小酸漿的分子特異性標記引物和檢測方法與流程
2023-05-20 18:05:06 1
本發明涉及一種小酸漿Physalis minima L.的分子特異性標記引物，以及利用該特異性標記引物對小酸漿進行快速檢測的方法。
背景技術：
小酸漿Physalis minima L.為茄科酸漿屬Physalis一年生草本植物，在我國多地都有分布，其中雲南、廣東、廣西及四川分布較多。主要以野生為主，多生長在海拔1000-1300米的山坡上。在我國，小酸漿是一種民間傳統中藥材，在《全國中草藥彙編》中有記載。其味苦、涼，具有清熱、利尿、抗炎、抗氧化、降血糖及細胞毒性等功效，主要用於咽喉腫痛、支氣管炎、感冒發熱、膽囊炎、血尿、溼疹及癤腫等的治療。小酸漿葉片卵形或卵狀披針形，邊緣波狀或有少數粗齒，兩面脈上有柔毛。花生短柔毛，花萼鍾狀，果萼近球狀或卵球狀，果實球狀，直徑約6毫米。其形態學特徵與酸漿屬植物毛酸漿、苦蘵及酸漿非常相似。利用傳統鑑別方法很難將它們區分開，這也阻礙了小酸漿藥材的安全利用和保護。
DNA分子標記技術彌補和克服了傳統形態學分類方法的一些缺陷和難題，可以通過基因序列差異比較分析為植物鑑別、系統分類提供直接的證據。常規的分子標記技術譬如RAPD、ISSR及SRAP等採用通用隨機引物進行PCR擴增，其PCR產物指紋圖譜比較複雜、重複性較差、且在物種鑑定中的應用性不強。特異性分子標記技術的引物具有較強的專一性，能夠進行特異性擴增，且穩定性較好。該方法技術具有快速、簡便、成本低、準確度高的特點，在植物種類鑑定中具有較好的應用前景。目前尚未有特異性分子標記技術應用於小酸漿物種檢測的研究報導。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供小酸漿Physalis minima L.的分子特異性標記引物，該特異性標記引物序列如下：
上遊引物XSJF:5』-TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3』,如SEQ ID NO.1所示；
下遊引物XSJR:5』-CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3』,如SEQ ID NO.2所示。
該引物組合是採用PCR技術，經過大量篩選實驗，獲得小酸漿特異性DNA片段，通過切膠回收、TA克隆、測序，獲得該DNA序列，在此基礎上設計小酸漿特異性標記引物，以該引物對小酸漿及其他酸漿屬相近物種進行PCR擴增，只與小酸漿樣本DNA發生反應，獲得444bp大小的特異性片段，而不與其他酸漿屬植物樣品反應。
本發明的第二個目的是提供上述分子特異性標記引物對小酸漿進行檢測的方法。所述方法為：採用上述引物組合(XSJF/XSJR)作為特異性擴增引物，以待測酸漿屬植物樣品基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若電泳結果出現分子量為444bp大小的特異性片段，則待測酸漿屬植物樣品為小酸漿，反之則不是。
具體的，所述方法如下：
(1)基因組DNA的提取：取待測酸漿屬植物樣品新鮮葉片，加液氮研磨至粉末，然後利用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取待測酸漿屬植物樣品的基因組DNA。
(2)PCR擴增：以步驟(1)提取的待測酸漿屬植物樣品基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物(XSJF/XSJR)作為擴增引物，進行PCR擴增。
PCR反應體系(總體積20μl)：10×Buffer(含Mg2+)2μl，dNTPs(10mM)0.8μl，引物XSJF(10μM)1μl，引物XSJR(10μM)1μl，Taq酶(2U/μl)0.5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，ddH2O 13.7μl。
PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性50s，60℃退火50s，72℃延伸1.5min,共35個循環；72℃延伸10min。
(3)電泳檢測：取步驟(2)PCR產物7μl,在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，然後利用凝膠成像系統拍照檢測。若電泳結果出現分子量為444bp大小的DNA條帶，則待測樣品為小酸漿，反之則不是。
本發明主要有益效果表現為：引物組合XSJF/XSJR為小酸漿特異性擴增引物，若為其他酸漿屬植物樣品，則為陰性反應，進而實現小酸漿的快速鑑別，結果準確，方法簡便，耗時短。
附圖說明
圖1為利用本發明設計的特異性標記引物XSJF/XSJR對酸漿屬植物樣品進行PCR擴增的電泳圖，其中M為DNA分子量標準marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens。電泳圖顯示只有小酸漿樣品擴增出分子量為444bp大小的特異性DNA條帶。
具體實施方式
本發明可以從分子水平上較為快速準確的鑑別小酸漿樣品，下面結合具體實施例對本發明做進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此：
實施例1：小酸漿分子特異性標記引物開發設計
1.基因組DNA的提取
剪取酸漿屬植物樣品(包括4個小酸漿樣品、9個苦蘵樣品、4個酸漿樣品及3個毛酸漿樣品)新鮮葉片100mg放入研缽，立即加入液氮徹底磨碎，然後使用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取基因組DNA，所得DNA用0.8％瓊脂糖膠進行電泳檢測，並用紫外分光光度計檢測濃度，稀釋至50ng/μl，用於後續PCR擴增。
2.分子特異性標記引物設計
通過大量PCR擴增篩選試驗，獲得小酸漿特異性核苷酸序列，經過切膠回收、克隆及測序，獲得該DNA序列，在此基礎上設計獲得小酸漿特異性標記引物XSJF/XSJR(XSJF:5』-TTGCAAACTATCTTGTGAGTCG-3；XSJR:5』-CCACCAGAATGTACTTGTTACG-3』)。在上海生工生物工程有限公司進行引物序列合成。
實施例2：特異性引物XSJF/XSJR的PCR擴增及電泳檢測
採用本發明設計的特異性標記引物XSJF/XSJR對不同酸漿屬植物樣品(具體見附圖說明)進行PCR檢測。
PCR反應體系(總體積20μl)：10×Buffer(含Mg2+)2μl，dNTPs(10mM)0.8μl，引物XSJF(10μM)1μl，引物XSJR(10μM)1μl，Taq酶(2U/μl)0.5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，ddH2O 13.7μl。
PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性50s，60℃退火50s，72℃延伸1.5min,共35個循環；72℃延伸10min。
在1.5％瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行電泳檢測，利用凝膠成像系統進行拍照檢測。電泳圖如圖1所示(圖中，通道M為DNA分子量標準marker DL2000；通道1～20為4種不同酸漿屬植物的樣品，具體見附圖說明)，從圖1可以看出只有小酸漿樣品(通道1～4)能擴增出特異性DNA片段，將該小酸漿的特異性DNA片段送去測序，其序列長度為444bp。而其他酸漿屬植物樣品沒有擴增出任何條帶，這表明本發明的特異性標記引物專一性好，靈敏度高，可以用於小酸漿樣品的快速檢測。
SEQUENCE LISTING
杭州師範大學
小酸漿的分子特異性標記引物和檢測方法
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2
PatentIn version 3.3
1
22
DNA
人工合成
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ttgcaaacta tcttgtgagt cg 22
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DNA
人工合成
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ccaccagaat gtacttgtta cg 22