白蛋白融合的Kunitz結構域肽的製作方法

2023-05-03 15:46:56 1

專利名稱：：白蛋白融合的Kunitz結構域肽的製作方法白蛋白融合的Kunitz結構域肽相關申請本申請要求2002年2月7日申請的美國臨時申請系列號60/355,547的優先權。本文以其整體引用該申請的公開內容作為參考。發明領域本發明涉及Kunitz結構域肽和白蛋白融合蛋白領域。更具體地說，本發明涉及用於治療，預防，或改善疾病或紊亂的Kunitz結構域肽和白蛋白融合蛋白。發明背景Kunitz結構域是形成中央反向平行0摺疊和短C-末端螺旋的大約51_64個殘基的摺疊結構域(參見，例如，美國專利號6,087,473,本文以其整體引用以供參考)。該特徵性結構域包含形成3個二硫鍵的6個半胱氨酸殘基，導致產生雙環結構。N-末端區和第一P鏈之間存在活性抑制結合環。該結合環通過P2Cw殘基與最後2個P鏈之間形成的髮夾環以二硫鍵結合。來自各種蛋白酶抑制劑的分離的Kunitz結構域顯示出具有抑制活性(例如，Petersen等，Eur.J.Biochem.125:310-316,1996;Wagner等，Biochem.Biophys.Res.Comm.186:1138-1145，1992;Dennis等，J.Biol.Chem.270:25411-25417，1995)。連接的Kunitz結構域也顯示出具有抑制活性，例如，在美國專利號6,087,473中討論。含有一個或多個Kunitz結構域的蛋白酶抑制劑包括組織因子途徑抑制劑(TFPI),組織因子途徑抑制劑2(TFPI-2),澱粉樣P-蛋白前體(APPP)，抑酶肽和胎盤bikunin。TFPI,即一種外源性途徑抑制劑和天然抗凝劑，含有3個串聯連接的Kunitz抑制劑結構域。氨基末端的Kunitz結構域抑制因子VIIa,纖溶酶，和組織蛋白酶G;第二個結構域抑制因子Xa,胰蛋白酶，和胰凝乳蛋白酶；第三個結構域無已知活性(Petersen等，出處同上)。以前的一些研究證實了Kunitz結構域肽對絲氨酸蛋白酶的抑制活性。在下面的段落中討論諸如血漿激肽釋放酶，纖溶酶，和嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的絲氨酸蛋白酶被Kunitz結構域肽抑制的研究結果。血漿激肽釋放酶抑制劑激肽釋放酶是在組織和血漿中都可發現的絲氨酸蛋白酶[參見，例如，Markland的美國專利號6,333,402,在此以其整體引用以供參考]。血漿激肽釋放酶與接觸激活(內源性途徑)凝血，纖維蛋白溶解，低血壓，和炎症相關[參見Bhoola，K.D.，C.D.Figueroa，和K.Worthy,PharmacologicalReviews(1992)44(1)1-80]。激肽釋放酶的這些效果通過3種不同生理底物的活性介導i)因子XII(凝血)，ii)尿激酶原/纖溶酶原(纖維蛋白溶解)，和iii)激肽原(低血壓和炎症)。激肽釋放酶裂解激肽原導致產生激肽，即小的高效生物活性肽。激肽通過細胞表面受體起作用，該受體稱為BK-1和BK-2，存在於包括內皮，上皮，平滑肌，神經，腺和造血細胞的各種細胞類型中。細胞內異源三聚體G-蛋白連接激肽受體與包括氧化氮，腺苷酸環化酶，磷脂酶A2和磷脂酶C的第二信使途徑。激肽的重要生理活性包括(i)增加血管透性；(ii)血管舒張；(iii)支氣管痙攣；和(iv)誘導疼痛。因此，激肽介導與菌血症(膿毒)或外傷相關的威脅生命的血管中風和水腫，哮喘的水腫和導氣管反應過強，與組織損傷相關的炎症和神經性疼痛。血漿激肽釋放酶活性不當並導致激肽產生的後果在遺傳性血管水腫(HAE)患者中有明顯表現。HAE由Cl-抑制劑，即血漿激肽釋放酶的主要內源性抑制劑的遺傳缺陷引起。HAE的症狀包括皮膚，皮下組織和胃腸道的水腫，腹痛和嘔吐。幾乎三分之一的HAE患者由於喉頭和上呼吸道水腫引起的窒息死亡。激肽釋放酶以酶原(前激肽釋放酶)形式分泌，該酶原作為無活性分子循環直到由蛋白水解事件活化[Genebank登錄號P03952顯示了人血漿前激肽釋放酶]。體內血漿激肽釋放酶(pKA)的一種重要抑制劑是Cl抑制劑；(參見Schmier,等，《HemostasisandThrombosis》第2章，"接觸活化及其異常，，，Colman，RW，JHirsh,VJMarder,和EWSalzman編，第二版，1987，J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA.,第27-28頁)。Cl是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑且與pKA形成不可逆或幾乎不可逆的複合物。儘管牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(也稱為BPTI,抑酶肽，或TrasylolTM)最初認為是Ki-320pM的強pKA抑制劑[Auerswald，E.-A.，D.Hoerlein,G.Reinhardt,W.Schroder,和E.Schnabel,Bio.Chem.Hoppe-Seyler，(1988),369(Supplement):27-35],但是最近的報導[Berndt,等，Biochemistry,32:4564-70,1993]表明其對血漿激肽釋放酶的Ki為30nM(即，30,000pM)。G36S突變型具有超過500nM的K"Markland等[美國專利號6,333,402;5,994,125;6,057,287;和5，795，865;各文獻以其整體在此引用以供參考]要求保護在抑制人血漿激肽釋放酶中具有高親和力和特異性的許多衍生物。一種這類蛋白質在患有HAE的人類患者中進行試驗。儘管以前表明該化合物是安全和有效的，但是作用的持續時間比期望的要短。纖溶酶抑制劑纖溶酶是纖溶酶原產生的絲氨酸蛋白酶。纖溶酶的催化區(或"CatDom")裂解肽鍵，特別是在精氨酸殘基之後的肽鍵且在賴氨酸之後的裂解程度較小，該催化區與胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，激肽釋放酶，和許多其它的絲氨酸蛋白酶具有高度同源性。纖溶酶的最大特異性由血纖蛋白的kringles結合產生(Lucas等，JBiologicalChem(1983)258(7)4249-56;Varadi&Patthy，Biochemistry(1983)22:2440-2446;和Varadi&Patthy,Biochemistry(1984)23:2108-2112)。活化時，裂解ARGs6廣Val562之間的鍵，使得新產生的游離氨基末端形成鹽橋。然而，kringles通過兩個二硫鍵保持附著到CatDom上(Colman，RW，JHirsh,VJMarder，和EWSalzman編，《HemostasisandThrombosis》，第二版,1987，LB.LippincottCompany,Philadelphia,Pa.，Bobbins,1987，出處同上)。主要負責纖維蛋白溶解的試劑是纖溶酶，即纖溶酶原的活化形式。許多物質可活化纖溶酶原，包括活化的Hageman因子，鏈激酶，尿激酶(uPA)，組織型纖溶酶原激活劑(tPA)，和血漿激肽釋放酶(pKA)。pKA是尿激酶的酶原形式的激活劑和直接的纖溶酶原激活劑。纖溶酶在正常循環血液中檢測不到，但是纖溶酶原，即酶原以大約3(iM存在。另一含量不可測的纖溶酶原與血纖蛋白和細胞外基質和細胞表面的其它成份結合。正常血液含有大約2pM的纖溶酶生理抑制劑，(X2-纖溶酶抑制劑((X2-PI)。纖溶酶與Ot2-PI形成1:1的複合物。基質或細胞結合的纖溶酶相對難以受到OC2-PI的抑制。因此，纖溶酶的活化可超出OC2-PI的中和能力而產生血纖蛋白原裂解狀態。一旦形成，纖溶酶可i)降解血纖蛋白凝血塊，有時過早降解凝血塊；ii)消化血纖蛋白原(凝血塊的組成材料)，通過引起從降解產物形成脆弱的，容易裂解的凝血塊，和通過血纖蛋白原降解產物抑制血小板附著/聚集而削弱止血；iii)直接與血小板相互作用以裂解糖蛋白Ib和1Ib/IIIa,防止附著到高剪切血流區的損傷內皮上並削弱形成血小板栓塞所需的聚集反應(Adelman等,Blood(1986)68(6)1280-1284);iv)通過蛋白水解滅活外源性凝血途徑中的酶，進一步促進蛋白裂解狀態。Robbins(Robbins,《HemostasisandThrombosis》第21章，Colman,R.W.,J.Hirsh,V.J.Marder,和E.W.Salzman編，第二版，1987,J.B,LippincottCompany,Philadelphia,PA)詳細綜述了纖溶酶原-纖溶酶系統。該出版物(即，Colman，R.W.，JHirsh，V,J.Marder,和E.W,Salzman編，《HemostasisandThrombosis》，第二版，1987，J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA)在此引用以供參考。if舉f^溶麻和if舉蛋^^溶席纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解不當導致出血過多是諸如心肺旁路的需要體外循環的手術操作中常見的併發症，且也在血栓溶解療法和特別是肝臟的器官移植中遇到。以出血素質發生率高為特徵的其它臨床病症包括肝硬化，澱粉樣變性，急性早幼粒細胞白血病和實體瘤。恢復止血需要冒著免疫反應和接觸諸如肝炎病毒和HIV的病原體的風險輸注血漿和/或血漿產品o甚至大量灌注高度失血亦可抵抗稀釋。當判斷有生命危險時，用諸如c畫氨基己酸(參見Hoover等，Biochemistry(1993)32:10936-43)(EACA),氨曱環酸(tranexarnicacid),和抑肽酶(Neuhaus等，Lancet(1989)2(8668)924-5)的抗纖維蛋白溶是纖溶酶的直接抑制劑且是這些試劑中最有效的。由於存在血栓形成併發症，腎臟毒性，和對於BPTI有免疫原性的可能性，這些試劑需慎重使用且通常用作"最後手段(lastresort)"(Putterman，ActaChirScand(1989)155(6-7)367)。這三種抗纖維蛋白溶解劑都缺乏靶特異性和親和性且通過未鑑定的代謝途徑與組織和器官相互作用。由於親和性低需要大劑量，由於缺乏特異性而引起副作用，和存在免疫反應和器官/組織毒性的可能性增大了使用這些抗纖維蛋白溶解劑預防出血或作為常規手術後療法避免或減少輸血治療的爭議。因此，需要一種安全的抗纖維蛋白溶解劑。該試劑的必要特性有i)中和相關靶纖維蛋白溶解酶；ii)以高親和性與靶酶結合以最小化劑量；iii)對靶具有高度特異性以減小副作用；和iv)與人蛋白質具有高度相似性以最小化可能的免疫原性和器官/組織毒性。作為被有效抗纖維蛋白溶解劑抑制的候選靶的所有纖維蛋白溶解酶都是胰凝乳蛋白酶同源的絲氨酸蛋白酶。凝血活性缺陷，纖維蛋白溶解活性升高，或兩種情況相結合可引起出血過多。在大多數出血素質中必須控制纖溶酶的活性。據認為在減少失血中BPTI的臨床上有益的效果由其對纖溶酶(Ki0.3nM)或血漿激肽釋放酶(Ki~100nM)或者兩種酶的抑制產生。Garddl[Toxicol.Pathol.(1993)21(2)190-8]綜述了通常使用的血栓溶解劑，並闡明儘管血栓溶解劑(例如，tPA)確實可開通血管，但是出血過多是一個嚴重的安全問題。儘管tPA和鏈激酶具有短的血漿半衰期，但是它們活化的纖溶酶在系統中保持較長的時間，且正如所述，該系統可能存在纖溶酶抑制劑缺陷。因此，纖溶酶原過度活化可導致危險的凝血無力和有害的或致命的出血。一種有效的，高特異性的纖溶酶抑制劑在這種情況下將是有用的。BPTI是一種有效的纖溶酶抑制劑。然而，已發現其抗原性足夠大以致於第二次使用需要進行皮試。另外，控制出血所需的BPTI劑量相當高且作用機制不清楚。有人認為BPTI對纖溶酶起作用，而其他人認為它通過抑制血漿激肽釋放酶起作用。Fraedrich等[ThoracCardiovascSurg(1989)37(2)89-91]報導了對80個心臟打開手術患者使用大約840mg劑量的BPTI減少幾乎一半的失血，且平均輸血量減少74%。MilesInc.最近在美國引入TmsylolTM以減少手術出血[參見Miles關於Trasylol的產品宣傳冊，在此引用以供參考]。Lohmann和Marshal[RefractCornealSurg(1993)9(4)300-2]表明纖溶酶抑制劑可用於控制眼科手術中的出血。Sheridan等[DisColonRectum(1989)32(6)505-8]報導了BPTI可用於限制結腸手術中的出血。與BPTI幾乎一樣有效或者更有效但與人蛋白區幾乎相同的纖溶酶抑制劑可提供相似的治療潛力但產生的抗原性潛力更小。纖溶酶是血管生成中的關鍵酶。O'Reilly等[Cell(1994)79:315-328]報導了纖溶酶的38kDa片斷(缺少催化區)是一種有效的轉移抑制劑，表明抑制纖溶酶在阻斷腫瘤轉移中有用[Fidler&Ellis,Cell(1994)79:185-188;也參見Ellis等，AnnNYAcadSci(1992)667:13-31;O'Reilly等，Fidler&Ellis,和Ellis等，在此引用以供參考]。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制嚢性纖維變性是一種影響肺，胃腸，和生殖系統的遺傳性常染色體隱性疾病。在全世界有80,000例流行，CF的發病率估計為每3500人中有1例[嚢性纖維變性基金會，iJeg^o^j""wa/iepo",Bethesda，Maryland,1999年9月]。CF中的遺傳缺陷在1989年描述為在508位置缺失單個苯丙氨酸(AF508)，產生缺陷型嚢性纖維變性跨膜傳導調節蛋白(CFTR)，它可抑制Cr(和由此引起的Na+和水)的再吸收[Rommens，J.M.，等，"嚢性纖維變性基因的鑑定:染色體步查和跳查"，>SWe"ce245:1059,1989;Riordan，J,R.,等，"嚢性纖維變性基因的鑑定克隆和互補DNA",Sc/e"ce245:1066,1989;Kerem，B.,等，"嚢性纖維變性基因的鑑定遺傳分析"，Sc/e"ce245:1073,1989]。在CFTR中發現了非AF508的突變且可引起CF。乾燥的粘液隨後可能堵塞呼吸，胃腸，和生殖系統中的許多通道。CF中75%以上的死亡率由呼吸併發症引起[嚢性纖維變性基金會，ieg&^j;799S^wwa/DatoiepoW,Bethesda,Maryland,1999年9月]。儘管在cf個體中出生前存在胰腺，肝臟，和腸疾病，但是cf的肺在出生時是正常的，直到受到感染和炎症攻擊。隨後，cf肺中的cr再吸收缺陷導致通過從導氣管取走鈉，伴隨著隨後被動取走水引起導氣管分泌物乾燥。然後乾燥的分泌物可通過將細菌截留在非常適合於不同微生物病原體定居的環境中而幹擾黏膜纖毛的清除作用[Reynolds,H.Y.,等，"黏膜綠膿假單胞菌(屍"M^mo"osawMg/"o^):患有慢性肺疾病的青年中嚢性纖維變性的徵兆",JAMA236:2190,1976]。繼發的肺感染和炎症募集並活化可釋放嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的嗜中性粒細胞。在呼吸上皮表面嗜中性粒細胞主導的炎症產生嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的慢性上皮負擔。CF肺內過量的NE迅速超過內源性抗蛋白酶。另外，NE刺激促炎介質的產生並裂解補體受體和IgG,從而削弱宿主防止更多細菌定居的防禦機制[Tosi，M.F.，等，"嗜中性粒細胞彈性蛋白酶裂解調理的假單胞菌屬(屍^^fomo"05)上的C3bi和嗜中性粒細胞上的CR1以產生功能重要的調理素受體錯配"，C//"./"veW.86:300，1990]。感染因此變得更持久，且^t動進行的炎症和過量水平的NE破壞導氣管上皮，引起支氣管擴張，和肺功能的進行性喪失和死亡。對患有CF的患者的一種治療方案是通過諸如妥布黴素和ciprofloxin的系統抗微生物劑消滅CF病原體。儘管這些特定的抗微生物劑表現出在清除感染和改善肺功能中有效，但是分別在7.5%和9.6%的CF患者中報導了對妥布黴素和dprofloxin具有抗生素抗性[嚢性纖維變性基金會，戶a"en/^egW77^5^"m^/Datoiepc^，Bethesda,Maryland,1999年9月]。在CF患者中60%感染綠膿假單胞菌(戶^n^/wwfl)且41%感染金黃色釀膿葡萄球菌(S.aw^M),隨著對CF使用這些抗微生物劑的增加，藥物抗性選擇壓力也增力口。在患有CF的患者中肺功能也是治療的目標。Pulmozymes(鏈球菌DNA酶a),即一種通過水解痰中的DNA降低粘液粘彈性的重組人脫氧核糖核酸酶，在臨床試—險中已表明治療8天後可增加FEV,和FVC。該變化持續6個月，並伴隨著靜脈內抗生素使用的減少[Fuchs，H.L.,等，"煙霧化重組人脫氧核糖核酸酶對呼吸症狀加重和嚢性纖維變性患者肺功能的效果"，iV.￡"g/.331:637-642,1994]。另一治療方案是使用蛋白酶抑制劑消除NE對彈性蛋白酶降解及其後遺症的直接影響。中和過多的NE可恢復正常體內平衡，保護細胞外肺基質。肺內正常的抗蛋白酶活性可保護彈性蛋白，通過減少嗜中性粒細胞反應降低粘液粘度，並保護肺功能，從而降低CF的死亡率。另外，恢復補體介導的吞噬作用可允許免疫系統清除細菌性病原體，導致肺感染的發生率，持續時間，和嚴重性降低。例如，在CF的大鼠模型中，用od抗胰蛋白酶治療7天後細菌數與安慰劑組中的85±21相比減少到0.2士0.4[Cantin,A.和Woods,D,"慢性綠膿假單胞菌肺感染模型中煙霧化的Prolastin抑制細菌增殖"，爿m7A，>"0〃160:1130-1136,1999]。本發明小結本發明涉及含有與白蛋白融合的Kunitz結構域肽的蛋白質。這些融合蛋白本文統稱為"本發明的白蛋白融合蛋白"。本發明的這些融合蛋白表現出體內半衰期延長和/或在溶液中的治療活性延長。本發明包含治療性白蛋白融合蛋白，組合物，藥用組合物，劑型和試劑盒。本發明還包含編碼本發明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，用這些核酸和載體轉化的宿主細胞，和使用這些核酸，載體，和/或宿主細胞製備本發明的白蛋白融合蛋白的方法。本發明的一個目的是提供含有Kunitz結構域肽或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白。用於該白蛋白融合蛋白的合適的Kunitz結構域肽包括DX-890，DX-88,DX-1000，和DPI-14。Kunitz結構域肽部分任選可通過接頭與白蛋白部分隔開。本發明的另一目的是提供包含白蛋白融合蛋白以抑制絲氨酸蛋白酶的組合物和方法，該絲氨酸蛋白酶的非限制性例子包括血漿激肽釋放酶，纖溶酶和嗜中性粒細胞彈性蛋白酶。本發明的另一方面是提供含有至少兩個Kunitz結構域肽或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中至少一個Kunitz結構域肽或片斷或變異體具有諸如抑制纖溶酶，激肽釋放酶，或人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的功能活性。本發明還有另一方面是提供含有Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白具有白蛋白活性，與未融合狀態下的Kunitz結構域肽或其片斷或變異體的體內半衰期相比，該白蛋白活性可延長諸如DX-8卯，DX-88,DX-1000,和DPI-14的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體的體內半衰期。本發明還有另一方面是提供含有Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中本發明的白蛋白融合蛋白在生理學pH下溶解度增加。本發明的另一方面是提供含有Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體與白蛋白N-末端或與白蛋白片斷或變異體的N-末端融合。作為選擇，本發明還提供了含有Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體與白蛋白C-末端或與白蛋白片斷或變異體的C-末端融合。本發明還提供了含有白蛋白融合蛋白和藥用上可接受的載體的組合物。本發明的另一目的是提供治療患有嚢性纖維變性，嚢性纖維變性相關性疾病或紊亂，或可用包含DX-890和/或DPI-14的Kunitz結構域肽調節的疾病或紊亂的患者的方法。該方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步驟，該白蛋白融合蛋白含有包含DX-890和/或DPI-14的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。本發明的另一目的是提供治療患有遺傳性血管性水腫，遺傳性血管性水腫相關的疾病或紊亂，或可用諸如DX-88的Kunitz結構域肽調節的疾病的患者的方法。該方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步驟，其中該白蛋白融合蛋白含有包含DX-88的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。本發明的一個目的是提供治療患有癌症，癌症相關的疾病，出血，或可用諸如DX-1000的Kunitz結構域肽調節的疾病的患者的方法。該方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步驟，其中該白蛋白融合蛋白含有包含DX-1000的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。本發明的另一目的是提供含有編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列的核酸分子，以及含有該核酸分子的載體。本發明還提供了製備白蛋白融合蛋白的方法，其中該方法包括(a)提供在生物體中可表達的含有編碼白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在該生物體中表達該核酸以形成白蛋白融合蛋白；和(c)純化該白蛋白融合蛋白。附圖的簡要描述圖1:DX-890和DX-8卯-HAS融合蛋白的Ki測量。圖2:^I-DX-890(左側)和125I-DX-890-HAS融合蛋白(右側)的血漿清除率曲線。圖3:在SE-HPLC(Superose-12)上的正常小鼠血漿中的125I-DX890。圖4:正常小鼠血漿中125I-HAS-DX890的SE-HPLC(Superose-12)圖譜。圖5:1251標記的DX-890和HSA-DX-8卯在兔中的血漿清除率。圖6:兔血漿樣品的SEC分析。本發明的詳細描述本發明涉及白蛋白融合的Kunitz結構域肽。本發明還涉及雙功能(或多功能)融合蛋白，其中白蛋白與兩個(或多個)Kunitz結構域肽，任選不同的Kunitz結構域肽偶連。具有不同Kunitz結構域肽的該雙功能(或多功能)融合蛋白與僅包含一種類型的Kunitz結構域肽的白蛋白融合蛋白相比預期具有改進的藥物抗性譜。某些情況下可能需要抑制兩種或多種蛋白酶且融合多個Kunitz結構域允許一種化合物可用於抑制兩種或多種蛋白酶。作為選擇，可融合兩個或多個Kunitz結構域，各結構域針對相同的蛋白酶以便增加每克的抑制劑活性。具有兩個Kunitz結構域的抑制劑的一種有用的形式是K1::SA::K2，其中Kq和&是Kunitz結構域且SA是血清白蛋白或其主要部分。該雙功能(或多功能)融合蛋白與僅包含一種類型的Kunitz結構域肽的白蛋白融合蛋白相比也可表現出協同效應。另外，可將化學實體共價附著到本發明的融合蛋白上以增強生物學活性或調節生物學活性。本發明的白蛋白融合蛋白預期可延長Kunitz結構域肽的體內半衰期。所述白蛋白融合肽的體外或體內半衰期比缺少該連接的白蛋白的肽的半衰期延長2倍，或5倍，或更多。另外，至少部分由於該肽的半衰期增加，預期本發明的白蛋白融合蛋白可減少該治療肽的給藥安排頻率。與缺少連接白蛋白的治療肽的給藥安排頻率(thefrequencyofthedosingschedule)相比，該給藥安排頻率減少至少四分之一或者至少一半。本發明的白蛋白融合蛋白可延長該肽的儲存期(shelflife),和/或穩定該肽和/或其在溶液中(或在藥用組合物中)的體外和/或體內活性。可作為治療劑的這些白蛋白融合蛋白預期可減少這樣的需要，即需要用大量過量的載體蛋白(例如未融合的白蛋白)配製蛋白質溶液以防止由諸如非特異性結合的因素引起的蛋白質損失。本發明還包含編碼白蛋白融合蛋白的核酸分子以及含有這些核酸的載體，用這些核酸載體轉化的宿主細胞，和使用這些核酸，載體，和/或宿主細胞製備本發明的白蛋白融合蛋白的方法。本發明還包括修飾成含有本發明的核酸分子，任選修飾成表達由該核酸分子編碼的白蛋白融合蛋白的轉基因生物。白蛋白朮語人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可交換使用。術語"白蛋白，，和"血清白蛋白，，範圍更寬，且包含人血清白蛋白(和其片斷和變異體)以及來自其它物種的白蛋白(和其片斷和變異體)。本文使用的"白蛋白"統指具有白蛋白的一種或更多種功能活性(例如，生物學活性)的白蛋白蛋白質或胺基酸序列，或白蛋白片斷或變異體。具體地說，"白蛋白"是指人白蛋白或其片斷(參見EP201,239，EP322,094,WO97/24445,W095/23857),特別是本文SEQIDNO:18和美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480的表1和SEQIDNO:18所示的人白蛋白的成熟形式或來自其它脊推動物的白蛋白或其片斷，或這些分子的類似物或變異體或其片斷。本發明的白蛋白融合蛋白中使用的人血清白蛋白蛋白質參照SEQIDNO:18含有一組或兩組下列點突變組Leu-407突變成Ala,Leu-408突變成Val，Val-409突變成Ala，和Arg-410突變成Ala;或Arg-410突變成Ala,Lys-413突變成Gin,和Lys-414突變成Gln(參見，例如，國際公開號W095/23857,本文以其整體在此引用以供參考)。在一些實施方案中，含有一組或兩組上述點突變組的本發明的白蛋白融合蛋白對酵母Yap3p蛋白水解裂解的穩定性/抗性增強，使得在酵母宿主細胞中表達的重組白蛋白融合本文使用的足以延長或延續該治療性蛋白的體內半衰期，治療活性，或儲存期的白蛋白部分是指與非融合狀態的治療性蛋白質的體內半衰期，治療活性，或儲存期相比在長度或結構上足以穩定，延長或延續該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分的體內半衰期，治療活性或儲存期的白蛋白部分。該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含上述HA序列的全長，或者可包含能夠穩定或延長該治療活性的其一個或多個片斷。該片斷可具有10個或更多個胺基酸的長度或者可包括HA序列的大約15,20，25，30，50，或更多個連續的胺基酸或者可包括部分或全部的HA特異性結構域。本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的變異體。本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分也可以是本文所述的治療性蛋白質的變異體。術語"變異體"包括插入，缺失和取代，包括保守的或非保守的取代，其中該變異基本上不改變一種或多種白蛋白的親瘤性(oncotic)，有用的配體結合和非免疫原性特性，或給治療性蛋白賦予治療活性的活性位點，或活性結構域。具體地說，本發明的白蛋白融合蛋白可包括人白蛋白的天然存在的多態性變異體和人白蛋白的片斷，例如在EP322,094中公開的那些片斷(即HA(Pn)，其中n是369至419)。該白蛋白可來自於任何脊推動物，特別是任何哺乳動物，例如人，奶牛，綿羊，或豬。非哺乳動物白蛋白包括，但不限於，雞和鮭魚。該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可與治療性蛋白部分來自於不同的動物。一般來說，HA片斷或變異體有至少100個胺基酸長，例如，至少150個胺基酸長。HA變異體由HA的至少一個完整結構域組成或任選包含HA的至少一個完整結構域，例如結構域l(SEQIDNO:18的胺基酸1-194)，2(SEQIDNO:18的胺基酸195-387)，3(SEQIDNO:18的胺基酸388-585)，l+2(SEQIDNO:18的1-387),2+3(SEQIDNO:18的195-585)或l+3(SEQIDNO:18的胺基酸1-194+SEQIDNO:18的胺基酸388-585)。各結構域本身由兩個同源性亞結構域，即1-105,120-194，195-291，316-387,388-491和512-585組成，具有包含殘基Lys106至Glul19,Glu292至Val315和Glu492至Ala511的亞結構域間的彈性接頭區。本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含HA的至少一個亞結構域或結構域或其保守修飾。如果該融合蛋白以亞結構域為基礎，任選可使用一些或全部相鄰接頭與治療性蛋白半分子相連。白蛋白融合蛋白本發明一般涉及白蛋白融合蛋白和治療，預防，或改善疾病或紊亂的方法。本文使用的"白蛋白融合蛋白"是指由至少一個分子的白蛋白(或其片斷或變異體)與至少一個分子的治療性蛋白(或其片斷或變異體)融合形成的蛋白質。本發明的白蛋白融合蛋白包含互相結合，例如互相通過遺傳融合(即該白蛋白融合蛋白通過翻譯核酸產生，在該核酸中編碼全部或部分治療性蛋白的多核苷酸與編碼全部或部分白蛋白的多核苷酸在閱讀框內連接)的治療性蛋白的至少一個片斷或變異體和人血清白蛋白的至少一個片斷或變異體。治療性蛋白質和白蛋白蛋白質，即白蛋白融合蛋白的一個部分可稱為白蛋白融合蛋白的"部分"，"區域"，或"半分子"。在一個實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質和血清白蛋白蛋白質，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在另一實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質的生物活性和/或治療活性片斷和血清白蛋白蛋白質，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在另一實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質的生物活性和/或治療活性變異體和血清白蛋白蛋白質，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在一些實施方案中，白蛋白融合蛋白的該血清白蛋白蛋白質組件是血清白蛋白的成熟部分。在另一實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性片斷，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在另一實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性變異體，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在某些實施方案中，白蛋白融合蛋白的該治療性蛋白質部分是治療性蛋白質的成熟部分。在另一實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質的生物活性和/或治療活性片斷或變異體和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性片斷或變異體，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在某些實施方案中，本發明提供了包含治療性蛋白質的成熟部分和血清白蛋白的成熟部分，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。該白蛋白融合蛋白包含HA作為N-端部分，和治療性蛋白質作為C-末端部分。作為選擇，也可使用包含HA作為C-端部分，和治療性蛋白質作為N-末端部分的白蛋白融合蛋白。在另一實施方案中，該白蛋白融合蛋白具有與白蛋白N-末端和C-末端都融合的治療性蛋白質。在一個實施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是相同的治療性蛋白質。在另一實施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是不同的治療性蛋白質。在另一實施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是可用於治療或預防相同疾病，紊亂或症狀的不同治療性蛋白質。在一些實施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質是可用於治療或預防本領域已知通常在患者中同時發生的疾病或紊亂的不同治療性蛋白質。除了白蛋白部分與治療性蛋白部分的N-末端和/或C-末端融合外，本發明的白蛋白融合蛋白也可通過將目的治療性蛋白或肽插入HA的內部區域產生。例如，在HA分子的蛋白質序列內，在a-螺旋的末端和開始之間存在許多環和轉角，它們通過二硫鍵穩定。從HA的晶體結構測定的環(PDB標識符1A06,1BJ5，1BKE，1BM0,1E7E至1E7I和1U0R)大部分從該分子的主體延伸出去。這些環用於插入，或內部融合治療性活性肽，特別是那些需要二級結構發揮功能的肽，或者治療性蛋白質，以便基本上產生具有特定生物學活性的白蛋白分子。可插入肽或多肽以產生本發明的白蛋白融合蛋白的人白蛋白結構中的環包括Val54-Asn61，Thr76-Asp89，Ala92-Glu100，Glnl70-Ala176，His247-Glu252，Glu266-Glu277，Glu280-His288,Ala362-Glu368，Lys439-Pro447，Val462-Lys475,Thr478-Pro486，和Lys560-Thr566。在其它實施方案中，將肽或多肽插入成熟人白蛋白的Val54-Asn61,Glnl70-Ala176,和/或Lys560-Thr566環中(表l)(SEQIDNO:18)。插入的治療性蛋白質可來自任一來源，包括篩選特異性生物學活性的噬菌體展示和合成肽文庫，或者來自具有所需功能的分子的活性部分。另外，含有用作治療性蛋白質的候選物的包含Kunitz結構域肽的隨機肽文庫可在特定環內或者通過將該隨機化肽插入HA分子的特定環中產生，其中提供了胺基酸的許多(例如，5xl0"組合。通過下列方法之一可在HA或HA的結構域片斷上產生該文庫(a)隨機突變HA或HA結構域片斷的一個或多個肽環內的胺基酸。以該方式可突變環內的一個，一個以上或全部殘基；(b)用長度Xn(其中X是胺基酸且n是殘基數目)的隨機肽取代，或插入進HA或HA結構域片斷的一個或多個環(即，內部融合)；(c)除了(a)和/或(b)夕卜的N-,C-或N-和C-末端肽/蛋白融合。結構域片斷也可使得該HA或HA結構域片斷具有多功能。插入人血清白蛋白環中的肽的非限制性例子有DX-8卯(人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑)，DPI-14(人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑)，DX-88肽(人血漿激肽釋放酶抑制劑，表2)，和DX-1000(人纖溶酶抑制劑，表2)或其肽片斷或肽變異體。更具體的說，本發明涉及白蛋白融合蛋白，它含有插入人血清白蛋白環中的至少7，至少8,至少9,至少10,至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30,至少35，或至少40個胺基酸長的肽片斷或肽變異體。本發明還涉及這樣的白蛋白融合蛋白，它含有與人血清白蛋白N-末端融合的至少7,至少8，至少9,至少10，至少11,至少12,至少13,至少14,至少15，至少20,至少25,至少30,至少35，或至少40個胺基酸長的肽片斷或肽變異體。本發明還涉及這樣的白蛋白融合蛋白，它含有與人血清白蛋白C-末端融合的至少7，至少8,至少9,至少10，至少11，至少12,至少13，至少14，至少15，至少20,至少25，至少30，至少35，或至少40個胺基酸的肽片斷或肽變異體。一般來說，本發明的白蛋白融合蛋白可具有一個來自HA的區域和一個來自治療性蛋白質的區域。然而，可使用各蛋白質的多個區域來製備本發明的白蛋白融合蛋白。同樣，可使用一個以上的治療性蛋白質來製備本發明的白蛋白融合蛋白。例如，治療性蛋白質可與HA的N-末端和C-末端都融合。在該構型中，治療性蛋白質部分可以是相同或不同的治療性蛋白質分子。雙功能白蛋白融合蛋白的結構可表示為X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-X-Y-HA或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA-Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多種組合或在HA序列的任何位置內插入X和/或Y。涉及諸如Kunitz結構域的治療性蛋白質"X"，和治療性肽"Y"的其它實施方案涉及將HA分隔成部分1和2。本發明的融合蛋白可具有形式X-HA(部分l)-Y-HA(部分2)和HA(部分l)-Y-HA(部分2)-X。其它實施方案涉及兩個治療性蛋白質結構域"X"和"Z，，和治療性肽"Y",產生具有下列形式的融合蛋白X-HA(部分l)-Y-HA(部分2)-Z和Z-HA(部分1)-Y-HA(部分2)-X。可根據功能，半衰期，等以各種比率製備雙或多功能白蛋白融合蛋白。雙或多功能白蛋白融合蛋白也可製備成通過HA另一端的蛋白質或肽將融合蛋白的治療性蛋白質部分靶向靶器官或細胞類型。作為對融合蛋白的已知治療性分子的另一選擇，可通過篩選將一般6,8,12,20或25或XJ其中X是胺基酸(aa)且n等於殘基數目)的隨機化胺基酸與HA或HA結構域片斷的N-,C-或N-和C-末端融合構建的文庫獲得該肽，且其中允許胺基酸的所有可能的組合。該方案的具體優勢在於可在HA分子上原位選擇該肽，因此該肽的特性是選擇的而不會與通過任何其它方法產生然後連接到HA上的肽的情況一樣可能被修改。與摺疊恰當的結構域，例如HA末端的Kunitz結構域的連接不必進行該選擇。原位選擇對於沒有二硫鍵或單個二硫鍵環的肽可能是重要的。另外，本發明的白蛋白融合蛋白可包括融合部分之間的接頭肽以便在半分子之間提供更大的物理間隔且因此最大化治療性蛋白質部分的可接近性，例如與其關連受體的結合。該接頭肽可由胺基酸組成以便具有彈性或更具有剛性。因此，如上所述，本發明的白蛋白融合蛋白可具有下列通式R2-R1;Rl-R2;R2-R1-R2;R2-L-R1-L-R2;R1-L畫R2;R2-L畫R1;或R1-L隱R2-L-R1，其中Rl是至少一個治療性蛋白，肽或多肽序列(包括其片斷或變異體)，且不必是相同的治療性蛋白，L是接頭且R2是血清白蛋白序列(包括其片斷或變異體)。舉例性的接頭包括(GGGGSV(SEQIDNO:—)或(GGGS)"SEQIDNO:—)或(GGS)n,其中N是大於或等於1的整數且其中G表示甘氨酸，S表示絲氨酸。在某些實施方案中，含有治療性蛋白的本發明的白蛋白融合蛋白與未融合白蛋白的相同治療性蛋白的儲存期或體內半衰期或治療活性相比具有延長的儲存期或體內半衰期或治療活性。儲存期一般是指在溶液或在某種其它貯存劑型中治療性蛋白的治療活性穩定而無過度的治療活性損失的時間期限。許多治療性蛋白質在其未融合狀態下是非常不穩定的。如下所述，這些治療性蛋白質的一般儲存期在摻入本發明的白蛋白融合蛋白時顯著延長。具有"延長"或"延期"儲存期的本發明的白蛋白融合蛋白相對於在相同貯存和處理條件下的標準品表現出更高的治療活性。該標準品可以是未融合的全長治療性蛋白。當白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分是類似物，變異體，或者是改變的或不包括該蛋白的完整序列時，治療活性的延長任選與該類似物，變異體，改變肽或不完整序列的未融合同等物相比較。作為例子，與標準品在給定時間點比較時，本發明的白蛋白融合蛋白保留比在相同貯存和處理條件下的標準品的治療活性高大約100%的治療活性，或高大約105%，110%，120%，130°/。，150%或200%的治療活性。然而，應注意該治療活性取決於該治療性蛋白質的穩定性，且可能低於100%。儲存期也可按相對於貯存開始時的治療活性標準化的，貯存後的治療發明的白蛋白融合蛋白可保留相同條件下同等未融合治療性蛋白質治療活性的超過大約50%的治療活性，大約60%,70%，80%,或90%或更高的治療活性。本發明的白蛋白融合蛋白相對於相同貯存和處理條件下的未融合治療性蛋白質標準品表現出更高的可溶性。治療性蛋白質如上所述，本發明的白蛋白融合蛋白包含通過遺傳融合互相結合的至少治療性蛋白質的片斷或變異體和至少人血清白蛋白的片斷或變異體。本文使用的"治療性蛋白質，，是指Kunitz結構域肽，其非限制性的例子包括DX-890，DPI-14，DX-88或DX-1000,或其具有一種或多種治療和/或生物學活性的片斷或變異體。Kunitz結構域是形成中央反向平行卩摺疊和短C-末端螺旋的大約51-64個殘基的摺疊結構域。該特徵性結構域含有6個半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵，產生雙環結構。在N-末端區和第一個P鏈之間存在活性抑制結合環。該結合環通過P2C14殘基與最後兩個卩鏈之間形成的髮夾環形成二硫鍵。Kunitz結構域是如下通式的從大約51個胺基酸至大約64個胺基酸的多肽formulaseeoriginaldocumentpage24在Cs和C55,Cw和C38,和C30和C5!之間形成二硫鍵。(^4-(:38二硫鍵常見於天然Kunitz結構域，但在人工Kunitz結構域中可去掉。如果C,4變成另一胺基酸類型，那麼(338也改變成非半胱氨酸，反之亦然。可將任一多肽融合到氨基末端。X廠X4可包含0至4個胺基酸。X6-Xu可包含8或9個胺基酸。如果Xw不存在，那麼Xu是Gly。X26a,X26b，和X26c中每一個都可以不存在；即，X5-X3o可包含16，17,18，或19個胺基酸。X33是Phe或Tyr。X39-Xso可包含12,13,14,或15個胺基酸；即，X42a,X42b,和X42c中的每一個都可以不存在。X45是Phe或Tyr。X56-X58可包含0至3個胺基酸。其它半胱氨酸可存在於位置50,53,54或58。任何多肽可融合到羧基末端。表3顯示了21個已知的人Kunitz結構域的胺基酸序列。表3:21個已知的人Kunitz結構域的胺基酸序列tableseeoriginaldocumentpage24tableseeoriginaldocumentpage25tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27表1中的任一結構域都可改造成具有特異性生物學作用(例如抑制特定的蛋白酶)並與HA融合。因此本發明的白蛋白融合蛋白可至少含有治療性蛋白質的片斷或變異體。變異體包括突變體，類似物，和模擬物，以及同源物，包括內源性或天然存在的相關物。表現出"治療活性"的多肽或"治療上有活性"的蛋白質是指具有與諸如本文所述的或者本領域已知的一種或多種治療性蛋白質的治療性蛋白質相關的一種或多種已知生物學和/或治療活性的多肽。作為非限制性例子，"治療性蛋白質"是用於治療，預防或改善疾病，症狀或紊亂的蛋白質。本文使用的"治療活性"或"活性"是指其效果與人體所需的治療結果一致的活性，或者指在非人哺乳動物或在其它物種或生物體中所需的效果。治療活性可在體內或體外測量。例如，可在細胞培養物中測定所需效果。用於本領域所述的許多治療性蛋白質的該體外或細胞培養測定法通常是可獲得的。有用的測定法的例子包括，但不限於，特別是本文作為參考文獻引用的，表4的參考文獻和出版物中所述的，和本文實施例所述的那些測定法。可測量本發明的融合蛋白表現出的活性，例如，通過在體外測定法，例如本文所述的那些測定法中容易完成。使用這些測定法時，可測定這樣的參數，即與治療性蛋白(或其片斷或變異體)未融合到白蛋白上時相比，該融合蛋白表現的相對生物學和/或治療活性。相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分的治療性蛋白可通過連接一個或多個寡糖基團進行修飾。稱為糖基化的該修飾可顯著影響蛋白質的物理特性且在蛋白質的穩定性，分泌，和定位方面是重要的。該修飾在美國臨時申請系列號60/355，547和WOO1/79480中進行了詳細描述，本文引用以供參考。可修飾相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分的治療性蛋白，及其類似物和變異體以改變一個或多個位點的糖基化，該改變可由對其核酸序列的改造，通過表達它們的宿主細胞，或者由於其表達的其它條件引起。例如，通過消除或導入糖基化位點，例如，通過取代或缺失胺基酸殘基，例如用穀氨醯胺取代天冬醯胺，可產生糖基化異構體，或者通過在不能糖基化它們的宿主細胞，例如在大腸桿菌或糖基化缺陷型酵母中表達該蛋白質可產生未糖基化的重組蛋白。這些方法的例子在美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480中進行了更詳細的描述，本文引用以供參考，且它們是本領域已知的。表4提供了相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質的非窮舉性列表。"治療性蛋白質X"欄公開了治療性蛋白質分子，下面的插入語包含科學命名和商標名稱，它包含治療性蛋白質分子或其片斷或變異體，或任選由其組成。本文使用的"治療性蛋白質X"可指單個的治療性蛋白質分子(亦可從CAS和Genbank登錄號獲得的胺基酸序列限定)，或者指與該欄公開的給定治療性蛋白質分子相關的整組治療性蛋白質。與各條目相關的信息分別以其整體引用以供參考，特別是對於其中所述的胺基酸序列。"PCT/專利參考文獻"欄提供了相應於描述該治療性蛋白質分子的專利和/或公開的專利申請的美國專利號，或PCT國際公開號。在"PCT/專利參考文獻"欄中引證的各專利和/或公開的專利申請以其整體在此引用以供參考。具體地說，各引證的"PCT/專利參考文獻"的序列表中描述的特定多肽的胺基酸序列，在例如，各引證的"PCT/專利參考文獻"的詳細描述中描述的這些胺基酸序列的變異體(突變，片斷，等)，在例如，各引證的"PCT/專利參考文獻"的詳細描述中描述的治療適應徵，和在各引證的"PCT/專利參考文獻"的詳細描述，和更具體地說，在實施例中描述的用於特定多肽的活性測定法均在本文中引用以供參考。"生物學活性"欄描述了與治療性蛋白質分子相關的生物學活性。在"相關出版物"欄中引證的各參考文獻以其整體，特別是關於在該文獻中描述(例如，參見方法部分)"優選適應徵(indication)Y"欄描述了可用治療性蛋白質X或含有治療性蛋白質X部分的本發明的白蛋白融合蛋白治療，預防，診斷，或改善的疾病，紊亂，和/或情況。表4:選定的治療性蛋白質列表tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30在各種實施方案中，本發明的白蛋白融合蛋白具有與治療性蛋白質的治療活性和/或生物學活性相應的治療活性和/或生物學活性，該治療性蛋白質相應於表4相應行中所列的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分。(參見，例如，表4的"生物學活性"和"治療性蛋白質X"欄)。在其它實施方案中，本發明的白蛋白融合蛋白的治療活性蛋白部分是參考序列的片斷或變異體且具有表4"生物學活性"欄公開的相應治療蛋白質的治療活性和/或生物學活性。多肽和多核苦酸片斷和變異體^錄本發明還涉及表4所述治療性蛋白質，白蛋白，和/或本發明的白蛋白融合蛋白的片斷。即使從蛋白質的N-末端缺失一個或多個胺基酸導致修改或喪失了該治療性蛋白質，白蛋白，和/或白蛋白融合蛋白的一種或多種生物學功能，但是仍然可保留其它的治療活性和/或功能活性(例如，生物學活性，多聚化能力，結合配體的能力)。例如，當從N-末端去掉完整多肽的不超過大多數的殘基時，一般可保留N-末端缺失的多肽誘導和/或結合抗體的能力，該抗體可識別該多肽的完整或成熟形式。缺失了完整多肽的N-末端殘基的具體多肽是否保留該免疫學活性可通過本文所述或者本領域已知的常規方法容易測定。大量缺失N-末端胺基酸殘基的突變體可保留一些生物學或免疫原性活性也不是不可能的。事實上，由少到6個胺基酸殘基組成的肽通常可誘發免疫反應。因此，相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白的片斷，包括全長蛋白質以及從對照多肽(例如表4公開的治療性蛋白質)的胺基酸序列的氨基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苦酸。另外，相應於本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽的片斷，包括全長蛋白質以及從對照多肽(即，血清白蛋白)的胺基酸序列的氨基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苦酸。另外，本發明的白蛋白融合蛋白的片斷包括全長白蛋白融合蛋白以及從該白蛋白融合蛋白的氨基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，如上所述，即使從對照多肽(例如，治療性蛋白質和/或血清白蛋白)的N-末端或C-末端缺失一個或多個胺基酸導致修改或喪失了該蛋白質的一種或多種生物學功能，但是仍然可保留其它的功能活性(例如，生物學活性，多聚化能力，結合配體的能力)和/或治療活性。例如，當從C-末端去掉完整或成熟多肽的不超過大多數的殘基時，一般可保留C-末端缺失的多肽誘導和/或結合抗體的能力，該抗體可識別該多肽的完整或成熟形式。缺失了對照多肽的N-末端和/或C-末端殘基的具體多肽是否保留治療活性可通過本文所述和/或本領域已知的常規方法容易測定。本發明還提供了從相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質(例如，在表4中提及的治療性蛋白質)的胺基酸序列的羧基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，本發明還提供了從相應於本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如，血清白蛋白)的胺基酸序列的羧基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，本發明還提供了從本發明的白蛋白融合蛋白的羧基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，可聯合任意的上述N-或C-末端缺失以產生N-和C-末端缺失的對照多肽(例如，表4中提及的治療性蛋白質，或血清白蛋白(例如，SEQIDNO:18,表l)，或本發明的白蛋白融合蛋白)。本發明還提供了從氨基和羧基末端都缺失了一個或多個胺基酸的多肽。本發明還包含編碼這些多肽的多核苦酸。本申請還涉及含有與本文所述的對照多肽序列(例如，治療性蛋白質，血清白蛋白或本發明的白蛋白融合蛋白)至少60%,80%,85%,90%，95°/0，96%,97%,98%或99%相同的多肽的蛋白質，或其片斷。在一些實施方案中，本申請涉及含有與上述具有N-和C-末端缺失的胺基酸序列的對照多肽至少80%，85%,90%，95%,96%，97%,98%或99%相同的多肽的蛋白質。本發明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。本發明的其它多肽片斷是包含胺基酸序列，或任選由其組成的片斷，該胺基酸序列表現出治療性蛋白或血清白蛋白的多肽序列的治療活性和/或功能活性(例如生物學活性)，該多肽序列的胺基酸序列是片斷。其它多肽片斷有生物學活性片斷。生物學活性片斷是表現出與本發明的多肽的活性相似，但不必相同的活性的那些片斷。該片斷的生物學活性可包括改進所需的活性，或者降低不需要的活性。史^謬"變異體"是指不同於對照核酸或多肽，但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般來說，變異體與對照核酸或多肽總體上非常相似，且在許多區域相同。本文使用的"變異體"是指在序列上分別不同於治療性蛋白(例如，參見表4的"治療性蛋白X"欄)，白蛋白，和/或本發明的白蛋白融合蛋白，但是保留本文它處所述或者本領域已知的其至少一種功能和/或治療特性(例如，在表4"生物學活性"欄中公開的治療活性和/或生物學活性)的本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分，本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分，或白蛋白融合蛋白。一般來說，變異體與相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白，相應於本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白，和/或本發明的白蛋白融合蛋白的胺基酸序列總體上非常相似，且在許多區域相同。本發明還包含編碼這些變異體的核酸。本發明還涉及包含一種胺基酸序列，或任選由其組成的蛋白質，該胺基酸序列與例如，相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白(例如，在表4的參考文獻中公開的胺基酸序列，或其片斷或變異體)，相應於本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如，表l，或其片斷或變異體)，和/或本發明的白蛋白融合蛋白的胺基酸序列至少60%,80%，85%,90%，95%,96%,97%，98%,99%或100%相同。還提供了這些多肽的片斷(例如，本文公開的那些片斷)。本發明包含的其它多肽是由這樣的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在嚴格雜交條件下(例如，在大約45攝氏度下在6X氯化鈉/種檬酸鈉(SSC)中與結合DNA的濾膜雜交，接著在0.2XSSC,0.1%SDS中在大約50-65才聶氏度下洗滌一次或多次)，在高度嚴格條件下(例如，在大約45攝氏度下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與結合DNA的濾膜雜交，接著在0.1XSSC,0.2%SDS中在大約68攝氏度下洗滌一次或多次)，或者在本領域的技術人員已知的其它嚴格雜交條件下(參見，仿H口，Ausubel，F.M.等，編,1989Cwre"f屍rotoco/A/o/ecw/arB/o/ogV，Greenpublishingassociates,Inc.,andJohnWiley&SonsInc.，NewYork,第6.3.1-6.3.6和2.10.3頁)與編碼本發明的胺基酸序列的核酸分子的互補序列雜交。本發明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。具有與本發明的查詢(query)胺基酸序列至少例如，95%相同的胺基酸序列的多肽，是指除了所述多肽序列在每100個查詢胺基酸序列的胺基酸中包含多達5個胺基酸改變外，所述多肽的胺基酸序列與該查詢序列相同。換句話說，為了獲得具有與查詢胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列的多肽，可插入，缺失，或用另一胺基酸取代所述序列的多達5%的胺基酸殘基。對照序列的這些改變可在對照胺基酸序列的氨基-或羧基末端位置，或者在那些末端位置之間的任何位置發生，可單獨散布在對照序列的殘基中，或者在對照序列內以一個或多個連續組存在。實際上，任何具體多肽與例如，本發明的白蛋白融合蛋白或其片斷(例如該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分或該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)的胺基酸序列是否具有至少60%，80%,85%,90%,95%，96。/。，97%，98%或99%的相同性可使用已知的電腦程式按常規測定。該程序和使用它們的方法在例如，本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480(第41-43頁)中描述，且是本領域熟知的。本發明的多核苷酸變異體可在編碼區，非編碼區，或兩者中都含有改變。多核苷酸變異體包括那些含有這樣的改變的變異體，即該改變產生沉默取代，添加，或缺失，但不改變所編碼的多肽的特性或活性。由於遺傳密碼的筒並性可通過沉默取代產生該核苷酸變異體。多肽變異體包括小於50，小於40,小於30，小於20，小於IO，或5—50,5-25,5-10，1-5,或1-2個胺基酸以任意組合取代，缺失，或添加的那些變異體。多核苷酸變異體可因為各種原因而產生，例如，為了優化特定宿主的密碼子表達(將人mRNA中的密碼子改變成諸如酵母或大腸桿菌的微生物宿主優選的那些密碼子)。在另一實施方案中，可優化編碼本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸用於在酵母或哺乳動物細胞中表達。在還有另一實施方案中，可優化編碼本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的多核苷酸用於在酵母或哺乳動物細胞中表達。在還有另一實施方案中，可優化編碼本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸用於在酵母或哺乳動物細胞中表達。在另一實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分蛋白質的野生型多核苷酸雜交。在另一實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密碼子優化的多核苷酸在本文所述的嚴格雜交條件下不與編碼該白蛋白的野生型多核苷酸雜交。在另一實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的密碼子優化的多核苷酸在本文所述的嚴格雜交條件下不與編碼該治療性蛋白質部分或該白蛋白部分的野生型多核苷酸雜交。在另一實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的多核苷酸不包含該治療性蛋白質天然存在的序列，或者任選不由其組成。在另一實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含該白蛋白天然存在的序列，或者任選不由其組成。在另一實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含該治療性蛋白質部分或該白蛋白部分的天然存在的序列，或者任選不由其組成。在另一實施方案中，該治療性蛋白質可選自通過生物淘選(biopanning)的隨機肽文庫，因為這將沒有天然存在的野生型多核苷酸。天然存在的變異體稱為"等位基因變異體"，且是指佔據生物染色體給定基因座的基因的一些可選擇的形式之一。(GenesII，Lewin,B.，編，JohnWiley&Sons,NewYork(1985))。這些等位基因變異體可在多核苦酸和/或多肽水平上改變且包含在本發明中。另外，通過誘變技術或通過直接合成也可產生非天然存在的變異體。使用蛋白質工程和重組DNA技術的已知方法，可產生變異體以改良或改變本發明多肽的特性。例如，可從本發明的多肽的N-末端或C-末端缺失一個或多個胺基酸而基本上不喪失生物學功能。參見，例如，Ron等(J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(KGF變異體)和Dobeli等，J.Biotechnology7:199-216(1988)(幹擾素y變異體)。另外，大量證據證實了變異體通常保留與天然存在的蛋白質相似的生物學活性(例如Gayle及其同事(J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)(IL-la變異體))。另外，即使從多肽的N-末端或C-末端缺失一個或多個胺基酸導致修改或喪失了一種或多種生物學功能，但是仍然可保留其它的生物學活性。例如，當從N-末端或C-末端去掉分泌形式的小於大多數的殘基時，很可能保留缺失變異體誘導和/或結合可識別該分泌形式的抗體的能力。缺失了蛋白質的N-或C-末端殘基的具體多肽是否保留該免疫學活性可通過本文所述或者本領域已知的常規方法很容易地測定。因此，本發明還包括具有功能活性(例如，生物學活性和/或治療活性)的多肽變異體。在另一實施方案中，本發明提供了具有功能活性(例如，諸如在表4"生物學活性"欄中公開的生物學活性和/或治療活性)的白蛋白融合蛋白的變異體，該功能活性相應於治療性蛋白質的一種或多種生物學和/或治療活性，該治療性蛋白質相應於該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質部分。該變異體包括根據本領域已知的一般規則選擇的缺失，插入，倒位，重複，和取代以便對活性具有很小影響。在另一實施方案中，本發明的變異體具有保守取代。"保守取代"是指在組內的交換，例如脂肪族或疏水胺基酸Ala,Val，Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；醯胺殘基Asn和Gin的取代，鹼性殘基Lys，Arg，和His的取代；芳香殘基Phe,Tyr，和Trp的取代，小的胺基酸Ala，Ser,Thr，Met,和Gly的取代。關於如何製備表型沉默的胺基酸取代的指導在例如，Bowie等，"翻譯蛋白質序列中的信息對胺基酸取代的耐受性"，Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出有兩個主要的策略可用於研究胺基酸序列對於改變的耐受性。按作者所述，蛋白質具有驚人的胺基酸取代耐受性。作者還指出在該蛋白質的某些胺基酸位置很可能允許進行胺基酸改變。例如，大多數隱蔽(buried)(蛋白質的三級結構內)的胺基酸殘基需要非極性側鏈，而一般很少有表面側鏈的特性保守。另外，有耐受性的保守胺基酸取代包含脂肪族或疏水胺基酸Ala,Val,Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；醯胺殘基Asn和Gln的取代，鹼性殘基Lys,Arg,和His的取代；芳香殘基Phe，Tyr，和Trp的取代，小體積胺基酸Ala,Ser，Thr,Met,和Gly的取代。除了保守胺基酸取代外，本發明的變異體包括(i)含有一個或多個非保守胺基酸殘基的取代，其中取代的胺基酸殘基可以是或者不是遺傳密碼編碼的殘基，或(ii)含有一個或多個具有取代基團的胺基酸殘基的取代的多肽，或(iii)與另一化合物，例如增加多肽穩定性和/或可溶性的化合物(例如，聚乙二醇)融合或化學連接的多肽，(iv)含有添加胺基酸的多肽，例如，IgGFc融合區肽。根據本文的教導該變異體多肽認為在本領域的一支術人員的知識範圍內。例如，含有用其它帶電或中性胺基酸取代帶電胺基酸的胺基酸取代的多肽變異體可產生具有改進特性，例如更少聚集的蛋白質。由於聚集體的免疫原性活性，藥用配製品的聚集同時降低了活性且增加了清除率。參見Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbins等，Diabetes,36:838-845(1987);Cldand等，Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSystems10:307-377(1993)。在具體實施方案中，本發明的多肽包含本文所述的治療性蛋白質和/或人血清白蛋白，和/或本發明的白蛋白融合蛋白的胺基酸序列的片斷或變異體，或任選由其組成，其中該片斷或變異體與對照胺基酸序列相比具有1-5,5-10，5-25,5-50,10-50或50-150個胺基酸殘基的添加，取代，和/或缺失。在某些實施方案中，該胺基酸取代是保守的。本發明還包含編碼這些多肽的核酸。本發明的多肽可由通過肽4定或修飾的肽4建，即肽等配物(peptideisosteres)互相連接的胺基酸組成，且可含有20個基因編碼的胺基酸以外的胺基酸。該多肽可通過天然加工，例如翻譯後加工，或者通過本領域熟知的化學修飾技術進行修飾。該修飾在基礎課文和在更詳細的專著，以及在多巻的研究作品中進行了充分的描述。修飾可在包括肽主鏈，胺基酸側鏈和氨基或羧基末端的多肽的任何位置發生。可預料到在給定多肽的一些位點可存在相同或各種程度的相同類型的修飾。另外，給定多肽可含有許多類型的修飾。多肽可以是分支的，例如，由於遍在蛋白化作用，且它們可以是環狀的，含有或不含分支。環狀，分支，和分支環狀的多肽可由翻譯後的天然加工產生或者可通過合成方法製備。修飾包括乙醯化，醯化，ADP-核糖基化，醯胺化，黃素的共價連接，血紅素半分子的共價連接，核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接，脂類或脂類衍生物的共價連接，磷脂醯肌醇的共價連接，交聯，環化，二硫鍵形成，脫曱基化，形成共價交聯，形成半胱氨酸，形成焦穀氨酸，曱醯化，Y-羧基化，糖基化，GPI錨形成，羥基化，碘化，甲基化，十四烷基化，氧化，PEG化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊二烯化，外消旋，硒化，硫酸化，轉移-RNA介導的蛋白質胺基酸添加，例如精胺醯基化，和遍在蛋白化。另外，可將化學實體共價連接到白蛋白融合蛋白上以增強或調節特定功能或生物學活性，例如，通過在CurrentOpinionsinBiotechnology,10:324(1999)中公開的方法。另外，可將靶向實體共價連接到本發明的白蛋白融合蛋白上以便將特定功能或生物學活性靶向某些細胞或階段特異性類型，組織類型或解剖結構。針對本發明的白蛋白融合蛋白，可定位該試劑的作用。另外，該靶向可降低所需的本發明的白蛋白融合蛋白的劑量，因為通過在所需位點積聚本發明的白蛋白融合蛋白，可達到更高的局部濃度。本發明的白蛋白融合蛋白可通過使用交聯劑以及通過在配體是蛋白質時將編碼本發明的白蛋白融合蛋白，或其功能性部分的核苷酸序列克隆到與配體核苷酸序列相鄰，並作為融合蛋白表達該連接物的重組DNA技術與靶向部分連接。本發明包含的另一翻譯後修飾包括，例如，N-連接的或O-連接的糖鏈，N-末端或C-末端的加工，將化學半分子連接到胺基酸主鏈上，化學修飾N-連接或O-連接的糖鏈，和由於原核宿主細胞表達而添加或缺失N-末端曱硫氨酸殘基。該白蛋白融合蛋白還可用4企測標記，例如酶，螢光，同位素或親和性標記^"飾以允許4企測和分離該蛋白質。該《務飾的例子在例如，本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480(第105-106頁)中提供，且是本領域熟知的。功能活性"具有功能活性的多肽"是指能夠表現出與治療性蛋白質的全長，前體蛋白，和/或成熟形式相關的一種或多種已知功能活性的多肽。該功能活性包括，但不限於，生物學活性，酶抑制，抗原性[與抗多肽的抗體結合或與多肽竟爭結合的能力]，免疫原性(產生與本發明的特定多肽結合的抗體的能力)，與本發明的多肽形成多聚體的能力，和與多肽的受體或配體結合的能力。"具有生物學活性的多肽"是指在有或無劑量依賴性的具體生物學試驗中測量時表現出與包括成熟形式的本發明的治療性蛋白的活性相似，但不必相同的活性的多肽。如果存在劑量依賴性，與本發明的多肽相比在給定活性下的劑量依賴性與該肽不必相同，而是基本上相似。在另一實施方案中，本發明的白蛋白融合蛋白具有與未融合到白蛋白上的治療性蛋白(或其片斷或變異體)相關的至少一種生物學和/或治療活性。可使用本領域已知的或按常規改良的測定法，以及本文所述的測定法來測定本發明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物學活性)。具體地說，可使用表4"相關出版物"欄引用的測定法測定白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物學活性或治療活性)。另外，本領域的技術人員可使用在其表4相應行中引用的測定法按常規測定相應於本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質的片斷的活性。另外，本領域的技術人員可使用本領域已知的和/或下面實施例部分所述的測定法按常規測定相應於本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白的片斷的活性。另外，本文所述的(見實施例和表4)或者本領域已知的測定法可按常規用於測量本發明的白蛋白融合蛋白和其片斷，變異體和衍生物誘發與本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分和/或白蛋白部分相關的生物學活性和/或治療活性(體外或體內)的能力。其它方法將是本領域的技術人員已知的且在本發明的範圍內。融合蛋白的表達本發明的白蛋白融合蛋白可作為重組分子從酵母，諸如細菌的微生物，或人或動物細胞系中分泌產生。任選的是，該多肽可從宿主細胞中分泌。為了表達本文舉例的白蛋白融合蛋白，與酵母啟動子，WO90/01063中舉例的HAS/MFa-7融合蛋白前導序列，酵母爿Z)///終止子，丄^72選擇標記和美國專利號5,637,504中舉例的去整合(disintegration)載體pSAC35聯合，成功使用了WO95/33833中舉例的i/5P/50基因分裂的酵母菌抹，或WO00/44772[rHA加工]中舉例的PM77基因分裂的酵母菌抹(用於減少/消除白蛋白融合蛋白的O-連接的糖基化)，或WO95/23857中舉例的E4"基因分裂的酵母菌林。預期可用於本發明的其它酵母菌株，啟動子，前導序列，終止子，標記和載體在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和在WO01/74980(第94-99頁)中描述，且是本領域熟知的。本發明還包括轉化後表達本發明的白蛋白融合蛋白的細胞，任選酵母細胞。除了轉化的宿主細胞本身外，本發明還涉及在營養培養基中的這些細胞的培養物，任選單克隆(克隆同源的)培養物，或從單克隆培養物產生的培養物。如果該多肽是分泌型的，那麼該培養基可含有該多肽，含有該細胞，或者如果它們被過濾或離心掉的話不含該細胞。許多表達系統是已知的且可以使用，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，酵母(例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)和巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris))，絲狀真菌(例如麴黴屬)，植物細胞，動物細月包和昆蟲細月包。目的蛋白可按常規方法生產，例如從插入宿主染色體或者在游離質粒中的編碼序列產生。可用目的蛋白編碼序列以任何常規方法，例如電穿孔五"2^wo/.194,182中公開。成功轉化的細胞，即含有本發明的DNA構建體的細胞可通過熟知技術來鑑定。例如，可生長導入表達構建體所得的細胞以產生目的多肽。使用諸如Southern(1975)JMo/.98,503或Berent等(1985)腸tec/z.3，208所述的方法收穫細胞並裂解，檢查其DNA成份中是否存在該DNA。作為選擇，可使用抗體檢測上清中是否存在該蛋白質。有用的酵母質粒載體包括pRS403-406和pRS413-416且一般可從StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA獲得。質粒pRS403,pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合質粒(YIps)且插入了酵母選擇標記ifZS3，77eP7，丄5^/2和W^3。質粒pRS413-416是酵母著絲粒質粒(YCps)。用於在酵母中表達的製備白蛋白融合蛋白的載體包括pPPC0005,pScCHSA,pScNHSA,和pC4:HSA,它們於2001年4月11日在美國典型培養物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209保藏且在本文作為參考文獻引用的臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480中描述。預期用於在酵母中表達白蛋白融合蛋白的另一載體是pSAC35載體，它在Sleep等，BioTechnology8:42(19卯)中描述，本文以其整體引用以供參考。質粒pSAC35屬於US5,637,504中所述的去整合類載體。接。例如，可將互補同聚物片斷到需要插入載體DNA中的DNA片斷上。然後該載體和DNA片斷通過互補同聚物尾之間的氫4定連接形成重組DNA分子。含有一個或多個限制性位點的合成接頭提供了連接該DNA片斷與載體的另一方法。通過核酸內切酶的限制性消化產生的DNA片斷用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理，該酶用其3'5，-核酸外切活性去掉伸出的，Y-單鏈末端，並用其聚合活性補上3'-凹(recessed)端。因此這些活性的聯合產生平端DNA片斷。然後將該平端片斷與摩爾數大量過剩的接頭分子在諸如噬菌體T4DNA連接酶的能夠催化平端DNA分子連接的酶存在的條件下溫育。因此，該反應產物是在其末端攜帶多聚體接頭序列的DNA片斷。然後用合適的限制性酶裂解這些DNA片斷並與已經用能產生與該DNA片斷匹配的末端的酶裂解的表達載體連接。含有各種限制性核酸內切酶位點的合成接頭可從許多商業來源以商品獲得。例如，如果製備HA變異體，修飾根據本發明的DNA的所需方法是使用Saiki等(1988)Sc/e"ce239,487-491公開的聚合酶鏈式反應。在該方法中，需要酶促擴增的DNA側翼是兩個特異性寡核苷酸引物，該引物本身摻入擴增的DNA中。該特異性引物可含有限制性核酸內切酶識別位點，它可用於使用本領域已知的方法克隆進表達載體中。預期用於實施本發明的作為表達該白蛋白融合蛋白的宿主的酵母舉例性的屬有畢赤氏酵母屬(Pichia)(以前分類為漢遜氏酵母屬(Hansenula)),糖酵母屬(Saccharomyces)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，麴黴屬(Aspergillus),假絲酵母屬(Candida),球擬酵母屬(Torulopsis),有孢圓酵母屬(Tomlaspora)，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)，固嚢酵母屬(Citeromyces)，屍ac/yw/e"，4矣合併唐酵母屬(Zygosaccharomyces),德、巴利氏酵母屬(Debaromyces)，木霧屬(Trichoderma),頭孑包屬(Cephalosporium)，腐質黴屬(H謹icola),白黴屬(Mwco。，鏈孢黴屬(Neurospora)，K2/rcwz'a，梅奇酵母屬(Metschunikowia),糹工冬孑包屬(Rhodosporidium)，丄ewco5/on'd/"w，J5o^yooycz^，鎖扭卩酵母屬(Sporidiobolus),擬內孑包黴屬(Endomycopsis)，等。屬包括選自由糖酵母屬，裂殖糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，畢赤氏酵母屬和有孢圓酵母屬組成的組中的那些屬。糖酵母屬種的例子有啤酒糖酵母，義大利糖酵母(S.italicus)和魯氏糖酵母(S.rouxii)。其它種的例子，和轉化它們的方法在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480(第97-98頁)中描述。轉化啤酒糖酵母的方法在EP251744，EP258067和WO90/01063中有一般性教導，它們都在本文中作為參考文獻引用。用於啤酒糖酵母的合適的啟動子包括與PGW基因，04"或04Z^0基因，CTC/,屍i7(95,7TP/，爿￡>///,甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，丙糖磷酸異構酶，磷酸葡糖異構酶，葡萄糖激酶，a-交配因子信息素，[一種交配因子信息素]的基因相關的那些啟動子，戶朋/啟動子，GLT2啟動子，GPD/啟動子，和包含部分5，調控區與其它啟動子的部分5，調控區或與上遊活化位點的雜合體的雜合啟動子(例如，EP-A-258067的啟動子)。用於粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)的方l更可調啟動子有Maundrell(1990>/歷o/.C7zem.265,10857-10864所述的來自nmt基因的硫胺素抑制型啟動子和Hoffman&Winston(1990)Ge""z'"124,807-816所述的葡萄糖抑制型jbpl基因啟動子。轉化畢赤氏酵母屬用於表達外源性基因的方法在例如，Cregg等(1993)和許多Phillips專利(例如，US4857467，本文作為參考文獻引用)中教導，且畢赤氏酵母屬表達試劑盒可從InvitrogenBV，Leek，Netherlands,和InvitrogenCorp.,SanDiego,California以商品形式買到。合適的啟動子包括AOXI和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol,132,3459-3465包含關於漢遜氏酵母屬載體和轉化的信息，合適的啟動子是MOXl和FMD1;同時EP361991，Fleer等(1991)和來自Rhone-PoulencRorer的其它出版物教導了如何在克魯維氏酵母屬種中表達外源性蛋白質。轉錄終止信號可以是含有合適的轉錄終止和多聚腺香化信號的真核基因的3，側翼序列。合適的3'側翼序列可以是例如，該基因天然連接的所用表達調控序列的那些序列，即與啟動子相應。另外，它們也可以不同，其中任選使用啤酒糖酵母^D/f/基因的終止信號。所需白蛋白融合蛋白開始可用分泌前導序列表達，該前導序列可以是在選定酵母中有效的任何前導序列。在啤酒糖酵母中有用的前導序列包括來自交配因子a多肽(MFoc-l)的前導序列和EP-A-387319的雜合前導序列。該前導序列(或信號)可在成熟白蛋白釋放進周圍培養基前被酵母裂解。另外，該前導序列包括在JP62-096086(授權號為911036516)中公開的啤酒糖酵母轉化酶0St/C2),酸性磷酸酶(PH05)，MFa-l的前序列，0葡聚糖酶(BGL2)和殺傷毒素；糖化糖酵母(S.diastaticus)葡糖澱粉酶II;卡爾斯伯糖酵母(S.Carlsbergensis)a-半乳糖苷酶(MEL1);乳克魯維氏酵母(K.lactis)殺傷毒素；和假絲酵母屬(Candida)葡糖澱粉酶的那些前導序列。,jg和合^^:產冷蛋冷廚合蛋4的^它才法本發明包括編碼本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及含有這些多核苷酸的載體，宿主細胞和生物體。本發明還包括通過合成和重組技術生產本發明的白蛋白融合蛋白的方法。該多核苷酸，載體，宿主細胞，和生物體可通過本領域已知的方法分離和純化。用於本發明的載體可以是，例如，噬菌體，質粒，粘粒，微型染色體，病毒或逆轉錄載體。可用於克隆和/或表達本發明的多核苷酸的載體是在需要複製和/或表達該多核苷酸的宿主細胞中能夠複製和/或表達該多核苷酸的載體。一般來說，多核苦酸和/或載體可用於真核或者原核的任何細胞，包括哺乳動物細胞(例如，人(例如，HeLa),猴(例如，Cos),兔(例如，兔網織紅細胞)，大鼠，倉鼠(例如，CHO,NSO和幼倉鼠腎細胞)或小鼠細胞(例如，L細胞)，植物細胞，酵母細胞，昆蟲細胞或細菌細胞(例如，大腸桿菌)。參見，例如，RAusubel等,Cwrew/7Votoco/s/"Mo/ecw/arA'o/ogy，GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience(1992)和Sambrook等(1989)中用於各種類型的宿主細胞的合適載體的例子。然而，應注意當使用複製缺陷型逆轉錄病毒載體時，病毒增殖一般僅在互補型宿主細胞中發生。可使用含有這些多核苷酸的宿主細胞大量表達該蛋白質用於例如，藥品，診斷試劑，疫苗和治療劑。該蛋白質可通過本領域已知的或者本文描述的方法進行分離和純化。編碼本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可與含有選擇標記的載體連接用於在宿主中增殖。一般來說，可將質粒載體導入諸如磷酸鈣沉澱的沉澱物或者含有帶電脂類的複合物中。如果該載體是病毒，可使用合適的包裝細胞系體外包裝，然後導入宿主細胞中。該多核苷酸插入片斷應與表達該多核苷酸的宿主細胞相容的合適啟動子可操作地連接。該啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。啟動子的例子包括噬菌體XPL啟動子，大腸桿菌/ac，化p，p/2o^和toc啟動子，SV40早期和晚期啟動子和逆轉錄病毒LTRs啟動子，僅列舉幾個例子。其它合適的啟動子是本領域的技術人員已知的。該表達構建體還含有轉錄起始，終止位點，和在轉錄區用於翻譯的核糖體結合位點。該構建體表達的轉錄子的編碼部分可包含在開始處的翻譯起始密碼子和在需要翻譯的多肽末端合適位置的終止密碼子(TAA，TGA或TAG)。正如所述，該表達載體可包含至少一個選擇標記。該標記包括用於真核細胞培養物的二氬葉酸還原酶，G418，穀氨醯胺合酶，或新黴素抗性，和用於培養大腸桿菌和其它細菌的四環素，卡那黴素，或氨苄青黴素抗性基因。合適宿主的代表性例子包括，但不限於，諸如大腸桿菌，鏈黴菌(Streptomyces)屬和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella)細胞的細菌細胞；諸如酵母細胞(例如，啤酒糖酵母或巴斯德畢赤氏酵母(ATCC保藏號201178))的真菌細胞；諸如果蠅S2和SpodopteraSf9細胞的昆蟲細胞；諸如CHO,COS，NSO,293,和Bowes黑素瘤細胞的動物細胞；和植物細胞。用於上述宿主細胞的合適培養基和條件是本領域已知的。在一個實施方案中，編碼本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可與指導本發明的蛋白質定位到原核或真核細胞特定區室和/或指導從原核或真核細胞分泌本發明蛋白質的信號序列融合。例如，在大腸桿菌中，人們可能希望指導該蛋白質表達進壁膜間隙。可融合本發明的白蛋白融合蛋白以指導該多肽表達進細菌壁膜間隙的信號序列或蛋白質(或其片斷)的例子包括，但不限於，pe/j5信號序列，麥芽糖結合蛋白(MBP)信號序列，MBP,owpj信號序列，周質大腸桿菌熱不穩定性腸毒素B-亞基的信號序列，鹼性磷酸酶信號序列。用於構建融合蛋白指導蛋白質定位的一些載體是商業上可獲得的，例如可從NewEnglandBiolabs獲得的pMAL系列載體(特別是pMAL-p系列)。在一個具體實施方案中，本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可與WW果膠酸裂合酶信號序列融合以提高該多肽在革蘭氏陰性細菌中的表達和純化效率。參見，美國專利號5,576,195和5,846,818，本文以其整體引用其內容以供參考。可與本發明的白蛋白融合蛋白融合以介導其在哺乳動物細胞中分泌的信號肽的例子包括，但不限於，MPIF-1信號序列(例如，GenBank登錄號AAB51134的胺基酸l畫21)，stanniocalcin信號序歹'J(MLQNSAVLLLLVISASA,SEQIDNO:一_);和共有信號序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG,SEQIDNO:—)。可用於與杆狀病毒表達系統結合的合適的信號序列是gp67信號序列(例如，GenBank登錄號AAA72759的胺基酸1-19)。使用穀氨醯胺合酶(GS)或DHFR作為選擇標記的載體分別可在藥物曱硫氨酸sulphoximine或氨曱蝶呤存在的條件下擴增。基於穀氨醯胺合酶的載體的一個優勢是可利用穀氨醯胺合酶陰性的細胞系(例如，鼠骨髓瘤細胞系，NSO)。穀氨醯胺合酶表達系統也可通過提供另一抑制劑防止內源性基因的作用而在表達穀氨醯胺合酶的細胞(例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中起作用。穀氨醯胺合酶表達系統及其元件在PCT公開號WO87/04462;WO86/05807;WO89/01036;WO89/10404;和WO91/06657中詳細描述，本文以其整體引用以供參考。另外，穀氨醯胺合酶表達載體也可從LonzaBiologies,Inc.(Portsmouth,NH)獲得。使用GS表達系統在鼠骨髓瘤細胞中表達和生產單克隆抗體在Bebbington等，Ao々ec/z"o/ogv10:169(1992)和在Biblia和Robinson所o&c/z"o/.11:1(1995)中描述，本文引用以供參考。本發明還涉及含有諸如在本文中所述的載體構建體的宿主細胞，且還涉及含有使用本領域已知的技術與一個或多個異源性調控區(例如，啟動子和/或增強子)可操作地相連的本發明的核苷酸序列的宿主細胞。該宿主細胞可以是高等真核細胞，例如哺乳動物細胞(例如，來源於人的細胞)，或低等真核細胞，例如酵母細胞，或者該宿主細胞可以是原核細胞，例如細菌細胞。可選擇能夠控制插入的基因序列表達，或以所需的特定方式修飾和加工該基因產物的宿主菌抹。在某些誘導劑存在時可提高從某些啟動子的表達；因此可控制該遺傳工程多肽的表達。另外，不同宿主細胞具有特徵性和特異性的蛋白質翻譯和翻譯後加工和修飾(例如，磷酸化，裂解)的機制。可選擇合適的細胞系以確保表達的外源性蛋白質的所需修飾和加工。通過磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，陽離子脂類介導的轉染，電穿孔，轉導，感染，或其它方法可實現將本發明的核酸和核酸構建體導入宿主細胞中。該方法在許多標準實驗室手冊，例如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)中描述。特別可預期的是本發明的多肽事實上可通過不含重組載體的宿主細胞表達。除了涉及含有本文討論的載體構建體的宿主細胞外，本發明還涉及改造為缺失或取代內源性遺傳物質(例如，用相應於治療性蛋白的白蛋白融合蛋白取代相應於治療性蛋白的編碼序列)，和/或包含遺傳物質(例如，可包含異源性多核苦酸序列，例如相應於治療性蛋白的本發明的白蛋白融合蛋白)的脊推動物來源，特別是哺乳動物來源的原代，傳代，和永生化宿主細胞。與內源性多核苷酸可操作地相連的遺傳物質可活化，改變，和/或擴增內源性多核苷酸。另外，可使用本領域已知的技術通過同源重組可操作地連接異源性多核芬酸(例如，編碼白蛋白融合蛋白，或其片斷或變異體的多核苷酸)和/或異源性調控區(例如，啟動子和/或增強子)與編碼治療性蛋白的內源性多核苷酸序列(參見，例如，美國專利號5,641,670，1997年6月24日公開；國際公開號WO96/29411;國際公開號WO94/12650;Koller等，Ato/.爿o^.S"L/iSJ86:8932-8935(1989);和Zijlstra等，Atowre342:435-438(1989),各文獻的公開內容以其整體引用以供參考)。有利的是，本發明的白蛋白融合蛋白可通過包括硫酸銨或乙醇沉澱，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜法，磷酸纖維素色譜法，疏水相互作用色譜法，親和色譜法，羥基磷灰石色譜法，疏水電荷相互作用色譜法，和凝集素色譜法的熟知方法從重組細胞培養物中回收和純化。在一些實施方案中，可使用高效液相色鐠法("HPLC")純化。在某些情況下，治療性蛋白質具有低可溶性或者僅在低或高pH下或者僅在高或低鹽條件下可溶。治療性蛋白與HAS的融合很可能提高該治療性蛋白質的可溶性特徵。在一些實施方案中，使用一種或多種上述色譜法純化本發明的白蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，本發明的白蛋白融合蛋白使用一種或多種下列色譜柱純化Q瓊脂糖FF柱，SP瓊脂糖FF柱，Q瓊脂糖高效柱，藍色瓊脂糖FF柱，藍色柱，苯基瓊脂糖FF柱，DEAE瓊脂糖FF,或曱基柱。另外，本發明的白蛋白融合蛋白可使用在國際公開號WO00/44772中所述的方法純化，本文以其整體引用以供參考。本領域的技術人員可容易地改良其中所述的方法用於純化本發明的白蛋白融合蛋白。本發明的白蛋白融合蛋白可從包括例如，細菌，酵母，高等植物，昆蟲，和哺乳動物細胞的原核或真核宿主通過重組技術產生的產物中回收。依賴於重組生產方法採用的宿主，本發明的多肽可被糖基化或者非糖基化。另外，在某些情況下由於宿主介導的加工，本發明的白蛋白融合蛋白也可包含起始修飾的曱硫氨酸殘基。因此，本領域熟知在所有真核細胞中任何蛋白質在翻譯後一般高效切除翻譯起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸。儘管在大多數原核生物中也有效切除大多數蛋白質上的N-端曱硫氨酸，但是對於某些蛋白質，依賴於與N-末端曱硫氨酸共價連接的胺基酸的特性，該原核切除加工失效。本發明的白蛋白融合蛋白和結合治療性蛋白或其片斷或變異體的抗體可與諸如肽的標記序列融合以有利於純化。在一個實施方案中，該標記的胺基酸序列是六組氨酸肽，例如在pQE載體(QIAGEN，Inc.，9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的標記，以及其它標記，其中許多是商業上可獲得的。按Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)所述，例如，六組氨酸給融合蛋白提供了方便的純化方法。用於純化的其它肽標記包括，但不限於，"HA"標記，它相應於來自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell37:767(1984))和"FLAG"標記。另外，本發明的白蛋白融合蛋白可與諸如細胞毒素的治療性半分子，例如細胞抑制劑或殺細胞劑，治療劑或放射性金屬離子，例如a-放射體，例如213Bi相連接。該試劑的例子在美國臨時申請系列號60/355,547和在WO01/79480(第107頁)中提供，本文引用以供參考。白蛋白融合蛋白也可附著到固相支持物上，該固相支持物具體用於肽的免疫測定和純化，與本發明的白蛋白融合蛋白結合或相連。該固相支持物包括，但不限於，玻璃，纖維素，聚丙烯醯胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。本發明還提供了本發明的白蛋白融合蛋白的化學修飾衍生物，它可提供進一步的優勢，例如多肽的可溶性，穩定性和循環時間增加，或免疫原性降低(參見美國專利號4,179,337)。WO01〃9480(第109-111頁)中提供了涉及使用聚乙二醇的實施例，本文引用以供參考。本發明的白蛋白融合蛋白的存在和數量可使用ELISA,即本領域已知的熟知免疫測定法來測定。多肽的使用本文鑑定的各多肽可用於許多方法。下面的描述應認為是舉例性的且利用了已知的技術。本發明的白蛋白融合蛋白可用於哺乳動物，優選人類的各種紊亂(disorder)的治療，預防和/或預後。該紊亂包括，但不限於，本文在表4標題為"生物學活性，，下描述的那些紊亂。例如，本發明的白蛋白融合蛋白可用作絲氨酸蛋白酶，纖溶酶，人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶和/或激肽釋放酶的抑制劑。白蛋白融合蛋白也可用於測定生物學樣品中的多肽水平。例如，放射標記的本發明的白蛋白融合蛋白可用於體內的多肽成像。測定法的例子在例如，本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO0179480(第112-122頁)中提供且是本領域熟知的。用於體內蛋白質成像的標記包括，但不限於通過X-射線照相術，核磁共振(NMR),電子自旋馳豫(relaxation)(ESR),正電子發射斷層照像(PET),或計算機X-射線斷層術(CT)可檢測的那些標記。對於X-射線照相術，合適的標記包括諸如鋇或銫的放射性同位素，它們發射可檢測的射線但對受試者無明顯傷害。用於NMR和ESR的合適標記包括具有可檢測的特徵性自旋的那些標記，例如氘，通過標記給表達本發明的白蛋白融合蛋白的細胞系提供的營養成分可將它摻入白蛋白融合蛋白的。通過將用合適的可檢測成像半分子，例如放射性同位素(例如，131I，112In，99mTc，(131I，125I，123I,121I),碳("C)，硫("S)，氚(3印，銦(115，11,113mIn，112In，mIn),和鎝("Tc,99mTc)，鉈(加Ti)，鎵(、，67Ga),釔(，d),鉬("Mo)，氙('"Xe),氟("F,153Sm,177Lu,159Gd,149Pm，140La，175Yb，166Ho,90Y,47Sc，186Re,188Re,142Pr,15Rh,97Ru)，不透射線物質，或核磁共振可檢測的物質標記的白蛋白融合蛋白導入(例如，腸胃外，皮下或腹膜內)哺乳動物中用於檢查免疫系統疾病。本領域應明白受試者的大小和所用的成像系統將決定產生診斷圖像所需的成像半分子的量。對於人受試者所用的放射性同位素半分子，注射的放射性量一般範圍是從大約5至20毫居裡(millicuries)的99mTc。然後標記的白蛋白融合蛋白在存在一種或多種受體，配體或底物(相應於用於製備本發明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質的受體，配體或底物)的體內位置(例如，器官，細胞，細胞外空間或基質)優先積累。作為選擇，如果白蛋白融合蛋白包含治療性抗體的至少一個片斷或變異體，那麼標記的白蛋白融合蛋白可在存在相應於治療性抗體(用於製備本發明的融合蛋白)結合的那些多肽/表位的體內位置(例如，器官，細胞，細胞外空間或基質)優先積累。體內腫瘤成像在S.W.Burchiel等，"放射性標記的抗體及其片斷的免疫藥物動力學，，(見r"附or7wag/"g:TTzei^d/oc/ze/w'ca/o/Ca"cer第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編，MassonPublishingInc.(1982))中描述。其中所述的方法可由本領域的技術人員容易地進行改良用於本發明的白蛋白融合蛋白。本發明的白蛋白融合蛋白也可用於產生抗體，該抗體又可用於測量治療性蛋白，白蛋白，和/或本發明的白蛋白融合蛋白在重組細胞中的蛋白質表達，作為評估宿主細胞轉化的一個方法，或者用於測量在生物學樣品中的蛋白質表達。另外，本發明的白蛋白融合蛋白可用於檢測本文所述的生物學活性。轉基因生物本發明還包括表達本發明的白蛋白融合蛋白的轉基因生物。轉基因生物是將重組，外源性或克隆的遺傳物質轉移進其中的遺傳修飾的生物。該遺傳物質通常稱為轉基因。轉基因的核酸序列可包含一個或多個轉錄調控序列和對於所編碼的蛋白質最佳表達和分泌所必需的其它核酸序列，例如內含子。該轉基因可設計成指導所編碼的蛋白質以有利於其從生物或者從該生物產生的產物，例如，從該生物的奶，血液，尿，卵，毛髮或種子中回收的方式表達。該轉基因可由與靶動物種相同物種或者不同物種的基因組產生的核酸序列組成。該轉基因可在正常情況下沒有發現該具體核酸序列的基因組位置或者在該轉基因的正常位置整合。術語"生殖細胞系轉基因生物"是指將遺傳改變或遺傳信息導入種系細胞，從而賦予該轉基因生物能將該遺傳信息傳遞給後代的能力的轉基因生物。如果該後代事實上具有某些或者全部該改變或遺傳信息，那麼它們也是轉基因生物。該改變或遺傳信息對於接受者所屬的生物物種可以是外源的，僅對特定的個體接受者是外源的，或者可以是該接受者已經具有的遺傳信息。對於最後一種情況，改變的或導入的基因可不同於天然基因進行表達。轉基因生物可以是轉基因人，動物或植物。轉基因可通過包括轉染，電穿孔，顯微注射，胚胎幹細胞中的基因靶向和重組病毒或逆轉錄病毒感染的各種不同的方法產生(參見，例如，美國專利號4,736,866;美國專利號5,602,307;Mullins等(1993)Hypertension22(4):630-633;Brenin等(1997)Surg.Oncol,6(2)99-110;Tuan(糹扁)，/ecomZ,W(3"GeweExpr&w/ow/Vofoco/s,MethodsinMolecularBiologyNo.62，HumanaPress(1997))。將核酸片斷導入重組受體哺乳動物細胞中的方法可通過支持多個核酸分子共轉化的任何方法進行。產生轉基因動物的詳細方法是本領域的技術人員容易獲得的，包括在美國專利號5,489,743和美國專利號5,602,307中公開的內容。另一信息在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480(第151-162頁)中提供。編碼本發明的白蛋白融合蛋白的構建體可用作基因治療方法的一部分用於傳遞治療上有效劑量的白蛋白融合蛋白。將核酸體內導入細胞的一個方法是通過使用含有編碼本發明的白蛋白融合蛋白的核酸的病毒載體。用病毒載體感染細胞具有這樣的優勢，即大部分靶細胞可接受該核酸。另外，病毒載體內編碼的分子，例如通過病毒載體包含的cDNA，可在吸收病毒載體核酸的細胞中有效表達。所述白蛋白融合蛋白的血漿半衰期延長甚至可基因治療補償可能的低水平表達。逆轉錄病毒載體和腺伴隨病毒載體可用作重組基因傳遞系統用於體內轉移編碼白蛋白融合蛋白的外源性核酸分子。這些載體用於將核酸有效傳遞進細胞，且轉移的核酸穩定整合進宿主的染色體DNA中。該載體，使用它們的方法，及其優點，和非病毒傳遞方法的例子在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01〃9480(第151-153頁)中詳細描述。用於編碼本發明的白蛋白融合蛋白的基因的基因傳遞系統可通過許多方法中的任一種導入患者。例如，該基因傳遞系統的藥用製品可通過例如，靜脈內注射全身性導入，且該蛋白質在靶細胞中的特異性轉導主要由基因傳遞載體，控制受體基因表達的轉錄調控序列引起的細胞型或組織型表達，或其結合提供的特異性轉染發生。在其它實施方案中，重組基因的起始傳遞更局限於完全定向地導入動物。例如，該基因傳遞載體可通過插管(參見美國專利5，328，470)或通過立體定位注射(例如，Chen等(1994)PNAS91:3054-3057)導入。基因治療構建體的藥用製品可基本上由在可接受的稀釋劑中的基因傳遞系統組成，或者可包含包埋該基因傳遞載體的緩釋基質。如果該白蛋白融合蛋白從重組細胞，例如逆轉錄病毒載體完整地生產，那麼該藥用製品可包含產生該白蛋白融合蛋白的一個或多個細胞。其它基因治療方法在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01〃9480(第153-162頁)中描述。藥用或治療組合物本發明的白蛋白融合蛋白或其配製品可通過包括腸胃外(例如，皮下或肌內)注射或靜脈內輸注的任何常規方法給藥。該治療可由單次劑量或一段時間內的多次劑量組成。另外，該單次或多次劑量比未融合白蛋白的治療性蛋白以更低的頻率給藥。儘管單獨施用本發明的白蛋白融合蛋白是可能的，但是與一種或多種可接受的載體一起作為藥用配製品存在是可取的。該載體在與該白蛋白融合蛋白具有相容性和對其接受者無害的意義上必須是"可接受的"。一^:來說，該載體是無菌和無熱原的水或鹽水。本發明的白蛋白融合蛋白特別非常適合於在諸如無菌無熱原水，鹽水或其它等滲溶液的含水載體中配製，因為它們在溶液中的儲存期延長。例如，本發明的藥用組合物可預先以水溶液形式配製好，例如在配藥前幾周或幾月或更長的時間期限前配製好。含有該白蛋白融合蛋白的配製品可考慮該白蛋白融合蛋白在含水配製品中的儲存期延長後製備。如上所述，許多這類治療性蛋白質的儲存期在與HA融合後顯著增加或延長。如果氣溶膠給藥是合適的，本發明的白蛋白融合蛋白可使用標準方法配製成氣溶膠。術語"氣溶膠"包括能夠吸入細支氣管或鼻通道的任何氣體攜帶的懸浮相的本發明白蛋白融合蛋白。具體地說，氣溶膠包括可在測定劑量的吸入器或噴化器，或在噴霧器中產生的氣體攜帶的懸浮相的本發明白蛋白融合蛋白小滴。氣溶膠還包括懸浮於空氣或其它載體氣體中的本發明化合物的乾粉組合物，例如，它可通過從吸入器裝置吹入給藥。該配製品可按常規以單位劑量形式存在且可通過藥學領域熟知的任一方法製備。該方法包括將白蛋白融合蛋白與構成一種或多種輔助成分的載體混合的步驟。一般來說，該配製品可通過將活性成份與液體載體或細分的固體載體或兩者均勻和充分混合來製備，然後，如果需要，整形該產品。適合於腸胃外給藥的配製品包括可含有抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑和導致該配製品適合於目的接受者的溶質的含水和不含水的無菌注射溶液；和包含懸浮劑和增稠劑的含水和不含水的無菌懸液。該配製品可在單位劑量或多劑量容器，例如密封安瓿，小瓶或注射器中存在，且可在凍幹(冷凍乾燥)條件下貯存，使用前僅需要臨時加入無菌液體載體，例如注射水。臨時注射溶液和懸液可從無菌粉末製備。由於本發明的許多白蛋白融合蛋白表現出血清半衰期延長，因此與該治療性蛋白的非融合型標準配製品相比，該配製品劑量可含有更低摩爾濃度或更低劑量的治療性蛋白部分。作為例子，當本發明的白蛋白融合蛋白包含一個或多個治療性蛋白質區域時，可根據相對於該治療性蛋白效力的該白蛋白融合蛋白的效力，同時考慮與天然治療性蛋白相比該白蛋白融合蛋白的血清半衰期和儲存期延長來計算該劑量形式。例如，在由全長HA與全長治療性蛋白融合組成的白蛋白融合蛋白中，按單位的等價劑量可表現出更大的試劑重量，但是可減少給藥頻率。本發明的配製品或組合物可與提及該白蛋白融合蛋白成份儲存期延長的說明書或包裝插頁包裝在一起，或者與其一起包含在試劑盒中。例如，該說明書或包裝插頁可說明推薦的貯存條件，例如時間，溫度和光照，並考慮本發明的白蛋白融合蛋白的儲存期延長。該說明書或包裝插頁也可說明本發明的白蛋白融合蛋白的具體優點，例如便於貯存以便用於需要在野外，受控制的醫院的戶外，臨床或辦公室條件下使用的配製品。如上所述，本發明的配製品可以是含水形式且可在低於理想環境下貯存而不明顯損失治療活性。本發明還提供了通過給受試者施用在藥用上可接受的載體中的有效量的本發明白蛋白融合蛋白或編碼本發明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸("白蛋白融合蛋白多核苷酸")來治療和/或預防疾病或紊亂(例如，本文公開的任何一種或多種疾病或紊亂)的方法。施用的本發明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效劑量可通過描述了諸如生物學半衰期，生物可利用率和毒性的參數的本領域技術人員熟知的方法，包括使用來自諸如在表4中參考文獻描述的常規體外和體內研究的數據，使用本領域的技術人員熟知的方法來測定。該白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可按與良好醫學實踐一致的方式，並考慮個體患者的臨床情況(特別是單獨用白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸治療的副作用)，給藥位點(thesiteofdelivery),給藥方法，給藥時間表，和醫師已知的其它因素進行配製和給藥。因此本文使用的"有效量"可按該考慮進行測定。例如，測定給藥的物質的有效量依賴於許多因素，包括，例如，該物質的化學結構和生物學活性，動物的年齡和體重，需要治療的確切病症及其嚴重性，和給藥途徑。治療的頻率依賴於許多因素，例如每個劑量施用的多核苦酸構建體量，以及受試者的健康狀況和病史。給藥的精確量，次數，和給藥時間選擇可由主治醫師或獸醫確定。本發明的白蛋白融合蛋白和多核苷酸可施用給任何動物，優選哺乳動物和鳥類。優選的哺乳動物包括人類，狗，貓，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛，馬和豬，特別優選人。作為一般性建議，本發明的白蛋白融合蛋白可以比未融合的治療性肽劑量更低或給藥頻率更少。治療上有效的劑量可指足以導致症狀改善，疾病穩定，延長患者存活，或改善生活質量的化合物的量。白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通過口服，直腸，腸胃外，腦池內，陰道內，腹膜內，局部(作為粉末，軟膏，凝膠，滴劑或皮膚膏藥)，口頰，或者作為口腔或鼻內噴霧給藥。"藥用上可接受的載體"是指無毒性固體，半固體或液體填充物，膠嚢材料或任何配製輔劑。本文使用的術語"腸胃外"是指包括靜脈內，肌肉內，腹膜內，胸骨內，皮下和關節內注射和輸注的給藥方式。本發明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸還適合於通過緩釋系統給藥，例如在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480(第129-130頁)中所述的那些系統。對於腸胃外給藥，在一個實施方案中，該白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般可通過將它以所需純度，以單位劑量的可注射形式(溶液，懸液，或乳劑)，與藥用上可接受的載體，即在所用劑量和濃度下對接受者無毒性且與該配製品的其它成份相配伍的載體混合來配製。例如，該配製品任選不包括氧化劑和已知對該治療劑有害的其它化合物。本發明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可單獨或者與其它治療劑聯合給藥。可與本發明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯合給藥的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸試劑包括但不限於，化療劑，抗生素，類固醇和非類固醇抗炎劑，常規免疫治療劑，和/或在本文作為參考文獻引用的美國臨時申請系列號60/355,547和WO01/79480(第132-151頁)中所述的治療性處理。聯合可以是同時，例如作為混合物，分開但同時進行或並行；或者依次給藥。它包括該聯合試劑作為治療性混合物一起給藥的情況，且也包括該聯合試劑分開但同時給藥的操作，例如，通過分開的靜脈內路線進入相同個體中。"聯合"給藥還包括先給予一種化合物或試劑，接著再給第二種的分開給藥。適用於本發明的藥用組合物包括這樣的組合物，其中包含有效量的活性成份以達到其計劃目的。本發明還提供了一種藥品包或試劑盒，它包含一個或多個容器，其中填充了含有本發明白蛋白融合蛋白的藥用組合物的一種或多種成份。任選與該容器相聯的是按控制藥品或生物學產品製造，使用或銷售的政府機構指定形式的說明書，該說明書反映了該機構批准製造，使用或銷售用於人類給藥。按照本發明的該一般性描述，相信本領域的普通技術人員使用前面的描述和下面的說明性實施例能夠作出和利用本發明發現的改變並實施所要求保護的方法。因此下面的工作實施例，具體指出了本發明的不同實施方案，且不以任何方式構成對該公開內容的其它方法的限制。實施例實施例1:構建N-末端和C-末端白蛋白-(GGShGG接頭克隆載體重組白蛋白表達載體pDB2243和pDB2244以前已經在專利申請WO00/44772中描述。重組白蛋白表達載體pAYE645和pAYE646以前已經在英國專利申請0217033.0中描述。^"飾質粒pDB2243以1更以這樣的方式在白蛋白多肽的C-末端導入編碼14個胺基酸多肽接頭N-GGSGGSGGSGGSGG-C((GGS)4GG，"N，，和"C"表示多肽序列的方向)(SEQIDNO:—)的DNA序列，該方式隨後使得另一多肽鏈在C-末端插入到(GGS)4GG接頭上以產生一般構型為白蛋白-(GGS)4GG-多肽的C-末端白蛋白融合蛋白。同樣，修飾質粒pAYE645以便以這樣的方式在白蛋白多肽的N-末端導入編碼(GGS)4GG多肽接頭的DNA序列，該方式隨後使得另一多肽鏈以N-末端插入到(GGS)4GG接頭上以產生一般構型為多肽-(GGS)4GG-白蛋白的N-末端白蛋白融合蛋白。質粒pDB2243在Sleep，D,,等(1991)Bio/Technology9,183-187和在專利申請WO00/44772中描述，它包含酵母屍朋7啟動子和酵母v4D//7終止子以提供合適的轉錄啟動子和轉錄終止子序列。質粒pDB2243用BawHI完全消化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，最後再連接以產生質粒pDB2566。通過退火合成寡核苷酸JH033A和JH033B合成雙鏈合成寡核苷酸接頭Bsu36I/HindlII接頭。J腦3A5，-TTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTTAATA畫3，(SEQIDNO:一)JH033B5，-AGCTTATTAACCACCGGATCCACCAGAACCACCGGAACCACCAGAACCACCTAAGCC-3，(SEQIDNO:—)將退火的Bsu36I/HindlH接頭連接進Hindm/Bsu361切割的pDB2566中以產生質粒pDB2575X,它包含在其C-末端有(GGS)4GG肽接頭的白蛋白編碼區。含有酵母啟動子和酵母jD///終止子提供合適的轉錄啟動子和轉錄終止子序列的質粒pAYE645在英國專利申請0217033.0中描述。質粒pAYE645用限制性酶消化完全並用限制性酶HindIII部分消化，分離含有酵母啟動子3，端和rHA編碼序列的DNA片斷。用4/n////,7dIII消化在專利申請WO00/44772中描述的質粒pDB2241並分離含有酵母/^^7啟動子5'端和酵母爿Z)//7終止子的DNA片斷。然後將來自pAYE645的4/7IW,'"dmDNA片斷克隆進4/7n/歷"dmpDB2241載體DNA片斷上以產生質粒pDB2302。將質粒pDB2302用Pacl/Xhol消化完全並分離6.19kb片斷，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，並再連接以產生質粒pDB2465。將質粒pDB2465用Clal線形化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，並再連接以產生質粒pDB2533。質粒pDB2533用Blnl線形化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，並再連接以產生質粒pDB2534。質粒pDB2534用BmgBI/5gffl消化完全，分離6.96kbDNA片斷並連接到一個雙《連寡核香酸接頭，即VC053/VC054和VC057/VC058上以產生質粒pDB2540,或連接到VC055/VC056和VC057/VC058上以產生質粒pDB2541。VC0S3(SEQIDNO:—VC054(SEQEDNO:_)VC055(SEQIDNO:_)VC056(SEQIDNO:)VC057CTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3'(SEQIDNO:)VC058AAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3'(SEQIDNO:)雙鏈合成寡核苷酸接頭BglII/Agel接頭通過退火合成寡核苷酸JHO:55A和JH035B來合成。JH035A5'-GATCTTTGGATAAGAGAGGTGGATCCGGTGGTTCCGA-3，(SEQIDNO:JH035B5'-CCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCACCACAA陽3'(SEQIDNO:一)將退火的Bg氾"gel接頭連接進5g/II"gel切割的pDB2540上以產生質粒pDB2573X,它包含在其N-末端具有(GGS)4GG肽接頭的白蛋白編碼區。實施例2:未融合的DPI-14的平衡抑制常數DPI-14的胺基酸序列是EAVREVCSEQAETGPCIAFFPRWY過反向翻譯過程可從該多肽序列產生一個DNA序列。在畢赤氏酵母屬中表達DPI-14並使用離子交換色譜，疏水相互作用色譜，和超濾從發酵肉湯上清中提取。DPI-14抑制人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)的平衡抑制常數(Ki)測定為15土2pM，對於[HNEh57土7pM。使用實施例15所述的方法進行IQ測量。實施例3:構建N-末端和C-末端白蛋白-DPI-14融合蛋白在5，或3'末端提供該DNA序列以編碼DPI-14編碼區，白蛋白編碼區或前導序列之間的連接序列以適合於N-末端DPI-14-(GGS)4GG-白蛋白或C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14融合蛋白。從重疊的寡核苦酸構建N-末端BglII-BamHIDPI-14cDNA(表5)和C-末端BamHI-HindIIIDPI-14cDNA(表6)。實施例4:構建N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白表達質粒質粒pDB2573X用BglII和BamHI消化完全，分離6.21kb的DNA片斷並用小牛腸磷酸酶處理，然後與0.2kb的BglII/BamHIN-末端DPI-14cDNA連接以產生pDB2666。N-末端DPI-14-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和胺基酸序列分別在表7和表8中顯示。通過"分解(disintegration)"在EP-A-286424中一般性公開和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2666分離NotlN-末端DPI-14-(GGS)4GG-rHA表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生兩個質粒；第一個(pDB2679)含有與LEU2相同表達方向的Notl表達序列盒，而第二個(pDB2680)含有與LEU2相反方向的Notl表達序列盒。pDB2679和pDB2680都是較好的目的融合蛋白生產質粒。實施例5:構建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DPI-14表達質粒質粒pDB2575X用HindIII部分消化，然後用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷並與0.2kbBamHI/Hind111C末端DPI-14cDNA連接以產生pDB2648。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14融合蛋白的DNA和胺基酸序列分別在表9和表10中顯示。通過"分解"在EP-A-286424中一般性公開和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC354是供合適的酵母載體序列。從pDB2648分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生含有與LEU2相同表達方向的Notl表達序列盒的pDB2651。實施例6:構建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-1000表達質粒質粒pDB2575X用HindIII部分消化，然後用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷並與表11所示的0.2kbBamHI/HindlllC末端DX-1000cDNA連接以產生pDB2648X-1000。通過"分解，，在EP-A-286424中一般性公開和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2648X-1000分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX1000表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生含有與LEU2相同表達方向的Notl表達序列盒的pDB2651X-1000。實施例7:構建N-末端和C-末端白蛋白-DX-8卯融合蛋白產生基礎克隆DX-890的胺基酸序歹'J是EACNLPIVRGPCIAFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVP(SEQIDNO:—)。通過反向翻i爭過程從該多肽序列產生DNA序列。在5，或3，端提供該DNA序列以編碼DX-890編碼區，白蛋白編碼區或前導序列之間的連接序列以適合於N-末端DX-890-(GGS)4GG-白蛋白或C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890融合蛋白。從重疊的寡核苷酸構建N-末端BglII-BamHIDX-890cDNA(表12)和C-末端Bamffl-HindIIIDX-890cDNA(表13)。實施例8:構建N-末端DX-89(KGGSV3G-白蛋白表達質粒質粒pDB2573X用Bglll和BamHI消化完全，分離6.21kb的DNA片斷並用小牛腸磷酸酶處理，然後與0.2kb的BglII/BamHIN-末端DX-890cDNA連接以產生pDB2683。N-末端DX-8卯-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和胺基酸序列分別在表14和表15中顯示。通過"分解"在EP-A-286424中一般性公開和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2683分離NotlN-末端DX-890-(GGS)4GG-rHA表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生含有與LEU2相反方向的Notl表達序列盒的pDB2684。實施例9:構建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890表達質粒質粒pDB2575X用HindIII部分消化，然後用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷並與0.2kbBamHI/Hindl11C末端DX-890cDNA連接以產生pDB2649。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-8卯融合蛋白的DNA和胺基酸序列分別在表16和表17中顯示。通過"分解，，在EP-A-286424中一般性公開和由Sle印，D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2649分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生兩個質粒；第一個pDB2652含有與LEU2相同表達方向的Notl表達序列盒，而第二個pDB2653含有與LEU2相反方向的Notl表達序列盒。實施例10:發酵生產融合蛋白按WO00/44772中所述在發酵培養物中表達DX-8卯-HSA融合蛋白。除了在洗脫緩衝液中需要額外的200mMNaCl外，按WO00/44772中所述使用標準HA純化SP-FF(Pharmacia)條件從發酵培養物上清純化DX-890-HSA融合蛋白。實施例11:酵母轉化和培養條件按SleepD.,等(2001)Yeast18,403-421所述將在WO95/23857,WO95/33833和WO94/04687中公開的酵母菌林轉化成亮氨酸原養型。將轉化子塗布到緩衝型基本培養基(BMM,Kerry-Williams,S.M.等(1998)Yeast14,161-169所述)上並在3(TC下培養直到生長至足夠用於進一步分析。實施例12:DX-890樣品的KJ則量按照形成可逆複合物的緊密結合抑制模型(1:1化學計量法)測定DX-8卯或DX-890-HAS抑制HNE的平衡抑制常數(KO。在30。C下在50mMHEPES,pH7.5,150mMNaCl,和0.1%TritonX-100中測定hNE的抑制。所有反應(總體積二200^L)在微量滴定板(Costai^3789)上進行。hNE用各種濃度的添加抑制劑培養24小時。從相對底物水解率測定剩餘酶活性。通過添加N-曱氧基琥珀醯-八&-八13-1"0^31-7-氨基-甲基香豆素作為底物開始水解反應。該底物的酶促裂解釋放曱基香豆素半分子，伴隨著樣品螢光增強。在360nm激發光和460nm發射光下監測底物水解率。通過對公式1的非線性回歸分析擬合剩餘百分活性與抑制劑濃度的繪圖以測定平衡解離常數。其中%八=百分活性I=DX-890E=HNE濃度Ki=平衡抑制常數在相同時間測量天然DX-890的Kj作為陽性對照。DX-8卯和DX-890-HAS融合蛋白對人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)的K;彼此相似(圖1)。用來自搖瓶酵母培養物或者來自發酵罐的上清中的DX-8卯-HAS融合蛋白可見相似的結果。兩種上清都由Aventis或Dyax供應。該結果表明與HAS融合不影響DX-890作為HNE抑制劑的效力。實施例13:DX-88與HASN末端的融合DX-88是來自人LACI第一Kunitz結構域的一個Kunitz結構域，它以K廣40pM抑制人血漿激肽釋放酶。DX-88的血清半衰期不超過1小時。DX-88在臨床試驗中通常用於治療遺傳性血管性水腫(HAE)。初步數據表明DX-88是安全有效的。HAE是發病以陣髮式復發的病症，且具有長效形式可允許預防性治療代替反應性治療。可獲得準備用於與HA的N末端融合的DX-88的DNA序歹'J。在5，或3，端提供該DNA序列以編碼DX-88編碼區，白蛋白編碼區或前導序列之間的連接序列以適合於N-末端DX-SS-(GGS)4GG-白蛋白(表")。質粒pDB2573X用BglII和BamHI消化完全，分離6.21kb的DNA片斷並用小牛腸磷酸酶處理，然後與0.2kb的BglII/BamHIN-末端DX-88cDNA連接以產生pDB2666-88。N-末端DX-88-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和胺基酸序列分別在表19和表20中顯示。通過"分解"在EP-A-286424中一般性公開和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2666-88分離NotlN-末端DX-88-(GGS)4GG-rHA表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生兩個質粒；第一個pDB2679-88含有與LEU2相同表達方向的Notl表達序列盒，而第二個pDB2680-88含有與LEU2相反方向的Notl表達序列盒。實施例14:構建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-88表達質粒按實施例5所述，質粒pDB2575X用HindIII部分消化，然後用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷並與0.2kbBamHI/HindlllC末端DX-88cDNA連接(表21)以產生pDB2648-88。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-88融合蛋白的DNA和胺基酸序列分別在表22和表23中顯示。通過"分解"在EP-A-286424中一般性公開和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2648-88分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-88表達序列盒，純化並連接進已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產生含有與LEU2相同表達方向的Notl表達序列盒的pDB2651-88。實施例15:在小鼠中的藥物動力學試驗按WO00/44772中所述在發酵培養物中表達DX-890-HSA融合蛋白。除了在洗脫緩衝液中需要額外的200mMNaCl外，按WO00/44772中所述使用標準HA純化SP-FF(Pharmacia)條件從發酵培養物上清純化DX-8卯-HSA融合蛋白。通過SEC-HPLC從滲濾殘留物純化大約10mg的rHA-DX-8卯融合蛋白並通過SCS-PAGE和RP-HPLC方法鑑定為大約92%是單體形式。該物質用於隨後進行125I放射標記和體內血漿清除試驗。對於小鼠試驗，在尾靜脈注射動物且在注射後大約0,7,15,30和90分鐘，4小時，8小時，16小時，24小時時處死4隻動物，對於天然DX-890不超過4個時間點，因為其很可能半衰期較短。記錄注射時間和取樣時間。處死時，將0.5ml的樣品收集進抗凝劑(0.02mlEDTA)中。離心細胞並與血漿分離。將血漿分成兩個等分試樣，一個冷凍且一個在4。C下貯存用於即時分析。分析包括對所有樣品進行Y計數。另外，對各時間點的兩個血漿樣品(N二2)進行分析，即，對0，和30分鐘的125I-DX-890,和0，30分鐘，和24小時的125I-DX-890-HAS融合蛋白。使用帶有在線(in-line)放射檢測器的SEC-HPLC瓊脂糖-12柱分析血漿級份(fractions)。結果表明DX-890與HAS融合將其p(清除)半衰期顯著提高約5倍(圖2)。另外，似乎DX-890-HSA-融合蛋白在小鼠血漿中比DX-8卯更穩定(圖3和4)。實施例16:在兔中的藥物動力學試-瞼通過碘標記蛋白質並測量放射性標記從兔循環中的清除率來測量DX-8卯和DX-890-HAS的藥物動力學特性。使用生碘(iodogen)方法用碘-125碘標記兩種DX-890製品。碘標記後，通過大小排阻層析(SEC)從未結合的標記中純化兩種標記的蛋白質製品。合併具有最高放射性的SEC柱級份。通過閃爍計數鑑定純化的放射性標記的製品的比活並通過使用帶有在線放射檢測器的瓊脂糖-12柱通過SEC鑑定其純度。紐西蘭白兔(約2.5Kg)用於清除率測定，一隻動物分別用於兩種標記的蛋白質製品。將放射性標記的製品通過耳靜脈注射進動物中。在大約O，7，15,30,和90分鐘的早期時間點和在4,8,16，24，48,72，96，144，168,和192小時的晚期時間點對每隻動物在每個時間點收集一個血液樣品。將樣品(大約0.5ml)收集進抗凝劑(EDTA)試管中。通過離心分離細胞與血漿/血清成份。將血漿成份分成兩個等分試樣。一個血漿等分試樣在-70。C貯存且另一個等分試樣在4。C下保持用於即時分析。樣品分析包括用於清除率測定的放射計數和用於體內穩定性的SEC層析。兔清除率試驗的結果在圖5和6和在表24中總結。HSA-DX-890融合蛋白顯示出體內循環特性相對於未修飾的DX-890顯著改進。對該融合蛋白的血漿清除率大量減小以致於一天後的放射性標記的相對循環水平HSA-DX-890融合蛋白比未修飾的蛋白高100倍(圖5)。對該數據的筒單雙指數匹配表明清除率曲線的a和p部分都大量增加(表24)。具體地說，Tv2(3的值增加超過20倍，從未修飾蛋白質的大約165分鐘(2.75小時)到HSA-DX-890融合蛋白的大約3500分鐘(~60小時，~2.5天)。另夕卜，與該曲線的緩慢清除部分相關的總物質部分對於融合蛋白幾乎是未修飾的DX-890的2倍(表24)。表24在兔中的清除時間tableseeoriginaldocumentpage63最後，融合蛋白相對於未修飾的DX-890表現出體內穩定性提高(圖6)。對來自用125I-DX-890注射的兔的血漿進行SEC分析(圖6,A部分)表明標記與更高分子量的血漿成份(更早的洗脫峰)相當迅速地相關聯。另外，與高分子量物質相關的總殘留循環標記的相對比例隨著注射後時間的增加而增加(比較30分鐘和4小時時的洗脫分布圖)。相反，對來自注射了125I-HSA-DX-8卯的兔的血漿樣品進行SEC分析(圖6，B部分)表明幾乎全部循環標記與注射液中可見的HSA-DX-890峰值相關且該標記與該峰值在至少72小時內保持穩定相關。實施例17:用於製備雙重融合的HSA的載體載體pDB2300Xl是pDB2575X的修飾形式，其中靠近rHA基因5，端有Bg/II/Bamffl序列盒且靠近3，端有5^EI/Kp"I序列盒。包含該基因的Notl序列盒在表25中顯示，其中顯示了該DNA，編碼的胺基酸序列和有用的限制性位點。在表25各行中，驚嘆號後面的各內容是注釋，編號和分開該DNA序列以便於理解該設計。實施例18:將第一種情況的DX890加入pDB2300Xl中將表12所示的DNA導入已經用BglII和BamHI切割的pDB2300Xl中以製備新載體pDB2300X2。表26顯示了pDB2300X2的Notl序列盒的DNA，編碼的胺基酸序列和有用的限制性位點。實施例19:將第二種情況的DX8卯加入。DB2300X2中將表27所示的DNA導入已經用BspEI和Kpnl切割的pDB2300X2中以製備新載體pDB2300X3。儘管該DNA編碼與表12的DNA相同的胺基酸序列，但是改變了許多密碼子以減少兩個DX890-編碼區之間的重組可能性。表28顯示了該構建體的DNA,編碼的胺基酸序列和有用的限制性位點。編碼的胺基酸序列在表29中顯示。該蛋白質按與本發明的其它構建體相同的方式表達。表103的蛋白質，即"Dx890-HA-Dx890",具有~16%的DX890的HNE-中和活性但是血清壽命時間長得多。因此代表HNE抑制的曲線下面積比淨果露的DX890高得多。實施例20:DX1000::(GGS)4GG::HSA將表30所示的DNA導入已經用和SawHI切割的pDB2573X中以構建pDX1000。表31顯示了該編碼的蛋白質的胺基酸序列。該蛋白質的表達基本上與本發明的其它HA融合蛋白相同。實施例21:DX-88::(GGS、GG::HSA::(GGSy3G::DX-88按與編碼DX-8卯-HSA-DX-890的基因的構建體相似的方式，將表18的DNA插入已經用Bg/II和BawHI切割的pDB2300Xl中以製備新載體中以產生含有兩種情況的編碼DX-88的DNA的pDB2300X88b。表32的DNA基本上不同於表18的DNA以便不可能發生重組。實施例22:多個白蛋白融合蛋白可修飾本文所述的N-末端融合蛋白表達質粒pDB2540以便在C-末端導入單一Bsu361;該新質粒稱為pDB2301X。來自pDB2301X的Notl表達序列盒的DNA序列如下pDB2540+腸361Not工1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag61atagacagatagagatggacgagaaacagggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaagNarl121aaagactcatctatcgcagataagacaatcaaccctcatGGCGCCtccaaccaccatccgformulaseeoriginaldocumentpage6528B1catttcacccaattgtagatatgctaactccagcaa'tgagttgatgaatctcggtg亡gtaMot工2941ttttatgtcctcagaggacaacacctgttgtaatcgttcttccacacggatcGCGGCCGC可將編碼多肽的DNA插入BglII和Agel位點之間以表達N-末端白蛋白融合蛋白，或者插入Bs11361和HindlII(不是單一的且因此需要部分HindIII消化)位點之間以表達C-末端白蛋白融合蛋白，或者插入兩種位點對之間以製備聯合N-和C-末端白蛋白融合蛋白。可任選插入多肽間隔區。來自修飾的pDB"40的Notl表達序列盒的DNA序列預期如下pDB2540+2xGS接頭611211612413013S14214B1541S〇l"1721781NotlGCGGCCGCccatagacagatcsctagggacgaaagagct仁taagaggcttggacacatatatgcacttatgtaatgcggtagagatggacctatcgcagacaagcgctcggtgcaatgggtttgaacactgcccggggtctccgggttaggcaaaatttggtcccgttatatcgtgaaaggagaaacaggcaccgttagcagtgccaattgcattgcacctttttt333CggctcagtaaattggagttccgaaaaaaaaactaacagtaNai:工aaccctcatG33cgcttgsccgscaaatcatgcacccgacaaaaaacgaggggctttcggtgccactgcagataaagagcttcccatacaGCGCCtccaagaatacg仁ctgccactaset己tagcacag仁ctttggsaatgtggcttatcgataagacagccaccatccggctcgcctttscgaggtcacagtgtgataat:gtgcctacttgtccgtggattaggtgactscgcca_gga_ctccaattagcHind:[工工ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagatgaagtgggtt841ttcategtetccattttg亡tcttc^ttctcctctg,cttact:>......................融合蛋白前導序列-..Bgl工工ctAGATCTttggataagaga901短10211081i:ui120112611381BajnK工ggtGGATCCggtggttccggtggttctggtggttccggtggtgaegcteacaagtccgaa>>.........:......GS:接頭'.................〉1>>.....rHA........>Age工gtcgctcACCGGTtcaaggacctaggtgaggaaaacttcaaggct匕tggtettgatcget>..............rHA合成基因連續到鹼基2739ttcgctcaatsccgaattcgcscsccttgtgacgacaacc仁tccacgacacca_ta_cttct:ac仁仁gcaacactasgscttggttgtgctaacaaacttgccacgraagaaacacgctccsgaatgtccattctgttgctgacgttgtgtactaagattggt仁cttcttgaagattgttgttcgaagatcacggaatctgctggttgetaectagaccagaagasgtac亡t:gtttegctaagatcaag仁tggttgsgagaaacsatgtttcttttgaegtcataegaaattgegstsca^ggccaacgasgttcaagtccttggtgtactgcttagsagacactgct仁tcscc14411501156116B11741180118S119211981204121012161"2122已123"2401gaatgttgtcgacgaaggtaggtgaaagaggaattcgctgcacggtgactaaccaagacttctcactgtagctgacttcgttgggtatgtttgagattggcacgaatgttt仁gatcaagcttgttggttatctagaaactccatgtgctgtgtttctctgaagctgctgaaggcttcttcctttcaaggcaagtttctaatgttggaatgctatctcttcttgctgaagtttgaatctaatcttgtacgactaagacctaacgctaaggtaaaactgtgagatacactaactgatagagtctttggwgttsaggctgctttgggc仁gtcgttggttacttgctgatgaccaagttgaagtgaaaacgatggacg仁仁仁gtatacgctagacgaaacCacctttcgatgaaattgttcgaagaaggtcccacggttctaaggtccgtcgtt■caccaagtgtcgacgaaacttgttt^ttgcagattgaeigtgctagattg仁gacttgactaagagctgactgaatgttgtggaaatgccagaagaactacgagacacccagttggaaaagtttcaagccatcaattgggtgcaagtctccatgttgtaagc仁tgaaccaattgtactgaattacgttccaacaaagttggagtgcttccttctcaaagattaggttcacactggctaagtactgacttgccctgaagctaaactactccgtgttgtgctgctgg匕cgaagaaatacaagttccccasctttacccagaagctgtgtgttttctttggttaaaggaattcaatgaattgagacccaaaggcttgaatgttgtcatctgtgaaatctttggctggacgtcttctgtct仁gttgtgctgacccaccaaaacgctggttgaagtctaagagaatgcgctgaaact246125212581270127612S21288129413001ttcaccttccactgc仁t仁gggtcstggatg2641tgtttcgctgEcoRVacgctGATATCtgtaccttgttgaattggtcaagcacaagatt仁cgctgctttcgttgaatccgaaaaggaagtgttgtasagaaggtaagaagtt:ggtcgctgcttccc...........rHA合成基因......aggctgatgasttgaaggctBsu36Iaagc仁gCCTTAGGcttaggtBspE工Kpn工ggttctagtggt丁CCGGAggttctggtGGTACCggtggttHind工工工aatAAGCTTaattcttatgatttatgatttttattattaaataagttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaagtgactcttaggttttaaaacgaaaattcttattcttgagtaactctttcc仁gt:aggt:caggttgctttctcagg仁atagcatgaggtcgctc仁tattgaccagcaaatgcctgcaaatcgctccccatttcacccaattgttgagttga仁gaatctcggtgtgtattttatgtcctcagagSphlacacctctaccgGCATGCcgagatatgctaactccagcasgacaacacctgttgtaatcg30S1ttc仁tccacacggatcGCGGCCGC可將編碼多肽的DNA插入BglII和BamHI位點之間以表達N-末端白蛋白融合蛋白，或者插入單一的BspEI和Kpnl位點之間以表達C-末端白蛋白融合蛋白，或者插入兩種位點對之間以製備聯合N-和C-末端白蛋白融合蛋白。通過使用本文所述的BglII-BamHIDPI-14cDNA和BamHI-HindlllDX-890cDNA可最筒單地例證這點。通過將這些cDNAs連接進合適的位點，可構建具有下列DNA序列的DPI-14-(GGS)4GG-rHA-(GGS)4GG-DX-890融合蛋白。Not工1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag"atagacagatagagatgqacgagaaacagggggggagaaaagg3gaaaagagaaggaaag1213014214B1721csctagggacgaaagagctttaagaggcttstgeacttatetttaaaegetgttgaasaaccatatgttacetategcagacaagcgctcggtgcaatgggtttgaacactgcccggggtcteegggttaggtcccgttatcaccgttagcagtgccaattcegggaggagcagagtagcaggctcagtaaattggagttcsacgcttgsctgcacccgscgggcttteggtgccactgcaGCGCCtccaaatagcacagtagatcaggtcggctgggsaactttggaaatgtggct亡atcccaccatccgactgccggctgctcgcctttacgaggtcacag匕gtgataatgtgcctactttaggtgactacgccsggsctccaattsgc781Hind工工IttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctsscssgesssgatgaagtgggttBgl工工841t;tcatcgtctccattctgttct仁gttctcctctgct仁actctAGATCTttgga仁aagaga>.......................融合蛋白前導序列........................9019S11021gaagctgttagagasgtttgttctgascaagctgaaactggtccatgtattgetttctte>>DPI—14達鹼基1060:ccasgatggtacttcgatgttactgaaggtaagtgcgcgcca仁tcttctacggtggttgtggtggtaacagasacaacttcgatactgaagaatactgtatggctgtttgtggttctg匚t>............................DP工-14............................>:>10B11141120113211S2117411S0120412101216122212341252125B12"1ggtGGATCCggtggttccggtggttctggtggt仁ccggtggtgacgctcacaagtccgaa》................GS接—頭.................>1》...rHA合成基因'Age工gtcgctcACCGGTtcaaggacctaggtgaggaaaacttcaaggctttggtcttgatcgct>rHA合成基因連續到鹼基2877..............ttcgctcaatcacaccttgtatggctgac仁gacgacaaccgaatgttgtcgacgaaggtaggtgaaagaggaattcgctgcaeggtgacttctcactgtagctgacttcgttgggtatgtcacgaatgttttgttggttaccatgtgctgsccccagtcttgtttctctgttcsccttccacttgcs3csctaagacttgtcggtgataagttgtgctaacaaacttgccacgctccsgaaagctgctgaaggc仁tcttcctttcaaggcaagtttctaatgttggaatgctatctcttc仁tgctgaagttcttgtacgactaagacctaaegctaaggtaaaactgtgatgggtaaggtsagattacttctgatagagtctttggsagtacgct:GATATstgtccsttctgttgctgacgttgtgtact:aagsttggttcttcttgaagattgttgttctaaggctgetcgctaagcaattgggctgCcgttggttacttgct:ga仁gaccaagttgaagtgaaaacgatggacgtttgttttcgatgaaattgttcgaagaaggtcccacggttctaaggtccgtcg仁tcaccaagtgtCTgtaccttggaagatcacggaatctgctggttgetsectgaaagasacgaagtscttgt仁tcgctaagstgtttgttgcagattgaagtgctagattgtg&cttgsctsagagctgac仁gaatgttgtggaastgccagaagaactacgagacacccagttcaagecatcaattgggtgcaagtctccatgttgtaagcttgaaccaattacg仁tccsstcaagttggttgagagaaacaatgtttcttttgacgtca仁aegaaattgegtgettecttctcaa^gsttaggfttcacactggctaagtaaaaagccat仁ctgacttgeectgaagctaaactactccgtgttgtgctgctgg.tcgaagaaatacsagttccccaact仁tacccagaagcct匕tggttaacasgtccttgctscggtga^gtgtactgcttgct仁tcaccccca_a_aggcttgaatgttgtg仁仁ggaaaagatctttggctggacgtc仁tctgtct仁gttgtgctgaccca_ggttgaagtcta^gsgaa_tggeaegssaagcsgssg3ccscgctgaaacttaagaagcaaformulaseeoriginaldocumentpage69但是由於前24個胺基酸構成本文所述的該融合蛋白的前導序列，因此分泌產物的胺基酸序列如下-1eaveevcseq51eycravcgsa101faqylqqcpf151vatlretyge201fhdweetflk251cllpkldelr301efaevsklvt351eccekpllek40]_lgmfla'eyar451fkp:lveep，501sri、;lgkvgsk551ctes:lvnrrpsoi丁alvelvkhk651aasqaalglg701cvlfpyggcqaetgpc工affggsggsggsgedhvklvnevmadccakqepkylye工arrhdegkassakqdltkvhteccshc工aevendrhpdyswllcckhpeakrmcfsa;levdetpkatkeqlkagsggsggsgggkignkfysekpjwyfdvteggsggdahksetefaktcvadernecfl/3hkpyfyapsl:lfrlkcaslqkfhgdllecaddempadlpslalrlaktyettqlgeykfqnapcasdylswyvpkefnaetvmddfaafvesggeacnlp工ecreycgvpkcapffyggcvahrfkdlgeesaencdkslddnpnlprla/fakrykaaftgerafkawavradlakyiceadfveskdvclekccaaadpllvrytkkvplnglcvlhekftfhadictlkcckaddketwgpc工affpgg艦則fdteewfkalvliahtlfgdklc了rp￡vdvmctaeccqaadkaaarlsqrfpkanqdsissklkKNTAEAKDVFhecyakvfdegvstptlvevtpvsdrvtkcsekerqikkqcfaeegkklvrwafdavkgk實施例23:DPI-14-(GGS、GG-HSA融合蛋白的胺基酸序列表33顯示了DPI14通過含有(GGS)4GG的接頭與HSA融合的胺基酸序列。使用本文所述的方法和載體可簡單地構建編碼給定序列的基因。DPI-14是HNE的有效抑制劑且與HAS的融合產生具有更長血清殘留時間的分子。表1:來自GenBank登錄號AAN17825的成熟HSA的胺基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLOHKDDNP肌PRIjVRPEVDVMCTAFHDNEETFIjKKYLYE工ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHC工AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQISICEIjFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTAL/VELAAKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL(SEQIDNO:1S)表2:DX-1000和DX-88的胺基酸序列DX-1000(SEQ工DNO:DX-88(SEQ工DNO:表5:N-末端Bg/II-B"mHIDPI-14cDNA的DNA序列TCTGCTGGTGGATCC(SEQIDNO:_)表6:C-末端"flmHI-/^"dnDPI-14cDNA的DNA序列表7:N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白編碼區的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage72表8:N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白的胺基酸序列tableseeoriginaldocumentpage73表9:C-末端白蛋白-(GGSXiGG-DPI-14融合蛋白編碼區的DNA序列formulaseeoriginaldocumentpage74嫋10:C-末端白蛋白-(GGSVGG-DPI-14融合蛋白的胺基酸序列謹KSEVAHRFKD1jGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFE;DHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE1SICDK:SLHTLFGDKLCTVATTiRErYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAraDNEETFLKKYLYE工ARRHPYFYAPEliLiFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLIjPKLDELRDEGKASRADLAKY工CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLiPSLAADFVESKDVCKNYAGNRNNFDTEEYCMAVCGSA(SEQIDNO:表11:C-末端BamHI-HindIIIDX-1000cDNA的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage75表12:N隱末端Sg/II-^amHIDX-8卯cDNA的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage75表13:C-末端五w"HI-歷mflnDX-890cDNA的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage75表14:N-末端DX-890-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白編碼區的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage76表15:N-末端DX-890-(GGSVnrT-白備白融合蛋白的胺基酸序列EC3KKLVAASQAALGL(SEQIDNO:表16:C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-890融合蛋白編碼區的DNA序列TOCTCA/TCGGTTTAAAGATTTGGGA口AAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTMATTAGTGATGXATTTGCAAAAACATG丁GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCAXACCCTTTTTGGAGACAAAT丁ATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATCGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACGAGAAATGAATGCTTCTTGCTGACAACCCAAACCTCCCCCACCvGAGGTTGCACTGCTTTTCATGAGAATTTTTOAAAAAATACTTATA丁GAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTT丁A丁GCCCCGGAACTCCTTTTCTTTCCTAAAAGGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTCCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATCAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTCCCAAACAGAGGCCAGTCTCCTTCAAAGCA丁GGGCAG丁AGCTCGCCTGAGCGTTTGCAGAAGT丁TCCAAGTTAGTGACAGAGTCCACACGGAATCCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATCTGCTCATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTA丁ATCAAGMTCGA丁CTCCAGTAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTCGAAAAA丁CCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGA丁GCCTGCTCATTAGCTGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGG'CAAAGGATGTCTTCCTGGGCAtGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCC:AAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTG.CTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTT,GTGGVM3AGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAgactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaam:GCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTGAAGCCTGTAACTTGCCAATTGTTAGAGGTCCATGTATTGC丁TTCTTCCCAAGATGGGCTTTCGATGCTGTTAAGGGTAAGTGTGTTTTGTTCCCATATGGTGGTTGTCAAGGTAACGGTAACAAGTTCTACTCTGAAAAGGAATGTAGAGAATACTGTGGTGTTCCA(SEQID'NO:)表17:C-末端白蛋白-(GGSVGG-DX-890融^茶白的氨泉酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATIiRETYGEMADCCAKQEPERNECFLVEEPQNLIKQNCELFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCABDYIiSWLNQIvCVXHEKTPVSDRVTKCCTESLVWHRPCFSALEVDETYVPKEFMAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSGGSGGSGGEACNLPIVRGPCIAFFPIWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYC(SEQIDNO:_)表18:N-末端Bg/II-醜amfflDX-88cDNA的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage79嫋19:N-末端DX-88-(GGShGG-白蛋白融合蛋白編碼區的DNA序列GAAGCTATGCACTCTTTCTCTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGT丁CTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGGAGTGTAAGAAGATGTCTACTAGAGACGGT(SEQIDNO:_)表20:DX-88::HSA的胺基酸序列eamhsfcafkaddgpcraahpr^ffniftrqceefiyggcegngnrfes:lEECKKMCTRDGGSGGSGGSGGSGGDAHKSEVAHRFKDLiGEENFKALA/IilAFAQYIjQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSIjHT1jFGDKLC丁VA1TjRETYGEMADCCAKQEPERNECFI^HKDDMPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFIjKKYLYEIARRHPYFYAPEKLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACIjIjPKLDEIjRDEGKASSAKQRLKCASIjGKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEE7VEVSKLVTDIjTKVHTECChgdjl;lecaddRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPI/LEKSHC工AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLiLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLi工KQNCELFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL/3KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYXSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCctes:lvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadicti;sekerqikkqTALTVELVKHKPKATKEH(SEQIDNO:表21:C-末端BamHI-HindlllDX-88cDNA的DNA序列GGATCCGGTGGTGAAGCTATGCACTCTTTCTGTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGTTCTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGTGTAAGATGTGTACTAGAGACTAATAAGCTT(SEQIDNO:_〉表22:HSA::〖GGS)4rTrT::Dy-WgatgcaCSCagt3aggttgetcateggtttgat仁tggaagsst仁cgcc仁tggtgttg3仁tgcctttgett3tct仁cagcagtgttttcatgtasssttagtaacttttgcaa^aatgtgttgetgatgaggetsattgtgactC￡Lcttcatc仁ttttggagac仁tstgc3ca_gttgcaisetcttcgttatggtstggetgact:gctgtgescctg巧sa±ga^tgcttcttgcasetcccccg^Lttggtgagaccagsggttgatatgtgcactgettttgacgaagagtttttg仁5LCttsgaasttgccagacatcctttttatgccccggaaetccttttctttgetW3&ggtata^ELgetgettttgastgttgcgc仁getgatgetgcctgcc仁g仁tgaagetcgatgaacttegggatgaagggsaggc仁tegtctgrccasscagetcsag亡gtgccagtetctttggagaaagagetttcgcatgggesgtagetcgcctgagecagagatttcccgetgagtttgcagssgtttecsaggtggatcttseegtcacggaa仁gctgcest，gatctgcttgaatgtgetg紅gacagggcggaccttgccaagt己tatetgtaatCMgattegatetecctggaatgctgtcctttgtectgcsttgccgs3gtgsstgatgagcctgc仁gacttgteattsgetgetga^tttt3ttagtgatgtttgctdtgetgsggesgatgtcctgtttta^tgsa仁&tgesagaaggcc仁gsttct狗ctgctgctgagacttgccaaggsa_deca_ctetag巧tgctgtgccgetgcagatcctesttgct3tgccttcgaitgastttcctcttgtggagcctcagttsELtCtgtgagctttttgagcagct仁仁scttccsg33仁cta_tt3gttcgttscdCCaagcccgtgactactcttg仁agaggtcteaagsggagtgggcagetgttgtestcctgaagc，atgccct9tgaatatCt3tecgtggtcctgcagtt3tg仁gtg"gC3t333acgccaiagtagagtc3CCtgctgctecttggtgaggcgatgctttteagetctggaagtcgattscgttccctttgetttcsecttcgcagattgcctttctgagateaagactgcacttgttgagetcgtgC3C.cccaaggcagagC33ctggetgttatggstgatt匕cgcagettttgtagagsagtgctgcaaggetgacgataaggagtgctttgccgaggagsascttgttgetgc3agtgetgccttsggcggtgg仁tctggtggttec.ggtggttctggtggatecggtggtGAAGCTATGCACTCTTTCTGTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGTTCTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGGAGTGTAAGAAGATGTGTACTAGAGAC(SEQ工DNO:一表23:表22中編碼的成熟蛋白質的胺基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL工AFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLiQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDE!jRDEGKASSAKQRIiKCASIjQKFGERAFKAWAVARIiSQRFPKAEFAEVSKLVTDIuTKVHTECCHGDLLECADDRAI)LAKY工CENQDS工SSKLKECCEKPLIjEKSHC工AEVENDEMPADIiPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLiYEYARRHPDYSWlaLLRLAKTYETTIuEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ肌IKQNCEIaFEQLGEYKFQNALAVRYTKKVPQVSTPTLiVEVSRNU3KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC丁ESl;VNRRPCFSALEVDETYVPKEF船ETFTFHADICTIjSEKERQIKKQTAIiVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAAS。AAIiGLGGSGGSGGSGGSGGEAMHSFCAFKADDGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRJD(SEQ.IDNO:_)具有2xGS接頭的pDB2300Xl的Notl序列盒j--1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag!Notl.，..Slatagacagatagagatggacgagaaac:agggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaag;121aaagactcatctatcgcagataagacaatcssccctcstGGCGCCtccasccaccatccgINarl,..181cactagggaccaAGCGCTcgcaccgttagcAfe工.-actGCCGGCtNgoM工V241301361421gsaagagc仁ttaagaggc仁tggacacatstgtgcaatgggtttgaacactaccaatagttttgccaagacgcattgcaccttttttaaaCcgacaaatcataxactctatTGCACccgacgaatacgtctgccactaactatagcacagtagatcaggtcBsgl.gctcgcctttacgaggtcactg仁gcctsct4B1atgcacttatgcccggggtcccgggaggagaaaaaacgagggctgggaaatgtccgtgga541ctttaaacgctccgggttagcagagtaGCAgggcttTCGgctttggaaatttaggtgactBcgl.........6D1tgttgaaaaagcaaaatttgggctcagtaatgCCActgcagTGGcttatcacgccaggacBstX工........6￡ILtgcgggagtggcgggggcaaacacacccgcgataaagagcgcgatgaatataaaaggggg721ccsatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaaCTTAAGagtccaattageAflII.781ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagHindI工I(1/2)12345678101112131415MKWVFIVSIFLiFSsatgtgggttttcateg仁Ctecatttt3ttcttgttc仁CCtct1618192021222324252S27282930ASRSDKRGGSGGSgettsctctAGATCTgstaagagaggtGGAggttecBamHI..31323334353S3738394041."4345GGSGGSGGDAHKSEVggtggttcttec的tggtgacgetCSCtecgaagtc"4748495051525354555S575859soAHRFKI;.GEEFKASS4getcACCGGTtcCTAGGtgaggaattcaagget:ttgAgeI.Avrl.100910S411441189123412"1324SIVgtc7SDgatS2S3Ii工ttgate7778HVCACGTCSIc1Q6TSlCC121T136Raga151PCSLCVgtt107122Ytac137N152agaDgac$3Aget108F123妙13SE153ttgS4AgetKG124gaa!39ctgt154Vgtt169Egaa65Fttc80Xi仁tg110gat125MatgFttc155Raga170Egaa56Aget81Vgtc;6Stct111Kaag12SAget141ttg15SPccs171Tetcc678297AgetU2Lttg127Dgac142Q157Egaa1726B83Egaa6984Vg仁仁98E113Ctgt128CHC3C1S8Vg匕t173!ttg5>SsacTact123Ctgt1"K159174sag70QT3CC100cVgtt130Aget:U5Dgac160Vgtc17571QEgas101Dg&clisget131Kaag1S1Matg176Y72Ctgt87仁仁c102KsisigT132Q147162Ctgt177IiTtg73P8BAgc仁103stecttg1"Egaa148Pset1787475FEttcgaa8S30KTaagact10410SIiH119120agagaaPEccagaa143150sacttg164165AFgetttc179180E工Seal.1414150415431594181Aget19SAget211Egaa241Iittg256Raga182R197Ksag212aag227Gggt242Q2S7ttg1B3aga1S8RAget228K243Kaag258Stct:iS4HC3C19SYtac214Aget229Aget2"Fttc25SQ185PCC3200Ksag215Ctgt230Stct245Gggt2S0R185Ytac201Aget216ttg231stec245E2S1B*ttc187ttc202Aget21*7ttg232Agc仁247Rags262P188Yt3C203Fttc218PCCSL233Kssg248Aget2S3189A^Ct204T21SKaag234Qess243Fttc264Aget190PCCSL205Ega_a220tts23Saga250KE191Egaa_20SCtgt221Dgat23Sttg251Aget26SPttcIittg207Ctgt222Eg&a237Kaag252W267Aget193ttg208Q223ttg238CtstAget268Egas194195FFttcttc209210AAgetget22422SRDagagac235240gettec2S425SVAgtcget270gt仁tc仁271272273274275276277278279280281282283284285KLVTDLTKVHTECCHttg3Ctgac2862872BB290231GDliECggtgscttgttggaatgt30130230330430530Syiceq1729taca_tctgtgaa316317318319320321CCEKP1774tgttgtgaaasgttg331332333334335336VENDEM1819gttgaagatgaaatg34734S343350351DFVESKgacttcsttgaatct3613623S33653"KDVFG1909gtcttc仁tg!376377378379380381HPDYSVC3Cgact￡LC仁ccgtt39139339SYETTE1999tacgaasetttggaa40S40740B409410"1ECYAKgaatgttSLCgetgtt421422423424425426EPQN工2089gaatTGATCBell..I437438439440441ILGEYKF2134ttgggtgaatacasgttc!451452453454455456IKKVPQV2179aagaaggtcccacaagtc4""74。470471RN1/GKV2224AGAaacttgggtaaggtc4814824B34844S5486A3CRMPC2269getaagaGAATGCcatgtactaaggtt'cacactgaatgttgtcac29229329429529729B299300getgatgacagagetgacttggetaag307308309310311312313314315DS工SSKLKEgac仁ctatCTCTTCcaagttgaaggaaEarl....32232332432532S327329330IiEKSHCIAEttggaaaagtctcactgtattgetgaa337338339340341342343344345cCAGCTGacttgccatctttggetget3523533543553563573583593S0DVCKNYAEAgacgtttgtaagaactacgetgaaget368369370371372373374375MFLiYEYARRatg,ttcttgtacgaatacgetagsaga38238338438538S387388389390gtcttgttgttgagattggetaagacc"735B399400401402403404405KCCAAADPHaagtgttgtgetgc仁getgacccacac412413414415416417418420FDEFKPIjVEttcgatgaat仁caagccattggtcgaa427428429430431432433434435KQNCEIjFEQAagcaaaactgtgaattgttcgaacaa442"3444"5"644*7448449450ona;llvrytcaaaacgetttgttggttagatacact4574SB459460461"24。4S4465STPTLVEVStCCAccccaacttTGGttgaagtcTCTXcm工................472473474475476477478479480GSKCCKHPEggttctaagtgtt;gtaagcacccagaa4874884894904514924934S4495AEDYIiSVVIigetgaagattact仁gtecg仁cg仁仁ttg,Bsm工...，06"749950D5(US02S035D4S055065075D8509510.NQIjCVIjHEKTPVSDR2314aaccaattgtgtgttttgcacgaaaaGACcccaGTCtctgatagaPshAI........AlwNl.......511512513514S15516S17S1851S5205215225235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cccatttcaatctcggtgtgtattttatcggatCGCGGCCGCNotl......ttct仁gagtaactctttcctgtaggtcaggcttattgaccacacc匕ctaccgGCATGCcgSphl..acccsattgtagatatgetaactccagcaagtectcsgaggacaacacctgttgtaatcg(SEQ.IDNO:_J.129:DX890::(GGS)4GG::HA::(GGS)4GG::DX8卯的胺基酸序列EACNLPIVRGPC工AFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVPGGSGGSGGSGGSGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKA!LVIj工A闊Yformulaseeoriginaldocumentpage97表30:N-末端BglII-BamHlDX-1000cDNA的DNA序別formulaseeoriginaldocumentpage97表31:DXlOOO::(GGS)4GG::HA的胺基酸序列formulaseeoriginaldocumentpage97表32:N-末端BwEI-Kp"IDX-88cDNA-第二個編碼區的DNA序列tableseeoriginaldocumentpage98權利要求1.一種白蛋白融合蛋白，它含有Kunitz結構域肽或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。2.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結構域肽或其片斷或變異體具有功能性活性。3.根據權利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制絲氨酸蛋白酶。4.根據權利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制纖溶酶。5.根據權利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶。6.根據權利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制激肽釋放酶。7.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，它含有DX-890或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。8.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，它含有DPI-14或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。9.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含DX-88或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。10.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含DX-1000或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。11.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包含至少兩個Kimitz結構域融合肽或其片斷或變異體。12.根據權利要求11的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個Kunitz結構域融合肽或其片斷或變異體分別具有功能性活性。13.根據權利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個Kunitz結構域融合肽之一的功能性活性包含抑制絲氨酸蛋白酶。14.根據權利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個Kunitz結構域融合肽之一的功能性活性包含抑制纖溶酶。15.根據權利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個Kunitz結構域融合肽之一的功能性活性包含抑制人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶。16.根據權利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個Kunitz結構域融合肽之一的功能性活性包含抑制激肽釋放酶。17.根據權利要求11的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個Kunitz結構域肽或其片斷或變異體具有不同的胺基酸序列。18.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含選自由DX-890,DX-88，DX-1000,或DPI-14組成的組中的肽的至少一個片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體，其中所述的白蛋白片斷或變異體具有白蛋白活性且所述的肽片斷或變異體具有功能性活性。19.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的白蛋白活性具有與未融合狀態的肽或其片斷或變異體的體內半衰期相比延長選自由DX-890，DX-88，DX-IOOO，或DPI-14組成的組中的肽，或其片斷或變異體的體內半衰期的能力。20.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，它還包含一個或多個額外的白蛋白半分子。21.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包含選自由DX-890，DX-88,DX-IOOO，或DPI-14組成的組中的一個或多個半分子，或其片斷或變異體，或一個或多個額外的白蛋白半分子。22.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的融合蛋白還包含化學半分子。23.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體與白蛋白的N-末端或者與白蛋白的片斷或變異體的N-末端融合。24.根據權利要求23的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結構域肽含有DX-8卯，DPI-14,DX-88,或DX-IOOO。25.權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結構域肽或其片斷或變異體，與白蛋白的C-末端，或白蛋白的片斷或變異體的C-末端融合。26.根據權利要求24的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結構域肽包含DX-890,DPI-14，DX-88，或DX-IOOO。27.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的Kunitz結構域肽包含第一肽，或其片斷或變異體，和第二肽，或其片斷或變異體，且其中所述的肽，或其片斷或變異體不同於所述的第二肽，或其片斷或變異體。28.根據權利要求27的白蛋白融合蛋白，其中所述的第一肽，或其片斷或變異體，和所述的第二肽，或其片斷或變異體選自由DX-890,DX-88,DX-1000,或DPI-14組成的組中。29.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體通過接頭與該白蛋白或白蛋白的片斷或變異體分開。30.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包含如下通式R2-R1;Rl-R2;R2-R1隱R2;R2-L-R1-L-R2;Rl-L-R2;R2-L-R1;或R1-L-R2畫L-R1，其中Rl是選自由DX-890,DX-88,DX-1000,或DPI-14組成的組中的至少一個肽，或其片斷或變異體，L是肽接頭，R2是白蛋白。31.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中融合到白蛋白，或其片斷或變異體上的該Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體的體外生物學活性比未融合狀態的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體的體外生物學活性更高。32.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中與白蛋白，或其片斷或變異體融合的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體的可溶性比處於相同貯存，處理或生理學條件下的未融合狀態的Kunitz結構域肽，或其片斷或變異體的可溶性更高。33.根據權利要求30的白蛋白融合蛋白，其中與白蛋白，或其片斷或變異體融合的至少一個肽，或其片斷或變異體的體內生物學活性比未融合狀態的至少一個肽，或其片斷或變異體的體內生物學活性更高。34.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白是非糖基化的。35.根據權利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白在酵母中表達。36.根據權利要求35的白蛋白融合蛋白，其中該酵母是糖基化缺陷型。37.根據權利要求36的白蛋白融合蛋白，其中該酵母是蛋白酶缺陷型。38.根據權利要求l的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白通過哺乳動物細胞表達。39.根據權利要求38的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白通過培養的哺乳動物細胞表達。40.—種組合物，它含有權利要求1-39任一項的白蛋白融合蛋白和藥用上可接受的載體。41.一種治療患者疾病或紊亂的方法，包含施用權利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟。42.—種治療患有可由DX-890和/或DPI-14調控的嚢性纖維化或嚢性纖維化相關性疾病或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟，其中所述的Kunitz結構域肽是DX-8卯或DPI-14,或其片斷或變異體。43.—種延長DX-890和/或DPI-14，或其片斷或變異體的體內半衰期的方法，包含將DX-8卯和/或DPI-14，或其片斷或變異體融合到白蛋白，或白蛋白的片斷或變異體上的步驟，以便與未融合狀態下的DX-890和/或DPI-14，或其片斷或變異體的體內半衰期相比足以延長DX-890和/或DPI-14，或其片斷或變異體的體內半衰期。44.一種治療患有可通過DX-88調控的遺傳性血管性水腫或遺傳性血管性水肺相關性疾病或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟，其中所述的Kunitz結構域肽是DX-88,或其片斷或變異體。45.—種延長DX-88,或其片斷或變異體的體內半衰期的方法，包含將該DX-88，或其片斷或變異體融合到白蛋白或白蛋白的片斷或變異體上的步驟，以便與未融合狀態下的DX-88,或其片斷或變異體的體內半衰期相比足以延長DX-88，或其片斷或變異體的體內半衰期。46.—種治療患有可通過DX-1000調控的癌症，癌症相關性疾病，出血或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟，其中所述的Kunitz結構域肽是DX-lOOO，或其片斷或變異體。47.—種延長DX-IOOO，或其片斷或變異體的體內半衰期的方法，包含將DX-IOOO，或其片斷或變異體融合到白蛋白或白蛋白的片斷或變異體上的步驟，以便與未融合狀態下的DX-1000,或其片斷或變異體的體內半衰期相比足以延長DX-IOOO,或其片斷或變異體的體內半衰期。48.—種核酸分子，它包含編碼權利要求1的白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。49.含有權利要求48的核酸分子的載體。50.含有權利要求48的核酸分子的宿主細胞。51.—種藥用組合物，它包含有效量的權利要求1的白蛋白融合蛋白和藥用上可接受的載體或賦形劑。52.—種製備權利要求1的白蛋白融合蛋白的方法，該方法包括(a)提供在生物中可表達的含有編碼白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在該生物中表達該核酸以形成白蛋白融合蛋白；和Cc)純化該白蛋白融合蛋白。53.權利要求52的方法，其中該白蛋白融合蛋白包含在糖基化缺陷型酵母菌抹中表達的DX-890和/或DPI-14白蛋白融合蛋白。全文摘要本發明涉及包含與白蛋白或其片斷或變異體融合的諸如Kunitz結構域肽(包括，但不限於其片斷和變異體)的絲氨酸蛋白酶抑制肽的蛋白質。這些融合蛋白在本文中統稱為「本發明的白蛋白融合蛋白」。這些融合蛋白表現出在溶液中的儲存期延長和/或治療活性延長。本發明包含治療性白蛋白融合蛋白，組合物，藥用組合物，劑型和試劑盒。本發明還包含編碼本發明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，用這些核酸和載體轉化的宿主細胞，和使用這些核酸，載體，和/或宿主細胞製備本發明的白蛋白融合蛋白的方法。本發明還涉及抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，激肽釋放酶，和纖溶酶的組合物和方法。本發明還涉及治療囊性纖維變性和癌症的組合物和方法。文檔編號C07K14/76GK101166762SQ03807516公開日2008年4月23日申請日期2003年2月7日優先權日2002年2月7日發明者託馬斯·韋默,斯科特·M·基,漢斯-彼得·豪澤,瓦爾·羅姆伯格,羅伯特·C·拉德納,達裡爾·斯利普,阿瑟·C·利申請人:達爾塔生物技術有限公司;戴克斯公司