具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質的製作方法

2023-09-21 22:31:45

專利名稱：具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及對II型磷脂酶A2具有強抑制活性的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質。
更具體地，本發明涉及對II型磷脂酶A2特異性、親和性好，同時抑制II型磷脂酶A2作用強，作為涉及II型磷脂酶A2的疾病的治療藥可利用的新型單克隆抗體及含其一部分的蛋白質。本發明涉及產生該單克隆抗體或蛋白質的細胞，編碼該單克隆抗體或蛋白質的DNA及含有該DNA的重組載體。本發明進一步涉及含有該單克隆抗體或蛋白質的醫藥組合物或II型磷脂酶A2抑制劑。
背景技術：
已知磷脂酶A2是生物膜構成成分1，2-二醯基磷酸甘油酯C2位上的酯鍵的水解酶。此酶見於哺乳動物的各種臟器和細胞，不僅調節生物膜磷脂的生成和代謝，而且起花生四烯酸級聯反應的限速酶的作用，已知其代謝產物前列腺素、白三烯、血栓烷、PAF等具有很多生理活性。
磷脂酶A2已知有I型、II型、細胞內等種類(厚味嚴一等，日本臨床，1994年特刊，202-206)。其中，II型磷脂酶A2會伴隨炎症反應進入炎症部位的滲出液，大量釋放到血液中。有各種報告表明，這種酶在各種炎症性疾病中使病情惡化或成為一部分病因。例如，Kikuchi-Yanoshita等報告了在心肌梗塞模型大鼠的缺血性心臟疾病中，此酶活性的上升與臟器損害的進展相對應(Kikuchi-Yanoshita，R.et al.，J.Biochemistry，11433-38，1993)。Leong等報告了心肌梗塞患者血中存在比正常人多的此種酶(Leong，L.L et al.，Clinical ExperimentalPharmacology and Physiology，19113-118，1992)。
Lauritzen等報告了在腦梗塞的缺血再灌流障礙中，本酶對疾病的惡化起了重要的作用(Lauritzen I.et al.，Brain Research，651353-356，1994)。Baur等報告了在急性腎功能衰竭中，本酶在病情的惡化上起了重要作用(Baur M.，KlinWochenschr，67196-202，1989)。Murakami等提出，該酶在哮喘等變態反應性疾病中起著中心作用，會促進肥大細胞釋放組胺顆粒，抑制此酶可能開發出哮喘等變態反應性疾病的治療藥(Murakami，M.et al.，Journal of Immunology，1515675-5684，1993)。
Smith等和Pruzanski等報告了慢性類風溼性關節炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Smith G.M.et al.，British Journal ofRheumatology，31175-178，1992；Pruzanski W.et al.，J.Rheumatol.，151351-1355，1988)。Pruzanski等報告了變形性關節炎患者滲出液中同樣存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Pruzanski W.et al.，Life Sciences，482457-2462，1991)。Vadas等報告了敗血性休克患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Vadas P.et al.，Life Sciences，50807-811，1992，Green J.，Inflammation，15355-367，1991)、Nevalainen等報告了胰腺炎患者、特別是重症患者的血中存在大量本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Nevalainen T.J.et al.，Gut，341133-1136，1993)。Anderson等報告了牛皮癬患者皮膚中存在大量本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Anderson S.et al.，Inflammation，181-12，1994)。
Koike等報告了在多器官衰竭(MOF)中，該酶作為病因起了主要作用(Koike K.et al.，Surgery，112173-180，1992)。Koeniger等、Edelson等及Romaschin等報告了在急性呼吸窘迫症候群(ARDS)患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Koeniger R.et al.，Klin Wochenschr，67212-216，1989；Edelson J.D.et al.，AM REV RESPIRDIS，1431102-1109，1991；Romaschin A.et al.，Clin.Biochem.，255-60，1992)。
Minami等報告了在克羅恩病及潰瘍性大腸炎患者血中存在比正常人多的本酶，提示此酶引起或加重該病的可能性(Minami T.et al.，Gut，33914-921，1992)。
另外，據推測，眼色素層炎、新生兒呼吸窘迫症候群(RDS)、支氣管肺發育異常(BPD)等疾病也與本酶有關。
作為抗人II型磷脂酶A2抗體，報導了以下情況。
Stoner等從人胎盤和滑液精製了人II型磷脂酶A2，將其作為抗原，用小鼠獲得單克隆抗體(Stoner C.R.et al.，Journal of Immunological Methods，145127-136，1991)。此文中所用的免疫方法是將BALB/cByJ系小鼠先用與福氏完全佐劑混合的磷脂酶A25μg免疫，再在25日後用3μg免疫。進行脾細胞融合三天前(免疫36天後)以5μg最終免疫。因此，免疫的抗原全量13μg分三次、經36天進行免疫。脾細胞的融合採用小鼠骨髓瘤PAI-0細胞，選擇HAT培養基。培養基上清液用磷脂酶A2經ELISA系統檢測，獲得單克隆抗體(PLA184、PLA185、PLA186、PLA187)。這些抗體具有對人磷脂酶A2的抑制活性。但是，對其它動物磷脂酶A2抑制活性的檢測試驗僅對大鼠II型磷脂酶A2進行了試驗，這些抗體對大鼠II型磷脂酶A2幾乎沒有或完全沒有交叉反應，因此不能用於大鼠動物試驗。
Takayama等從風溼症患者的關節液中提純了人II型磷脂酶A2，作為免疫原，用小鼠獲得了單克隆抗體(Takayama K.et al.，BIOCHEMICAL ANDBIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 1671309-1315，1990)。該文所用的免疫方法為在硝酸纖維素膜上吸附人II型磷脂酶A2 10μg後，製成勻漿，將其接種於BALB/c小鼠脾內。2周後，進行同樣的免疫。從而，免疫的抗原全量20μg分兩次、於28日內免疫。然後，在3天後，進行脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(X63-Ag8.6.5.3)的融合。通過使用磷脂酶A2的ELISA系統檢測培養基的上清液，得到有反應性的單克隆抗體(HP-1、HP-2、HP-3、HP-4)。這些抗體中，對人磷脂酶A2抑制活性最強的為HP-1。然而，即使HP-1，其抑制活性也是弱的，即使加入200倍摩爾比的抗體，也只顯示約80％的抑制活性。
McCord等精製了重組人II型磷脂酶A2，將其作為免疫原，用小鼠得到單克隆抗體(McCord M.et al.，THE JOURNAL OF INVESTIGATIVEDERMATOLOGY 102980-986，1994)。該文所用的免疫方法是對CAF1系小鼠用混合了福氏完全佐劑的磷脂酶A2各以100、50、25μg的量每4周免疫一次。在進行脾細胞融合前3天，進行最終免疫。因而免疫的抗原全量約200μg，分4次，於56日內進行免疫。脾細胞的融合採用小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-AG14，選擇HAT培養基。將培養基上清液。用磷脂酶A2檢測抑制活性，獲得單克隆抗體(3F10)。用此抗體1μg檢測人磷脂酶A2抑制活性。然而，該論文中沒有記載用多少量的人磷脂酶A2，抑制活性是否強並不明確。
Johnson等還在專利申請公開公報(特表平4-506447號公報)中公開了精製重組人磷脂酶A2，將其作為免疫原，用家兔獲得多克隆抗體的方法。這不是單克隆抗體，而且，他們用兩種肽(人磷脂酶A2序列的片斷GTKFLSYKFSNSGSRITC(N末端67-85位)和NKTTYNKKYQYYSNKHSRGSTPRC(N末端109-132位))作為免疫原進行免疫。用此抗體檢測磷脂酶A2抑制活性。然而，從該說明書的記載中，用多少量的抗體和人磷脂酶A2是不清楚的，抑制活性是否強也不明確。
在特開平7-109300號中揭示了能促進人II型磷脂酶A2與硫酸化多糖結合的抗體，但該抗體對人II型磷脂酶A2活性的抑制作用未加以確認。
在上述公知的抗體中，關於對猴、小鼠、家兔、貓、狗和大鼠的II型磷脂酶A2的抑制作用，以及是否能釋放結合於細胞的人磷脂酶A2，尚不明了。
一旦以人的酶免疫小鼠，就容易對人酶的胺基酸序列與小鼠不同的部分產生抗體。因而，將人II型磷脂酶A2給小鼠免疫後，從理論上推斷，結合於人II型磷脂酶A2的抗體與小鼠II型磷脂酶A2幾乎完全不結合。
II型磷脂酶A2的酶活性中心及其鄰近部位一般在動物種間具保守性，即便在小鼠與人之間同源性也相當高。當用人II型磷脂酶A2對小鼠免疫時，由於免疫學的耐受性，難以得到識別酶活性中心及其鄰近部位的抗體。因此，對人II型磷脂酶A2抑制作用強的抗體也難以得到，這是目前的狀況。
強力抑制人II型磷脂酶A2、同時抑制小鼠II型磷脂酶A2和/或猴II型磷脂酶A2的抗體尚未被發現。新藥在進行人體臨床試驗前，必須先通過動物試驗闡明其藥效作用。因此，必須有對實驗動物特別對小鼠等小動物和猴發揮藥效作用的單克隆抗體，即抑制人II型磷脂酶A2的同時，強力抑制這些動物的II型磷脂酶A2的單克隆抗體。
已知在磷脂酶A2水解膜磷脂時，必須與細胞結合(Suga H.et al.，Eur.J.Biochem.，218807-813，1993；Murakami M.et al.，J.Biol.Chem.，268839-844，1993)。因此，如果抗體不但能抑制血中或滲出液中游離狀態的酶，而且能釋放結合於其膜磷脂將被水解的細胞上的磷脂酶A2，由於新的作用機制，可望這樣的抗體具有更強力的磷脂酶A2抑制作用。然而，抗體一旦與結合於細胞表面的磷脂酶A2結合，可預想到補體和/或效應細胞可攻擊所述細胞，因而具有副作用。然而，可釋放結合於細胞的磷脂酶A2的抗體尚未得到。
因此，在考慮作為醫藥品的抗II型磷脂酶A2抗體時，期望獲得強力抑制人II型磷脂酶A2、同時可抑制來自其它動物種類的II型磷脂酶A2的抗體、及具有可釋放與細胞結合的II型磷脂酶A2的性質的抗體。
發明的揭示本發明者們為克服這些問題而進行了刻意研究，完成了以下發明。
即將重組人II型磷脂酶A2按每隻小鼠20μg與福氏完全佐劑混合，以2-3周間隔共免疫8次。這樣，與其他研究者不同，免疫的頻率高，同時免疫的時間長，旨在避免免疫學的耐受性。而且，在篩選抗體時，努力改善了用於磷脂酶A2抑制活性的檢測系統。
即用敏感性高的大腸桿菌磷脂作為磷脂酶A2活性檢測用底物(Jacobson P.B.et al.，Biochem.Pharm.，391557，1990)，並改進了作為底物的大腸桿菌磷脂的製備。大腸桿菌磷脂的製備系採用磷脂酶A2缺失的大腸桿菌SN17(pldA，pla-2，thr-1，leuB6，thi)(Doi，O.et al.，J.Biochem.，801247-1258，1976)，攙入氚標記的油酸，進行製備。使用這種菌，高效地製成了不被大腸桿菌磷脂酶A2分解的、氚標記的比活性高的大腸桿菌磷脂。而且，使用比現有技術(J.Biol.Chem.，2614239-4246，1986)酶反應時間長、敏感性高的檢測系統，高效、精確地篩選了產生目標抗體的雜交瘤。從而，檢測了對得自各種動物的II型磷脂酶A2的活性的抑制效果。
而且，採用檢測所得抗體是否釋放結合於細胞的磷脂酶A2的系統，檢測了抗體的新作用。
結果，成功地獲得以具有如下性質為特徵的單克隆抗體。
即，本發明者們獲得的單克隆抗體對人II型磷脂酶A2有反應性，具有強的抑制活性。而且，與得自猴和小鼠血小板的II型磷脂酶A2顯示交叉反應性，具有強的抑制活性。因此，如果使用本發明的抗體，在進行人體試驗時，可先進行猴、小鼠的動物試驗。此外，本發明的抗體不僅能抑制血中或滲出液中的酶，特別是血中或滲出液中的游離酶，而且能釋放結合於細胞的II型磷脂酶A2。已知II型磷脂酶A2通過細胞表面的硫酸肝素與細胞結合，從而與細胞表面具有硫酸肝素等的肝細胞。血管內皮細胞等結合。本發明的單克隆抗體不僅抑制血中或滲出液中呈游離狀態的酶，而且具有如上所述的從細胞膜釋放結合於細胞的II型磷脂酶A2的性質。
此外，本發明中包括包含具有上述性質的單克隆抗體的一部分，而與該單克隆抗體有同等的抗原結合能力的蛋白質。而且，本發明還包括還原烷基化衍生物，以及對於免疫動物所得的單克隆抗體的胺基酸序列進行了一個或幾個胺基酸添加、缺失、取代或變異而得到的蛋白質，只要它們具有與該單克隆抗體同等的抗原結合能力。
本發明者還從產生本發明所包括的抗體的「雜交瘤1.4」和「雜交瘤10.1」分離出編碼抗體的H鏈和L鏈可變區的cDNA，確定其全鹼基序列。據此，不但可利用遺傳工程技術大量生產抗體，而且可利用遺傳工程技術將本發明所包括的抗體自由地進行改變。(將「雜交瘤1.4」確定的鹼基序列表示為序列1(L鏈)、序列3(H鏈)。從該鹼基序列推測的胺基酸序列表示為序列2(L鏈)、序列4(H鏈)。將「雜交瘤10.1」確定的鹼基序列表示為序列5(L鏈)、序列7(H鏈)。從該鹼基序列推測的胺基酸序列表示為序列6(L鏈)、序列8(H鏈)。)即，本發明包含以下內容(1)可抑制人II型磷脂酶A2的活性、同時抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性的單克隆抗體，或含有該抗體的一部分、具有該抑制活性的蛋白質。
(2)具有釋放結合於細胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含有該抗體的一部分、具有該作用的蛋白質。
(3)如(2)中所述的單克隆抗體或蛋白質，其中磷脂酶A2來自人。
(4)可抑制人II型磷脂酶A2的活性、同時抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性、而且具有釋放結合於細胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含有該抗體的一部分、具有該作用的蛋白質。
(5)從雜交瘤12H5(FERM BP-5300)、雜交瘤1.4(FERM BP-5297)或雜交瘤10.1(FERM BP-5298)產生的單克隆抗體或含有該抗體一部分的蛋白質，或具有與它們同等的對II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體或含有該抗體一部分的蛋白質。
(6)如(1)或(2)中所述的單克隆抗體或含有其一部分的蛋白質，所述單克隆抗體或蛋白質包含具有序列2、4、6或8之一所示的胺基酸序列或具有對該胺基酸序列中所含的一個或幾個胺基酸進行了胺基酸取代、缺失或插入的胺基酸序列的蛋白質。
(7)如(1)或(2)中所述的單克隆抗體、含有該抗體一部分的蛋白質，其中所述單克隆抗體或蛋白質包含具有序列9-20之一所示的胺基酸序列或具有對該胺基酸序列中所含的一個或幾個胺基酸進行了有胺基酸取代、缺失或插入的胺基酸序列的蛋白質。
(8)產生(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質的細胞。
(9)如(8)所述的細胞，所述細胞為雜交瘤。
(10)如(8)所述的細胞，所述細胞是用重組DNA轉化的細胞。
(11)如(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質的製備方法，所述方法包含培養(8)中所述的細胞，從培養上清液回收單克隆抗體或蛋白質的工序。
(12)編碼(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質的DNA。
(13)如(12)所述的DNA，所述DNA包含序列1、3、5或7之一所示的鹼基序列或對該鹼基序列中所含的一個或幾個鹼基進行了鹼基取代、缺失或插入的鹼基序列。
(14)含有(12)或(13)的DNA的重組載體。
(15)由(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質與藥劑學上允許的載體組成的醫藥組合物。
(16)含有(1)-(7)之一所述的單克隆抗體或蛋白質的II型磷脂酶A2抑制劑。
本發明所述的「蛋白質」並不特別限定胺基酸的數目，也包含胺基酸較少的肽。本發明所述的「產生單克隆抗體或蛋白質的細胞」，也只要是產生本發明的單克隆抗體或蛋白質的細胞即可，包含細菌、酵母、哺乳動物細胞等所有細胞。
本發明的單克隆抗體例如可通過在培養基或小鼠腹水中培養小鼠雜交瘤而產生。其片斷F(ab′)2、Fab、Fab′等，例如可將產生的抗體用選自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等的蛋白分解酶進行消化，再作適當的精製而得到。
本發明的雜交瘤，例如雜交瘤12H5、1.4、10.1，可這樣得到將以高的免疫頻率、長的免疫時間用健康人II型磷脂酶A2致敏的BALB/c系小鼠的脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞P3×63Ag8/U1(P3U1)按常規方法，如Kohler和Milstein的細胞融合法進行融合(參照後面的實施例)。
本發明者們取得的、本發明中所包含的小鼠雜交瘤12H5、1.4、10.1分別保藏如下關於雜交瘤12H5的保藏(1)保藏機構名稱、地址名稱通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番3號(郵政編碼305)(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日(3)保藏編號生命研條寄第5300號(FERM BP-5300)關於雜交瘤1.4的保藏(1)保藏機構名稱、地址名稱通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番3號(郵政編碼305)(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日(3)保藏編號生命研條寄第5297號(FERM BP-5297)
關於雜交瘤10.1的保藏(1)保藏機構名稱、地址名稱通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所地址日本國茨城縣つくば市東1丁目1番3號(郵政編碼305)(2)保藏日(最初保藏日)1994年11月22日(3)保藏編號生命研條寄第5298號(FERM BP-5298)作為上述雜交瘤的培養基，可使用在例如Dalbecco改良的Eagle極限必需培養基(以下簡稱「DMEM」)中含有胎牛血清、L-穀氨醯胺、葡萄糖、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇及抗生素(如青黴素G、鏈黴素、慶大黴素等)的培養基等。
雜交瘤的培養通常在如下條件下進行在培養基中於37℃、5％CO2、95％空氣的氣相中培養2-4天，或在以2，6，10，14-四甲基正十五烷(例如姥鮫烷，Aldrich公司制)預處理的BALB/c小鼠腹腔內培養10-20天左右，產生可精製量的抗體。
將編碼本發明抗體的基因的全部或部分插入表達載體中，轉移到大腸桿菌、酵母或動物細胞中，使其產生本發明的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質，也可得到它們。
這樣製得的單克隆抗體可用從培養上清液或腹水中分離精製蛋白質的常規方法加以分離精製。這樣的方法可列舉如離心分離、透析、硫酸銨鹽析、用DEAE-纖維素、羥基磷灰石、A蛋白瓊脂糖等柱層析等。
這樣分離精製所得的抗體，可按常規方法，用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶進行消化，再按蛋白質分離精製的常規方法進行分離精製，得到具有活性的部分，如F(ab′)2、Fab、Fab′、Fv。進一步通過用二硫蘇糖醇和碘乙醯胺等按常規方法將橋接抗體的H鏈與H鏈和/或H鏈與L鏈的二硫鍵還原烷基化，可得到H鏈與L鏈僅以非共價鍵結合的抗體的還原烷基化衍生物(有用的免疫試驗法，第39頁，講談社科學書籍)。
關於本發明的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質，為了抑制效應細胞的活性，也可改變Fc部分的胺基酸序列(Duncan，A.R.et al.，Nature，332738，1988；Tao，M.et al.，J.Exp.Med.，178661-667，1993；Lund，J.，J.Immunology，1472657，1991)。也可以用其他蛋白質置換Fc部分。還可將其他蛋白質融合於Fc部分，使其產生新的作用。
在人的治療中使用本發明的單克隆抗體或含該抗體一部分的蛋白質時，較佳的是使用來自人的部分比例高的單克隆抗體或含該抗體一部分的蛋白質。這樣的單克隆抗體的例子可列舉(1)僅作為可變區由來自小鼠等動物的胺基酸序列、作為恆定區由來自人的胺基酸序列組成的抗體，即所謂「嵌合抗體」；(2)僅在互補決定區(或高變區，以下簡稱「CDR」)由來自小鼠等動物的胺基酸序列、其他區域由來自人的胺基酸序列組成的抗體即所謂「人源化抗體」。這些類型的抗體也包括在本發明中。本領域技術人員例如可通過從本發明的雜交瘤分離對應於可變區或CDR的基因，將其與人抗體基因重組，引入宿主細胞進行表達，來製備這些「嵌合抗體」或「人源化抗體」(參照Int.J.Cancer，44，424-433(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,8095-8099(1990))。當基因的鹼基序列確定後，即可使用合成的相應序列的基因，也可使用從雜交瘤和人抗體形成細胞所得的基因與合成基因結合而成的基因。作為對應於可變區或CDR的基因，最好為本發明者們分離所得的、序列1、3、5或7之一所記載的鹼基序列或含其CDR部分的鹼基序列的DNA，或包含編碼序列2、4、6或8之一所記載的胺基酸序列或其CDR部分的鹼基序列的DNA，或具有對該DNA的鹼基序列的一個或幾個鹼基進行了鹼基的取代、缺失或插入的鹼基序列的DNA基因或其一部分的DNA。鹼基的取代、缺失或插入等變異的引入可用公知的方法進行(Gillamn et al.，Gene，8，81-97(1979)；Roberts et al.，Nature，328，731-734(1987))。在所得的變異鹼基序列中，選擇編碼具有較佳性質的胺基酸序列的序列，可用噬菌體展示法(Annu.Rev.Immunol.，12，433-455(1994))等。特別是，具體的關於「人源化抗體」，本領域技術人員可按照公知的方法容易地進行製備(Nature，321，522-525(1986)；Science，239，1534-1536(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，86,10029-10033(1989)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，88,2869-2873(1991))。根據這些文獻，製備「人源化抗體」時，較佳的是使用與衍生該被移植的CDR的人以外的生物的抗體高度同源的人抗體，作為僅在CDR部位以人以外的生物衍生的CDR取代的人抗體(即構成「人源化抗體」的基本骨架的抗體，稱為「人受體抗體」)。如實施例7所示，與本發明者們所得到的本發明中所包括的小鼠抗體高度同源的人抗體有例如Pag-1抗體(Hughes-Jones，N.C.et al.，Biochem.J.，268，135-140(1990))、WEA抗體(Goni，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80,4837-4841(1983))、ITH5-2抗體(Chin，L.T.，et al.，Immunol.Letter，44，25-30(1995))、ITC48抗體(Ohlin，M.，et al.，Mol.Immunol.，31，983-991(1994))，這些抗體據認為適於作為製備「人源化抗體」時的「人受體抗體」。
至於「嵌合抗體」，本領域技術人員可按照公知的方法容易地進行製備(Nature，314，268-270(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,3439-3443(1987)；ibid.，84，214-218(1987)；ibid.，81，6851-6855(1984))。
本發明中所包含的較好的單克隆抗體或蛋白質可列舉用人II型磷脂酶A2致敏，如上所述製成的單克隆抗體12H5或1.4及其片斷F(ab′)2、Fab、Fab′等。可列舉具有這些單克隆抗體或其一部分的可變區或高變區、其他部分來自人的單克隆抗體。
本發明的醫藥組合物非經口投與，即皮下、肌肉或靜脈注射特別有效。非經口投與用的組合物通常由溶解於可投與的載體(較佳為水性載體)的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質的溶液組成。各種水性載體，如水、緩衝液、0.4％食鹽水、0.3％甘氨酸溶液、5％葡萄糖溶液、人白蛋白溶液等均可使用。這些溶液為無菌的，並且一般不含有會形成顆粒的物質。這些組合物可用常規所用的公知的滅菌技術進行滅菌。這些組合物可含有緩衝劑、等滲劑之類為接近生理條件所必需的藥劑學上允許的輔助劑，如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、枸櫞酸鈉等。可非經口投與的組合物的實際製備可採用本領域熟練技術人員知道的或眾所周知的技術，如記載於「Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA(1980)＂的技術。
本發明的單克隆抗體或蛋白質或醫藥組合物可冷凍儲存，或冷凍乾燥儲存而於使用前用適當的溶劑溶解再生後使用。冷凍乾燥和再生可用採用本領域技術人員已知的技術。
附圖的簡單說明

圖1表示用重組人II型磷脂酶A2對12H5、10.1和1.4的ELISA結果。
圖2表示12H5、10.1和1.4對來自大鼠血小板的磷脂酶A2活性的ELISA結果。
圖3表示12H5、10.1和1.4對重組人II型磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖4表示12H5、10.1和1.4對大鼠II型磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖5表示12H5對來自各種動物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖6表示10.1對來自各種動物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖7表示1.4對來自各種動物血小板的磷脂酶A2活性的抑制作用。
圖8表示12H5、10.1和1.4釋放結合於BRL-3A細胞的磷脂酶A2的作用。
圖9表示1.4的H鏈和L鏈可變區cDNA錨式PCR克隆方法。
圖10表示抗體1.4的L鏈可變區的cDNA序列及翻譯所得的胺基酸序列。對應於CDR序列的推測的序列加下劃線。
圖11表示抗體1.4的H鏈可變區的cDNA序列及翻譯所得的胺基酸序列。對應於CDR序列的推測的序列加下劃線。
圖12表示10.1的H鏈和L鏈可變區cDNA的PCR克隆方法。
圖13表示抗體10.1的L鏈可變區的cDNA序列及翻譯所得的胺基酸序列。對應於CDR序列的推測的序列加下劃線。
圖14表示抗體10.1的H鏈可變區的cDNA序列及翻譯所得的胺基酸序列。對應於CDR序列的推測的序列加下劃線。
實施發明的最佳方案以下描述本發明的實施例，但本發明不受這些實施例的限制。
實施例1 雜交瘤12.5、1.4、10.1的製備(a)重組人II型磷脂酶A2的製備本發明的單克隆抗體可通過將重組人II型磷脂酶A2免疫動物而得到，關於重組人II型磷脂酶A2的製備，按照特開平5-192167號公報中記載的方法進行。
(b)經免疫的脾細胞的製備將實施例1(a)中精製所得的重組人II型磷脂酶A2按每隻動物20μg溶解於0.1ml生理鹽水中，與等體積福氏完全佐劑混合，乳化，給BALB/c雄性小鼠(開始免疫時是6周齡)腹腔注射(初次免疫)。以後按2-3周間隔，用同量的磷脂酶A2和同體積福氏完全佐劑混合乳化而成的乳劑進行加強免疫7次。第7次免疫的24天後，將磷脂酶A2(20μg/只)溶於0.2ml生理鹽水，腹腔注射(最終免疫)。最終免疫3天後，從1隻小鼠取脾細胞，懸浮於DMEM培養基中。
(c)雜交瘤12H5、1.4、10.1的製備將如上製備的脾細胞(1×108個)與小鼠骨髓瘤細胞P3×63Ag8·U1(P3U1)(2×107個)按KohlerMilstein的方法(見Nature，256，495(1975))進行融合。即將脾細胞與P3U1細胞用DMEM洗滌幾次後，一起放入50ml塑料離心管，充分混合。再離心分離除去培養基，在攪拌下，用1分鐘向其中緩緩加入保溫於37℃的含50％(w/v)聚乙二醇(Sigma，平均分子量3350)的DMEM1ml。
然後，滴加保溫於37℃的DMEM 10ml，使細胞融合反應終止。離心分離反應液，除去上清液後，向殘渣中加入HAT培養基(含有添加了次黃嘌呤(1×10-4M)、氨基喋呤(4×10-7M)、胸苷(1.6×10-5M)的10％胎牛血清的DMEM培養基)，使脾細胞濃度達到6×105個/ml。將此細胞懸浮液按每孔200μl(脾細胞1.2×105個)分別注入96孔塑料板。11天後，吸去半量培養基，加入上述HAT培養基。細胞融合7-10天後，約半數孔中見到雜交瘤的增殖。用下述(d)的方法測定培養上清液中的抗體活性。將陽性的克隆移至48孔塑料板，再移至24孔塑料板，除了不含氨基喋呤外，用與上述同樣的培養基進行培養。用24孔塑料板培養上清液按(d)的方法確認抗體活性的重現性，同時用(e)的方法測定酶抑制活性。
為了證實顯示酶抑制活性的3個克隆為單克隆，用有限稀釋法進行連續克隆化。將這樣所得的克隆產生的單克隆抗體分別命名為12H5、1.4和10.1。
(d)用ELISA法測定抗體的活性將精製的重組人II型磷脂酶A2用20mM Tris緩衝的食鹽水(TBS，pH7.4)溶解成0.05μg/ml，在96孔平底微量滴定板的各孔中每孔加入100μl，在溼潤室中於4℃保存一夜。然後，棄去溶液，每孔添加含有1％BSA的TBS 200μl，37℃靜置1小時，以封閉各孔的未吸附部分。然後，用含0.05％吐溫20(商品名)的TBS(TBS-吐溫)溶液洗滌幾次。將雜交瘤培養上清液或腹水或精製的抗體製品用含0.2％BSA的TBS-吐溫(BSA-TBS-吐溫)溶液稀釋，在每孔中各加入100μl，室溫反應2小時。
與前面同樣的用TBS-吐溫溶液洗滌後，在每個孔中各加入以BSA-TBS-吐溫溶液200倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗小鼠抗體(Zymed公司制)100μl，室溫下反應2小時。反應後，與前面同樣的用TBS-吐溫溶液洗滌後，各加入含0.006％過氧化氫和3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(0.1mg/ml)的0.1M乙酸-枸櫞酸鈉緩衝液(pH5.8)100μl作為酶底物，室溫下靜置30分鐘。靜置後，各加入3M硫酸25μl使反應停止，測定450nm的吸光度。
(e)磷脂酶A2抑制活性的測定用如下對生物化學雜誌的方法(Pepinsky，R.B.et al.，J.Biol.Chem.，261(9)，4239-4246(1986))作了若干改良的方法測定抗體對磷脂酶A2的抑制活性。
將重組人II型磷脂酶A2精製製品0.5ng和培養上清液或精製抗體製品在含150mM氯化鈉、12.5mM氯化鈣和250μg/ml牛血清白蛋白的125mM Tris-鹽酸緩衝液(pH8.0)100μl中，室溫下預培養2小時。然後，將摻入氚標記的油酸的大腸桿菌SN17的高壓消毒的製品25μl(5萬-10萬cpm)加入反應液中，37℃反應30分鐘。將反應混合物轉入冰中，加入4N鹽酸25μl終止反應。反應終止後，加入40mg/ml牛血清白蛋白25μl，混合後在冰中放置30分鐘。
然後，於15000rpm離心2分鐘，測定上清液的放射活性。從所得的放射活性中減去陰性對照(不含磷脂酶A2和抗體的樣品的放射活性)，所得的值作為磷脂酶A2的活性。抗體對磷脂酶A2活性的抑制率以陽性對照的磷脂酶A2活性(含所述磷脂酶A2但不含抗體的樣品的磷脂酶A2活性)為基準，按如下計算表示為百分率。
磷脂酶A2活性抑制率＝{1-(磷脂酶A2與培養上清液或精製抗體製品一起保溫後的磷脂酶A2活性)/(陽性對照的磷脂酶A2活性)}×100在磷脂酶A2活性測定中作為底物用的摻入氚標記油酸的大腸桿菌的高壓消毒製品按特開平5-192167號公報第8頁記載的方法進行製備。
實施例2 單克隆抗體的產生和精製(a)單克隆抗體的產生BALB/c小鼠出生後5-6周腹腔注射2，6，10，14-四甲基正十五烷(姥鮫烷，Sigma)0.5ml，14-21天後，腹腔內接種以0.5ml生理鹽水懸浮的5×106個雜交瘤細胞。10-20天後，處死小鼠，剖腹，取其產生的腹水。從每隻小鼠得到5-10ml含有單克隆抗體的腹水。
(b)單克隆抗體的精製將此腹水離心分離除去不溶物後，加入等體積的飽和硫酸銨溶液，於冰上攪拌1小時。離心分離產生的沉澱，溶於少量含0.9％氯化鈉的0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，對100倍體積的同一緩衝液於4℃透析一夜，得到粗Y-球蛋白部分。使用MAPS-II小鼠單克隆抗體精製試劑盒(商標，BioRad Laboratories制)，從此部分提純IgG。
即在Y-球蛋白部分加入等體積的結合緩衝液，混合後，加到以同樣的結合緩衝液充分平衡過的A蛋白-瓊脂糖CL4B(Pharmacia制)填充的柱上(凝膠床體積20ml)，用3倍柱體積的結合緩衝液洗滌。然後用試劑盒中所裝的洗脫緩衝液約3倍柱體積洗脫IgG。洗脫的IgG對20mM Tris-緩衝食鹽水(pH7.4)等進行透析，將此作為抗體製品。通常每ml腹水中得到5-10mg IgG。
實施例3抗體亞類的確定用雜交瘤培養上清液，採用Amersham制的小鼠單克隆抗體分型用試劑盒測定其IgG亞類。本方法基於ELISA法，分別確定了12H5(IgG2a)、1.4(IgG2a)和10.1(IgGl)。
實施例4抗體的交叉反應性(a)大鼠II型磷脂酶A2的精製在大鼠PRP(富血小板血漿)中加入1/5體積的ACD液(含65mM檸檬酸和85mM檸檬酸鈉的2％(w/v)的葡萄糖液)，以2500×g離心10分鐘。將沉澱的血小板加ACD/F10培養基(1∶5)(F10，Gibco制)混合液懸浮成2×109個細胞/毫升後，以2500×g離心10分鐘。再將沉澱的血小板用F10培養基再懸浮成2×109個細胞/毫升，然後依次加入1M氯化鈣和2500單位/毫升凝血酶使終濃度為2mM和2.5單位。
添加後，37℃培養5分鐘，再於4℃、3000×g離心15分鐘，回收上清液(凝血酶刺激的大鼠血小板上清液)，將此上清液供給以後的精製操作。磷脂酶A2的精製系將特開平5-192167號公報第12頁記載的方法作若干改良。即將凝血酶刺激的大鼠血小板上清液通過預先用0.1M乙酸鹽緩衝液(pH6.0)平衡過的硫酸化cellulofine(生化學工業株式會社制)柱(Econocolumn，柱體積20ml，BIO-RAD公司制)。將洗滌液(含0.5M氯化鈉的0.1M乙酸鹽緩衝液(pH6.0))200ml通過該柱進行充分洗滌後，用30ml洗脫液(含1.5M氯化鈉的0.1M乙酸鹽緩衝液(pH6.0))洗脫，所得的流份為硫酸化cellulofine結合部分。然後，再用HPLC分離出硫酸化cellulofine結合部分。
用LC-4AHPLC系統(島津製作所制)，採用CAPCELL PAK C 18柱(4.6mmID×25cm；資生堂制)，全部以1ml/分的流速進行HPLC。硫酸化cellulofine結合部分通過柱後，讓0.1％三氟乙酸通過柱60分鐘。然後，在0.1％三氟乙酸存在下，以0-50％的線性梯度的乙腈洗脫磷脂酶A2。磷脂酶A2的峰出現在約30％乙腈附近，故在此加以回收。
回收的部分用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和銀染色法鑑定，檢出磷脂酶A2單一區帶，證實此帶為大鼠II型磷脂酶A2。
(b)來自人、猴、狗、家兔、貓和小鼠血小板的II型磷脂酶A2的製備按照生物化學雜誌(J.Biol.Chem.，264(10)，5768-5775(1989))記載的人血小板破碎液的製備方法製備來自各種動物血小板的II型磷脂酶A2。
即，從人、恆河猴、狗、家兔、小鼠和貓製備PRP(富血小板血漿)，添加EDTA使終濃度成為2mM後，2500×g離心10分鐘，回收細胞。將細胞懸浮在含有120mM氯化鈉和2mM EDTA的30mM Tris-鹽酸緩衝液(pH7.4)中，再以2500×g離心10分鐘。本操作進行2次後，將所得的細胞再懸浮於含有120mM氯化鈉和2mM EDTA的30mM Tris-鹽酸緩衝液(pH7.4)中，使每毫升含2×109個細胞，冷凍於液氮中。
使冷凍的細胞懸浮液融解，加入等體積0.36N的硫酸，進行超聲粉碎(BIOMC 7040 ULTRA SONIC PROCESSORSeiko制，輸出80，15秒×6次)。所得的細胞超聲波破碎液在冰中放置60分鐘後，於4℃、10000×g離心30分鐘，回收上清液。在沉澱中再加入離心上清液1/3體積的0.18N硫酸，再懸浮後，在冰中放置60分鐘。然後於4℃、10000×g離心30分鐘，回收上清液。合併兩次離心上清液，對含有200mM氯化鈉的50mM乙酸鹽緩衝液(pH4.5)透析一夜。透析後，將細胞破碎液於4℃、15000×g離心40分鐘，回收上清液，作為來自血小板的磷脂酶A2。
(c)ELISA反應性用實施例2(b)中所得的各種單克隆抗體純品進行如下實驗。將IgG製品用BSA-TBS-吐溫配成10μg/ml，進行系列3倍稀釋。按照實施例1(d)，進行ELISA，研究對重組人II型磷脂酶A2和大鼠II型磷脂酶A2的交叉反應性。將實施例1(d)的重組人II型磷脂酶A2換成大鼠II型磷脂酶A2，進行對大鼠II型磷脂酶A2的ELISA。
結果見圖1-圖2，圖中橫軸為抗體濃度，縱軸為450nm處的吸光度。對於12H5和1.4觀察到對大鼠磷脂酶A2的交叉反應性，對於10.1未見交叉反應性。
(d)對來自各種動物的磷脂酶A2的抑制活性用實施例2(b)中所得的各種單克隆抗體純品進行如下實驗。
(1)對重組人II型磷脂酶A2的抑制活性用實施例1(a)的重組人II型磷脂酶A2，按照實施例1(e)測定對磷脂酶A2的抑制活性。各抗體對重組人II型磷脂酶A2活性的抑制率見圖3，將磷脂酶A2和抗體樣品預培養後的抗體濃度作為橫軸。12H5和1.4在10μg/ml的濃度時幾乎完全抑制磷脂酶A2的活性。而10.1在3μg/ml的濃度達到80％的抑制率。
(2)對大鼠II型磷脂酶A2的抑制活性將實施例1(e)的重組人II型磷脂酶A2換成實施例4(a)的大鼠II型磷脂酶A2精製品(0.5ng)，測定對磷脂酶A2的抑制活性。各抗體對大鼠II型磷脂酶A2活性的抑制率見圖4，將磷脂酶A2和抗體樣品預培養後的抗體濃度作為橫軸。12H5和1.4也抑制大鼠II型磷脂酶A2的活性，抑制磷脂酶A2活性50％所需的抗體濃度在12H5為5μg/ml。
(3)對來自人、猴、狗、家兔、貓和小鼠血小板的II型磷脂酶A2的抑制活性將實施例1(e)的重組人II型磷脂酶A2換成一定量的各血小板破碎液(20-40μl)，測定對磷脂酶A2的抑制活性。各抗體對來自血小板的磷脂酶A2活性的抑制率見圖5-圖7，橫軸為血小板破碎液和抗體樣品預培養後的抗體濃度。12H5、1.4和10.1對來自人血小板的磷脂酶A2活性與重組人II型磷脂酶A2活性同樣地具有抑制作用。從而表明，本發明的抗重組人II型磷脂酶A2的抗體具有抑制天然人II型磷脂酶A2活性的能力。另一方面，本發明的抗體抑制來自恆河猴、小鼠的血小板的磷脂酶A2的活性。對來自狗血小板的磷脂酶A2活性也能部分抑制。而對來自家兔、貓的血小板的磷脂酶A2活性則無抑制作用。
實施例5 抗體釋放結合於細胞的II型磷脂酶A2的活性在96孔平板培養皿(Falcon公司制)上，用F12K/10％FCS(F12K大日本製藥社制)培養肝細胞(BRL-3A購自大日本製藥)。將長成鋪滿細胞後的培養基棄去，加入含有以4ng125I標記的重組人II型磷脂酶A2的F12K/10％FCS 50μl，於37℃培養，使磷脂酶A2與細胞結合。1小時後，加入含有精製抗體製品的F12K/10％FCS或者F12K/10％FCS 50μl，再培養2小時。培養後，回收培養液，測定其放射活性。同時，將添加到反應系統中的4ng125I標記的磷脂酶A2的放射活性另外加以測定。
以所添加的磷脂酶A2的放射活性減去磷脂酶A2與細胞結合後添加F12K/10％FCS培養後的培養液的放射活性所得的值作為100％，抗體從細胞釋放磷脂酶A2的活性表示為添加各種濃度抗體進行培養後的培養液的放射活性的百分率。
重組人II型磷脂酶A2的125I標記用以下方法進行。在塗有IODOGEN(Pierce公司制)10μg的玻璃試管中加入含有30μg重組人II型磷脂酶A2的100mMTris-鹽酸緩衝液(pH7.4)100μl，加入100mCi/ml Na125I(ICN公司制)6μl後，在室溫下放置20分鐘。從玻璃試管中取出反應液使反應終止。用凝膠過濾法除去未反應的Na125I。
在結合了磷脂酶A2的細胞中加入各種濃度的精製抗體製品進行培養，測定培養液的放射活性。各抗體釋放結合於細胞的磷脂酶A2的活性見圖8，橫軸為加入抗體後培養液中的抗體濃度。作為對照的小鼠抗體完全不從細胞釋放磷脂酶A2，而12H5、10.1和1.4濃度依賴性地從細胞釋放磷脂酶A2。
實施例6 抗體的H鏈和L鏈可變區cDNA的克隆使用QuickPrep Micro mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)，從約107個雜交瘤細胞製成用於cDNA克隆的信使RNA。即將細胞懸浮於提取緩衝液，用寡(dT)-纖維素分離mRNA。
使用5′RACE系統試劑盒(Gibco制)，按圖9所示順序製成抗體1.4的H鏈和L鏈可變區cDNA。即使用與恆定區基因(C)雜交形成的引物和逆轉錄酶(SUPER SCRIPTII逆轉錄酶)，以1μg mRNA為模板，合成單鏈cDNA。此處所用的引物對於L鏈為「GSP 1L(5′-GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3′)/序列21」，對於H鏈為「GSP 1H(5′-GGAA(AG)TA(AGC)CCCTTGACCAGGC-3′)/序列22」。GSP 1H序列中，括號內的序列表示對應於簡併的鹼基。然後，在用RNA酶H消化作為模板的mRNA後，用「GLASSMAX Spin Cartridge」提純單鏈DNA。用dCTP和末端脫氧核苷酸轉移酶在單鏈cDNA的3′末端連接聚(dC)尾。使用與聚(dC)尾雜交的錨定引物(5′-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′/序列23)和與恆定區基因(C)雜交的引物「GSP 2L(5′-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3′)/序列24」(在L鏈的情況下)或「GSP 2H(5′-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(TC)GTTTTGGC-3′)/序列25」(在H鏈的情況下)，使用LATaq(寶酒造社制)，使H鏈和L鏈可變區基因(V)擴增。GSP 2H序列中括號內的序列表示對應於簡併的鹼基。將這些PCR反應產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，可檢出對應於約550-570鹼基對的H鏈和L鏈單一區帶。
使用「Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontec制)」，按圖12的方法製成抗體10.1的H鏈和L鏈可變區cDNA。即使用「Marathon cDNA合成引物」和逆轉錄酶，以1μg mRNA為模板，合成單鏈cDNA。再使此反應液與RNA酶H、DNA聚合酶I、DNA連接酶反應，合成雙鏈cDNA。然後，將此反應液用T4 DNA聚合酶催化反應，使雙鏈DNA末端平整。使用T4 DNA連接酶，使MarathoncDNA銜接頭結合於雙鏈cDNA。用與銜接頭雜交的銜接引物1和引物GSP2L(在L鏈的情況下)或GSP2H(在H鏈的情況下)，使用LATaq(寶酒造社制)使H鏈和L鏈可變區基因(V)擴增。將此PCR反應產物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，可檢出對應於約550-570鹼基對的H鏈和L鏈單一區帶。
為了測定序列，使用「TA克隆試劑盒(Invitrogen制)」，將PCR擴增的片斷整合到pCRTMII載體中。將插入此片斷的pCRTMII質粒轉化到大腸桿菌JM109的感受態細胞(寶酒造社制)中。用板上形成的集落和與pCRTMII雜交的「5′引物UD(5′-ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3′)/序列26」和「3′引物-DU(5′-ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3′)/序列27」，使用Taq聚合酶(寶酒造社制)進行克隆-PCR。用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增的DNA片斷，從約600-620個鹼基對的片斷擴增的克隆中選出抗體1.4L鏈3個克隆，H鏈4個克隆，及抗體10.1L鏈2個克隆，H鏈4個克隆。培養各克隆的大腸桿菌，用「QIAwell-8質粒純化試劑盒(Qiagen制)」製備質粒DNA。
用所製得的各克隆的質粒DNA和引物UD、引物DU，或L鏈用的GSP2L，H鏈用GSP2H，使用「DNA序列測定試劑盒(Parkin-Elmer制)，進行序列測定反應，用373DNA序列分析儀(ABI制)進行分析。抗體1.4的3個L鏈特異性和4個H鏈特異性克隆，及抗體10.1的2個L鏈特異性和4個H鏈特異性克隆分別具有相同的序列。圖10(序列1和2)關於抗體1.4的L鏈、圖11(序列3和4)關於抗體1.4的H鏈，分別表示可變區的cDNA序列及推斷的胺基酸序列。圖13(序列5和6)關於抗體10.1的L鏈、圖14(序列7和8)關於抗體10.1的H鏈，分別表示可變區的cDNA序列及推斷的胺基酸序列。在各圖中，對應於CDR序列推測的序列加下劃線。(抗體1.4L鏈的推測的CDR序列以序列9-11表示，抗體1.4H鏈的推測的CDR序列以序列12-14表示，抗體10.1L鏈的推測的CDR序列以序列15-17表示，抗體10.1H鏈的推測的CDR序列以序列18-20表示。)實施例7 抗體1.4和抗體10.1的H鏈和L鏈可變區的胺基酸序列與人抗體胺基酸序列的同源性檢索從GenBank、EMBL、SWISS-PROT、PIR、PRF資料庫檢索與實施例6中所得的抗體1.4和抗體10.1的H鏈和L鏈可變區的胺基酸序列具有高度同源性的人抗體。同源性檢索採用BLASTP 1.4.8MP(Altschul，S.F.et al.，J.Mo1.Biol.，215，403-410(1990))方案進行。其結果表明，抗體1.4與諸如Pag-1抗體(Hughes-Jones，N.C.et al.，Biochem.J.，268，135-140(1990))和WEA抗體(Goni，F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80,4837-4841(1983))等具有高度同源性。抗體10.1與諸如ITH 5-2抗體(Chin，L.T.et al.，Immunol.Letter，44，25-30(1995))、ITC 48抗體(Ohlin，M.，et al.，Mol.Immunol.，31，983-991(1994))等具有高度同源性。
產業上利用的可能性本發明的單克隆抗體及含其一部分的蛋白質與人II型磷脂酶A2有反應性，具有強的抑制活性。而且，所述抗體和蛋白質與來自猴和/或小鼠血小板的II型磷脂酶A2顯示交叉反應性，因此在作為實驗動物的這些動物上也可適用，在對人試驗藥理效應前可先在猴、小鼠身上進行動物試驗，這是其有利之處。此外，本發明的單克隆抗體及含其一部分的蛋白質可釋放結合於細胞的II型磷脂酶A2，因此對II型磷脂酶A2具有特別強的抑制活性，被認為不會產生因補體和/或效應細胞的攻擊而引起的副作用。
本發明的單克隆抗體及含其一部分的蛋白質可用作人II型磷脂酶A2被認為是病情惡化或引起疾病的原因之一的各種疾病的治療劑，如心肌梗塞、腦梗塞、急性腎衰竭、哮喘等變應性疾病、慢性類風溼性關節炎、變形性關節炎、敗血性休克、胰腺炎、牛皮癬、多臟器衰竭(MOF)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、克羅恩病和潰瘍性大腸炎、葡萄膜炎、新生兒呼吸窘迫症候群(RDS)、支氣管肺發育異常(BPD)等。
序列表序列編號1序列長度393序列類型核酸鏈的數目雙鏈拓撲學直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細胞系1.4序列的特徵表示特徵的代號CDS存在的位置1..393鑑定特徵的方法E序列ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA48Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCC TTG GCT96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30GTG TCT TTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser35 40 45GTT GAT AGT TAT GGC ATT AGT TTT ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA 192Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60GGA CAG CCC CCC AAA CTC CTC ATT TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAA TTC ACC 288Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr85 90 95CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT CAC TGT 336Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys100 105 110CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG 384Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu115 120 125GAA ATA AAA 393Glu Ile Lys130序列編號2序列長度131序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 510 15Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser35 40 45Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser65 70 75 80Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Glu Phe Thr85 90 95Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr His Cys100 105 110Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys130序列編號3序列長度408序列類型核酸鏈的數目雙鏈拓撲學直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細胞系1.4序列的特徵表示特徵的代號CDS存在的位置1..408鑑定特徵的方法E序列ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT TTC48Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe1 5 10 15CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAA TCG GGA CCT GGC CTG GTG AAA CCT96Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro20 25 30TCT CAA TCT CTG TCC CTC ACC TGC ATG GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr35 40 45AGT GAT TAT GCC TGG AAC TGG ATC CGG CAG TTT CCG GGA AAC AAA CTG 192Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu50 55 60GAG CGG ATG GGA TAC ATA AGG TAC AGT GGT TAC ACT AGC TAC AAC CCA 240Glu Arg Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro65 70 75 80TCT CTC AAA AGT CGA ATC TTT ATC ACG CGA GAC ACA TCC CAG AAC CAG 288Ser Leu Lys Ser Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln85 90 95TTC TTC CTA CAT TTG ACT TCT GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT 336Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr100 105 110TAC TGT ACA AGA GAC TTG GAC GCC TGG TAC TTC GAT GTT TGG GGC GCA 384Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala115 120 125GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCC TCA 408Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號4序列長度136序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Phe1 510 15Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro20 25 30Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr35 40 45Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu50 55 60Glu Arg Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro65 70 75 80Ser Leu Lys Ser Arg Ile Phe Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln85 90 95Phe Phe Leu His Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr100 105 110Tyr Cys Thr Arg Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala115 120 125Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號5序列長度381序列類型核酸鏈的數目雙鏈拓撲學直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細胞系10.1序列的特徵表示特徵的代號CDS存在的位置1..381鑑定特徵的方法E序列ATG GAA TCA CAG ACT CTG GTC TTC ATA TCC ATA CTG CTC TGG TTA TAT48Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr1 5 10 15GGA GCT GAT GGG AAC ATT GTA ATG ACC CAA TCT CCC AAA TCC ATG TCC96Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser20 25 30ATG TCA GTA GGA GAG AGG GTC ACC TTG ACC TGC AAG GCC AGT GAG AAT 144Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn35 40 45GTG GTT ACT TAT GTT TCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAG CAG TCT CCT 192Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro50 55 60AAA CTG CTG ATA TAC GGG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGG GTC CCC GAT 240Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp65 70 75 80CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GCA ACA GAT TTC ACT CTG ACC ATC AGC 288Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTT GCA GAT TAT CAC TGT GGA CAG GGT TAC 336Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr100 105 110AGC TAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA 381Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125序列編號6序列長度127序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr1 510 15Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser20 25 30Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn35 40 45Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro50 55 60Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp65 70 75 80Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr100 105 110Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125序列編號7序列長度414序列類型核酸鏈的數目雙鏈拓撲學直鏈狀序列的種類mRNA的cDNA起源細胞系10.1序列的特徵表示特徵的代號CDS存在的位置1..414鑑定特徵的方法E序列ATG GCT GTC CTG GCA TTA CTT TTT TGC CTG GTA ACA TTC CCA AGC TGT48Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys1 510 15ATC CTT TCC CAG GTG CAG CTG AAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG96Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala20 25 30CCC TCA CAG AGC CTG TCC ATC ACA TGT ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA 144Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu35 40 45ACC GAC TTT GGT GTA AAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG 192Thr Asp Phe Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60GAG TGG CTG GGA ATG ATA TGG ACT GAT GGA ATC ACA GAC TAT AAT TCA 240Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser65 70 75 80GTT CTC AAA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC ACC TCC AAG AGC CAA 288Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln85 90 95GTT TTC TTG AAA ATG AAC AAT CTG CAA ACT GAT GAC ACA GCC AGG TAC 336Val Phe Leu Lys Met Asn Asn Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr100 105 110TAC TGT GCC AGA GAT GCA TAC TAC GGC TTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG 384Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp115 120 125GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 414Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號8序列長度138序列類型胺基酸鏈的數目雙鏈拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys1 510 15Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala20 25 30Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu35 40 45Thr Asp Phe Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser65 70 75 80Val Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln85 90 95Val Phe Leu Lys Met Asn Asn Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser130 135序列編號9序列長度15序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His1 510 15序列編號10序列長度7序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser1 5序列編號11序列長度9序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr1 5
序列編號12序列長度6序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Ser Asp Tyr Ala Trp Asn1 5序列編號13序列長度16序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15序列編號14序列長度9序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系1.4序列Asp Leu Asp Ala Trp Tyr Phe Asp Val1 5序列編號15序列長度11序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser1 5 10序列編號16序列長度7序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr15序列編號17序列長度9序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr15序列編號18序列長度5序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Asp Phe Gly Val Asn1 5序列編號19序列長度16序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Met Ile Trp Thr Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser1 5 10 15序列編號20序列長度11序列類型胺基酸拓撲學直鏈狀序列的種類蛋白質起源細胞系10.1序列Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr15 10序列編號21序列長度2序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列GGCACCTCCA GATGTTAACT GC22
序列編號22序列長度20序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列GAARTAVCCC TTGACCAG GC 20序列編號23序列長度48序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列的特徵存在的位置36，37，41，42，46，47其它特徵N表示肌苷(I)。
序列CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48序列編號24序列長度46序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸 合成DNA序列TATAGAGCTC AAGCTTGGAT GGTGGGAAGA TGGATACAGT TGGTGC46
序列編號25序列長度50序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列TATAGAGCTC AAGCTTCCAG TGGATAGACH GATGGGGSTG TYGTTTTGGC50序列編號26序列長度20序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸合成DNA序列ACCGAGCTCG GATCCACTAG20序列編號27序列長度21序列類型核酸拓撲學直鏈狀序列的種類其它核酸 合成DNA序列ATGCATGCTC GAGCGGCCGCC2權利要求
1.抑制人II型磷脂酶A2活性，同時也可抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2活性的單克隆抗體，或含其一部分、具有該抑制活性的蛋白質。
2.具有釋放結合於細胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含其一部分、具有該作用的蛋白質。
3.如權利要求2所述的單克隆抗體或蛋白質，其中磷脂酶A2來自人。
4.抑制人II型磷脂酶A2活性，同時也可抑制猴II型磷脂酶A2和/或小鼠II型磷脂酶A2的活性，並具有釋放結合於細胞膜的II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體，或含其一部分、具有該作用的蛋白質。
5.從雜交瘤12H5(FERM BP-5300)、雜交瘤1.4(FERM BP-5297)或雜交瘤10.1(FERM BP-5298)之一產生的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質，或有與它們同等的對II型磷脂酶A2的作用的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質。
6.如權利要求1或2所述的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質，其特徵在於包含具有序列2、4、6或8之一所述的胺基酸序列或對於該胺基酸序列中所含的1個或幾個胺基酸進行了胺基酸取代、缺失或插入的胺基酸序列的蛋白質。
7.如權利要求1或2所述的單克隆抗體或含其一部分的蛋白質，其特徵在於包含具有序列9-20之一所述的胺基酸序列或對於該胺基酸序列中所含的1個或幾個胺基酸進行了胺基酸取代、缺失或插入的胺基酸序列的蛋白質。
8.產生如權利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質的細胞。
9.如權利要求8所述的細胞，其中所述細胞為雜交瘤。
10.如權利要求8所述的細胞，其中所述細胞為用重組DNA轉化的細胞。
11.製備如權利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質的方法，其特徵在於包括培養權利要求8所述的細胞，從培養上清液中回收單克隆抗體或蛋白質的工序。
12.編碼權利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質的DNA。
13.如權利要求12所述的DNA，其中包含序列1、3、5或7之一所示的鹼基序列或該鹼基序列中所含的1個或幾個鹼基進行了鹼基取代、缺失或插入的鹼基序列。
14.包含權利要求12或13的DNA的重組載體。
15.權利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質與藥劑學上允許的載體組成的醫藥組合物。
16.包含權利要求1-7之一所述的單克隆抗體或蛋白質的II型磷脂酶A2抑制劑。
全文摘要
本發明獲得了抑制Ⅱ型磷脂酶A
文檔編號C07K16/40GK1171792SQ95197145
公開日1998年1月28日 申請日期1995年12月27日 優先權日1994年12月29日
發明者河內康司, 高崎淳, 安永知榮, 曾保安彥 申請人:山之內製藥株式會社