使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的腫瘤抑制的製作方法

2024-02-23 12:24:15 1

專利名稱：使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的腫瘤抑制的製作方法
使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的
腫瘤抑制本申請要求於2008年9月28日提交的美國臨時專利申請號60/995，763和於2008 年8月21日提交的美國臨時專利申請號61/090，555的優選權，所述申請的全部內容通過 參考納入本文。
1.發明領域本發明提供了通過將腫瘤細胞與胎盤灌洗液、來自胎盤的細胞、來自胎盤(例如 來自胎盤灌洗液)的自然殺傷細胞、和/或包含來自胎盤(例如來自胎盤灌洗液)的自然 殺傷細胞和來自臍帶血的自然殺傷細胞的混合自然殺傷細胞接觸來抑制腫瘤細胞生長或 增殖的方法。本發明還提供了從胎盤，例如從胎盤灌洗液(例如人胎盤灌洗液)，來製備獨 特自然殺傷細胞群的方法。進一步地，本發明提供了使用胎盤灌洗液及其中的自然殺傷細 胞抑制腫瘤細胞增殖的方法。
2.
背景技術：
胎盤灌洗液包含通過下述方式獲得的胎盤細胞群使灌洗溶液流經胎盤血管系 統，並從所述血管系統、從所述胎盤的母體面、或從兩者收集灌洗液體。灌洗哺乳動物胎盤 的方法描述在例如美國專利號7，045，146和美國專利號7，255，879中。通過灌洗獲得的胎 盤細胞群是異源性的，包含造血細胞(CD34+)、有核細胞例如粒細胞、單核細胞和巨噬細胞、 小百分比(少於1%)的組織培養基質-粘附的胎盤幹細胞和自然殺傷細胞。至今還無人 描述胎盤灌洗液或來自灌洗液的胎盤細胞群在抑制腫瘤細胞增殖中的用途。自然殺傷(NK)細胞是構成先天免疫系統的主要組分的細胞毒性淋巴細胞。在人 體中，NK細胞不表達T-細胞抗原受體(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B細胞受體，但通 常表達表面標記物⑶16(FcyRIII)和⑶56。NK細胞是細胞毒性的；其細胞質中的小顆粒 包含特殊蛋白質如穿孔素和被稱為粒酶的蛋白酶。當在非常接近於待殺死的細胞周圍釋放 時，穿孔素在靶細胞的細胞膜中形成孔，粒酶和相關分子可以通過所述孔進入，誘導細胞凋 亡。一種粒酶，粒酶B (也被稱為粒酶2和細胞毒性T-淋巴細胞-結合的絲氨酸酯酶1)，是 在細胞介導免疫應答中快速誘導靶細胞細胞凋亡的一種重要的絲氨酸蛋白酶。NK細胞響應幹擾素或巨噬細胞_衍生的細胞因子而被活化。活化的NK細胞被稱 為淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞。NK細胞具有兩類表面受體，標記為「活化受體」和「抑 制受體」，它們控制細胞的細胞毒活性。除了其它活性，NK細胞在宿主的腫瘤排異反應中起作用。因為癌細胞具有降低的 或沒有I型MHC表達，它們可以成為NK細胞的靶點。大量臨床數據表明從PBMC或骨髓分 離的人NK細胞的單倍體相合移植可介導強烈的抗白血病效應，而不會產生可檢測的移植 物抗宿主病(GVHD)。參見Ruggeri等人，Science 295:2097-2100(2002))。自然殺傷細胞 可由缺乏或呈現低水平的主要組織相容性複合體(MHC)蛋白的細胞活化。活化的和擴增的 NK細胞和LAK細胞已被用於對患有晚期癌症的患者的離體治療和體內治療，並在骨髓相關疾病(例如白血病)、乳腺癌、和某些類型的淋巴瘤的治療中取得了一定的成功。LAK細胞 治療要求患者首先接受IL-2，接著接受白細胞分離法，然後在IL-2的存在下，將收集的自 體血細胞離體培育和培養幾天。LAK細胞必須與相對高劑量的IL-2 —起重新輸注，以完成 治療。該淨化治療(purging treatment)價格昂貴且可能引起嚴重的副作用。這些副作用 包含體液瀦留、肺水腫、血壓降低和高熱。儘管NK細胞在殺死腫瘤細胞和病毒感染的細胞中具有有利的性質，處理它們和 將它們用於免疫治療仍然很難，主要原因在於在培養和擴增期間，很難保持它們的腫瘤靶 向和殺死腫瘤的能力。因而，本領域存在對自然殺傷細胞的易用供給的需要。3.發明概述本發明提供了胎盤灌洗液；來自胎盤灌洗液的細胞，例如來自胎盤灌洗液的所有 有核細胞；胎盤灌洗液細胞和臍帶血細胞的組合；和/或來自胎盤的自然殺傷細胞，例如來 自胎盤灌洗液的自然殺傷細胞或通過消化胎盤組織獲得的自然殺傷細胞在抑制腫瘤細胞 增殖中的用途。在一個方面，本發明提供一種抑制腫瘤細胞或腫瘤細胞群增殖的方法，該方法包 括將所述腫瘤細胞或腫瘤細胞群與人胎盤灌洗液接觸。在該方法的具體實施方案中，所述 腫瘤細胞為血癌細胞。在另一具體實施方案中，所述腫瘤細胞為多個血癌細胞。在另一具 體實施方案中，所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。在另一具體實施方案中，所述腫瘤細胞為多個 實體瘤細胞。在另一實施方案中，所述腫瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T 細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病 (CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、成視網 膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或結腸直腸腺癌細胞。在另一具體實施方案中，所述接觸在 體外進行。在另一具體實施方案中，所述接觸在體內進行。在更具體的實施方案中，所述體 內接觸在人體中進行。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液為已流經胎盤血管系統(例如僅流經胎 盤血管系統)的灌洗液。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液已流經胎盤血管系統，且 是從胎盤的母體面收集的。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液中所有的或基本上所 有的(例如大於90%、95%、98%或99%)的細胞是胎兒細胞。在另一具體實施方案中，所 述胎盤灌洗液包含胎兒細胞和母體細胞。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液中的胎 兒細胞包含少於約90%、80%、70%、60%或50%的所述灌洗液中的細胞。在另一具體實施 方案中，所述灌洗液是通過用0. 9% NaCl溶液流經胎盤血管系統獲得的。在另一具體實施 方案中，所述灌洗液包含培養基。在另一具體實施方案中，所述灌洗液已經過處理除去了大 量紅細胞。在另一方面，本發明提供了一種抑制腫瘤細胞或多個腫瘤細胞增殖的方法，該方 法包括將所述腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與眾多胎盤灌洗液細胞接觸。在另一具體實施方案 中，所述眾多胎盤灌洗液細胞是或包含來自胎盤灌洗液的所有有核細胞。在另一具體實施 方案中，所述胎盤灌洗液或胎盤灌洗液細胞(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞)已經 過處理除去了至少一類細胞。在另一具體實施方案中，所述接觸在體外進行。在另一具體 實施方案中，所述接觸在體內進行。在更具體的實施方案中，所述體內接觸在哺乳動物(例 如人類)中進行。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已經過處理從而富集了至少一類細胞，例如CD56+細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞為CD56+胎盤 細胞。在更具體的實施方案中，所述CD56+細胞為CD56+CD16_自然殺傷細胞，例如胎盤中間 體自然殺傷(PINK)細胞，所述細胞例如從胎盤灌洗液細胞獲得，或從通過機械破壞或酶破 壞胎盤組織獲得的胎盤細胞中獲得。在另一具體實施方案中，所述CD56+細胞通過CD56-偶 聯微珠選擇。在另一具體實施方案中，所述CD56+細胞包含的細胞與等量的CD56+CD16+自然 殺傷細胞相比，顯示出可檢測的更低的NKG2D、NKp46或⑶94的表達。在另一具體實施方案 中，所述PINK細胞為CD3_。在更具體的實施方案中，在所述胎盤灌洗液細胞中的至少50% 的細胞是所述CD56+細胞。在更具體的實施方案中，其中所述CD56+細胞為至少50%的所 述胎盤灌洗液細胞，所述腫瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細 胞、慢性髓細胞樣淋巴(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌 細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、成視網膜細胞瘤細胞、結 腸直腸癌細胞或結腸直腸腺癌細胞。在具體實施方案中，所述接觸為體外接觸。在另一實 施方案中，所述接觸為體內接觸，例如在哺乳動物(例如人體)中。在另一個方面，本發明提供一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方 法包括將所述腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與眾多來自胎盤的自然殺傷細胞(例如PINK細胞) 接觸。在具體實施方案中，所述來自胎盤的自然殺傷細胞為從胎盤灌洗液獲得的自然殺傷 細胞。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞為通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織 獲得的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞為CD56+CD16—自然殺傷 細胞，例如PINK細胞。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞通過CD56-偶聯微珠從 例如胎盤灌洗液細胞或通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的細胞中選擇。在另一具 體實施方案中，所述自然殺傷細胞為CD3—。在具體實施方案中，所述眾多自然殺傷細胞為包 含該自然殺傷細胞的細胞群中的至少80%的細胞。在另一具體實施方案中，所述接觸在體 外進行。在另一具體實施方案中，所述接觸在體內進行。在更具體的實施方案中，所述體內 接觸在哺乳動物(例如人類)中進行。在所述方法的另一具體實施方案中，所述眾多自然殺傷細胞包含的細胞與等量的 ⑶56+CD16+自然殺傷細胞相比，顯示出可檢測的更低的NKG2D、NKp46或⑶94的表達。在 另一具體實施方案中，與外周血液自然殺傷細胞相比，所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK 細胞)以可檢測的更高的水平表達以下一種或多種微小RNA :hsa-miR-100、hsa-miR-127、 hsa—miR-211、hsa_miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa_miR-517c、hsa-miR-518a> hsa_miR-518e、 hsa_miR-519d、hsa_miR-520g、hsa_miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618 禾口 / 或 hsa-miR-99a。在另一具體實施方案中，將所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)與一定量 的免疫調節化合物接觸一段時間，所述量和所述時間足以使得所述眾多自然殺傷細胞與沒 有接觸所述免疫調節化合物的等量的所述自然殺傷細胞相比，表達可檢測的更多的粒酶B。 在更具體的實施方案中，所述免疫調節化合物為來那度胺或pomalid0mide(3-氨基_N_(2， 6- 二氧代-3-哌啶基)鄰苯二甲醯亞胺)。在另一具體實施方案中，將所述眾多自然殺傷細 胞(例如PINK細胞)與一定量的免疫調節化合物接觸一段時間，所述量和所述時間足以使 得所述自然殺傷細胞與沒有接觸所述免疫調節化合物(例如來那度胺或pomalidomide)的等量的所述自然殺傷細胞相比，顯示出針對所述腫瘤細胞的可檢測的更高的細胞毒性。在 另一具體實施方案中，與沒有接觸所述免疫調節化合物的等量的所述自然殺傷細胞相比， 所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以更高水平表達BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、 ⑶SB、IL2RA或TNFRSF18中的一種或多種。在另一具體實施方案中，與沒有接觸所述免疫 調節化合物的等量的所述自然殺傷細胞相比，所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以 更高水平表達 ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、⑶SB、GZMB、 ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI 和 TBX21 中的一種或多種。在另一實施方案中，將來自胎盤的自然殺傷細胞與來自另一來源(例如胎盤血和 /或臍帶血)的自然殺傷細胞混合，例如以形成混合的自然殺傷細胞。本文使用的短語「來 自胎盤的自然殺傷細胞」不包含來自臍帶血或胎盤血的自然殺傷細胞。在更具體的實施方 案中，來自胎盤的自然殺傷細胞與來自另一來源的自然殺傷細胞的混合比例為約100 1、 95 5、90 10,85 15,80 20,75 25,70 30,65 35,60 40,55 45,50 50、 45 55,40 60,35 65,30 70,25 75,20 80,15 85,10 90、5 95,100 1、 95 1、90 1、85 1、80 1、75 1、70 1、65 1、60 1、55 1、50 1、45 1、 40 1、35 1、30 1、25 1、20 1、15 1、10 1、5 1、1 1、1 5、1 10、1 15、 1 20、1 25、1 30、1 35、1 40、1 45、1 50、1 55、1 60、1 65、1 70、 1 75、1 80、1 85、1 90、1 95、1 100 等。在具體實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞沒有進行培養，且其包含與來自 外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3—CD56+CD16-自然殺傷細 胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更低數量的CD3TD56+CD16+ 自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的 ⑶3_CD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測 的更低數量的CD3_CD56+NKp46+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相 比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp30+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺 傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+2B4+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的 自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3TD56+CD94+自然殺傷細胞。在其它具體實施方 案中，所述混合的自然殺傷細胞沒有進行培養，且其包含與來自外周血液的等量的自然殺 傷細胞相比，可檢測更低數量的⑶3TD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞；與來自外周血液的 等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp46+自然殺傷細胞；與來自外 周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp44+自然殺傷細胞； 與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp30+自然殺 傷細胞。在任一上述方法的具體實施方案中，所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。在另一具體實 施方案中，所述腫瘤細胞為液體腫瘤細胞，例如血液腫瘤細胞。在更具體的實施方案中，所 述腫瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴 瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細 胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、成視網膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或 結腸直腸腺癌細胞。在另一方面，本發明提供了一種組合物，其包含分離的胎盤⑶56+、⑶16—自然殺傷
9細胞(例如PINK細胞)。在一具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞是從胎盤灌洗液中 分離的。在另一具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞是通過物理破壞和/或酶消化胎 盤組織從胎盤中分離的。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞包含所述組合物中至 少50%的細胞。在具體實施方案中，所述自然殺傷細胞包含所述組合物中至少80%的細 胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的CD56+、CD16+自然殺傷細胞。在更具體 的實施方案中，所述CD56+、CD16+自然殺傷細胞來自與所述CD56+、CD16_自然殺傷細胞不同 的個體。在另一具體實施方案中，所述分離的CD56+、CD16_自然殺傷細胞來自單個個體。在 更具體的實施方案中，所述分離的CD56+、CD16—自然殺傷細胞包含來自至少兩個不同個體 的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞(例如所述PINK細胞) 被擴增。在更具體的實施方案中，所述組合物包含胎盤自然殺傷細胞和來自另一來源的自 然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述其它來源為臍帶血和/或臍帶血。在另一具體實施 方案中，所述其它來源為外周血液。在更具體的實施方案中，來自胎盤的自然殺傷細胞與來 自另一來源的自然殺傷細胞的混合比例為約100 1、95 5、90 10,85 15,80 20、 75 25,70 30,65 35,60 40,55 45,50 50,45 55,40 60,35 65,30 70、 25 75,20 80,15 85,10 90、5 95,100 1、95 1、90 1、85 1、80 1、 75 1、70 1、65 1、60 1、55 1、50 1、45 1、40 1、35 1、30 1、25 1、 20 1、15 1、10 1、5 1、1 1、1 5、1 10、1 15、1 20、1 25、1 30、1 35、 1 40、1 45、1 50、1 55、1 60、1 65、1 70、1 75、1 80、1 85、1 90、 1 95、1 100 等。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌洗液。在更具體的實施方 案中，所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體的實施方案中， 所述胎盤灌洗液包含來自與所述自然殺傷細胞不同個體的胎盤灌洗液。在另一具體實施方 案中，所述胎盤灌洗液中所有的或基本上所有的(例如大於90%、95%、98%或99%)的細 胞為胎兒細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液包含胎兒細胞和母體細胞。在更具 體的實施方案中，所述胎盤灌洗液中的胎兒細胞包含少於約90 %、80%、70%、60 %或50% 的所述灌洗液中的細胞。在另一具體實施方案中，所述灌洗液是通過用0. 9% NaCl溶液流 經胎盤血管系統而獲得的。在另一具體實施方案中，所述灌洗液包含培養基。在另一具體 實施方案中，所述灌洗液已經處理除去了眾多紅細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含胎盤灌洗液細胞。在更具體的實施方案 中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體實施方案中， 所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自不同的個體。在另一具體實施方案中，所述 組合物包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細胞，其中所述分離的灌洗液和所述分 離的胎盤灌洗液細胞來自不同的個體。在任一上述包含胎盤灌洗液的實施方案中的另一更 具體實施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。在任一上述包含 胎盤灌洗液細胞的實施方案中的另一更具體實施方案中，所述分離的胎盤灌洗液細胞來自 至少兩個個體。所述組合物可另外包含分離的PINK細胞，其中所述PINK細胞與所述胎盤 灌洗液或所述灌洗液細胞來自不同的個體。在另一方面，本發明提供了一種分離胎盤自然殺傷細胞的方法，該方法包括獲得眾多胎盤細胞，和從所述眾多胎盤細胞分離自然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述胎盤細 胞是或包含胎盤灌洗液細胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞。在另一具體實施方案 中，所述眾多胎盤細胞是或包含通過機械破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的胎盤細胞。在 另一實施方案中，所述分離是使用一種或多種抗體進行的。在更具體的實施方案中，所述一 種或多種抗體包含一種或多種針對CD3、CD16或CD56的抗體。在更具體的實施方案中，所述 分離包括在所述眾多胎盤細胞中將CD56+細胞與CD56_細胞分離。在更具體的實施方案中， 所述分離包括將⑶56+、⑶16_胎盤細胞與⑶56_或⑶16+胎盤細胞分離。在更具體的實施方 案中，所述分離包括將⑶56+、⑶16_、⑶3_胎盤細胞與⑶56_、OT16+或⑶3+胎盤細胞分離。在 另一實施方案中，所述分離胎盤自然殺傷細胞的方法產生的胎盤細胞群的至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少 99%細胞是 CD56+、CD16-自然殺 傷細胞。在上述方法的某些實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已經在培養基中擴增。在各 種實施方案中，所述細胞擴增了至少、大約或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 天。在具體實施方案中，所述胎盤 灌洗液細胞已經在滋養層的存在下和/或在至少一種細胞因子的存在下擴增。在更具體的 實施方案中，所述滋養層包含K562細胞或外周血液單核細胞。在另一更具體實施方案中， 所述至少一種細胞因子是白細胞介素_2。3. 1.定義本文使用的「混合的自然殺傷細胞」是例如來自匹配的臍帶和人胎盤灌洗液的自 然殺傷細胞，其中胎盤灌洗液與臍帶血獲自相同的胎盤。分別或同時分離來自兩者的自然 殺傷細胞，並將其混合。本文使用的「PINK」和「PINK細胞」指胎盤中間體自然殺傷細胞，其是從人胎盤(例 如人胎盤灌洗液或已被機械破壞和/或酶破壞的胎盤組織)獲得的。所述細胞為CD56+和 CD16_，例如可通過流式細胞術，例如使用針對CD56和CD 16的抗體螢光激活細胞分類術測 定。PINK細胞不是從臍帶血或外周血液獲得的。本文使用的「胎盤灌洗液」指已流經至少一部分胎盤(例如人胎盤)例如流經胎 盤血管系統的灌洗溶液，其包含灌洗溶液在流經胎盤期間收集的眾多細胞。本文使用的「胎盤灌洗液細胞」指從胎盤灌洗液分離或可從其中分離的有核細胞 (例如所有有核細胞)。本文使用的「腫瘤細胞抑制」、「腫瘤細胞增殖的抑制」等包括例如通過將腫瘤細胞 群與PINK細胞、包含PINK細胞的細胞群、混合的自然殺傷細胞、包含混合的自然殺傷細胞 的細胞群、人胎盤灌洗液等接觸，例如通過殺死所述腫瘤細胞群中的一個或多個腫瘤細胞， 來減緩腫瘤細胞群的生長。4.附圖簡要說明

圖1顯示了對於從人胎盤灌洗液(HPP)中通過⑶56微珠選擇的細胞，使用抗-⑶3 抗體和抗-CD56抗體的流式細胞術結果。大部分的分離細胞是CD56+CD3_。圖2描述了在24小時培養期間，PINK細胞和/或腫瘤細胞的細胞因子的生成。 圖2A描述了單獨或在KG-Ia腫瘤細胞的存在下，來自胎盤灌洗液的中間體自然殺傷細胞 (PINK)對幹擾素Y (IFN)的分泌。PINK細胞和KG-Ia細胞單獨或按1 1的比例混合培養。Y軸培養物生成的IFNy的皮克數。圖2B描述了 PINK細胞單獨或在KG-Ia腫瘤細 胞的存在下對粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌。PINK細胞和KG-Ia細胞 單獨或按1 1的比例混合培養。Y軸培養物生成的GM-CSF的皮克數。圖3描述了在PINK細胞與腫瘤細胞以1 1、5 1、10 1或20 1的比例進 行的24小時共同培養中，PINK細胞對KG-Ia腫瘤細胞的細胞毒性。X軸PINK細胞與腫瘤 細胞的比例。Y軸相對於沒有PINK細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數。圖4描述了培養了 21天的胎盤NK細胞和外周血液(PB) NK細胞對K562細胞的細 胞毒性。誤差柱代表4個單位的培養的胎盤NK細胞或3個單位的培養的外周血液NK細胞 的標準偏差。圖5描述了在HPP細胞與腫瘤細胞以1 1、5 UlO 1或20 1的比例進行 的24小時共同培養中，從胎盤獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-Ia腫瘤細胞的細胞毒性。X 軸HPP細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸相對於沒有HPP細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百 分數。圖6描述了在HPP細胞或UCB細胞與腫瘤細胞以100 1、50 1、25 1、 12.5 1,6. 25 1,3. 12 1,1. 56 1或0. 78 1的系列稀釋進行的48小時共同培養 中，從胎盤和臍帶血獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-Ia腫瘤細胞的細胞毒性。X軸HPP細 胞或臍帶細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸在48小時後相對於沒有HPP細胞或臍帶細胞的腫 瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數。圖7 描述了在HPP 細胞與腫瘤細胞以 100 1、50 1、25 1,12. 5 1,6. 25 1、 3.12 1,1.57 1或0.78 1的系列稀釋進行的48小時共同培養中，從胎盤獲得的全部 人胎盤灌洗液對KG-Ia腫瘤細胞的細胞毒性。使用收集的灌洗液或經100U/ml或1000U/ml 白細胞介素-2(IL-2)刺激24小時的灌洗液。X軸HPP細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸在 48小時後相對於沒有HPP細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數。圖8描述了在HPP或UCB細胞與腫瘤細胞以50 1的比例進行培養後，人胎盤灌 洗液對一組腫瘤細胞系的細胞毒性作用。圖8A:共同培養24小時。圖8B:共同培養48小 時。X軸測試的腫瘤細胞系。Y軸共同培養後相對於不存在腫瘤細胞的腫瘤細胞數的腫 瘤細胞死亡百分數。圖9描述了 HPP細胞與腫瘤細胞的按不同比例下，與KG-Ia腫瘤細胞共同培養的 HPP細胞的IFNy生成。X軸實驗條件，包括HPP細胞與腫瘤細胞的比例，Y軸在24小時 共培養後每毫升的IFNy水平。圖10與一組腫瘤細胞共同培養的HPP或UCB細胞對IFN γ的生成。將HPP或UCB 細胞與腫瘤細胞系按照50 1的比例共同培養24小時(圖10Α)或48小時(圖10Β)。通 過Luminex試驗(HCYT0-60K-03, Millipore)測定IFNy水平。X軸測試的腫瘤細胞系。 Y軸與不存在腫瘤細胞下生成的IFNy的皮克數相比，HPP或UCB細胞生成的IFNY的皮 克數。圖11描述了當向患有KG-I細胞腫瘤(體積約為332mm3)的小鼠施用2X107個人 胎盤灌洗液(HPP)細胞時腫瘤尺寸的減小。瘤內——將HPP細胞直接注射到皮下腫瘤部位。 IV——靜脈內施用HPP細胞。對照——僅施用運載體。腫瘤體積以mm3計。5.詳細說明
本發明提供了從胎盤獲得的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤灌洗液衍生 的自然殺傷(「PINK」)細胞在抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞生長或增殖中的用途。特別 地，本發明提供了從胎盤灌洗液(例如人胎盤灌洗液)分離的或從機械破壞和/或酶破壞 的胎盤組織分離的自然殺傷(NK)細胞和NK細胞群、獲得NK細胞的方法、和使用所述細胞 的方法。本發明還提供了包含自然殺傷細胞的細胞群，例如胎盤細胞群。獲得胎盤灌洗液 和從胎盤灌洗液獲得細胞的方法描述在下述部分5. 1中。來自胎盤灌洗液的自然殺傷細胞 和獲得所述細胞的方法描述在下述部分5. 2中。使用胎盤灌洗液、來自胎盤灌洗液的細胞 來自或胎盤灌洗液的自然殺傷細胞(例如中間體自然殺傷細胞)抑制腫瘤細胞增殖的方法 描述在下述部分5. 3中。5. 1.胎盤灌洗液5. 1. 1.細胞採集組合物本發明提供的胎盤灌洗液、灌洗液細胞和來自胎盤灌洗液的自然殺傷細胞可以通 過使用胎盤細胞採集組合物灌洗哺乳動物例如人分娩後的胎盤來收集。可以通過使用任何 生理學可接受的溶液(例如鹽溶液、培養基或更複雜的細胞採集組合物)灌洗胎盤來從胎 盤收集灌洗液。適於灌洗胎盤、和適於收集和保存灌洗液細胞(例如所有有核胎盤灌洗液 細胞或PINK細胞)的細胞採集組合物詳細描述在相關美國申請公開號2007/0190042中， 該申請的全部內容通過參考納入本文。所述細胞採集組合物可以包含適於收集和/或培養幹細胞的任何生理學可接受 的溶液，例如鹽溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水、Kreb，s溶液、改良的Kreb，s溶液、Eagles，s 溶液、0. 9% NaCl等)、培養基(例如DMEM、H. DMEM等)等。所述細胞採集組合物可以包含一種或多種易於保存胎盤細胞的組分，所述保存即 自收集時至培養時，防止胎盤細胞死亡、或延遲胎盤細胞死亡、減少死亡的細胞群中胎盤細 胞的數量等。這些組分可以是例如細胞凋亡抑制劑(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑 或JNK抑制劑)；血管擴張藥(例如硫酸鎂、抗高血壓藥、心房利鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質 激素、促腎上腺皮質激素釋放激素、硝普鈉、胼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷 酸二酯酶抑制劑等)；壞死抑制劑(例如2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-馬來醯亞胺、 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-a抑制劑；和/或載氧全氟化碳(例如全氟辛 基溴、全氟癸基溴等)。所述細胞採集組合物可以包含一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸 蛋白酶、中性蛋白酶、透明質酸酶、RNase或DNase等。這些酶包括但不限於膠原酶(例如 膠原酶I、II、III或IV，來自溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)的膠原酶等)；分散 酶；嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明質酸酶等。所述細胞採集組合物可以包含殺菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性實 施方案中，所述抗生素是大環內酯類(例如妥布黴素)、頭孢菌素類(例如頭孢氨苄、頭孢 黴定、頭孢呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨苄)、克拉黴素、紅黴素、青黴素 (例如青黴素V)或喹諾酮類(例如氧氟沙星、環丙沙星或諾氟沙星)、四環素、鏈黴素等。在 特別實施方案中，所述抗生素具有抗革蘭氏陽性(+)和/或革蘭氏陰性(_)細菌(例如綠 月農假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等) 的活性。
所述細胞採集組合物還可包含一種或多種下述化合物腺苷(約ImM至約50mM)； D-葡萄糖(約20mM至約IOOmM)；鎂離子(約ImM至約50mM)；分子量大於20，000道爾頓 的大分子，在一實施方案中，其以足夠保持內皮完整性和細胞生存力的量存在(例如，合成 的或天然存在的膠體、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，以約25g/l至約100g/l、或約40g/l至 約60g/l存在)；抗氧化劑(例如丁羥茴醚、丁羥甲苯、穀胱甘肽、維生素C或維生素E，以 約25 μ M至約100 μ M存在)；還原劑(例如N-乙醯半胱氨酸，以約0. ImM至約5mM存在)； 防止鈣進入細胞的試劑(例如維拉帕米，以約2 μ M至約25 μ M存在)；硝化甘油(例如，約 0. 05g/l至約0. 2g/l)；抗凝血藥，在一個實施方案中，以足以幫助防止殘餘血液凝固的量 存在(例如肝素或水蛭素，以約1000單位/1至約100，000單位/1的濃度存在)；或包含 阿米洛利的化合物(例如阿米洛利、乙基異丙基阿米洛利、環六亞甲基阿米洛利、二甲基阿 米洛利或異丁基阿米洛利，以約1. 0 μ M至約5 μ M存在)。5. 1. 2.胎盤的收集和處理通常，在出生後胎盤娩出後立即回收人胎盤。在優選實施方案中，在患者籤署知情 同意書以及在獲取患者的全部病史並將其與所述胎盤關聯後，回收患者的胎盤。優選地，在 產後繼續跟蹤病史。這樣的病史可用於調整所述胎盤或從其中獲得的細胞的後續使用。例 如，根據病史，人胎盤細胞可用於對與所述胎盤相關的嬰兒、或該嬰兒的父母、同胞或其它 親屬的個性化用藥。在回收灌洗液之前，除去臍帶血和胎盤血。在某些實施方案中，在產後，回收胎盤 中的臍帶血。可對所述胎盤進行常規的臍帶血回收處理。典型地，使用針或插管，藉助於 重力來給胎盤排血(參見，例如Anderson，美國專利號5，372，581 ；Hessel等人，美國專利 號5，415，665)。通常將所述針或插管置於臍靜脈中，可以輕輕按摩胎盤以幫助將臍帶血排 出胎盤。這樣的臍帶血回收可以商業化進行，例如LifeBank Inc. , Cedar Knolls, N. J., ViaCord,Cord BloodRegistry and CryoCell。優選地，所述胎盤依靠重力排空而無需進一 步處理，由此在回收臍帶血期間對組織破壞最小化。典型地，將胎盤從產房或分娩房轉運到另外的地點(例如實驗室)以回收臍帶血 和收集灌洗液。胎盤優選地在無菌隔熱的轉運裝置(將胎盤溫度保持在20-28°C之間)中 轉運，例如將夾住近端臍帶的胎盤置於無菌自封塑膠袋中，然後將其放置到絕熱容器中。在 另一實施方案中，將胎盤在基本上如美國專利號7，147，626所述的臍帶血收集試劑盒中轉 運。優選地，在產後四至二十四小時將胎盤遞送到實驗室。在某些實施方案中，在臍帶血回 收之前，夾住近端臍帶，優選地在插入到胎盤盤的4-5cm(釐米)以內處夾住近端臍帶。在 其它實施方案中，在回收臍帶血之後但在進一步處理胎盤之前，夾住近端臍帶。在收集灌洗液之前，可以將胎盤貯存在無菌條件和在室溫或5至25°C (攝氏溫 度)下。胎盤可被貯存超過四十八個小時，優選地貯存四至二十四小時，之後灌洗胎盤以除 去任何殘留臍帶血。胎盤優選地貯存在5°C至25°C (攝氏溫度)的抗凝血溶液中。合適的 抗凝血溶液是本領域所熟知的。例如，可以使用肝素或華法林鈉的溶液。在優選實施方案 中，所述抗凝血溶液包含肝素溶液(例如，在1 1000溶液中l%w/w)。在收集胎盤灌洗 液之前，無血胎盤優選地貯存不超過36小時。5. 1. 3.胎盤的灌洗灌洗哺乳動物胎盤的方法公開在例如Hariri的美國專利號7，045，148和7. 255，879、以及題為「 Improved Composition for Collecting and PreservingOrgans (米 集和保存器官的改進的組合物)，，的和美國申請公開號2007/0190042中，所述專利和專利 申請的全部內容通過參考納入本文。可以通過使灌洗溶液(例如鹽溶液、培養基或上述的細胞採集組合物)流經胎盤 血管系統來獲得灌洗液。在一個實施方案中，通過使灌洗溶液流經臍動脈和臍靜脈中的任 意一個或兩者來灌洗哺乳動物的胎盤。可以利用例如向胎盤內的重力流來實現灌洗溶液經 過胎盤的流動。優選地，使用泵例如蠕動泵迫使灌洗溶液經過胎盤。可以用與無菌連接裝 置(例如無菌管)連接的插管(例如TEFLON 或塑料插管)對臍靜脈插管。所述無菌連 接裝置連接灌洗歧管。在準備灌洗時，優選地以臍動脈和臍靜脈位於胎盤最高點的方式來定位胎盤。可 以通過使灌洗溶液流經胎盤血管系統，或者流經胎盤血管系統和周圍組織來灌洗胎盤。在 一個實施方案中，臍動脈和臍靜脈同時連接移液器，該移液器經由彈性連接體連接到灌洗 溶液儲庫。灌洗溶液流入臍靜脈和臍動脈。所述灌洗溶液從血管流出和/或穿過血管壁 進入胎盤的周圍組織，並從妊娠期間連接母親子宮的胎盤表面將其收集到合適的開放器皿 中。也可以通過臍帶開口引入灌洗溶液，並允許其從與母體子宮壁相連的胎盤壁中的開口 流出或滲濾出。在另一實施方案中，灌洗溶液流經臍靜脈並從臍動脈收集，或其流經臍動脈 而從臍靜脈收集，即，灌洗溶液只流經胎盤血管系統(胎兒組織)。在一個實施方案中，例如，臍動脈和臍靜脈同時連接例如移液器，該移液器經由彈 性連接體連接到灌洗溶液儲庫。灌洗溶液流入臍靜脈和臍動脈。所述灌洗溶液從血管流出 和/或穿過血管壁進入胎盤的周圍組織，並從妊娠期間連接母親子宮的胎盤表面將其收集 到合適的開口器皿中。也可以通過臍帶開口引入灌洗溶液，並允許其從與母體子宮壁相連 的胎盤壁中的開口流出或滲濾出。用該方法(其可以稱為「鍋」法)收集的胎盤細胞典型 地是胎兒細胞和母體細胞的混合物。在另一實施方案中，灌洗溶液流經臍靜脈並從臍動脈收集，或流經臍動脈並從臍 靜脈收集。用該方法(其可以稱為「閉路」法)收集的胎盤細胞典型地幾乎僅僅是胎兒細 胞。在一個實施方案中，所述閉路灌洗法可以如下進行。在分娩後約48小時之內獲得 分娩後的胎盤。夾住臍帶，並在夾鉗上方切下臍帶。可以丟棄臍帶，或者可以處理臍帶以回 收例如臍帶幹細胞，和/或處理臍帶膜以製備生物材料。在灌洗期間，可以保留羊膜，或者 例如使用手指鈍剝離將羊膜與絨毛膜分離。如果羊膜與絨毛膜在灌洗前分離，例如可以棄 去羊膜，或處理羊膜以獲得幹細胞(例如通過酶消化)、或製備例如羊膜生物材料(例如在 美國申請公開號2004/0048796中描述的生物材料)。在例如使用消毒紗布清洗胎盤的所有 可見血塊和殘餘血液後，暴露出臍帶血管，例如通過部分切開臍帶膜以暴露臍帶的橫截面。 例如，通過推進封閉的鱷魚夾進入各血管的切口末端，識別和打開血管。然後，將連接灌洗 裝置或蠕動泵的裝置(例如塑料管)插入到每個胎盤動脈中。所述泵可以是適用於所述目 的的任何泵，例如蠕動泵。然後，將連接收集儲庫(例如血袋，例如250mL的收集袋)的塑 料管插入到胎盤靜脈中。或者，將連接泵的管插入到胎盤靜脈中，並且將連接儲庫的管插入 到胎盤的一個或兩個動脈中。然後，用一定體積的灌洗溶液(例如約750ml灌洗溶液)灌 洗胎盤。接著，例如通過離心收集灌洗液中的細胞。
在一個實施方案中，在灌洗期間夾住近端臍帶，更優選地，在臍帶插入到胎盤盤體 的4-5cm (釐米)之內夾住臍帶。通常，在排血過程中，哺乳動物胎盤灌洗流體的第一批採集物被臍帶血和/或胎 盤血的殘留紅細胞著色。隨著灌洗的進行以及胎盤的殘留臍帶血細胞被洗淨，所述灌洗流 體進一步變成無色。通常，30至IOOmL的灌洗流體足以初步衝洗胎盤中的血液，但可以根據 觀察結果，使用更多或更少的灌洗流體。用於灌洗胎盤的灌洗液體的體積可以根據待收集的胎盤細胞數量、胎盤尺寸、由 單個胎盤形成的採集物的數量等變化。在各種實施方案中，灌洗液體的體積可以為50mL 至 5000mL、50mL 至 4000mL、50mL 至 3000mL、IOOmL 至 2000mL、250mL 至 2000mL、500mL 至 2000mL、或750mL至2000mL。典型地，在排血後，用700-800mL的灌洗液體灌洗胎盤。可以在幾個小時或幾天期間，多次灌洗胎盤。當灌洗胎盤多次時，可將胎盤置於 容器或其它合適的器皿中，在無菌條件下保持或培養，並用細胞採集組合物或標準灌洗溶 液灌洗(例如，生理鹽水溶液例如磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」)，其含有或不含抗凝血劑(例 如肝素、華法林鈉、香豆素、雙香豆素)，和/或含有或不含抗微生物劑(例如β-巰基乙醇 (0. ImM)；抗生素例如鏈黴素(例如40-100 μ g/ml)、青黴素(例如40U/ml)、兩性黴素B (例 如0. 5μ g/ml))。在一個實施方案中，將分離的胎盤保持或培養一段時間而不收集灌洗液， 因此在灌洗和收集灌洗液之前，保持或培養胎盤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23或24小時、或2或3或更多天。可以一次或更多次地保持經灌 洗的胎盤例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 更多個小時，並用例如700-800mL的灌洗液體再次灌洗。可以灌洗胎盤1、2、3、4、5或更多 次，例如每1、2、3、4、5或6個小時一次。在優選的實施方案中，重複灌洗胎盤和收集灌洗溶 液(例如胎盤細胞採集組合物)，直到回收的有核細胞數量低於100個細胞/ml。可以進一 步分別處理不同時間點的灌洗液，以回收時間依賴性細胞群，例如所有有核細胞。也可以匯 總不同時間點的灌洗液。5. 1. 4.胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細胞胎盤灌洗液保包含細胞的異源採集物。典型地，在使用之前，去除胎盤灌洗液中的 紅細胞。這樣的去除可以通過分離紅細胞與有核血細胞的已知方法進行。在某些實施方案 中，冷凍保存灌洗液或灌洗液細胞。在某些其它實施方案中，胎盤灌洗液或灌洗液細胞僅包 含胎兒細胞或包含胎兒細胞和母體細胞的組合。典型地，來自單次胎盤灌洗的胎盤灌洗液包含約1億至約5億個有核細胞。在某 些實施方案中，所述胎盤灌洗液或灌洗液細胞包含CD34+細胞，例如造血幹細胞或祖細胞。 在更具體的實施方案中，這些細胞可以包含⑶34+CD45_幹細胞或祖細胞、⑶34+⑶45+幹細 胞或祖細胞、骨髓祖細胞、淋巴祖細胞和/或紅系祖細胞。在其它的實施方案中，胎盤灌洗 液和胎盤灌洗液細胞包含粘附性胎盤幹細胞，例如CD34—幹細胞。在其它實施方案中，所述 胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細胞包含例如內皮祖細胞、骨祖細胞和自然殺傷細胞。在某些實 施方案中，從胎盤收集並去除紅細胞的胎盤灌洗液，或從這樣的灌洗液分離的灌洗液細胞， 包含約6-7%的自然殺傷細胞(⑶3_、⑶56+)；約21-22%的T細胞(⑶3+)；約6_7%的B細 胞(CD19+)；約1-2%的內皮祖細胞(CD34+、CD31+)；約2_3%的神經祖細胞(巢蛋白+)；約 2-5%的造血祖細胞(CD34.)；和約0. 5-1. 5%的粘附性胎盤幹細胞(例如CD34—、CD117—、⑶105+和⑶44+)，如通過流式細胞術，例如通過FACS分析所測定的。5. 2.破壞和消化胎盤組織以獲得PINK細胞胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)可以從已經機械破壞和/或酶破壞的胎盤 組織獲得。可以使用一種或多種組織降解酶(例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、 RNase或DNase等)破壞胎盤組織。這樣的酶包括但不限於膠原酶(例如膠原酶I、II、 III或IV，來自溶組織梭菌的膠原酶等)、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、 LIBERASE、透明質酸酶等。典型地，在消化後，使消化的組織穿過濾網或濾器以除去部分消 化的細胞簇，留下基本上單細胞的懸浮液。在獲得胎盤細胞的懸浮液後，可以使用例如針對⑶3和⑶56的抗體分離自然殺傷 細胞。在具體實施方案中，通過如下方法分離胎盤自然殺傷細胞選擇CD56+細胞以形成第 一細胞群；將所述第一細胞群與CD3和/或CD16特異性抗體接觸；從所述第一細胞群中除 去⑶3+或⑶56+細胞，由此形成第二細胞群，其基本上是⑶56+和⑶3 ⑶56+和⑶16 或 CD56\ CD3"和 CD16-細胞。在一個實施方案中，使用磁珠從胎盤細胞的懸浮液中分離胎盤自然殺傷細胞。所 述細胞可以使用例如磁性激活細胞分類(MACS)技術來分離，該技術是基於顆粒結合磁珠 (例如約0. 5-lOOym直徑)的能力分離顆粒的方法，所述磁珠包含一種或多種特定抗體，例 如抗-CD56抗體。對所述磁性微球可以進行多種有用的修飾，包括共價添加特異性識別特 定的細胞表面分子或半抗原的抗體。然後，將所述珠與細胞混合以允許結合。然後，使細胞 經過磁場以分離出具有特定細胞表面標記物的細胞。在一個實施方案中，隨後可以分離這 些細胞，並將其與偶聯了針對另一種細胞表面標記物的抗體的磁珠再混合。將所述細胞再 次經過磁場，分離同時結合兩種抗體的細胞。隨後，可以將這些細胞稀釋到單獨的皿中，例 如用於克隆分離的微量滴定皿。5. 3.胎盤自然殺傷細胞在一方面，本發明提供了可從胎盤(例如從胎盤灌洗液、和/或經機械破壞和/或 酶破壞的胎盤組織)獲得的自然殺傷細胞以及包含這樣的自然殺傷細胞的組合物的分離、 表徵和用途。在具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞為「胎盤中間體自然殺傷細胞」或 「PINK」細胞，其被表徵為⑶56+⑶16—，即呈現⑶56細胞標記物且缺乏⑶16細胞標記物，例 如，如上所述通過流式細胞術，例如使用抗CD16和CD56的抗體的螢光激活細胞分類術所測 定的。因而，本發明提供了分離的PINK細胞和分離的眾多PINK細胞。本發明還提供了分 離的眾多細胞，其包含⑶56+CD16—PINK細胞與⑶56+⑶16+自然殺傷細胞的組合。在更具體 實施方案中，所述CD56+CD16+自然殺傷細胞可以從胎盤、或另一來源(例如外周血液、臍帶 血、骨髓等)中分離。因而，在各種其它實施方案中，PINK細胞可以與CD56+CD16+自然殺傷 細胞例如以約 1 10、2 9、3 8、4 7 、5 6、6 5、7 4、8 3、9 2、1 10、 1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、1 4、1 3、1 2、1 1、2 1、3 1、4 1、5 1、 6 1、7 1、8 1或約9 1的比例混合。本文使用的「分離的」指所述細胞以從其正常 環境例如胎盤中移出。在某些實施方案中，所述PINK細胞是⑶3_。在其它實施方案中，所述PINK細胞不呈現完全成熟的自然殺傷細胞所呈現的一種或多種細胞標記物(例如CD16)，或者相對於完全成熟的自然殺傷細胞以可檢測的更低 的水平呈現這樣的一種或多種標記物，或者呈現出與自然殺傷細胞前體相關但與完全成熟 的自然殺傷細胞無關的一種或多種細胞標記物。在具體實施方案中，與完全成熟的NK細胞 相比，本文提供的PINK細胞以可檢測的更低的水平表達NKG2D、⑶94和/或NKp46。在另 一具體實施方案中，本文提供的眾多PINK細胞與等量的完全成熟的NK細胞相比以可檢測 的更低的水平表達全部NKG2D、⑶94和/或NKp46。在某些實施方案中，與外周血液自然殺傷細胞相比，PINK細胞以可檢測的更 高的水平表達以下一種或多種微小RNA :hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、 hsa_miR-302c、 hsa-miR-326、 hsa-miR-337、 hsa-miR-497、 hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa_miR-517c、hsa-miR-518a> hsa_miR-518e、 hsa_miR-519d、hsa_miR-520g、hsa_miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618 禾口 / 或 hsa-miR-99a。在某些實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)已在培養基中擴 增。在某些其它實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已在培養基中擴增。在具體實施方案中， 所述胎盤灌洗液細胞已在滋養層的存在下和/或在至少一種細胞因子的存在下擴增。在更 具體的實施方案中，所述滋養層包含K562細胞或外周血液單核細胞。在另一更具體的實施 方案中，所述至少一種細胞因子為白細胞介素_2。在另一實施方案中，本文提供了分離的眾多PINK細胞(例如細胞群)。在另一具體 實施方案中，通過從胎盤灌洗液中用CD56-微珠分離細胞生成分離的細胞群。在各種具體 實施方案中，所述群包含至少約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%或至少約99%的PINK細胞。在另一實施方案中，眾多PINK細胞包含沒有經過擴增的 PINK細胞，或由其組成；例如，從胎盤灌洗液收集的。在另一實施方案中，眾多PINK細胞包 含經過擴增的PINK細胞，或由其組成。擴增自然殺傷細胞的方法描述在例如Ohno等人的 美國專利申請公開號2003/0157713中；也可參見Yssel等人，J. Immunol. Methods 72(1) 219-227(1984)和 Litwin 等人，J. Exp. Med. 178(4) 1321-1326 (1993)，以及在下述實施例 1中對自然殺傷細胞擴增的描述。在其它實施方案中，所述分離的眾多PINK細胞不呈現完全成熟的自然殺傷細胞 所呈現的一種或多種細胞標記物(例如CD16)，或者相對於完全成熟的自然殺傷細胞以可 檢測的更低的水平呈現這樣的一種或多種標記物，或者呈現出與自然殺傷細胞前體相關但 與完全成熟的自然殺傷細胞無關的一種或多種細胞標記物。在具體實施方案中，與完全成 熟的NK細胞相比，本文提供的PINK細胞以可檢測的更低的水平表達NKG2D、CD94和/或 NKp46。在另一具體實施方案中，本文提供的眾多PINK細胞與等量的完全成熟的NK細胞相 比以可檢測的更低的水平表達全部NKG2D、⑶94和/或NKp46。在某些實施方案中，與外周血液自然殺傷細胞相比，PINK細胞群以可檢測的 更高的水平表達以下一種或多種微小RNA :hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、 hsa_miR-302c、 hsa-miR-326、 hsa-miR-337、 hsa-miR-497、 hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、 hsa_miR-519d、hsa_miR-520g、hsa_miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618 禾口 /或hSa-miR-99a。在另一具體實施方案中，與等量的外周血液自然殺傷細胞相比，PINK細胞群表達可檢測的更高量的粒酶B。在其它實施方案中，本文提供的PINK細胞已在培養基中擴增。在具體實施方案 中，PINK細胞已經過培養(例如在培養基中擴增)至少、大約、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 天。在具體實施方案 中，所述PINK細胞培養了約21天。在另一實施方案中，本文提供了一種包含PINK細胞的分離的細胞群，例如胎盤細 胞群。在具體實施方案中，所述分離的細胞群為來自胎盤灌洗液的所有有核細胞(例如胎 盤灌洗液細胞)，其包含自體的、分離的PINK細胞。在另一具體實施方案中，所述細胞群是 通過從胎盤灌洗液中使用CD56-微珠分離細胞而生成的分離的細胞群。在各種具體實施方 案中，所述群包含至少約 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%^； 至少約99%的PINK細胞。因為分娩後的胎盤包含來自胎兒和來自母親的組織和細胞，根據收集的方法，胎 盤灌洗液可以僅包含胎兒細胞，或基本上主要包含胎兒細胞(例如大於約90%、95%、98% 或99% )，或者可以包含胎兒細胞和母體細胞的混合物(例如，胎兒細胞包含少於約90%、 80%、70%、60%、或50%的灌洗液的所有有核細胞)。在一個實施方案中，所述PINK細胞 僅源自胎兒胎盤細胞，例如閉路灌洗胎盤獲得的細胞(見上)，其中所述灌洗產生包含基本 上大多數或僅包含胎兒胎盤細胞的灌洗液。在另一實施方案中，所述PINK細胞源於胎兒細 胞和母體細胞，例如通過所述鍋法(見上)灌洗獲得的細胞，其中所述灌洗產生包含胎兒和 母體胎盤細胞混合物的灌洗液。因而，在一個實施方案中，本發明提供了來自胎盤的中間體 自然殺傷細胞群，其中基本上大多數具有胎兒基因型。在另一實施方案中，本文提供了來自 胎盤的中間體自然殺傷細胞群，其包含具有胎兒基因型的自然殺傷細胞和具有母親表型的 自然殺傷細胞。本文還提供了來自胎盤的中間體自然殺傷細胞群，其包含來自非胎盤來源的自然 殺傷細胞。例如，在一個實施方案中，本文提供了 PINK細胞群，其還包含來自臍帶血、外周 血液、骨髓或前述兩種或多種組合的自然殺傷細胞。包含PINK細胞和來自非胎盤來源的 自然殺傷細胞的自然殺傷細胞群可以包含例如如下比例的細胞約1 10、2 9、3 8、 4 7 、5 6、6 5、7 4、8 3、9 2、10 1、1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、 1 4、1 3、1 2、1 1、2 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、9 1,100 1、 95 5、90 10,85 15,80 20,75 25,70 30,65 35,60 40,55 45:50 50、 45 55,40 60,35 65,30 70,25 75,20 80,15 85,10 90、5 95,100 1、 95 1、90 1、85 1、80 1、75 1、70 1、65 1、60 1、55 1、50 1、45 1、 40 1、35 1、30 1、25 1、20 1、15 1、10 1、5 1、1 1、1 5、1 10、1 15、 1 20、1 25、1 30、1 35、1 40、1 45、1 50、1 55、1 60、1 65、1 70、 1 75、1 80,1 85、1 90,1 95 或約 1 100 等。本發明進一步提供了臍帶血和分離的PINK細胞的組合。在各種實施方案中，臍 帶血與PINK細胞的混合比例為每毫升臍帶血約1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、 5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、或 5X 108 或更多個 PINK 細胞。本發明還提供分離PINK細胞的方法。在一個實施方案中，通過如下方法收集 PINK細胞獲得胎盤灌洗液，然後將所述胎盤灌洗液與特異性結合CD56+細胞的組分例如抗⑶56的抗體接觸，之後基於所述結合分離⑶56+細胞，形成⑶56+細胞群。所述⑶56+細 胞群包含分離的自然殺傷細胞群。在具體實施方案中，將CD56+細胞與特異性結合CD16+細 胞的組分例如抗CD16的抗體，並從CD56+細胞群中排除CD16+細胞。在另一具體實施方案 中，還從所述⑶56+細胞群中排除了⑶3+細胞。在一個實施方案中，從胎盤灌洗液如下獲得PINK細胞。將分娩後的人胎盤排血， 並例如用約200-800mL的灌洗溶液僅灌洗流過胎盤血管系統。在具體實施方案中，在所述 灌洗之前，去除所述胎盤的臍帶血，並例如用灌洗溶液衝洗胎盤血管系統除去殘餘血液。收 集灌洗液，並且處理除去任何殘留的紅細胞。在灌洗液的所有有核細胞中的自然殺傷細胞 可以基於⑶56和⑶16的表達來分離。在某些實施方案中，PINK細胞的分離包括使用針對 CD56的抗體分離，其中分離的細胞為CD56+。在另一實施方案中，PINK細胞的分離包括使用 針對CD16的抗體分離，其中分離的細胞為CD16_。在另一實施方案中，PINK細胞的分離包 括使用針對CD56的抗體分離，並且使用針對CD16的抗體排除眾多非-PINK細胞，其中分離 的細胞包含⑶56+、⑶16_細胞。細胞分離可以通過本領域已知的任何方法來實現，例如螢光激活細胞分類術 (FACS)，或者優選地使用偶聯特定抗體的微珠的磁性細胞分類術。可以使用例如AUT0MACS Separator(Miltenyi)進行磁性細胞分離和並實現自動化。在另一方面，本發明提供了一種分離胎盤自然殺傷細胞的方法，該方法包括獲得 眾多胎盤細胞，從所述眾多胎盤細胞中分離自然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述胎盤細 胞是或包含胎盤灌洗液細胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞。在另一具體實施方案 中，所述眾多胎盤細胞是或包含通過機械消化和/或酶消化胎盤組織獲得的胎盤細胞。在 另一實施方案中，使用一種或多種抗體進行所述分離。在更具體的實施方案中，所述一種或 多種抗體包含一種或多種針對CD3、CD16或CD56的抗體。在更具體的實施方案中，所述分離 包括在所述眾多胎盤細胞中將CD56+細胞與CD56_細胞分離。在更具體的實施方案中，所述 分離包括將⑶56+、⑶16—胎盤細胞，例如胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)，與⑶56—或 ⑶16+胎盤細胞分離。在更具體的實施方案中，所述分離包括將⑶56+、⑶16_、⑶3_胎盤細胞 與CD56+、CD16+或CD3+胎盤細胞分離。在另一實施方案中，所述分離胎盤自然殺傷細胞的 方法生成的胎盤細胞群中至少 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 98%或至少99%的細胞是⑶56+、⑶16—自然殺傷細胞。
_5] 5. 4.來j匹配』射Il洗液禾Π臍帶血的胎盤自然殺傷細朐,本發明進一步提供了從匹配單元的胎盤灌洗液和臍帶血的組合獲得的和可獲得 的自然殺傷細胞，本文稱為混合的自然殺傷細胞。本文使用的「匹配單元」表示，NK細胞從 胎盤灌洗液細胞和臍帶血細胞獲得，其中所述臍帶血細胞從胎盤的臍帶血獲得，所述胎盤 灌洗液也獲自所述胎盤，即所述胎盤灌洗液細胞和臍帶血細胞以及從其中各自得到的自然 殺傷細胞都來自相同的個體。在某些實施方案中，混合的胎盤殺傷細胞僅包含、或基本上僅包含CD56+和 CD16_的自然殺傷細胞。在某些其它實施方案中，混合的胎盤殺傷細胞包含CD56+和CD16_的 NK細胞以及CD56+和CD16+的NK細胞。在某些具體實施方案中，所述混合的胎盤殺傷細胞包 含至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 99. 5% 的 CD56+CD16-自 然殺傷細胞(PINK細胞)。
在一個實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞未經培養。在具體實施方案中，與來 自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更高數量的 CD3—CD56+CD16-自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷 細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數量的CD3_CD56+CD16_自然殺傷細 胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺 傷細胞包含可檢測的更高數量的⑶3TD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞。在另一具體實施方 案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的 更低數量的CD3_CD56+NKp46+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等 量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數量的CD3_CD56+NKp30+ 自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混 合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數量的CD3_CD56+2B4+自然殺傷細胞。在另一具體實 施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢 測的更低數量的⑶3TD56+⑶94+自然殺傷細胞。在另一實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞已經培養例如21天。在具體實施方 案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的 更低數量的⑶3TD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述混合的自 然殺傷細胞未經培養。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比， 所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp44+自然殺傷細胞。在具 體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含 可檢測的更高數量的⑶3TD56+NKp30+自然殺傷細胞。在另一實施方案中，與等量的外周血液自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷 細胞表達可檢測的更高量的粒酶B。本發明進一步提供了臍帶血和混合的自然殺傷細胞的組合。在各種實施方案 中，臍帶血與混合的自然殺傷細胞的混合比例為每毫升臍帶血約1X104、5X104、1X105、 5 X 105、1 X 106、5 X 106、1 X 107、5 X 107、1 X 108、5 X 108 個混合的自然殺傷細胞。5. 5.灌洗液/細胞組合除了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和胎盤自然殺傷細胞 (例如胎盤中間體自然殺傷細胞)之外，本發明還提供了包含所述灌洗液或細胞的組合物， 其用於抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖。5.5. 1.胎盤灌洗液、灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的組合本發明進一步提供了組合物，其包含在以上5. 1,5. 3或5. 4部分中描述的胎盤灌 洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞的組合。在一 個實施方案中，例如，本發明提供了一定體積的胎盤灌洗液，其中補充了眾多胎盤灌洗液細 胞和/或眾多胎盤自然殺傷細胞，例如從胎盤灌洗液細胞、或經機械破壞或酶破壞的胎盤 組織獲得的胎盤中間體自然殺傷細胞。在具體實施方案中，例如每毫升胎盤灌洗液補充了 約1\104、5\104、1\105、5\105、1\106、5\106、1\107、5\107、1\108、5\108或更多個胎 盤灌洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在另一實施方案中， 眾多胎盤灌洗液細胞補充了胎盤灌洗液、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷 細胞。在另一實施方案中，眾多胎盤中間體自然殺傷細胞補充了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在某些實施方案中，當灌洗液被用於補充時，灌洗液的體 積是、大於或少於細胞(溶液中)加灌洗液總體積的約50%、45%、40%、35%、30%、25%、 20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%。在某些其它實施方案中，當胎盤灌洗液細胞與 眾多PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞混合時，所述胎盤灌洗液細胞通常包含大約、 大於約或小於約 50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%,15%,10%,8%,6%,4%,2%^； 的細胞總數。在某些其它實施方案中，當PINK細胞與眾多胎盤灌洗液細胞和/或混合 的自然殺傷細胞混合時，所述PINK細胞通常包含大約、大於約或小於約50%、45%、40%、 35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或的細胞總數。在某些其它實施 方案中，當混合的自然殺傷細胞與PINK細胞和/或胎盤灌洗液細胞混合時，所述混合的自 然殺傷細胞通常包含大約、大於約或小於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、 10%、8%、6%、4%、2%或的細胞總數。在某些其它實施方案中，當PINK細胞、混合的 自然殺傷細胞或胎盤灌洗液細胞被用於補充胎盤灌洗液時，其中懸浮了細胞的溶液(例如 鹽溶液、培養基等)的體積包含灌洗液加細胞總體積的大約、大於約、或小於約50%、45%、 40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或 1%，其中在補充前，PINK 細 胞以每毫升約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108 或更多個細胞懸浮。在其它實施方案中，任一上述組合都隨後與臍帶血或來自臍帶血的有核細胞混
口 o本發明進一步提供了匯總的胎盤灌洗液，其從兩種或多種來源(例如兩個或多個 胎盤)獲得，並混合(例如匯總)。這樣的匯總的灌洗液可以包含大約等體積的來自各來源 的灌洗液，或可以包含不同體積的來自各來源的灌洗液。來自各來源的相對體積可以隨機 地選擇，或可基於例如一種或多種細胞因素(例如細胞因子、生長因子、激素等)的濃度或 數量、來自各來源的灌洗液中胎盤細胞的數量、或來自各來源的灌洗液的其它特徵選擇。來 自相同胎盤的多次灌洗的灌洗液可以類似地匯總。類似地，本發明提供了胎盤灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細胞，其從 兩個或多個來源(例如兩個或多個胎盤)獲得並匯總。這樣的匯總的細胞可以包含大約等 量的來自兩個或多個來源的細胞，或不同數量的來自一個或多個匯總來源的細胞。來自各 來源的細胞的相對量可以基於例如待匯總的細胞中一種或多種特定細胞類型的數量，例如 CD34+細胞的數量、CD56+細胞的數量等來選擇。匯總庫(Pool)可包含例如補充了胎盤灌洗液細胞的胎盤灌洗液；補充了來自胎 盤的中間體自然殺傷(PINK)細胞的胎盤灌洗液；同時補充了胎盤灌洗液細胞和PINK細胞 的胎盤灌洗液；補充了胎盤灌洗液的胎盤灌洗液細胞；補充了 PINK細胞的胎盤灌洗液細 胞；同時補充了胎盤灌洗液和PINK細胞的胎盤灌洗液細胞；補充了胎盤灌洗液的PINK細 胞；補充了胎盤灌洗液細胞的PINK細胞；或同時補充了胎盤灌洗液細胞和胎盤灌洗液的 PINK細胞。本發明進一步提供了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和胎盤中間體自然殺傷細胞， 及其匯總庫或其組合，已經對其進行了測試以確定從例如給定量的胎盤灌洗液或PINK細 胞或給定體積的灌洗液預期可產生的腫瘤抑制(即效力)的程度或量。例如，在所述腫瘤 細胞將增殖的條件下，將已知數量的腫瘤細胞與等分試樣或樣本量的細胞接觸，並且將胎
22盤灌洗液、灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞或其組合存在時腫瘤細胞隨時間(例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10周，或更長時間)的增殖速率與在不存在灌洗液、灌洗液細胞、胎盤自然 殺傷細胞或其組合時等量腫瘤細胞的增殖速率進行比較。胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/ 或PINK細胞，或其組合或匯總庫的效力可以表示為例如以約10%、15%、20%、25%、30%、 35%,40%,45%,50%等抑制腫瘤細胞生長所需的細胞數量或溶液體積。在某些 實施方案中，胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和PINK細胞作為藥物級可施用 單位提供。這樣的單位可以以離散的體積提供，例如1 OOmL、150mL、200mL、250mL、300mL、 350mL、400mL、450mL、500mL等。也可以提供這樣的單位使得其包含規定量的例如胎盤灌 洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞或兩者，例如1 X 104、5X 104、1 X IO5,5X IO5,1 X 106、 5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8 或更多個細胞 / 毫升，或 1 X 104、5 X 104、1 X 105、 5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、 1 X IO11或更多個細胞/單位。可以提供這樣的單位以包含規定量的胎盤灌洗液、胎盤灌洗 液細胞和/或PINK細胞中的任何兩種或所有三種。在胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞的上述組合中，胎盤灌洗液、胎盤 灌洗液細胞和/或PINK細胞中的任一種、任兩種或所有三種可以是接受者自體的(即，從 接受者獲得)、或與接受者同源的(即，從除所述接受者之外的至少一個其它個體獲得)。PINK細胞、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤灌洗液的任何上述組合或匯總庫可以包 含來自例如胎盤灌洗液、外周血液、臍帶血、骨髓等的CD56+CD16+自然殺傷細胞。在具體 實施方案中，所述組合包含大約、至少約、或至多約1 X 104、5X 104、1 X 105、5X 105、1 X 106、 5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、5X IO8或更多個這樣的自然殺傷細胞/毫升，或者IX 104、 5 X IO4UX IO5,5 X IO5UX IO6,5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8UX 10\5 X 10\ 1 X 101(l、5 X IO10,1 X IO11或更多個細胞/單位。可以使用從自然來源分離的所述⑶56+⑶16+ 自然殺傷細胞，或者可以在擴增所述CD56+CD16+自然殺傷細胞之後將其包含在一種上述組 合或匯總庫中。所述CD56+CD16+NK細胞可以是自體的(即，從與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細 胞和/或PINK細胞相同的個體獲得的；或者從接受者獲得的)或同源的(即，來源於與胎 盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞不同的個體；或者來源於非接受者的個體)。優選地，標記每個單位以說明細胞體積、數量，細胞類型，該單位是否已富集了特 定類型的細胞，和/或該單位中給定數量的細胞的效力，或對特定類型的腫瘤細胞的增殖 產生可測量抑制的所述單位的給定毫升數。本發明還提供了僅包含胎盤中間體自然殺傷細胞、或包含胎盤中間體自然殺傷細 胞與胎盤灌洗液細胞和/或胎盤灌洗液組合的組合物。因而，在另一方面，本發明提供了包 含分離的CD56+、CD16—自然殺傷細胞的組合物，其中所述自然殺傷細胞從胎盤灌洗液分離， 且其中所述自然殺傷細胞包含至少50%的所述組合物中的細胞。在具體實施方案中，所述 自然殺傷細胞包含至少80%的所述組合物中的細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物 包含分離的⑶56+、⑶16+自然殺傷細胞。在更具體的實施方案中，所述⑶56+、⑶16+自然殺 傷細胞與所述CD56+、CD16_自然殺傷細胞來自不同的個體。在另一具體實施方案中，所述自 然殺傷細胞來自單個單體。在更具體的實施方案中，所述分離的自然殺傷細胞包含來自至 少兩個不同個體的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌 洗液。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液包含的胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自不 同個體。在另一具體實施方案中，所述組合物包含胎盤灌洗液細胞。在更具體的實施方案 中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體的實施方案 中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自不同的個體。在另一具體實施方案中，所 述組合物還包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細胞，其中所述分離的灌洗液和所 述分離的胎盤灌洗液細胞來自不同的個體。在包含胎盤灌洗液的任一上述實施方案的另一 更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。在包含胎盤 灌洗液細胞的任一上述實施方案的另一更具體的實施方案中，所述分離的胎盤灌洗液細胞 來自至少兩個個體。5.5.2.包含粘附件胎盤幹細胞的組合物在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液、眾多胎盤灌洗液細胞和/或眾多PINK細胞 或任意前述的組合或匯總庫補充了粘附性胎盤幹細胞。這樣的幹細胞描述在例如Hariri 的美國專利號7，045，148和7，255，879中。粘附性胎盤幹細胞不是滋養細胞。所述胎盤灌洗液、眾多胎盤灌洗液細胞和/或眾多PINK細胞、或任意前述的組 合或匯總庫可以補充例如 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、 1X108、5X108 或更多個細胞 / 毫升，或 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、 lxio^sxio^ixio^sxio^ixio^sxio^ixiolsxiolixio^sxio11 或更多個粘 附性胎盤細胞。在所述組合中的粘附性胎盤幹細胞可以是例如已經培養發生例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 次群體倍增或更多的 粘附性胎盤幹細胞。當在原始培養中或在細胞培養中培養時，粘附性胎盤幹細胞粘附組織培養基質， 例如組織培養容器表面(例如組織培養塑料)。培養中的粘附性胎盤幹細胞通常具有成纖 維樣、星形外觀，具有從中央細胞體延伸出的若干胞質突。然而，在相同條件下，粘附性胎盤 幹細胞與培養的成纖維細胞在形態學上是可區分的，因為胎盤幹細胞比成纖維細胞顯示出 更多數量的此類突起。在形態學上，胎盤幹細胞也可和造血幹細胞相區分，培養中的造血幹 細胞通常呈現更圓或卵圓的形態學。可用於本文提供的組合物和方法的粘附性胎盤幹細胞和胎盤幹細胞群表達眾多 標記物，這些標記物可被用於鑑別和/或分離所述幹細胞或包含所述幹細胞的細胞群。可 用於本文提供的組合物和方法中的粘附性胎盤幹細胞和粘附性幹細胞群包括幹細胞和直 接從胎盤或其任何部分(例如，羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤母面絨毛小葉、臍帶等) 獲得的含有幹細胞的細胞群。在一個實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞群是在培養中的 粘附性胎盤幹細胞群，例如在容器(例如袋)中的細胞群。粘附性胎盤幹細胞通常表達標記物⑶73、⑶105、⑶200、HLA-G和/或0CT-4，而不 表達CD34、CD38或CD45。粘附性胎盤幹細胞也可以表達HLA-ABC(MHC-l)和HLA-DR。這些 標記物可用於鑑別粘附性胎盤幹細胞，和將胎盤幹細胞與其它幹細胞類型相區分。因為胎 盤幹細胞可以表達CD73和CD105，它們可以具有間充質幹細胞樣特徵。然而，因為所述粘 附性胎盤幹細胞可以表達CD200和HLA-G (—種胎兒特異性標記物)，它們可以與既不表達 CD200也不表達HLA-G的間充質幹細胞(例如來自骨髓的間充質幹細胞)相區分。同樣地， ⑶34、⑶38和/或⑶45表達的缺乏確定所述粘附性胎盤幹細胞不是造血幹細胞。
在一個實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是CD200+、HLA-G+的，其中所述幹細胞 可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是CD73+和 ⑶105+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是⑶34_、⑶38_或⑶45_的。在更 具體的實施方案中，所述粘附性幹細胞也是⑶34_、⑶38_、⑶45_、⑶73+和⑶105+的。在另 一實施方案中，當在允許胚樣體形成的條件下培養時，所述粘附性幹細胞生成一個或多個 胚樣體。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是⑶73+、⑶105+、⑶200+的，其中所述 幹細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在所述群的具體實施方案中，所述粘附性幹 細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞是⑶34—、⑶38—或⑶45—的。 在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞是CD34_、CD38_和CD45—的。在更具體的實施方 案中，所述粘附性幹細胞是⑶34—、⑶38—、⑶45—和HLA-G+的。在另一具體實施方案中，當在 允許胚樣體形成的條件下培養時，所述粘附性胎盤幹細胞生成一個或多個胚樣體。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是⑶200+、0CT-4+的，其中所述幹細胞 可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在具體實施方案中，所述粘附性幹細胞是CD73+和 CD105+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案 中，所述粘附性幹細胞是⑶34—、⑶38—和⑶45—的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹 細胞是⑶34-、⑶38\⑶45-、⑶73+、⑶105+和HLA-G+的。在另一具體實施方案中，當在允許 胚樣體的形成條件下培養時，所述粘附性胎盤幹細胞生成一個或多個胚樣體。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是⑶73+、⑶105+和HLA-G+的，其中所 述粘附性幹細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在上述多個方案的具體實施方案 中，所述粘附性幹細胞也是CD34_、CD38_或CD45_的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹 細胞也是⑶34_、⑶38_和⑶45_的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是0CT-4+ 的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是CD200+的。在更具體的實施方案中， 所述粘附性幹細胞也是CD34-、CD38-、CD45-、0CT-4+和CD200+的。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是⑶73+、⑶105+幹細胞，其中當在 允許胚樣體形成的條件下時，所述幹細胞生成一個或多個胚樣體，並且其中所述粘附性幹 細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是 ⑶34_、⑶38—或⑶45—的。在另一具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是⑶34_、⑶38—和 CD45—的。在具體實施方案中，所述粘附性幹細胞也是0CT-4+的。在更具體的實施方案中， 所述粘附性幹細胞也是0CT-4+、⑶34-、⑶38-和⑶45-的。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是0CT-4+幹細胞，其中當在允許胚樣 體形成的條件下培養時，所述幹細胞生成一個或多個胚樣體，並且其中所述幹細胞已經被 證實可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在各種實施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述分離的胎盤細胞是0CT4+幹細胞。 在上述群的具體實施方案中，所述幹細胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所 述幹細胞是⑶34_、⑶38_或⑶45_的。在另一具體實施方案中，所述幹細胞是⑶200+的。在更 具體的實施方案中，所述粘附性幹細胞也是⑶73+、⑶105+、⑶200+、⑶34—、⑶38—和⑶45—的。 在另一具體實施方案中，所述群已經過擴增，例如已傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。在任意上述實施方案的更具體的實施方案中，所述粘附性胎盤細胞表達 ABC-p (—種胎盤-特異性ABC轉運蛋白；參見，例如Allikmets等人，CancerRes. 58(23) 5337-9(1998))。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞是⑶29+、⑶44+、⑶73+、⑶90+、⑶105+、 ⑶200+、⑶34_和⑶133_的。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤幹細胞、胎 盤幹細胞組成性 分泌IL-6、IL-8和單核細胞趨化蛋白(MCP-I)。每種上述提及的胎盤幹細胞可以包含從哺乳動物胎盤直接獲得和分離的胎盤幹 細胞，或已經過培養和傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多次 的胎盤幹細胞，或其組合。腫瘤細胞抑制性的大量上述粘附性胎盤幹細胞可以包含大約、至 少或不超過 1 X IO5,5X IO5U X IO6,5X IO6U X IO7,5X IO7U X IO8,5X IO8U X 10\5X IO9, 1 X 101Q、5 X 101Q、1 X IO11或更多個粘附性胎盤幹細胞。5. 5. 3.包含胎盤幹細胞條件培養基的組合物本發明還提供了包含PINK細胞、胎盤灌洗液和/或胎盤灌洗液以及另外的條件培 養基的腫瘤-抑制性組合物的用途。粘附性胎盤幹細胞、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤中間 體自然殺傷細胞可用於生成腫瘤細胞抑制性的條件培養基，即包含幹細胞分泌或排出的一 種或多種生物分子的培養基，其對眾多的一種或多種類型的免疫細胞具有可檢測的腫瘤細 胞抑制作用。在各種實施方案中，所述條件培養基包含胎盤細胞(例如幹細胞、胎盤灌洗液 細胞、PINK細胞)已在其中生長了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培 養基。在其它實施方案中，所述條件培養基包含胎盤細胞已在其中生長至至少30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%匯合或直至100%匯合的培養基。這樣的條件培養基可用於支 持獨立的胎盤細胞群或另一類型的細胞群的培養。在另一實施方案中，本文提供的條件培 養基包含粘附性胎盤幹細胞和非胎盤幹細胞已在其中經過培養的培養基。這樣的條件培養基可以與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤中間體自然殺 傷細胞中的任一種或任意組合混合以形成腫瘤細胞抑制性組合物。在某些實施方案中， 所述組合物包含小於一半體積的條件培養基，例如大約或小於約50 %、45 %、40 %、35 %、 30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或 體積。因而，在一個實施方案中，本發明提供了一種包含來自胎盤幹細胞培養的培養基， 其中所述胎盤幹細胞(a)粘附於基質；(b)表達⑶200和HLA-G，或表達⑶73、⑶105和 CD200,或表達CD200和0CT-4，或表達CD73、CD105和HLA-G，或表達CD73和CD105且當在允 許胚樣體形成的條件下培養包含所述胎盤幹細胞的胎盤細胞群時促進所述群中形成一個 或多個胚樣體，或者表達0CT-4且當在允許胚樣體形成的條件下培養包含所述胎盤幹細胞 的胎盤細胞群時促進所述群中形成一個或多個胚樣體；和(c)可檢測地抑制腫瘤細胞或腫 瘤細胞群的生長或增殖。在具體實施方案中，所述組合物進一步包含眾多所述胎盤幹細胞。 在另一具體實施方案中，所述組合物包含眾多非胎盤細胞。在更具體的實施方案中，所述非 胎盤細胞包含⑶34+細胞，例如造血祖細胞(例如外周血液造血祖細胞、臍帶血造血祖細胞 或胎盤血造血祖細胞)。所述非胎盤細胞也可以包含其它幹細胞，例如間充質幹細胞(例 如來自骨髓的間充質幹細胞)。所述非胎盤細胞也可以是一種或多種類型成年細胞或細胞 系。在另一具體實施方案中，所述組合物包含抗增殖試劑，例如抗-MIP-I α或抗-MIP-I β抗體。在具體實施方案中，胎盤細胞_條件化的培養基或上清液是從與眾多腫瘤細胞共 培養的眾多胎盤幹細胞得到的，所述胎盤幹細胞與腫瘤細胞的比例為約1 1、約2 1、約 3 1、約4 1或約5 1。例如，所述條件化的培養基或上清液可以從包含約1X105個 胎盤幹細胞、約IX106個胎盤幹細胞、約1X107個胎盤幹細胞或約IX 108個胎盤幹細胞或 更多個胎盤幹細胞的培養物中得到的。在另一具體實施方案中，所述條件化的培養基或上 清液是從包含如下細胞的共同培養物中得到的約1X105至約5X105個胎盤幹細胞和約 1X105個腫瘤細胞；約IX 106至約5 X106個胎盤幹細胞和約IX 106個腫瘤細胞；約1X107 至約5 X 107個胎盤幹細胞和約1 X 107個腫瘤細胞；或約1 X 108至約5 X 108個胎盤幹細胞 和約1X108個腫瘤細胞。在具體實施方案中，適於施用至70kg個體的條件培養基包含的上清液是被約 200mL培養基中的約7千萬個胎盤幹細胞條件化的。可以濃縮條件培養基以製備可施用的藥物級產品。例如，通過除去水(例如通過 蒸發、冷凍乾燥等)，可將培養基濃縮至約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%或更少。在具體實施方案中，例如，來自約7千萬胎盤幹細胞的200mL條件培養基可被 濃縮至約 180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL 或更少的體積。所述條 件培養基也可以例如通過蒸發、冷凍乾燥等手段基本上乾燥成例如粉末。5. 6.灌洗液和胎盤細胞的保存胎盤灌洗液或胎盤細胞，例如灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和PINK細胞可以 保存，即放置在允許長期儲存的條件下，或放置在抑制細胞死亡(例如因凋亡或壞死而死 亡)的條件下。胎盤灌洗液可以通過使胎盤細胞組合物流經至少一部分胎盤(例如流經胎盤血 管系統)而生成。所述胎盤細胞採集組合物包含一種或多種能夠保存包含在灌洗液內的 細胞的化合物。這樣的胎盤細胞採集組合物在上述部分5. 1中描述，例如包含細胞凋亡 抑制劑、壞死抑制劑和/或載氧全氟化碳的組合物，如在2006年12月28日提交的題為 「Improved Composition for Collecting andPreserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition (採集和保存胎盤幹細胞的改進組合物和使用該組合 物的方法)」的相關美國申請號11/648,812中所述。在一個實施方案中，流經胎盤或胎盤 組織的胎盤細胞採集組合物是可用於下述部分5. 4中描述的方法的胎盤灌洗液。在一個實施方案中，通過將細胞與包含細胞凋亡抑制劑和載氧全氟化碳的胎盤細 胞採集組合物接觸，從哺乳動物(例如人)分娩後的胎盤收集胎盤灌洗液和/或胎盤細胞， 其中和沒有與細胞凋亡抑制劑接觸的幹細胞群相比，所述細胞凋亡抑制劑存在的量和時間 足以減少或預防幹細胞群的細胞凋亡。例如，可以用胎盤細胞採集組合物灌洗所述胎盤並 從中分離胎盤細胞(例如所有有核胎盤細胞)。在具體實施方案中，細胞凋亡抑制劑是半胱 氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。在另一具體實施方案中，所述細胞凋亡抑制劑為JNK抑制劑。 在更具體的實施方案中，所述JNK抑制劑不能調節所述幹細胞的分化或增殖。在另一實施 方案中，所述胎盤細胞採集組合物在分離相中包含所述細胞凋亡抑制劑和所述載氧全氟化 碳。在另一實施方案中，所述胎盤細胞採集組合物在乳液中包含的所述細胞凋亡抑制劑和 所述載氧全氟化碳。在另一實施方案中，所述胎盤細胞採集組合物還包含乳化劑，例如卵磷月旨。在另一實施方案中，在接觸胎盤細胞時，所述細胞凋亡抑制劑和所述全氟化碳為約0°c 至約25°C之間。在另一更具體的實施方案中，在接觸胎盤細胞時，所述細胞凋亡抑制劑和所 述全氟化碳在約2°C至10°C之間、或約2°C至約5°C之間。在另一更具體的實施方案中，所 述接觸在轉運所述幹細胞群期間進行。在另一更具體的實施方案中，所述接觸在冷凍和解 凍所述幹細胞群期間進行。在另一實施方案中，可以通過將所述灌洗液和/或細胞與細胞凋亡抑制劑和器 官-保存化合物接觸來收集和保存胎盤灌洗液和/或胎盤細胞，其中與沒有和所述細胞凋 亡抑制劑接觸的灌洗液或胎盤細胞相比，所述細胞凋亡抑制劑存在的量和時間足以減少或 預防所述細胞的凋亡。
在具體實施方案中，所述器官-保存化合物為UW溶液(描述在美國專利號 4，798，824 中；也稱為 VIASPAN ；也可參見 Southard 等人，Transplantation 49 (2) 251-257(1990)或描述在Stern等人，美國專利號5，552，267中的溶液。在另一實施方案 中，所述器官_保存組合物為羥乙基澱粉、乳糖酸、棉子糖或其組合。在另一實施方案中，所 述胎盤細胞採集組合物還在兩相中或作為乳液包含載氧全氟化碳。在所述方法的另一實施方案中，在灌洗期間，將胎盤灌洗液和/或胎盤細胞與包 含細胞凋亡抑制劑和載氧全氟化碳、器官_保存化合物、或其組合的胎盤細胞採集組合物 接觸。在另一實施方案中，在通過灌洗進行收集之後，將胎盤細胞與所述幹細胞採集組合物 接觸。典型地，在胎盤細胞收集、富集和分離期間，優選地減少或消除由於缺氧和機械應 力引起的細胞應激。因此，在所述方法的另一實施方案中，在所述保存期間，在收集、富集 或分離期間，胎盤灌洗液、胎盤細胞或胎盤細胞群暴露於缺氧狀態下少於六小時，其中缺氧 狀態為氧濃度低於正常血氧濃度。在更具體的實施方案中，在所述保存期間，所述胎盤細胞 群暴露於所述缺氧狀態下少於兩小時。在另一更具體的實施方案中，在收集、富集或分離期 間，將所述胎盤細胞群暴露於所述缺氧狀態少於一小時、或少於三十分鐘、或不暴露於缺氧 狀態下。在另一具體實施方案中，在收集、富集或分離期間，所述胎盤細胞群不暴露於剪切 應力下。本文提供的胎盤細胞可以冷凍保存在例如在小容器(例如安瓿)中的冷凍保存培 養基中。合適的冷凍保存培養基包括但不限於培養基，包括例如生長培養基或細胞冷凍培 養基，例如市售的細胞冷凍培養基，例如C2695、C2639或C6039 (Sigma)。冷凍保存培養基 優選地包含濃度為例如約10% (ν/ν)的DMSO(二甲亞碸)。冷凍保存培養基可以包含另外 的試劑，例如甲基纖維素和/或甘油。在冷凍保存期間，優選地將胎盤細胞以約1°C /分鐘 冷卻。優選的冷凍保存溫度為約-80°C至約_180°C，優選地約_125°C至約_140°C。在解凍 使用之間，可以將冷凍保存的胎盤細胞轉移到液氮中。在某些實施方案中，例如，一旦安瓿 達到約_90°C，將其轉移到液氮貯存區。冷凍保存的細胞優選地在約25°C至約40°C的溫度 下解凍，優選地在約37°C的溫度解凍。5. 7.胎謝瞿洗液、PINK細朐,禾Π、混合_臺盤自然殺傷細朐舶泡丨腫瘤細朐並長的用 途本發明還提供了使用胎盤灌洗液、從胎盤灌洗液分離的細胞、分離的混合自然殺 傷細胞或分離的胎盤自然殺傷細胞(例如來自胎盤的中間體自然殺傷細胞)抑制腫瘤細胞生長(例如增殖)的方法。在一個實施方案中，本發明提供一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法， 該方法包括將腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、分離的混合自然 殺傷細胞和/或PINK細胞接觸，使得與沒有和胎盤灌洗液、灌洗液細胞、分離的混合自然殺 傷細胞和/或PINK細胞接觸的同樣類型腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞相比，所述腫瘤細胞或眾 多腫瘤細胞的增殖可檢測地減少了。在一個實施方案中，本文使用的「接觸」包含在胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤 自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)和/或分離的混合自然殺傷細胞以及腫瘤 細胞或眾多腫瘤細胞之間的直接物理接觸，例如細胞-細胞接觸。在另一實施方案中，「接 觸」包含存在於相同的物理空間中，例如將胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細 胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)和/或分離的混合自然殺傷細胞與腫瘤細胞或眾多腫 瘤細胞置於相同的容器中，例如培養皿(多孔板)中。在另一實施方案中，將胎盤灌洗液、 胎盤灌洗液細胞、混合自然殺傷細胞或胎盤中間體自然殺傷細胞與腫瘤細胞或眾多腫瘤細 胞「接觸」是通過例如將所述胎盤灌洗液或細胞(例如胎盤灌洗液細胞)、混合的自然殺傷 細胞或胎盤中間體自然殺傷細胞注射或輸注到個體中完成的，所述個體例如包含腫瘤細胞 或眾多腫瘤細胞的人，例如癌症患者。在某些實施方案中，將胎盤灌洗液以能對包含腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的個體 (例如癌症患者)產生可檢測的治療益處的任何量使用。在某些其它實施方案中，將胎盤灌 洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞以能對包含腫瘤細胞或眾 多腫瘤細胞的個體(例如癌症患者)產生可檢測的治療益處的任何量使用。因而，在另一 實施方案中，本發明提供了一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括在 個體內將腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或來自胎盤的中間 體自然殺傷細胞或眾多PINK細胞接觸，使得所述接觸對所述個體有可檢測的或可證實的 治療益處。本文使用的「治療益處」包括但不限於例如減小腫瘤的尺寸；減輕或終止腫瘤的擴 張；減少每單位體積的組織樣品例如血樣中的癌細胞數量；臨床上改善所述個體患有的具 體癌症的任何症狀，減輕或終止所述個體患有的具體癌症的任何症狀的惡化等。實現任一 或多項這樣的治療益處的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞的接觸被稱作是治 療有益的。在某些實施方案中中，將胎盤灌洗液細胞，例如來自胎盤灌洗液的有核細胞、混合 的自然殺傷細胞和/或胎盤中間體自然殺傷細胞以能對包含腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的 個體(例如癌症患者)產生可檢測的治療益處的任何量或數量使用。可以將胎盤灌洗液細 胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)以一 定的細胞數量施用至這樣的個體，例如可以向所述個體施用大約、至少約或至多約1X105、 5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X101CI 或 5X1010 個 胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或自然殺傷細胞。在其它實施方案中，可以將 胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞以一定的細 胞數量施用至這樣的個體，例如可以向所述個體施用大約、至少約或至多約IX 105、5X105、 1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X101ci 或 5X1010 個胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或自然殺傷細胞/每千克個體。可以根據胎盤灌洗液細 胞和/或胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)與所述個體中腫瘤細胞的近 似比例向這樣的個體施用胎盤灌洗液細胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞。例如， 可以將胎盤灌洗液細胞和/或胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)與個 體的腫瘤細胞數以大約、至少約或至多約1 1、1 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、 8 1、9 UlO 1、15 1、20 1、25 1、30 1、35 1、40 1、45 1、50 1、 55 1、60 1、65 1、70 1、75 1、80 1、85 1、90 1、95 1 或 100 1 的比例 施用至所述個體。在這樣的個體中的腫瘤細胞的數量可以例如通過對來自所述個體的組織 樣品(例如血樣、 活組織檢查等)中的腫瘤細胞計數來估計。在具體實施方案中，例如，對 於實體瘤，所述計數與對所述腫瘤成像以獲得近似腫瘤體積結合進行。本發明進一步提供一種使用胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞 和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的組合抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法。 在各種實施方案中，本發明提供了一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方法 包括將所述腫瘤細胞與如下物質接觸補充了眾多胎盤灌洗液細胞或PINK細胞的胎盤灌 洗液；補充了胎盤灌洗液或眾多PINK細胞的胎盤灌洗液細胞；補充了胎盤灌洗液和胎盤灌 洗液細胞的PINK細胞；眾多PINK細胞和眾多混合的自然殺傷細胞；眾多混合的自然殺傷 細胞和眾多胎盤灌洗液細胞；補充了混合的自然殺傷細胞的胎盤灌洗液；或胎盤灌洗液、 胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和PINK細胞全部的組合。在一個具體實施方案中，例如，腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖被補充了眾多胎 盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或眾多胎盤中間體自然殺傷細胞的胎盤灌洗液 所抑制。在具體實施方案中，例如每毫升的胎盤灌洗液補充了約1X104、5X104、1X105、 5X 105、1X 106、5X IO6或更多個胎盤灌洗液細胞或胎盤中間體自然殺傷細胞。在其它具體 實施方案中，胎盤灌洗液，例如一單元(即，來自單個胎盤的收集物)或約100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 IOOOmL 的灌洗液 補充了約 1 X 10\5 X IO4U X IO5,5 X IO5U X IO6,5 X IO6U X IO7,5 X IO7U X IO8,5 X IO8 或 更多個PINK細胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤灌洗液細胞/毫升，或1 X 104、5X 104、 1 X IO5,5 X IO5UX IO6,5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8UX 10\5 X 10\1X IO10, 5X IO10,1 X IO11或更多個PINK細胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤灌洗液細胞。在另一具體實施方案中，腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖被補充了胎盤灌洗液、 混合的自然殺傷細胞和/或眾多胎盤中間體自然殺傷細胞的眾多胎盤灌洗液細胞所抑制。 在更具體實施方案中，約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、 1 X 108、5X IO8 或更多個胎盤灌洗液細胞 / 毫升，或 1 X 104、5X 104、1 X IO5,5X IO5,1 X 106、 5 X IO6U X IO7,5 X IO7U X IO8,5 X IO8U X IO9,5 X IO9UX IO10,5 X IO10U X IO11 或更多個胎 盤灌洗液細胞補充了大約、或至少約 1 X 104、5X 104、1 X IO5,5X IO5,1 X IO6,5X IO6,1 X 107、 5X 107、1 X 108、5X IO8或更多個PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1 X 104、 5 X IO4UX IO5,5 X IO5UX IO6,5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8UX 10\5 X 10\ 1 X 1010、5 X 1010、1 X IO11 >更多個PINK細胞。在其它更具體實施方案中，約1 X 104、5 X 104、 1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108 或更多個胎盤灌洗液細胞、 PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106UX 107,5X 107UX 108,5X 108UX109,5X10\lX1010,5X1010UX10n 或更多個胎 盤灌洗液細胞補充 了大約、或至少約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、950或1000mL的灌洗液或約1單元的灌洗液。在另一具體實施方案中，腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖被補充了胎盤灌洗液、 胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞的眾多胎盤中間體自然殺傷細胞所抑制。在更 具體實施方案中，約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、 5X108或更多個胎盤中間體自然殺傷細胞，或1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、 5X106UX 107,5X 107UX 108,5X 108UX 109,5X 109UX1010,5X1010UX10n 或更多個 PINK 細胞補充了約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、 5X108或更多個胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1 X 104、5X 104、 1X105、5X 105、1X 106、5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、5X 108、1X 109、5X109、1X 1010、 sxiolixio11或更多個胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在其它更具體實 施方案中，約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108 或更多個胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1\104、5\104、1\105、 5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、 IX 1011或更多個胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞補充了大約、或 至少約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 1000mL的灌洗液或約1單元的灌洗液。在另一具體實施方案中，通過將腫瘤細胞與補充了粘附性胎盤幹細胞的胎盤灌洗 液、灌洗液細胞、PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞接觸來抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細 胞的增殖。在具體實施方案中，所述胎盤灌洗液、灌洗液細胞或PINK細胞補充了約1X104、 5X 104、1X 105、5X 105、1X 106、5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、5X 108 或更多個粘附性胎盤 幹細胞 / 毫升，或者 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、 5 X 108、1 X 109、5 X 109、1 X 1010、5 X 1010、1 X 1011 或更多個粘附性胎盤幹細胞。在另一實施方案中，通過將腫瘤細胞與補充了粘附性胎盤幹細胞-條件培養基的 胎盤灌洗液、灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或PINK細胞接觸來抑制腫瘤細胞或眾 多腫瘤細胞的增殖，例如每單位灌洗液、灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或PINK細 胞，或每 104、105、106、107、108、109 或 101Q 個細胞補充了 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 1、 0. 8,0. 9、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL 的幹細胞條件化培養基。在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞(例如 PINK細胞)、混合的自然殺傷細胞，及包含它們的組合和匯總庫按其最初獲得的形式使用， 即灌洗液是灌洗期間獲得的，胎盤灌洗液細胞是從這樣的灌洗液分離的，混合的自然殺傷 細胞是從這樣的灌洗液和匹配的臍帶血得到的，或PINK細胞是從這樣的灌洗液或這樣的 胎盤灌洗液細胞分離的。在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞 及它們的組合和匯總庫在使用前經過處理。例如，胎盤灌洗液可以以其從胎盤收集的原始 的、未經處理的形式被使用。胎盤灌洗液也可以在使用前被處理，例如通過陰性選擇一種或 多種類型的細胞，通過脫水減小體積；凍幹和再水合等方式進行處理。類似地，灌洗液細胞群可以以其最初從胎盤灌洗液分離的形式(如從胎盤灌洗液分離的所有有核細胞)被使 用，或者可以經過處理以例如除去一種或多種細胞類型(例如紅細胞)。PINK細胞可以以 其最初從胎盤灌洗液分離(例如使用CD56微珠分離)的形式被使用，或者可以經過處理例 如以除去一種或多種非殺傷細胞類型。在另一實施方案中，本發明提供一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將用 腫瘤細胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞或包含它們的匯 總庫或組合接觸，其中在所述接觸之前，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞、混 合的自然殺傷細胞或包含它們的匯總庫或組合已經與白細胞介素-2(IL-2)接觸了一段時 間。在某些實施方案中，在所述接觸之前，所述一段時間為大約、至少或至多1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46 或 48 小時。可以在抗癌治療療程中，向患有癌症的個體、或具有腫瘤細胞的個體施用一次所 述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞或它們的匯總庫和/或組合，或者 可以施用多次，例如在治療期間，每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22或23小時施用一次，或每1、2、3、4、5、6或7天施用一次，或每1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10或更多周施用一次。可以施用所述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯 總庫和/或組合，而不用考慮在過去是否曾向患有癌症或具有腫瘤細胞的人施用過所述灌 洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總庫和/或組合。因而，本文提供的方法包括 向患有癌症或具有腫瘤細胞的人施用胎盤灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總 庫和/或組合的任一種組合。在具體實施方案中，所述腫瘤細胞為血癌細胞。在各種具體實施方案中，所述腫 瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤 (CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、 組織細胞性淋巴瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、成視網膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或結腸 直腸腺癌細胞。所述胎盤灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞、包含它們的匯總 庫和/或組合可以屬於包括一種或多種其它抗癌劑的抗癌治療方案的一部分。這些抗癌 劑是本領域熟知的。除了所述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總庫和/或 組合之外，可以向患有癌症的個體施用的具體抗癌劑包括但不限於阿西維辛；阿柔比星； 阿考達唑鹽酸鹽；阿克羅寧；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波黴素；阿美蒽醌乙酸 鹽；安吖啶；阿那曲唑；安麴黴素；門冬醯胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐黴素； 巴馬司他；苯佐替派；比卡魯胺；比生群鹽酸鹽；二甲磺酸雙奈法德；比折來新；硫酸博來 黴素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C ；卡普睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉬；卡氮 芥；鹽酸卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；塞來考昔(C0X-2抑制劑)；苯丁酸氮芥；西羅黴 素；順鉬；克拉屈濱；甲磺酸克立那託；環磷醯胺；阿糖胞苷；達卡巴嗪；更生黴素；鹽酸柔 紅黴素；地西他濱；右奧馬鉬；地扎呱寧；甲磺酸地扎呱寧；地吖醌；多西他賽；多柔比星； 鹽酸多柔比星；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；達佐黴素；依達曲沙；鹽酸依 氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉬；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比 星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑；依託泊苷；磷酸依託泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法 倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；氟尿苷；磷酸氟達拉濱；氟尿嘧啶；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；伊達比星鹽酸鹽；異環磷醯胺；伊莫福新；異丙 鉬；依立替康；鹽酸依立替康；乙酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索 鈉；環己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕 酮；美法侖；美諾立爾；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米 託卡星；絲裂紅素；米託潔林；米託馬星；絲裂黴素；米託司培；米託坦；鹽酸米託蒽醌；麥 考酚酸；諾考達唑；諾拉黴素；奧馬鉬；奧昔舒侖；紫杉醇；培門冬酶；佩裡黴素；戊氮芥；培 洛黴素硫酸鹽；培磷醯胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡羅蒽醌鹽酸鹽；普卡黴素；普洛美坦；卟 菲爾鈉；泊非黴素；潑尼莫司汀；鹽酸甲基苄胼；嘌呤黴素；鹽酸嘌呤黴素；吡唑呋喃菌素； 利波腺苷；沙芬戈；沙芬戈鹽酸鹽；司莫司汀；二甲二苯四氮烯；sparfosate鈉；司帕黴素； 鹽酸鍺螺胺；螺莫司汀；螺鉬；鏈黑菌素；鏈佐星；磺氯苯脲；他利黴素；tecogalan鈉；泰索 帝；替加氟；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔隆；睪內酯；硫咪嘌呤；硫鳥嘌呤； 噻替派；噻唑呋林；替拉扎明；檸檬酸託瑞米芬；乙酸曲託龍；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡 糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；妥布氯唑鹽酸鹽；尿嘧啶氮芥；尿烷亞胺；伐普肽；維替泊芬； 硫酸長春鹼；硫酸長春新鹼；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定；硫酸長春甘酯；硫 酸長春羅辛；酒石酸長春瑞濱；硫酸長春羅定；硫酸長春利定；伏氯唑；折尼鉬；淨司他丁 ； 和鹽酸佐柔比星。 其它抗癌藥物包括但不限於20_表-1，25_ 二羥維生素D3 ；5-乙炔基尿嘧啶；阿 比特龍；阿柔比星；醯基富烯；腺環戊醇；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜 胺；氨莫司汀；2，4_ 二氯苯氧乙酸；氨磷汀；氨基乙醯丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷； 阿那曲唑；穿心蓮內酯；血管生成抑制劑；拮抗劑D ；拮抗劑G ；安雷利克斯；抗背側發育形 態發生蛋白-1 ；抗雄激素藥，前列腺癌；抗雌激素藥；抗瘤酮；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非 迪黴素；細胞凋亡基因調節劑；細胞凋亡調節劑；無嘌呤酸；阿糖-CDP-DL-PTBA ；精氨酸 U兌；asulacrine ；Hftk^fi ；H^WjtT ；axinastatin 1 ；axinastatin 2 ；axinastatin 3 ；阿扎司瓊；阿扎毒素；重氮酪氨酸；漿果赤黴素III衍生物；balanol ；巴馬司他；BCR/ABL 拮抗劑；苯並二氫卟吩；苯甲醯星孢素；日內醯胺衍生物；日-alethine ；亞阿克拉黴素B ； 白樺脂酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；比生群；雙氮丙啶基精胺；雙奈法德；bistratene A ；比 折來新；breflate ；溴匹立明；布度鈦；丁硫氨酸亞碸胺；卡泊三醇；抑激酶素C ；喜樹鹼衍 生物；卡培他濱；甲醯胺-氨基-三唑；羧基醯胺基三唑；CaRest M3 ；CARN 700 ；軟骨衍生的 抑制劑；卡折來新；酪蛋白激酶抑制劑(IC0S)；澳粟精胺；殺菌肽B ；西曲瑞克；chlorlns ； 氯喹喔啉磺醯胺；西卡前列素；順卟啉；克拉屈濱；克羅米芬類似物；克黴唑；collismycin A ；collismycin B ；考布他汀 A4 ；考布他汀類似物；conagenin ；crambescidin 816 ；克立那 ft MMM^X 8 ；月太 A；curacin A ；cyclopentanthraquinones ；cycloplatam ；
cypemycin ；阿糖胞苷十八烷基磷酸鈉；細胞溶解因子；cytostatin ；達昔單抗；地西他 濱；脫氫膜海鞘素BWehydrodidemnin B)；地洛瑞林；地塞米松；右異環磷醯胺；右雷佐 生；右維拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B ;didox ；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)； 二氫-5-氮胞苷；二氫紫杉醇，9- ；dioxamycin ； 二苯基螺莫司汀；多西他賽；二十二烷 醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌黴素SA;依布硒啉； 依考莫司汀；依地福新；依決可單抗；依氟鳥氨酸；欖香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立 雄胺；雌莫司汀類似物；雌激素激動劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依託泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；非格司亭；非那司提；黃酮類抗腫瘤藥；氟卓斯汀； fluasterone ；氟達拉濱；鹽酸fluorodaunorunicin ；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫 司汀；釓替沙林；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶抑制劑；吉西他濱；穀胱甘肽抑制 劑；h印sulfam ；heregulin ；六亞甲基雙乙酸胺；金絲桃素；伊班膦酸；伊達比星；艾多昔 芬；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；伊馬替尼(例如GLEEVEC )；咪喹莫特；免疫刺激 肽；胰島素樣生長因子-1受體抑制劑；幹擾素激動劑；幹擾素；白細胞介素；碘苄胍；碘阿 黴素；甘薯苦醇，4-；伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole ；isohomohalicondrinB ；伊他司 瓊；jasplakinolide ；kahalalide F ；三醋酸片螺素-N ；蘭瑞肽；leinamycin ；來格司亭; 硫酸蘑菇多糖；leptolstatin;來曲唑；白血病抑制因子；白細胞a幹擾素；亮丙瑞林+ 雌激素+黃體酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性 鉬類化合物；lissoclinamide 7 ；洛鉬；胍乙基磷酸絲氨酸；洛美曲索；氯尼達明；洛索蒽 醌；洛索立賓；勒託替康；德卟啉鑥(lutetium texaphyrin) ；lysofylline ；裂解肽；美坦 辛；制苷糖酶素A ；馬立馬司他；馬索羅酚；乳腺絲抑蛋白(maspin)；基質溶解素抑制劑； 基質金屬蛋白酶抑制劑；美諾立爾；美巴龍；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制 劑；米非司酮；米替福新；米立司亭；米託胍腙；二溴衛矛醇；絲裂黴素類似物；米託萘胺； mitotoxin成纖維細胞生長因子-皂草素蛋白；米託蒽醌；莫法羅汀；莫拉司亭；愛必妥，人 絨毛膜促性腺激素；單磷醯脂質A+分支桿菌細胞壁sk ；莫哌達醇；芥子類抗癌劑；印度洋 海綿(myCaper0Xide)B ；分支桿菌細胞壁提取物；myriaporone ；N-乙醯基地那林；N-取代 的苯甲醯胺；那法瑞林；那瑞替噴；納洛酮+噴他佐辛；napavin ；naphterpin ；那託司亭；奈 達鉬；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼魯米特；nisamycin ；—氧化氮調節劑；硝基氧抗氧化劑； nitrullyn ；奧利默森(GENASENSE ) ；06-苄基鳥嘌呤；奧曲肽；okicenone ；寡核苷酸；奧那 司酮；奧坦西隆；昂丹司瓊；oracin ； 口服細胞因子誘導物；奧馬鉬；奧沙特隆；奧沙利鉬； oxaunomycin ；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine ；棕櫚醯根黴素；帕米磷 酸；人參三醇；帕諾米芬；菌鐵素；帕折普汀；培門冬酶；培得星；戊聚糖多硫酸鈉；噴司他 丁 ；pentrozole ；全氟溴烷；培磷醯胺；紫蘇子醇；苯連氮黴素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制劑； 溶血性鏈球菌製劑；鹽酸毛果芸香鹼；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A ；placetin B ；纖溶 酶原活化因子抑制劑；鉬絡合物；鉬化合物；鉬-三胺絡合物；卟菲爾鈉；泊非黴素；撥尼 松；丙基二吖啶酮；前列腺素J2 ；蛋白酶體抑制劑；基於蛋白A的免疫調節劑；蛋白激酶C 抑制劑；微藻蛋白激酶C抑制劑；蛋白質酪氨酸磷酸酶抑制劑；嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑； 紫紅素；吡唑啉吖啶；吡多酸化血紅蛋白聚乙二醇偶聯物；raf拮抗劑；雷替曲塞；雷莫司 瓊；ras-法呢基蛋白轉移酶抑制劑；ras抑制劑；ras-GAP抑制劑；脫甲基瑞替普汀；依替 磷酸錸Re 186 ；根黴素；核酶；RII維甲醯胺；rohitukine ；羅莫肽；羅喹美克；rubiginone B1 ；ruboxyl ；沙芬戈；saintopin ； SarCNU ；肉芝軟珊瑚醇(sarcophytol) A ；沙格司亭； Sdi 1模擬物；司莫司汀；衰老衍生抑制劑1 ；有義寡核苷酸；信號轉導抑制劑；西佐喃； 索布佐生；硼卡鈉；苯基乙酸鈉；solverol ；生長調節素結合蛋白；索納明；膦門冬酸；穗 黴素D ；螺莫司汀；脾臟五肽；海綿抑制素1 ；角鯊胺；stipiamide ；溶基質蛋白酶抑制劑； sulfinosine ；超活性血管活性腸肽拮抗劑；suradista ；蘇拉明；八氫吲嗪三醇；他莫司汀； 他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎羅汀；替可加蘭鈉；替加氟；tellurapyrylium ；端 粒酶抑制劑；替莫泊芬；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide) ；tetrazomine ；thaliblastine ；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模擬物；胸腺法新；胸腺生成 素受體激動劑；噻可拉林；促甲狀腺激素；錫乙基初紫紅素；替拉扎明；二氯二茂鈦； topsentin ；託瑞米芬；翻譯抑制劑；維甲酸；三乙醯尿苷；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林； 託烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制劑；酪氨酸磷酸化抑制劑；UBC抑制劑；烏苯美司；來 自泌尿生殖竇的生長抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolin B ；維拉雷瑣；藜蘆 胺；verdins ；維替泊芬；長春瑞濱；vinxaltine ；牡荊鹼；伏氯唑；扎諾特隆；亞苄維C和淨 司他丁斯酯。5. 8.用免疫調節化合物處理自然殺傷細胞本文其它部分所述的分離的自然殺傷細胞(例如PINK細胞或混合的自然殺傷細 胞)可以用免疫調節化合物處理，例如與免疫調節化合物接觸，以增強所述細胞的抗腫瘤 活性。因此，本發明提供了一種增強自然殺傷細胞對腫瘤細胞的細胞毒性的方法，該方法包 括將所述自然殺傷細胞與一定濃度的免疫調節化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調 節化合物接觸的自然殺傷細胞相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細胞表現出對腫 瘤細胞增強的細胞毒性。在另一實施方案中，本發明提供了一種增加自然殺傷細胞中粒酶 B表達的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞與一定濃度的免疫調節化合物接觸一段時 間，與沒有與所述免疫調節化合物接觸的自然殺傷細胞相比，所述濃度和時間足以使所述 自然殺傷細胞表現出增加的粒酶B的表達。所述免疫調節化合物可以是如下所述的任一種 化合物，例如來那度胺或pomalidomide。本發明還提供了一種增強自然殺傷細胞群(例如PINK細胞群或混合的自然殺傷 細胞群)對眾多腫瘤細胞的細胞毒性的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞群與一定濃 度的免疫調節化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調節化合物接觸的等量自然殺傷細 胞群相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細胞群表現出對所述眾多腫瘤細胞可檢測 的增強的細胞毒性。在另一實施方案中，本發明提供了一種增加自然殺傷細胞群中粒酶B 表達的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞群與一定濃度的免疫調節化合物接觸一段時 間，與沒有與所述免疫調節化合物接觸的等量自然殺傷細胞群相比，所述濃度和時間足以 使所述自然殺傷細胞群表達可檢測的增多量的粒酶B。在具體實施方案中，所述自然殺傷細 胞群包含在胎盤灌洗液細胞(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞)內。在上述實施方案的具體實施方案中，所述自然殺傷細胞是CD56+、〔016_胎盤中間 體自然殺傷細胞(PINK細胞)。在上述實施方案的另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞 為混合的自然殺傷細胞，即來自匹配的胎盤灌洗液和臍帶血的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與沒有與所述免疫調節化合物接觸的等量所述自然殺傷 細胞相比，與所述免疫調節化合物接觸的所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞或混合的 自然殺傷細胞)以更高水平表達BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、⑶SB、IL2RA或TNFRSF18中的 一種或多種。在另一具體實施方案中，與沒有和所述免疫調節化合物接觸的等量所述自然 殺傷細胞相比，與所述免疫調節化合物接觸的所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以 更高水平表達 ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、⑶SB、GZMB、 ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI 和 TBX21 中的一種或多種。本發明還提供了一種增強人胎盤灌洗液細胞群(例如來自胎盤灌洗液的所有有 核細胞群)對眾多腫瘤細胞的細胞毒性的方法，該方法包括將所述胎盤灌洗液細胞與一定濃度的免疫調節化合物接觸一段時間，與沒有和所述免疫調節化合物接觸的等量胎盤灌洗 液細胞相比，所述濃度和時間足以使所述胎盤灌洗液細胞表現出對所述眾多腫瘤細胞的可 檢測的增強的細胞毒性。在另一實施方案中，本發明提供了一種增加胎盤灌洗液細胞群中 粒酶B表達的方法，該方法包括將所述胎盤灌洗液細胞群與一定濃度的免疫調節化合物接 觸一段時間，與沒有與所述免疫調節化合物接觸的等量胎盤灌洗液細胞相比，所述濃度和 時間足以使所述胎盤灌洗液細胞群表達可檢測的增多量的粒酶B。免疫調節化合物可以是商業上購買的或根據本文提及的專利或專利公開物中描 述的方法製備的，所有這些專利或專利公開物通過參考納入本文。進一步地，可以不對稱合 成或者使用已知拆分試劑或手性柱以及其它標準合成有機化學技術拆分得到光學純的組 分。免疫調節化合物可以是外消旋的、立體異構富集的或立體異構純的，並且可以包含其藥 學可接受的鹽、溶劑化物及前藥。除非另有說明，本文使用的術語「免疫調節化合物」包含顯著地抑制TNF a、LPS誘 導的單核細胞IL-IB和IL-12，且部分地抑制IL-6生成的有機小分子。在具體實例中，所述 免疫調節化合物為來那度胺、pomalidomide或沙立度胺。免疫調節化合物的具體實例包括但不限於取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物， 例如在美國專利號5，929，117中公開的那些；1-氧代-2- (2,6- 二氧代-3-氟哌啶-3-基) 異二氫吲哚和1，3- 二氧代-2- (2,6 二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚，例如在美國專 利號5，874，448和5，955，476中公開的那些；在美國專利號5，798，368中描述的四取代的 2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異二氫吲哚；1-氧代和1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代 哌啶-3-基)異二氫吲哚(例如，沙立度胺的4-甲基衍生物)，包括但不限於在美國專利號 5，635，517,6, 476，052,6, 555，554 和 6，403，613 中公開的那些；在美國專利號 6，380，239 中描述的在二氫吲哚環的4-或5-位發生取代的1-氧代和1，3-二氧代異二氫吲哚(例 如，4-(4_氨基-1，3-二氧代異二氫吲哚-2-基)-4_氨基甲醯基丁酸)；在美國專利號 6，458，810中描述的在2-位用2，6- 二氧代-3-羥基哌啶_5_基取代的異二氫吲哚酮 和異二氫吲哚-1，3- 二酮(例如，2- (2,6- 二氧代-3-羥基-5-氟代哌啶-5-基)-4-氨基異 二氫吲哚-1-酮)；在美國專利號5，698，579和5，877，200中公開的一類非多肽環醯胺；氨 基沙立度胺及氨基沙立度胺的類似物、水解產物、代謝產物、衍生物和前體，和取代的2-(2， 6- 二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲醯亞胺和取代的2-(2，6- 二氧代哌啶-3-基)-1_氧異吲 哚，例如在美國專利號6，281，230和6，316，471中描述的那些；以及異吲哚_醯亞胺化合 物，例如在美國專利公開號2003/0045552 A1、美國專利號7，091，353和TO 02/059106中描 述的那些。本文提及的每個專利和專利申請的全部內容通過參考納入本文。免疫調節化合 物不包含沙立度胺。在某些實施方案中，所述免疫調節化合物是在苯環上發生氨基取代的1-氧代-和 1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚，如在美國專利號5，635，517中所描 述的，該專利的全部內容通過參考納入本文。這些化合物具有結構I 其中X和Y之一是C = 0，X和Y中的另一個為C = 0或CH2，且R2是氫或低級烷 基，特別是甲基。具體的免疫調節化合物包括但不限於Ι 氧代哌啶 -3-基)-4-氨基異二氫吲哚 氧代哌啶-3-基)-5-氨基異二氫吲哚 氧代哌啶-3-基)-6-氨基異二氫吲哚 氧代哌啶-3-基)-7-氨基異二氫吲哚1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)-4-氨基異二氫吲哚； 1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)-5-氨基異二氫吲哚；
1-氧代-2-(2，6-1-氧代-2-(2，6-1-氧代-2-(2，6-1-氧代-2-(2 Α-其它具體免疫調節化合物屬於一類取代的2-(2，6_ 二氧代哌啶-3-基)鄰苯 二甲醯亞胺和取代的2-(2，6_ 二氧代哌啶-3-基)-1_氧代異吲哚，例如在美國專利號 6，281，230,6, 316，471,6, 335，349、和 6，476，052，以及 WO 98/03502 中描述的那些，每專利
和專利公開物均通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中X和Y之一是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨立地是滷素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其餘的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苄基或滷素；條件是如果X和Y是C = 0，且⑴各HR3和R4是氟或(U)R1U或R4中 的一個是氨基，則R6不為氫。這類的代表性化合物具有下式 其中R1是氫或甲基。在單獨的實施方案中，包含了這些化合物的對映體純的形式 (例如光學純的(R)或(S)對映異構體)的用途。其它具體免疫調節化合物屬於公開在美國專利申請公開號US2003/0096841和US 2003/0045552和WO 02/059106中的一類異吲哚_醯亞胺，各專利和專利公開物通過參考納 入本文。代表性的化合物具有下式II 及其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映異構體、非對映異構體、 外消旋體和立體異構體的混合物，其中X和Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是CH2或C = 0 ；R1 是 H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、 (C0-C4)烷基-(CfC6)雜環烷基、(C0-C4)燒基-(C2-C5)雜芳基、C(O) R3、C (S)R3、C(O) OR4、 (C1-C8)燒基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O) OR5、C(O) NHR3、C ⑶ NHR3、C(O) NR3R3'、C (S) NR3R3'、或(C1-C8)烷基-0 (CO) R5 ；R2 是 H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、或(C2-C8)炔基；R3和R3』獨立地是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、 (C-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O) OR5、(C1-C8)烷基-0 (CO) R5、或 C (0) OR5 ；R4 是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基 _0R5、苄基、芳基、 (C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環烷基、或(Ctl-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基；
R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、或(C2-C5)雜芳基；R6每次出現時獨立地是H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C2-C5)雜芳基、或(Ctl-C8)烷基-C(O)O-R5,或多個R6基團可以連接形成雜環烷基基團；η 是 0 或 1 ；和*代表手性-碳中心。在式II的具體化合物中，當η是0時，則R1是(C3-C7)環烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8) 炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、C(O)R3, C(O)0R\ (C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(S)NHR3、或(C1-C8) 烷基-O(CO)R5 ；R2 是 H、或(C1-C8)烷基；且R3 是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4) 烷基-(C1-C6)雜環烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C5-C8)烷基-N(R6)2 ； (C0-C8)烷 基-NH-C (0) O-R5 ； (C1-C8)烷基-OR5，(C1-C8)烷基-C (0) OR5、(C1-C8)烷基-0 (CO) R5 或-C (0) OR5 ；且其它變量具有相同的定義。在式II的其它具體化合物中，R2是H、或(C1-C4)烷基。在式II的其它具體化合物中，R1是(C1-C8)烷基、或苄基。在式II的其它具體化合物中，R1是H、(C1-C8)烷基、苄基、CH2OCH3^ CH2CH2OCH3、或 在式II化合物的另一實施方案中，R1是 其中Q是0或S，R7每次出現時獨立地是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環烷基、(C2-C8) 烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、滷素、(Ctl-C4)烷基-(C1-C6)雜環烷基、(Ctl-C4)烷基-(C2-C5) 雜芳基、(Ctl-C8)烷基-N(R6)2、(C「C8)烷基-OR5、(C「C8)烷基-C(O) OR5、(C「C8)烷基-O(CO) R5、或C(0)0R5，或相鄰出現的R7可以結合在一起形成雙環烷基或芳環。在式II的其它具體化合物中，R1是C(0)R3。在式II的其它具體化合物中，R3是(Ctl-C4)燒基-(C2-C5)雜芳基、(C1-C8)烷基、 芳基、或(Ctl-C4)烷基-0R5。在式II的其它具體化合物中，雜芳基是吡啶基、呋喃基、或噻吩基。在式II的其它具體化合物中，R1是C(0)0R4。在式II的其它具體化合物中，C(O)NHC(O)的H可以被(C1-C4)烷基、芳基、或苄基代替。該類型中的化合物的進一步實例包括但不限於[2- (2，6- 二氧代-哌啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3- 二氫-IH-異吲哚-4-基甲基]-醯胺；(2- (2,6- 二氧代-哌 啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3- 二氫-IH-異吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸叔丁酯；4-(氨基 甲基)-2- (2，6- 二氧代(3-哌啶基))-異二氫吲哚-1，3- 二酮；N- (2- (2，6- 二氧代-哌 啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3- 二氫-IH-異吲哚-4-基甲基)-乙醯胺；N- {(2- (2,6- 二氧代 (3-哌啶基)-1，3- 二氧代異二氫吲-4-基)甲基}環丙基-甲醯胺；2-氯-N- {(2- (2，6- 二 氧代(3-哌啶基))_1，3-二氧代異二氫吲-4-基)甲基}乙醯胺；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌 啶基))-1，3_二氧代異二氫吲-4-基)-3_吡啶基甲醯胺；3-{1-氧代-4-(苄基氨基)異二 氫吲哚_2_基}哌啶-2，6-二酮；2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-4-(苄基氨基)異二氫吲 哚-1，3- 二酮；N- {(2- (2,6- 二氧代(3-哌啶基))-1，3- 二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基} 丙醯胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}_3_吡 啶基甲醯胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲-4-基)甲基}庚 醯胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}_2_呋 喃基甲醯胺；{N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲-4-基)氨基甲醯 基}乙酸甲酯；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基)戊醯 胺；N- (2- (2,6- 二氧代(3-哌啶基))-1，3- 二氧代異二氫吲哚-4-基)-2-噻吩基甲醯胺； N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基} (丁基氨基)甲 醯胺；N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基}(辛基氨 基)甲醯胺；和N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基} (苄基氨基)甲醯胺。其它具體免疫調節化合物屬於在美國專利申請公開號2002/0045643、國際公開號 WO 98/54170和美國專利號6，395，7546中公開的一類異吲哚-醯亞胺，各專利和專利公開 物均通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式III 及其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映異構體、非對映異構體、 外消旋體和立體異構體的混合物，其中X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是CH2或C = 0 ；R 是 H、或 CH20C0R，；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨立地是滷素、1至4個碳原子的烷基，或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3或R4中一個是硝基或-NHR5，且R1、R2、R3或R4中其餘的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；R，是 R7-CHRici-N (R8R9)；R7間-亞苯基、或對-亞苯基、或-(CnH2n)-,其中η具有0至4的值；各R8和R9彼此獨立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結合在一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-,其中X1是-O-、-S-或-NH-；R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基；且*代表手性碳中心。其它代表性的化合物具有下式 其中 X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3或R4彼此獨立地是滷素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其餘的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；R7是間-亞苯基、或對-亞苯基、或-(CnH2n)-,其中η具有0至4的值；各R8和R9彼此獨立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結合在一起是四 亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-0-、-S-、或-NH-；R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基。其它代表性的化合物具有下式 其中X和Y中的一個是C = 0，且X禾口 Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨立地是滷素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是硝基或被保護的氨基，且R1、R2、R3和R4中其 餘的是氫；且R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；其它代表性的化合物具有下式 其中X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨立地是滷素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其餘的是氫；R5是氫、1至8個碳原子的烷基、或CO-R7-CH(Riq) NR8R9,其中每個R7、R8、R9和Riq如 本文所定義；且R6是1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟。所述化合物的具體實例具有下式 其中X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苄基、氯或氟；R7是間-亞苯基、對-亞苯基、或-(CnH2n)-,其中η具有0至4的值；各R8和R9彼此獨立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結合在一起是四 亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-,其中X1是-0-、-S-、或-NH-；且R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基。最優選的免疫調節化合物是4-(氨基)-2- (2,6- 二氧代(3_哌啶基))-異二氫吲 哚-1，3- 二酮和3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6- 二酮。所 述化合物可以經由標準的合成方法(參見例如美國專利號5，635，517，通過參考納入本文) 獲得。所述化合物可從 Celgene Corporation，Warren，NJ 獲得。4-(氨基)-2-(2，6-二氧
代(3-哌啶基))_異二氫吲哚-1，3-二酮具有如下化學結構 化合物3-(4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮具有如下化學結構 在另一實施方案中，具體免疫調節化合物包含3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異 口引哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的多晶型，例如晶型A、B、C、D、E、F、G和H，其公開在美國公 開號US 2005/0096351 Al中，該申請通過參考納入本文。例如，3_(4_氨基-1-氧代-1， 3- 二氫_異吲哚-2-基)_哌啶-2，6- 二酮的晶型A是可從非水溶劑系統獲得的非溶劑化 的結晶材料。晶型A的X射線粉末衍射圖包含在約8、14. 5、16、17. 5,20. 5、24和26度2 θ 處的顯著峰，和具有約270°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型A為弱吸溼性的或非 吸溼性的，且似乎是迄今為止發現的3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-哌 啶_2，6-二酮的熱力學最穩定的無水晶型。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型B是半 水合的結晶材料，其可以從各種溶劑系統中獲得，所述溶劑系統包括但不限於己烷、甲苯和 水。晶型8的乂射線粉末衍射圖包含在約16、18、22和27度2 9處的顯著峰，且其DSC曲 線在約146°C和268°C吸熱，所述約146°C和268°C溫度通過熱臺顯微鏡試驗鑑定為脫水和 熔融溫度。互變研究顯示晶型B在水性溶劑系統中轉變成晶型E，且在丙酮及其它無水體系 中轉變成其它形式。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型C是半 溶劑化的結晶材料，其可以從多種溶劑(例如但不限於丙酮)中獲得。晶型C的X射線粉 末衍射圖包含在約15. 5和25度2 θ處的顯著峰，和具有約269°C的差示掃描量熱法熔融溫 度峰值。晶型C在低於約85%的RH時是非吸溼性的，但可以在較高相對溼度下可轉變成晶 型B。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6- 二酮的晶型D是從 乙腈和水的混合物中製備的結晶的、溶劑化的多晶型物。晶型D的X射線粉末衍射圖包含 在約27和28度2 θ處的顯著峰，且具有約270°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型D 為弱吸溼性的或非吸溼性的，但是當在較高相對溼度下，其通常將轉變成晶型B。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型E是二 水合的結晶材料，其可以通過將3-(4_氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2， 6_ 二酮在水中製漿並在具有約9 1比例的丙酮水的溶劑系統中緩慢蒸發3-(4_氨 基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6- 二酮而獲得。晶型E的X射線粉末 衍射圖包含在約20、24. 5和29度2 θ處的顯著峰，和具有約269°C的差示掃描量熱法熔融 溫度峰值。晶型E可以在丙酮溶劑系統中轉變成晶型C，且可在THF溶劑系統中轉變成晶型 G。在水性溶劑系統中，晶型E似乎是最穩定的形式。對晶型E進行的去溶劑化試驗表明， 當在約125°C加熱約五分鐘後，晶型E可以轉變成晶型B。當在175°C加熱約五分鐘後，晶型 B可以轉變成晶型F。
3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型F是非 溶劑化的結晶物質，其可以通過使晶型E脫水獲得。晶型F的X射線粉末衍射圖包含在約 19、19. 5和25度2 θ處的顯著峰，且具有約269°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型G是非 溶劑化的結晶物質，其可以通過將晶型B和E在溶劑中製漿而獲得，所述溶劑例如但不限於 四氫呋喃(THF)。晶型G的X射線粉末衍射圖包含在約21、23和24. 5度2 θ處的顯著峰， 且具有約267°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。
3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6- 二酮的晶型H是部 分水合的(約0. 25摩爾)結晶材料，其可以通過將晶型E暴露於0%相對溼度而獲得。晶 型H的X射線粉末衍射圖包含在約15、26和31度2 θ處的顯著峰，且具有約269°C的差示 掃描量熱法熔融溫度峰值。可用於本發明提供的方法的其它具體免疫調節化合物包括但不限於1-氧 代-2- (2,6- 二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚和1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代-3-氟 哌啶-3-基)異二氫吲哚，例如在美國專利號5，874，448和5，955，476中描述的那些，各專 利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中Y為氧或H2，且各R1、R2、R3和R4彼此獨立地為氫、滷素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子
的烷氧基，或氨基。可用於本發明提供的方法的其它具體免疫調節化合物包括但不限於在美國專利 號5，798，368中描述的四取代的2- (2,6- 二氧代-哌啶-3-基)-1-氧代異二氫吲哚，該專 利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中各R1、! 2、! 3和R4彼此獨立地為滷素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原
子的烷氧基。可用於本發明提供的方法的其它具體免疫調節化合物包括但不限於在美國專利 號6，403，613中描述的1-氧代和1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚，
該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中Y 為氧或 H2,R1和R2中的第一個為滷素、烷基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、或氨基甲 醯基，R1和R2中的第二個(獨立於第一個)是氫、滷素、烷基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨 基、氰基、或氨基甲醯基，且R3為氫、烷基、或苄基。所述化合物的具體實例具有下式 其中R1和R2中的第一個為滷素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧 基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲醯基，R1和R2中的第二個(獨立於第一個)是氫、滷素、1至4個碳原子的烷基、1至4個 碳原子的烷氧基、其中烷基具有1至4個碳原子的烷基氨基、其中各烷基具有1至4個碳原 子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲醯基，且R3為氫、1至4個碳原子的烷基、或苄基。具體實例包括但不限於1-氧代_2-(2， 6- 二氧代哌啶-3-基)-4-甲基異二氫吲哚。可用於在本發明提供的方法的其它化合物具有下式 其中R1和R2中的第一個為滷素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧 基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲醯基，R1和R2中的第二個(獨立於第一個)是氫、滷素、1至4個碳原子的烷基、1至4個 碳原子的烷氧基、其中烷基具有1至4個碳原子的烷基氨基、其中各烷基具有1至4個碳原 子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲醯基，且R3為氫、1至4個碳原子的烷基、或苄基。可用於本發明提供的方法的其它具體免疫調節化合物包括但不限於在美國專利號6，380，239和美國申請公開號2006/0084815中描述的在二氫吲哚環的4-或5-位發生 取代的1-氧代和1，3-二氧代異二氫吲哚，所述專利和專利公開物通過參考納入本文。代 表性的化合物具有下式 其中，指明為Cf的碳原子構成手性中心(當η不為零且R1與R2不同時)；X1和X2 中的一個為氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個為氫；各R1和R2 彼此獨立地是羥基或NH-Z ；R3是氫、一至六個碳的烷基、滷素、或滷代烷基；Z為氫、芳基、一 至六個碳的烷基、甲醯基、或一至六個碳的醯基；且η具有為0、1或2的值；條件是如果X1 是氨基，且η是1或2，則R1和R2不同時是羥基；及其鹽。可用於本發明提供的方法的進一步的化合物具有下式 其中，當η不是零且R1與R2不同時，指明為C*的碳原子構成手性中心；X1和X2中 的一個是氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼 此獨立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳的烷基、商素、或氫；Z是氫、芳基、或一至六個碳 的烷基或醯基；且η具有0、1或2的值。可用於本發明提供的方法的化合物的具體實例包括但不限於分別具有如下結構 的2- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-4-氨基甲醯基丁酸和4- (4-氨基-1-氧 代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-4-氨基甲醯基-丁酸，及其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、 前藥和立體異構體 其它代表性的化合物具有下式 其中，當η不是零且R1與R2不同時，指明為C*的碳原子構成手性中心；X1和X2中 的一個是氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼 此獨立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳的烷基、商素、或氫；Z是氫、芳基、或一至六個碳 的烷基或醯基；且η具有0、1或2的值；及其鹽。具體實例包括但不限於分別具有如下結構的4-氨基甲醯基-4-{4_[(呋 喃-2-基-甲基)_氨基]-1，3- 二氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基} - 丁酸、4-氨基甲醯 基-2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丁酸、 2- {4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3- 二氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基} -4-苯肌氨 基甲醯基-丁酸、和2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3- 二氧代-1，3- 二氫-異吲 哚-2-基}_戊二酸，及其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、前藥和立體異構體 所述化合物的其它具體實例具有下式 其中X1和X2中的一個是硝基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼此獨立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳的烷基、滷素、或氫；Z是氫、苯基、一至六個碳的醯基、或一至六個碳的烷基；且
η具有0、1或2的值；條件是如果X1和X2中的一個是硝基，且η是1或2，則R1和R2不是羥基；和如果-COR2和-(CH2)n-COR1不同，指明為C*的碳原子構成手性中心。其它代表性
的化合物具有下式 其中X1和X2中的一個是一至六個碳的烷基；各R1和R2彼此獨立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳原子的烷基、滷素、或氫；Z是氫、苯基、一至六個碳的醯基、或一至六個碳的烷基；且η具有0、1或2的值；且如果-COR2和-(CH2)n-COR1不同，指明為C*的碳原子構成手性中心。其它具體免疫調節化合物包括但不限於在美國專利號6，458，810中描述的在 2-位用2，6- 二氧代-3-羥基哌啶-5-基取代的異二氫吲哚-1-酮和異二氫吲哚-1，3- 二 酮，該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中指明為*的碳原子構成手性中心；X 是-C(O) _、或-CH2-；R1是1至8個碳原子的烷基、或-NHR3;R2是氫、1至8個碳原子的烷基、或滷素；且R3 是氫，1至8個碳原子的烷基，未取代，或被1至8個碳原子的烷氧基、滷素、氨基、或1至 4個碳原子的烷基氨基取代，3至18個碳原子的環烷基，苯基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、滷素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基取代，苄基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、滷素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基、或-COR4取代，其中
R4 是氫，1至8個碳原子的烷基，未取代，或被1至8個碳原子的烷氧基、滷素、氨基、或1至 4個碳原子的烷基氨基取代，3至18個碳原子的環烷基，苯基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、滷素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基取代，或苄基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、滷素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基取代。本發明提供的化合物可以是商業購買的或根據在本文公開的專利或專利公開物 中描述的方法製備。進一步地，可以不對稱合成或者使用已知的拆分試劑或手形柱以及其 它標準合成有機化學技術拆分獲得光學純的化合物。各種免疫調節化合物包含一個或多個手性中心，且可以作為對映異構體的外消 旋混合物或非對映異構體的混合物存在。本發明涵蓋這些化合物的立體異構純形式的用 途，以及這些形式的混合物的用途。例如，在本發明提供的方法和組合物中可以使用包含 等量或不等量特定免疫調節化合物的對映異構體的混合物。這些異構體可以是不對稱 合成的或者使用標準技術例如手性柱或手性拆分劑拆分的。參見，例如Jacques，J.，等 人，Enantiomers, Racematesand Resolutions(ffiley-Interscience, New York,1981)； ffilen, S. H.等 人』 Tetrahedron 33 2725 (1977) ；Eliel, E. L. , Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；禾口Wilen,S. H. ,Tables of Resolving Agents andOptical Resolutions p. 268(E. L. Eliel,Ed. ,Univ. of Notre Dame Press,NotreDame, IN,1972)。應當注意，如果圖示的結構和給予該結構的名稱之間存在差異，以圖示的結構為 重。另外，如果結構或一部分結構的立體化學沒有用例如加粗線或虛線表示，則該結構或部 分結構應當解釋為包含其所有立體異構體。5. 9. PINK細朐,、人胎盤灌洗液或、混合的自然殺傷細朐,的施用可以通過本領域已知適於施用活細胞的任何醫學可接受的途徑，將PINK細胞、人 胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞、包含這些細胞的細胞群、或其組合施用至個體，例 如具有腫瘤細胞的個體，例如癌症患者。在各種實施方案中，本發明提供的細胞可以通過外 科手術植入、注射、輸注(例如經由導管或注射器)、或以其它方式，直接或間接施用至需要 修復或加強的部位。在一個實施方案中，將所述細胞靜脈內施用至個體。在另一實施方案 中，將所述細胞施用至個體的腫瘤(例如實體瘤)部位。在其中個體在超過一個部位具有 腫瘤的具體實施方案中，將所述細胞施用至至少兩個或所有的腫瘤部位。在某些其它實施 方案中，本發明提供的細胞或包含這些細胞的組合物被口服、鼻腔、動脈內、腸胃外、眼內、 肌內、皮下、腹膜內、腦內、心室內、腦室內、鞘內、腦池內、脊椎內和/或脊椎旁施用。在某些 具體實施方案中，所述細胞經由帶有或者沒有泵裝置的顱內或脊柱內針和/或導管遞送。所述PINK細胞、人胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞、或其組合，或包含這些 細胞的細胞群可以作為組合物(例如包含所述細胞的基質、水凝膠、支架等)施用至個體。在一個實施方案中，將本發明提供的細胞接種在天然基質(例如胎盤生物材料例如羊膜材料)上。這樣的羊膜材料可以是例如直接從哺乳動物胎盤解剖出的羊膜；經固 定或熱處理的羊膜、基本上乾燥(即< 20% H20)的羊膜、絨毛膜、基本上乾燥的絨毛膜、基 本上乾燥的羊膜和絨毛膜等。可以在其上接種胎盤幹細胞的優選的胎盤生物材料描述在 Hariri的美國申請公開號2004/0048796中，該專利申請的全部公開內容通過參考納入本 文。在另一實施方案中，將所述PINK細胞、人胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞、 或其組合，或包含這些細胞的細胞群懸浮在適於例如注射的水凝膠溶液中。用於這些組合 物的合適的水凝膠包含自組裝肽，例如RAD 16。在一個實施方案中，可允許包含所述細胞的 水凝膠溶液硬化，例如在模中硬化，以形成用於植入的、具有細胞分散在其中的基質。也可 以培養這些基質中的細胞，使得所述細胞在植入前有絲分裂擴增。所述水凝膠可以是例如 有機聚合物(天然的或合成的)，其通過共價鍵、離子鍵、或氫鍵交聯以形成三維開放-晶格 結構，其俘獲水分子形成凝膠。形成水凝膠的材料包含多糖，例如海藻酸及其鹽、肽、聚磷嗪 和聚丙烯酸酯，其通過離子交聯；或嵌段聚合物，例如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物， 其分別通過溫度或PH交聯。在某些實施方案中，本發明的水凝膠或基質是可生物降解的。在本發明的某些實施方案中，所述製劑包含原位可聚合的凝膠(參見，例如美國 專利申請公布 2002/0022676 ;Anseth 等人，J. Control Release, 78 (1-3) 199-209 (2002)； Wang 等人，Biomaterials, 24 (22) :3969_80 (2003))。在某些實施方案中，所述聚合物至少部分地可溶於水性溶液(例如水、緩衝鹽溶 液或水性醇溶液)中，所述聚合物具有帶電側基或其一價離子鹽。具有可以與陽離子反應 的酸性側基的聚合物的實例為聚(磷腈)(p0ly(ph0sphazenes))、聚(丙烯酸)、聚(甲基 丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、和磺化聚合物例如磺化聚苯乙 烯。也可以使用通過丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯醚單體或聚合物反應形成的具有酸性側基 的共聚物。酸性基團的實例是羧酸基、磺酸基、滷化(優選氟化)醇基、酚0H基和酸性0H 基。本發明的胎盤幹細胞或其共同培養物可以被接種在三維框架(framework)或支 架上，或植入體內。這樣的框架可以與刺激組織形成或以其它方式加強或改善本發明實施 的任何一種或多種生長因子、細胞、藥物或其它組分聯合植入。可用於本發明的支架的實例包括無紡墊、多孔泡沫、或自組裝肽。無紡墊可以使 用由合成的易吸收的乙醇酸和乳酸的共聚物(例如PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc.， Somerville, N.J.)製成的纖維形成。也可以使用通過例如冷凍乾燥或凍乾等方法形成的 由例如聚(￡ 「己內酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物組成的泡沫(參見，例如美國專利 號6，355，699)作為支架。本發明的胎盤幹細胞也可被接種在生理學可接受的陶瓷材料上或與其接觸，所 述生理學可接受的陶瓷材料包括但不限於磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、a -磷酸三鈣、
磷酸三鈣、和磷酸四鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、硫酸鈣、氟化鈣、氧化鈣、碳酸鈣、磷酸 鈣鎂、生物學活性玻璃例如BI0GLASS 及其混合物。目前市售的多孔生物相容性陶瓷材料 舌 SURG I BONE (CanMedica Corp. ， Canada)、END0B0N (Merck Biomaterial France, France)、CER0S (Mathys, AG, Bettlach, Switzerland)、和礦化的膠原骨移植產品例如 HEALOS(TM) (DePuy, Inc.，Raynham, MA)和 VIT0SS ，RHAK0SS R C0RT0SS (Orthovita,Malvern, Pa.)。所述框架可以是天然和/或合成材料的混合物、摻合物或複合物。在另一實施方案中，胎盤幹細胞可被接種在氈上或與其接觸，所述氈可以是例如由生物可吸收材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物，或透明質酸)製成的復絲組成。在另一實施方案中，本發明的胎盤幹細胞可被接種在泡沫支架上，所述泡沫支架 可以是複合結構。可以將這樣的泡沫支架模壓成有用的形狀，例如待修復、替代或增強的一 部分體內特定結構的形狀。在某些實施方案中，例如用0. IM乙酸處理所述框架，接著在聚 賴氨酸、PBS和/或膠原中培養，之後接種本發明的細胞以增強細胞粘附。可以通過如下方 法修飾基質的外表面以改善細胞粘附或生長和組織分化，例如血漿_包塗基質，或加入一 種或多種蛋白(例如膠原、彈性纖維、網狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如硫酸肝素、軟骨 素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白等)、細胞基質和/或其它材料 (例如但不限於明膠、海藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物膠等)。在某些實施方案中，所述支架包含使其不形成血栓的材料，或經所述材料處理。這 些處理和材料也可以促進和維持內皮生長、遷移和細胞外基質沉積。這些材料和處理的 實例包括但不限於天然材料，例如基底膜蛋白(例如層粘連蛋白和IV型膠原)、合成材料 (例如 EPTFE)、和分段的聚氨酯脲矽酮(例如 PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc.，Berkeley, Calif.))。所述支架也可以包含抗血栓形成劑，例如肝素；也可以在用胎 盤幹細胞接種前，處理所述支架以改變表面電荷(例如用血漿包塗)。
6.實施例6. 1.實施例1 來自胎盤灌洗液禾Π臍帶血的胎盤Φ丨旬體自然殺傷細朐,的表徵本實施例說明了來自人胎盤灌洗液的自然殺傷細胞的分離和培養。胎盤自然殺傷細胞的分離。使用CD56-偶聯的微珠，從8個單元的人胎盤灌洗液 (HPP)和4個單元的臍帶血(UCB)中分離自然殺傷細胞。通過磁珠選擇(Miltenyi Biotec) 進行PINK細胞的分離。將分娩後的胎盤排血，並用約200至約750mL的灌洗溶液(0. 9% NaCl注射溶液，USP級(目錄號68200-804，VWR))灌洗。收集未處理的灌洗液，並處理以除 去紅細胞。用螢光激活細胞分類(FACS)緩衝液(RPMI 1640，不含酚紅，加入5% FBS)洗滌 來自HPP或UCB的單核細胞一次，然後以1500rpm離心6分鐘。計數細胞數量，將細胞沉澱 以107個總細胞/8(^1^緩衝液重懸，並加入2(^1^的0)31^(^(^63(18(目錄號130-050-101， Miltenyi)。均勻混合所述系統，並在4_8°C下培養15分鐘。向每IO7個總細胞加入l_2mL緩 衝液，然後以300g離心該混合物10分鐘。完全吸除上清液。將細胞沉澱重懸為IO8個細胞 /500 μ L緩衝液，並準備進行磁分離。將LS柱(Miltenyi Biotec)置於MIDIMACS 細胞分 離器(Miltenyi Biotec)的磁場中，用3mL的緩衝液洗滌所述柱，並將細胞/微珠懸浮液加 樣至所述柱。使用2X3mL的洗滌緩衝液，收集流過所述柱且包含自然殺傷細胞的未標記的 CD3—細胞。計數CD3—細胞，洗滌一次，然後用CD56微珠(目錄號130-050-401，Miltenyi) 染色，並使用與上述CD3微珠分離相同的方案分離所述細胞。由此收集了 CD56+CD3—群並 用於進一步分析。HPP中的自然殺傷細胞的百分比範圍為3. 52至11. 6 (中值6. 04，平均 5.22)，UCB中的自然殺傷細胞的百分比範圍為1.06至8.44(中值3.42，平均4. 2)。對 來自HPP的自然殺傷細胞的⑶56微珠選擇產生約80%純的群。參見圖1。在整個⑶56+、 ⑶3_自然殺傷細胞群中，來自HPP的⑶56+、⑶16—自然殺傷細胞(即PINK細胞)的百分比範圍為56. 6至87.2 (中值74. 2，平均65. 5)，來自UCB的CD56+、CD16"自然殺傷細胞(即PINK細胞)的百分比範圍為53. 7至96. 6 (中值72. 8)。來自HPP的CD56+，CD16+自然殺傷 細胞的百分比範圍為12. 8至43. 3 (中值25. 8，平均34. 5)，來自UCB的CD56+，CD16+自然殺 傷細胞的百分比範圍為3. 4至46. 3 (中值27. 3，平均33. 4)。在其它試驗中，使用靶向人血細胞的細胞表面抗原(⑶3、⑶4、⑶14、⑶19、⑶20、 ⑶36、⑶66b、⑶123、HLA-DR、血型糖蛋白A)的磁性陰性選擇試劑盒分離自然殺傷細胞。 將HPP和UCB低溫保存單元解凍，並按與解凍培養基(RPMI Media 1640 (目錄號22400， Gibco)和20%的熱滅活的胎牛血清(目錄號SH30070.03，Hyclone)) 1 1的比例稀釋，並 以1500rpm離心8分鐘。去除上清液，並用氯化銨處理以進一步去除紅細胞；將各單元重 懸在約30mL冰冷的FACS緩衝液(RPMI 1640，不含酚紅，加入5 % FBS)中，接著加入60mL 冰冷的氯化銨(目錄號07850，Stem Cell)，渦旋所述溶液，然後在冰上培育5分鐘。然後， 用FACS緩衝液洗滌單核細胞3次，接著以1500rpm離心8分鐘。計數細胞數，將細胞沉澱 以5X IO7個活細胞/ml重懸在RoboS印緩衝液中(目錄號20104，Stem Cell)中，並向細 胞懸浮液中加入0. lmg/mL的DNA酶I溶液(目錄號07900，Stem Cell)，用移液器輕輕地 混合，並在室溫下培育15分鐘，之後分離。通過用40μπι目尼龍濾網(目錄號352340，BD Falcon)過濾，從所述細胞懸浮液中除去細胞團，之後進行分離。使用包括EasySep陰性選 擇人NK細胞富集雞尾酒和EasyS印磁微粒子的人NK細胞富集試劑盒(目錄號19055，Stem Cell)，用裝置 Robos印(目錄號 20000，Stem Cell)和程序「Human NK Negative Selection 19055and high recovert」 (加入50 μ L/mL混合物，加入100 μ L/mL微粒子，培育10分鐘 和5分鐘，進行1X2. 5分鐘的分離)進行自動分離。由此收集⑶56+⑶3_群並用於進一步 分析。自然殺傷細胞的擴增。通常，如下擴增自然殺傷細胞。基於Yssel等人， J. Immunol. Methods 72(1) 219-227 (1984)禾口 Litwin 等人，J. Exp. Med. 178(4) 1321-1326 (1993)中描述的方案的改進，製備用於自然殺傷細胞培養的初始培養基。簡而言 之，初始培養基包含具有10% FCS(Hyclone)的IMDM(Invitrogen)，其包含以下終濃度的試 劑35 μ g/ml 轉鐵蛋白(Sigma-Aldrich)、5 μ g/ml 胰島素(Sigma-Aldrich)、2X ICT5M 乙醇 胺(Sigma-Aldrich)、1 μ g/ml 油酸(Sigma-Aldrich)、1 μ g/ml 亞油酸(Sigma-Aldrich)、 0. 2 μ g/ml 棕櫚酸(Sigma-Aldrich)、2· 5 μ g/ml BSA(Sigma-Aldrich)和 0. 1 μ g/ml 植物凝 集素(PHA-P，Sigma-Aldrich)。將CD56+CD;TNK細胞以2. 5 X IO5個活細胞/mL初始培養基 (加入200iu/mL的IL-2 (R&D Systems))重懸在細胞培養物處理的24孔板或T燒瓶中。將 絲裂黴素C-處理的異體PBMC和K562細胞(慢性粒性白血病細胞系)作為滋養細胞加入 到初始培養基中，最終濃度為lX106/mL。在5% CO2中，於37°C下，培養NK細胞5-6天。在 5-6天後，每3-4天向所述培養物中加入等體積的維持培養基(含有10% FCS,2% HumanAB 血清、抗生素、L-穀氨醯胺和400單位IL-2/mL的IMDM)。在第21天，收集NK細胞。來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的表徵。將供體匹配的HPP和CB解凍，用FACS緩 衝液(含有5%FBS&RPMI-1640)洗滌所述細胞。然後，按照製造商的說明，使用R0B0SEP 磁分離系統(StemCell Technologies)用CD56微珠富集自然殺傷細胞。用下述抗體(BD Bioscience，如果沒有另外說明的話)對CD56富集的自然殺傷細胞群進行染色以進行免 疫表型的表徵偶聯 PE-Cy-7 的抗-CD56、抗-CD3APC Cy7、抗-CD 16FITC、抗-NKG2D APC、抗-NKp46APC、抗-CD94PE (R&D)、抗-NKB1PE、和抗-KIR-NKAT2PE。在 NK 祖細胞中，NKG2D 和NKp46為不存在的標記物，或顯示出表達減少，但在完全分化的NK細胞中存在NKG2D和 NKp46。參見Freud等人,「Evidence forDiscrete States of Human Natural Killer Cell Differentiation In Vivo", J. Exp. Med. 203(4) :1033_1043(2006) ；Eagle & Trowsdale， "Promiscuity and the SingleReceptor :NKG2D，，,Nature Reviews Immunology Published online, 2007 年 8 月 3 日；Walzer 等人，「Natural Killer Cells =From CD3"NKp46+to Post-GenomicsMeta-Analyses，，, Curr. Opinion Immunol. 19 :365_372 (2007)。如表 1 所不， 在來自HPP的富集的⑶56+細胞群和來自臍帶血(CB)的HLA-匹配的⑶56+細胞群之間， KIR3DL1、KIR2DL2/L3、NKG2D、NKp46 和 CD94 的表達沒有顯著地不同。表1.具有某些標記物組合的NK細胞的百分數。3個樣品的平均值。

6. 2.實施例2 來自混合的胎盤灌洗液和臍帶血的胎盤中間體自然殺傷細胞的表 證混合臍帶血和胎盤灌洗液的供體匹配的單核細胞(混合體)，並用FACS緩衝液 (含有5 % FBS的RPMI-1640)洗滌一次，並使用表2中列出的抗體，在BDFACSCanto (BD Biosciences)上進行免疫表型表徵。用Flowjo軟體(Tree Star)分析數據。表2 在免疫表型表徵中使用的抗體列表 胎盤NK細胞和外周血液(PB)NK細胞的免疫表型的表徵。將NK細胞分成兩個主 要的組⑶56+⑶16+NK細胞和⑶56+⑶16-細胞。⑶56+⑶16+NK細胞具有大量溶細胞顆粒且高 度表達⑶16，因此，能夠激發抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。相反，⑶56+⑶16_NK 細胞具有非常少的溶細胞顆粒，低水平表達或不表達CD16，但在活化時能夠生成細胞因子 和趨化因子。每種NK細胞顯示出活化和抑制受體的不同組合，所述受體包括殺傷免疫球蛋 白樣受體(KIR，例如KIR3DL1和KIR2DL2/3)、自然細胞毒性受體NCR (例如NKp30、NKp44和 NKp46)、殺傷細胞凝集素樣受體(KLR ；例如⑶94、NKG2D)、2B4和⑶226。使用針對特定NK受體的螢光偶聯的單克隆抗體對胎盤NK和外周血液NK細胞進 行FACS分析。在表徵的11個NK亞組中，在胎盤NK和外周血液NK細胞之間，11個NK亞 組的七個亞組(CD3TD56+CD16\ CD3XD56+CD16+、CD3TD56+KIR2DL2/3+、CD3TD56+NKp46+、 CD3_CD56+NKp30+、CD3_CD56+2B4+、和 CD3_CD56+CD94+)中的細胞數顯示出顯著性差異(ρ < 0. 05)(相當於64%的差異)(表3Α;也可參見表3Β和3C)。表3Α.在16個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)和 13個單元的外周血液(PB)中CD3—CD56+NK細胞的表型表徵。使用雙樣本t_檢驗來確定胎 盤和外周血液單位中的群均值是否相等。
表3B和3C顯示了獨立的試驗中，在16個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人 胎盤灌洗液(混合體)和13個單位的外周血液(PB)中的⑶3_CD56+D16_和⑶3TD56+D16+NK 細胞的表型表徵。表 3B 表 3C 60. 9 %的胎盤NK細胞是⑶56+CD16—(來自胎盤的中間體自然殺傷(PINK)細
胞)，而僅僅21.4%的外周血液NK細胞是⑶56+⑶16_的。在培養21天後，在胎盤和外周
血液NK細胞之間，11個NK亞組中的四個亞組(⑶3TD56+KIR2DL2/3+、⑶3TD56+NKp46+、
CD3XD56+NKp44+和CD3XD56+NKp30+)的百分比顯示出顯著性差異(ρ < 0. 05)(表4)。表4來源於12個單元的混合的供體_匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)
和9個單元的外周血液(PB)的21天培養的NK細胞的表型表徵。使用雙樣本t-檢驗來確
定組合和外周血液單位中的群均值是否相等。 另外，在獨立試驗中確定，在培養21天後，胎盤和外周血液NK細胞表現出獨特的 細胞因子特徵，特別是對於IL-8，如通過Luminex所測定(表5)。表 5 胎盤NK細胞和外周血液NK細胞的微小RNA表徵。使用MIRVANA miRNA分離試劑 盒(Ambion,目錄號1560)從分離的或擴增的NK細胞製備微小RNA(miRNA)。NK細胞(0. 5至1.5 X IO6個細胞)在變性的裂解緩衝液中裂解。接著，對樣品進行酸-苯酚+氯仿抽提 以分離高度富集小RNA的RNA。加入100%的乙醇以使樣品含有25%的乙醇。當該裂解產 物/乙醇混合物穿過玻璃纖維濾器時，大的RNA無法移動，而小RNA被收集在濾液中。然 後，將濾液的乙醇濃度增加至55%。使該混合物穿過第二個玻璃纖維濾器，在此，小RNA變 得無法移動。洗滌該RNA若干次，用低離子強度溶液洗脫。通過測量其在260和280nm的 吸光度來測定回收的小RNA的濃度和純度。表6中顯示了被發現是PINK細胞所特有的miRNA。發現一種miRNA(命名為 hsa-miR-199b)是外周血液NK細胞所特有的。表6.經由qRT-PCR對piNK細胞和PB NK細胞的miRNA表徵 經培養的胎盤NK細胞和未培養的NK細胞的免疫表型的表徵。通過大量免疫表型 研究和細胞毒性試驗來評價經培養的PINK細胞的整體性質。為了測定擴增的NK細胞的表 型，分析了 NK受體(NKR)例如KIR、NKG2D、NKp46、NKp44、和2B4的表達。通過用PKH26標 記腫瘤細胞(K562細胞)，然後將其與PINK細胞共同培養4小時來進行細胞毒性試驗。從 第0天至第21天，離620的表達從60.9% 士4. 8%增加至86% 士 17. 4% (p值為0. 024)； NKp46 的表達從 10. 5% 士5. 4%增加至 82. 8% ±9. 0% (p 值為 0. 00002) ；NKp44 的表達從 9. 6% 士6. 5%增加至 51. 6% ±27. 5% (p 值為 0. 022)；且 2B4 的表達從 13. 0% 士7. 減 少至0.65% 士 0.5% (p值為0.009% )(表7)。在這些培養條件下，在21天的擴增期間， 抑制性KIR，包括KIR3DL1 (殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，三個結構域，長胞質尾1，抑制性受 體)和KIR2DL2/L3(殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，兩個結構域，長胞質尾2和長胞質尾3 ；抑 制性受體)保持不受影響。NKR表達的變化進一步與針對K562細胞的溶細胞活性在第21 天相比於第14天的顯著增加相關(63% 士 15%對45% 士4%，p值為0.0004)。這些發現 帶來了對NK細胞中與NK細胞的細胞毒活性密切相關的推定標記物的鑑別。表7.在21天培養前後piNK細胞的表型表徵。計算了 5個供體的群均值的標準 偏差(Stdev)。
用基於脂質的蛋白固定技術和線性離子俘獲LC/MS對經培養的胎盤NK細胞和經 培養的外周血液NK細胞的膜蛋白組學進行表徵。膜蛋白純僕,在細胞裂解之前，將培養21 天的來自混合的胎盤灌洗液和臍帶血細胞的胎盤自然殺傷細胞及PB的NK細胞與蛋白酶 抑制劑混合物溶液(P8340，SigmaAldrich, St. Louis, M0 ；包含4-(2-氨基乙基)苯磺醯氟 (AEBSF)、胃酶抑素A、E-64、抑氨肽酶素b、亮肽素和抑酶肽，不含金屬螯合劑)培育15分 鍾。然後，通過加入10mM HC1溶液而不加入去汙劑，裂解所述細胞，並且以400g離心10分 鍾至沉澱，並除去細胞核。將去核後的上清液轉移到超離心管中，並且以100，000g在具有 T-1270 轉子的 WX80 超離心機(Thermo Fisher Scientific,Asheville,NC)上離心 150 分 鍾，產生膜蛋白沉澱。蛋白脂質體的生成、固定和消化使用NAN0XIS 緩衝液(10mM Tris,300mM NaCl， pH 8)洗滌所述膜蛋白沉澱若干次。將膜蛋白沉澱懸浮在1.5mLNAN0XIS 緩衝液中，並在 冰上使用 VIBRA-CELL (TM) VC505 超聲處理器(Sonics & Materials，Inc.，Newtown, CT)尖 端超聲20分鐘。通過用FM1-43染料染色(Invitrogen, Carlsbad, CA)和用螢光顯微鏡 觀察來測定所述蛋白脂防體的大小。通過BCA試驗(Thermo Scientific)來確定所述蛋 白脂質體懸浮液的蛋白濃度。然後，使用標準移液器吸頭將該蛋白脂質體注射至LPI(TM) FlowCell(Nanoxis AB, Gothenburg, Sweden)上，使其無法移動1小時。在無法移動後，進 行一系列洗滌步驟，將胰蛋白酶(Princeton Separations,Adelphi,NJ)以5 y g/ml直接注 射至LPI(TM)Flow Cell上。在37°C下，培養小片過夜。之後，從該小片洗脫胰蛋白酶消化 後的肽，然後使用 S印-Pak 柱(WatersCorporation，Milford，MA)脫鹽。強陽離子交換(SCX)分餾將胰蛋白酶消化後的肽重新配製在0. 的甲酸/水 溶液中，並加樣至強陽離子交換(SCX)TOP-TIP 柱(PolyLC, Columbia, MD)上，用30iim的polysufoETHYL aspartamide SCX填充材料裝填移液器吸頭。使用甲酸銨緩衝液，pH 2.8(10mM-500mM)的階躍梯度從SCX TOP TIP 洗脫肽。使用speed-vac系統乾燥各SCX餾 分，並用5%的乙腈、0. 的甲酸重配以準備用於下遊LC/MS分析。LTQ線件離子俘獲LC/MS/MS分析使用180分鐘的梯度(緩衝液A 水，0. 1 %甲 酸；緩衝液 B 乙腈，0. 甲酸)，在 0. 2讓X15(kim 3 y m 的200A MAGIC C18 柱(Michrom Bioresources,Inc. , Auburn, CA)上分離各SCX餾分，所述柱直接連接到軸向去溶劑化真空 輔助納米毛細電噴霧電離(ADVANCE)源(Michrom Bioresources，Inc.)。所述ADVANCE源 達到了與常規納米ESI相當的靈敏度，但其以相對較高的流速3 u L/分鐘運行。在LTQ線 性離子阱質譜儀(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)上分析洗脫的肽，所述質譜儀 在每次全掃描質譜後進行十次數據依賴性的MS/MS掃瞄。牛物信息學在SORCERER S0L0 工作站(Sage-N Research, San Jose,CA)上使 用SEQUEST算法工具，在IPI人類資料庫中對六個原始文件(對應於從各腫瘤細胞系(AML， CML)收集的6種鹽餾分)進行單次檢索。規定肽質量允差為1.2amu，規定甲硫氨酸的氧化 為差異修飾(differential modification)，且規定氨基甲醯基甲基化為靜態修飾(static modification)。使用 Trans-Proteomic Pipeline (TPP)的 Scaffold 軟體工具來整理和解 析膜蛋白質組學數據。如果蛋白被確定為95%肽概率、95%蛋白概率和1個特有的肽，則進 行蛋白分析。使用公司內部研發的常規Perl程序進行膜蛋白質組學數據集之間的比較。分析顯示，相對於從外周血液NK細胞鑑定出的膜蛋白，從經培養的胎盤NK細胞鑑 定出的8個膜蛋白是特有的。參見表8。進一步，相對於經培養的胎盤NK細胞，從外周血液 NK細胞鑑定出特有的8個膜蛋白。參見表8。發現僅有10個鑑定出的膜蛋白是經培養的 胎盤NK細胞和外周血液NK細胞共有的。表8 6. 3.實施例3 自然殺傷細胞對腫瘤細胞的細胞毒件 該實施例證實了胎盤中間體自然殺傷細胞對腫瘤細胞有細胞毒性。如在細胞毒性 試驗和NK細胞的細胞因子分泌Luminex分析中所證實的，來自HPP的PINK細胞對急性髓 性白血病細胞有細胞毒性。在細胞因子分泌試驗中，將來自HPP的⑶56微珠富集的NK細胞與KG-Ia急性髓 性白血病細胞按照1 1的比例混合。在培養24小時後，收集上清液，並對其進行IFN-γ 和GM-CSF分泌的Luminex分析。如圖2所示，在將CD56-富集的HPP細胞與KG-Ia細胞共 同培養24小時後，觀察到IFN- γ和GM-CSF的水平增加。PINK細胞的細胞毒性在使用PINK細胞的細胞毒性試驗中，用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記靶 腫瘤細胞。CFSE是一種對細胞無毒的活體染料，且其在細胞分裂期間可分配至子細胞中。 隨後將所述細胞置於96-孔U型底組織培養板中，並在補充了 10% FBS的RPMI 1640中， 按照20 UlO 1、5 1和1 1的效應細胞-靶細胞(E T)比例，將所述細胞與新 鮮分離的CD56+CD16—PINK細胞共同培養。在4小時的培養時間之後，收集細胞，並通過流式 細胞術檢測CFSE的存在。使用從不含NK細胞的培養物中回收的靶細胞數作為參考。細胞 毒性定義為(I-CFSEtis/CFSEwm) X 100%。在20 1比例觀察到顯著的腫瘤細胞細胞毒 性。參見圖3。腫瘤細胞對經培養的PINK細胞的易感性乳酸脫氫酶(LDH)-釋放試驗。使用CYT0T0X 96 細胞毒性比色試驗試劑盒 (Promega,目錄號G1780)進行該LDH-釋放試驗。在該試驗中，經培養的NK細胞(包含 源自匹配的HPP/UCB的⑶56+CD16—細胞和⑶56+⑶16+細胞的組合)為效應細胞，腫瘤細 胞為靶細胞。將效應細胞和靶細胞置於96-孔U型底組織培養板中，並在補充了 2 %人 AB 血清(Gemini，目錄號 100-512)的不含酚紅的 100 μ 1 RPMI 1640 (Invitrogen,目錄號 11835-030)中，按照各種效應細胞-靶細胞(E T)比例進行培養。在5% CO2中，於37°C 培育培養物4小時。在培育後，將50 μ 1上清液轉移到酶標板中，按照製造商的要求檢測 LDH活性，並在ELISA讀板儀(Synergy HT, Biotek)中測量在490nm的吸收。根據下述等 式計算細胞毒性程度％細胞毒性=(樣品-效應細胞自發的-靶細胞自發的)/(靶細胞 的最大值-靶細胞自發的)X100。某些腫瘤類型可較其它腫瘤類型對NK細胞更具響應性。為了分析腫瘤細胞對培 養的PINK細胞的易感性，在LDH釋放試驗中，分析與PINK細胞共同培養的十二種不同腫 瘤細胞系。所述12種腫瘤細胞系包括人慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤、成視網膜細胞瘤 (RB)、和多發性骨髓瘤(MM)(表9)。在共同培養4小時後，通過LDH釋放試驗來測量NK細 胞的細胞毒性。表9. ATCC腫瘤細胞系
0422] 按照10 1的效應細胞對靶細胞(E T)比例，觀察到經培養的PINK細胞對以 下細胞具有顯著細胞毒性對K562細胞(CML)為88. 6% 士5. 6% ；對U937細胞(淋巴瘤) 為 89. 2% 士 9. 8%;對 TORI-RB-1 細胞(RB)為 73. 3% 士 11. 8%;對 RPMI8226 細胞(MM)為 61. 3% 士 1.3% ；和對 U266 細胞(MM)為 57. 4% 士4. 7% (表 10)。表10.腫瘤細胞對經培養的PINK細胞的差異易感性。計算3個供體的平均細胞 毒性的平均數標準誤差(S. E. M.)。
用來那度胺和Pomalidomide處理增強了 PINK細胞的細胞毒性RNA的分離和純化。使用RNAQUEOUS -4PCR試劑盒(Ambion，目錄號AM1914)從 分離的或擴增的NK細胞製備RNA。簡言之，在胍鹽裂解溶液中裂解NK細胞(0. 5至1. 5X106 個細胞)。隨後將樣品裂解物與乙醇溶液混合，並使其通過基於二氧化矽的濾器，該濾器選 擇性地和定量地結合mRNA和更大的核醣體RNA ；而不定量結合非常小的RNA，例如tRNA和 5S核糖體RNA。隨後洗滌濾器以除去殘留的DNA、蛋白及其它汙染物，用包含痕量EDTA(用 於螯合重金屬)而不含核酸酶的水洗脫RNA。將二氧化矽濾器放在小柱中，將該小柱安裝到 由試劑盒提供的不含RNase的微離心管中。通過離心或真空壓力使樣品裂解物、洗滌溶液 和洗脫溶液通過所述濾器。在從濾器洗脫後，用所述試劑盒提供的超高純的DNase 1處理 RNA，以除去痕量的DNA。最後，通過也由所述試劑盒提供的試劑除去DNase和二價陽離子。 通過測定其在260nm和280nm的吸光度來確定回收的RNA的濃度和純度。定量實時(q RT-PCR)分析。可將分離的RNA用於使用TAQMAN 反轉錄試劑 (Applied Biosystems,目錄號N8080234)的cDNA合成，隨後使用人免疫陣列(Applied Biosystems,目錄號 4370573)和人微小 RNA 陣列(AppliedBiosystems,目錄號 4384792)通 過7900HT快速實時PCR系統進行實時PCR分析。來那度胺和pomalidomide是沙立度胺的化學類似物，其具有增強的抗癌和抗炎 活性。為了研究來那度胺和pomalidomide是否可以增強PINK細胞的細胞毒性，用來那度 胺或pomalidomide預處理離體培養的(第19天)PINK細胞，接著將所述細胞與靶標結腸 直腸癌細胞系HCT-116共同培養。經來那度胺處理的NK細胞表現出42. 的細胞毒性，經 pomalidomide處理的NK細胞顯示出47. 4%的細胞毒性，而作為對照的未經處理的PINK細
65胞僅僅顯示出24. 3%的細胞毒性。定量實時PCR(qRT-PCR)和流式細胞術分析顯示，pomalidomide激發的NK細胞細 胞毒性的增強與粒酶B (GZMB)的基因表達增加(增加60% 士 1. 7% )(表11)和GZMB-陽性 NK細胞的百分數增加(增加25%)有關。另外，在經來那度胺(增加232% 士 1.6%)和 pomalidomide (增加396% 士0. 3 處理的PINK細胞中，GM-CSF的表達增加(表11A、 11B)。表11A，11B.與未經處理的細胞相比，經來那度胺和pomalidomide處理的培養的 PINK細胞的qRT-PCT分析。IlA 對於所列基因，經來那度胺處理的和未經來那度胺處理的 樣品之間基因表達的倍數變化。使用配對t-檢驗來確定在經來那度胺處理的和未經來那 度胺處理的樣品中的倍數變化是否相等。IlB 對於所列25個基因，經pomalidomide處理 的和未經pomalidomide處理的樣品之間基因表達的倍數變化。使用配對t_檢驗來確定在 經處理的和未經處理的樣品中的變化倍數是否相等。表 IlA BAX-BCL2-相關 X 蛋白CCL5-趨化因子(C-C基序)配體5
CCR5-趨化因子(C-C基序)受體5CSF2-集落刺激因子2 (粒細胞-巨噬細胞)
FAS-TNF受體超家族，成員6⑶SB-葡糖醛酸糖苷酶3IL2RA-Q白細胞介素2受體TNFRSF18-腫瘤壞死因子受體超家族，成員18表 11B ACTB-3-肌動蛋白BAX-BCL2-相關 X 蛋白CCL2-趨化因子(C-C基序)配體2CCL3-趨化因子(C-C基序)配體3CCL5-趨化因子(C-C基序)配體5CCR5-趨化因子(C-C基序)受體5CSF1-集落刺激因子1 (巨噬細胞)CSF2-集落刺激因子2 (粒細胞-巨噬細胞)ECE11-內皮素轉化酶1FAS-TNF受體超家族，成員6GNLY-粒溶素⑶SB-葡糖醛酸糖苷酶_ 3GZMB-粒酶B (粒酶2，細胞毒性T-淋巴細胞-相關絲氨酸酯酶1)ILIA-a白細胞介素1IL2RA-白細胞介素2受體-aIL8-白細胞介素8IL10-白細胞介素10LTA-淋巴細胞毒性a (TNF超家族，成員1)PRF1-穿孔素1(成孔蛋白)
PTGS2-前列腺素-內過氧化物合酶2 (前列腺素G/H合成酶和環氧合酶)SKI-v-ski肉瘤病毒癌基因同系物(鳥類的)TBX21-T-box 21混合的自然殺傷細胞的細胞毒性在獨立的細胞毒性試驗中，經培養的來源於供體匹配的臍帶血和胎盤灌洗液的NK細胞為效應細胞，而腫瘤細胞為靶細胞。用PKH26 (Sigma-Aldrich目錄號PKH26-GL)標記腫 瘤細胞(參見，例如 Lee-MacAry 等人，J. Immunol. Meth. 252(1-2) :83_92 (2001))，PKH26 由 於其親脂性脂肪族殘基而插入到細胞質膜中，隨後將所述腫瘤細胞置於96-孔U型底組織 培養板中，在200 μ 1補充了 10% FBS的RPMI 1640中，按照各種效應細胞-靶細胞(Ε Τ) 比例，與經培養的NK細胞共同培養。在5% CO2中，於37°C培育該培養物4小時。在培育 後，收集細胞，並將T0-PR0-3 (Invitrogen目錄號T3605)，一種膜不可滲透的DNA染色劑，力口 入到培養物中至最終濃度為1 μ Μ,隨後使用BD FACSCanto進行FACS分析。細胞毒性可以 表示為死細胞(PKH26+T0-PR0-3+)在全部ΡΚΗ26+靶腫瘤細胞內的百分數。在該細胞毒性試驗中，用ΡΚΗ26標記人慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)Κ562細胞， ΡΚΗ26插入到細胞質膜中，並將所述Κ562細胞置於96-孔U型底組織培養板中。在補充了 10% v/v FBS的RPMI 1640中，按照10 1、5 1,2. 5 1和1. 25 1的效應細胞與靶細 胞(Ε Τ)比例，將培養了 21天的胎盤(混合體)或外周血液NK細胞與Κ562細胞混合。 在4小時的培育時間後，收集細胞，將T0-PR0-3加入到細胞培養物中，接著用流式細胞術測 定ΡΚΗ26和T0-PR0-3的存在。細胞毒性表示為PKH26+T0-PR0-3+死細胞在全部ΡΚΗ26+靶 腫瘤細胞內的百分數。在測試的所有E T比例下，胎盤NK細胞和外周血液NK細胞都顯 示出對Κ562細胞的明顯毒性(圖4)。在兩個E T比例(10 1和5 1)下，觀察到胎 盤NK細胞對Κ562細胞的毒性顯著高於外周血液NK細胞對Κ562細胞的毒性(圖4)。6. 4.實施例4 人胎盤灌洗液對腫瘤細胞的細胞毒性本實施例證實了人胎盤灌洗液細胞對腫瘤細胞具有細胞毒性，且來自HPP的所有 有核細胞(TNC-HPP)對KG-Ia的細胞毒性高於來自匹配的UCB的TNC的細胞毒性。將來 自HPP或臍帶血(UCB)的所有有核細胞與KG-Ia細胞按照1 1、5 UlO 1,20 1 或100 1的比例混合。在培育24小時或48小時後，收集細胞，並通過FACS分析(BD FACSCanto,BD Bioscience)檢測CFSE的存在。使用單獨培養的腫瘤細胞作為對照。細胞 毒性定義為(l-CFSE樣s/CFSE對照)X100%。在100 1的比例下，顯示出顯著的細胞毒性。 參見圖5。在獨立的實驗中，比較來自HPP的所有有核細胞的細胞毒性與來自臍帶血的所有 有核細胞的細胞毒性。按照 0.78 1,1. 56 1,3. 12 1,6. 25 1,12. 5 1、25 1、 50 1或100 1的比例，將匹配的TNC-HPP或UCB與KG-Ia細胞混合。在所有比例下， TNC-HPP始終顯示出較UCB更高的細胞毒性。參見圖6。在另一實驗中，在與KG-Ia細胞培育24小時之前，用100U/mL或1000U/mL的IL-2 刺激TNC-HPP，同時使用RPMI培養基培養的HPP作為對照。在6. 25NK細胞/KG-Ia細胞及 以上的比例下，IL-2似乎增強了 TNC-HPP的細胞毒性。參見圖7。如表12所示，使用更廣泛的腫瘤細胞類型，使用5 X IO5個HPP細胞和1 X IO4個腫
瘤細胞重複該實驗。
表12 用來測量胎盤灌洗液細胞毒性作用的腫瘤細胞 當按照50 1的比例共同培養HPP細胞和腫瘤細胞24小時或48小時後，HPP細 胞顯示出對腫瘤細胞的明顯毒性。對於這兩個時間段，共同培養都引起超過50%的腫瘤細 胞死亡。參見圖8A和8B。6. 5.實施例5 人胎盤灌洗液細胞在暴露於腫瘤細胞期間細胞因子的牛成為了確定負責介導HPP細胞的抗白血病作用的主要作用機制，使用多重Luminex 試驗，在不同時間點對與腫瘤細胞系共同培養的HPP細胞的細胞因子釋放特徵進行了分 析，並將其與UCB細胞的細胞因子釋放特徵進行了比較。對培養後收集的上清液進行Luminex試驗，以確定IFN- y、TNF- a和GM-CSF (目 錄號HCYT0-60K-03，MillipOre)的濃度。這三種細胞因子與NK細胞毒性有關(參見，例如 Imai 等人，Blood 2005. 106(1) :376_83)。使用 AppliedBiosystems FAST 7900HT 儀器和引物，進行定量RT-PCR，以檢測IFN- y ,TNF- α和GM-CSF的表達。培養條件與上述的共同 培養細胞毒性試驗的條件相同。使用Luminex試驗來確定細胞因子的濃度。確定與腫瘤細胞共同培養的HPP細胞對IFN-γ、TNF- α和GM-CSF的分泌顯著 地高於UCB細胞的分泌。在一個實驗中，在存在或不存在100U的IL-2的情況下，按照 0. 78 1,1. 56 1,3. 12 1,6. 25 1,12. 5 1、25 1、50 1 或 100 1 的比例，將 HPP細胞與KG-Ia細胞混合。與不存在IL-2相比，在IL-2的存在下，TNC-HPP顯示出IFN-γ 生成的持續增加。確定在24小時，IFN- γ的水平增加了約5-26倍(中值16倍)；在48 小時，增加了約3-65倍(中值27倍)，其與細胞毒性研究得到的結果一致。參見圖9。在另一個實驗中，在與KG-Ia細胞培育24小時之前，用100U/mL或1000U/mL IL-2 刺激TNC-HPP，同時使用RPMI培養基培養的HPP作為對照。在與KG-Ia細胞共同培育之前， 在存在或不存在IL-2的情況下，培養HPP或匹配的UCB細胞24小時。在與K562和KG-Ia 共同培養48小時的HPP細胞中，IFN- γ的分泌增加最多。當用100U/ml IL-2處理HPP細 胞時，在第24小時和48小時，HPP細胞對KG-Ia的細胞毒性增加。當用IL-2處理時，HPP 細胞中IFN- γ的分泌水平高於匹配的UCB細胞。通過對來自匹配的HPP和UCB的細胞的 RT-PCR分析確認了更高的IFN-Y表達。這些結果表明與UCB細胞相比，HPP細胞顯示出更 高的抗白血病活性，並且該更高的活性與IFN-Y生成的顯著增加有關。使用表1中列出的腫瘤細胞系對與一組腫瘤細胞系共同培養期間HPP細胞和臍帶 血細胞中的IFN-Y生成進行分析。按照50 1的比例，使用IO4個腫瘤細胞和5 X IO5個 HPP細胞共同培養HPP細胞和腫瘤細胞24小時或48小時。對於CCRF-CEM、J. RT3-T3. 5、 K562、KGU KG-la, KU812、NC1-H1417、U-937 和 WERl-RB-I 細胞系，在共同培養 24 小時時， HPP細胞的IFN-Y生成的增加超過了與這些細胞系共同培養相同時間的臍帶血細胞。參 見圖IOA0在共同培養48小時時，對於所有的腫瘤細胞系，HPP細胞的IFN-Y生成的增加 超過臍帶血。參見圖10B。在所有腫瘤細胞系中，在24小時和48小時，K562細胞均誘導了 HPP細胞中IFN-Y生成的最大增加。對於TNF-α和GM-CSF，觀察到類似的結果。細胞周期分析證實，與單獨培養的KG-Ia細胞相比，當與HPP共同培養時，處於S 期的KG-Ia的百分比降低30%。使用HPP的不同富集部分進行的進一步共同培養實驗證 實，HPP的抗白血病活性極大地歸因於高濃度的特有的未成熟自然殺傷細胞，所述未成熟自 然殺傷細胞的特徵為高水平表達⑶56+，而不表達⑶16。6. 6.實施例6 人胎盤灌洗液細胞在體內對腫瘤細胞增殖的抑制6. 6. 1.材料和方法本實施例通過使用N0D/SCID小鼠異種移植腫瘤模型證實了人胎盤灌洗液在體內 對腫瘤細胞的功效。KG-I細胞的培養。將KG-I細胞保持在37°C下，在95%空氣/5% CO2和100% 溼度下的Iscove』 s改良的Dulbecco，s培養基中，該培養基補充了 20%的胎牛血清(生 長培養基)。每隔一天更換所述培養物中的培養基，每周將細胞傳代。KG-I細胞呈懸浮生 長。因此，為了更換培養基或將細胞傳代，將細胞懸浮液收集在離心管中，並且在S0RVALL HERAEUS 轉子(零件號75006434)中以2，OOOrpm離心10分鐘。棄去上清液，並將合適量 的細胞沉澱重懸在生長培養基中繼續培養。用於植入的KG-I細胞製劑。為了將細胞植入小鼠，如上所述通過離心收集細胞。收集細胞沉澱，並將其重懸在磷酸鹽緩衝鹽水中。為了確定待植入到小鼠的細胞數量，使用 血細胞計數器對等分試樣的細胞懸浮液進行計數。使用臺盼藍染料排除懸浮液中的死細 胞。用於植入的HPP細胞製劑。為了 HPP的貯存和解凍，將接收的樣品冷凍在良好條件 下的乾燥運送容器中。將所述單位貯存在乾燥的運送容器中，直到2007年2月7日解凍。 在解凍當天，從冷凍乾燥器中取出HPP單元(每次一個)，放置到自封口塑膠袋中。然後，將 該袋放到37°C水浴中，輕輕搖晃，直到大部分解凍(袋中仍存留小冷凍塊)。隨後從水浴中 取出所述袋，從自封口袋中取出所述單元，並輕輕倒置該單元直到完全解凍。隨後將該單元 放入層流淨化罩中，通過用70%的乙醇噴霧對血袋的外表面進行滅菌。使用無菌剪刀剪開 血袋，用無菌移液器將細胞轉移到無菌的50ml錐形管(每個HPP單位1管；每個UCB單位 2管)中。接著，將10mL解凍緩衝液(2.5%人白蛋白，5%葡聚糖40)慢慢地加入到每個管 中，輕輕地混合(在2. 2-2. 9分鐘期間)。然後，用10mL解凍緩衝液衝洗每個血袋，隨後將 該衝洗緩衝液慢慢地加入到50ml的錐形管中(在0. 7-1. 3分鐘期間)。在解凍後，在離心前將每個單位貯存在溼冰上。將所有的管離心10分鐘(440 X g， 10°C )，使用無菌移液器吸出上清液，通過振搖所述管輕輕地打散沉澱。將1ml等分試樣的 運載體(PBS+1%胎牛血清)加入到一個管中，並通過輕輕地旋轉混合所述管。使用2ml移 液器，將內含物轉移到第二個管中，接著轉移到第三個管，之後轉移到第四個管。用0. 2ml 稀緩衝液洗滌空管。為了細胞計數，將25 yl等分試樣轉移到在冰上的15ml錐形管中，該管中含有 975 yl運載體。然後，通過加入4ml冷的氯化銨裂解試劑並在冰上培育10分鐘來裂解紅 細胞。在培育後，將5ml的冷PBS加入到每個管中，離心所述管(10min，400Xg，10°C )。在 RBC裂解後，通過血細胞計數器對細胞進行計數，使用臺盼藍評價生存力。計數結果針對稀 釋進行校正並除以裂解因子(0. 46)，以估計在RBC裂解之前存在的細胞數。對於HPP劑量配製，在計數後，通過加入運載體將HPP細胞稀釋至1 X 108個細胞/ ml。然後將HPP細胞貯存在冰上，直到填充注射器。從解凍第一個單位到完成劑量配製之 間的間隔時間少於3小時。在填充注射器之前，留出50 iU等分試樣的給藥材料，用於通過如上所述的計數 進行給藥後的驗證。在給藥後，評價剩餘給藥材料以進行給藥驗證。研究設計。在第1天，將5百萬個活KG-1細胞S/C植入到二十四個N0D/SCID雄 性小鼠(Jackson Laboratories)的側腹區域。分開所述小鼠，使得四至五隻小鼠飼養在具 有木屑床的小分離籠系統中。隨意提供無菌的嚙齒類動物飼料和水。每周兩次嚴格地監測 小鼠的腫瘤生長。在第25天，觀察到第一個可測量的腫瘤。然後，每周一次記錄體重，並每 周兩次用測徑器記錄腫瘤測量結果。在植入後第52天，將動物隨機分成三個獨立的組，腫 瘤體積平均為約300-350mm3。參見下表13。第一組由具有平均腫瘤體積為312mm3的四隻 對照小鼠組成。這些小鼠中，兩隻靜脈內(IV)、兩隻動脈內(IT)分別植入200iU和50iU 運載體溶液。具有平均腫瘤體積345mm3的第二組由靜脈內植入200 yl HPP細胞/小鼠 (2X107個細胞)的四隻小鼠組成。IT植入50 yl HPP細胞/小鼠的最後一組也由具有平 均腫瘤體積332mm3的四隻小鼠組成。表13 用於體內腫瘤抑制試驗的實驗組 在第66天，植入HPP細胞後14天，由於腫瘤體積過大而終止研究。6. 6. 2.結果測量腫瘤體積(TV)直到第66天(HPP-細胞植入後第14天)，此時對照組的TV達 到平均2921mm3。在研究結束時，IV處理組的平均TV為2076mm3，IT組的TV為2705mm3。關 於處理後TV的增加％，與對照組相比，IT組顯示出對腫瘤生長20%的中度抑制，而IV組顯 示出對腫瘤生長超過35%的抑制。IT組的抑制是可證實的。參見圖11。等同物本發明不受限於本文所描述的具體實施方案的範圍。實際上，除了描述的那些外， 根據以上描述和附圖，對本發明進行的各種改變對於本領域的技術人員來說是顯而易見 的。這樣的改變落在所附權利要求的範圍內。本文引用的所有參考文獻通過參考完整納入本文，且為了所有的目的以相同程度 納入本文，就如同各單獨的出版物、專利或專利申請被特別地且單獨地指明為了所有目的通過參考完整納入本文一樣。對任何出版物的引用針對其在本申請日之前的公開內容，而 不應認為是承認是本發明由於在先發明而不能享有該出版物之前的日期。
權利要求
一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞與人胎盤灌洗液細胞接觸。
2.權利要求1的方法，其中所述腫瘤細胞為血癌細胞。
3.權利要求1的方法，其中所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。
4.權利要求1的方法，其中所述腫瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細 胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病 (CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、結腸直腸癌細胞、結腸直腸 腺癌細胞、或成視網膜細胞瘤細胞。
5.權利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液是僅流經胎盤血管系統的灌洗液。
6.權利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液已流經胎盤血管系統，並且從胎盤的母體 面被收集。
7.權利要求1的方法，其中所述灌洗液是通過用0.9% NaCl溶液流經胎盤血管系統而 獲得的。
8.權利要求1的方法，其中所述灌洗液包含培養基。
9.權利要求1的方法，其中所述灌洗液已經過處理除去了眾多紅細胞。
10.權利要求1的方法，其中所述接觸是體外接觸。
11.權利要求1的方法，其中所述接觸是體內接觸。
12.權利要求11的方法，其中所述接觸是在人體中。
13.權利要求1的方法，其中所述眾多胎盤灌洗液細胞是來自胎盤灌洗液的所有有核 細胞。
14.權利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液細胞已經過處理除去了至少一類細胞。
15.權利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液細胞已經過處理富集了至少一類細胞。
16.權利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液細胞包含至少約50%的CD56+胎盤細胞。
17.權利要求16的方法，其中所述⑶56+細胞是由⑶56-偶聯微珠選擇的。
18.權利要求1的方法，其中所述灌洗液細胞和所述腫瘤細胞以每個腫瘤細胞約5個灌 洗液細胞的比例接觸。
19.權利要求1的方法，其中所述灌洗液細胞和所述腫瘤細胞以每個腫瘤細胞約10個 灌洗液細胞的比例接觸。
20.一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞與眾多CD56+、CD16lg 盤中間體自然殺傷(PINK)細胞接觸。
21.權利要求20的方法，其中所述接觸在體外進行。
22.權利要求20的方法，其中所述接觸在體內進行。
23.權利要求22的方法，其中所述接觸在人體中進行。
24.權利要求20的方法，其中所述腫瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T 細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病 (CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、結腸直 腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、或成視網膜細胞瘤細胞。
25.權利要求20的方法，其中與外周血液自然殺傷細胞相比，所述PINK細胞以 可檢測的更高水平表達以下微小RNA中的一種或多種hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa—miR-211、hsa_miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa_miR-517c、hsa-miR-518a> hsa_miR-518e、 hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、禾口 / 或 hsa-miR-99a。
26.權利要求20的方法，其中將所述PINK細胞與一定量的免疫調節化合物接觸一段時 間，所述量和所述時間足以使得所述PINK細胞與沒有接觸所述免疫調節化合物的等量的 PINK細胞相比表達可檢測的更多的粒酶B。
27.權利要求26的方法，其中所述免疫調節化合物為來那度胺或pomalidomide。
28.權利要求20的方法，其中將所述PINK細胞與一定量的免疫調節化合物接觸一段時 間，所述量和所述時間足以使得所述PINK細胞與沒有接觸所述免疫調節化合物的等量的 PINK細胞相比顯示出對所述腫瘤細胞的可檢測的更高的細胞毒性。
29.權利要求28的方法，其中所述免疫調節化合物為來那度胺或pomalidomide。
30.權利要求26或權利要求28的方法，其中所述PINK細胞與沒有接觸所述免疫調節 化合物的等量的PINK細胞相比，以更高水平表達BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、⑶SB、IL2RA、 或TNFRSF18中的一種或多種。
31.權利要求26或權利要求28的方法，其中所述PINK細胞與沒有接觸所述免疫調節 化合物的等量的PINK細胞相比，以更高水平表達ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、 CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、I LI A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、和 TBX21 中的一種或多種。
32.—種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞與混合的自然殺傷細 胞接觸，其中所述混合的自然殺傷細胞包含從胎盤灌洗液分離的自然殺傷細胞和從臍帶血 分離的自然殺傷細胞，其中所述臍帶血分離自從中獲得所述胎盤灌洗液的所述胎盤。
33.權利要求32的方法，其中所述接觸在體外進行。
34.權利要求32的方法，其中所述接觸在體內進行。
35.權利要求34的方法，其中所述接觸在人體中進行。
36.權利要求32的方法，其中所述腫瘤細胞為原發性導管癌細胞、白血病細胞、急性T 細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病 (CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、結腸直 腸癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、或成視網膜細胞瘤細胞。
37.權利要求32的方法，其中所述混合的自然殺傷細胞包含與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3—CD56+CD16-自 然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更低數量的CD3—CD56+CD16+自 然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3TD56+KIR2DL2/ L3+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更低數量的CD3_CD56+NKp46+自 然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp30+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+2B4+自然 殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3—CD56+CD94+自 然殺傷細胞。
38.權利要求37的方法，其中所述自然殺傷細胞沒有經過培養。
39.權利要求32的方法，其中所述混合的自然殺傷細胞包含與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更低數量的CD3TD56+KIR2DL2/ L3+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp46+自 然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp44+自 然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數量的CD3_CD56+NKp30+自 然殺傷細胞。
40.權利要求39的方法，其中所述自然殺傷細胞經過培養。
41.權利要求40的方法，其中所述自然殺傷細胞已經被培養約21天。
42.一種組合物，其包含分離的⑶56+、⑶16—自然殺傷細胞，其中所述自然殺傷細胞是 從胎盤灌洗液分離的，且其中所述自然殺傷細胞包含所述組合物中至少50%的細胞。
43.權利要求42的組合物，其中所述自然殺傷細胞包含所述組合物中至少80%的細胞。
44.權利要求42的組合物，其中所述組合物包含分離的⑶56+、⑶16+自然殺傷細胞。
45.權利要求32的組合物，其中所述⑶56+、⑶16+自然殺傷細胞與所述⑶56+、⑶16—自 然殺傷細胞來自不同的個體。
46.權利要求30的組合物，其中所述自然殺傷細胞來自單個個體。
47.權利要求30的組合物，其中所述分離的自然殺傷細胞包含來自至少兩個不同個體 的自然殺傷細胞。
48.權利要求30的組合物，該組合物包含分離的胎盤灌洗液。
49.權利要求36的組合物，其中所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。
50.權利要求36的組合物，其中所述胎盤灌洗液包含與所述自然殺傷細胞來自不同個 體的胎盤灌洗液。
51.權利要求30的組合物，該組合物包含分離的胎盤灌洗液細胞。
52.權利要求39的組合物，其中所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自相同的 個體。
53.權利要求39的組合物，其中所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自不同的 個體。
54.權利要求30的組合物，該組合物包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細 胞，其中所述分離的灌洗液和所述分離的胎盤灌洗液細胞來自不同的個體。
55.權利要求36的組合物，其中所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。
56.權利要求39的組合物，其中所述分離的胎盤灌洗液細胞來自至少兩個個體。
全文摘要
本發明提供了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷(PINK)細胞及其組合。本發明還提供了包含胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細胞及其組合的組合物，以及使用胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細胞及其組合抑制腫瘤細胞、癌細胞等的生長或增殖的方法和治療具有腫瘤細胞的個體的方法。在一個優選的實施方案中，所述組合物包含分離的CD56+、CD16-自然殺傷細胞。
文檔編號A61K35/50GK101878034SQ200880118399
公開日2010年11月3日 申請日期2008年9月29日 優先權日2007年9月28日
發明者尼拉弗·迪利普·帕德裡亞, 曉奎·張, 琳·康, 瓦內薩·A·沃斯基納裡安-貝爾斯 申請人:細胞基因細胞療法公司