一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法

2023-06-18 23:04:11

一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫用材料術領域，特別是涉及一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法。將水產魚皮膠原蛋白在4℃下不斷攪拌的條件下，充分溶於濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成膠原液；將溶解後的膠原液離心收集上清液，待用；用過濾後的氫氧化鈉溶液調節上述膠原上清液的pH；或，用過濾後的磷酸鹽緩衝液與上述膠原上清液按按體積比1:1的比例混合，並不斷攪拌混合液，而後用過濾後的氫氧化鈉溶液調節混合液的pH；將調節pH後的膠原上清液混合液置於模具中，然後在30-40℃水浴靜置1-2h，使其充分自聚凝固成型；將成型後的水凝膠從模具中取出，置於超純水中浸泡20-30min，即得水產魚皮膠原蛋白水凝膠。本發明製備過程簡單、廉價易得，產品用途廣泛。
【專利說明】一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫用材料術領域，特別是涉及一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是動物體內含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質。膠原蛋白具有獨特的三螺旋結構、低抗原性、無毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點，已被廣泛應用於組織工程支架材料、止血海綿、藥物控緩釋系統、基因傳遞載體、美容外科等生物醫用領域。目前，國內使用的膠原蛋白主要來自豬和牛的皮膚和跟腱，但隨著狂牛症和口蹄疫等疾病的發生，使人們對它們的安全性產生了質疑；另外，由於宗教和習俗等原因，豬來源的膠原蛋白在某些地區的應用受到了限制。因此，迫切需要尋求質量和安全性更好的膠原蛋白來源。
[0003]我國每年魚鱗，魚皮等水產品廢棄物約有40多萬噸，這些水產品廢棄物均含有豐富的膠原蛋白，其胺基酸組成與陸生哺乳動物膠原蛋白無明顯差異，且其不存在人畜共患的傳染性疾病，具有極大的開發和利用價值，但這些廢棄物除小部分被用於生產飼料外，大部分卻被丟棄。因此，開發魚皮等水產品廢棄物的利用新途徑，不僅可提高水產品加工的附加值，而且能減少環境汙染，具有良好的經濟和社會效益。
【發明內容】

[0004]本發明目的在於提供一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法。
[0005]為實現上述目的，本發明採用技術方案為:
[0006]一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法，
[0007]I)將水產魚皮膠原蛋白在4°C下不斷攪拌的條件下，充分溶於濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成膠原液；
[0008]2)將溶解後的膠原液於4°C、20000g的條件下離心30min，充分除去不溶性的雜質，用移液槍小心吸出上清液，待用；
[0009]3)用過濾後的10-15mol/L氫氧化鈉溶液調節上述膠原上清液的pH至?.0-7.8 ；
[0010]或，用過濾後的磷酸鹽緩衝液與上述膠原上清液按體積比1:1的比例混合，並不斷攪拌混合液，而後用過濾後的10-15mol/L氫氧化鈉溶液調節混合液的pH至7.0-7.8 ；
[0011]4)將調節pH後的膠原上清液混合液置於模具中，然後在30_40°C水浴靜置l_2h，使其充分自聚凝固成型；
[0012]5)將成型後的水凝膠從模具中取出，置於超純水中浸泡20_30min，即得水產魚皮膠原蛋白水凝膠。
[0013]所述過濾後的磷酸鹽緩衝液為濃度為40mM的含濃度為260mM的氯化鈉的磷酸鹽緩衝液，濾紙過濾，待用。
[0014]所述磷酸鹽緩衝液為磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩衝液，pH7.4。[0015]所述水產魚皮膠原蛋白為羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白；
[0016]I)將清洗並吸乾表面水分的羅非魚皮在磁力攪拌下用10%正丁醇對魚皮進行脫脂24h，期間每8h更換一次正丁醇溶液；而後清洗待用；
[0017]2)於4°C條件下，用0.lmol/L的氫氧化鈉對上述處理後魚皮進行脫雜蛋白24h，期間每8h更換一次氫氧化鈉溶液,而後清洗待用；
[0018]3)將上述脫雜蛋白後的魚皮粉碎，粉碎後魚皮粉與0.5mol/L醋酸溶液混合，混合後再加入原料魚皮質量0.5%-1%的胃蛋白酶(750U/mg，Sigma)，而後於4°C下攪拌提取48h ；
[0019]4)將上述提取後魚皮提取液離心收集上清液，並在冰水浴及攪拌的條件下向上清液中緩緩加入研磨細碎的氯化鈉至終濃度為0.9mol/L，而後將液體置於4°C冰箱中過夜鹽析；
[0020]5)將上述鹽析液離心，收集沉澱，而後將沉澱復溶於0.5mol/L的醋酸溶液中；所得復溶液裝於3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液(pH8.6)；
[0021]6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析後再用純水透析48h ；透析後的膠原液於_80°C快速遇冷，然後_60°C冷凍乾燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白(PSC)。
[0022]本發明的優點效果:
[0023]1.本發明所用原 料為水產加工的下腳料羅非魚皮，原料來源安全，本發明充分利用羅非魚水產加工過程中產生的魚皮廢料，變廢為寶，提高經濟效益。
[0024]2.本發明所用提取方法為酶促提取法，這樣不僅可以使魚皮膠原蛋白提取的更加徹底，而且在提取過程中，酶可以切除膠原蛋白的末端端肽，這樣可以降低人體對其的免疫抗性。
[0025]3.本發明可以開發哺乳動物(豬和牛)以外來源的水產膠原蛋白醫用材料，其安全係數更高、產量更大，而且更加廉價。
[0026]4.本發明開發的水產魚皮膠原蛋白水凝膠，是在模擬生理酸鹼度和離子強度環境的條件下完全依靠膠原蛋白自聚的性質製備的，未加任何交聯劑，所以其在體內的安全性、穩定性和相容性會更好。
[0027]5.本發明獲得的水產魚皮膠原蛋白水凝膠，其低溫(4-10°C )下為透明無色液體，當水浴達到一定溫度(30_40°C)時便會快速自聚成型變為固體狀，機械強度良好，具有一定的支持作用，而且可降解；當溫度高於一定值時(50V )便會再次變回為液體，但當溫度再次降到30_40°C，液體無法再次聚集成固體，即這是一個不可逆的過程。通過本發明所獲得的水產魚皮膠原蛋白水凝膠用途廣泛，如脊髓手術後填充等，前景可觀。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發明實施例提供的濃度為lmg/mL膠原液製備的水凝膠；
[0029]圖2本發明實施例提供的濃度為2mg/mL膠原液製備的水凝膠；
[0030]圖3本發明實施例提供的濃度為3mg/mL膠原液製備的水凝膠；
[0031]圖4本發明實施例提供的生理鹽度下濃度為lmg/mL膠原液製備的水凝膠；
[0032]圖5本發明實施例提供的生理鹽度下濃度為2mg/mL膠原液製備的水凝膠；[0033]圖6本發明實施例提供的生理鹽度下濃度為3mg/mL膠原液製備的水凝膠。【具體實施方式】
[0034]下面用具體實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容並不局限於此。
[0035]實施例1水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備:
[0036]1.1酶促溶性羅非魚皮膠原蛋白的提取:
[0037]1.1.1清洗魚皮:取出一定量保存於_20°C的羅非魚皮，用大量自來水浸泡並衝洗，去除魚皮表面殘留的魚肉、魚鱗等其他組織，用超純水浸泡清洗3次，再用吸水紙吸乾魚皮表面的水分，
[0038]1.1.2脫脂:準確稱取1g上述魚皮，將魚皮剪成I X 2cm大小，於4°C冰櫃中，在磁力攪拌器不斷攪拌的條件下，用200mL的10%正丁醇水溶液脫脂8h，重複上述脫脂過程3次，然後用自來水衝洗30min，再用超純水清洗3次；
[0039]1.1.3脫雜蛋白:在4°C冰櫃中，將脫脂後的上述魚皮浸泡於200mL的0.lmol/L氫氧化鈉溶液中脫雜蛋白8h，期間適時用玻璃棒攪拌，重複上述脫脂過程3次，然後用自來水衝洗至中性，再用超純水清洗3次；
[0040]1.1.4酶解提取:用組織粉碎機將上述魚皮粉碎，粉碎後魚皮粉中加入500mL的 0.5mol/L醋酸溶液及0.05g(原料魚皮質量的0.5% )胃蛋白酶(750U/mg Sigma)，於4°C冰櫃中，用磁力攪拌器攪拌提取48h，然後於4°C，lOOOOr/min條件下離心30min，收集上清液；
[0041]1.1.5鹽析及透析:準確稱取5.2596g研磨細碎的氯化鈉，緩緩加入到酶提上清液中(最後濃度為0.9mol/L)，整個過程均在冰水浴和磁力攪拌器不斷攪拌的條件下進行，然後將其置於4°C冰箱中過夜鹽析，於4°C，10000r/min條件下離心30min，收集沉澱，將沉澱復溶於0.5mol/L的醋酸溶液中，復溶液裝於3.5kDa的透析袋中，依次在0.02mol/L磷酸氫二鈉(pH8.6)溶液中透析24h、0.lmol/L醋酸溶液中透析24h和純水中透析48h，整個透析過程均在4 °C冰櫃中進行，
[0042]1.1.6冷凍乾燥:將透析完成的膠原蛋白，在_80°C快速預冷，再在_60°C下冷凍乾燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白。
[0043]1.2羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白自聚製備水凝膠:
[0044]1.2.1不同濃度膠原蛋白自聚製備水凝膠:
[0045]準確稱取10、20、30及40mg的膠原蛋白分別加入到1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰櫃中、磁力攪拌器攪拌條件下充分溶解48h，然後於4°C、20000g條件下離心30min，用移液槍取出上清液，即得濃度分別為1、2、3及4mg/mL的膠原液，然後用lOmol/L氫氧化鈉溶液，調節混合液PH至7.4，迅速將調節好pH的膠原上清液倒入模具中，然後置於37°C水浴中自聚成型lh，然後將成型的不同濃度的水凝膠洗入超純水中，浸泡30min即得不同濃度的水凝膠(參見圖1-3)。
[0046]1.2.2模擬生理鹽水濃度對不同膠原蛋白濃度自聚水凝膠製備的影響:
[0047]準確稱取20、40、60和80mg的膠原蛋白分別溶於1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰櫃中、磁力攪拌器攪拌條件下充分溶解48h，然後於4°C、20000g條件下離心30min，用移液槍取出上清液，即得濃度分別為2、4、6和8mg/mL的膠原液；向各膠原液中緩慢加入10mL40mM含氯化鈉260mM pH為7.4的磷酸鹽緩衝液(膠原液與上述磷酸鹽緩衝液體積比為1:1)即得生理鹽度條件下不同濃度的膠原蛋白液(終濃度為1、2、3和4mg/mL、磷酸鹽終濃度分別為20mM、氯化鈉的終濃度分別為130mM)，期間不斷攪拌，然後用10mol/L氫氧化鈉溶液，調節混合液PH至7.4，迅速將調節好pH的膠原混合液倒入模具中，然後置於37°C水浴中自聚成型lh，然後將成型的生理鹽度條件下的不同濃度的水凝膠洗入超純水中，浸泡30min即得不同濃度的水凝膠(參見圖4-6)。
[0048]實施例2水產魚皮水凝膠抗壓能力測定:
[0049]將上述各條件製備得到的水凝膠放置於水平的玻璃板上，用面積為S的測力計向水凝膠施加一個垂直壓力，緩緩增大壓力，直至水凝膠碎裂為止，記錄水凝膠碎裂時的瞬間壓力F，計算膠原蛋白水凝膠產品的抗壓力性質，公式如下:
[0050]抗壓力強度(N/cm2)= F/S
[0051] 經測定，結果顯示本發明製得的上述不同濃度水凝膠或生理鹽度下的不同濃度的水凝膠，其抗壓強度範圍均在0.2-0.8之間，抗壓能力性質優良。
【權利要求】
1.一種水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法，其特徵在於: 1)將水產魚皮膠原蛋白在4°c下不斷攪拌的條件下，充分溶於濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成膠原液； 2)將溶解後的膠原液離心，收集上清液，待用； 3)用過濾後的10— 15mol/L氫氧化鈉溶液調節上述膠原上清液的pH至7.0-7.8 ； 或，用過濾後的磷酸鹽緩衝液與上述膠原上清液按體積比1:1的比例混合，並不斷攪拌混合液，而後用過濾後的10 — 15mol/L氫氧化鈉溶液調節混合液的pH至7.0—7.8 ； 4)將調節pH後的膠原上清液混合液置於模具中，然後在30-40°C水浴靜置l_2h，使其充分自聚凝固成型； 5)將成型後的水凝膠從模具中取出，置於超純水中浸泡20-30min，即得水產魚皮膠原蛋白水凝膠。
2.按權利要求1所述的水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法，其特徵在於:所述過濾後的磷酸鹽緩衝液為濃度為40mM的含濃度為260mM的氯化鈉的磷酸鹽緩衝液，濾紙過濾，待用。
3.按權利要求2所述的水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法，其特徵在於:所述磷酸鹽緩衝液為磷酸氫 二鈉一磷酸二氫鈉緩衝液，PH7.4。
4.按權利要求1所述的水產魚皮膠原蛋白水凝膠的製備方法，其特徵在於:所述水產魚皮膠原蛋白為羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白； 1)將清洗並吸乾表面水分的羅非魚皮在磁力攪拌下用10%正丁醇對魚皮進行脫脂24h，期間每8h更換一次正丁醇溶液；而後清洗待用； 2)於4°C條件下，用0.lmol/L的氫氧化鈉對上述處理後魚皮進行脫雜蛋白24h，期間每8h更換一次氫氧化鈉溶液,而後清洗待用； 3)將上述脫雜蛋白後的魚皮粉碎，粉碎後魚皮粉與0.5mol/L醋酸溶液按質量比1:50混合，混合後再加入原料魚皮質量0.5% -1%的胃蛋白酶(750U/mg, Sigma),而後於4°C下攬祥提取48h ； 4)將上述提取後魚皮提取液離心收集上清液，並在冰水浴及攪拌的條件下向上清液中緩緩加入研磨細碎的氯化鈉至終濃度為0.9mol/L，而後將液體置於4°C冰箱中過夜鹽析； 5)將上述鹽析液離心，收集沉澱，而後將沉澱復溶於0.5mol/L的醋酸溶液中；所得復溶液裝於3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液(pH8.6)； 6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析後再用純水透析48h ;透析後的膠原液於_80°C快速遇冷，然後_60°C冷凍乾燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白(PSC)。
【文檔編號】C12P21/06GK104031274SQ201410231874
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】閆鳴豔, 史文軍, 秦松, 張朝暉, 崔紅利 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所, 江蘇省海洋水產研究所