖酶被稱為「Fx3核糖酶」並且描述在美國公開申請案第2003/0228593號中，所述申請案的內容是以引用的方式併入本文中，所述核糖酶充當用於合成裝載同源非天然胺基酸的各種氨醯基-tRNA的多用途催化劑。
底物上的固定化可用來使經氨基醯化的tRNA的有效親和純化能夠實現。合適的底物的實例包括(但不限於)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。核糖酶可通過利用RNA的化學結構而固定於樹脂上，諸如RNA的核糖上的3′-順式二醇可經高碘酸鹽氧化而產生相應的二醛以助於RNA在樹脂上的固定。可使用各種類型的樹脂，包括廉價的醯肼樹脂，其中還原性胺化作用使樹脂與核糖酶之間的相互作用成為不可逆的鍵。氨醯基-tRNA的合成可通過這種柱上氨基醯化技術而大大促進。Kourouklis等人(Methods 2005；36239-4)描述一種基於柱的氨基醯化系統。
經氨基醯化的tRNA的分離可以各種方式實現。一種合適的方法是利用緩衝液(諸如，具有10mM EDTA的乙酸鈉溶液、含有50mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH 7.0)、10mM EDTA的緩衝液或僅為EDTA緩衝水(pH7.0))從柱子洗脫經氨基醯化的tRNA。
可將經氨基醯化的tRNA加入到翻譯反應中以便併入胺基酸，在由翻譯反應製得的多肽中的選定位置上tRNA被所述胺基酸氨基醯化。可以使用本發明的經氨基醯化的tRNA的翻譯系統的實例包括(但不限於)細胞溶胞產物。細胞溶胞產物提供為從輸入mRNA進行多肽的活體外翻譯所必需的反應組分。所述反應組分的實例包括(但不限於)核糖體蛋白、rRNA、胺基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始因子和延伸因子以及與翻譯相關的其它因子。另外，翻譯系統可以是批式翻譯或分區翻譯(compartmentalizedtranslation)。批式翻譯系統在單一隔室中組合反應組分，而分區翻譯系統使翻譯反應組分與可抑制翻譯功效的反應產物分開。所述翻譯系統是可購得的。
此外，可以使用偶合轉錄/翻譯系統。偶合轉錄/翻譯系統允許將輸入DNA轉錄成相應的mRNA，此mRNA又被反應組分翻譯。可購得的偶合轉錄/翻譯系統的一個實例是快速翻譯系統(Rapid Translation System，RTS，Roche Inc.)。所述系統包括含有用於提供諸如核糖體和翻譯因子的翻譯組分的大腸桿菌溶胞產物的混合物。另外，包括RNA聚合酶以用於將輸入DNA轉錄成用於翻譯的mRNA模板。RTS可以通過置於反應隔室(包括供應/消耗隔室和轉錄/翻譯隔室)之間的膜使反應組分隔開而採用分區翻譯。
tRNA的氨基醯化可以通過包括(但不限於)移轉酶、聚合酶、催化性抗體、多功能蛋白質等的其它試劑來執行。
Lu等人在Mol Cell.2001年10月；8(4)759-69中描述一種將蛋白質與含有非天然胺基酸的合成肽化學性連接(表達蛋白連接)的方法。
也已使用顯微注射技術將非天然胺基酸併入蛋白質中。參見，例如，M.W.Nowak、P.C.Kearney、J.R.Sampson、M.E.Saks、C.G. Labarca、S.K.Silverman、W.G. Zhong、J.Thorson、J.N.Abelson、N.Davidson、P.G. Schultz、D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268439(1995)；和D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4645(2000)。用以下活體外製得的兩種RNA物質共同注射爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)編碼在所關注的胺基酸位置處具有UAG終止密碼子的靶蛋白質的mRNA，和經所要的非天然胺基酸氨基醯化的琥珀抑制tRNA。接著，卵母細胞的翻譯機器在由UAG所指定的位置處將非天然胺基酸插入。這種方法已使得一般不符合活體外表達系統的整合膜蛋白的活體內結構-功能研究得以進行。實例包括將螢光胺基酸併入速激肽神經激肽-2受體中以通過螢光共振能量轉移測量距離，參見，例如，G. Turcatti、K.Nemeth、M.D.Edgerton、U.Meseth、F.Talabot、M.Peitsch、J.Knowles、H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，27119991(1996)；併入生物素化胺基酸以鑑別離子通道中的表面暴露殘基，參見，例如，J.P.Gallivan、H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4739(1997)；使用籠形酪氨酸類似物以實時監測離子通道中的構象改變，參見，例如，J.C.Miller、S.K.Silverman、P.M.England、D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20619(1998)；和使用α羥基胺基酸以改變離子通道構架用於探測其門控機制。參見，例如，P.M.England、Y. Zhang、D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，9689(1999)；和T.Lu、A.Y. Ting、J.Mainland、L.Y.Jan、P.G. Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4239(2001)。
在活體內將非天然胺基酸直接併入蛋白質中的能力提供包括(但不限於)以下優點的多種優點突變蛋白的高產率、技術簡易性、在細胞中或可能在活生物體中研究突變蛋白的可能性，和這些突變蛋白在治療性治療和診斷用途中的使用。使具有各種尺寸、酸性、親核性、疏水性和其它性質的非天然胺基酸包括到蛋白質中的能力可大大地擴大我們合理地和系統地操縱蛋白質的結構的能力，以探測蛋白質功能並且產生具有新穎性質的新型蛋白質或生物體。
在部位特異性地併入對氟苯丙氨酸的一次嘗試中，將酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨醯基-tRNA合成酶對用於對氟苯丙氨酸抗性、苯丙氨酸營養缺陷型大腸埃希氏桿菌菌株中。參見，例如，R.Furter，Protein Sci.，7419(1998)。
也有可能使用無細胞(活體外)翻譯系統獲得本發明的GH(例如，hGH)多聚核苷酸的表達。翻譯系統可以是細胞系統或無細胞系統，並且可以是原核系統或真核系統。細胞翻譯系統包括(但不限於)諸如透性化細胞的全細胞製劑或細胞培養物，其中可將所要的核酸序列轉錄成mRNA並且將mRNA翻譯。無細胞翻譯系統是可購得的並且許多不同的類型和系統是熟知的。無細胞系統的實例包括(但不限於)諸如大腸埃希氏桿菌溶胞產物的原核生物溶胞產物，和諸如小麥胚芽提取物、昆蟲細胞溶胞產物、兔網狀細胞溶胞產物、兔卵母細胞溶胞產物和人類細胞溶胞產物的真核生物溶胞產物。當所得蛋白質經糖基化、磷酸化或經別的方式修飾時，真核生物提取物或溶胞產物可為優選的，這是因為許多所述修飾僅在真核系統中為可能的。這些提取物和溶胞產物中的一些是可購得的(Promega；Madison，Wis.；Stratagene；La Jolla，Calif.；Amersham；Arlington Heights，I11.；GIBCO/BRL；Grand Island，N.Y.)。諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物的膜提取物也是可用的，其可用於翻譯分泌蛋白。在可包括mRNA作為模板(活體外翻譯)或者DNA作為模板(組合的活體外轉錄和翻譯)的這些系統中，活體外合成是通過核糖體來引導。已經對開發無細胞蛋白質表達系統作出了相當多的努力。參見，例如，Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，74309-316(2001)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，BiotechnologyProgress，16，385-390，(2000)；Kim，D.M.和J.R.Swartz，Biotechnology andBioengineering，66，180-188，(1999)；和Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美國專利第6,337,191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式併入本文中。可以應用於表達包含非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽的另一種方法包括mRNA-肽融合技術。參見，例如，R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)9412297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistry Biology 101043-1050(2003)。在這種方法中，與嘌呤黴素相連接的mRNA模板在核糖體上被翻譯成肽。如果已經修飾一個或一個以上的tRNA分子，那麼也可將非天然胺基酸併入肽中。在已經讀出最後的mRNA密碼子後，嘌呤黴素俘獲肽的C端。如果在活體外檢定中發現所得的mRNA-肽結合物具有引人關注的性質，那麼其特性可容易地從mRNA序列顯示出。因此，所屬領域的技術人員可以篩選包含一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽的庫以鑑別具有所要性質的多肽。近期已經報導，用經純化的組分進行活體外核糖體翻譯使得經非天然編碼的胺基酸取代的肽可合成。參見，例如，A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)1006353(2003)。
也可以使用重構翻譯系統。經純化的翻譯因子的混合物以及經諸如起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(EF-Tu)或終止因子的經純化的翻譯因子補充的溶胞產物或溶胞產物的組合也已經成功地用來將mRNA翻譯為蛋白質。無細胞系統也可以是偶合轉錄/翻譯系統，其中如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編者，Wiley Interscience，1993)中所述將DNA引入系統中、轉錄成mRNA並且翻譯mRNA，所述參考文獻由此以引用的方式特別地併入。在真核轉錄系統中轉錄的RNA可以呈異核RNA(hnRNA)或5′-端帽(7-甲基鳥嘌呤核苷)和3′-端多聚A有尾成熟mRNA形式，此在某些翻譯系統中可為有利條件。舉例而言，加帽mRNA是以高效率在網狀細胞溶胞產物系統中被翻譯。
IX.與GH(例如，hGH)多肽偶合的大分子聚合物本文中所述的對非天然胺基酸多肽的各種修飾可使用本文中所述的組合物、方法、技術和策略來實現。這些修飾包括將包括(但不限於)以下物質的另一官能團併入多肽的非天然胺基酸組分上標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光致交聯劑；放射性核素；細胞毒素化合物；藥物；親和標記；光親和標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔助因子；脂肪酸；碳水化合物；多聚核苷酸；DNA；RNA；反義多聚核苷酸；糖類；水溶性樹枝狀聚合物；環糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；螢光團；含金屬的部分；放射性部分；新穎官能團；共價地或非共價地與其它分子相互作用的基團；光籠鎖部分)；光化輻射可激發部分；光敏異構化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素類似物；併入重原子的部分；可化學裂解的基團；可光致裂解的基團；伸長的側鏈；經碳連接的糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；有毒部分；經同位素標記的部分；生物物理學探針；發磷光的基團；化學發光基團；電子密集基團；磁性基團；插入基團；發色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測的標記；小分子；量子點；納米傳導物；放射性核苷酸；放射性傳導物；中子俘獲劑；或上述物質的任何組合，或任何其它所要的化合物或物質。作為本文中所述組合物、方法、技術和策略的一個說明性、非限制性實例，以下描述將集中於將大分子聚合物添加至非天然胺基酸多肽中，條件是針對其所述的組合物、方法、技術和策略也適用於(在有必要時，加以適當修飾且對於其，所屬領域的技術人員能利用本文中的揭示內容來進行)添加其它官能性物質，其包括(但不限於)以上所列出的官能性物質。
可將多種大分子聚合物和其它分子連接到本發明的GH(例如，hGH)多肽以調節GH(例如，hGH)多肽的生物學性質，且/或為GH(例如，hGH)分子提供新的生物學性質。這些大分子聚合物可通過天然編碼的胺基酸、非天然編碼的胺基酸、或天然或非天然胺基酸的任何官能性取代基或添加至天然或非天然胺基酸的任何取代基或官能團而與GH(例如，hGH)多肽相連接。所述聚合物的分子量可處於寬廣範圍內，包括(但不限於)處於約100Da與約100,000Da或以上之間。所述聚合物的分子量可為處於約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限於)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，所述聚合物的分子量可為處於約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，所述聚合物的分子量可為處於約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，所述聚合物的分子量可為處於約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，所述聚合物的分子量可為處於約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，所述聚合物的分子量可為處於約10,000Da與40,000Da之間。
本發明提供聚合物蛋白質結合物的大體上均質的製劑。如本文中所用的「大體上均質的」意謂經觀察，聚合物蛋白質結合物分子大於總蛋白質的一半。聚合物蛋白質結合物具有生物學活性且本文中所提供的本發明「大體上均質的」PEG化GH(例如，hGH)多肽製劑是為足夠均質以展現均質製劑的優點的那些製劑，例如在臨床應用中易於預測批量間的藥物代謝動力學性質。
所屬領域的技術人員也可以選擇製備聚合物蛋白質結合物分子的混合物，並且本文中所提供的優點為，所屬領域的技術人員可以選擇單聚合物蛋白質結合物包括於混合物中的比例。因此，若有必要時，所屬領域的技術人員可以製備具有所連接的各種數量的聚合物部分(即，二-、三-、四-等)的各種蛋白質的混合物，並且將所述結合物與使用本發明的方法製備的單聚合物蛋白質結合物組合，並且得到具有預定比例的單聚合物蛋白質結合物的混合物。
所選擇的聚合物可為水溶性的，以便使與其連接的蛋白質不會在水性環境(諸如生理環境)中發生沉澱。此聚合物可為分枝的或未分枝的。對於最終產物製劑的治療用途而言，此聚合物將為醫藥學上可接受的。
聚合物的實例包括(但不限於)聚烷基醚和其烷氧基封端類似物(例如，聚氧乙烯乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其甲氧基或乙氧基封端類似物，尤其為聚氧乙烯乙二醇，後者也稱為聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉；聚烷基噁唑啉和聚羥烷基噁唑啉；聚丙烯醯胺、聚烷基丙烯醯胺和聚羥烷基丙烯醯胺(例如聚羥丙基甲基丙烯醯胺和其衍生物)；聚羥烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其類似物；親水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、葡聚糖硫酸酯、氨基葡聚糖；纖維素和其衍生物，例如羧甲基纖維素、羥烷基纖維素；幾丁質和其衍生物，例如脫乙醯幾丁質、丁二醯脫乙醯幾丁質、羧甲基幾丁質、羧甲基脫乙醯幾丁質；透明質酸和其衍生物；澱粉；海藻酸鹽；硫酸軟骨素；白蛋白；支鏈澱粉和羧甲基支鏈澱粉；聚胺基酸和其衍生物，例如聚穀氨酸、聚賴氨酸、聚天門冬氨酸、聚天冬醯胺；順丁烯二酸酐共聚物，諸如苯乙烯順丁烯二酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚順丁烯二酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和前述聚合物的衍生物。
聚乙二醇分子與蛋白質分子的比例將變化，此就如同其在反應混合物中的濃度將變化一樣。一般而言，最佳比率(就存在最小過量的未反應的蛋白質或聚合物的反應的效率而言)可由所選聚乙二醇的分子量和可用反應性基團的可用數目所決定。當涉及分子量時，通常聚合物的分子量越高，可以與蛋白質連接的聚合物分子的數量就越少。同樣地，在優化這些參數時，應考慮聚合物的分枝。通常，分子量越高(或分枝越多)，聚合物∶蛋白質比率就越高。
如本文中所用，並且當涵蓋PEG:GH(例如hGH)多肽結合物時，術語「治療有效量」指的是為患者提供所要益處的量。此量將根據個體不同而變化，並且將視若干因素(包括患者的總體身體狀況和待治療病症的潛在病因)而定。用於治療的GH(例如，hGH)多肽的量提供可接受的變化率並且將所要的反應維持在有益水平。本發明組合物的治療有效量可由所屬領域的技術人員使用公開可用的材料和程序來容易地確定。
水溶性聚合物可為任何結構形式，包括(但不限於)直鏈、分叉或分枝。通常，水溶性聚合物為聚(亞烴基二醇)，諸如聚(乙二醇)(PEG)，但也可採用其它水溶性聚合物。例如，將PEG用於描述本發明的某些實施例。
PEG是為人熟知的水溶性聚合物，其為市售的或可根據所屬領域的技術人員已知的方法(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138至161頁)，通過乙二醇的開環聚合而製備。術語「PEG」廣泛地用於涵蓋任何聚乙二醇分子，不考慮PEG的大小或末端的修飾，並且可通過下式表示為與GH(例如，hGH)多肽連接XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y.
其中n為2至10,000且X為H或包括(但不限於)C1-4烷基、保護基或末端官能團的末端修飾。
在一些情況下，本發明中所用的PEG在一末端上以羥基或甲氧基為終止，即X為H或CH3(「甲氧基PEG」)。或者，PEG可以反應性基團為終止，由此形成雙官能聚合物。典型反應性基團可包括那些常用於與20種常見胺基酸中存在的官能團反應的反應性基團(包括(但不限於)順丁烯二醯亞胺基團、經活化的碳酸酯(包括(但不限於)對硝基苯基酯)、經活化的酯(包括(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺、對硝基苯基酯)和醛)以及對於20種常見胺基酸為惰性但與存在於非天然編碼的胺基酸中的互補官能團起特異性反應的官能團(包括(但不限於)疊氮基、炔基)。應注意，在上式中以Y表示的PEG的另一端將經由天然存在的胺基酸或非天然編碼的胺基酸直接地或間接地連接於GH(例如，hGH)多肽。舉例而言，Y可為連接到多肽的胺基(包括(但不限於)賴氨酸的ε胺或N-末端)的醯胺鍵、氨基甲酸酯鍵或脲鍵。或者，Y可為連接到硫醇基(包括(但不限於)半胱氨酸的硫醇基)的順丁烯二醯亞胺鍵。或者，Y可為連接到通常經由20種常見胺基酸不易接近的殘基的鍵。舉例而言，可使PEG上的疊氮基與GH(例如，hGH)多肽上的炔基反應，以形成胡氏根[3+2]環加成產物。或者，可使PEG上的炔基與存在於非天然編碼的胺基酸中的疊氮基反應，以形成類似產物。在一些實施例中，可在適宜時，使強親核物質(包括(但不限於)肼、醯肼、羥胺、氨基脲)與存在於非天然編碼的胺基酸中的醛基或酮基反應，以形成腙、肟或縮氨基脲，其在一些情形下可通過用適當還原劑處理而進一步還原。或者，強親核物質可通過非天然編碼的胺基酸併入GH(例如，hGH)多肽中，並且用於優先地與存在於水溶性聚合物中的酮基或醛基反應。
PEG的任何分子質量可按實際需要來使用，其根據需要包括(但不限於)約100道爾頓(Da)至100,000Da或以上(有時包括(但不限於)0.1至50kDa或10至40kDa)。PEG的分子量可處於寬廣範圍內，其包括(但不限於)處於約100Da與約100,000Da或以上之間。PEG的分子量可為處於約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限於)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000 Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約10,000Da與40,000Da之間。也可使用支鏈PEG，其包括(但不限於)其中各鏈具有1至100kDa範圍內(包括(但不限於)1至50kDa或5至20kDa)分子量的PEG分子。支鏈PEG的各鏈的分子量可為(包括(但不限於))處於約1,000Da與約100,000Da或以上之間。支鏈PEG的各鏈的分子量可為處於約1,000Da與約100,000Da之間，包括(但不限於)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000 Da、65,000 Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些實施例中，支鏈PEG的各鏈的分子量為處於約1,000Da與50,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的各鏈的分子量為處於約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的各鏈的分子量為處於約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，支鏈PEG的各鏈的分子量為處於約5,000Da與20,000Da之間。在(包括(但不限於))Shearwater Polymers，Inc.catalog，Nektar Therapeutics catalog(其以引用的方式併入本文中)中描述寬廣範圍的PEG分子。
一般而言，PEG分子的至少一個末端可用於與非天然編碼的胺基酸反應。舉例而言，具有適於與胺基酸側鏈反應的炔基和疊氮基部分的PEG衍生物可用於使PEG連接於如本文中所述的非天然編碼的胺基酸。如果非天然編碼的胺基酸包含疊氮部分，那麼PEG通常將含有炔基部分以形成[3+2]環加成產物，或為含有瞵基的活化PEG物質(即，酯、碳酸酯)以形成醯胺鍵。或者，如果非天然編碼的胺基酸包含炔部分，那麼PEG通常將含有疊氮部分以形成[3+2]胡氏根環加成產物。如果非天然編碼的胺基酸包含羰基，那麼PEG通常將包含有效親核物質(包括(但不限於)醯肼、肼、羥胺、氨基脲官能團)，以便分別形成相應腙鍵、肟鍵和縮氨基脲鍵。在其它替代實施例中，可使用上述反應性基團的反向定向基團，即可使非天然編碼的胺基酸中的疊氮基部分與含有炔基的PEG衍生物反應。
在一些實施例中，具有PEG衍生物的GH(例如，hGH)多肽變異體含有可與存在於非天然編碼的胺基酸側鏈上的化學官能團反應的化學官能團。
本發明在一些實施例中提供含有疊氮基的聚合物衍生物和含有乙炔基的聚合物衍生物，其包含具有約800Da至約100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主鏈。此水溶性聚合物的聚合物主鏈可為聚(乙二醇)。然而，應了解，多種水溶性聚合物(包括(但不限於)聚乙二醇和其它相關聚合物，包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))也適用於本發明的實踐，並且術語PEG或聚(乙二醇)的使用預期涵蓋且包括所有這些分子。術語PEG包括(但不限於)任何形式的聚(乙二醇)，包括雙官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉PEG、分枝PEG、側接PEG(即具有一個或一個以上側接於聚合物主鏈的官能團的PEG或相關聚合物)或其中具有可降解的鍵的PEG。
PEG通常為透明、無色、無嗅、可溶於水、對熱穩定的、對許多化學試劑呈惰性、不會水解或變質且通常為無毒的。聚(乙二醇)被視為是生物相容的，也就是說PEG能夠與活組織或生物體共存而不會造成損害。更明確地說，PEG是大體上非免疫原性的，也就是說PEG不傾向於在體內產生免疫響應。當在體內連接於具有一些理想功能的分子(諸如生物活性劑)時，PEG傾向於掩蔽此試劑且可減少或消除任何免疫響應，以便使生物體可容許此試劑的存在。PEG結合物不會傾向於產生實質的免疫反應或引起凝結或其它不良效應。具有式-CH2CH2O-(CH2CH2O)n--CH2CH2-的PEG(其中n為約3至約4000，通常為約20至約2000)適用於本發明。具有約800Da至約100,000Da分子量的PEG在本發明的一些實施例中作為聚合物主鏈尤其有用。PEG的分子量可處於寬廣範圍內，其包括(但不限於)處於約100Da與約100,000Da或以上之間。PEG的分子量可為處於約100Da與約100,000Da之間，包括(但不限於)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，PEG的分子量為處於約10,000Da與40,000Da之間。
聚合物主鏈可為直鏈的或分枝的。分枝聚合物主鏈在所屬領域中一般為已知的。通常，分枝聚合物具有一個中心分枝核心部分和複數個連接到此中心分枝核心的直鏈聚合物鏈。PEG一般是以分枝形式使用，此形式可通過氧化乙烯對多種多元醇(諸如甘油、甘油低聚物、季戊四醇和山梨醇)的加成而製備。中心分枝部分也可由若干種胺基酸(諸如賴氨酸)衍生得到。分枝聚(乙二醇)可以由通式R(-PEG-OH)m表示，其中R是衍生自核心部分(諸如甘油、甘油低聚物或季戊四醇)，並且m表示臂數。諸如美國專利第5,932,462號；第5,643,575號；第5,229,490號；第4,289,872號；美國專利申請案2003/0143596；WO 96/21469；和WO 93/21259(其各者的全文以引用的方式併入本文中)中所述的那些PEG分子的多臂PEG分子也可用作聚合物主鏈。
分枝PEG也可為由PEG(--YCHZ2)n表示的分叉PEG形式，其中Y為連接基團，並且Z是通過一連串的具有指定長度的原子與CH連接的活化末端基團。
另一種分枝形式，即側接PEG，沿著PEG主鏈而非PEG鏈末端上具有諸如羧基的反應性基團。
除了這些PEG形式以外，聚合物也可經製備而在主鏈中具有弱的或可降解的鍵。舉例而言，PEG可經製備而在聚合物主鏈中具有易於水解的酯鍵。如下所示，此水解作用會導致聚合物裂解成具有較低分子量的片段-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-所屬領域的技術人員了解，術語聚(乙二醇)或PEG表示或包括所屬領域中已知的所有形式，其包括(但不限於)本文中揭示的那些形式。
許多其它聚合物也適用於本發明。在一些實施例中，具有2到約300個末端的水溶性聚合物主鏈尤其適用於本發明。合適的聚合物的實例包括(但不限於)諸如聚(丙二醇)(「PPG」)的其它聚(亞烴基二醇)，其共聚物(包括(但不限於)乙二醇和丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。儘管聚合物主鏈中各鏈的分子量可變化，但其通常在約800Da至約100,000Da的範圍內，往往為約6,000Da至約80,000Da的範圍內。聚合物主鏈中各鏈的分子量可為處於約100Da與約100,000Da之間，其包括(但不限於)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些實施例中，聚合物主鏈中各鏈的分子量為處於約100Da與50,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈中各鏈的分子量為處於約100Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈中各鏈的分子量為處於約1,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈中各鏈的分子量為處於約5,000Da與40,000Da之間。在一些實施例中，聚合物主鏈中各鏈的分子量為處於約10,000Da與40,000Da之間。
所屬領域的技術人員將認識到，大體上水溶性主鏈的前述列舉決非詳盡無遺，而僅僅為說明性的，並且將具有上述特性的所有聚合材料均視為適用於本發明。
在本發明的一些實施例中，聚合物衍生物為「多官能性」的，意謂聚合物主鏈具有至少兩個，且可能多達約300個經官能團官能化或活化的末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限於)具有兩個末端的直鏈聚合物，其中各末端鍵結至可能為相同或不同的官能團。
在一些實施例中，聚合物衍生物具有以下結構X-A-POLY-B-N＝N＝N，其中N＝N＝N為疊氮基部分；B為連接部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原性聚合物；
A為連接部分，其可存在或不存在，且其可與B相同或不同；且X為第二官能團。
連接部分A和B的實例包括(但不限於)含有至多18個且可能含有1至10個碳原子的多重官能化烷基。烷基鏈中可包括雜原子，諸如氮、氧或硫。烷基鏈也可在雜原子處分枝。連接部分A和B的其它實例包括(但不限於)含有至多10個且可能含有5至6個碳原子的多重官能化芳基。此芳基可經又一個碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。合適連接基團的其它實例包括那些在美國專利第5,932,462號、第5,643,575號；和美國專利申請公開案2003/0143596(其各以引用的方式併入本文中)中所述的連接基團。所屬領域的技術人員將認識到，連接部分的前述列舉絕非詳盡無遺的，而僅為說明性的，且將具有上述特性的所有聚合材料均視為適用於本發明。
適於用作X的官能團的實例包括(但不限於)羥基、經保護羥基、烷氧基、活性酯(諸如N-羥基丁二醯亞胺基酯和1-苯並三唑基酯)、活性碳酸酯(諸如N-羥基丁二醯亞胺基碳酸酯和1-苯並三唑基碳酸酯)、乙縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、活性碸、胺、氨基氧基、經保護胺、醯肼、經保護醯肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、順丁烯二醯亞胺、乙烯碸、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙醯胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烴、酮和疊氮化物官能團。如所屬領域的技術人員所了解，所選擇的X部分應與疊氮基相容，以免與疊氮基發生反應。含疊氮基的聚合物衍生物為同雙官能性(homobifunctional)，此意謂第二官能團(即X)也為疊氮基部分；或為雜雙官能性，此意謂第二官能團為不同官能團。
術語「經保護」指的是防止化學反應性官能團在某些反應條件下反應的保護基或部分的存在。保護基將視所保護的化學反應性基團的類型而變化。舉例而言，如果化學反應性基團為胺或醯肼，那麼保護基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)的群組。如果化學反應性基團為硫醇，那麼保護基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學反應性基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那麼保護基可為苄基或烷基(諸如甲基、乙基或叔丁基)。所屬領域中已知的其它保護基也可用於本發明。
文獻中末端官能團的特定實例包括(但不限於)N-丁二醯亞胺基碳酸酯(參看例如美國專利第5,281,698號、第5,468,478號)、胺(參看例如Buckmann等人Makromol.Chem.1821379(1981)，Zalipsky等人Eur.Polym.J.191177(1983))、醯肼(參看例如Andresz等人Makromol.Chem.179301(1978))、丁二醯亞胺基丙酸酯和丁二醯亞胺基丁酸酯(參看例如Olson等人於Poly(ethylene glycol)Chemistry Biological Applications，第170至181頁，Harris Zalipsky Eds.，ACS，Washington，D.C.，1997；也參看美國專利第5,672,662號)、丁二醯亞胺基丁二酸酯(參看例如Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.7175(1984)和Joppich等人Makromol.Chem.1801381(1979))、丁二醯亞胺酯(參看例如美國專利第4,670,417號)、苯並三唑碳酸酯(參看例如美國專利第5,650,234號)、縮水甘油醚(參看例如Pitha等人Eur.J Biochem.9411(1979)，Elling et al，Biotech.Appl.Biochem.13354(1991))、氧羰基咪唑(參看例如Beauchamp等人，Anal.Biochem.13125(1983)、Tondelli等人J.Controlled Release 1251(1985))、對硝基苯基碳酸酯(參看例如Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，2745(1991))、醛(參看例如Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22341(1984)、美國專利第5,824,784號、美國專利第5,252,714號)、順丁烯二醯亞胺(參看例如Goodson等人Biotechnology(NY)8343(1990)，Romani et al.in Chemistry of Peptides and Proteins229(1984)和Kogan，Synthetic Comm.222417(1992))、鄰吡啶基二硫化物(參看例如Woghiren等人Bioconj.Chem.4314(1993))、丙烯醇(參看例如Sawhney等人Macromolecules，26581(1993))、乙烯碸(參看例如美國專利第5,900,461號)。所有上述文獻和專利均以引用的方式併入本文中。
在本發明的特定實施例中，本發明的聚合物衍生物包含具有以下結構的聚合物主鏈X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N＝N＝N，其中X為如上所述的官能團；且n為約20至約4000。
在另一實施例中，本發明的聚合物衍生物包含具有以下結構的聚合物主鏈X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N，其中W為包含1至10個碳原子的脂族或芳族連接子部分；n為約20至約4000；且
X為如上所述的官能團，m為1與10之間。
本發明的含疊氮基的PEG衍生物可通過所屬領域中已知的和/或本文中所揭示的多種方法製備。在一種以下所示的方法中，使具有約800Da至約100,000Da平均分子量的水溶性聚合物主鏈、具有鍵結至第一官能團的第一末端和鍵結至合適離去基團的第二末端的聚合物主鏈與疊氮基陰離子(其可與若干合適反離子(包括鈉離子、鉀離子、叔丁基銨離子等)中的任何一離子配對)反應。此離去基團經受親核置換且被疊氮基部分置換，得到所要含疊氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3-→X-PEG-N3如其所示，用於本發明的合適聚合物主鏈具有式X-PEG-L，其中PEG為聚(乙二醇)，且X為不與疊氮基反應的官能團，且L為合適離去基團。合適官能團的實例包括(但不限於)羥基、經保護羥基、乙縮醛、烯基、胺、氨基氧基、經保護胺、經保護醯肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、順丁烯二醯亞胺、二硫吡啶和乙烯基吡啶以及酮官能團。合適離去基團的實例包括(但不限於)氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯和甲苯磺酸酯基團。
在本發明的含疊氮基的聚合物衍生物的另一種製備方法中，使具有疊氮基官能團的連接劑與具有約800Da至約100,000Da平均分子量的水溶性聚合物主連結觸，其中此連接劑具有官能團，其將選擇性地與PEG聚合物上的化學官能團反應，以形成含疊氮基的聚合物衍生物產物，其中疊氮基通過連接基團與聚合物主鏈隔開。
下文顯示示範性反應流程X-PEG-M+N-連接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-連接子-N＝N＝N，其中PEG為聚(乙二醇)，且X為封端基團，諸如烷氧基或如上所述的官能團；且M為不與疊氮基官能團反應但將有效地且選擇性地與N官能團反應的官能團。
合適官能團的實例包括(但不限於)如果N為胺，那麼M為羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N為醯肼或氨基氧基部分，那麼M為酮；如果N為親核物質，那麼M為離去基團。
粗產物的純化可通過已知方法完成，這些方法包括(但不限於)產物沉澱，繼而在必要時層析。
在下文中顯示在PEG二胺的情況下的更特別的實例，其中這些胺中的一種受保護基團部分(諸如叔丁基-Boc)保護，且使所得單保護PEG二胺與具有疊氮基官能團的連接部分反應BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N。
在此情況下，可使用多種活化劑(諸如亞硫醯二氯或碳化二亞胺試劑以及N-羥基丁二醯亞胺或N-羥基苯並三唑)將胺基偶合至羧酸基，以在單胺PEG衍生物與具有疊氮基的連接子部分之間形成胺鍵。當成功形成胺鍵後，所得經N-叔丁基-Boc-保護的含疊氮基衍生物可直接用於修飾生物活性分子，或其可經進一步精製以加入其它有用官能團。舉例而言，N-叔丁氧羰基可通過用強酸處理而水解，以生成ω-胺基-PEG-疊氮化物。所得胺可用作合成把(synthetic handle)以加入其它有用官能團(諸如順丁烯二醯亞胺基團、活化二硫化物、活化酯等)，用以形成有價值的雜雙官能性試劑。
雜雙官能性衍生物在需要其將不同分子連接至聚合物的各末端時特別適用。舉例而言，ω-N-氨基-N-疊氮基PEG將允許具有活化親電子基團的分子(諸如醛、酮、活化酯、活化碳酸酯等)連接至PEG的一個末端，且允許具有乙炔基的分子連接至PEG的另一個末端。
在本發明的另一實施例中，聚合物具有以下結構X-A-POLY-B-C≡C-R，其中R可為H或烷基、烯基、烷氧基或芳基或經取代芳基；B為連接部分，其可存在或不存在；POLY為水溶性非抗原性聚合物；A為連接部分，其可存在或不存在，且其可與B相同或不同；且X為第二官能團。
連接部分A和B的實例包括(但不限於)含有至多18個且可能含有1至10個碳原子的多重官能化烷基。烷基鏈中可包括雜原子，諸如氮、氧或硫。烷基鏈也可在雜原子處分枝。連接部分A和B的其它實例包括(但不限於)含有至多10個且可能含有5至6個碳原子的多重官能化芳基。此芳基可經又一個碳原子、氮原子、氧原子或硫原子取代。合適連接基團的其它實例包括那些在美國專利第5,932,462號、第5,643,575號；和美國專利申請公開案2003/0143596(其各以引用的方式併入本文中)中所述的連接基團。所屬領域的技術人員將認識到，連接部分的前述列舉絕非詳盡無遺的，而僅預期為說明性的，且將具有上述特性的多種聚合材料均視為適用於本發明。
適於用作X的官能團的實例包括(但不限於)羥基、經保護羥基、烷氧基、活性酯(諸如N-羥基丁二醯亞胺基酯和1-苯並三唑基酯)、活性碳酸酯(諸如N-羥基丁二醯亞胺基碳酸酯和1-苯並三唑基碳酸酯)、乙縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、活性碸、胺、氨基氧基、經保護胺、醯肼、經保護醯肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、順丁烯二醯亞胺、乙烯碸、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙醯胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烴、酮和乙炔基。如我們所了解，所選擇的X部分應與疊氮基相容，以免與疊氮基發生反應。含乙炔基的聚合物衍生物為同雙官能性(homobifunctional)，意謂第二官能團(即X)也為乙炔基部分；或為雜雙官能性，意謂第二官能團為不同官能團。
在本發明的另一實施例中，聚合物衍生物包含具有以下結構的聚合物主鏈X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH，其中X為如上所述的官能團；n為約20至約4000；且m為1與10之間。
在下文中顯示各雜雙官能性PEG聚合物的特定實例。
本發明的含乙炔基的PEG衍生物可使用所屬領域的技術人員已知的和/或本文中所揭示的方法來製備。在一種方法中，使具有約800Da至約100,000Da平均分子量的水溶性聚合物主鏈、具有鍵結至第一官能團的第一末端和鍵結至合適親核基團的第二末端的聚合物主鏈與具有乙炔基官能團和離去基團(其適於與PEG上的親核基團反應)的化合物反應。當具有親核部分的PEG聚合物和具有離去基團的分子組合時，此離去基團經受親核置換且被親核部分置換，得到所要的含乙炔基聚合物。
X-PEG-Nu+I-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR』
如其所示，用於此反應的優選聚合物主鏈具有式X-PEG-Nu，其中PEG為聚(乙二醇)，Nu為親核部分且X為不與Nu、L或乙炔基官能團反應的官能團。
Nu的實例包括(但不限於)胺、烷氧基、芳氧基、巰基、亞氨基、羧酸酯、醯肼、氨基氧基，其主要經由SN2型機制進行反應。Nu基團的其它實例包括那些將主要經由親核加成反應進行反應的官能團。L基團的實例包括氯化物、溴化物、碘化物、甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯和甲苯磺酸酯基團以及其它預期經受親核置換的基團，如酮、醛、硫酯、烯烴、α-β不飽和羰基、碳酸酯和其它預期經受親核物質加成的親電子基團。
在本發明的另一實施例中，A為1至10個碳原子的脂族連接子或6至14個碳原子的經取代芳環。X為不與疊氮基反應的官能團，且L為合適離去基團。
在本發明的含乙炔基聚合物衍生物的另一種製備方法中，使具有約800Da至約100,000Da平均分子量、在一個末端上具有經保護官能團或封端劑且在另一末端上具有合適離去基團的PEG聚合物與乙炔陰離子接觸。
在下文中顯示示範性反應流程X-PEG-L+-C≡CR』→X-PEG-C≡CR』其中PEG為聚(乙二醇)且X為封端基團，諸如烷氧基或上文所述的官能團；且R′為H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基，或經取代烷基、經取代烷氧基、經取代芳基或經取代芳氧基。
在上述實例中，離去基團L應具有足夠反應性，以在與足夠濃度的乙炔陰離子接觸時經受SN2型置換。完成離去基團經乙炔陰離子SN2置換所需的反應條件對於所屬領域的技術人員而言為已知的。
粗產物的純化通常可通過所屬領域中已知的方法來完成，這些方法包括(但不限於)產物沉澱，繼而在必要時層析。
可將水溶性聚合物連接至本發明的GH(例如，hGH)多肽。水溶性聚合物可經由併入GH(例如，hGH)多肽中的非天然編碼的胺基酸，或非天然編碼的或天然編碼的胺基酸的任何官能團或取代基，或加入到非天然編碼的或天然編碼的胺基酸的任何官能團或取代基而連接。或者，水溶性聚合物是經由天然存在的胺基酸(包括(但不限於)半胱氨酸、賴氨酸或N-末端殘基的胺基)連接至其中併入非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽。在一些情況下，本發明的GH(例如，hGH)多肽包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上的非天然胺基酸，其中一個或一個以上非天然編碼的胺基酸連接於水溶性聚合物(包括(但不限於)PEG和/或低聚糖)。在一些情況下，本發明的GH(例如，hGH)多肽另外包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上連接至水溶性聚合物的天然編碼的胺基酸。在一些情況下，本發明的GH(例如，hGH)多肽包含一個或一個以上連接至水溶性聚合物的非天然編碼的胺基酸和一個或一個以上連接至水溶性聚合物的天然存在的胺基酸。在一些實施例種，用於本發明的水溶性聚合物相對於非結合形式而言可增強GH(例如，hGH)多肽的血清半衰期。
可調節連接至本發明的GH(例如，hGH)多肽的水溶性聚合物的數量(即PEG化或糖基化的程度)，以提供改變的(包括(但不限於)增加的或減少的)藥理學特徵、藥物代謝動力學特徵或藥效特徵，諸如活體內半衰期。在一些實施例中，GH(例如，hGH)多肽的半衰期相對於未經修飾多肽而言增加至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少約100倍。
含有強親核性基閉(即醯肼、肼、羥胺或氨基脲)的PEG衍生物在本發明的一個實施例中，包括含羰基的非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽經含有末端肼、羥胺、醯肼或氨基脲部分(其直接連接至PEG主鏈)的PEG衍生物修飾。
在一些實施例中，羥胺末端PEG衍生物將具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000(即，平均分子量為5至40kDa)。
在一些實施例中，含肼或含醯肼部分的PEG衍生物將具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000，且X視需要為可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些實施例中，含有氨基脲部分的PEG衍生物將具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000。
在本發明的另一實施例中，包括含羰基胺基酸的GH(例如，hGH)多肽經含有末端羥胺、醯肼、肼或氨基脲部分(其經由醯胺鍵連接至PEG主鏈)的PEG衍生物修飾。
在一些實施例中，羥胺末端PEG衍生物具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000(即，平均分子量為5至40kDa)。
在一些實施例中，含肼或含醯肼部分的PEG衍生物具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10，n為100至1,000，且X視需要為可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些實施例中，含有氨基脲部分的PEG衍生物具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000。
在本發明的另一實施例中，包括含羰基胺基酸的GH(例如，hGH)多肽經含有末端肼、羥胺、醯肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修飾，其中此分枝PEG的各鏈具有10至40kDa範圍內且可能為5至20kDa範圍內的分子量。
在本發明的另一實施例中，包含非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽經具有分枝結構的PEG衍生物修飾。舉例而言，在一些實施例中，肼末端或醯肼末端PEG衍生物將具有下列結構 2CH(CH2)m-X-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000，且X視需要為可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些實施例中，含有氨基脲部分的PEG衍生物將具有以下結構[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視需要為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2至10且n為100至1,000。
在一些實施例中，含有羥胺基團的PEG衍生物將具有以下結構[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，X視需要為NH、O、S、C(O)或不存在，m為2至10且n為100至1,000。
水溶性聚合物連接至hGH多肽的程度和部位可調節hGH多肽至hGH多肽受體在部位1上的結合。在一些實施例中，本發明提供通過肟鍵與至少一個PEG相連接的GH(例如hGH)，其中此反應中用於形成肟鍵的PEG為直鏈、30kDa的單甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯鹽酸鹽，如圖19中所示。圖20呈現在本發明特定實施例的合成中適用的直鏈、30kDa的單甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯鹽酸鹽的合成的說明性實例。
僅舉例而言而不作為對於與本文中所述組合物、方法、技術和策略一同使用的PEG試劑類型或種類的限制，圖21呈現含羥胺PEG試劑的其它說明性實例(這些PEG試劑可與含羰基的非天然胺基酸多肽反應以形成連接至PEG基團的含肟非天然胺基酸多肽)以及含羰基PEG試劑的實例(這些PEG試劑可與含肟非天然胺基酸多肽或含羥胺非天然胺基酸多肽反應以形成連接至PEG基團的新的含肟非天然胺基酸多肽)。圖22呈現用於形成含羥胺PEG試劑、或含羥胺PEG試劑的經保護形式、或含羥胺PEG試劑的經掩蔽形式的合成方法的四個說明性實例。圖23呈現用於形成醯胺連接的含羥胺PEG試劑、或醯胺連接的含羥胺PEG試劑的經保護形式、或醯胺連接的含羥胺PEG試劑的經掩蔽形式的合成方法的一個說明性實例。圖24和圖25呈現用於形成氨基甲酸酯連接的含羥胺PEG試劑、或氨基甲酸酯連接的含羥胺PEG試劑的經保護形式、或氨基甲酸酯連接的含羥胺PEG試劑的經掩蔽形式的合成方法的一個說明性實例。圖26呈現用於形成簡單的含羥胺PEG試劑、或簡單的含羥胺PEG試劑的經保護形式、或簡單的含羥胺PEG試劑的經掩蔽形式的合成方法的一個說明性實例。此外，圖27呈現具有連接PEG基團的多個分枝的含羥胺試劑的說明性實例，且進一步顯示一種如此的含羥胺多PEG分枝試劑與含羰基非天然胺基酸多肽反應以形成具有連接多PEG分枝基團的含肟非天然胺基酸多肽的反應。
適用於本發明的水溶性聚合物(例如PEG)的其它實例(例如經修飾能夠形成肟鍵的PEG)可見於美國專利申請案第60/638,418號；第60/638,527號和於2004年12月22日申請的題為″Compositions containing，methods involving，and uses of non-naturalamino acids and polypeptides，″的第60/639,195號，其全文以引用的方式併入本文中。其也在美國專利申請案第60/696,210號；第60/696,302號和於2005年7月1日申請的題為″Compositions containing，methods involving，and uses of non-natural amino acids andpolypeptides，″的第60/696,068中描述，所述參考文獻全文以引用的方式併入本文中。
水溶性聚合物連接至hGH多肽的程度和部位可調節GH(例如，hGH)多肽至GH(例如，hGH)多肽受體在部位1上的結合。在一些實施例中，鍵經如此地配置以便使GH(例如，hGH)多肽與GH(例如，hGH)多肽受體在部位1上以約400nM或以下的Kd、以150nM或以下的Kd且在一些情況下以100nM或以下的Kd(Kd按照諸如Spencer等人，J.Biol.Chem.，2637862-7867(1988)中所述的平衡結合檢定所測量)結合。
用於聚合物活化以及肽結合的方法和化學反應在文獻中有所描述，且在所屬領域中為已知的。用於聚合物活化的常用方法包括(但不限於)使用溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、雙環氧化物、表氯醇、二乙烯基碸、碳化二亞胺、磺醯滷化物、三氯三嗪等來活化官能團(參看R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL ANDAPPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OF PROTEINCONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G. T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.，等人，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACSSymposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
關於PEG官能化和結合作用的一些綜述和專論是可用的。參看(例如)Harris，Macromol.Chem.Phys.C25第325-373頁(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135第30-65頁(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14第866-874頁(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9第249-304頁(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6第150-165頁(1995)。
用於聚合物活化的方法也可見於WO 94/17039、美國專利第5,324,844號、WO94/18247、WO 94/04193、美國專利第5,219,564號、美國專利第5,122,614號、WO90/13540、美國專利第5,281,698號和WO 93/15189，並且可找到用於經活化聚合物與酶之間的結合作用的方法，這些酶包括(但不限於)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利第4,412,989號)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11第141-52頁(1985))。所引用的全部文獻和專利均是以引用的方式併入本文中。
通過任何便利方法進行含有非天然編碼的胺基酸(諸如對疊氮基-L-苯丙氨酸)的GH(例如，hGH)多肽的PEG化(即，加入任何水溶性聚合物)。舉例而言，用末端為炔基的mPEG衍生物使GH(例如，hGH)多肽PEG化。簡而言之，於室溫下在攪拌情況下將過量的固體mPEG(5000)-O-CH2-C≡H添加至含對疊氮基-L-Phe的GH(例如，hGH)多肽的水溶液中。通常使用具有與反應進行時所處的pH值(一般約為pH值4至10)接近的pKa的緩衝液將所述水溶液緩衝。舉例而言，用於在pH值7.5下PEG化的合適緩衝液的實例包括(但不限於)HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、TRIS-HCl、EPPS和TES。持續監測pH值，且在必要時進行調節。通常允許此反應持續約1至48小時。
隨後使反應產物經受疏水相互作用色譜法處理，以使PEG化GH(例如，hGH)多肽變異體與游離mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH和PEG化GH(例如，hGH)多肽的任何高分子量複合物(其可在未阻斷PEG在分子兩端上均受活化時而形成)，從而使GH(例如，hGH)多肽變異體分子交聯。疏水相互作用色譜法期間的條件為如此，以便使游離mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流過管柱，同時任何經交聯的PEG化GH(例如，hGH)多肽變異體複合物在所要形式(其含有一個與一個和一個以上PEG基團結合的GH(例如，hGH)多肽變異體分子)之後洗脫。合適條件將視交聯複合物對於所要結合物的相對大小而變化，且可由所屬領域的技術人員容易地確定。含有所要結合物的洗脫液通過超濾而濃縮且通過透濾脫鹽。
必要時，由疏水色譜法獲得的PEG化GH(例如，hGH)多肽可進一步通過所屬領域的技術人員已知的程序中的一種和一種以上程序而純化，這些程序包括(但不限於)親和色譜法；陰離子交換或陽離子交換色譜法(其使用包括(但不限於)DEAE瓊脂糖凝膠)；矽石色譜法；反相HPLC；凝膠過濾(使用包括(但不限於)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色譜法；尺寸排阻色譜法(size-exclusion chromatography)；金屬螯合色譜法；超濾/透濾；乙醇沉澱；硫酸銨沉澱；色譜焦聚；置換色譜法；電泳程序(包括(但不限於)製備性等電聚焦)；差異溶解性法(包括(但不限於)硫酸銨沉澱)；或提取法。表觀分子量可以通過將GPC與球狀蛋白質標準相比而估算(Preneta，AZ in PROTEINPURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(HarrisAngal，編)IRL Press1989，第293-306頁)。GH(例如hGH)-PEG結合物的純度可通過蛋白水解降解(包括(但不限於)胰蛋白酶裂解)繼而進行質譜分析來評估。Pepinsky RB.，等人，J.Pharmcol.Exp.Ther.297(3)1059-66(2001)。
也通過任何便利方法進行含有含羰基非天然編碼的胺基酸(諸如對乙醯基-L-苯丙氨酸)的GH(例如，hGH)多肽的PEG化(即，加入任何水溶性聚合物)。作為非專有實例，使用氨基氧基乙胺氨基甲酸酯mPEG衍生物(其分子量為約0.1至100kDa、或約1至100kDa、或約10至50kDa、或約20至40kDa、或例如30kDa的)將含有含羰基非天然編碼的胺基酸(例如對乙醯基-L-苯丙氨酸)的GH(hGH)多肽PEG化。簡而言之，於室溫下在攪拌情況下將過量的固體MPEG-羥基胺，例如mPEG(30,000)-O-CO-NH-(CH2)2-ONH3+(線性30kDa單甲氧基-聚(乙二醇)-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯鹽酸鹽，30K MPEG-羥基胺)添加至含有對乙醯基-L-苯丙氨酸的GH(例如，hGH)多肽的水溶液中。PEGGH(例如，hGH)的摩爾比可為約2至15、或約5至10、或約5、6、7、8、9或10。通常使用具有與反應進行時所處的pH值(一般約為pH值2至8)接近的pKa的緩衝液將所述水溶液緩衝。舉例而言，用於在pH值4.0下PEG化的合適緩衝液的實例包括(但不限於)通過添加乙酸而調節至pH4.0的乙酸鈉/甘氨酸緩衝液。通常允許此反應於室溫下輕柔搖動下持續約1至60小時、或約10至50小時、或約18至48小時、或約39至50小時。PEG化可通過SDS凝膠確定。
隨後使反應產物經受從(例如)游離30K MPEG-羥基胺和PEG化GH(例如，hGH)多肽的任何高分子量複合物(其可在未阻斷PEG在分子兩端上均受活化時而形成)純化，從而使GH(例如，hGH)多肽變異體分子交聯。可使用任何合適的純化方法，例如管柱色譜法(諸如使用SourceQ緩衝液A和SourceQ緩衝液B進行的SourceQ管柱色譜)。反應混合物可用TRIS鹼和SourceQ緩衝液A以及MilliQ水進行稀釋，隨後加載至管柱上。含有所要結合物的洗脫液可進一步通過超濾而濃縮且通過透濾脫鹽。
必要時，由色譜法獲得的PEG化GH(例如，hGH)多肽可進一步通過所屬領域的技術人員已知的和本文中所述(參看例如上文)的程序中的一種和一種以上程序而純化。可以高於50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或99.99％的純度獲得最終的PEG化GH(例如，hGH)多肽。純度可通過所屬領域中已知的方法測定。評估純度的示範性非限制性方法包括SDS-PAGE、使用西方墨點法和ELISA檢定測量GH(例如，hGH)多肽、Bradford檢定、質譜(包括(但不限於)MALDI-TOF)、HPLC方法(諸如RP HPLC、陽離子交換HPLC和凝膠過濾HPLC)和所屬領域的技術人員已知的其它用於表徵蛋白質的方法。
與本發明的GH(例如，hGH)多肽中的胺基酸相連接的水溶性聚合物可無限制地經進一步衍生或取代。
含疊氮基的PEG衍生物在本發明的另一實施例中，用含有疊氮基部分(其將與存在於非天然編碼的胺基酸側鏈上的炔基部分反應)的PEG衍生物修飾GH(例如，hGH)多肽。一般而言，這些PEG衍生物將具有1至100kD且在一些實施例中為10至40kDa的平均分子量。
在一些實施例中，末端為疊氮基的PEG衍生物將具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000(即，平均分子量為5至40kDa)。
在另一實施例中，末端為疊氮基的PEG衍生物將具有以下結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10，p為2至10且n為100至1,000(即，平均分子量為5至40kDa)。
在本發明的另一實施例中，用含有末端疊氮基部分的分枝PEG衍生物(其中所述PEG的各鏈具有10至40kDa且可能為5至20kDa範圍內的分子量)修飾GH(例如，hGH)多肽。舉例而言，在一些實施例中，末端為疊氮基的PEG衍生物將具有下列結構[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10，p為2至10且n為100至1,000，且X視需要為O、N、S或羰基(C＝O)，其在各種情況下可存在或不存在。
含炔基的PEG衍生物在本發明的另一實施例中，用含有炔基部分(其將與存在於非天然編碼的胺基酸側鏈上的疊氮基部分反應)的PEG衍生物修飾GH(例如，hGH)多肽。
在一些實施例中，末端為炔基的PEG衍生物將具有下列結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10且n為100至1,000(即，平均分子量為5至40kDa)。
在本發明的另一實施例中，用含有末端疊氮基部分或末端炔基部分(其通過醯胺鍵與PEG主鏈相連接)的PEG衍生物修飾包含含炔基非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽。
在一些實施例中，末端為炔基的PEG衍生物將具有下列結構RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10，p為2至10且n為100至1,000。
在本發明的另一實施例中，用含有末端炔基部分的分枝PEG衍生物(其中所述PEG的各鏈具有10至40kDa且可能為5至20kDa範圍內的分子量)修飾包含含疊氮基胺基酸的GH(例如，hGH)多肽。舉例而言，在一些實施例中，末端為炔基的PEG衍生物將具有下列結構[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH，其中R為簡單烷基(甲基、乙基、丙基等)，m為2至10，p為2至10且n為100至1,000，且X視需要為O、N、S或羰基(C＝O)，或不存在。
含膦部分的PEG衍生物在本發明的另一實施例中，用含有經活化官能團(包括(但不限於)酯、碳酸酯)且進一步包含芳基膦基團(其將與存在於非天然編碼的胺基酸側鏈上的疊氮基部分反應)的PEG衍生物修飾GH(例如，hGH)多肽。一股而言，這些PEG衍生物將具有1至100kD且在一些實施例中為10至40kDa的平均分子量。
在一些實施例中，所述PEG衍生物將具有以下結構 其中n為1至10；X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，且W為水溶性聚合物。
在一些實施例中，所述PEG衍生物將具有以下結構 其中X可為O、N、S或不存在，Ph為苯基，W為水溶性聚合物，且R可為H、烷基、芳基、經取代烷基和經取代芳基。示範性R基團包括(但不限於)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、滷基、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R和R″″各自獨立地指的是氫、經取代或未經取代的雜烷基、經取代或未經取代的芳基(其包括(但不限於)經1至3個滷原子取代的芳基)、經取代或未經取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。舉例而言，當本發明的化合物包括一個以上的R基團時，各R基團是是獨立地加以選擇的；就如同當R′、R″、R和R″″中的一個以上基團存在時，R′、R″、R和″″基團各自是獨立地加以選擇的那樣。當R′和R″與同一個氮原子相連接時，其可與此氮原子組合以形成5元、6元或7元環。舉例而言，-NR′R″意謂包括(但不限於)1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據以上對取代基的論述，所屬領域的技術人員將了解，術語「烷基」意謂包括包含與非氫基團鍵結的碳原子的基團，諸如滷代烷基(包括(但不限於)-CF3和-CH2CF3)和醯基(包括(但不限於)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般PEG化技術可與GH(例如，hGH)多肽相連接的其它示範性PEG分子以及PEG化方法包括在下列專利案中所述的那些PEG分子以及PEG化方法美國專利公開案第2004/0001838號；第2002/0052009號；第2003/0162949號；第2004/0013637號；第2003/0228274號；第2003/0220447號；第2003/0158333號；第2003/0143596號；第2003/0114647號；第2003/0105275號；第2003/0105224號；第2003/0023023號；第2002/0156047號；第2002/0099133號；第2002/0086939號；第2002/0082345號；第2002/0072573號；第2002/0052430號；第2002/0040076號；第2002/0037949號；第2002/0002250號；第2001/0056171號；第2001/0044526號；第2001/0021763號；美國專利第6,646,110號；第5,824,778號；第5,476,653號；第5,219,564號；第5,629,384號；第5,736,625號；第4,902,502號；第5,281,698號；第5,122,614號；第5,473,034號；第5,516,673號；第5,382,657號；第6,552,167號；第6,610,281號；第6,515,100號；第6,461,603號；第6,436,386號；第6,214,966號；第5,990,237號；第5,900,461號；第5,739,208號；第5,672,662號；第5,446,090號；第5,808,096號；第5,612,460號；第5,324,844號；第5,252,714號；第6,420,339號；第6,201,072號；第6,451,346號；第6,306,821號；第5,559,213號；第5,747,646號；第5,834,594號；第5,849,860號；第5,980,948號；第6,004,573號；第6,129,912號；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、WO 98/05363、EP 809 996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP 510 356、EP400 472、EP 183 503和EP 154 316，其以引用的方式併入本文中。本文中所述的任何PEG分子可以任何形式使用，包括(但不限於)單鏈、支鏈、多臂鏈、單官能性、多官能性或其任何組合。
增強對血清白蛋白的親和力也可將多種分子與本發明的GH(例如，hGH)多肽融合，以調節GH(例如，hGH)多肽在血清中的半衰期。在一些實施例中，將分子與本發明的GH(例如，hGH)多肽相連接或融合，以增強對於動物的內源性血清白蛋白的親和性。
舉例而言，在一些情況下，進行GH(例如，hGH)多肽與白蛋白結合序列的重組融合。示範性白蛋白結合序列包括(但不限於)來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結合域(參看例如Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277534-542(1996)和Sjolander等人，J，Immunol.Methods 201115-123(1997))，或白蛋白結合肽(諸如在例如Dennis等人，J.Biol.Chem.277第35035-35043頁(2002)中所述)。
在其它實施例中，使用脂肪酸將本發明的GH(例如，hGH)多肽醯化。在一些實施例中，脂肪酸促進與血清白蛋白的結合。參看例如Kurtzhals等人，Biochem.J.312第725-731頁(1995)。
在其它實施例中，本發明的GH(例如，hGH)多肽是與血清白蛋白(包括(但不限於)人類血清白蛋白)直接融合。所屬領域的技術人員將認識到，也可使多種其它分子與本發明的GH(例如，hGH)多肽相連接，以調節與血清白蛋白或其它血清組分的結合。
X.GH(例如，hGH)多肽的糖基化本發明包括其中併入一個或一個以上具有糖類殘基的非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽。這些糖類殘基可為天然的(包括(但不限於)N-乙醯基氨基葡萄糖)或非天然的(包括(但不限於)3-氟半乳糖)。這些糖類可通過N連接或O連接的糖苷鍵(包括(但不限於)N-乙醯基半乳糖-L-絲氨酸)或非天然鍵(包括(但不限於)肟或相應C連接或S連接的糖苷)與非天然編碼的胺基酸相連接。
可將糖類(包括(但不限於)糖基)部分添加至活體內或活體外的GH(例如，hGH)多肽。在本發明的一些實施例中，使用以氨基氧基衍生的糖類來修飾包含含羰基非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽，以產生通過肟鍵相連接的相應糖基化多肽。一旦連接至非天然編碼的胺基酸後，就可通過用糖基轉移酶和其它酶處理將糖類進一步精製，以產生與GH(例如，hGH)多肽結合的低聚糖。參看例如H.Liu等人J.Am.Chem.Soc.125第1702-1703頁(2003)。
在本發明的一些實施例中，使用作為氨基氧基衍生物而製備的、具有確定結構的聚糖來直接修飾包含含羰基非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽。所屬領域的技術人員將認識到，可使用其它官能團(包括疊氮基、炔基、醯肼、肼、和氨基脲)將糖類連接至非天然編碼的胺基酸。
在本發明的一些實施例中，接著可通過(包括(但不限於))分別與(包括(但不限於))炔基或疊氮基衍生物的胡氏根[3+2]環加成反應來修飾包含疊氮基或含炔基非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽。此方法允許以極高的選擇性來修飾蛋白質。
XI.GH超基因家族成員二聚體和多聚體本發明也提供GH超基因家族成員的組合(包括(但不限於)GH，例如hGH和hGH類似物)，諸如同源二聚體、雜二聚體、同源多聚體或雜多聚體(即，三聚體或四聚體等)，其中含有一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的GH超基因家族成員多肽(諸如GH，例如hGH)與另一個GH超基因家族成員或其變異體或非GH超基因家族成員或其變異體的任何其它多肽結合，直接或通過連接子而連接至多肽主鏈。由於其分子量相較於單體而言較高，因此GH超基因家族成員(諸如GH，例如hGH)二聚體或多聚體結合物可展現新的或所要的特性，其包括(但不限於)不同藥理特性、藥物代謝動力學特性、藥效特性、相對於單體GH超基因家族成員的經調節半衰期或經調節血漿半衰期。在一些實施例中，本發明的GH超基因家族成員(諸如GH，例如hGH)二聚體將調節GH超基因家族成員受體的二聚作用。在其它實施例中，本發明的GH超基因家族成員二聚體或多聚體將充當GH超基因家族成員受體拮抗劑、促效劑或抑揚第劑。
在一些實施例中，存在於含有二聚體或多聚體的GH(例如hGH)中的一個或一個以上GH(例如hGH)分子包含與存在於部位II結合區域內的水溶性聚合物相連接的非天然編碼的胺基酸。因而，二聚體或多聚體的各個分子易於通過部位I界面與GH(例如，hGH)多肽受體結合，但不可通過部位II界面與第二GH(例如，hGH)多肽受體結合。因此，GH(例如，hGH)多肽二聚體或多聚體可與兩個不同GH(例如，hGH)多肽受體中各受體的部位I結合部位結合，但由於GH(例如，hGH)多肽分子具有連接至存在於部位II區域中的非遺傳編碼胺基酸的水溶性聚合物，因此GH(例如，hGH)多肽受體無法與GH(例如，hGH)多肽配位體的部位II區域結合，且二聚體或多聚體充當GH(例如，hGH)多肽拮抗劑。在一些實施例中，存在於含有二聚體或多聚體的GH(例如hGH)中的一個或一個以上GH(例如hGH)分子包含與存在於部位I結合區域內的水溶性聚合物相連接的非天然編碼的胺基酸，以允許與部位II區域結合。或者，在一些實施例中，存在於含有二聚體或多聚體的GH(例如hGH)中的一個或一個以上GH(例如hGH)分子包含與不存在於部位I或部位II結合區域內的水溶性聚合物相連接的非天然編碼的胺基酸，以便使兩個區域均可結合。在一些實施例中，使用具有部位I可用、部位II可用或兩者均可用的GH(例如hGH)分子組合。GH(例如hGH)分子組合(其中至少一個分子具有可用於結合的部位I，且至少一個分子具有可用於結合的部位II)可提供具有所要活性或特性的分子。另外，同時具有可用於結合的部位I和部位II的GH(例如hGH)分子組合可產生超促效GH(例如hGH)分子。
在一些實施例中，GH超基因家族成員多肽(包括(但不限於))通過Asn-Lys胺鍵或Cys-Cys二硫化物而直接連接。在一些實施例中，經連接的GH超基因家族成員多肽和/或經連接的非GH超基因家族成員將包含不同的非天然編碼的胺基酸以便於二聚作用，其包括(但不限於)在第一GH(例如，hGH)多肽的一個非天然編碼的胺基酸中的炔基和在在第二GH超基因家族成員多肽的第二非天然編碼的胺基酸中的疊氮基將通過胡氏根[3+2]環加成結合連接。或者，第一GH超基因家族成員和/或經連接的非GH超基因家族成員、包含含酮基非天然編碼的胺基酸的多肽可結合連接至包含含羥胺非天然編碼的胺基酸的第二GH超基因家族成員多肽，這些多肽通過形成相應的肟而進行反應。
或者，兩個GH超基因家族成員多肽和/或經連接的非GH超基因家族成員通過連接子連接。可使用任何雜雙官能性或同雙官能性連接子來連接兩個GH超基因家族成員和/或經連接的非GH超基因家族成員、多肽(其可具有相同或不同的一級序列)。在一些實施例中，用於將GH超基因家族成員和/或經連接的非GH超基因家族成員、多肽連接在一起的連接子可為雙官能性PEG試劑。此連接子可具有寬廣範圍的分子量或分子長度。較大分子量或較小分子量的連接子可用於在GH超基因家族成員與連接實體之間、或GH超基因家族成員與GH超基因家族成員受體之間、或連接實體與GH超基因家族成員受體之間提供所要空間關係或構造。具有較長分子長度或較短分子長度的連接子也可用於在GH超基因家族成員與連接實體之間、或GH超基因家族成員與其受體之間、或連接實體與GH超基因家族成員受體之間提供所要空間和撓性。類似地，具有特殊形狀或構造的連接子可用於在GH超基因家族成員到達目標之前或之後對GH超基因家族成員或連接實體賦予特殊形狀或構造。這種對於GH超基因家族成員與連接實體之間的空間關係的優化可為分子提供新的、接調節的或所要的特性。
在一些實施例中，本發明提供水溶性雙官能性連接子，其具有啞鈴結構，此結構包括a)位於聚合物主鏈的至少第一端上的疊氮基、炔基、肼、醯肼、羥胺或含羰基部分；和b)位於聚合物主鏈第二端上的至少一個第二官能團。此第二官能團可與第一官能團相同或不同。在一些實施例中，第二官能團不與第一官能團反應。在一些實施例中，本發明提供包含分枝分子結構的至少一個臂的水溶性化合物。舉例而言，此分枝分子結構可為樹枝狀的。
在一些實施例中，本發明提供包含一個或一個以上GH超基因家族成員(諸如GH，例如hGH)的多聚體，其通過與具有以下結構的水溶性活化聚合物反應而形成R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，其中n為5至3,000，m為2至10，X可為疊氮基、炔基、肼、醯肼、氨基氧基、羥胺、乙醯基或含羰基部分，且R為封端基團、官能團或離去基團，其可與X相同或不同。R可為(例如)選自由下列各基團組成的群組的官能團羥基、經保護羥基、烷氧基、N-羥基丁二醯亞胺酯、1-苯並三唑基酯基、N-羥基丁二醯亞胺基碳酸酯、1-苯並三唑基碳酸酯、乙縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、活性碸、胺、氨基氧基、經保護胺、醯肼、經保護醯肼、經保護硫醇、羧酸、經保護羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、順丁烯二醯亞胺、乙烯碸、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙醯胺、環氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烴和酮。
XII.hGH多肽活性和hGH多肽對於hGH多肽受體的親和性的測量[586]可按照McFarland等人，Science，245第494-499頁(1989)和Leung，D.等人，Nature，330第537-543頁(1987)中所述製備hGH受體。hGH多肽活性可使用標準或已知的活體內或活體外檢定測定。舉例而言，在hGH存在情況下增殖的細胞系(例如表達hGH受體或催乳受體的細胞系)可用於監測hGH受體結合。參看例如Clark，R.等人，J.Biol.Chem.271(36)第21969頁(1996)；Wada等人，Mol.Endocrinol.12第146-156頁(1998)；Gout，P.W.等人Cancer Res.40，第2433-2436頁(1980)；WO 99/03887。對於包含非天然胺基酸的非PEG化或PEG化hGH多肽而言，激素對於其受體的親和性可通過使用BIAcoreTM生物傳感器(Pharmacia)來測量。參看例如美國專利第5,849,535號、Spencer，S.A.等人，J.Biol.Chem.，263第7862-7867頁(1988)。用於測試hGH活性的活體內動物模型包括那些在(例如)Clark等人，J.Biol.Chem.271(36)第21969-21977頁(1996)中所述的模型。可按照Cunningham，B.等人，Science，254第821-825頁(1991)和Fuh，G.等人，Science，256第1677-1680頁(1992)中所述進行對於包含一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的hGH多肽的二聚能力的檢定。所有引用的文獻和專利以引用的方式併入本文中。
關於檢定方法的文獻編輯並非詳盡無遺的，且所屬領域的技術人員將認可適用於測試所要最終結果的其它檢定。
XIII.對於效能、功能性活體內半衰期和藥物代謝動力學參數的測量本發明的一個重要方面為通過hGH多肽(在有或無多肽與水溶性聚合物部分的結合的情況下)的構造所獲得的延長的生物學半衰期。hGH多肽血清濃度的迅速降低已使得評估對於使用結合或非結合hGH多肽和其變異體的治療的生物反應具有重要性。在皮下或靜脈注射投藥後，本發明的結合或非結合hGH多肽和其變異體也可具有持久血清半衰期，使得通過(例如)ELISA方法或通過初級篩選檢定進行測量成為可能。可使用購自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的ELISA或RIA套組。如本文中所述進行活體內生物半衰期的測量。
包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽的效能和功能性活體內半衰期可根據Clark，R.等人，J.Biol.Chem.271(36)第21969-21977頁(1996)中所述的方法測定。
包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽的藥物代謝動力學參數可在普通Sprague-Dawley雄性大鼠(N＝5隻動物/治療組)中評估。動物將接受25μg/大鼠靜脈內或50μg/大鼠皮下的單次劑量，根據預先確定的時程(一般涵蓋對於包含非天然編碼的胺基酸、未與水溶性聚合物結合的GH(例如，hGH)多肽而言約6小時，而對於包含非天然編碼的胺基酸且與水溶性聚合物結合的GH(例如，hGH)多肽而言約4天)採集大約5至7份血樣。在若干物質中充分研究了GH(例如，hGH)多肽的藥物代謝動力學數據，且可將其與對於包含非天然編碼的胺基酸的GH(例如，hGH)多肽所獲得的數據直接進行比較。關於與GH(例如，hGH)多肽相關的研究，參看Mordenti J.等人，Pharm.Res.8(11)第1351-59頁(1991)。
藥物代謝動力學參數也可在靈長類動物(例如獼猴)中評估。通常，以皮下或靜脈內的方式投予單次注射，且隨時間監測血清GH(例如hGH)含量。關於進一步描述，參看例如「實例」。
在一些實施例中，本發明提供在以皮下方式投予哺乳動物時具有至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或16個小時以上的平均血清半衰期的GH(例如hGH)。在一些實施例中，本發明提供在以皮下方式投予哺乳動物時具有至少約0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或12個小時以上的平均血清半衰期的GH(例如hGH)。「平均」血清半衰期是至少三個動物、或至少四個動物、或至少五個動物、或五個以上動物的平均值。在一些實施例中，哺乳動物為大鼠；在一些實施例中，哺乳動物為靈長類動物，諸如獼猴，或諸如人類。在一些實施例中，本發明提供PEG化GH(例如PEG化hGH)，其在以皮下方式投予時具有相當於非PEG化形式GH(例如hGH)的平均血清半衰期至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或50倍以上的平均血清半衰期。在一些實施例中，本發明提供PEG化GH(例如PEG化hGH)，其在以靜脈內方式投予時具有相當於非PEG化形式GH(例如hGH)的平均血清半衰期至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或50倍以上的平均血清半衰期。「平均」血清半衰期是至少三個動物、或至少四個動物、或至少五個動物、或五個以上動物的平均值。在一些實施例中，哺乳動物為大鼠；在一些實施例中，哺乳動物為靈長類動物，諸如獼猴，或諸如人類。在一些實施例中，GH為GH(例如hGH)。在一些實施例中，生長激素通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接，其中所述共價鍵為肟鍵。GH可為GH(例如hGH)。在一些實施例中，GH(例如hGH)包括非天然編碼的胺基酸，諸如含羰基非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸為含酮基胺基酸，例如對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，GH(例如hGH)含有非天然編碼的胺基酸，例如在GH(例如hGH)中對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置上進行取代的對乙醯苯丙氨酸。水溶性聚合物可為PEG。合適PEG包括線性PEG和分枝PEG；可使用本文中所述的任何PEG。在特定實施例中，PEG為約0.1至100kDa、或約1至100kDa、或約10至50kDa、或約20至40kDa、或約30kDa的線性PEG。在一些實施例中，醫藥組合物含有通過肟鍵與30kDa的PEG相連接的GH(例如hGH)，其中所述肟鍵在位於對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置上的對乙醯苯丙氨酸與PEG之間。
根據本發明的GH(例如，hGH)多肽的特定活性可通過所屬領域中已知的多種檢定測定。根據本發明所獲得且純化的GH(例如，hGH)多肽突變型蛋白或其片段的生物活性可通過本文中所述或引用的方法、或所屬領域的技術人員已知的方法來測試。
XIV.投藥和醫藥組合物本發明的多肽或蛋白質(包括(但不限於)GH(例如hGH)、合成酶、包含一個或一個以上胺基酸的蛋白質等)視需要(包括(但不限於))與合適醫藥載劑組合用於治療用途。舉例而言，所述組合物包含治療有效量的化合物和醫藥學上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包括(但不限於)鹽水、經緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。使配方適於投藥。一般而言，投予蛋白質的方法對於所屬領域的技術人員為已知，且可應用於投予本發明的多肽。
在一些實施例中，本發明提供含有激素組合物(其包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素，其中所述共價鍵為肟鍵)的醫藥組合物；以及醫藥學上可接受的賦形劑。GH可為hGH。在一些實施例中，GH(例如hGH)包括非天然編碼的胺基酸，諸如含羰基非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸為含酮基胺基酸，例如對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，GH(例如hGH)含有非天然編碼的胺基酸，例如在GH(例如hGH)中對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置上進行取代的對乙醯苯丙氨酸。水溶性聚合物可為PEG。合適PEG包括線性PEG和分枝PEG；可使用本文中所述的任何PEG。在特定實施例中，PEG為約0.1至100kDa、或約1至100kDa、或約10至50kDa、或約20至40kDa、或約30kDa的線性PEG。在一些實施例中，醫藥組合物含有通過肟鍵與30kDa的PEG相連接的GH(例如hGH)，其中所述肟鍵在位於對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置上的對乙醯苯丙氨酸與PEG之間。
根據所屬領域的技術人員已知的方法，視需要在一個或一個以上適當的活體內和/活體外動物疾病模型中測試本發明的包含一個或一個以上多肽的治療組合物，以確認效能、組織新陳代謝且估算劑量。具體來說，可通過本文中非天然胺基酸相對於天然胺基酸同源物(包括(但不限於)經修飾以包括一個或一個以上非天然胺基酸的GH(例如，hGH)多肽與天然胺基酸GH(例如，hGH)多肽的比較)，即在相關檢定中的活性、穩定性或其它合適量度來初步確定劑量。
通過通常用於將分子引入與血液或組織細胞的最終接觸的任何途徑進行投藥。以任何合適方式投予本發明的非天然胺基酸多肽，視需要使用一種或一種以上醫藥學上可接受的載劑。在本發明文中投予所述多肽的合適方法是可用的，且儘管可使用一種以上的途徑來投予特定組合物，但特定途徑通常可提供相較於其它途徑更直接且更有效的作用或反應。
醫藥學上可接受的載劑在某種程度上由所投予的特定組合物以及用於投予所述組合物的方法而確定。因此，本發明的醫藥組合物存在多種合適的配方。
本發明的hGH多肽(包括(但不限於)PEG化hGH)可通過任何適用於蛋白質和多肽的常規途徑投予，這些途徑包括(但不限於)非經腸方式，例如注射或輸注(包括(但不限於)皮下或靜脈內或任何其它形式的注射或輸注。多肽組合物可通過若干途徑投予，這些途徑包括(但不限於)經口腔、靜脈內、腹膜內、肌肉內、經皮、皮下、局部、舌下或直腸方式。包含非天然胺基酸多肽的組合物(經修飾或未經修飾)也可經由脂質體投予。所述投藥途徑和適當配方對於所屬領域的技術人員通常為已知。包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽(包括(但不限於)PEG化hGH)可單獨使用或與其它合適組分(諸如醫藥載劑)結合使用。
也可將包含非天然胺基酸的GH(例如，hGH)多肽單獨地或與其它合適組分結合制於氣溶膠配方中(即其可為「噴霧狀」)，以經由吸入投予。可將氣溶膠配方置於加壓的可接受推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等。
適用於非經腸投藥(諸如通過關節內、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內和皮下途徑)的配方包括水性和非水性的等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使得此配方與預期接受者的血液等張的溶質；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。hGH的配方可存在於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和管瓶)中。
非經腸投藥和靜脈內投藥為優選投藥方法。具體來說，已用於天然胺基酸同源物治療(包括(但不限於)那些用於EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白細胞間介素、抗體和/或任何其它以醫藥方式傳遞的蛋白質)的投藥途徑，連同當前所用的配方，提供優選投藥途徑和本發明多肽的優選配方。
根據應用，在本發明文中投予患者的劑量足以隨時間在患者體內具有有益的治療反應或其它適當活性。通過特定載體或配方的效能、所用非天然胺基酸多肽的活性、穩定性或血清半衰期、患者的病症以及待治療患者的體重和表面積確定劑量。也通過伴隨在特定患者體內投予特定載體、配方等的任何不利副作用的存在、性質和程度來確定劑量大小。
在確定於疾病(包括(但不限於)癌症、遺傳性疾病、糖尿病、AIDS或類似疾病)的治療或預防中待投予的載體或配方的有效量時，醫師評估循環血漿水平、配方毒性、疾病的進程和/或在何處產生抗非天然胺基酸多肽抗體。
對於(例如)70千克的患者所投予的劑量通常在與當前所用針對相應組合物的改變活性或血清半衰期進行調節的治療蛋白的劑量相等的範圍內。本發明的載體或配方可通過任何已知常規治療(包括投予抗體、投予疫苗、投予細胞毒素劑、天然胺基酸多肽、核酸、核苷酸同源物、生物反應修飾劑等)對治療狀況進行補充。
對於投藥而言，按照通過相應配方的LD-50或ED-50和/或對(包括(但不限於))如對應於患者的的質量和整體健康應用時各種濃度下非天然胺基酸的任何副作用的觀測所確定的比率投予本發明的配方。可通過單次劑量或分次劑量完成投藥。
如果經受配方輸注的患者患上發燒、受寒或肌肉疼痛，那麼他/她可服用適當劑量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它解熱鎮痛藥。對於輸注有反應(諸如發燒、肌肉疼痛或受寒)的患者在繼續輸注阿司匹林(aspirin)、醋氨酚(acetaminophen)或(包括(但不限於))苯海拉明(diphenhydramine)之前前驅用藥30分鐘。度冷丁(Meperidine)是用於不能對解熱藥和抗組胺劑作出快速反應的更嚴重受寒和肌肉疼痛。根據反應的嚴重程度減緩或停止細胞輸注。
本發明的人類GH多肽可直接投予哺乳動物受檢者。通過任何常用於將hGH多肽引入受檢者的途徑進行投藥。根據本發明實施例的hGH多肽組合物包括那些適用於口腔、直腸、局部、吸入(包括(但不限於)經由氣溶膠)、頰內(包括(但不限於)舌下)、陰道、非經腸(包括(但不限於)皮下、肌肉內、皮內、關節內、胸膜內、腹膜內、腦內、動脈內或靜脈內)、局部(即皮膚和黏膜表面，包括氣管表面)和經皮投藥的組合物，然而在任何給定情況下的最合適途徑將視所治療病症的性質和嚴重程度而定。投藥可為局部的或全身的。化合物的配方可存在於單劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和管瓶)中。本發明的GH(例如，hGH)多肽以單位劑量可注射形式(包括(但不限於)溶液、懸浮液或乳濁液)與醫藥學上可接受的載劑在混合物中製備。本發明的GH(例如，hGH)多肽也可通過連續輸注(使用包括(但不限於)小型真空泵(諸如滲透泵))、獨立大丸劑或緩釋儲庫型配方投予。
適於投藥的配方包括水性和非水性溶液、等張無菌溶液，其可含有使得此配方等張的抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和溶質；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。溶液和懸浮液可由先前所述種類的無菌粉末、顆粒和片劑製備。
冷凍乾燥是一種常用於表達蛋白質的技術，其用於從所述蛋白質製備中移除水分。冷凍乾燥或凍幹法是一種將待乾燥的材料首先冷凍接著通過在真空環境中升華將冰或冷凍溶劑移除的方法。在預先凍幹配方中可能包括賦形劑，以增強冷凍乾燥過程期間的穩定性且/或改良凍乾產物在存儲時的穩定性。Pikal，M.Biopharm.3(9)第26-30頁(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3)第285-291頁(1991)。
藥物的噴霧乾燥對於所屬領域的技術人員也為已知。舉例而言，參看Broadhead，J.等人在Drug Dev.hid.Pharm，18(1112)，第1169-1206頁(1992)中的″The Spray Dryingof Pharmaceuticals，″。除了小分子藥物以外，已將多種生物材料噴霧乾燥，且這些材料包括酶、血清、血漿、微生物和酵母。噴霧乾燥是一種適用的技術，因為其可在一步過程中使液體藥物製備轉化為精細、無塵或凝聚的粉末。基本技術包含下列四個步驟a)將饋料溶液霧化為噴霧；b)噴霧-空氣接觸；c)噴霧乾燥；d)將經乾燥產物與乾燥空氣分離。美國專利第6,235,710號和第6,001,800號(其以引用的方式併入本文中)描述通過噴霧乾燥製備重組促紅細胞生成素。
本發明的醫藥組合物可包含醫藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑。醫藥學上可接受的載劑在某種程度上通過所投予的特定組合物以及用於投予所述組合物的特定方法確定。因此，本發明的醫藥組合物存在多種合適配方(包括視需要的醫藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑)(參看例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版本，1985))。
合適載劑包括緩衝劑，其含有丁二酸、磷酸、硼酸、HEPES、檸檬酸、組氨酸或組氨酸衍生物、咪唑、乙酸、重碳酸和其它有機酸；抗氧化劑，其包括(但不限於)抗壞血酸；低分子量多肽，其包括(但不限於)那些小於約10個殘基的多肽；蛋白質，其包括(但不限於)血清白蛋白、動物膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，其包括(但不限於)聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，其包括(但不限於)甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、精氨酸、組氨酸或組氨酸衍生物、甲硫氨酸、穀氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，其包括(但不限於)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，其包括(但不限於)EDTA；二價金屬離子，其包括(但不限於)鋅離子、鈷離子或銅離子；糖醇，其包括(但不限於)甘露醇或山梨醇；成鹽反離子，其包括(但不限於)TweenTM(包括(但不限於)Tween 80(聚山梨酸酯80)和Tween 20(聚山梨酸酯20)、PluronicsTM和其它聚醚酸，其包括(但不限於)聚醚酸F68(泊洛沙姆(poloxamer)188)或PEG。合適表面活性劑包括(例如但不限於)基於聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-poly(氧化乙烯)(即(PEO-PPO-PEO))或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)(即(PPO-PEO-PPO))或其組合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO可以商標PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.，Wyandotte，Mich.)購得，且進一步在美國專利第4,820,352號(其全文以引用的方式併入本文中)中描述。其它乙烯/聚乙烯嵌段聚合物可為合適的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用於針對一種或一種以上壓力(其包括(但不限於)由攪動導致的壓力)使PEG化hGH穩定。上述有些試劑可稱為「膨脹劑」。有些也可稱為「緊張性修飾劑」。
本發明的GH(例如，hGH)多肽(其包括那些與諸如PEG的水溶性聚合物相連接的GH)也可通過持續釋放系統或作為持續釋放系統的一部分來投予。持續釋放組合物包括(但不限於)成形物品形式(其包括(但不限於)薄膜或微膠囊)的半透性聚合物基質。持續釋放基質包括生物相容材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15第267-277頁(1981)；Langer，Chem.Tech.，12第98-105頁(1982))、乙烯基乙酸乙酯(Langer等人，見上文)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美國專利第3,773,919號；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酐、L-穀氨酸和γ-乙基-L-穀氨酸酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22，第547-556頁(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、多聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和矽酮。持續釋放組合物也包括以脂質體包被的化合物。通過下列自身已知的方法製備含有此化合物的脂質體DE 3,218,121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82第3688-3692頁(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77第4030-4034頁(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美國專利第4,619,794號；EP 143,949；美國專利第5,021,234；日本專利申請案第83-11 8008號；美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；以及EP 102,324。所有引用的文獻和專利以引用的方式併入本文中。
通過例如下列文獻和專利中所述的方法可製備以脂質體包被的GH(例如，hGH)多肽DE 3,218,121；Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82第3688-3692頁(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77第4030-4034頁(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美國專利第4,619,794號；EP 143,949；美國專利第5,021,234號；日本專利申請案第83-118008號；美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；以及EP 102,324。脂質體的組成和大小為人熟知或能夠由所屬領域的技術人員容易地以實驗方式測定。脂質體的一些實例在例如以下文獻和專利中描述Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92第1327-1331頁(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(eds)MEDICALAPPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人在Teicher B(ed)CANCERDRUGDISCOVERY ANDDEVELOPMENT(2002)中的Liposomal drug delivery systems forcancer therapy；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8第1172-1181頁(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3)第109-118頁(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63第3154-3161頁(2003)。所有引用的文獻和專利以引用的方式併入本文中。
在本發明文中投予患者的劑量應足以隨時間在患者體內引起有益反應。一般而言，每劑中非經腸投予的本發明GH(例如，hGH)多肽的醫藥學上有效總量在以患者體重計約0.01μg/kg/日至約100μg/kg、或約0.05mg/kg至約1mg/kg的範圍內，然而這應視療法而定。給藥頻率也應視療法而定，且相較於經認可適用於人類的市售GH(例如，hGH)多肽產品而言，其頻率可能更高或更低。一般而言，可通過上述任何投藥途徑來投予本發明的PEG化GH(例如，hGH)多肽。在一些實施例這，本發明提供一種組合物，其在本文中所述的對於存儲和給藥服法足夠穩定的醫藥組合物中包含本文中所述的任何GH(例如，hGH)多肽。測試穩定性的方法在所屬領域中為已知。
XV.本發明的GH(例如，hGH)多肽的治療用途本發明的GH(例如，hGH)多肽適用於治療各種病症。
本發明的GH(例如，hGH)促效劑多肽可適用於(例如)治療生長缺陷、免疫失調，且適用於促進心臟功能。患有生長缺陷的個體包括(例如)患有特納氏綜合症(Turner′sSyndrome)的個體、GH缺陷個體(包括兒童)、在生長板閉合前經歷約2至3年其正常生長曲線出現生長緩慢或延遲的兒童(有時也稱為「矮小正常兒童」)和其中已用化學方式(即通過糖皮質激素治療)或通過自然條件(諸如在其中IGF-I對GH的反應自然減少的成年患者中)阻斷胰島素樣生長因子(IGF-I)對GH的反應的個體。本發明的hGH多肽可適用於治療患有下列病症的個體兒科生長激素缺乏症、特發性身材矮小、兒童期發作的成年人生長激素缺乏症、成年期發作的成年人生長激素缺乏症或繼發性生長激素缺乏症。經診斷患有成年期生長激素缺乏症的成年人可能具有垂體腫瘤或放射物。病症(包括(但不限於)代謝綜合症、顱腦損傷、肥胖症、骨質疏鬆症或抑鬱症)可能會導致成年人中的類似生長激素缺乏的症狀。
促效劑GH(例如，hGH)變異體可以通過增加哺乳動物的免疫功能起作用以刺激其免疫系統，無論此增加是由於抗體調節還是細胞調節，且無論免疫系統對於經GH(例如，hGH)多肽治療的宿主為內源性的還是從供體移植至接受GH(例如，hGH)多肽的宿主受體(如在骨髓移植中)。「免疫失調」包括其中個體的免疫系統具有少於正常的免疫系統的對抗原的抗體或細胞反應的任何病症，包括(但不限於)那些由於藥物(例如化學治療)治療而小脾免疫性降低的個體。患有免疫失調的個體的實例包括(例如)老年患者、經受化學治療或放射治療的個體、重病初愈的個體或將要接受外科手術的個體、患有AIDS的個體、患有先天性和後天性B細胞缺乏症(諸如低丙種球蛋白血症、常見變體丙種球蛋白缺乏症和選擇性免疫球蛋白缺乏症(例如IgA缺乏症))的患者、受諸如狂犬病病毒的病毒(其具有相較於患者的免疫反應更短的潛伏時間)感染的患者；和患有遺傳性失調症(諸如diGeorge綜合症)的患者。
本發明的GH(例如，hGH)拮抗劑多肽可用於治療巨人症和肢端肥大症、糖尿病和由糖尿病產生的併發症(糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病變)、血管性眼病(例如包括增生性血管再生)、腎病和GH反應性惡性腫瘤。
血管性眼病包括(例如)視網膜病(由(例如)早產兒貧血病或鐮狀細胞貧血症引起)和黃斑變性。
GH反應性惡性腫瘤包括(例如)威爾姆氏腫瘤(Wilm′s tumor)、肉瘤(例如，骨源性肉瘤)、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌，以及表達GH受體mRNA的組織的癌症(即，胎盤、胸腺、腦、唾液腺、前列腺、骨髓、骨骼肌、氣管、脊髓、視網膜、淋巴結的癌和來自伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、結直腸癌、肺癌、淋巴性白血病和黑素瘤的癌症)。
舉例而言，本發明的GH(例如，hGH)促效劑多肽可用於治療慢性腎衰竭、與慢性腎機能不全(CRI)相關的生長障礙、與特納氏綜合症(Turner′s Syndrome)相關的身材矮小、兒科普來德-威利綜合症(Prader-Willi Syndrome)(PWS)、患有消瘦或惡病質的HIV患者、小於孕齡(SGA)出生的兒童、肥胖症和骨質疏鬆症。
GH(例如，hGH)的平均量可改變，且尤其應以合格醫師的推薦和處方為基礎。GH(例如，hGH)的準確量是一個關於優選的問題，其為以下因素所支配所治療病症的準確類型、所治療患者的病症以及組合物中的其它成份。本發明也提供治療有效量的另一種活性劑的投藥。可由所屬領域的技術人員基於使用hGH的治療容易地確定待投予的量。
本發明的醫藥組合物可用常規方式製造。
在一些實施例中，本發明提供一種治療方法，其包括將有效量的激素組合物投予需要治療的個體，所述激素組合物含有通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述共價鍵為肟鍵。在一些實施例中，所述方法包括將GH(例如，hGH)投予個體(例如人類)。在一些實施例中，GH(例如，hGH)包括非天然編碼的胺基酸，諸如含羰基的非天然編碼的胺基酸。在一些實施例中，非天然編碼的胺基酸為含酮基的胺基酸，例如對乙醯苯丙氨酸。在一些實施例中，GH(例如hGH)含有非天然編碼的胺基酸，例如在GH(例如hGH)中對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置上進行取代的對乙醯苯丙氨酸。水溶性聚合物可為PEG。合適PEG包括線性PEG和分枝PEG；可使用本文中所述的任何PEG。在特定實施例中，PEG為約0.1至100kDa、或約1至100kDa、或約10至50kDa、或約20至40kDa、或約30kDa的線性PEG。在一些實施例中，醫藥組合物含有通過肟鍵與30kDa的PEG相連接的GH(例如hGH)，其中所述肟鍵在位於對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置上的對乙醯苯丙氨酸與PEG之間。在一些實施例中，受治療的個體患有兒科生長激素缺乏症、特發性身材矮小、兒童期發作的成年人生長激素缺乏症、成年期發作的成年人生長激素缺乏症或繼發性生長激素缺乏症。
如本文中所述且如所屬領域中已知，可以任何合適形式、途徑、劑量、頻率和持續時間將GH(例如，hGH)投予個體。在一些實施例中，本發明提供一種治療方法，其包括將有效量的激素組合物投予需要治療的個體，所述激素組合物含有通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述水溶性聚合物為線性聚合物，且其中所述激素組合物是以每隔一天僅約一次，或每3天、4天、5天或6天一次，每周一次，每8天、9天、10天、11天、12天或13天一次，每兩周一次，每15天、16天、17天、18天、19天或20天一次，每三周一次，每22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天一次，每月一次或小於約每月一次的頻率給藥。應了解，投藥頻率可根據個體或(更通常)治療專家的判斷而改變，且可使用任何頻率組合。在一些實施例中，GH組合物是以每周僅約一次、每兩周一次、每三周一次或每月一次的頻率投予。在一些實施例中，GH組合物是以每周僅約一次、每兩周一次或每月一次的頻率投予。在一些實施例中，GH組合物是以每周僅約一次的頻率投予。在一些實施例中，GH組合物是以每兩周僅約一次的頻率投予。在一些實施例中，GH組合物是以每月僅約一次的頻率投予。
本發明也提供治療有效量的另一種活性劑連同本發明的hGH一起的投藥。可由所屬領域的技術人員基於使用hGH的治療容易地確定待投予的量。
本發明的醫藥組合物可用常規方式製造。
實例提供下列實例來說明(但不限制)所主張的發明。
實例1此實例描述多種用於選擇將非天然編碼的胺基酸併入hGH中的優選部位的潛在標準設置中的一種。
此實例展示如何選擇hGH多肽中的優選部位，以用於引入非天然編碼的胺基酸。將由與受體(hGHbp)細胞外域的兩個分子複合的hGH組成的晶體結構3HHR用於確定可引入一個或一個以上非天然編碼的胺基酸的優選位置。利用其它hGH結構(例如，1AXI)檢驗晶體結構數據集之間的一級和二級結構元素的潛在改變。這些結構的坐標可從蛋白質資料庫(PDB)(Bernstein等人J.Mol.Biol.1997，112，第535頁)獲得，或經由www.rcsb.org上的The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB獲得。結構化模型3HHR含有完整成熟的22kDa hGH序列，但殘基148至153和C端F191殘基除外(由於在晶體結構不規則而將其忽略)。存在兩個由C53和C165以及C182和C185形成的二硫橋鍵。在此實例中所用的序列編號與SEQ ID NO2中所示的成熟hGH(22kDa變異體)的胺基酸序列相對應。
使用下列標準來估算用於引入非天然編碼的胺基酸的各hGH位置殘基(a)不應幹擾基於3HHR、1AXI和1HWG(與hGHbp單體或二聚體結合的hGH的結晶學結構)的結構分析的hGHbp結合，(b)不應受丙氨酸或同系物掃描突變的影響(Cunningham等人Science(1989)2441081-1085和Cunningham等人Science(1989)2431330-1336)，(c)應為表面暴露的且展現與周圍殘基的範德華力(van der Waals)或氫鍵鍵合相互作用為最小，(d)在hGH變異體中應缺失或應為可變的(例如Tyr35、Lys38、Phe92、Lys140)，(e)在經非天然編碼的胺基酸取代後將導致保守性變化，(f)可見於高度撓性的區域(包括(但不限於)CD環)中或結構上為剛性的區域(包括(但不限於)螺旋B)中。此外，利用Cx程序(Pintar等人(2002)Bioinformatics，18，第980頁)針對hGH分子進行其他計算，以估算各蛋白質原子的凸出程度。因此，在一些實施例中，在(但不限於)hGH的下列位置中的一個或多個位置處將一個或一個以上非天然編碼的胺基酸併入位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中的相應胺基酸)。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(SEQ IDNO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置30、74、103(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。在一些實施例中，在一個或一個以上下列位置處位置35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)，用一個或一個以上非天然編碼的胺基酸取代。
在一些實施例中，在包括(但不限於)下列位置的這些位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、 141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白質的羧基端)(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3的相應胺基酸)。在一些實施例中，在包括(但不限於)下列位置的這些位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)。
在一些實施例中，在包括(但不限於)下列位置的這些位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)。
在一些實施例中，在包括(但不限於)下列位置的這些位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)。
在一些實施例中，在包括(但不限於)下列位置的這些位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置30、74、103(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)。在一些實施例中，在所述位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的相應胺基酸)。在一些實施例中，在所述位置中的一個或一個以上位置處的非天然存在的胺基酸與水溶性聚合物相連接位置35、92、143、145(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的相應胺基酸)。
一些用於產生hGH拮抗劑的部位包括位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或在位置1前的添加，或其任何組合(SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或任何其它GH序列中的相應胺基酸)。利用促效劑設計的標準(c)-(e)選擇這些部位。拮抗劑設計也可包括部位I殘基的定點修飾，以增加對hGHbp的結合親和性。
實例2此實例詳細描述hGH多肽(包括大腸桿菌(E.coli)中的非天然編碼的胺基酸)的克隆和表達。此實例也描述一種用於評估經修飾hGH多肽的生物活性的方法。
在美國專利第4,601,980號；第4,604,359號；第4,634,677號；第4,658,021號；第4,898,830號；第5,424,199號和第5,795,745號中詳細描述用於克隆hGH和其片段的方法，所述專利是以引用的方式併入本文中。在SEQ ID NO21和SEQ ID NO22中分別顯示編碼全長hGH或缺少N端信號序列的hGH成熟形式的cDNA。
使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)的引入翻譯系統來表達含有非天然編碼的胺基酸的hGH。O-RS優選地使具有非天然編碼的胺基酸的O-tRNA氨基醯化。所述翻譯系統又響應於所編碼的選擇密碼子，將非天然編碼的胺基酸插入hGH中。
表2O-RS和O-tRNA序列。


用含有經修飾hGH基因和正交氨醯基tRNA合成酶/tRNA對(對於所要非天然編碼的胺基酸為特異性的)的質粒轉化大腸桿菌(E.coli)以允許將非天然編碼的胺基酸部位特異性地併入hGH多肽中。經轉化大腸桿菌(E.coli)(在37℃下於含有0.01至100mM的特定非天然編碼的胺基酸的培養基中生長)以高保真度和高效率表達經修飾的hGH。含有非天然編碼的胺基酸的經His標記的hGH以內含體或聚集體的形式由大腸桿菌(E.coli)宿主細胞產生。在6M胍HCl中於變性條件下將所述聚集體溶解且親和純化。通過在4℃下於50mM TRIS-HCl，pH8.0，40μM CuSO4和2％(w/v)N-十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)中過夜透析進行重摺疊。接著將所述材料對20mM TRIS-HCl，pH8.0，100mM NaCl，2mM CaCl2透析，繼而移除His標記。參看Boissel等人，(1993)J.Bio.Chem.26815983-93。用於hGH純化的方法對於所屬領域的技術人員而言為已知的，且是通過SDS-PAGE、西方墨點分析或電噴霧離子阱質譜等來確認。
圖6為經純化hGH多肽的SDS-PAGE。使用ProBond鎳螯合樹脂(Invitrogen，Carlsbad，CA)經由由製造商提供的標準His標記蛋白純化程序，繼而通過陰離子交換柱來純化經His標記的突變體hGH蛋白，然後加載至凝膠上。色帶1顯示分子量標記，且色帶2表示未併入非天然胺基酸的N-His hGH。色帶3至10含有N-His hGH突變體，其分別在位置Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143和K145中的各位置上包含非天然胺基酸對乙醯苯丙氨酸。
為進一步評估經修飾hGH多肽的生物活性，使用對hGH與其受體相互作用的下遊標記進行測量的檢定。hGH與其內源性產生的受體的相互作用導致轉錄家族成員的信號轉導子和激活子(STAT5)在人類IM-9淋巴細胞系中發生酪氨酸磷酸化。從IM-9 cDNA庫中鑑別STAT5的兩種形式，STAT5A和STAT5B。參看例如Silva等人，Mol.Endocrinol.(1996)10(5)第508-518頁。由於大鼠生長激素或人類催乳激素均不導致可檢測的STAT5磷酸化作用，所以IM-9細胞上的人類生長激素受體對於人類生長激素是選擇性的。重要的是，大鼠GHR(L43R)細胞外域和具有hGH的G120R有效地競爭hGH刺激的pSTAT5磷酸化。
用本發明的hGH多肽刺激IM-9細胞。人類IM-9淋巴細胞是購自ATCC(Manassas，VA)，且使其在補充有丙酮酸鈉、青黴素、鏈黴素(Invitrogen，Carlsbad，San Diego)和10％熱失活胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640中生長。將IM-9細胞在檢定培養基(不含酚紅的RPMI、10mM Hepes、1％熱失活的經炭/葡聚糖處理的FBS、丙酮酸鈉、青黴素和鏈黴素)中飢餓一夜，隨後在37℃下用12點劑量範圍的hGH多肽刺激10分鐘。用1％甲醛固定經刺激細胞，之後用90％冰冷甲醇在冰上透化1小時。通過在室溫下使用初級磷酸化STAT5抗體(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)進行細胞內染色30分鐘，接著用PE結合二級抗體染色，從而檢測STAT5磷酸化水平。利用FACSArray進行樣品採集，用Flowjo軟體(Tree Star Inc.，Ashland，OR)分析所採集的數據。根據利用SigmaPlot以平均螢光強度(MFI)相對蛋白質濃度所繪製的劑量響應曲線得到EC50值。
下文表3概述所產生的關於突變體hGH多肽的IM-9數據。使用所述人類IM-9細胞來測試在不同位置處具有非天然胺基酸取代的各種hGH多肽。特定而言，圖7，A圖顯示經His標記的hGH多肽的IM-9數據，且圖7，B圖顯示經His標記的hGH(包含取代Y143的非天然胺基酸對乙醯苯丙氨酸)的IM-9數據。使用同樣的檢定來評估包含非天然胺基酸的PEG化hGH多肽的生物活性。


實例3此實例詳細描述含羰基的胺基酸的引入以及隨後與含氨基氧基的PEG的反應。
此實例展示一種用於產生hGH多肽的方法，所述hGH多肽中併入含酮基的非天然編碼的胺基酸，其隨後與分子量大約為5,000的含氨基氧基的PEG發生反應。根據實例1(hGH)的標準所確定的殘基35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、120、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155中的各者獨立地經具有下列結構的非天然編碼的胺基酸取代

用於將對乙醯苯丙氨酸部位特異性地併入hGH中的序列為SEQ ID NO2(hGH)Tyr和SEQ ID NO4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNACUA)和16、17或18(TyrRS LW1、5或6)(上文實例2中所述)。
一旦經修飾後，包含含羰基胺基酸的hGH多肽變異體即與以下形式的含氨基氧基的PEG衍生物反應R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2其中R為甲基，n為3且N為大約5,000的分子量。使以10mg/mL溶解於25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)pH6.0、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)pH7.0或10mM乙酸鈉(Sigma Chemical，St.Louis，MO)pH4.5中的經純化的含有對乙醯苯丙氨酸的hGH與10至100倍過量的含氨基氧基的PEG反應，接著在室溫下攪拌10至16小時(Jencks，W.J.Am.Chem.Soc.1959，81，第475頁)。接著將PEG-hGH稀釋至合適緩衝液中，以供立即純化和分析。
實例4與包括通過醯胺鍵與PEG相連接的羥胺基團的PEG的結合。
使用實例3中所述的程序使具有下列結構的PEG試劑與含酮基的非天然編碼的胺基酸偶合R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2.
其中R＝甲基，n＝4且N為大約20,000的分子量。反應條件、純化條件和分析條件如實例3中所述。
實例5此實例詳細描述將兩種不同的非天然編碼的胺基酸併入hGH多肽中。
此實例說明一種用於產生hGH多肽的方法，所述hGH多肽中併入在下列殘基中的兩個位置處包含酮基官能團的非天然編碼的胺基酸E30、E74、Y103、K38、K41、K140和K145。除了在核酸內的兩個不同部位處引入選擇密碼子以外，按照實例1和2中所述製備hGH多肽。
實例6此實例詳細描述hGH多肽與含醯肼的PEG的結合和隨後的原位還原。
根據實例2和3中所述的程序製備其中併入含羰基胺基酸的hGH多肽。一旦經修飾後，具有下列結構的含醯肼PEG即與所述hGH多肽結合R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2，其中R＝甲基，n＝2且N＝10,000的分子量，且X為羰基(C＝O)。使經純化的含有對乙醯苯丙氨酸的hGH以0.1-10mg/mL之間的濃度溶解於25mM MES(SigmaChemical，St.Louis，MO)pH6.0、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)pH7.0或10mM乙酸鈉(Sigma Chemical，St.Louis，MO)pH4.5中，使其與1至100倍過量的含醯肼PEG反應，並且通過添加溶解於H2O中的儲備1M NaCNBH3(Sigma Chemical，St.Louis，MO)直到10至50mM的最終濃度使相應腙原位還原。在暗處於4℃到室溫下反應18至24小時。通過添加1M Tris(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH值為約7.6)直至50 mM的最終Tris濃度來中止反應，或將反應物稀釋至合適緩衝液中以供立即純化。
實例7此實例詳細描述將含炔基的胺基酸引入hGH多肽中以及以mPEG-疊氮化物衍生化。
以下殘基35、88、91、92、94、95、99、101、131、133、134、135、136、140、143、145和155各自經下列非天然編碼的胺基酸(hGH；SEQ ID NO2)取代 用於將對炔丙基酪氨酸部位特異性地併入hGH中的序列為SEQ ID NO2(hGH)、TyrSEQ ID NO4(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNACUA)和9、10或11(上文實例2中所述)。在大腸桿菌(E.coli)中表達含有炔丙基酪氨酸的hGH多肽，且使用實例3中所述的條件將其純化。
使經純化的含有炔丙基酪氨酸的hGH以0.1至10mg/mL溶解於PB緩衝液(100mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pH＝8)中，且將10至1000倍過量的含疊氮基的PEG添加至反應混合物中。接著將催化量的CuSO4和Cu絲添加至反應混合物中。在培養所述混合物(包括(但不限於)室溫下或37℃下約4小時，或4℃下過夜)之後，添加H2O且通過透析膜過濾所述混合物。可通過(包括(但不限於))實例3中所述的程序分析此樣品的加成。
在此實例中，PEG將具有下列結構R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3，其中R為甲基，n為4且N為10,000的分子量。
實例8此實例詳細描述在hGH多肽中大型疏水性胺基酸經炔丙基酪氨酸取代。
存在於hGH下列區域中的一區域內的Phe、Trp或Tyr殘基1-5(N端)、6-33(螺旋A)、34-74(螺旋A與螺旋B之間的區域，A-B環)、75-96(螺旋B)、97-105(螺旋B與螺旋C之間的區域，B-C環)、106-129(螺旋C)、130-153(螺旋C與螺旋D之間的區域，C-D環)、154-183(螺旋D)、184-191(C端)(SEQ ID NO2)，如實例7中所述經下列非天然編碼的胺基酸取代
一旦經修飾後，PEG即連接至包含含炔基胺基酸的hGH多肽變異體。所述PEG將具有下列結構Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3，且偶合程序將遵循實例7中的程序。此將產生包含與天然存在的大型疏水性胺基酸中的一種大致同配(isosteric)的非天然編碼的胺基酸的hGH多肽變異體，且其在多肽內的不同部位處經PEG衍生物修飾。
實例9此實例詳細描述為一個或一個以上PEG連接子所隔開的hGH多肽同源二聚體、雜二聚體、同源多聚體或雜多聚體的產生。
使實例7中所製造的含炔基hGH多肽變異體與以下形式的雙官能PEG衍生物反應N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3，其中n為4且PEG具有大約5,000的平均分子量，以產生相應的hGH多肽同源二聚體，其中兩個hGH分子實體上為PEG所隔開。以類似的方式，可使hGH多肽與一個或一個以上的其它多肽偶合，以形成雜二聚體、同源多聚體或雜多聚體。將如同實例7和3般進行偶合、純化和分析。
實例10此實例詳細描述糖類部分與hGH多肽的偶合。
下列殘基中的一殘基29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(hGH，SEQ ID NO2)，如實例3中所述經下列非天然編碼的胺基酸取代
一旦經修飾後，包含含羰基胺基酸的hGH多肽變異體，即與N-乙醯氨基葡萄糖(GlcNAc)的β連接氨基氧基類似物反應。將hGH多肽變異體(10mg/mL)和氨基氧基糖類(21mM)在水性100mM乙酸鈉緩衝液(pH5.5)中混合，且在37℃下培養7至26小時。通過於環境溫度下將糖類結合hGH多肽(5mg/mL)與UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖基轉移酶(galacytosyltransferase)(0.4單位/mL)一起在150mM HEPES緩衝液(pH7.4)中培養48小時，以酶促方式使第二糖類偶合至第一糖類(Schanbacher等人J.Biol.Chem.1970，245，5057-5061)。
實例11此實例詳細描述PEG化hGH多肽拮抗劑的產生。
下列殘基中的一殘基1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123或127(hGH，SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1或3中的相應胺基酸)，如實例3所述經下列非天然編碼的胺基酸取代。
一旦經修飾後，包含含羰基胺基酸的hGH多肽變異體就將與以下形式的含氨基氧基的PEG衍生物反應R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，其中R為甲基，n為4且N為20,000的分子量，以產生包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽拮抗劑，其在多肽內的單一部位處經PEG衍生物修飾。如同實例3般進行偶合、純化和分析。
實例12其中hGH分子為直接連接的hGH多肽同源二聚體、雜二聚體、同源多聚體或雜多聚體的產生包含含炔基胺基酸的hGH多肽變異體可直接偶合至另一包含含疊氮基胺基酸的hGH多肽變異體，其各自包含在(包括(但不限於))實例10中所述部位上的非天然編碼的胺基酸取代。此將產生相應的hGH多肽同源二聚體，其中兩個hGH多肽變異體在部位II結合界面處實體連接。以類似的方式，可使hGH多肽偶合至一個或一個以上的其它多肽，以形成雜二聚體、同源多聚體或雜多聚體。如同實例3、6和7般進行偶合、純化和分析。
實例13PEG-OH+Br-(CH2)n-C≡CR』→PEG-O-(CH2)n-C≡CR』AB使聚亞烴基二醇(P-OH)與烷基滷(A)反應以形成醚(B)。在所述化合物中，n為1至9的整數且R′可為直鏈或支鏈、飽和或不飽和C1至C20烷基或雜烷基。R′也可為C3至C7飽和或不飽和環烷基或環狀雜烷基、經取代或未經取代的芳基或雜芳基，或經取代或未經取代的烷芳基(所述烷基為C1至C20飽和或不飽和烷基)或雜烷芳基。通常，PEG-OH為具有800至40,000道爾頓(Da)分子量的聚乙二醇(PEG)或單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
實例14mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)處理具有20,000Da分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g；0.1mmol，Sunbio)。接著將炔丙基溴溶於二甲苯中的80重量％溶液(0.56mL，5mmol，50當量，Aldrich)和催化量的KI添加至所述溶液中，且將所得混合物加熱至回流歷時2小時。接著添加水(1mL)且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)並將有機層分離，經無水Na2SO4乾燥，且將體積減少至大約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚(150mL)中。收集所得沉澱，用若干份冷乙醚洗滌並且乾燥，以得到炔丙基-O-PEG。
實例15mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)處理具有20,000Da分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g；0.1mmol，Sunbio)。接著將50當量的5-溴基-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量的KI添加至所述混合物中。將所得混合物加熱至回流歷時16小時。接著添加水(1mL)且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)且將有機層分離，經無水Na2SO4乾燥，且將體積減少至大約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加至乙醚(150mL)中。收集所得沉澱，用若干份冷乙醚洗滌並乾燥，以得到相應的炔。在類似反應中可使用5-氯基-1-戊炔。
實例16(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C＝CH首先向3-羥基苄醇(2.4g，20mmol)於THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中添加粉末狀氫氧化鈉(1.5g，37.5mmol)，接著添加炔丙基溴溶於二甲苯中的80重量％溶液(3.36mL，30mmol)。將反應混合物回流加熱歷時6小時。向所述混合物中添加10％檸檬酸(2.5mL)且在真空下移除溶劑。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取殘餘物，且用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌組合有機層，經MgSO4乾燥，並且濃縮，以得到3-炔丙基氧基苄醇。
在0℃下將甲烷磺醯氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加至化合物3(2.0g，11.0mmol)於CH2Cl2中的溶液中，且將反應物置於冰箱中歷時16小時。通常的處理(work-up)得到呈淺黃色油狀的甲磺酸酯。使所述油(2.4g，9.2mmol)溶解於THF(20mL)中，且添加LiBr(2.0g，23.0mmol)。將反應混合物加熱至回流歷時1小時，接著冷卻至室溫。向混合物中添加水(2.5mL)且在真空下移除溶劑。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取殘餘物，且用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌組合有機層，經無水Na2SO4乾燥並濃縮，以得到所要溴化物。
將mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解於THF(20mL)中，且在冰浴中冷卻溶液。在劇烈攪拌情況下經過若干分鐘的時段添加NaH(6mg，0.25mmol)，繼而添加上文中所獲得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。移除冷卻浴，且將所得混合物加熱至回流歷時12小時。向混合物中添加水(1.0mL)且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(25mL)且將有機層分離，經無水Na2SO4乾燥，且將體積減少至大約2mL。逐滴添加至醚溶液(150mL)得到白色沉澱，將其收集以得到PEG衍生物。
實例17mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR』→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR』也可通過將含有末端官能團的聚(乙二醇)聚合物偶合至含有如上文所示的炔基官能團的反應性分子，從而獲得含有末端炔基的聚(乙二醇)聚合物。n為1與10之間。R′可為H或C1至C4的小烷基。
實例18(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C＝CH將4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解於CH2Cl2(25mL)中。添加N-羥基丁二醯亞胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)，且將溶液在室溫下過夜攪拌。所得粗NHS酯7不經進一步純化即用於下步反應。
將具有5,000Da分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，Sunbio)溶解於THF(50mL)中，且將混合物冷卻至4℃。在劇烈攪拌情況下逐份添加NHS酯7(400mg，0.4mmol)。在溫至室溫的同時允許將混合物攪拌3小時。接著添加水(2mL)且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(50mL)且將有機層分離，經無水Na2SO4乾燥，且將體積減少至大約2mL。將此CH2Cl2溶液逐滴添加至醚(150mL)。收集所得沉澱且在真空下乾燥。
實例19此實例呈現聚(乙二醇)的甲磺醯酯的製備，所述聚(乙二醇)的甲磺醯酯也可被稱為聚(乙二醇)的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯。相應的甲苯磺酸酯和滷化物可通過類似程序製備。
mPEG-OH+CH3SO2Cl+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3將150mL甲苯中的mPEG-OH(分子量＝3,400，25g，10mmol)在氮氣下共沸蒸餾2小時，且將溶液冷卻至室溫。將40mL無水CH2Cl2和2.1mL無水三乙胺(15mmol)添加至所述溶液中。在冰浴中冷卻所述溶液，且逐滴添加1.2mL的經蒸餾的甲烷磺醯氯(15mmol)。將溶液在室溫下於氮氣氛中過夜攪拌，且通過添加2mL無水乙醇來中止反應。在真空下將混合物蒸發以移除溶劑(主要為甲苯以外的溶劑)，過濾，再次在真空下濃縮，接著沉澱至100 mL乙醚中。用若干份冷乙醚洗滌濾液且在真空中乾燥，以得到甲磺酸酯。
將甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解於75ml THF中，且將溶液冷卻至4℃。向經冷卻溶液中添加疊氮化鈉(1.56g，24mmol)。在氮氣下將反應物加熱至回流歷時2小時。接著蒸發溶劑且用CH2Cl2(50mL)稀釋殘餘物。用NaCl溶液洗滌有機餾分，且經無水MgSO4乾燥。將體積減少至20mL，且通過添加到150mL冷的無水醚中使產物沉澱。
實例20(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3可使用美國專利第5,998,595號中所述的方法製造4-疊氮基苄醇，所述專利是以引用的方式併入本文中。在0℃下將甲烷磺醯氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)添加至4-疊氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)於CH2Cl2中的溶液中，且將反應物置於冰箱中歷時16小時。通常的處理得到呈淺黃色油狀的甲磺酸酯。使所述油(9.2mmol)溶解於THF(20mL)中，且添加LiBr(2.0g，23.Ommol)。將反應混合物加熱至回流歷時1小時，接著冷卻至室溫。向混合物中添加水(2.5mL)且在真空下移除溶劑。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取殘餘物，且用飽和NaCl溶液(10mL)洗滌組合有機層，經無水Na2SO4乾燥且濃縮，以得到所要溴化物。
用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)處理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)，且將溴化物(3.32g，15mmol)連同催化量的KI一起添加至混合物中。將所得混合物加熱至回流歷時12小時。向混合物中添加水(1.0mL)且在真空下移除溶劑。向殘餘物中添加CH2Cl2(50mL)且將有機層分離，經無水Na2SO4乾燥，且將體積減少至大約2mL。逐滴添加至醚溶液(150mL)中得到沉澱，將其收集以得到mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
實例21NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H將NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(分子量3,400Da，2.0g)溶解於飽和NaHCO3水溶液(10mL)中，且將溶液冷卻至0℃。在劇烈攪拌情況下添加3-疊氮基-1-N-羥基丁二醯亞胺基丙酸酯(5當量)。在3小時後，添加20ml H2O且在室溫下將混合物再攪拌45分鐘。用0.5N H2SO4將pH值調節為3，且添加NaCl直至大約15重量％的濃度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反應混合物，經Na2SO4乾燥且濃縮。在用冷乙醚沉澱後，通過過濾收集產物且在真空下乾燥，以得到ω-羧基-疊氮化PEG衍生物。
實例22mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H在劇烈攪拌情況下，向乙炔鋰於THF中的溶液(4當量)(如所屬領域中所知而製備，且經冷卻至-78℃)中逐滴添加溶解於THF中的mPEG-OM溶液。在3小時後，允許將反應物溫至室溫且通過添加1mL丁醇而中止反應。接著添加20mL H2O，且在室溫下將混合物再攪拌45分鐘。用0.5N H2SO4將pH值調節為3，且添加NaCl直至大約15重量％的濃度。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反應混合物，經Na2SO4乾燥且濃縮。在用冷乙醚沉澱後，通過過濾收集產物且在真空下乾燥，以得到1-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
實例23使用下列文獻中所述的方法將含疊氮基的胺基酸和含乙炔基的胺基酸部位選擇性地併入蛋白質中L. Wang等人，(2001)，Science292498-500；J.W.Chin等人，Science301964-7(2003))；J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society1249026-9027；J.W.Chin， P. G. Schultz，(2002)，Chem Bio Chem3(11)1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America9911020-11024；和L. Wang， P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，11-11。一旦併入胺基酸後，即在37℃下，於pH值為8的磷酸鹽緩衝液(PB)中，在存在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和約1mg Cu絲的情況下進行與0.01mM蛋白質的環加成反應，歷時4小時。
實例24此實例描述對乙醯基-D，L-苯丙氨酸(pAF)和m-PEG-羥胺衍生物的合成。
使用先前在Zhang，Z.，Smith，B.A.C，Wang，L.，Brock，A.，Cho，C. Schultz，P.G.，Biochemistry，(2003)42，6735-6746中所述的程序合成外消旋pAF。
完成下列程序以合成m-PEG-羥胺衍生物。向(N-叔丁氧羰基-氨基氧基)乙酸(0.382g，2.0mmol)和1，3-二異丙基碳二亞胺(0.16mL，1.0mmol)於二氯甲烷(DCM，70mL)中的溶液(其在室溫下被攪拌1小時)中添加甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2，7.5g，0.25mmol，Mt.30 K，購自BioVectra)和二異丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。將反應產物在室溫下攪拌48小時，接著濃縮至約100mL。將混合物逐滴添加至冷醚(800mL)中。使叔丁氧羰基保護產物沉澱析出，並通過過濾收集，用醚(3×100mL)洗滌。通過在DCM(100mL)中再溶解和在醚(800mL)中沉澱兩次將其進一步純化。在真空中乾燥，得到7.2g(96％)產物，此通過NMR和Nihydrin測試確認。
於0℃下在50％TFA/DCM(40mL)中進行上面所獲得的受保護產物(7.0g)的去叔丁氧羰基反應歷時1小時，接著於室溫下進行1.5小時。在真空中移除大多數TFA後，通過將二噁烷(1mL)中的4N HCl添加至殘餘物中而使羥胺衍生物的TFA鹽轉化為HCl鹽。將沉澱溶解於DCM(50mL)中，且在醚(800mL)中再次沉澱。通過過濾收集最終產物(6.8g，97％)，用醚(3×100mL)洗滌，在真空中乾燥，將其儲存在氮氣下。使用相同程序合成其它PEG(5K，20K)羥胺衍生物。
實例25此實例描述用於包含非天然胺基酸的hGH多肽的表達方法和純化方法。已用正交tRNA、正交氨醯基tRNA合成酶和hGH構建物轉化宿主細胞。
使來自經轉化DH10B(fis3)細胞的冷凍甘油儲備物的少許穿刺培養物(stab)首先於37℃下在具有100μg/ml氨苄青黴素(ampicillin)的2ml確定成分培養基(補充有亮氨酸、異亮氨酸、痕量金屬和維生素的葡萄糖基本培養基)中生長。當OD600達到2至5時，將60ul轉移至60ml具有100μg/ml氨苄青黴素的新鮮確定成分培養基中，且再次在37C下生長至2至5的OD600。將50ml培養物轉移到5升發酵罐(Sartorius BBI)中的2升具有100μg/ml氨苄青黴素的確定成分培養基中。以碳酸鉀將發酵罐pH值控制在pH6.9，溫度控制在37℃，空氣流動速率為51pm，且用聚亞烷基消泡劑KFO F1 19(Lubrizol)控制泡沫。自動調節攪拌器的速度以維持溶解氧水平大於30％，且如果攪拌器的速度達到其最大值，那麼使用純氧氣來補充空氣噴射。在37℃下8小時後，以指數級的增加率饋入確定成分培養基50倍濃度的培養物，以維持0.15小時-1的特定生長率。當OD600達到大約100時，添加對乙醯苯丙氨酸的外消旋混合物至3.3mM的最終濃度，且將溫度降至28℃。在0.75小時後，添加異丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷至0.25mM的最終濃度。使細胞在28℃下再生長8小時，粒化，且在-80℃下冷凍直至進一步處理。
使用ProBond鎳螯合樹脂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，經由由Invitrogen的說明書所提供的標準His標記蛋白純化程序，繼而通過陰離子交換柱，來純化經His標記的突變體hGH蛋白。
將經純化的hGH濃縮至8mg/ml，且將緩衝液改為反應緩衝液(20mM乙酸鈉，150mM NaCl，1mM EDTA，pH4.0)。以20∶1的PEG∶hGH摩爾比將MPEG-羥基胺粉末添加至hGH溶液中。在28℃加以輕柔振蕩的情況下進行反應歷時2天。經由陰離子交換柱自未反應的PEG和hGH純化PEG-hGH。
通過三種檢定來評估各PEG化突變體hGH的品質，然後進入動物實驗。通過在非還原性條件(Invitrogen)下用MES SDS電泳緩衝液進行4％至12％丙烯醯胺NuPAGEBis-Tris凝膠電泳來檢驗PEG-hGH的純度。用考馬斯藍(Coomassie blue)將凝膠染色。根據光密度分析掃描，PEG-hGH帶的純度大於95％。通過動力學LAL檢定使用購自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA2套組來測試各PEG-hGH的內毒素水平，且其為小於5 EU/劑量。使用IM-9 pSTAT5生物檢定(在實例2中提及)評估PEG-hGH的生物活性，且EC50值為小於15nM。
實例26此實例描述用於評估包含非天然胺基酸的hGH多肽的純化和均質性的方法。
圖8為在位置92上包含非天然胺基酸的hGH多肽的SDS-PAGE。凝膠的色帶3、4和5顯示在位置92上包含共價連接至5kDa、20kDa或30kDa PEG分子的對乙醯苯丙氨酸的hGH。在圖11中顯示其它包含非天然胺基酸的PEG化hGH多肽。將5μg的各PEG-hGH蛋白質加載至各SDS-PAGE上。圖11，A圖色帶1，分子量標記；色帶2，WHO rhGH參比標準(2μg)；色帶3和7，30KPEG-F92pAF；色帶4，30KPEG-Y35pAF；色帶5，30KPEG-R134pAF；色帶6，20KPEG-R134pAF；色帶8，WHO rhGH參比標準(20μg)。圖11，B圖色帶9，分子量標記；色帶10，WHO rhGH參比標準(2μg)；色帶11，30KPEG-F92pAF；色帶12，30KPEG-K145pAF；色帶13，30KPEG-Y143pAF；色帶14，30KPEG-G131pAF；色帶15，30KPEG-F92pAF/G120R；色帶16，WHO rhGH參比標準(20μg)。圖9顯示PEG化hGH多肽(5kDa、20kDa或30kDa)在IM-9細胞中的生物活性；方法是如實例2中所述執行。
hGH-PEG結合物的純度可通過蛋白水解降解(包括(但不限於)胰蛋白酶裂解)繼而進行質譜分析來評估(Pepinsky RB.，等人，J.Pharmcol. Exp.Ther.297(3)1059-66(2001))。用於進行胰蛋白酶消化的方法也在European Pharmacopoeia(2002)第四版，第1938頁中有描述。對所述方法進行修改。將樣品在50mM TRIS-HCl(pH7.5)中過夜透析。以66∶1的質量比將rhGH多肽與胰島素(經TPCK處理的胰蛋白酶，Worthington)一起在37℃水浴中培養4小時。將樣品在冰上培養若干分鐘，以中止消化反應且隨後在HPLC分析期間維持在6℃。將經消化的樣品(約200μg)加載至0.1％三氟乙酸中的25×0.46cm Vydac C-8柱(5μm粒徑，100孔徑)上，且在30℃下用0至80％梯度的乙腈經70分鐘以1ml/分鐘的流動速率洗脫。通過214nm下的吸光率監測胰蛋白酶肽的洗脫。
圖10，A示hGH的一級結構，其中指示胰蛋白酶裂解部位並且用箭頭說明非天然的胺基酸取代F92pAF(根據Becker等人Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4)326-337修改所得的圖)。B圖顯示由包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH多肽產生的肽(30K PEG His6-F92pAF rhGH，標記為A)、由包含非天然編碼的胺基酸的hGH多肽產生的肽(His6-F92pAF rhGH，標記為B)和由野生型hGH產生的肽(WHO rhGH，標記為C)的疊加的胰蛋白酶圖。WHO rhGH和His6-F92pAF rhGH的胰蛋白酶圖的比較僅顯示兩個峰移位(肽峰1和肽峰9)，而其餘的峰是相同的。這些差異是由在經表達His6-F92pAF rhGH的N端上His6的加成所引起的，其導致峰1移位；而峰9的移位是由殘基92上經對乙醯苯丙氨酸取代而引起的。C圖顯示對來自B圖的峰9的放大。His6-F92pAF與30K PEG His6-F92pAF rhGH胰蛋白酶圖的比較顯示在His6-F92pAF rhGH的PEG化後峰9消失，由此確認所述修飾對於肽9為特異性的。
實例27此實例描述由各自包含非天然胺基酸的兩個hGH多肽所形成的同源二聚體。
圖12將在位置92上包含對乙醯苯丙氨酸取代的經His標記的hGH多肽和與具有實例25中所述用於hGH的PEG化的官能團和反應性的雙官能性連接子連接在一起的此經修飾多肽的同源二聚體的IM-9檢定結果進行比較。
實例28此實例描述充當hGH拮抗劑的單體和二聚體hGH多肽。
其中將G120R取代引入部位II中的hGH突變型蛋白能夠與單hGH受體結合，但不能使兩個受體二聚。所述突變型蛋白可能通過在不活化細胞內發信路徑的情況下佔據受體部位，從而充當活體外的hGH拮抗劑(Fuh，G.等人Science 2561677-1680(1992))。圖13，A圖顯示測量通過具有G120R取代的hGH使pSTAT5磷酸化的IM-9檢定數據。如圖13，B圖中所示，具有相同位置(G120)處併入的非天然胺基酸的hGH多肽導致也可充當hGH拮抗劑的分子。將圖13，B圖中所示的hGH拮抗劑的二聚體構建為與具有實例25中所述用於hGH的PEG化的官能團和反應性的雙官能性連接子連接在一起。圖14顯示此二聚體在IM-9檢定中也缺少生物活性。
進行其它檢定以比較包含G120pAF取代的hGH多肽與通過PEG連接子連接的經G120pAF修飾hGH多肽的二聚體。劑量響應範圍內的單體和通過pEG連接子所連接的二聚體競爭WHO hGH誘導的STAT5磷酸化。也進行表面受體競爭研究，以顯示單體和二聚體與GH競爭在IM-9和大鼠GHR(L43R)/BAF3細胞上的細胞表面受體結合。所述二聚體充當比單體更有效的拮抗劑。
表4顯示來自所述研究的數據。

實例29此實例詳細描述hGH活性和hGH多肽對於hGH受體親和性的測量。
大鼠GH受體的克隆和純化將大鼠GH受體的細胞外域(GHR ECD，胺基酸S29-T238)克隆至pET20b載體(Novagen)的與C端6His標記同框的Nde I和Hind III部位之間。引入L43至R的突變以進一步接近人類GH受體結合部位(Souza等人，ProcNatl Acad Sci U S A.(1995)92(4)959-63)。通過在30℃下以0.4mM IPTG誘導4至5小時，從而在BL21(DE3)大腸桿菌(E.coli)細胞(Novagen)中產生重組蛋白。將細胞溶解後，通過在具有30mL的50mM Tris(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100的杜恩斯組織勻漿器(dounce)中再懸浮而洗滌四次，且用相同緩衝液(不含Triton X-100)洗滌兩次。在此，內含體由95％以上的GHR ECD組成，且使其溶解於0.1M Tris(pH11.5)、2M尿素中。藉助於使內含體溶液的等分試樣通過S100(Sigma)凝膠過濾柱(經50mM Tris(pH 7.8)、1M L-精氨酸、3.7mM胱胺、6.5mM半胱胺平衡)，從而完成重摺疊。使含有可溶性蛋白質的流分組合且對50mM Tris(pH7.6)、200mM NaCl、10％甘油透析。簡短地將樣品離心分離以移除任何沉澱，且根據製造商說明書用Talon樹脂(Clontech)的等分試樣培養。在用補充有5mM咪唑的20體積透析緩衝液進行洗滌後，在透析緩衝液中用120mM咪唑洗脫蛋白質。最終，將樣品對於50mM Tris(pH7.6)、30mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油過夜透析，簡短地離心分離以移除任何沉澱，調節至20％的最終甘油濃度，在-80℃下等分和存儲。使用經計算的消光係數ε＝65,700M-1*μm-1通過OD(280)測量蛋白質濃度。
GH至GHR的結合的Bio coreTM分析使用如製造商所推薦的標準胺偶合程序，將大約600至800 RU的可溶性GHR ECD固定於BiacoreTMCM5晶片上。即使大部分受體通過此技術失活，由實驗方法發現這種程度的固定化也足以產生約100至150 RU的最大特異性GH結合響應，且在結合動力學上無顯著變化。參看例如Cunningham等人J Mol Biol.(1993)234(3)554-63和WellsJA.Proc Natl Acad Sci USA(1996)93(1)1-6)。
將HBS-EP緩衝液(BiacoreTM，Pharmacia)中各種濃度的野生型突變體GH(0.1至300nM)以40μl/分鐘的流動速率歷時4至5分鐘注射於GHR表面上，且在注射後對分裂監測15分鐘。通過15秒脈衝的4.5M MgCl2使表面再生。在至少100次再生循環後僅觀測到最小的的結合親和性損失(1％至5％)。未固定受體的參比細胞用於扣除任何緩衝液體積效應和非特異性結合。
使用BiaEvaluation 4.1軟體(BIACORETM)來處理由GH滴定實驗獲得的動力學結合數據。「二價分析物」聯合模型提供令人滿意的配置(fit)(chi2值通常低於3)，與建議的連續1∶2(GH∶GHR)二聚作用相符(Wells JA.Proc Natl Acad Sci U S A(1996)93(1)1-6)。將平衡分裂常數(Kd)作為個別比率常數(koff/kon)計算。
表5顯示使用固定於CM5晶片上的大鼠GHR ECD(L43R)來自BiacoreTM的結合參數。


GHR穩定細胞系使IL-3依賴性小鼠細胞系(BAF3)以常規方式在RPMI 1640、丙酮酸鈉、青黴素、鏈黴素、10％熱失活胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇和作為IL-3源的10％WEHI-3細胞系經調節培養基中通過。所有細胞培養物均保持在37℃下5％CO2的潮溼氣氛中。
使用BAF3細胞系建立大鼠GHR(L43R)穩定細胞克隆，2E2-2B12-F4。簡而言之，用15μg含有全長大鼠GHR(L43R)cDNA的線性化pcDNA3.1質體使1×107個中度融合的BAF3細胞電極化。允許經轉染細胞恢復48小時，接著通過在含有800μg/ml G418和5nM WHO hGH的培養基中限制性稀釋進行克隆。GHR表達轉染子通過用抗人類GHR抗體(R D Systems，Minneapolis，MN)的表面染色來識別，且在FACS Array(BDBiosciences，San Diego，CA)上分析。接著根據對BrdU增殖檢定(如下文中所述)中WHO hGH的增殖活性來篩選表達良好GHR等級的轉染子。穩定轉染的大鼠GHR(L43R)細胞克隆建立於所要轉染子在1.2mg/ml G418和5nM hGH存在下、具有表面受體表達和增殖能力的恆定外形的另外兩輪重複亞克隆。由此建立的細胞克隆(2E2-2B12-F4)以常規方式保存於BAF3培養基(在無hGH的情況下加上1.2mg/mlG418)中。通過BrdU標記的增殖將血清飢餓大鼠GHR(L43R)表達BAF3細胞系(2E2-2B 12-F4)以5×104個細胞/孔的密度塗於96孔盤中。用12點劑量範圍的hGH蛋白使細胞活化，且同時用50μMBrdU(Sigma，St.Louis，MO)進行標記。培養48小時後，在室溫下用100μl的BD細胞固定/細胞透化(cytofix/cytoperm)溶液(BD Biosciences)使細胞固定/透化30分鐘。為暴露BrdU抗原決定基，在37℃下用30μg/孔的Dnase(Sigma)將經固定/透化的細胞處理1小時。使用APC結合抗BrdU抗體(BD Biosciences)的螢光免疫檢驗染色實現在FACS Array上的樣品分析。
表6顯示如pSTAT5(IM-9)和BrdU增殖檢定中所概述的PEG hGH突變體的生物活性。對於檢定之間的比較，WHO hGH表達為一致的。

實例30
此實例描述用於測量PEG化hGH的活體外和活體內活性的方法。
細胞結合檢定在不存在或存在各種濃度(體積10μl)未標記GH、hGH或GM-CSF的情況下，且在存在125I-GH(大約100,000cpm或1ng)的情況下，於0℃下將兩份細胞(3×106)在PBS/1％BSA(100μl)中培養90分鐘(總體積120μl)。接著使細胞在350μl塑料離心分離管中通過200μl冰冷FCS重新懸浮和分層，且離心分離(1000g；1分鐘)。通過切斷管的末端來收集小球，且在γ計數器(Packard)中對小球和上清液獨立計數。
按照無競爭者存在下的總結合(複製品的平均值)減去100倍過量未標記GH存在下的結合(非特異性結合)(cpm)來測定特異性結合(cpm)。對所用的各細胞類型測量非特異性結合。使用相同製備的125I-GH在不同天進行實驗，且應顯示內在一致性。125I-GH說明與產生GH受體的細胞的結合。所述結合以視劑量而定的方式受未標記天然GH或hGH限制，但不受GM-CSF或其它消極控制限制。hGH競爭天然125I-GH(類似於天然GH)結合的能力暗示，受體可同等地充分識別兩種形式。
PEG化hGH的活體內研究對小鼠或大鼠投予PEG-hGH、未經修飾hGH和緩衝溶液。結果將顯示本發明的PEG化hGH相較於通過顯著增加體重而展現的未經修飾hGH而言優越的活性和持久的半衰期。
結合和非結合hGH和其變異體在活體內半衰期的測量。
所有動物實驗均在AAALAC認可的設備中和St.Louis University的InstitutionalAnimal Care and Use Committee認可的協議下進行。大鼠單獨地居住於具有12小時明/暗循環室內的籠子中。為動物提供經檢定的Purina飼料5001和無限量的水。對於切除垂體的大鼠，飲用水額外地含有5％葡萄糖。
藥物代謝動力學研究通過三種檢定來評估PEG化突變體hGH的品質，隨後進入動物實驗。通過在非還原性條件(Invitrogen，Carlsbad，CA)下用MES SDS電泳緩衝液進行4％至12％丙烯醯胺NuPAGE Bis-Tris凝膠電泳來檢驗PEG-hGH的純度。用考馬斯藍(Coomassie blue)將凝膠染色。根據光密度分析掃描，PEG-hGH帶的純度大於95％。通過動力學LAL檢定使用購自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA2套組來測試各PEG-hGH的內毒素水平，且其小於5 EU/劑量。使用IM-9 pSTAT5生物檢定(在實例2中所述)評估PEG-hGH的生物活性，且EC50值經確認小於15nM。
將經PEG修飾的生長激素化合物的藥物代謝動力學彼此比較，且與從Charles RiverLaboratories獲得的雄性Sprague-Dawley大鼠(261至425g)體內的非PEG化生長激素進行比較。以外科手術方式在頸動脈中安裝導管，用於血液收集。在成功的導管安裝之後，將動物分配至治療組(每組3至6隻)，隨後給藥。按照1mg/kg化合物(以劑量體積計為0.41-0.55ml/kg)對動物皮下給藥。在多個時間點經由留置導管採集血樣，且採集至塗覆EDTA的微離心管中。在離心分離後採集血漿，且在-80℃下存儲直至分析。使用購自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗體夾心生長激素ELISA套組測量化合物濃度。使用與給藥類似物相應的標準計算濃度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版)估算藥物代謝動力學參數。使用具有線性增加/對數減少(linear-up/log-down)梯形積分的無間隔分析，且對濃度數據均一地加權。
圖15顯示在大鼠體內單次皮下給藥後的平均(+/-S.D.)血漿濃度。對大鼠(n＝每組3至4)提供1mg/kg hGH野生型蛋白(WHO hGH)、經His標記hGH多肽(his-hGH)或在位置92上包含共價連接至30kDa PEG的非天然胺基酸對乙醯苯丙氨酸的經His標記hGH多肽(30KPEG-pAF92(his)hGH)的單次大丸劑劑量。根據所指示的時間間隔和採集血漿樣品，且檢定所述的注射化合物。30KPEG-pAF92(his)hGH具有相較於控制hGH而言顯著擴展的循環。
圖16顯示在大鼠體內單次皮下給藥後的平均(+/-S.D.)血漿濃度。對大鼠(n＝每組3至6)提供1mg/kg蛋白質的單次大丸劑劑量。將在6個不同位置中的各位置上包含共價連接至30kDa PEG的非天然胺基酸對乙醯苯丙氨酸的hGH多肽與WHO hGH和(his)-hGH進行比較。根據所指示的時間間隔和採集血漿樣品，且檢定所述的注射化合物。表7顯示圖16中所示hGH多肽單劑量投藥的藥物代謝動力學參數值。通過無間隔分析(Pharsight，4.1版)估算濃度相對時間的曲線。所示值為平均值(+/-標準偏差)。Cmax最大濃度；terminalt1/2末端半衰期；AUC0-inf在外推至無窮大的濃度-時間曲線下的面積；MRT平均停留時間；Cl/f表觀總血漿清除率；Vz/f未期期間分布的表觀體積。
表7對普通雄性Sprague-Dawley大鼠單劑量1mg/kg大丸劑皮下投藥的藥物代謝動力學參數值。


藥效研究從Charles River Laboratories獲得切除垂體的雄性Sprague-Dawley大鼠。在3至4周大時以外科手術方式切除垂體。允許動物適應3周的時段，在此期間監測體重。將研究開始前7天時段內具有0至8g體重增加的動物包括於其中，且隨機分至治療組。對大鼠皮下投予大丸劑劑量或日劑量。在整個研究期間，每日依序地將大鼠稱重、麻痺、抽血和給藥(當合適時)。使用經肝素化的毛細管從眶竇採血，且將血樣置於經EDTA塗覆的微離心管中。通過離心分離分離血漿且在-80℃下保存直至分析。
圖17顯示在切除垂體的大鼠體內單次皮下給藥後的平均(+/-S.D.)血漿濃度。對大鼠(n＝每組5至7)提供2.1mg/kg蛋白質的單次大丸劑劑量。顯示來自在兩個不同位置(位置35、92)中各位置上包含共價連接至30kDa PEG的非天然胺基酸對乙醯苯丙氨酸的hGH多肽的結果。根據所指示的時間間隔和採集血漿樣品，且檢定所述的注射化合物。
肽IGF-1為生長調節素或類胰島素生長因子的家族成員。IGF-1介導生長激素的多種促生長效應。針對所提供的大鼠/小鼠IGF-1標準物(Diagnosic Systems Laboratories)使用競爭結合酶免疫檢定套組來測量IGF-1濃度。通過t測試使用雙尾分布(不成對、等方差)來測定顯著差異。圖18，A圖顯示切除垂體的大鼠體內化合物的評估。對大鼠(n＝每組5至7隻)皮下提供單次劑量或日劑量。每日依序將動物地稱重、麻醉、抽血和給藥(當合適時)。顯示對於安慰劑治療、野生型hGH(hGH)、經His標記的hGH((his)hGH)和在位置35和92上包含共價連接至30kDa PEG的對乙醯苯丙氨酸的hGH多肽治療的體重結果。圖18，B圖——顯示在包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH多肽單次劑量投藥後，對於循環血漿IGF-1水平的影響的圖。線條表示標準偏差。在圖18，A圖中，30KPEG-pAF35(his)hGH化合物在第9天的體重增加在統計上不同於(p＜0.0005)30KPEG-pAF92(his)hGH化合物(在其中觀測到更大體重增加)。
圖18，C圖顯示切除垂體的大鼠體內化合物的評估。對大鼠(n＝每組11)皮下提供大丸劑劑量或日劑量。每日依序地將動物稱重、麻醉、抽血和給藥(當合適時)。對於安慰劑治療、野生型hGH(hGH)和在位置92、134、145、131和143上包含共價連接至30kDa PEG的非天然胺基酸對乙醯苯丙氨酸的hGH多肽顯示體重結果。圖18，圖D——圖表顯示相較於安慰劑治療和野生型hGH而言，在包含非天然編碼的胺基酸(位置92、134、145、131、143)的PEG化hGH多肽單次劑量投藥後對於循環血漿IGF-1水平的影響。圖18，圖E顯示對應於包含非天然編碼的胺基酸(位置92、134、145、131、143)的PEG化hGH多肽的平均(+/-S.D.)血漿濃度。根據所指示的時間間隔和採集血漿樣品，且檢定所述的注射化合物。線條表示標準偏差。
實例31包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH的安全性和/或效能的人體臨床試驗。
目的對皮下投予的包含非天然編碼的胺基酸的PEG化重組人類hGH與一種或一種以上市售hGH產品(包括(但不限於)HumatropeTM(Eli Lilly Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))的安全性和藥物代謝動力學進行比較。
患者將18名年齡存20與40歲之間、體重存60與90kg之間的健康志願者加入研究中。受檢者對於血液或血漿化學以及尿毒物學篩檢、HIV篩檢和B型肝炎表面抗原將沒有任何臨床上顯著的異常實驗值。其不應具有下列任何跡象高血壓；任何原發性血液病的病史；顯著肝病、腎病、心血管病、胃腸病、泌尿生殖病、新陳代謝病、神經病的病史；貧血症或癲癇(seizure disorder)的病史；對於細菌或哺乳動物衍生產物、PEG或人類血清白蛋白的已知敏感；習慣性大量飲用含咖啡因的飲料；參與任何其它臨床試驗或曾在開始研究30天內進行輸血或獻血；曾在開始研究3個月內暴露於hGH；曾在開始研究7天內患病；以及對於研究前的體檢或開始研究14天內的臨床實驗室評估具有顯著異常性。所有受檢者對於安全性均為可評估的，且如期採集用於藥物代謝動力學分析的所有血液採樣。所有研究均根據institutional ethics committee認可和患者同意而進行。
研究設計此將為對於健康男性志願者的階段I、單中心、開放標記、隨機分組、二階段交叉研究。將18名受檢者隨機地分配為兩個治療序列組(9名受檢者/組)。使用等劑量的包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH和所選擇的市售產品，經過兩個獨立的給藥階段將GH作為大丸劑在大腿上部皮下注射。市售產品的投藥劑量和頻率應如包裝標籤所指示。通過包括額外的受檢者組可將使用市售產品的額外給藥、給藥頻率或其它所要參數添加至研究中。通過14天的淘汰(washout)期分隔各給藥階段。在每兩個給藥階段之前的12小時和之後的72小時內將受檢者限制於研究中心內，但在給藥階段之間不作限制。如果對於PEG化hGH還存在額外給藥、頻率或其它參數需要測試，那麼可添加額外的受檢者組。經認可為人類使用的多種GH配方可用於此研究。HumatropeTM(Eli Lilly Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)為經認可為人類使用的市售GH產品。hGH的實驗配方為包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH。
血液採樣通過投予hGH前後的直接靜脈穿刺連續抽血。在給藥(3基線樣品)之前約30、20和10分鐘以及給藥之後的下列大約時間獲得用於測定血清GH濃度的靜脈血樣(5mL)30分鐘以及1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60和72小時。將各血清樣品分為兩份等分試樣。所有血清樣品均在-20℃下存儲。在乾冰上裝載血清樣品。在第1天的初始給藥之前(立即)、第4天早晨、第16天給藥之前(立即)和第19天早晨進行空腹臨床實驗室測試(血液學、血清化學性質和尿分析)。
生物分析方法ELISA套組程序(Diagnostic Svstems Laboratory[DSL]，Webster TX)用於測定血清GH濃度。
安全性測定在每次給藥(第1天和第16天)前以及每次給藥後6、24、48和72小時記錄生命徵象。安全性測定是以不良事件的發生率和類型以及臨床實驗室測試相較於基線的變化為依據的。另外，對相較於研究之前在生命徵象測量(包括血壓)和體檢結果中的變化進行評估。
數據分析通過用各給藥之後的值減去平均基線GH濃度(通過對來自給藥前30、20和10分鐘採集的三份樣品的GH含量取平均值而測定)，對給藥後的血清濃度值校正給藥前的基線GH濃度。如果給藥前血清GH濃度低於檢定的量化含量，那麼其不包括在平均值的計算中。由已校正給藥前的基線GH濃度的血清濃度數據測定藥物代謝動力學參數。通過模型獨立方法在Digital Equipment Corporation VAX 8600計算機系統上使用最新版本的BIOAVL的軟體計算藥物代謝動力學參數。測定下列藥物代謝動力學參數峰值血清濃度(Cmax)；至峰值血清濃度的時間(tmax)；利用梯形積分規則計算的從0到最後血液採樣時間(AUC0-72)的濃度-時間曲線下的面積；和經由消除率常數計算的末端消除半衰期(t1/2)。通過對數-線性濃度-時間曲線的末端線性區域中連續數據點的線性回歸來估算消除率常數。對於各治療計算藥物代謝動力學參數的平均值、標準偏差(SD)和變差係數(CV)。計算參數平均值的比例(防腐配方/非防腐配方)。
安全性結果 不良事件的發生率在治療組中平均分布。不存在相較於基線或研究前臨床實驗室測試或血壓的臨床上顯著變化，且不存在相較於研究前關於體檢結果和生命徵象測量的明顯變化。兩個治療組的安全性概況應表達為相似。
藥物代謝動力學結果存所測量的各時間點上將所有18名受檢者服用單次劑量的一種或一種以上市售hGH產品(包括(但不限於)HumatropeTM(Eli Lilly Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))後的平均血清GH濃度-時間概況(未校正基線GH含量)與包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH進行比較。所有受檢者應具有正常生理範圍內的給藥前基線GH濃度。由已校正給藥前平均基線GH濃度的血清數據測定藥物代謝動力學參數，且測定Cmax和tmax。所選擇臨床比較儀(HumatropeTM(Eli Lilly Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))的平均tmax顯著短於包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH的平均tmax。相較於包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH的末端半衰期，市售hGH產品的末端半衰期值顯著更短。
儘管本研究在健康男性受檢者中進行，但在其它患者群體中也可預期類似的吸收特徵和安全性概況；諸如患有癌症或慢性腎衰竭的男性或女性患者、兒科腎衰竭患者、自體貯存式程序中的患者或預定進行選擇性外科手術的患者。總之，經皮下投予的單劑量包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH將為安全的，且健康男性受檢者對其有良好耐藥力。根據比較性不良事件的發生率、臨床實驗室值、生命徵象和體檢結果，市售形式的hGH和包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH的安全性概況將相等。包含非天然編碼的胺基酸的PEG化hGH潛在地為患者和保健提供者提供較大臨床效用。
實例32在下列實例中，ahGH和PEG-ahGH分別為hGH和在位置35上具有對乙醯苯丙氨酸的SEQ ID NO2的PEG化hGH，且在所述PEG化hGH中PEG通過以對乙醯苯丙氨酸所形成的肟鍵連接，其中PEG為線性30kDa PEG。
STAT5磷酸化檢定hGH與其受體的相互作用導致信號轉導物和轉錄家族成員激活物(STAT5)在人類IM-9淋巴細胞系中的酪氨酸磷酸化。通過用濃度漸增的ahGH和PEG-ahGH活化IM-9細胞，繼而對磷-STAT5細胞內螢光免疫檢驗法染色，從而測定ahGH和PEG-ahGH的濃度(要求50％最大STAT5磷酸化(EC50))。根據世界衛生組織WHO)標準hGH的EC50作為1.0，測出ahGH相較於WHO hGH的相對EC50為1.1，而PEG-ahGH的相對EC50為10.9。
實例33增殖檢定藉助於響應生長激素而增殖的細胞系在活體外測定PEG-ahGH活性。所述細胞系的一個實例為稱作2E2-2B12-F4的大鼠GHR[L43R]/BAF3細胞克隆，其為通過使用大鼠GHR(在位置43上具有Leu至Arg的取代)穩定轉染小鼠BAF3細胞所產生的細胞系。大鼠受體中Leu-43至Arg-43的轉化使得大鼠GHR更「與人類相似」，且因此實現有效hGH結合。採用活化分離大鼠GHR[L43R]/BAF3細胞的溴脫氧尿苷(BrdU)標記來提供一種用於生長激素誘導增殖定量的高分離度、無輻射性方法。將WHO hGH的EC50設定為一致，測出ahGH和PEG-ahGH相較於WHO hGH的EC50分別為1.06±0.29(n＝11)和5.37±1.23(n＝9)。
實例34.
PEG化hGH的效能研究在生長激素缺乏的大鼠模型中進行臨床前的效能研究。在所述模型中，於大約4周大時以外科手術方式切除垂體腺。在術後監測這些切除垂體大鼠的體重，將研究開始前7天時段內顯示小於7.5g體重增加的動物視為成功切除垂體的，且將其隨機分入治療組。將顯示大於2.5g體重減少的動物視為不健康的，且排除在研究之外。大約在術後3周開始所述研究。
每周用安慰劑或漸增的PEG-ahGH劑量對動物給藥(即，在第0天和第7天給藥)。一個額外治療組每天服用健豪寧(genotropin)或安慰劑。每天在給藥前對體重和血液採樣。所有動物在第14天死亡。圖28顯示整個研究期間的血漿IGF-1水平。觀測到穩固的、視劑量而定的IGF-1增加。
在每次給藥間隔後觀測到IGF-1 Cmax視劑量而定的增加。從第一次給藥開始的Cmax值的曲線擬合將最小(Eo)和最大(Emax)IGF-1 Cmax分別估算為136.7和1,136.2ng/mL，且測出ED50為0.136mg/kg(表8)。
血漿IGF-1水平也顯示在表達為AUC時明顯的視劑量而定的增加。對於此參數而言，將AUC表達為高於有效IGF-1血漿水平的AUC。先前的工作顯示，基線以上34ng/mL的持續IGF-1濃度導致切除垂體大鼠的體重增加。在當前研究中，貫穿所述研究從安慰劑組測定的基線IGF-1水平為128ng/mL。128ng/mL以上34ng/mL的增量估算為162ng/mL的有效IGF-1水平。因此162ng/mL以上的AUC是完整的。通過此分析，在每次給藥間隔後觀測到在有效水平以上的視劑量而定的AUC增加。從第一次給藥開始的AUC值的曲線擬合將Eo和Emax IGF-1 AUC分別估算為0和5,029.8ngXhr/mL，且測出所述參數的ED50為0.909mg/kg(表8)。
測定IGF-1水平在第一次給藥後的估算有效水平以上的誘導持續時間。在較高劑量下，IGF-1水平在第二次給藥前未返回基線。在這些情況下，使用經計算的末端斜率將IGF-1濃度外推至有效水平。通過此估算，IGF-1濃度在有效水平以上的持續時間視劑量而定的增加是顯而易見的。曲線擬合將最小和最大持續時間分別估算為0和8.84天，且測出所述參數的ED50為O.173mg/kg(表8)。
將骨生長用作額外藥效量度來計算PEG-ahGH ED50。在研究結束時從各動物採集脛骨，且浸液固定於10％經中性緩衝的福馬林(formalin)中，繼而進行放射線照相。在圖29中顯示結果。經PEG-ahGH治療的動物的脛骨長度存在明顯的視劑量而定的增加。此外，相較於每天經健豪寧治療的動物而言存在劑量節約效應。經7天的時間間隔所投予的健豪寧的量等於每周(即，第0天和第7天)提供的2.1mg/kg的PEG-ahGH。對於0.42至1.0mg/kg的PEG-ahGH顯示與健豪寧類似的脛骨長度增加的誘導。這對於PEG-ahGH而言表示相較於健豪寧大於或等於50％的劑量節約效應。
PEG-ahGH也誘導體重視劑量而定的增加(圖30)。此外，如同脛骨長度增加的誘導，PEG-ahGH優於健豪寧的劑量節約效應是顯而易見的。使用0.3mg/kg/天的健豪寧每日治療誘導起始於第0天在第14天27.74(+/-7.92)％的體重變化。以與GH相等量投予的PEG-ahGH(即2.1mg/kg在第0天和第7天)誘導相較於健豪寧更大的體重增加。此劑量的PEG-ahGH導致起始於第0天在第14天33.66(+/-7.55)％的體重變化。通過以1.0mg/kg較低劑量在第0天和第7天投予的PEG-ahGH所誘導體重百分比變化誘導在第14天27.02(+/-3.97)％的體重變化。此導致對於PEG-ahGH近似50％的劑量節約效應。每周2.1mg/kg劑量的非PEG化GH投藥無法誘導體重增加。
第14天體重百分比變化的曲線擬合將最小和最大體重百分比變化(由PEG-ahGH誘導)分別估算為7.17和50.65。通過此曲線，測出所述參數的ED50為1.097mg/kg(表8)。
表8.使用PEG-ahGH的效能研究結果


對於採集以用於IGF-1濃度測定的相同血漿樣品也用於檢定PEG-ahGH濃度。所用ELISA檢定是專用於hGH的，其對於PEG-ahGH顯示較低但仍穩固的響應，且不用於檢測大鼠GH。在圖31中顯示PEG-ahGH血漿濃度-時間圖。發生視劑量而定的PEG-ahGHCmax增加。PEG-ahGH在循環中的持續時間以及總PEG-ahGH AUC以視劑量而定的方式增加。每日投予的健豪寧在血漿中不可檢測，可能是因為快速清除。PEG-ahGH暴露結果支持上文所示的視劑量而定的效能。
上述切除垂體大鼠的研究已顯示下列內容1.PEG-ahGH視劑量而定地增加IGF-1血漿濃度。有效水平以上的IGF-1 Cmax以及IGF-1 AUC和持續時間均視劑量而定地增加。
2.脛骨長度和體重視劑量而定地增加。
3.說明相較於每日投予的健豪寧而言大於或等於50％的劑量節約。
4.PEG-ahGH顯示Cmax、AUC和持續性在循環中視劑量而定的增加，其與以上藥效效應相關。
實例35藥物代謝動力學研究大鼠藥物代謝動力學在上文實例34中顯示以各種劑量在大鼠疾病模型中投予的PEG-ahGH的血漿濃度相對於時間的概況。
靈長類藥物代謝動力學在獼猴中評估不同之處僅在於分子在N端位置上含有甲硫氨酸的PEG-ahGH類型(PEG-a(met)hGH)的藥物代謝動力學性質(圖32)。
分別以0.75mg/kg或0.15mg/kg的皮下或靜脈內劑量投予PEG-a(met)hGH的單次注射。相較於在具有PEG-ahGH的大鼠中的7.05(+/-0.47)小時，表觀末端半衰期為12.23(+/-1.72)小時。靜脈內投藥的半衰期為6.42(+/-0.51)小時。經劑量校正的AUC值對於皮下和靜脈內給藥分別為362,443和312,440ngXhrXkg/mL/mg。算出通過皮下投藥的生物活性為116％。
實例36在臨床方案中所提議的劑量和給藥服法的基本原理通過下列在動物中的研究來確定PEG化GH在人體中的最優服法。
大鼠效能研究一一在臨床前效能研究中所觀測的劑量節約(即與健豪寧可比的效能，但具有較少PEG-ahGH劑量)用於人體中生物活性所需的劑量估算。
在大鼠和獼猴中的藥物代謝動力學評估——使用異速生長尺度來估算人體中的藥物代謝動力學參數。
在大鼠和獼猴中的單劑量急性安全性研究用於評估暴露且測定NOAEL(未觀測不良效應水平)。
大鼠一個月重複劑量GLP安全性研究——在暴露於高於最大推薦人類劑量(MRHD)2倍、6倍和20倍劑量一個月後評估安全性。對於兒科GHD而言，MRHD＝0.36mg/kg/周。
獼猴一個月重複劑量GLP安全性研究——在暴露於高於最大推薦人類劑量(MRHD)2倍、10倍和30倍劑量一個月後評估安全性。對於兒科GHD而言，MRHD＝0.36mg/kg/周。
大鼠六個月重複劑量GLP安全性研究。在給藥暴露六個月以使大鼠中的暴露為人類中MRHD下所觀測到的暴露的1至2倍和10倍後評估安全性。
獼猴六個月重複劑量GLP安全性研究。在給藥暴露六個月以使獼猴中的暴露為人類中MRHD下所觀測到的暴露的1至2倍和10倍後評估安全性。
應了解，本文中所述的實例和實施例僅出於說明的目的，且根據其作出的各種修改或變化將易於為所屬領域的技術人員想到，且將包括於本申請案的精神和範圍以及隨附權利要求的範疇內。本申請案中引用的所有公開案、專利、專利申請案和/或其它文獻為了所有目的起見是以引用的方式全部併入本文中，其引用程度就如同個別地將各個公開案、專利、專利申請案和/或其它文獻為了所有目的起見以引用的方式併入一樣。
表9所引用的序列。


序列表110Cho，Ho SDaniel，Thomas 0.
DiMarchi，Richard D.
Hays，Anna-MariaWilson，Troy E.
Sim，Bee-ChengLitzinger，David C.120經修飾的人類生長激素130AMBX-0076.00PCT15060/638,6161512004-12-2215060/727,9961512005-10-1716022170PatentIn version 3.32101211217212PRT213智人4001Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu5 10 15Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu20 25 30Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln35 40 45Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys50 55 60Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe65 70 75 80Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys85 90 95Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp100 105 110Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val115 120 125Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu130 135 140Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg145 150 155 160Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser165 170 175His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe180 185 190Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys195 200 205Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe210 2152102211191212PRT213智人4002Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140
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1.一種激素組合物，其包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述共價鍵為肟鍵。
2.根據權利要求1所述的激素組合物，其中所述GH為人類生長激素(hGH)。
3.根據權利要求2所述的激素組合物，其中所述hGH包含至少約80％與SEQ ID NO2相同的序列。
4.根據權利要求2所述的激素組合物，其中所述hGH包含SEQ ID NO2的序列。
5.根據權利要求1或2所述的激素組合物，其中所述GH包含非天然編碼的胺基酸(NEAA)。
6.根據權利要求5所述的激素組合物，其包含在所述NEAA與所述水溶性聚合物之間的肟鍵。
7.根據權利要求6所述的激素組合物，其中所述NEAA包含羰基。
8.根據權利要求7所述的激素組合物，其中所述NEAA包含酮基。
9.根據權利要求8所述的激素組合物，其中所述NEAA為對乙醯苯丙氨酸。
10.根據權利要求9所述的激素組合物，其中在與SEQ ID NO2的位置35對應的位置處用所述對乙醯苯丙氨酸取代。
11.根據權利要求1或2所述的激素組合物，其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇(PEG)。
12.根據權利要求11所述的激素組合物，其中所述PEG為線性PEG。
13.根據權利要求12所述的激素組合物，其中所述PEG具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。
14.根據權利要求12所述的激素組合物，其中所述PEG具有約1kDa與約60kDa之間的分子量。
15.根據權利要求12所述的激素組合物，其中所述PEG具有約20kDa與約40kDa之間的分子量。
16.根據權利要求12所述的激素組合物，其中所述PEG具有約30kDa的分子量。
17.根據權利要求11所述的激素組合物，其中所述PEG為分枝PEG。
18.根據權利要求17所述的激素組合物，其中所述PEG具有約1kDa與約100kDa之間的分子量。
19.根據權利要求17所述的激素組合物，其中所述PEG具有約30kDa與約50kDa之間的分子量。
20.根據權利要求17所述的激素組合物，其中所述PEG具有約40kDa的分子量。
21.根據權利要求7所述的激素組合物，其中所述水溶性聚合物包含PEG。
22.根據權利要求21所述的激素組合物，其中所述PEG為線性PEG。
23.根據權利要求21所述的激素組合物，其中所述PEG具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。
24.根據權利要求21所述的激素組合物，其中所述PEG具有約1kDa與約60kDa之間的分子量。
25.根據權利要求21所述的激素組合物，其中所述PEG具有約20kDa與約40kDa之間的分子量。
26.根據權利要求21所述的激素組合物，其中所述PEG具有約30kDa的分子量。
27.根據權利要求7所述的激素組合物，其中所述PEG為分枝PEG。
28.根據權利要求28所述的激素組合物，其中PEG具有約1kDa與約100kDa之間的分子量。
29.根據權利要求28所述的激素組合物，其中所述PEG具有約30kDa與約50kDa之間的分子量。
30.根據權利要求28所述的激素組合物，其中所述PEG具有約40kDa的分子量。
31.根據權利要求10所述的激素組合物，其中所述水溶性聚合物為PEG。
32.根據權利要求31所述的激素組合物，其中所述PEG為線性PEG。
33.根據權利要求32所述的激素組合物，其中所述PEG具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。
34.根據權利要求32所述的激素組合物，其中所述PEG具有約1kDa與約60kDa之間的分子量。
35.根據權利要求32所述的激素組合物，其中所述PEG具有約20kDa與約40kDa之間的分子量。
36.根據權利要求32所述的激素組合物，其中所述PEG具有約30kDa的分子量。
37.根據權利要求32所述的激素組合物，其中所述GH為hGH。
38.根據權利要求37所述的激素組合物，其中所述hGH包含SEQ ID NO2。
39.根據權利要求1所述的激素組合物，其包含通過複數個共價鍵與複數個水溶性聚合物相連接的GH，其中所述共價鍵中的至少一個為肟鍵。
40.根據權利要求39所述的激素組合物，其中所述GH為人類生長激素(hGH)。
41.根據權利要求40所述的激素組合物，其中所述hGH包含至少約80％與SEQ IDNO2相同的序列。
42.根據權利要求2所述的激素組合物，其中所述hGH包含SEQ ID NO2的序列。
43.根據權利要求39或41所述的激素組合物，其中所述GH包含複數個NEAA。
44.一種激素組合物，其包含通過肟鍵與至少一個線性PEG相連接的hGH，其中所述hGH包含SEQ ID NO2的胺基酸序列且包含至少一個在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處進行取代的NEAA殘基1-5、6-33、34-74、75-96、97-105、106-129、130-153、154-183和184-191。
45.根據權利要求44所述的激素組合物，其中在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用所述NEAA取代位置1前(即，在N端)、位置1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192(即，在蛋白質的羧基端)。
46.根據權利要求44所述的激素組合物，其中在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用所述NEAA取代位置35、92、131、134、143和145。
47.根據權利要求44所述的激素組合物，其中在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用所述NEAA取代位置30、35、74、92、103、143和145。
48.根據權利要求44所述的激素組合物，其中在一個或一個以上選自由下列各殘基位置組成的群組的位置處用所述NEAA取代位置35、92、143和145。
49.根據權利要求44所述的激素組合物，其包含在位置35上進行取代的NEAA。
50.根據權利要求44、45、46、47、48或49所述的激素組合物，其包含為對乙醯苯丙氨酸的NEAA。
51.根據權利要求50所述的激素組合物，其中所述PEG具有約0.1kDa與約100kDa之間的分子量。
52.根據權利要求50所述的激素組合物，其中所述PEG具有約1kDa與約60kDa之間的分子量。
53.根據權利要求50所述的激素組合物，其中所述PEG具有約20kDa與約40kDa之間的分子量。
54.根據權利要求50所述的激素組合物，其中所述線性PEG具有約30kDa的分子量。
55.一種製造通過肟鍵與水溶性聚合物相連接的GH的方法，其包含使包含含羰基的NEAA的GH在適於形成肟鍵的條件下與PEG羥基胺接觸。
56.根據權利要求55所述的方法，其中所述NEAA含有酮基。
57.根據權利要求56所述的方法，其中所述NEAA為對乙醯苯丙氨酸。
58.根據權利要求57所述的方法，其中在所述GH(例如，hGH)中對應於SEQ IDNO2中的胺基酸35的位置處用所述對乙醯苯丙氨酸取代。
59.根據權利要求55所述的方法，其中所述PEG羥基胺為單甲氧基PEG(MPEG)羥基胺。
60.根據權利要求59所述的方法，其中所述MPEG羥基胺為線性。
61.根據權利要求60所述的方法，其中所述PEG的分子量為約20至40kDa。
62.根據權利要求61所述的方法，其中所述PEG的分子量為約30kDa。
63.根據權利要求62所述的方法，其中所述MPEG羥基胺為線性30kDa的單甲氧基-PEG-2-氨基氧基乙胺氨基甲酸酯鹽酸鹽。
64.根據權利要求55所述的方法，其進一步包含通過以下方法來製造包含NEAA的GH，所述方法包含將(i)編碼GH的核酸(其中所述核酸已被修飾以便為所述NEAA的併入提供信號)，和(ii)所述NEAA引入有機體中，其中所述有機體能夠響應於所述(i)核酸的所述信號將所述NEAA併入蛋白質中。
65.根據權利要求55所述的方法，其中所述條件包含(i)將所述GH與MPEG混合以產生MPEG-GH混合物，其中MPEG∶GH的比為約5至10，(ii)pH值為約4至6；和(iii)在室溫下將所述MPEG-GH混合物輕柔攪拌約10至50小時。
66.根據權利要求55所述的方法，其進一步包含純化所述GH。
67.根據權利要求56所述的方法，其中通過所述方法得到的GH為至少約99％純的。
68.一種醫藥組合物，其包含(i)激素組合物，其包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素，其中所述共價鍵為肟鍵；和(ii)醫藥學上可接受的賦形劑。
69.根據權利要求68所述的醫藥組合物，其中所述GH為hGH。
70.根據權利要求68或69所述的醫藥組合物，其中所述組合物包含醫藥學上可接受的注射用配方液。
71.根據權利要求69所述的醫藥組合物，其中所述GH包含NEAA。
72.根據權利要求71所述的醫藥組合物，其中所述水溶性聚合物包含PEG。
73.根據權利要求71所述的醫藥組合物，其中所述PEG為線性PEG。
74.根據權利要求73所述的醫藥組合物，其中所述PEG為約30kDa的線性PEG，且所述GH為在對應於SEQ ID NO2中的胺基酸35的位置處經對乙醯苯丙氨酸取代的hGH，且其中在所述對乙醯苯丙氨酸與所述PEG之間形成所述肟鍵。
75.一種治療方法，其包含將有效量的激素組合物投予需要治療的個體，所述激素組合物包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述共價鍵為肟鍵。
76.根據權利要求75所述的方法，其中所述個體患有選自由下列病症組成的群組的病症兒科生長激素缺乏症、特發性身材矮小、兒童期發作的成年人生長激素缺乏症、成年期發作的成年人生長激素缺乏症或繼發性生長激素缺乏症。
77.一種治療方法，其包含將有效量的激素組合物投予需要治療的個體，所述激素組合物包含通過共價鍵與至少一個水溶性聚合物相連接的生長激素(GH)，其中所述水溶性聚合物為線性聚合物，且其中以每周僅一次、每兩周一次或每月一次的頻率投予所述激素組合物。
78.一種激素組合物，其包含GH，其中當經皮下投予哺乳動物時所述GH具有至少約12小時的平均血清半衰期。
79.一種激素組合物，其包含通過肟鍵與PEG相連接的GH，其中當經皮下投予哺乳動物時所述GH的平均血清半衰期為包含無所述PEG的GH的組合物的血清半衰期的至少約7倍。
全文摘要
本發明提供經修飾的生長激素多肽和其用途。
文檔編號G01N33/74GK101090980SQ200580044464
公開日2007年12月19日 申請日期2005年12月21日 優先權日2004年12月22日
發明者丘霍松, 託馬斯·O·丹尼爾, 理察·D·迪馬什, 安娜·瑪麗亞·海斯, 特洛伊·E·威爾遜, 比·查·西姆, 戴維·C·利青格 申請人:Ambrx公司