光學純meso‑2,3‑丁二醇高產工程菌株的構建方法及應用與流程

2023-07-21 11:28:46 1

本發明屬於生物技術領域，具體是一種光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株的構建方法，及其在利用廉價原料生產光學純meso-2,3-丁二醇中的應用。

背景技術：

2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一種平臺化合物，在化工、食品、能源、醫藥等領域具有廣泛的應用價值，其微生物發酵生產是現代生物化工的重要課題。2,3-丁二醇分子中含有兩個手性碳原子，因此存在三種光學異構體，分別是(2r,3r)-2,3-丁二醇、(2s,3s)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇。單一構型的meso-2,3-丁二醇不僅具有混旋型2,3-丁二醇的基本功能，而且在不對稱合成高附加值化學品和藥物方面具有巨大的潛在優勢，例如用於合成可再生聚酯或者光學純滷代醇，具有廣闊的應用前景。傳統化學合成法獲得的2,3-丁二醇是三種光學異構體的混合物，不但存在過程繁瑣、產率低、環境汙染嚴重等問題，而且由於不同立體構型2,3-丁二醇的物理化學性質相近，手性拆分成本十分高昂，難以實現大規模低成本生產。因此，開展微生物高效合成單一構型meso-2,3-丁二醇的研究具有重要的意義。

與傳統化學合成法相比，2,3-丁二醇的微生物發酵法對環境友好，工藝簡單，符合綠色化工的要求。目前2,3-丁二醇的高產菌種大多屬於致病微生物，如klebsiellapneumoniae、klebsiellaoxytoca、enterobacteraerogenes、serratiamarcescens、enterobactercloaca，因此限制了這些菌株的產業化應用。另外，目前已報導的2,3-丁二醇發酵菌株所產的2,3-丁二醇多為兩種或三種光學異構體的混合物【biotechnoladv,2011,29:351-364】，同樣存在手性拆分、成本高昂的問題。目前尚未發現能夠發酵生產光學純meso-2,3-丁二醇的天然微生物。因此，迫切需要開發出meso-2,3-丁二醇的產量、轉化率以及光學純度高並且安全可靠的代謝工程菌株。

中國專利201410051821.8公開了克隆e.cloacaesubsp.dissolvens的2,3-丁二醇合成基因簇，該基因簇包括四個基因，其中lysr編碼2,3-丁二醇合成調控因子，buda、budb、budc編碼α-乙醯乳酸合成酶、α-乙醯乳酸脫羧酶、meso-2,3-丁二醇脫氫酶。將該基因簇插入表達載體pet-28a(+)獲得重組質粒petrabc，導入e.coli獲得工程菌株。該工程菌株meso-2,3-丁二醇最高產量為85g/l，但光學純度太低，僅為96％，而且為達到高產需要使用高價原料酵母粉和葡萄糖。此外，pet-28a(+)是高拷貝表達載體，而且該法需要誘導表達數量較多的基因(lysr、buda、budb和budc)，加大了宿主的代謝負荷，會增加大規模工業生產的不穩定性。而目前使用廉價碳源發酵生產meso-2,3-丁二醇的方法，則由於菌株的生產能力不足導致meso-2,3-丁二醇產量偏低，或者光學純度達不到要求。綜上所示，meso-2,3-丁二醇現有合成技術中存在原料成本過高、光學純度太低，產量太低，或者菌株不穩定等問題。

技術實現要素：

本發明針對meso-2,3-丁二醇現有合成技術存在的問題，提供一種光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株的構建及應用。本發明通過對編碼α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因進行密碼子優化及人工合成，利用表達載體構建多順反子表達質粒，利用合成生物學技術在安全模式微生物e.coli中構建meso-2,3-丁二醇的人工合成途徑，使用代謝工程技術對代謝網絡進行優化，敲除主要副產物合成途徑的關鍵基因，提高meso-2,3-丁二醇的光學純度、產量與轉化率。本發明所獲得的工程菌株能夠有效利用非糧木薯和廉價氮源作為發酵原料代替高純糖(葡萄糖)及高價氮源(酵母粉、蛋白腖)。本發明的方法能夠提高meso-2,3-丁二醇光學純度和產量，同時大幅度降低發酵原料的成本。

為了實現以上目的，本發明採用的技術方案如下：

一種光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株的構建方法，包括以下步驟：

(1)將α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因的核苷酸序列進行密碼子優化；(2)將經密碼子優化的α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因拼接獲得包含該三個基因的基因簇；(3)將基因簇插入表達載體中，獲得多順反子重組質粒；(4)將多順反子重組質粒導入宿主菌e.coli，即獲得光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株。

進一步地，所述密碼子優化的具體操作是在α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因每個基因前面添加含核糖體結合位點的核苷酸序列taaggaggatataca。

在細胞內，核糖體負責將mrna翻譯成蛋白質，16srrna是核糖體的一個亞基，它可與taaggaggatataca序列通過鹼基互補原則精確識別，在基因前面添加核糖體結合位點序列，可以增強核糖體與mrna的識別與結合能力，提高目標基因的表達效率，相應的α-乙醯乳酸合成酶、α-乙醯乳酸脫羧酶和meso-2,3-丁二醇脫氫酶活力升高，酶促反應加快，最終提高meso-2,3-丁二醇的合成能力。

進一步地，所述宿主菌e.coli為多基因缺失的突變菌株，其通過疊加敲除菌株中合成副產物的關鍵基因而獲得；所述副產物包括(2r,3r)-2,3-丁二醇、(2s,3s)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸；所述合成副產物的關鍵基因包括glda、dar、frdabcd、ldha、pta、adhe和pflb。

進一步地，所述的α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因的來源菌株選自klebsiellapneumoniae、enterobactercloacae、klebsiellaoxytoca、enterobacteraerogenes、serratiamarcescens、paenibacilluspolymyxa、bacillussubtilis和bacilluslicheniformis。

所述的α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因的來源菌株優選klebsiellapneumoniae、enterobactercloacae。

本發明還提供以上所述基因工程菌株在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)發酵培養基的製備：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化鈣，在80-100℃液化0.5-5h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20h，調節ph6.5-7.5，離心或過濾收集上清液，稀釋上清液後在115℃條件下滅菌15min，即得；按1000ml水計，所述發酵培養基各原料組分分別用量為：木薯粉100-200g，氮源原料40-80g，液化酶0.5-2ml，氯化鈣0.01-0.5g，糖化酶0.2-1ml，蛋白酶0.05-0.5g；所述木薯粉是將木薯去皮曬乾後經粉碎過50-200目篩製備而得；所述氮源原料為棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉、花生蛋白粉中的一種或一種以上組合；

(2)將發酵培養基轉移至發酵罐，然後添加50-100μg/ml氨苄青黴素，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌菌液以體積比為2-10％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度35-40℃、攪拌轉速200-600rpm、通氣量0.2-1.5vvm條件下培養24-72h，當檢測發酵液中meso-2,3-丁二醇的濃度不再增加時，發酵結束。

進一步地，所述基因工程菌菌株的活化方法包括以下步驟：將光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株劃線到含有質量體積比為1.5-1.8％瓊脂和含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養10-15h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養10-15h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

進一步地，在發酵過程中檢測發酵液中葡萄糖的濃度，待葡萄糖濃度降至10-30g/l時，補加木薯還原糖母液使發酵液中葡萄糖濃度為40-80g/l。

進一步地，所述木薯還原糖母液的葡萄糖濃度為500-800g/l。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

1、本發明提供的光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株所用的合成原料來源廣泛、成本低廉，菌株無致病性，菌株產量高、生產效率高、穩定性好，最高產量可達到91.5g/l，光學純度可達99％以上，克服了現有菌株存在的問題。

2、本發明菌株的構建方法具有操作方便簡單、生產效率高、成本低廉等優點，容易實現工業化生產。

3、本發明利用代謝工程敲除宿主菌合成主要副產物的關鍵基因，不需要表達轉錄調控因子，因此培養基中無需添加乙酸(鹽)解除轉錄抑制，簡化操作和降低成本。

4、本發明無需添加具有毒性並且成本較高的誘導劑iptg，工程菌株的外源基因表達水平即可滿足高效合成meso-2,3-丁二醇的需要，降低了生產成本，同時避免基因過量表達產生的代謝負荷，工程菌株性質穩定。

5、本發明利用非糧木薯粉為碳源，棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉或花生蛋白粉為氮源用於發酵meso-2,3-丁二醇，替代已有報導使用的高純糖、酵母粉，不僅可以提高這些廉價原料的綜合利用價值，還為meso-2,3-丁二醇發酵提供了更加廉價的原料，可大幅降低meso-2,3-丁二醇發酵的原料成本。

具體實施方式

下面將結合具體實施例對本發明進一步詳細說明，但不限於本發明的保護範圍。

下述實施例中所涉及的材料：(1)液化酶、糖化酶、蛋白酶為商業化產品，可購於諾維信(中國)生物技術有限公司等公司；(2)棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆餅粉、花生蛋白粉為商業化產品，可購於青島科瑞培養基有限公司等公司。

下述實施例在發酵生產meso-2,3-丁二醇過程中，採用sba-40c分析儀檢測發酵液中葡萄糖濃度，利用液相色譜測定主要副產物的濃度，利用氣相色譜測定2,3-丁二醇各種立體異構體的濃度並計算光學純度。

實施例1

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm1的構建：

將來源於k.pneumoniae菌株的α-乙醯乳酸合成酶基因kpbudb、α-乙醯乳酸脫羧酶基因kpbuda和來源於e.cloacae菌株的meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因ecbudc的核苷酸序列進行密碼子優化，在每個基因前面添加含有核糖體結合位點的核苷酸系列taaggaggatataca；將經過密碼子優化的α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因利用人工合成的方法進行拼接，獲得包含三個基因的基因簇kpbudb-kpbuda-ecbudc，其核苷酸序列長度為3292個鹼基，核苷酸序列如seqidno.1所述；利用雙酶切與連接方法，將kpbudb-kpbuda-ecbudc基因簇插入表達載體ptrc99a中，獲得ptrc99a-kpbudb-kpbuda-ecbudc多順反子重組質粒；將多順反子重組質粒導入宿主菌e.colimg1655，即獲得光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株gxasm1。

實施例2

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm2的構建：

通過分析工程菌株gxasm1發酵的主要副產物為(2r,3r)-2,3-丁二醇、(2s,3s)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸，其合成途徑的關鍵基因是glda、dar、frdabcd、ldha、pta、adhe和pflb。利用大腸桿菌噬菌體來源的red重組系統可在細菌內高效介導同源重組的原理，先用兩側帶有frt位點的抗性基因取代上述目標基因，再通過誘導外源性溫敏質粒表達flp重組酶刪除抗性基因達到敲除目標基因的目的，具體步驟如下：

將pkd46質粒轉化入宿主細胞，製備電轉化感受態細胞；利用引物進行pcr構建打靶序列(含氯黴素抗性基因)，並將其直接轉化含pkd46的宿主細胞；氯黴素平板篩選發生同源重組的克隆；利用測序技術驗證、挑選目標基因被氯黴素抗性基因取代的克隆，製備電轉化感受態細胞；電轉導入pcp20質粒刪除氯黴素抗性基因；氯黴素抗性基因刪除的克隆連續劃線傳代三次，製備甘油管-20℃保存。通過疊加敲除，可獲得多基因缺失的突變株e.colimg1655/δgldaδdarδfrdabcdδldhaδadheδpflb，製備電轉化感受態細胞，將實施例1構建的多順反子重組質粒ptrc99a-kpbudb-kpbuda-ecbudc電轉導入多基因缺失突變株，獲得工程菌株gxasm2。

所述的引物序列分別為：

glda-f:atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgttcctggtgtccctgttgata。

glda-r:caggcaattttgcgttcaaactcccggacaagccgggagtttggagtaggaattgctcctttagagatgagtagtgccaaatgcggcattccagtcgtgtatagatacatcagagcttttacgag。

dar-f:tcatgccgaccaaaatattacccaatgaaatatccacgcacctcactgcgcatatgaatatcctccttagttcctattc。

dar-r:atatgcgccttctatacttaacgtttattcagcgttaagtggagaactcggagctgcttcgaagttccta。

frdabcd-f:cttaccctgaagtacgtggctgtgggataaaaacaatctggaggaatgtccatatgaatatcctccttagttcctattc。

frdabcd-r:cgccataggcgggccggatttacattggcgatgcgttagattgtaacgacgagctgcttcgaagttccta。

ldha-f:cttaccctgaagtacgtggctgtgggataaaaacaatctggaggaatgtccatatgaatatcctccttagttcctattc。

ldha-r:attggggattatctgaatcagctcccctggaatgcaggggagcggcaagagagctgcttcgaagttccta。

pta-f:gtaacgaaagaggataaaccgtgtcccgtattattatgctgatccctacccatatgaatatcctccttagttcctattc

pta-r:ttatttccggttcagatatccgcagcgcaaagctgcggatgatgacgagagagctgcttcgaagttccta

adhe-f:attcgagcagatgatttactaaaaaagtttaacattatcaggagagcattcatatgaatatcctccttagttcctattc

adhe-r:tcggcattgcccagaaggggccgtttatgttgccagacagcgctactgagagctgcttcgaagttccta

pflb-f:gtggagcctttattgtacgctttttactgtacgatttcagtcaaatctaacatatgaatatcctccttagttcctattc

pflb-r:aaataaaaaatccacttaagaaggtaggtgttacatgtccgagcttaatgagctgcttcgaagttccta

實施例3

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm3的構建：

本實施例與實施例1的不同之處是：α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因的來源菌株為enterobactercloacae，meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因的來源菌株為klebsiellaoxytoca。

實施例4

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm4的構建：

本實施例與實施例2的不同之處是：將實施例3構建的多順反子重組質粒電轉導入多基因缺失突變株，獲得工程菌株gxasm4。

實施例5

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm5的構建：

本實施例與實施例1的不同之處是：α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因的來源菌株為serratiamarcescens。

實施例6

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm6的構建：

本實施例與實施例2的不同之處是：將實施例5構建的多順反子重組質粒電轉導入多基因缺失突變株，獲得工程菌株gxasm6。

實施例7

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm7的構建：

本實施例與實施例1的不同之處是：α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因的來源菌株為enterobacteraerogenes。

實施例8

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm8的構建：

本實施例與實施例1的不同之處是：α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因的來源菌株為paenibacilluspolymyxa。

實施例9

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm9的構建：

本實施例與實施例1的不同之處是：α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因的來源菌株為bacillussubtilis。

實施例10

生產meso-2,3-丁二醇基因工程菌株gxasm10的構建：

本實施例與實施例1的不同之處是：α-乙醯乳酸合成酶基因、α-乙醯乳酸脫羧酶基因的來源菌株為bacilluslicheniformis。

實施例2-10合成基因簇的方法與實施例1相同，或為現有常規技術方法，本領域技術人員能夠通過本申請公開的內容獲悉該基因簇的核苷酸序列，對此不再累述實施例2-10對應合成的基因簇的核苷酸序列。

應用實施例1

工程gxasm1、gxasm2、gxasm3、gxasm4、gxasm5、gxasm6、gxasm7、gxasm8、gxasm9、gxasm10在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)木薯去皮曬乾後，粉碎至粒徑為150目；分別稱取十份木薯粉160g，棉籽蛋白粉50g，分別加入1000ml自來水、0.5ml液化酶和0.1g氯化鈣，在90℃液化2h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入0.5ml糖化酶和0.2g蛋白酶，在55℃糖化15h，調節ph至7.5，過濾收集上清液，用自來水稀釋使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發酵培養基；

(2)分別取500ml發酵培養基轉移至上海百侖六聯發酵罐，然後添加100μg/ml氨苄青黴，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌gxasm1、gxasm2、gxasm3、gxasm4、gxasm5、gxasm6、gxasm7、gxasm8、gxasm9、gxasm10菌液以體積比為5％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度37℃、攪拌轉速300rpm、通氣量0.5vvm條件下培養28h後，利用氣相色譜和液相色譜測定產物meso-2,3-丁二醇及主要副產物的濃度，發酵液中meso-2,3-丁二醇的濃度不再增加，發酵結束，並計算meso-2,3-丁二醇的光學純度，測定結果如表1所示。

所述基因工程菌菌液的活化方法：將生產meso-2,3-丁二醇的工程菌株gxasm1至gxasm10分別劃線到含有質量體積比為1.5％瓊脂的並含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養3h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養10h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

表1不同工程菌株的發酵產物

從表中可以得知，敲除副產物合成途徑的關鍵基因glda、dar、frdabcd、ldha、pta、adhe和pflb，工程菌株gxasm2、gxasm4、gxasm6的meso-2,3-丁二醇產量和光學純度與未經過敲除處理的工程菌株(分別對應於gxasm1、gxasm3、gxasm5)相比顯著提高，主要副產物的濃度大大降低，因此經過副產物的敲除不但提高了轉化率，而且有利於下遊的產物提取，能夠降低生產成本並提高產品的質量(光學純度高)。

應用實施例2

工程菌株gxasm2在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)木薯去皮曬乾後，粉碎至粒徑為100目的木薯粉；稱取木薯粉200g，豆粕粉30g，加入1000ml自來水、1.0ml液化酶和0.5g氯化鈣，在80℃液化2h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入1.5ml糖化酶和0.5g蛋白酶，在50℃糖化20h，調節ph至7.0，離心分離收集上清液，用自來水稀釋使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發酵培養基；

(2)分別取500ml發酵培養基轉移至上海百侖六聯發酵罐，然後添加80μg/ml氨苄青黴素，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌gxasm2菌液以體積比為2％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度37℃、攪拌轉速600rpm、通氣量1.2vvm條件下發酵培養18h後，發酵液中葡萄糖濃度下降為25.7g/l，補加木薯還原糖母液使葡萄糖濃度提高到70g/l，發酵30h、48h再補加等量木薯還原糖母液，還原糖母液的葡萄糖濃度為500g/l，總共補料3次。發酵72h後，發酵結束。

所述基因工程菌gxasm2菌液的活化方法：將生產meso-2,3-丁二醇的工程菌株gxasm2劃線到含有質量體積比為1.8％瓊脂的並含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養15h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養12h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

本實施例中meso-2,3-丁二醇產量為91.5g/l，光學純度達到99.3％，主要副產物濃度為：乙酸2.1g/l、丁二酸0.3g/l、乳酸0.4g/l、甲酸0.2g/l、乙醇0.1g/l。

應用實施例3

工程gxasm3在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)木薯去皮曬乾後，粉碎至粒徑為200目；稱取木薯粉100g，花生蛋白粉80g，加入1000ml自來水、1.5ml液化酶和0.1g氯化鈣，在100℃液化0.5h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入2.0ml糖化酶和0.05g蛋白酶，在60℃糖化10h，調節ph至6.5，離心分離收集上清液，用自來水稀釋使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發酵培養基；

(2)分別取500ml發酵培養基轉移至上海百侖六聯發酵罐，然後添加50μg/ml氨苄青黴，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌gxasm3菌液以體積比為10％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度40℃、攪拌轉速200rpm、通氣量0.2vvm條件下發酵培養24h後，發酵液中葡萄糖濃度下降為23.4g/l，補加木薯粉還原糖母液使葡萄糖濃度提高到60g/l，發酵36h、50h再補加等量木薯粉還原糖母液，總共補料3次。發酵72h後，發酵結束。

利用氣相色譜和液相色譜測定產物meso-2,3-丁二醇及主要副產物的濃度，發酵液中meso-2,3-丁二醇的濃度不再增加，發酵結束，並計算meso-2,3-丁二醇的光學純度。

所述基因工程菌gxasm3菌液的活化方法：將生產meso-2,3-丁二醇的工程菌株gxasm3劃線到含有質量體積比為1.8％瓊脂的並含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養13h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養15h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

本實施中meso-2,3-丁二醇產量為71.6g/l，光學純度為96.5％。主要副產物濃度為：乙酸6.3g/l、丁二酸3.1g/l、乳酸2.6g/l、甲酸2.1g/l、乙醇1.5g/l。

應用實施例4

工程gxasm4在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)木薯去皮曬乾後，粉碎至粒徑為150目；稱取木薯粉160g，豆餅粉65g，加入1000ml自來水、1.0ml液化酶和0.2g氯化鈣，在90℃液化1.5h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入0.5ml糖化酶和0.2g蛋白酶，在60℃糖化5h，調節ph至7.5，離心分離收集上清液，用自來水稀釋使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發酵培養基；

(2)分別取500ml發酵培養基轉移至上海百侖六聯發酵罐，然後添加80μg/ml氨苄青黴，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌gxasm4菌液以體積比為5％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度40℃、攪拌轉速300rpm、通氣量1.5vvm條件下發酵培養22h後，發酵液中葡萄糖濃度下降為23.4g/l，補加木薯粉還原糖母液使葡萄糖濃度提高到60g/l，發酵40h、60h再補加等量木薯粉還原糖母液，總共補料3次。發酵72後，發酵結束。

所述基因工程菌gxasm4菌液的活化方法：將生產meso-2,3-丁二醇的工程菌株gxasm4劃線到含有質量體積比為1.6％瓊脂的並含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養11h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養15h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

本實施中meso-2,3-丁二醇產量為80.8g/l，光學純度為99.2％。主要副產物濃度為：乙酸1.4g/l、丁二酸0.3g/l、乳酸0.4g/l、甲酸0.1g/l、乙醇0.3g/l。

應用實施例5

工程gxasm7在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)木薯去皮曬乾後，粉碎至粒徑為60目；稱取木薯粉100g，豆餅粉30g，花生蛋白粉30g，加入1000ml自來水、2.0ml液化酶和0.05g氯化鈣，在80℃液化4h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入0.3ml糖化酶和0.3g蛋白酶，在50℃糖化18h，調節ph至7.5，離心分離收集上清液，用自來水稀釋使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發酵培養基；

(2)分別取500ml發酵培養基轉移至上海百侖六聯發酵罐，然後添加90μg/ml氨苄青黴，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌gxasm7菌液以體積比為6％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度37℃、攪拌轉速400rpm、通氣量1.2vvm條件下發酵培養24h後，發酵液中葡萄糖濃度下降為21.9g/l，補加木薯粉還原糖母液使葡萄糖濃度提高到70g/l，發酵36h再補加等量木薯粉還原糖母液，發酵54h後，發酵結束。

所述基因工程菌gxasm7菌液的活化方法：將生產meso-2,3-丁二醇的工程菌株gxasm7劃線到含有質量體積比為1.6％瓊脂的並含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養10h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養12h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

本實施中meso-2,3-丁二醇產量為58.6g/l，光學純度為96.1％。

應用實施例6

工程gxasm8在生產meso-2,3-丁二醇的應用，包括以下步驟：

(1)木薯去皮曬乾後，粉碎至粒徑為100目；稱取木薯粉150g，棉籽蛋白粉35g，花生蛋白粉15g，豆餅粉15g，加入1000ml自來水、1.1ml液化酶和0.5g氯化鈣，在95℃液化2h，靜置冷卻；當溫度降低至55℃時，加入0.6ml糖化酶和1.0g蛋白酶，在65℃糖化4h，調節ph至7.0，離心分離收集上清液，用自來水稀釋使還原糖濃度為100g/l，在115℃條件下滅菌15min，即得發酵培養基；

(2)分別取500ml發酵培養基轉移至上海百侖六聯發酵罐，然後添加100μg/ml氨苄青黴，在無菌條件下，將經活化的基因工程菌gxasm8菌液以體積比為8％的接種量接種至發酵培養基中，在溫度42℃、攪拌轉速200rpm、通氣量1.8vvm條件下發酵培養20h後，發酵液中葡萄糖濃度下降為22.6g/l，補加木薯粉還原糖母液使葡萄糖濃度提高到60g/l，發酵30h再補加等量木薯粉還原糖母液，發酵54h後，發酵結束。

所述基因工程菌gxasm8菌液的活化方法：將生產meso-2,3-丁二醇的工程菌株gxasm4劃線到含有質量體積比為1.6％瓊脂的並含有100μg/ml氨苄青黴素的lb平板上，37℃培養11h；在無菌的條件下，用牙籤挑取lb平板上的一個單菌落，然後接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的lb液體培養基中，37℃搖床震蕩培養15h；所述的lb培養基配方為：10g/l蛋白腖，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉。

本實施中meso-2,3-丁二醇產量為60.2g/l，光學純度為96.2％。

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廣西科學院

光學純meso-2,3-丁二醇高產工程菌株的構建方法及應用

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人工合成

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