新穎的抗生素及其加成鹽的製作方法

2023-05-20 00:40:21 2

專利名稱:新穎的抗生素及其加成鹽的製作方法
本發明針對一種稱為抗生素A42867的新的抗生物物質及其加成鹽，以及其藥物配方和用作藥劑，特別包括用於治療對它敏感的微生物所感染的疾病的方法。
本發明的化合物也可以起生長促進劑的作用，對諸如家禽、豬、反芻動物等的生長起到促進的作用。
本發明的另一個目的是提供一種用於製備抗生素A42867的方法，包括對新菌珠(Nocardia sp.)諾卡氏菌ATCC 53492或抗生素A42867產生菌的變異體及突變體進行培養的方法。
諾卡氏菌ATCC 53492由土壤樣品中分離而得，並於1986年5月23日按照布達佩斯條約規定保藏在美國典型培養物保藏中心((ATCC)12301 Parklawn-Drive，ROCKVILLE，20852Maryland，U.S.A.)。
該菌株的保藏號為ATCC 53492。
考慮到抗生素A42867及相應的藥理上可接受的鹽類之間抗微生物活性的相似性，故而，在本專利申請中，當論及抗生素A42867的生物學性質時，也包括相應的鹽類，反之亦然，當論及抗生素A42867的藥理上可接受的加成鹽的生物學性質時，也包括了相應的「未加成的」的形式。抗生素A42867的生產是在需氧條件下，在含可被吸收的碳、氮源及無機鹽類的水質營養培養基中對可產生抗生素A42867的諾卡氏菌SP.，即諾卡氏菌ATCC 53492或產生抗生素A42867的諾卡氏菌ATCC53492的變異體或突變體進行培養而實現。在發酵技術中可以採用通常使用的許多營養培養基，但其中某種營養培養基被優先採用。優先採用的碳源有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、澱粉、玉米粉等等。優先採用的氮源為氨、硝酸鹽、大豆粉、蛋白腖、肉類抽提物、酵母抽提物、胰蛋白腖、胺基酸等等。可加入至培養基的無機鹽類有通常可溶性的鈉、鉀、鐵、鋅、鈷、鎂、鈣、銨的、氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽等的離子化合物。
通常，產生抗生素的菌株在搖瓶中進行預培養，然後，所得培養液用於接種至發酵罐進行保溫培養以產生足夠量的抗生素物質。用於預培養的培養基可採用與較大規模發酵用的相同的培養基，也可採用其它的培養基。抗生素A42867的產生菌株可在20℃～40℃的溫度下生長，優先採用24℃至35℃的範圍。
在發酵過程中，可對發酵液或菌絲體提取液樣品進行諸如生物測試或薄層層析(TLC)或高效液相層析(HPLC)等抗生素活性的測定來對抗生素的生產進行監測。
對抗生素A42867敏感的生物體，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)及金黃色葡萄球菌(S.aureus)可用作撿定菌。生物測試法一般用瓊脂板上進行的瓊脂擴散法較好。抗生素活性物質的最大產量一般在發酵後的第2至第5天之間產生。
抗生素A42867是通過將諾卡氏菌株ATCC53492及其抗生素A42867產生菌的變異體或突變體進行培養，而在發酵液培養中得到的。
諾卡氏菌株ATCC53492的形態學特徵培養於土壤瓊脂培養基的該菌株的形態與顯示豐富的具有中度分枝的長菌絲(hyphae)的氣生菌絲的放線菌類是相似的。該菌株的一個主要的形態特徵是基部菌絲及氣生菌絲斷裂成杆狀的小單元。基部菌絲的斷裂在所有用於測試培養特徵的瓊脂培養基都被觀察到，而在第5號、第7號、Hickey-Tresner及卵蛋白培養基上則發現了完全的的斷裂的碎片。依靠培養的時間，諾卡氏菌株ATCC53492的基部菌絲(pyphae)可充分發育形成分枝並斷裂成杆狀的碎片單元(elements)。氣生菌絲體在土壤瓊脂及水瓊脂中得到很好的發育。在土壤瓊脂上培養的氣生菌絲(hyphae)呈長直線狀，有時形成小節或成束狀的纏結。該菌株在形態上與諾卡氏菌屬中的一種有某種相似。
對該菌株的形態特徵的分析可以在用於研究其培養特性的同一塊培養板來完成。為了確定在瓊脂培養板上是否發生斷裂作用，將培養基的表面用一塑料小刀取出並將樣品置於載玻片上用光學顯微鏡觀察。當該菌株於液體中培養時，顯示出大量地斷裂成桿菌狀的碎片單元。
諾卡氏菌株SP.ATCC53492的培養特徵為了測試其培養特徵，諾卡氏菌株SP.ATCC53492被培養在Shirling和Gottlieb建議的各種標準培養基(Shirling E.B.and Gottlieb D.，1966-Method for Characterization of Streptomyces species-Int.J.Syst.Bacteriol，16，313-340)中，其中還增加幾種由Waksman推薦的培養基(Waksman，S.A.1961-The Actinomycetes-The Williams and Wilkins Co.Baltimore;Vol.2，328-334)。
在需要的時候，用Maerz及Paul的方法進行顏色測定。(Maerz A.and M.Rea Paul，1950-A Dictionary of Color-2nd Edition Mc Garaw-Hill Book Company Inc.New York)。
生物體利用各種不同碳源的能力用Shirling及Gottlieb所描述的方法進行觀察。
培養特徵、和生理特徵以及碳源利用情況分別於表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、及Ⅴ進行了報導。
表Ⅰ中的數據是在28℃溫度保溫兩周後測出的。
表Ⅰ諾卡氏菌株SP.ATCC53492株的培養特徵培養基 特徵第2號培養基(酵母提取液 大量生長，表面褶皺，棕色-麥芽瓊脂) 15/H/11，可溶性色素，黃色第3號培養基(燕麥粉瓊脂) 中度生長，表面光滑，橙色12/L/12，微量氣生菌絲，白色第4號培養基(無機鹽- 大量生長，表面褶皺，暗橙色澱粉瓊脂) 13/L/12，微量氣生菌絲白色，微量可溶色素，玫瑰色第5號培養基 大量生長，表面褶皺(甘油-天冬醯胺瓊脂) 暗橙色13/L/12，微量氣生菌絲，白色第6號培養基 中度生長，表面略皺，(蛋白腖-酵母提取液 杏黃色10/F/7鐵質瓊脂)第7號培養基 大量生長，表面褶皺，(酪氨酸培養基) 棕色15/H/11，微量氣生菌絲，白色查貝克氏(Czapek)-蔗糖瓊脂 大量生長，表面光滑橙黃色9/G/8，微量氣生菌絲燕麥粉瓊脂 大量生長，表面略皺，橙色12/F/10，微量氣生菌絲白色，微量可溶性色素，玫瑰色Hickey及Tresner 大量生長，表面褶皺，瓊脂 金色9/I/6蘋果酸鈣瓊脂 大量生長，表面光滑，淺黃色10/C/4，微量氣生菌絲白色Bennett瓊脂 大量生長，表面褶皺，棕色15/H/11查貝克氏(Czapek)葡萄糖瓊脂 大量生長，表面褶皺，棕色7/E/12，微量氣生菌絲白色，可溶性，色素暗黃色葡萄糖天冬醯胺瓊脂 中度生長，表面略有結皮，黃色10/L/5營養瓊脂 大量生長，表面光滑，橙黃色9/G/6/脫脂乳瓊脂 大量生長，表面光滑，桃色9/I/5微量氣生菌絲，白色卵白蛋白瓊脂 中度生長，表面光滑，無色，微量氣生菌絲Sabouraud瓊脂 大量生長，表面褶皺，棕色10/L/10土豆瓊脂 大量生長，表面褶皺，黃色10/L/7，微量氣生菌絲，白色，可溶性色素，玫瑰色水瓊脂 極少量生長，表面光滑，無色完好形成氣生菌絲，白色土壤瓊脂 中度生長，表面光滑，無色，大量形成氣生菌絲葡萄糖胰蛋白腖瓊脂 大量生長，表面褶皺，黃色10/L/7字母及數字標明 根據Maerz及Paul(2)方法測定的顏色。
諾卡氏菌株SP.ATCC53492生理特徵表Ⅱ試驗 結果澱粉水解 正酪氨酸反應 正酪蛋白水解 正蘋果酸鈣的溶解 負自硝酸鹽至亞硝酸鹽 負纖維素分解 負硫化氫的產生 正(以醋酸鉛紙帶測試)
溫度耐受性表Ⅲ15℃＝-22℃＝+28℃＝++37℃＝++42℃＝+50℃＝-
最適於菌落生長的溫度在大約自22℃至大約42℃的範圍內。
最佳溫度為自28℃至37℃。
pH耐受性表ⅣpH3＝-pH4＝-pH5＝++pH6＝++pH7＝++pH8＝++pH9＝++pH10＝-pH11＝--＝不長+＝中度生長++＝大量生長採用Hickey及Tresner瓊脂糖培養基進行pH及溫度耐受性實驗以測定生理特徵。
碳源的利用表Ⅴ碳源利用碳源 生長乳糖 ++阿拉伯糖 ++木糖 ++甘露糖 ++果糖 ++纖維二糖 ++半乳糖 ++肌醇 ++葡萄糖 ++棉子糖 -核糖 ++蔗糖 -水楊苷 +纖維素 -鼠李糖 --＝不長+＝中度生長++＝大量生長本試驗系採用第8號培養基並於28℃～30℃下保溫10天之後記取結果。
化學分類研究菌株在v6培養基中培養(牛肉浸膏0.5%，自溶酵母0.5%，蛋白腖0.5%，水解的酪蛋白0.3%;葡萄糖2%，Na Cl0.15%)，在30℃下，置於旋轉式搖瓶機(轉速200rpm)搖瓶72小時。在v6培養基中生長的菌絲通過離心作用(3000rpm×10分鐘)而收穫，並用蒸餾水洗滌兩遍。菌絲再用乙醇洗滌，然後在室溫下進行層流乾燥。
幹的菌絲被用作整細胞製劑。
胺基酸分析用Becker等描述的方法(「通過整細胞水解產物的紙層析快速分辨諾卡氏菌及鏈絲菌」Appl.Microbiol.12，421-423(1964))進行的胺基酸分析表明有內消旋-二氨基庚二酸的存在。
糖分析根據M.P.Lechevalier的方法(「有重要臨床意義的需氧放線菌的鑑定」，J.Lab.Clin.Med.71，934-944(1968))，採用J.L.Staneck及G.D.Roberts描述的薄層層析片(「用薄層層析法識別需氧放線菌絲的簡化方法」，28，226-231(1974))進行的糖含量分析，表明了阿拉伯糖及半乳糖的存在。
諾卡氏菌SP.ATCC53492的識別由於內消旋二氨基庚二酸及有特徵的糖，諸如半孔糖及阿拉伯糖的存在，按照Lechevalier M.P.及H.Lechevalier的分類法(「在需氧的放線菌屬的分類中，以化學組成物作為一個鑑別指標」，Int.Journ.Syst.Bacterial.20，435-443(1970))。該菌種屬於細胞壁形態Ⅳ的放線菌屬，如其它微生物一樣，將A42867產生菌菌株的特徵進行誘變，例如，可通過各種已知的誘變劑，諸如，紫外線、x-射線、高頻波放射性射線，及化學藥品，如亞硝酸、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍等等，獲得該菌株的人工變異體或突變體。所有屬於諾卡氏菌屬中的各諾卡氏菌種，凡能產生抗生素A42867的，則被視為諾卡氏菌SP.ATCC53492株的等同物，並且位於本發明的保護範圍之內。
從發酵液中提取抗生素A42867，可根據已知的技術來實現，這些技術包括溶劑抽提，可以用對該品不溶解的溶劑或變化溶液pH值而發生的沉澱作用，分配層析，反相分配層析，離子交換層析，親和層析等等。
一種優先採用的方法，包括在固定化的D-丙氨醯-D-丙氨酸上進行的親和層析及繼而進行的反相柱層析。適用於目前的提取過程的固定化D-丙氨醯-D-丙氨酸基質由歐洲專利申請第83112555號所揭示。優先採用的基質為有控制孔隙的交聯聚右旋糖酐和D-丙氨醯-D-丙氨酸偶合的基質。
然後，將經過濾的發酵液在固定化D丙氨醯-D丙氨酸上進行親和層析，在柱中進行或分批間斷操作。
抗生素A42867與親和基質的結合系優先採用在pH大約為7.0～8.0下進行，洗脫時採用水溶性的鹼，使pH值處於更為偏鹼性的範圍(優先採用9.0至11.5的範圍)。這些水溶性的鹼，可以為氨水、揮發性胺、鹼或鹼金屬氫氧化物或在極性有機溶劑存在下用任選的鹼性的緩衝液，如下述的可與水混合的極性溶劑。
用隨意選擇的含有鹽類、脲素及/或可與水溶性溶劑的pH為4-8的含水緩衝液洗去柱中的雜質之後，用上述的混合洗脫劑將抗生素A42867洗脫下來。加入可與水形成最低沸點的共沸混合液的有機溶劑於所收集的含抗生素組份中，共沸蒸餾之後加入對該品不溶性的溶劑使需要的產物沉澱，由此將組份中含的水份完全去除，從而得到抗生素物質的粗產物。
可以與水形成最低溫共沸混合液的有機溶液的典型例子有正丁醇、苯、甲苯、丁基醚、四氯化碳、氯仿、環己烷、2，5-二甲基呋喃，己烷及間二甲苯;優先採用的溶劑為正丁醇。
不溶解該品的溶劑的例子有石油醚、低級烷醚，如乙基醚、丙基醚及丁基醚、及低級烷基酮類，如丙酮。
或者，首先將收集的含抗生素的組份的液體濃縮至小體積，優先採用加入以上確定的有機溶劑而進行的共沸蒸餾，然後將獲得的水溶液進行冷凍乾燥。
如果洗脫液中用的水溶性鹼是不揮發性的，那麼在濃縮液進行沉澱或冷凍乾燥之前必須進行中和及去鹽。
一個適宜的去鹽方法包括以下步驟將含抗生素的水溶液在矽烷化的二氧化矽凝膠柱上上柱，用蒸餾水洗滌然後用極性的與水混合的溶劑與水的混合液進行洗脫。
代表性的極性與水混合的溶劑有水溶性醇，(諸如甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇)丙酮，乙腈，低級鏈烷酸酯(諸如乙酸乙酯)，四氫呋喃，二噁烷及二甲基甲醯胺，及它們的混合液;其中優先採用乙腈或者，去鹽步驟可以如此進行將含抗生素的溶液在上述的親和柱上上柱，用蒸餾水洗滌後，用上述的用於洗脫親和層析柱的揮發性鹼的水溶液進行洗脫。
由此而獲得的產物為抗生素A42867。獲得純淨的抗生素A42867的適宜的方法，可用親和層析柱進行進一步的提純。一般採用如上相同的固定相(固定化的D-丙氨醯-D-丙氨酸)，所需的抗生素物質在上述的在固定的D-丙氨醯-D-丙氨酸進行的親和層析步驟之後，被洗脫下來。
優先採用的固定化D-丙氨醯-D-丙氨酸為瓊脂糖-ε-氨基己醯基-D-丙氨醯-D-丙氨酸，較好的平衡混合液為含0.16%(w/v)氨水的2MNa Cl溶液pH調至7～8，較好的洗滌液為含0.16%(w/v)氨水的，pH調至7～8的2M Na Cl溶液，較好的洗脫混合液為0.16%(w/v)氨水。
或者，本發明的抗生素物質可用強或弱陰離子樹脂，用包括帶有功能基團的聚苯乙烯、丙烯酸或聚右旋糖酐基質，從發酵液中分離出來，或進行再一步的純化。市售的弱陰離子交換樹脂的商品名為DowexMWA-1或WGR(Dow Chemical)，Amberlite IRA-73(Rohm及Haas)，DEAE-葡聚糖凝膠(Pharmacia)。根據本發明，可採用的強鹼性陰離子交換樹脂的商品名為DowexMSA-1，SBR，SBR-P(Dow Chemical)，Amberlite IR-904(Rohm及Haas)及QAE-Sephadex(Pharmacia)。
用電解質水溶液的線性梯度洗脫混合劑，諸如，氫氯化鈉或鉀的水溶液或水與可與水相混的有機溶劑(諸如低級醇(例如，(C1-C4)烷醇)或低級烷酮(例如，丙酮，甲基乙基酮，等))的混合物的溶液。
抗生素A42867的物化特徵A)紫外吸收光譜，如附圖1所示，展示了以下的吸收峰λmax(nm)a)0.1NHCl 282b)水 282c)磷酸緩衝液pH7.4 282d)磷酸緩衝液pH9 282305(肩)e)磷酸緩衝液0.1KOH 305265(肩)B)紅外吸收光譜，示於附圖2，展示了以下的吸收峰(cm-1)3700-3100，3000-2800(nujol);1650;1580;
1460(nujol)1375(nujol);1300;1235;1210;1160;
1130;1060;1025;1000;970;840;790-700;720(nujol)C)H-NMR譜，示於附圖3，展示了以下的信號功能團(in ppm)於二甲基亞碸d6(六氘二甲基亞碸)並在270MHz記錄，採用TMS為內標(0.00ppm)，(δ＝ppm)0.90，d[(CH3)2-(CH)];1.02，d[CH3-(CH)];
1.23，d[CH3-(CH)];1.52，s
;
1.77，m[CH(CH3)2];2.38，s(N-CH3);3.0-6.35，s及m(芳香族，糖及肽的CH′s);6.27-9.29(芳香族CH′s，肽NH′s及酚OH′s)d＝雙峰s＝單峰m＝多峰D)當在以下的條件進行反相HPLC分析時，相對於鹽酸萬古黴素(Vancocin，Eli Lilly，Rt＝16.36min的滯留時間(Rt)為0.537。
柱Ultrasphere ODS(5μm)Altex(Beckman)4.6mm(i.d.)×250mm前置柱Brownlee Labs RP 18(5μm)洗脫劑水∶乙腈∶2-乙醇胺∶三氟乙酸＝9∶1∶0.01∶0.01(v/v)流速1.6ml/min紫外檢測254nm內標物鹽酸萬古黴素(Rt＝16.36min)
(Vancocin，Eli Lilly)E)當在以下的條件進行反相高效液相層析(HPLC)分析時，相對於鹽酸萬古黴素(Vancocin，Eli Lilly，Rt 9.96min)的滯留時間(Rt)為0.665。
柱Ultrasphere ODS(5μm)Altex(Beckman)4.6mm(i.d.)×250mm前置柱Brownlee Labs RP 18(5μm)
洗脫方式洗脫劑A中含洗脫劑B的含量自5%至60%的線性梯度，時間為40分鐘。
流速1.6ml/min紫外檢測254nm內標物鹽酸萬古黴素(Rt＝9.96min)(Vancocin，Eli Lilly)F)元素分析，將樣品在140℃溫度下的惰性氣氛下乾燥，百分組成的近似值如下所列(平均)碳53.3%;氫5.9%;氮7.85%;氯(總量)4.41%;氯(離子)2.22%。無機殘留物0.875%(900℃空氣中)G)酸鹼滴定曲線，對預先加入過量的HCl水溶液的樣品用0.05NKOH水溶液滴定，顯示p Ka為3.2，7.1及8.3。
H)在下述層析系統中的Rf值為0.56。
採用反相矽烷化二氧化矽凝膠板(RA-18F254)顯現-紫外線，波長254nm-用Pauly試劑，即重氮化的對氨基苯磺酸(J.Chromatog.20，171(1965)，Z.Physiol.Chem.292，99(1953))試驗為黃色。
-生物自記圖表，採用枯草桿菌(B.Subtilis)ATCC6633在最低Davis培養基上培養。
I)分子量約為1559，從FAB-質譜測定，在1560出現M+H
峰。
抗生素A42867擁有的酸性及鹼性功能團除在合適的pH條件下可形成內鹽外，按照慣用的方法還可使之與無機或有機的反離子形成鹽類。
通過酸鹼的標準反應，形成具有典型性且合適的本發明的化合物的酸加成鹽的無機或有機的酸類有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、琥珀酸、檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、雙羥萘酸(pamoic acid)、粘酸、穀氨酸、樟腦酸、戊二酸、乙醇酸(glycolic acid)、苯二甲酸、酒石酸、月桂烯酸、硬脂酸、水楊酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸及其它類似的酸類。
這些有代表性的鹼的例子有鹼金屬或鹼土金屬的氫氧化物，如氫氧化鈉、鉀、鈣、鎂、鋇;氨及脂肪族、脂環或芳香族有機胺，如甲胺、二甲胺、三甲胺，及甲基吡啶。
本發明的「不成鹽形式」的化合物向其相應加成鹽形式的轉化，及反之，即本發明的加成鹽形式的化合物向「不成鹽」形式的轉化，屬於普通技術技能，因而包含於本發明之中。
例如，抗生素A42867向相應的酸加成鹽的轉化，可以通過將不成鹽形式的抗生素溶於含水溶劑中，再加入摩爾數稍稍過量的選定的酸或鹼。然後，將產生的溶液或懸浮液冷凍乾燥便可得到所需的鹽。
如果最終形成的鹽在一種溶劑中是不溶的而不成鹽的形式是溶解的，則可在溶有不成鹽形式抗生素的有機溶液中加入經化學計算而相當的或稍稍過量的選定的酸或鹼後再進行過濾而獲得。
不成鹽形式的抗生素可通過對溶解在相應的酸性或鹼性鹽於含水溶劑中進行中和使之游離出其不成鹽形式的抗生素。
中和之後如需對過量的酸或鹼進行消除，可採用普通的去鹽過程。
例如，以矽烷化二氧化矽凝膠、無功能基團的聚苯乙烯、聚丙烯酸及控制孔徑的聚右旋糖酐樹脂(如萄聚糖LH20)或活性炭為固相的柱層析可方便地採用。當用水容液將不需要的鹽洗脫之後，通過水及極性或非極性有機溶劑的混合液的線性或階梯型梯度洗脫所需的產品，如採用的洗脫液為乙腈/水自50∶50至大約100%乙腈。
由現有技術可知，抗生素無論與藥物上可接受的酸類(或鹼類)或與非藥物上可接受的酸類(或鹼類)形成鹽的過程可用作方便的純化技術。在成鹽及分離之後，抗生素A42867的鹽形式可轉化成相應的不成鹽的形式或轉化成藥物可接受的鹽形式。
在某些例子中，抗生素A42867的鹼加成鹽形式更易溶於水及親水溶劑。
本發明化合物的抗細菌活性可以通過對各種不同的微生物培養物上進行標準稀釋法試驗(standard dilution tests)而在體外進行演示。
用於MIC(最低抑制濃度)測定的培養基及生長條件如下所示對於葡萄球菌(staphylococci)、糞鏈球菌(strep·faecalis)及格蘭氏陰性細菌(大腸桿菌)，採用等靈敏度試驗用(Isosensitest)肉汁(Oxoid)培養24小時。對於其它的鏈球菌(streptococcal)菌種採用Todd-Hewitt肉汁(Difco)培養24小時。對於淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)採用GC基肉汁(Difco)+1%(Isovitalex)多價蛋白質(BBL)及CO2富含的氣氛，培養48小時。對於流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)採用腦心肉汁(BrainHeart broth)(Difco)+1%補充培養基C(Supplement C)(Difco)培養48小時。對於產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)採用AC肉汁(Difco)及厭氧氣氛培養24小時。對於其它的厭氧微生物瘡皰丙酸桿菌、艱難梭菌，脆弱桿菌採用Wilkins-Chalgren瓊脂(參見T.D.Wilkins S.Chalgren，1976，Antimicrob.Ag.Chemother.10，926)及厭氧的氣氛培養48小時。對於雞敗血枝原體(Mycoplasma gallisepticum)採用PPLO肉汁(Difco)+10%馬血清+1%葡萄糖，培養48小時。對於(U.urealyticum)採用PPLO肉汁及如R.T.Evans及D.Taylor-Robinson所述的各補充培養基(J.Antimicrob.Chemother.4，57)培養24小時。培養溫度採用37℃。接種量如下所列對於雞敗血枝原體(M.gallisepticum)1%(v/v)48小時肉汁培養液。對於(U.urealyticum)，大約104顏色變化單位/毫升。對於其它肉汁稀釋法的最低濃度測定採用大約104-105菌落形成單位/毫升。對於瓊脂稀釋MICs艱難梭菌(C.difficile)瘡皰丙酸桿菌(P.acnes)脆弱桿菌(B.fragilis)採用大約104-105細菌/點(用多點接種器進行接種)。
某些微生物的最低抑制濃度(MIC，μg/ml)如以下的表Ⅰ所示。
M.I.C.μg/ml菌株 抗生素A42867金黃色葡萄球菌 L165(104cfu/ml) 0.25表皮葡萄球菌 L147 ATCC 12228(凝固酶陰性) 1釀膿鏈球菌 L49 C203 0.13肺炎鏈球菌 L44 UC41 0.13糞鏈球菌 L149 ATCC 7080 1緩症鏈球菌 L796(臨床分離) 0.25產氣莢膜梭菌 L290 ISS 30543 0.13艱難梭菌 L1363 ATCC 9689 2瘡皰丙酸桿菌 L1014 ATCC 6919 0.5淋病奈瑟氏球菌 L997 ISM68/126 ＞128流感嗜血桿菌b型 L970 ATCC19418 ＞128普通變形菌 ATCC 881 L79 ＞128大腸桿菌 L47 SKF 12140 ＞128綠膿桿菌 ATCC 10145 L4 ＞128白念球菌 SKF 2270 L 145 ＞128雞敗血枝原體 L431 S6 Weybridge ＞128抗生素A42867經發現具有抗凝固酶陰性的葡萄球菌(staphylococci)活力。對於表皮葡萄球菌(S.epidermidis)及溶血性鏈球菌(S.haemolyticus)的一系列臨床分離物的最低抑菌濃度M.I.C(μg/ml)報導如下
表Ⅶ抗生素A42867 M.I.C(μg/ml)菌株表皮葡萄球菌 S.epidermidis L393 1表皮葡萄球菌 S.epidermidis L408 1表皮葡萄球菌 S.epidermidis L410 0.5溶血性鏈球菌 S.haemolyticus L381 4溶血性鏈球菌 S.haemolyticus L382 8溶血性鏈球菌 S.haemolyticus L383 1本發明化合物的抗生素活性也通過鼠敗血症實驗得到確證。
對照及治療組的鼠包括10隻CD-1鼠(Charles River)，重量在18～22g。採用無菌加蛋白腖的鹽水稀釋過液的釀膿鏈球菌(S.pyogenes C 203(L49))培養物而得到的細菌懸浮液，通過鼠腹膜注射0.5ml進行感染。將細菌接種量調節至使未治療動物於48小時死於敗血症的劑量。對該化合物的試驗是在感染之後立即通過皮下注射而施用。以mg/kg表示的ED50，在第7天用Spearman及Kaerber(D.J.Finney生物測定的統計方法「Statistical Methods in Biological Assay」，Griffin，page524，1952)的方法，通過對每一劑量的存活動物百分數來計算。
在這些條件之下，抗生素A42867的ED50值為1.54mg/kg。
一般地，用於抗細菌治療的抗生素A42867及其非毒性藥物上可接受的鹽或其混合物，可通過多種不同途徑施用，如局部施用或非腸胃給藥施用。一般地說非腸胃道施用是優先採用的途徑。
用於注射的複合物可採用在油性或水載體中為懸浮液、溶液、或乳濁液等形式，也可含有諸如懸浮、穩定及/或擴散劑等佐劑。
另一方面，活性組份也可為粉狀，便於施用時，加入合適的載體，如滅菌水而重新配製。
按照不同的施用途徑，這些化合物可被配成各種不同劑量的形式。
在某些情況下，可以把本發明的化合物配成包有腸溶衣的劑量形式以用於口服，製備方法為現有技術已知的(例如，參見「Remington′s Pharmaceu-tical Sciences」，fifteenth edition，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，USA，Page 1614)的例子。
這種情況發生在，當抗生素物質特別需要在腸道中的吸收的情況下，而同時又能在胃中通過時並不發生變化。
活性成份的施用數量取決於接受治療者的大小及條件，以及施用途徑及頻率，及致病原因等。
本發明的抗生素物質及其生理上可接受的鹽類，在每天劑量為病人每公斤體重施用大約0.5mg至50mg時是有效的，每天可隨意地分1至4次施用。
特別希望獲得複合物的劑量單位每單位含大約100至5，000mg。
適於注射的載體的典型例子有注射用滅菌水、Ringer氏溶液、0.9%鹽水及5%葡萄糖(dextrose)。對於靜脈輸注，抗生素在載體中的合適濃度在大約5%至10%。其它合適的配方形式有密閉小瓶、塑料囊、消毒橡皮塞封口小瓶及其它形式。
此外，本發明的抗生素物質可製成局部施用的製劑，諸如溶液、藥膏、及洗液。這些製劑通常含0.1至15%(w/v)的活性成份。
另外，本發明的抗生素物質可用於抑制造成腸道中假膜性結腸炎的艱難梭菌(Clostridium difficile)的生長。這些抗生素可用於治療腸道中假膜性結腸炎，通過口服有效劑量的抗生素或製成藥物上可接受劑量形式的藥物上可接受鹽來施用。對於這種用法抗生素可以製成明膠膠囊藥丸或液體懸浮液形式進行施用。
抗生素A42867或及可接受的鹽，除具藥物活性外，還可用作動物生長促進劑。
對於此種目的，本發明的化合物被混於合適的食料中口服施用。採用的合適的濃度為當通常需要消耗的食料數量中含有促進生長有效數量的活性藥劑。
在動物飼料中加入本發明的活性化合物的方法最好採用這樣的辦法;製備含有有效數量的活性化合物的合適的預混合飼料，然後再將之拌入完全的飼料中。
製備及施用這類預混合飼料及完全飼料的方法在如下的參考書中被描述，(諸如「應用的動物營養物」(W.H.Freedman and CO.S.Francisco USA1969或「家畜飼料及送料(O and B books，Corvallis，Oregon USA1977)並在此用作參考。
以下的例子對本發明進行進一步描述，而不對之產生任何限制。
例1抗生素A42867的生產將產生抗生素的生物體(諾卡氏菌SP.ATCC 53492)的原培養物在燕麥粉瓊脂斜面上劃線接種，並於28℃溫度下培養2周。
將一個菌環生長的菌株接種在500ml三角燒並中，瓶中含有的種子培養基的組成為葡萄糖2.0%、大豆粉0.8%、酵母浸汁0.2%、Na NaCl0.1%及CaCO30.4%，培養基在滅菌前pH被調至7.3。該瓶在28℃下在一個旋轉式搖瓶機上保溫培養72小時。然後將100ml的培養液接種到含有4升相同種子培養基的發酵罐中，培養物在28℃下培養48小時並以大約900rpm的速度攪動，並在每分鐘，每體積滴入1標準立升的空氣。將4立升種子培養液接種至含有200立升組成成份與種子培養基相同的發酵培養基的發酵罐中，在大約250rpm的速度進行攪拌的情況下，進行96小時的發酵，並通入1標準立升的空氣·每體積每分鐘。
用培養於最低戴維思(Davis)培養基上的枯草桿菌(B.subtilis)對抗生素的活性進行測定。
例2抗生素A42867的提取如例1所述的得到的全部發酵液(400升)利用助濾劑(Hyflo-Floma
)在滾筒過濾器進行過濾。濾液用2N的氫氯酸調節pH值至7.5後，加入至1000ml經過預膨脹的D-丙氨酸-D-丙氨酸-氨基己醯基-葡聚糖4B改進的基質(如歐洲專利申請第83112555.4描述的方法來製備)，在輕微攪拌的情況下放置過夜。
樹脂通過過濾而回收，當培養液棄去後，用(10升)含5%(w/v)Na Cl的pH為7.5的0.5%(w/v)鹽酸-三羥甲基甲胺(Tris)緩衝液進行洗滌，然後用水(4×5升)洗滌。
與樹脂發生選擇性結合的產物用1.5%(w/v)的氨水(4×51)進行洗脫，並在減壓的情況下，加入正丁醇進行共沸蒸餾，從而濃縮至較小的體積(大約1，800ml)。
將濃縮的水溶液冷凍乾燥而得到抗生素A42867的粗產品(75.6克)。
例3粗產品抗生素A42867的純化將通過例2的步驟而獲得的抗生素A42867的粗產品(75克)溶於2升含有2MNa Cl，用0.1N NaOH溶液調pH至7.5的水溶液中，然後過濾。
濾液以500ml/小時的速度在一個1000ml的預先用含有2M NaCl及0.6ml三角×100(辛基氧基聚乙氧基乙醇)((Triton)X100)(Baker grade)的0.04M硼酸鹽緩衝液pH7.5平衡的，經預漲的D-丙氨酸-D-丙氨酸-6-氨基己醯基-葡聚糖-4B·改進的基質的柱(按歐洲專利申請第83112555.4號描述的方法製備的)(0.1×0.1m)上進行上柱。
用8升8M脲素(pH7.5)以500ml/h的速度對柱進行洗滌，繼而用70升Na OH水溶液(pH10)洗脫並按1000ml收集每組份。
各組份用瓊脂圓碟測定法在枯草桿菌(B.subtilis)培養物上進行測定，將無活性的組份棄去，將活性組份(在此例中為63～70組份)合併，在減壓的情況下，加入正丁醇，通過共沸蒸餾濃縮成小體積(500ml)，然後冷凍乾燥得到抗生素A42867(4克)。
例4抗生素A42867的純化與去鹽將由例3得到的抗生素A42867 3.5克溶於70ml的含磷酸二氫鈉一水合物(2.5g/l)及乙腈(91∶9)的溶液中並過濾。
10ml濾液在填充有40克10μm RP18(Lichrosorb)反相矽烷化凝膠(Merck)的不鏽鋼柱(2×50cm)上進行上柱。該柱為Chromatospac Modulprep Unit的一個部件(Jobin Yvon，16-18Rue de Canal 91169 Long Jumeau，France).
用與溶解樣品時採用的溶液相同的溶液，以8ml/min速度對該柱進行洗脫，按每50ml收集組份。
每一組份通過HPLC及紙圓片生物測定法用敏感微生物，諸如枯草桿菌(B.Subtilis)進行監測。
將對於枯草桿菌(B.Subtilis)有活性的七個流出組份合併，在減壓的情況下蒸餾去除乙腈，剩留物用一定數量的水稀釋至與原溶液相當的體積。
溶液pH值被調至7.5，然後以100ml/h的流速在5×15cm規格的預先用0.04M硼酸鹽緩衝液(pH7.5)平衡的預漲的D-丙氨酸-D-丙氨酸-6-氨基己醯基-葡聚糖-4B改進的基質(按歐洲專利申請第83112555.4號所描述的方法製備)的柱上進行上柱。
用8升水(用0.5ml/l 1N鹽酸酸化)洗滌柱。
然後用1.5%(w/v)的氨水洗脫並按每100ml體積收集組份。
收集那些對枯草桿菌(B.Subtilis)有活性的組份，減壓濃縮並冷凍乾燥得到具有前述理化特徵的去鹽的抗生素A42867產品1.2克。
權利要求
1.抗生素A42867或其鹽類，也具有不成鹽的形式；有如下的特徵抗生素A42867的物化特徵A)紫外吸收光譜，如附圖1所示，展示以下吸收峰最大吸收峰i(nm)a)0.1NHCI 282b)水 282c)磷酸緩衝液pH7.4 282d)磷酸緩衝液pH9 282305肩(shoulder)e)磷酸緩衝液0.1KOH 305265肩(shoulder)B)紅外吸收光譜，如附圖2所示，展示了如下吸收峰(cm-1)3700-3100，3000-2800(nujol)；1650；1580；1460(nujol)1375(nujol)；1300；1235；1210；1160；1130；1060；1025；1000；970；840；790-700；720(nujol)。C)1H-NMR核磁共振譜，如附圖3所示，展示了如下的信號基團(ppm濃度)在二甲基亞碸(d6)(六氘二甲基亞碸)中於270MHz下記錄並應用TMS作為內標(0.00ppm)(δ=ppm)0.90，d[(CH3)2-(CH))]；1.02，d[(CH3-(CH)]；1.23，d[CH3-(CH)]；1.52，s[CH3-
]；1.77，m[CH(CH3)2]；2.38，s(N-CH3)；3.0-6.35，s及m(芳香族、糖及肽的CH′s)；6.27～9.29(芳香族CH′s肽NH′s及酚OH′s)d=雙峰s=單峰m=多峰D)當在如下條件進行反相HPLC分析時，則測得的相對於鹽酸萬古黴素(Vancocin，ELi Lilly，Rt=16.36min)的滯留時間(Rt)為0.537。柱Ultrasphere ODS(5μm)Altex(Beckman)4.6mm(i.d.)×250mm預置柱Brownlee LabsRP18(5μm)洗脫劑∶水∶乙腈∶2-乙醇胺∶三氟乙酸=9∶1∶0.01∶0.01(v/v)流速1.6ml/min紫外檢測器254nm內標物鹽酸萬古黴素(Rt=16.36min)(Vancocin，ELiLilly)E)當在如下條件進行反相HPLC分析時，測得的相對於鹽酸萬古黴素(Vancocin，ELiLillyRt9.96min)的滯留時間(Rt)為0.665。柱UltrasphereODS(5μm)Altex(Beckman)4.6mm(i.d.)×250mm前置柱Brownlee Labs R P18 (5μm)洗脫劑A
pH調至6.0洗脫劑B
pH調至6.0洗脫過程自洗脫劑A中含洗脫劑B5%至60%時間為40分鐘流速1.6ml/min紫外檢測器254nm內標物鹽酸萬古黴素(Rt=9.96min) (Vancocin，ELiLilly)F)元素分析，在惰性氣氛中於140℃對樣品進行預乾燥然後進行元素分析，表明下述的近似的百分組分(平均值)碳53.3%；氫5.9%；氮7.85%；氯(總量)4.41%；氯(離子)2.22%。無機殘留物於900℃空氣中測出為0.875%。G)在預先加入過量HCl水溶酸的樣品中用0.05NKOH水溶液進行滴定，得出的酸鹼滴定曲線顯示pKa值為3.2、7.1及8.3。H)在下列層析系統中的Rf值為0.56
pH調至6.0採用反相矽烷化二氧化矽凝膠板(RA-18 F254)顯現-紫外光線，波長為254nm-用Pauly試劑即重氮化磺胺酸顯示黃色，(J. Chromatog.20，171 (1965)，Z. Physiol. Chem. 292，99，(1953))-用在最低戴維斯培養基的枯草桿菌(B.subtilis)ATCC6633進行生物顯色。用質譜FAMs Ms測定在1560顯示M+H
峰，說明分子量約為15591)分子量約為1559，從FAB-質譜測定，在1560出現M+H
峰。
2.製備如權利要求
1所述之化合物的過程，其特為，包括在有氧條件下沉沒培養，在可吸收的碳源，氮源及無機鹽類存在的情況下培養諾卡氏菌株SP ATCC 53492或及產生抗生素A42867的突變體或變異體，從發酵液中提取並分離該抗生素並在需要的情況下轉化成所需的鹽。
3.如權利要求
2所述的過程，其特徵為，其中所述菌株在20℃至40℃的溫度範圍內培養。
4.如權利要求
2所述的過程，其特徵為，其中所述菌株在24℃至35℃溫度範圍內培養。
5.如權利要求
2所述的過程，其特徵為，其中所述抗生素物質的提取及分離是通過將過濾後的發酵液對固定化D-丙氨醯-丙氨酸固相進行親和層析，然後採用分配、反相或離子交換層析。
6.如權利要求
1所述之用作藥物的化合物。
7.將權利要求
1所述的化合物用作抗生素治療中的藥物或作為生長促進劑的用途。
8.以權利要求
1所述化合物作為活性成份的藥物配方。
9.治療感染性疾病的方法，其特徵為，其中包括按需對病人施用有效數量的如權利要求
1所述的抗生素。
10.諾卡氏菌SP.ATCC 53492或及產生抗生素A42867的突變體或變異體的生物學純培養物，所述培養物能夠產生在含有可吸收的碳源、氮源及無機物的水溶液營養培養基中具有可供提取數量的抗生素A42867。
11.諾卡氏菌SP.ATCC 53492。
專利摘要
一種新穎的抗生素A42867，通過在有氧條件下，沉沒培養在可吸收的碳源、氮源、及無機鹽類存在的情況下，培養諾卡氏菌株SPATCC53492或及產生抗生素A42867的突變體或變異體而製備。該抗生素及其加成鹽可用於治療感染性疾病或用作生長促進劑。
文檔編號A61P31/04GK87105285SQ87105285
公開日1988年3月9日 申請日期1987年7月29日
發明者愛納斯特, 瑞伐 申請人:哥羅布萊普蒂得愛斯皮艾導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan