血管生成蛋白及其應用的製作方法

2023-05-04 02:12:36

專利名稱：血管生成蛋白及其應用的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及血管生成蛋白，及血管生成蛋白的激動劑或拮抗劑。本發明還涉及鑑別血管生成蛋白活性的激動劑或拮抗劑的篩選方法。
相關現有技術新血管形成，或稱血管發生是胚胎發育，生長及組織修復所必需的。血管法生也是某些病理變化如瘤(即腫瘤和神經膠質瘤)的基本部分。異常血管發生與其它疾病如炎症，類風溼性關節炎，銀屑病，和糖尿病視網膜病變相關〔Flkman，J.和Klagsbrun，M.，科學235442-447(1987)〕。
酸性和鹼性成纖維細胞生長因子分子均是內皮細胞和其它類型細胞的促分裂原。Angiotropin和血管生成素能誘導血管發生，儘管其功能還不清楚〔Flkman，J.，癌症醫學，Lea和Febiger出版社，pp153-170(1993)〕。血管內皮細胞的高度選擇性促分裂原是血管內皮細胞生長因子或VEGF〔Ferrara，N.等，內分泌研究1319-32(1992)〕，其還已知是血管通透性因子(VPF)。
血管內皮生長因子是一種分泌的血管生長促分裂原，其靶細胞特異限定為血管內皮細胞。小鼠VEGF基因已經定性，且其在胚胎發生中的表達模式已經分析。VEGF的持續表達在透明內皮細胞附近的上皮細胞中觀測到，例如在脈絡膜血管和腎小球中。此資料與VEGF作為內皮細胞生長與分化的多重調節劑的作用相一致〔Breier，G.等，發育114521-532(1992)〕。
VEGF與血小板衍生的生長因子，PDGFa和PDGFb呈序列同源〔Leung，D.W.，等，科學2461306-1309(1989)〕。同源程度分別為大約21％和23％。有助於二硫鍵形成的8個半胱氨酸殘基在這些蛋白質中是嚴格保守的。儘管是相似的，但在VEGF和PDGF之間仍有特異差別。PDGF是結締組織的主要生長因子，而VEGF對內皮細胞是高度特異性的。VEGF和PlGF及PDGF的可變剪接的mRNAs已經鑑別，且這些不同剪接產物的生物活性和受體結合特異性不同。VEGF和PDGF有同源二聚體或異源二聚體功能，並與受體結合，且在受體二聚體化之後激發內在的酪氨酸激酶活性。
由於可變剪接，VEGF有121，165，189，和206個胺基酸的4種不同形式。VEGF121和VEGF165是可溶的，並能促進血管發生，而VEGF189和VEGF206在細胞表面與含有蛋白聚糖的肝素結合。VEGF的時間和空間表達與血管的生理增殖相關〔Gajdusek，C.M.，和Carbon，S.J.，細胞生理139570-579(1989)；McNeil，P.L.，等，細胞生物學雜誌109811-822(1989)〕。其高親和性結合位點只位於組織切片中的內皮細胞中〔Jakeman，L.B.，等，Clin.Invest.89244-253(1989)〕。此因子可分離自垂體細胞及一些腫瘤細胞系，並包含於一些人體神經膠質瘤中〔Plate，K.H.，自然359845-848(1992)〕。令人感興趣的是VEGF121或VEGF165的表達授與中國倉鼠卵巢細胞在裸鼠體內形成腫瘤的能力〔Ferrara，N.等，臨床研究雜誌91160-170(1993)〕。通過抗VEGF單克隆抗體對VEGF功能的抑制示出在免疫缺陷小鼠中抑制腫瘤生長〔Kim，K.J.，自然362841-844(1993)〕。另外，VEGF受體的顯性陰性的突變體示出在小鼠體內抑制神經膠質瘤生長。
也發現血管通透性因子(VPF)即使在創傷停止後，仍可對血漿蛋白有持續微血管高通透性應答，這是正常傷口癒合的一個典型特徵。由此推測VPF是傷口癒合的一個重要因子。Brown，L.F.等，實驗醫學雜誌1761375-1379(1992)。
VEGF的表達在血管性組織(如肺，心，胎盤和固體腫瘤)中較高，並與時間性及空間性血管發生相關。VEGF還示出在體內誘導血管發生。由於血管發生是正常組織尤其脈管組織修復所必需的，因此VEGF已用於促進脈管組織修復(如在動脈粥樣硬化中)在1991年12月17日授權的Chen等的美國專利No.5073492中，揭示了一種在適當環境中協同性增強內皮細胞生長的方法，包括在環境中加入VEGF，效應器和血清衍生的因子。同樣，血管內皮細胞生長因子C亞單位DNA已通過聚合酶鏈反應製備。此DNA編碼的蛋白質可以是異源二聚體或同源二聚體。此蛋白質是一種哺乳動物血管內皮細胞促分裂原，並由此用於促進血管發育和修復，如1992年4月30日公布的歐洲專利申請No.92302750.2所述。
近年增加到血管內皮生長因子家族的蛋白質包括VEGF-3，VEGF-D和VEGF-E。VEGF-3生長因子是促進血管內皮細胞和/或中胚層細胞增殖的強促分裂原，如在1996年12月12日出版的Hu等的國際出版物No.WO96/39421所述。VEGF-D是血管內皮細胞生長因子家族的另一成員，並具有刺激和/或增強內皮細胞增殖或分化的能力，如1998年2月26日出版的國際出版物No.WO98/07832所揭示。最近Meyer等公布了一種血管內皮生長因子家族的新成員，稱為VEGF-E。VEGF-E是一種潛在的血管生成因子，其選擇性地與VEGF受體-2(KDR)結合〔Meyer等，EMBO雜誌，18363-374(1999)〕。
因此，需要促進或抑制血管生成蛋白的療法。
發明概述本發明涉及VEGF/PDGF蛋白質家族的成員及相關蛋白質，統稱為「血管生成蛋白」或「血管生成多肽」，以及涉及血管生成蛋白的激動劑和/或拮抗劑。
根據本發明的另一方面，提供了利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸，例如治療性用於刺激血管發生，傷口癒合，損傷的骨和組織的生長，及促進血管組織修復的方法。尤其提供了利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸治療周圍動脈疾病的方法，如治療關鍵肢體局部缺血和冠狀動脈缺血性心臟病。根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的激動劑，其可用於增強這種多肽的作用，如促進血管發生，淋巴管發生，或促進血管組織修復。本發明還涉及編碼多肽的抗原性或免疫原性表位的上述多肽的變體。
根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的激動劑，其可用於增強或促進這種多肽的作用，例如阻止腫瘤血管發生，並因此抑制腫瘤生長，治療糖尿病視網膜病變，炎症，類風溼性關節炎，和銀屑病。根據本發明的又一方面，提供了這種多肽的激動劑，其可用於增強這種多肽的作用，例如促進血管發生，淋巴管發生，或促進血管組織修復。
根據本發明的另一方面，提供了抗這種多肽的抗體，和生產這種抗體的方法。根據本發明的又一方面，提供了利用這抗體治療性用途的方法例如刺激血管生成，傷口癒合，損傷的骨和組織生長，促進血管組織修復，及刺激淋巴管發生。尤其提供了利用這種抗體治療周圍動脈疾病如關鍵肢體局部缺血和冠心病。
根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的拮抗劑，其可用於抑制這種多肽的作用，例如阻止腫瘤血管生成並因此抑制腫瘤生長，治療糖尿病視網膜病變，炎症，類風溼性關節炎和銀屑病。
根據本發明的另一方面，提供了新的成熟多肽及其具有生物活性和診斷性或治療性用途的片段，類似物和衍生物。本發明的多肽是人源的。
根據本發明的另一方面，提供了分離的核酸分子，其包含編碼全長或截短的具有表1所示胺基酸序列的血管生成多肽的多核苷酸。本發明還涉及血管生成蛋白的生物活性及診斷或治療性用途的片段，類似物和衍生物。
根據本發明的另一方面，提供了通過重組方法生產這種多肽的方法，包括在促進所述蛋白質表達的條件下，培養含有編碼本發明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞，隨後回收所述蛋白質。
根據本發明的又一方面，提供了包含足夠長而特異雜交本發明的核酸序列的核酸分子的核酸探針。根據本發明的另一方面，提供了診斷與本發明的核酸序列或由此核酸序列編碼的蛋白質中突變相關的疾病，或對此疾病易感的方法。
根據本發明的另一方面，提供了一種利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸進行與科學研究、DNA合成及DNA載體生產等體外目的的方法。
根據本發明的另一方面，提供了篩選血管生成蛋白的激動劑和/或拮抗劑的方法，這些激動劑和/或拮抗劑可增強或抑制所需活性。
本發明的這些及其它方面本領域技術人員通過本文教導將顯而易見。
附圖簡述以下附圖舉例說明了本發明的實施方案，並無限制本發明權利要求所涵蓋的範圍。


圖1A-1E示出VEGF2的全長核苷酸(SEQ ID NO15)和推導的胺基酸(SEQ ID NO16)序列。此多肽包含大約419個胺基酸殘基，其中23個代表前導序列。使用標準單字母縮寫形式。用Model373自動DNA測序儀(應用生物系統公司)進行測序。序列精確性預計高於97％。
圖2A-2D示出VEGF2的截短的生物活性形式的核苷酸(SEQID NO25)和推導的胺基酸(SEQ ID NO26)序列。此多肽包含大約350個胺基酸殘基，其中前24個胺基酸代表前導序列。
圖3A-3C舉例說明了在以下序列間的胺基酸序列同源性PDGF-A(SEQ ID NO2)，PDGF-B(SEQ ID NO4)，P1GF(SEQID NO6)，PlGF-2(SEQ ID NO8)，GDGF(SEQ ID NO10)，VEGF(SEQ ID NO12)，VEGF-A(SEQ ID NO14)，VEGF-2(SEQ ID NO16)，VEGF-3(SEQ ID NO18)，VEGF-D(SEQID NO20)，VEGF-D1(SEQ ID NO22)，和VEGF-E(SEQ IDNO24)。框區代表保守的序列和8個保守的半胱氨酸殘基的位置。
優選實施方案詳述定義根據本發明的一方面，提供了多肽分子，其包含PDGF和VEGF家族的成員。更特別地，PDGF和VEGF家族成員包括血小板衍生的生長因子A(PDGF-A)(SEQ ID NO1-2)，如歐洲專利號EP-682110所揭示；血小板衍生的生長因子B(PDGF-B)(SEQ IDNO3-4)，如歐洲專利號EP-282317所揭示；胎盤生長因子(PlGF)(SEQ ID NO5-6)，如國際出版物WO92/06194所揭示；胎盤生長因子2(PlGF-2)(SEQ ID NO7-8)，如Hauser等，生長因子4259-268(1993)；神經膠質瘤衍生的生長因子(GDGF)，如歐洲專利號EP-399816所揭示(SEQ ID NO9-10)；血管內皮生長因子(VEGF)(SEQ ID NO11-12)，如國際出版物WO90/13649所揭示；血管內皮生長因子A(VEGF-A)(SEQ ID NO13-14)，如歐洲專利號EP-506477所揭示；血管內皮生長因子2(VEGF-2)(SEQ ID NO15-16)，如國際出版物WO96/39515所揭示；血管內皮生長因子3(VEGF-3)(SEQ ID NO17-18)，如國際出版物WO96/39421所揭示；血管內皮生長因子D(VEGF-D)(SEQ IDNO19-20)，如國際出版物WO98/07832所揭示；血管內皮生長因子D1(VEGF-D1)(SEQ ID NO21-22)，如國際出版物WO98/02543所揭示；和血管內皮生長因子E(VEGF-E)(SEQ ID NO23-24)，如德國專利DE19639601所揭示，並在此統稱為「血管生成蛋白」或「血管生成多肽」。以上所述參考文獻在此以其全文併入參考。
本文所用術語「激動劑」是指促進或增強血管生成蛋白所需活性的任何多核苷酸，多肽，抗體或分子，包括小分子。本文所用術語「拮抗劑」是指削弱或抑制血管生成蛋白所需活性的任何多核苷酸，多肽，抗體或分子，包括小分子。
本文所用術語「所需活性」是指與血管生成蛋白的天然活性相關的，激動劑和/或拮抗劑促進內皮細胞增殖(血管生成或淋巴管發生)，或抑制內皮細胞增殖(血管生成或淋巴管發生)的活性。血管生成蛋白的激動劑和拮抗劑本發明涉及血管生成蛋白的激動劑和/或拮抗劑。
血管生成蛋白激動劑的一實施方案包括抗體，其結合多肽並促進或增強所需活性。這些激動劑例如包括特異血管生成多肽的單克隆或多克隆抗體，其結合血管生成多肽並促進這些多肽的血管生成活性，例如通過穩定血管生成蛋白的二聚體化形式，或通過聚集結合抗體的多肽，從而濃縮或集中血管生成多肽的活性。
另一潛在的血管生成蛋白激動劑包括促進或增強血管生成蛋白活性的小分子。這種小分子激動劑可參與例如與血管生成蛋白受體，或者相關的受體的結合，並從而增強血管生成蛋白的活性。
在另一實施方案中，血管生成蛋白激動劑包括增強血管生成蛋白活性的多肽。這種多肽激動劑可包含於與血管生成蛋白結合受體中，或者例如相關的受體中，並從而增強血管生成蛋白的活性。
另外血管生成蛋白激動劑例如包括促進或增強血管生成蛋白所需活性的反義構建。
潛在的血管生成蛋白拮抗劑包括與多肽結合併有效刺激血管蛋白活性的抗體，或者在一些情況中的寡核苷酸。或者，潛在的拮抗劑可以是結合血管生成蛋白受體的密切相關的蛋白質，然而，它們是多肽的滅活形式，並從而阻止血管生成蛋白的作用。這些拮抗劑例如包括血管生成蛋白多肽的負顯性突變體，例如血管生成蛋白的異源二聚體形式的一個鏈可以是顯性的，並可以是突變的，由此生物活性不保留。負顯性突變體例如包括截短形式的二聚體血管生成蛋白，其能與另一二聚體相互作用，形成野生型血管生成蛋白，然而所得同源二聚體是失活的，並且不能呈現所需的特徵性活性。
另一潛在的血管生成蛋白的拮抗劑是用反義技術製備的一種反義構建。反義方法可用於通過三螺旋形成或反義DNA或RNA控制基因表達，這兩種方法基於多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，編碼本發明成熟多肽的多核苷酸序列的5』編碼部分，可用於設計長度為大約10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設計的DNA寡核苷酸與包含於轉錄中的基因的一區域互補(三螺旋，見Lee等，核酸研究63073(1979)；Cooney等，科學241456(1988)；和Dervan等，科學2511360(1991)，從而阻止轉錄和血管蛋白產生。反義RNA寡核苷酸在體內與m RNA雜交，並阻斷m RNA分子翻譯為血管生成蛋白質多肽(反義，Okano，神經化學雜誌56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)。上述寡核苷酸也可送遞細胞中，這樣反義RNA或DNA可在體內表達以抑制血管生成蛋白的產生。
在另一實施方案中，血管生成蛋白拮抗劑還包括一種小分子，其結合併佔據多肽的活性位點，從而使催化部位不可及底物，由此阻止正常生物活性。這種小分子例如包括但非限於小肽或類肽分子。
拮抗劑可用於限制固體腫瘤轉移所必需的血管生成。因為血管生成和新血管化是固體腫瘤生長的必需步驟，因此抑制血管生成蛋白的活性對阻止固體腫瘤的進一步生長，延緩或者甚至退化固體腫瘤是非常有效的。
本發明還涉及一種篩選化合物的方法，以鑑別這種化合物是血管生成蛋白的激動劑還是拮抗劑。這種方法例如有利於血管生成蛋白明顯刺激人內皮細胞在存在共促分裂原ConA的情況下的增殖。獲得內皮細胞並在96孔平底培養平板(Costar，Cambridge，MA)中，在補加ConA(Calbiochem，La Jolla，CA)的反應混合物中培養。加入Con-A，本發明的多肽和要篩選的化合物。在37℃溫育之後，將培養物用1Fci的3〔H〕胸苷(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)脈衝足夠的時間，以摻入3〔H〕，並經玻璃纖維濾膜過濾收集(Cambridge Technology，Watertown，MA)。三份培養物的摻入的3〔H〕胸苷平均值(cpm)用液態閃爍計數儀確定(BeckmanInstruments，Irvjne，CA)，與對照分析(其中不包括要篩選的化合物)相比，有效的摻入的3〔H〕胸苷值表明刺激內皮細胞增殖。
為分析激動劑，進行上述分析，化合物在存在血管生成蛋白的情況下，具有促進3〔H〕胸苷摻入的能力，則表明此化合物是血管生成蛋白的激動劑。相反，為分析拮抗劑，進行上述分析，化合物在存在血管生成蛋白的情況下，具有抑制3〔H〕胸苷摻入的能力，則表明此化合物是血管生成蛋白的拮抗劑。或者，可通過將血管生成蛋白的拮抗劑血管生成蛋白和潛在的拮抗劑與膜結合血管生成蛋白受體或重組受體組合，在適當條件下進行競爭性抑制分析而檢測。血管生成蛋白可被標記，如經放射性標記，由此與受體結合的血管生成蛋白分子的數目可確定潛在拮抗劑的效力或者，測定已知第二信使系統的應答及隨後的血管生成蛋白與受體的相互作用，並將有或無要篩選的化合物的情況作對比。這種第二信使系統包括但非限於cAMP鳥苷酸環化酶，離子通道，或磷酸肌酸酯水解。在另一種方法中，將表達血管生成蛋白受體的哺乳動物細胞或膜製品，在存在篩選化合物的情況下用標記的血管蛋白溫育。然後測定此化合物增強或阻斷這種相互作用的能力。表位和抗體本發明涵蓋的多肽，包含或由具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽的表位，或由ATCC中保藏號No.97149或75698的多核苷酸編碼的多肽的表位，或由與SEQ ID NO1或3序列的補體或ATCC中保藏號No.97149或75698的序列的補體在前述嚴格雜交條件下或較低嚴格雜交條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽的表位組成。含有SEQ ID NO2或4序列的一代表性克隆於1994年3月4日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，保藏號No.75698；及於1995年5月12日保藏於ATCC，保藏號No.97149。ATCC位於美國佛吉尼亞州馬納薩斯市。大學道20110-2209，郵編10801。ATCC保藏遵循國際共識的布達佩斯條約。本發明還涵蓋了以下多核苷酸序列編碼本發明多肽序列表位的多核苷酸序列(例如SEQ IDNO1或3所示序列)，編碼本發明表位的多核苷酸序列互補鏈的多核苷酸序列，和在前述嚴格雜交條件或較低嚴格雜交條件下與此互補鏈雜交的多核苷酸序列。
本文所用術語「表位」指在動物，優選哺乳動物，更優選在人體內具有抗原性或免疫原性活性的多肽的一部分。在一優選的實施方案中，本發明涵蓋一種多肽，其包含表位，以及編碼此多肽的多核苷酸。本文所用術語「免疫原性表位」是指在動物體內激發抗體應答的蛋白質的一部分，其可通過本領域已知的任何方法確定，例如通過前述產生抗體的方法確定〔見例如Geysen等，美國科學院院報813998-4002(1983)〕。術語「抗原性表位」是指其作為抗原，抗體能特異地與之結合的蛋白質的一部分，其可通過本領域熟知的任何方法確定，例如通過本文所述的免疫分析法。免疫特異性結合不包括非特異性結合，但非必需不包括與其它抗原的交叉反應。抗原性表位非必需是免疫原性的。
作為表位的片段可通過常規方法產生〔見例如Houghten，美國科學院院報825131-5135(1985)〕，另外見於美國專利No.4631211所述〕。
在本發明中，抗原性表位優選含有至少4，5，6，7個，更優選至少8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，40，50個，最優選大約15-30個胺基酸。包含免疫原性或抗原性表位的優選多肽的長度至少為10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100個胺基酸。另外非排外的優選抗原性表位包括本文所揭示的抗原性表位，以及其一部分。抗原性表位例如用於產生特異結合表位的抗體，包括單克隆抗體。優選的抗原性表位包括本文所揭示的表位，以及2，3，4，5或多個這些抗原性表位的任意組合。抗原性表位可用作免疫分析中的靶分子〔見例如，Wilson等，細胞37767-778(1984)；Sutclffe等，科學219660-666(1983)〕。
相似地，免疫原性表位例如可用於誘導抗體，根據本領域熟知的方法〔見例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；Chow等，美國科學院院報82910-914；和Bittle等，基因病毒學雜誌662347-2354(1985)〕。優選的免疫原性表位包括本文所揭示的免疫原性表位，以及2，3，4，5或多個這些免疫原性表位的任意組合。包含1或多個免疫原性表位的多肽可與載體蛋白如白蛋白一起，激發動物系統(如兔或小鼠)的抗體應答，或者如果多肽足夠長(至少大約25個胺基酸)，此多肽可不用載體。然而包含少如8-10個胺基酸的免疫原性表位，已示出足以產生能至少結合變性的多肽如在Western印跡中)中的線性表位的抗體。
本發明具有表位的多肽可用於誘導抗體，根據本發明熟知的方法，包括但非限於體內免疫接種，體外免疫接種和噬菌體展示方法。見例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；和Bittle等，基因病毒學雜誌662347-2354(1985)。如果使用體內免疫接種，可用游離肽接種動物；然而抗肽抗體滴定可通過將肽與大分子載體偶聯而加強，所述載體如是匙孔嘁血籃蛋白(KLH)或破傷風毒素。例如，含有半胱氨酸殘基的肽可用接頭與載體偶聯，接頭如間一馬來醯亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)，而其它肽可用一般的連接劑如戊二醛與載體偶聯。將動物如兔，大鼠和小鼠用游離或偶聯載體的肽免疫接種，例如通過腹膜內和/或皮內注射含有大約100μg肽或載體蛋白，和Freund’s佐劑或其它刺激免疫應答的任何佐劑的乳劑。可需要一些增強注射，例如間隔大約2周，以提供可例如經ELISA分析檢測的抗肽抗體的有效滴定，ELISA分析是用吸附於固體表面的游離肽。通過選擇抗肽抗體，例如根據本領域熟知方法將肽吸附於固體支持物並洗脫選擇的抗體，可提高免疫接種動物血清中抗肽抗體的效價。
本領域技術人員意識到及如上所述，包含免疫原性或抗原性表位的多肽可融合於其它多肽序列。例如，本發明的多肽可與免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的恆定區，或其一部分(CH1，CH2，CH3或其任意組合，及其一部分)融合，產生嵌合多肽。這種融合蛋白可易於純化並提高在體內的半衰期。已示出嵌合蛋白由人CD4-多肽的前兩個結構域和哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈恆定區的各種機構域組成。見例如EP394827；Traunecker等，自然，33184-86(1988)所述。在抗原(如胰島素)與FcRn結合配體如IgG或Fc片段綴合的情況下，抗原穿經上皮細胞壁至免疫系統的輸送增強已證實(見例如PCT出版物WO96/22024和WO99/04813所述)。由於IgG部分脫硫鍵而具有二硫鍵連的二聚體結構的IgG融合蛋白，也已發現比只是單體多肽或其片段在結合及中性化其它分子中更有效。見例如Fountoulakis等，生物化學雜誌2703958-3964(1995)。編碼上述表位的核酸也可與作為表位標記〔如血凝素(HA)標記或flag標記〕的相應基因重組，以助於檢測和純化表達的多肽。例如，由Janknecht等所述的系統可易於純化在人體細胞系中表達的非變性的融合蛋白(Janknecht等，1991，美國科學院院報888972-897)。在此系統中，將相應的基因亞克隆入豆苗重組質粒中，這樣基因的開發讀框翻譯性的融合於由6個組氨酸殘基組成的氨基末端標記中。此標記作為融合蛋白的基質結合結構域。將用重組豆苗病毒感染的細胞的提取物加樣於Ni2+次氮基乙酸—瓊酯糖層析柱中，且組氨酸標記的蛋白質可用含有咪唑的緩衝液選擇性洗脫。
本發明的其它融合蛋白可通過基因改組，基序改組，外顯子改組，和/或密碼子改組(統稱DNA改組)而產生。DNA改組可用於調節本發明多肽的活性，這種方法可用於產生具有改變活性的多肽，以及多肽的激動劑和拮抗劑。見美國專利No.5605793；58 11238；5830721；5834252；和5837458，和Patten等，生物技術學通用觀點8724-33(1997)；Harayama，生物技術趨勢16(2)76-82(1998)；Hansson等，分子生物學雜誌287265-76(1 999)；和Lorenzo和Blasco，生物技術24(2)308-13(1998)所述(這些專利及文獻均以全文併入參考)。在一實施方案中，相當於SEQ ID NO1或3的多核苷酸，及由這些多核苷酸編碼的多肽的變化，可通過DNA改組進行。DNA改組包括通過同源或位點特異性重組裝配2或多個DNA節段，以在多核苷酸序列中產生變化。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸或其編碼的多肽，可通過易錯PCR，隨機插入核苷酸，或其它方法隨機誘變，之後進行重組而改變。在另一實施方案中，編碼本發明多肽的多核苷酸的一或多種成分，基序，節段，部分，結構域，片段等，可與一或多種異源分子的一或多種成分，基序節段，部分，結構域，片段等重組。抗體本發明的另外的多肽涉及抗體和T細胞抗原受體(TCR)，其免疫特異性地結合本發明SEQ ID NO2或4的多肽，多肽片段或變體，和/或表位(通過本領域熟知的免疫分析方法分析特異性抗體—抗原結合)。本發明的抗體包括但非限於多克隆抗體，單克隆抗體，多特異性抗體，人抗體，人化抗體或嵌合抗體，單鏈抗體，Fab片段，F(ab』)片段，由Fab表達文庫產生的片段，抗獨特型(抗Id)抗體(包括本發明抗體的抗Id抗體)，和以上任何結合表位的片段。本文所用術語「抗體」是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性地結合抗原的抗原結合位點的分子。本發明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，類別(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亞類別的免疫球蛋白分子。
更優選的抗體是本發明結合抗原的人抗體片段，包括但非限於Fab，Fab』，和F(ab』)2，Fd，單鏈Fvs(scFV)，單鏈抗體，二硫鍵連的Fvs(sdFv)和包含VL或VH結構域的片段。結合抗原的抗體片段，包括單鏈抗體，可只包含可變區域或與以下完整區域或其一部分組合絞鏈區，CH1，CH2和CH3結構域。本發明還包括結合抗原的片段，其也包含可變區與絞鏈區，CH1，CH2和CH3結構域的任意組合。本發明的抗體可來源於任何動物，包括鳥和哺乳動物。優選地，抗體來源於人，鼠(如小鼠和大鼠)，驢，兔，山羊，豚鼠，駱駝，馬或雞。本文所用術語「人」抗體包括具有人免疫球蛋白胺基酸序列的抗體，及包括分離自人免疫球蛋白文庫的抗體，或分離自用—或多種人免疫球蛋白轉基因且不表達內源性免疫球蛋白的動物的抗體，如前述及例如Kucherlapati等的美國專利No.5939598所述。
本發明的抗體可以是單特異性，雙特異性，三特異性或更多特異性的。多特異性抗體可特異於本發明多肽的不同表位，或特異於本發明的兩種多肽，以及異源表位，如異源多肽或固體支持物。見例如PCT出版物WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt等，免疫學雜誌，14760-69(1991)；美國專利No.4474893；4714681；4925648；5573920；5601819；Kostelny等，免疫學雜誌1481547-1553(1992)。
本發明的抗體可以它們識別或特異結合的表位或本發明多肽的一部分等術語闡述。表位或多肽的一部分在本文特別通過N-末端和C-末端位，通過連續胺基酸殘基的大小加以闡述，或在圖表中列出。
在一實施方案中，可用於產生PDGF-A特異性抗體的抗原性多肽或肽包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO2的大約Lys72-Leu80，SEQ ID NO2的大約Ile82-Ile88，SEQ ID NO2的大約Pro106-Ser114，SEQ ID NO2的大約Lys139-Val145，SEQ IDNO2的大約Arg159-Lys165，和SEQ ID NO2的大約Serl83--Thr211胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PDGF-A蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO2的大約Ile82-Ile88胺基酸殘基。
可用於產生PDGF-B特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性地例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO4的大約Arg39-Gln45，Asp51-Asp56，Thr65-Gly71，Leu110-Ala116，Ser131-Thr144，Pro188-Thr206，Arg216-Lys227，Thr229-Leu235胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PDGF-B蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO4的大約Arg39-Gln45，Asp51-Asp56，Thr65-Gly71的胺基酸殘基。
可用於產生PlGF特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO6的大約Val46-Cys52，Arg110-Ser1 16，Val126-Asp144的胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PlGF蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO6的大約Val 46-Cys52胺基酸序列。
可用於產生PlGF-2特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO8的大約Val46-Cys52，Arg110-Serl 16，Val126-Asp159的胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PlGF-2蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO8的大約Val 46-Cys52胺基酸殘基。
可用於產生GDGF特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO10的大約Thr30-Ala36，Tyr46-Cys5 1，Glu63-Ile68，Ser125-Cys142，Pro144-His151，Gln155-Lys172，Asn179-Arg190胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶GDGF蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO10的大約Thr30-Ala36，Tyr46-Cys5 1胺基酸殘基。
可用於產生VEGF特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO12的大約Glu64-Ile69，Gly85-Gly91，His125-Cys143，Pro145-His152，Glu156-Lys173，Asn180-Arg191胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF蛋白的抗原性表位。
可用於產生VEGF-A特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO14的大約Thr30-Ala36，Tyr46-Cys51，Glu63-Ile68，Ser125-Val143，Gly145-Cys166，Pro 168-His 175，Gln179-Lys196，Asn203-Arg214胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-A蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO14的大約Thr30-Ala36，和Tyr46-Cys51胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-2特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO16的大約Asp40-Ala45，Lys 54-Leu60，Gln84-Gly89，Arg94-Thr106，Ile122-Cys131，Asn175-Leu181，Gln237-Pro244，Asp267-Phe276，Pro282-Asp287，Ser303-Ser314，Ala330-Thr338，Arg345-Cys358，Gly373-Cys395，Pro410-Ser419胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-A蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO16的Asp40-Ala45，Lys 54-Leu60，Gln84-Gly89，Arg94-Thr106，和Ile122-Cys131胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-3特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO18的Ser 24-Lys34，Ala45-Arg50，Arg125-Ala138，Prol41-Ser149，和His167-Pro172胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-3蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO18的大約Ser 24-Lys34，Ala45-Arg50，胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-D特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO20的大約Metl-Gln14，His29-Arg41，Met48-Thr58，Glu75-Thr87，Leu95-Phe103，Pro181-Lys191，Trp199-Cys204，Asp281-Thr293，Pro310-Ala316，Gly318-Pro325胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-D蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO20的大約Metl-Gln14，His29-Arg41，Met48-Thr58，Glu75-Thr87胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-D1特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO22的大約Ser22-Gln43，His58-Arg70，Met77-Thr87，Glu104-Thr116，Leu124-Phe132，Pro210-Lys220，Trp228-Cys233，Asp310-Thr322，Pro339-Ala345，Gly347-Pro354胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-D1蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO22的大約Ser22-Gln43，His58-Arg70，和Met77-Thr87，胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-E特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO24的大約Asp 21-Trp26，Asp46-Phe56，Gly68-Ser74，Pro121-Arg132胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-E蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO24的大約Asp 21-Trp26胺基酸殘基。
特異性結合本發明的任何表位或多肽的抗體也排除在外。因此，本發明包括特異結合本發明多肽的抗體，並又可不包括這種抗體。
本發明的抗體還可以交叉反應性加以闡述。本發明包括不結合本發明多肽的任何其它類似物，直向同源物，或同源物的抗體。本發明還包括結合與本發明多肽有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％相同性的多肽的抗體(相同性是通過本領域已知及本文所述方法計算的)。在特異的實施方案中，本發明的抗體與人體蛋白及其相應表位的小鼠，大鼠和/或兔同源物交叉反應。本發明還包括不結合與本發明多肽有少於95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％相同性的多肽的抗體(相同性是通過本領域已知及本文所述方法計算的)。在一特異的實施方案中，上述交叉反應性與任一種特異抗原性或免疫原性多肽，或2，3，4，5或多種特異抗原性或免疫原性多肽組合相關。本發明另外包括結合由在嚴格條件下與本發明多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽的抗體。本發明的抗體還可以其與本發明多肽的結合親和性加以闡述。優選的結合親和性包括解離常數或Kd少於以下數值的親和性5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。
本發明還提供了競爭性抑制抗體與本發明表位結合的抗體，以確定例如本文所述免疫分析中的競爭性結合，競爭性抑制是通過本領域已知方法確定的。在優選的實施方案中，抗體競爭競爭性抑制與表位結合的至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％或50％。
本發明抗體還作為本發明多肽的激動劑或拮抗劑。例如，本發明包括部分或完全破壞受體/配體與本發明多肽相互作用的抗體。優選地，本發明的抗體結合本文所述的抗原性表位或其一部分。本發明以受體特異性抗體和配體特異性抗體為特色。本發明還以阻止配體結合但阻止受體活化的受體特異性抗體為特色。受體活化(即信號化)可通過本文所述方法或本領域已知其它方法確定。例如，受體活化可通過檢測受體或其底物在通過免疫沉澱及隨後的Western印跡分析(如前述)後的磷酸化(如酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸)而確定。在特異的實施方氨中，所提供的抗體抑制的配體活性或受體活性比沒有抗體的情況下至少抑制95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％或50％。
本發明還以受體特異性抗體為特色，其阻止配體結合及受體活化，還以識別受體-配體複合物且優選不特異識別未結合的受體或未結合的配體的抗體為特色。另外，本發明包括中和抗體，其結合配偶體並阻止配體與受體的結合，以及包括結合配偶體從而阻止受體活化，但不阻止配體與受體結合的抗體。本發明另外包括激活受體的抗體。這些抗體可作為受體激動劑，即促進或活化配體介導的受體活化的所有或部分生物活性，配體介導的受體活化例如通過誘導受體二聚體化而活化。抗體可以生物活性包括本發明肽的特有生物活性的激動劑，拮抗劑或反向激動劑加以闡述。上述抗體激動劑可用本領域已知方法產生。見例如PCT出版物WO96/40281；美國專利No.5811097；Deng等，血液92(6)1981-1988(1998)；Chen等，癌症研究58(16)3668-3678(1998)；Harrop等，免疫學雜誌161(4)1786-1794(1998)；Zhu等，癌症研究58(15)3209-3214(1998)；Yoon等，免疫學雜誌160(7)3170-3179(1998)；Prat等，細胞科學雜誌111(Pt2)237-247(1998)；Pitard等，免疫學方法雜誌205(2)177-190(1997)；Liautard等，細胞因子9(4)233-241(1997)；Carlson等，生物化學雜誌272(17)11295-11301(1997)；Taryman等，神經元14(4)755-762(1995)；Muller等，結構6(9)1153-1167(1998)；Bartunek等，細胞因子8(1)14-20(1996)所述，以上文獻均以全文併入參考。
本發明的抗體可例如但非限制性用於純化，檢測及定向本發明的多肽，包括在體外和體內診斷及治療方法中。例如，抗體用於免疫分析中以定量及定性測定生物樣品中本發明多肽的水平。見例如Harlovo等，抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，第二版，1988)所述，以其全文併入參考。
如以下更詳細的闡述，本發明的抗體可單獨或與其它組合物組合使用。抗體還可在N或C末端經重組融合於異源多肽，或化學綴合於(包括共價和非共價綴合)多肽或其它組合物。例如本發明的抗體可重組融合或綴合於在檢測分析中用作標記的分子，和效應器分子，如異源多肽，藥物，放射性核素或毒素。見例如PCT出版物WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美國專利No.5314995；和EP396387。
本發明的抗體包括經修飾的衍生物，即通過將任何類型的分子共價吸附於抗體，這種共價吸附不阻止抗體產生抗獨特型應答。例如但非限制性地，抗體衍生物包括已經修飾的抗體，例如通過糖基化，乙醯化，Pegylation，磷酸化，醯胺化，通過已知防護/阻斷基團的衍生化，蛋白酶切，與細胞配體或其它蛋白質連接等加以修飾。可通過已知方法進行任何化學修飾，包括但非限於特異性化學切割，乙醯化，甲醯化，衣黴素的代謝合成等。另外，衍生物可含有一或多個非經典胺基酸。本發明的抗體可以通過本領域已知的任何適當方法產生。相應抗原的多克隆抗體可通過本領域熟知的各種方法生產。例如，可將本發明的多肽施用於各種宿主動物，包括但非限於兔，小鼠，大鼠等，以誘導含有特異於抗原的多克隆抗體的血清產生。根據宿主物種可使用各種佐劑以提高免疫應答，佐劑包括但非限於Freund’s(完全性及不完全性)佐劑，礦物質凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂，pluronic多醇，聚陰離子，肽，油乳液，匙孔嘁血籃蛋白，二硝基苯酚，和潛在用於人體的佐劑如BCG(卡介苗)和parvum棒桿菌。這些佐劑本領域已熟知。
單克隆抗體可用各種已知方法製備，包括使用雜交瘤，重組及噬菌體展示等方法，或組合使用這些方法。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法生產，包括本領域已知的及例如Harlow等，抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，第二版，19880；Hammerling等，單克隆抗體及T細胞雜交瘤563-681(Elsevier，N.Y.，1981)所述方法，所述文獻以其全文併入參考。本文所用術語「單克隆抗體」非限於通過雜交瘤方法生產的抗體。術語「單克隆抗體」是指衍生自一個單一克隆包括真核，原核或噬菌體克隆的抗體，而不是指由何種方法產生的抗體。
用雜交瘤方法生產和篩選特異性抗體的方法對本領域而言是常規且熟知的，並在實施例中加以詳細闡述。在一非限制性實施例中，可用本發明的多肽或表達這種肽的細胞免疫接種小鼠。一旦檢測到免疫應答，例如在小鼠血清中檢測到特異於抗原的抗體，則收集小鼠脾組織並分離脾細胞。然後將脾細胞通過熟知的方法融合於任何適當的骨髓瘤細胞，例如得自ATCC的sp20細胞系的細胞。選擇雜交瘤並通過限制稀釋而克隆。然後通過本領域已知方法分析雜交瘤克隆的分泌能結合本發明多肽的抗體的細胞。通常含有高水平抗體的腹水可用陽性雜交瘤克隆免疫接種小鼠而產生。
因此，本發明提供了產生單克隆抗體的方法，以及由這些方法產生的抗體，所述方法包括培養分泌本發明抗體的雜交瘤細胞，其中優選雜交瘤細胞是通過將脾細胞與骨髓瘤細胞融合而產生的，所用脾細胞分離自用本發明抗原免疫接種的小鼠，然後篩選經融合所得雜交瘤中分泌能結合本發明多肽的抗體的雜交瘤克隆。
識別特異表位的抗體片段可通過已知方法產生。例如，本發明的Fab和F(ab』)2片段可通過對免疫球蛋白分子進行蛋白酶切而產生，使用的酶如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)，或胃蛋白酶(產生F(ab』)2片段)。F(ab』)2片段含有可變區，輕鏈恆定區和重鏈的CH1結構域。
例如，本發明的抗體還可用本領域已知的各種噬菌體展示法產生。在噬菌體展示方法中，將功能性抗體結構域展示於攜帶編碼其的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面。在一特殊的實施方案中，這種噬菌體可用於展示表達自抗體文庫所有組成成分或組合抗體文庫(如人或小鼠)的抗原結合結構域。表達結合相應抗原的抗原結合結構域的噬菌體，可用抗原選擇或鑑別，如用標記的抗原或結合或捕捉於固體表面或玻珠的抗原。這些方法中使用的噬菌體是典型的絲狀噬菌體，包括fd和M13結合結構域，其表達自具有Fab，Fv或二硫鍵穩定的Fv抗體結構域，重組融合於噬菌體基因IV或基因VIII蛋白的噬菌體。可使用的產生本發明抗體的噬菌體展示法包括Brinkman等，免疫學方法雜誌18241-50(1995)；Ames等，免疫學方法雜誌184177-186(1995)；Kettleborough等，歐洲免疫學雜誌24952-958(1994)；Persic等，基因187，9-18(1997)；Burton等，免疫學進展57191-280(1994)；PCT出版物No.PCT/GB91/01134；PCT出版物WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美國專利No.5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516637；5780225；5658727；5733743和5969108所述方法；所述文獻以其全文併入參考。
如上述參考文獻所述，在噬菌體選擇後，可從噬菌體中分離抗體編碼區，以產生完整抗體，包括人抗體，或任何其它所需的抗原結合片段，並在任何所需宿主中表達，包括哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，酵母和細菌，如以下詳細論述。例如，也可使用本領域已知的重組產生Fab，Fab』和F(ab』)2片段的方法，如PCT出版物WO WO92/22324；MuUinax等，生物技術12(6)864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 3426-34(1995)；和Better等，科學2401041-1043(1988)所述方法，所述文獻以其全文併入參考。
可用於產生單鏈Fvs和抗體的方法例如包括美國專利4946778和5258498；Huston等，酶學方法20346-88(1991)；Shu等，PNAS907995-7999(1993)；和Skerra等，科學2401038-1040(1988).。在包括在人體內使用抗體及體外檢測分析中，優選使用嵌合的人化的或人抗體。嵌合抗體是一種分子，其中抗體的不同部分衍生自不同物種動物，如具有可變區的抗體衍生自小鼠單克隆抗體和人免疫球蛋白恆定區。本領域已知產生嵌合抗體的方法。見例如Morrison，科學2291202(1985)；Oi等，生物技術4214(1986)；GiUies等(1989)，免疫學方法雜誌125191202；美國專利No.5807715；4816397所述方法，以上文獻以其全文併入參考。人化的抗體是來自結合所需抗原的非人抗體的抗體分子，所需抗原具有一或多個非人物種的互補決定區(CDRs)和一個人免疫球蛋白分子的框架區。通常地，人框架區中的框架殘基由CDR供體抗體的相應殘基取代，以改變優選改良抗原結合。這些框架取代是通過本領域熟知方法鑑別的，例如通過模仿CDR與框架殘基的相互作用，以鑑別框架殘基對抗原結合的重要性，並對比序列以鑑別在特殊位置的異常框架殘基。(見例如Queen等，美國專利No.5585089；Riechmann等，自然332323(1988)，以其全文併入參考)。抗體可以用本領域已知的各種方法人化，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT出版物WO 91/09967；美國專利No.5225539，5530101和5585089)；鑲飾或換裝新表面(EP592106；EP519596；Padlan，分子免疫學28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等，蛋白質工程7(6)805-814；Roguska等，PNAS 91969-973(1994)，和鏈改組(美國專利No.5565332)。
完全性人抗體是為治療人患者所特別需要的人抗體可通過本領域已知任何方法產生，包括上述噬菌體展示法，使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗體文庫。見例如美國專利No.4444887和4716111；和PCT出版物WO98/46645，WO98/50433，WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735，和WO91/10741；以上文獻均全文併入參考。
人抗體也可用轉基因小鼠產生，該小鼠不能表達功能性內源性免疫球蛋白，但能表達人免疫球蛋白基因。例如，可將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物，隨機導入或同源重組於小鼠胚胎幹細胞中。或者，除了人重鏈和輕鏈基因之外，可將人可變區，恆定區和多樣性區導入小鼠胚胎幹細胞中。可對小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因非功能性分別或同時通過同源重組導入人免疫球蛋白基因座。尤其地，JH區的純合缺失阻止內源性抗體產生。擴展修飾的胚胎幹細胞，並微注射入成纖維細胞中以產生嵌合小鼠。然後繁育此嵌合小鼠以產生表達人抗體的純合子代。將轉基因小鼠用選擇的抗原以通常方式免疫接種，所用抗原例如是全部或部分本發明的多肽。直接抗抗原的單克隆抗體可得自用常規雜交瘤方法免疫接種的轉基因小鼠。由轉基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉基因，在B細胞分化期間重新排列，隨後進行類別轉換和體細胞突變。因此使用這種方法可產生有治療用途的IgG，IgA，IgM和IgE抗體。產生人抗體的這種方法參見Lonberg和Huszar，免疫學研究綜述1365-93(1995)。生產人抗體和人單克隆抗體的方法見例如PCT出版物WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；歐洲專利No.0598877；美國專利No.5413923；5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；5814318；5885793；5916771；和5939598所述，以其全文併入參考。另外，如Abgenix公司(Freemont，cA)和Genpharm公司(San Jose，c A)可提供直接抗選擇的抗原的人抗體，使用的方法類似於以上所述方法。
識別選擇表位的完全人抗體可使用稱為「指導選擇」的方法產生。在此方法中，選擇的非人單克隆抗體如小鼠抗體，用於指導選擇識別相同表位的完全人抗體〔Jespers等，生物/技術12899-903(1988)〕。
另外，本發明的抗體反過來可用於產生「模擬」本發明多肽的抗獨特型抗體，使用本領域熟知的方法(見例如Greenspan Bona，FASEB雜誌，7(5)437-444(1989)，和Nissinoff，免疫學雜誌147(8)2429-2438(1991))。例如，結合併完全抑制多肽多聚體化和/或本發明多肽與配體結合的抗體，可用於產生抗獨特型抗體，其「模擬」多肽多聚體化和/或結合結構域，從而結合併中和多肽和/或其配體。這種中和抗獨特型抗體或其Fab片段，可用於治療性中和多肽配體。例如，這種抗獨特型抗體可用於結合本發明的多肽和/或結合其配體/受體，從而阻斷其生物活性。編碼抗體的多核苷酸本發明還提供了包含編碼本發明抗體及其片段的核苷酸序列。本發明還涵蓋了在嚴格或較低嚴格雜交條件下，與編碼抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸，所述抗體優選特異結合本發明多肽的抗體，優選結合具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽的抗體。
通過本領域已知方法可獲得多核苷酸，並確定此多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知抗體的核苷酸序列，可從化學合成的寡核苷酸中裝配編碼抗體的多核苷酸〔例如Kutmeier等，生物技術17242(1994)〕，簡而言之包括合成含有編碼抗體的部分序列的重疊寡核苷酸，退火併連接這些寡核苷酸，然後通過PCR擴增連接的寡核苷酸。
或者，編碼抗體的多核苷酸可產生自適當來源的核酸。如果含有編碼特殊抗體的核酸的克隆不適合，但抗體分子的序列已知，則編碼免疫球蛋白的核酸可化學合成或得自適當來源(如產生自表達抗體的任何組織或細胞的抗體c DNA文庫，或c DNA文庫，或分離自表達抗體的任何組織或細胞的核酸，優選聚A+RNA，如選擇的表達本發明抗體的雜交瘤細胞)，使用可與序列的3』和5』末端雜交的合成引物通過PCR擴增而獲得，或使用特異於特殊基因序列的寡核苷酸探針通過克隆而獲得，以例如從編碼抗體的c DNA文庫中鑑別-c DNA克隆。然後可將通過PCR產生的擴增的核酸，通過本領域熟知的任何方法克隆入可複製的克隆載體中。
一旦確定抗體的核苷酸序列及相應的胺基酸序列，對抗體的核苷酸序列可用本領域熟知方法進行人工操縱，以產生具有不同胺基酸序列的抗體，例如產生胺基酸取代，缺失和/或插入，所用操縱方法例如重組DNA方法，位點直接誘變，PCR等(見例如Sambrook等，1990，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY；和Ausubel等編輯，1998，分子生物學通用方法，John WileySons，NY所述方法，所述文獻以其全文併入參考)。
在一特異的實施方案中，對重和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列進行檢測，以鑑別互補決定區(CDRs)的序列，通過本領域熟知的方法，例如通過與其它重和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行對比，以確定序列的高變區。使用常規重組DNA方法，可將一或多個CDRs插入框架區中，例如插入人框架區以人化非人抗體，如前所述。框架可以是天然發生的或是共有框架區，優選是人框架區(見例如Chothia等，分子生物學雜誌278457-479(1998)列出了人框架區)。優選地，通過組合框架區與CDRs而產生的多核苷酸，編碼特異結合本發明多肽的抗體。優選地，如前所述，可在框架區內產生一或多個胺基酸取代，並優選地，此胺基酸取代改良抗體與其抗原的結合。另外，這種方法可用於產生胺基酸取代，或缺失一或多個參與鏈內二硫鍵的可變區半胱氨酸殘基，以產生缺失一或多個鏈內二硫鍵的抗體分子。多核苷酸的其它改變也涵蓋在本發明內，並為技術人員熟知。
另外，可使用產生「嵌合抗體」的方法(Morrison等，美國科學院院報81851-855(1984)；Neuberger等，自然312604-608(1984)；Takeda等，自然314452-454(1985))，通過將來自適當抗原特異性的小鼠抗體分子的基因，與來自適當生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起而產生。如前所述，嵌合抗體是一種分子，其中不同部分衍生自不同動物物種，如具有衍生自小鼠mAb的可變區和人免疫球蛋白恆定區的抗體，例如人化抗體。
或者，可使用生產單鏈抗體的方法生產單鏈抗體(美國專利No.4946778；Bird，科學242423-42(1988)；Huston等，美國科學院院報855879-5883(1988)；和Ward等，自然334544-54(1989))。單鏈抗體是通過胺基酸橋連接Fv區的重和輕鏈片段，產生單鏈多肽而形成的。也可使用在大腸桿菌內裝配功能性Fv片段的方法〔Skerra等，科學2421038-1041(1988)〕。生產抗體的方法本發明的抗體可通過本領域任何已知合成抗體的方法生產，尤其通過化合或優選通過重組表達方法。重組表達本發明的抗體，或其片段，衍生物或類似物(如本發明抗體的重鏈或輕鏈，或本發明的單鏈抗體)，要求構建含有編碼抗體的多核苷酸的表達載體。一旦獲得編碼本發明抗體分子或其重鏈或輕鏈，或其一部分(優選含有重或輕鏈可變結構域)的多核苷酸，生產抗體分子的載體可通過本領域熟知的重組DNA方法產生。因此，本文闡述了通過表達含有抗體編碼核苷酸序列的多核苷酸而製備蛋白質的方法。可使用本領域技術人員熟知的方法構建含有抗體編碼序列和適當轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法例如包括體外重組DNA方法，合成方法，和體內遺傳重組。因此本發明提供了可複製載體，其包含編碼本發明抗體分子或其重或輕鏈，或重或輕鏈可變結構域的核苷酸序列，其可操縱地連於啟動子。這種載體可包括編碼抗體分子恆定區的核苷酸序列(見例如PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO89/01036；和美國專利No.5122464)，且抗體的可變區可克隆入這種載體中以表達完整輕或重鏈。
將表達載體通過常規方法移至宿主細胞中，然後通過常規方法培養轉染的細胞，以產生本發明的抗體。因此，本發明包括含有編碼本發明抗體，或其重或輕鏈，或單鏈抗體的多核苷酸的宿主細胞，該多核苷酸可操縱地連於異源啟動子。在表達雙鏈抗體的優選實施方案中，可將編碼重和輕鏈的載體共同在宿主細胞中表達，以表達完整免疫球蛋白分子，如下所述。
可使用各種宿主表達載體系統以表達本發明的抗體分子。這種宿主表達系統代表可產生並隨後純化相應編碼序列的載體，也可代表當用適當的核苷酸編碼序列轉化或轉染時，可在原位表達本發明抗體分子的細胞。這些細胞包括但非限於微生物如細菌(例如大腸桿菌，B.枯草桿菌)，該細菌用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA，質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化；酵母，(如Saccharomyces，Pichia)，其用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉化；昆蟲細胞系統，該細胞用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(如杆狀病毒)感染；植物細胞系統，該細胞用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒CaMV；菸草花葉病毒TMV)感染，或用含有抗體編碼序列的重組質粒表達載體(如Ti質粒)轉化；或哺乳細胞系統(如COS，CHO，BHK，293，3T3細胞)，該細胞具有含有衍生自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)，或衍生自哺乳動物病毒的啟動子(如腺病毒晚期啟動子，痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達構建體。優選地，細菌細胞如大腸桿菌細胞，更優選真核細胞，尤其表達整個重組抗體分子的真核細胞，用於表達重組抗體分子。例如，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，與載體如人巨細胞病毒的主要中間早期基因啟動子因子締合，是抗體的一種有效表達系統(Foecking等，基因45101(1986)；Cockett等，生物/技術82(1990))。
在細菌系統中，根據對被表達的載體的預期使用，可優選一些表達載體。例如，當為產生抗體分子的藥物組合物而大量生產這種蛋白質時，需要指導易於純化的融合蛋白產物高水平表達的載體。這種載體包括但非限於大腸桿菌表達載體pUR 278(Ruther等，EMBO雜誌21791(1983))，其中抗體編碼序列可單獨連接於載體中具有lacZ編碼區的框架中，以便產生融合蛋白；pIN載體(Inouye Inouye，核酸研究133101-3109(1985)；Van Heeke Schuster，生物化學雜誌245503-5509(1989))；等。還可使用pGEX載體以表達作為與穀胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白的外源多肽。一般地，這種融合蛋白是可溶的並且可易於從裂解的細胞中純化，通過附著並結合穀胱甘肽瓊脂糖珠，接著在存在游離穀胱甘肽的情況下洗脫而進行。設計的pGEX載體包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點，以便克隆的靶基因產物可從GST組分中釋放。
在昆蟲系統中，首苜銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcNPV)用作表達外源基因的載體。此病毒生長於Spodoptera frugiperda細胞中。抗體編碼序列可單獨克隆入病毒的非必需區域(如多角體蛋白基因)，並在AcNPV啟動子(如多角體蛋白啟動子)的控制下置放。
在哺乳動物宿主細胞中，可使用一些基於病毒的表達系統。在腺病毒用作表達載體的情況中，相應的抗體編碼序列可連接於腺病毒轉錄/翻譯控制複合物，如晚期啟動子和三聯前導序列。然後將此嵌合基因通過體外或體內重組插入腺病毒基因組中。在非必需區中插入病毒基因組(如在E1或E3區)產生一種重組病毒，其在感染的宿主中是可生存的並能表達抗體分子。(見Logan Shenk，美國科學院院報81355-359(1984))。為高效翻譯插入的抗體編碼序列，還需要特異的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。另外，起始密碼子必須是具有所需編碼序列的讀框的狀態，以確保翻譯完整的插入體。這些內源性翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種來源的，天然的及合成的均可。表達效力可通過包含適當轉錄增強子，轉錄終止子等而得以加強(見Bittner等，酶學方法15351-544(1987))。
另外，可選擇調節插入序列表達，或以特異所需方式修飾及加工基因產物的宿主細胞菌株。對蛋白質產物的這種修飾(如糖基化)和加工(如裂解)對蛋白質的功能是重要的。不同的宿主細胞具有特徵性及特異性的翻譯後加工和修飾蛋白質和基因產物的機制。可選擇適當的細胞系或宿主系統，以確保正確修飾和加工所表達的外源蛋白質。為此，可使用具有正確加工原始轉錄物，糖基化和磷酸化基因產物的細胞機制的真核宿主細胞。這種哺乳動物宿主細胞包括但非限於CHO，VERY，BHK，Hela，COS，MDCK，293，3T3，WI38，尤其包括乳腺癌細胞系如BT483，Hs578T，HTB2，BT20和T47D，和正常乳腺細胞系如CRL7030，和Hs578Bst。
為長期高產量產生重組蛋白質，優選穩定的表達。例如，可對穩定表達抗體分子的細胞系基因工程化。除了使用含有病毒複製起源的表達載體，宿主細胞可用由適當表達控制因子(如啟動子，增強子，序列，轉錄終止子，聚腺苷酸化位點等)控制的DNA，和一可選擇標記轉化。在導入外源DNA之後，使基因工程化的細胞在滋養培養基中生長1-2天，然後轉換為選擇性培養基。重組質粒中的可選擇標記授與對選擇的抗性，並使細胞穩定地將質粒整合入其染色體中，並生長形成foci，其反過來可克隆入細胞系中並擴展。色體中，並生長形成foci，其反過來可克隆入細胞系中並擴展。此方法可用於基因工程化表達抗體分子的細胞系。這種工程化的細胞系尤其用於篩選和評價直接或間接與抗體分子相互作用的化合物。
可使用一些選擇系統，包括但非限於單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，細胞11223(1977))，次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska Szybalski，美國科學院院報48202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等，細胞22817(1980))基因，可分別用於tk-hgprt-或aprt細胞中。同樣，抗體謝物抗性可用作選擇以下基因的基礎dhfr，其授與氨甲喋呤抗性(Wigler等，美國科學院院報77357(1980)；O』Hare等，美國科學院院報781527(1981))；gpt，其授與黴酚酸抗性(Mulligan Berg，美國科學院院報782072(1981))；neo，其授與氨基糖苷G-418抗性(臨床藥理學12488-505；Wu和Wu，生物治療387-95(1991)；Tolstoshev，藥物毒性分析研究32573-596(1993)；Mulligan，科學260926-932(1993)；和Morgan及Anderson，生物化學分析研究62191-217(1993)；May，1993，TIBTECH 11(5)155-215)；hygro，其授與潮黴素抗性(Santerre等，基因30147(1984))。本領域已知的重組DNA方法可常規用於選擇所需的重組克隆，這種方法例如由Ausubel等編輯，分子生物學通用方法，John Wiley Sons，NY(1993)；Kriegler，基因轉移和表達實驗手冊，Stockton出版社，NY(1990)；及Dracopoli等編輯，人體遺傳學通用方法，John Wiley Sons，NY(1994)中第12章和第13章；Colberre-Garapin等，分子生物學雜誌1501(1981)所述，以上文獻均以全文併入參考。
抗體分子的表達水平可通過載體擴增而提高(參見Bebbington和Hentschel，使用基於基因擴增的載體在哺乳動物細胞中表達克隆的基因，DNA克隆，第三卷(科學出版社，紐約，1987))。當表達抗體的載體系統中的標記是可擴增的時，提高宿主細胞培養物中抑制劑的水平，將提高標記基因的拷貝數。由於擴增的區域與抗體基因相締合，因此抗體的產量也隨之提高(Crouse等，分子細胞生物學3257(1983))。
宿主細胞可用本發明的兩個表達載體共轉染，第一個載體編碼重鏈衍生的多肽，第二個載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩個載體可含有相同的可選擇標記，其能相同表達重鏈和輕鏈多肽。或者，可使用一個單一載體，其編碼並能表達重鏈和輕鏈多肽。在這種情況中，輕鏈應置於重鏈之前，以避免過量的毒性游離重鏈(Proudfoot，自然32252(1986)；Kohler，美國科學院院報772197(1980))。重鏈和輕鏈編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
一旦已經通過動物，化學合成，或重組表達產生本發明的抗體分子，其可通過本領域已知的任何純化免疫球蛋白分子的方法純化，例如通過層析(如離子交換層析，親和層析，尤其在蛋白A之後特異性抗原層析，及規格柱層析)，離心，差異溶解性，或通過純化蛋白質的任何其它方法純化。另外，本發明的抗體或其片段可與本文所述或本領域已知的其它異源多肽序列融合，以易於純化。
本發明涵蓋了重組融合於或化學綴合於(包括共價和非共價綴合)本發明多肽(或其一部分，優選多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100個胺基酸)的抗體，以產生融合蛋白。此融合非必需直接融合，可通過接頭序列產生。此抗體可特異於除了本發明多肽(或其一部分，優選多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100個胺基酸)的抗原。例如，抗體可用於在體外或體內將本發明多肽定向於特殊細胞類型，通過將本發明的多肽融合或綴合於特異於特殊細胞表面受體的抗體而進行。融合或綴合於本發明多肽的抗體還可用本發明已知方法用於體外免疫分析和純化方法中，見例如Harbor等，如前，和PCT出版物WO93/21232；EP 439095；Naramura等，免疫學通訊3991-99(1994)；美國專利5474981；Gillies等，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等，免疫學雜誌1462446-2452(1991)，所述文獻以其全文併入參考。
本發明還包括一種組合物，其包含融合或綴合於抗體除可變區之外的結構域的本發明多肽。例如，本發明的多肽可融合於或綴合於抗體Fc區域，或其一部分。融合於本發明多肽的抗體部分可包含恆定區，絞鏈區，CH1功能域，CH2功能域，和CH3結構域或者完整結構域或其一部分的任意組合。多肽也可融合或綴合於上述抗體部分以形成多聚體。例如，融合於本發明多肽的Fc部分可通過Fc部分之間的二硫鍵形成二聚體。通過多肽與IgA和IgM部分融合可形成較高多聚體。本領域已知將本發明多肽融合或綴合於抗體部分的方法。見例如美國專利No.5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP 307434；EP 367166；PCT出版物WO96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，美國科學院院報8810535-10539(1991)；Zheng等，免疫學雜誌1545590-5600(1995)；和Vil等，美國科學院院報8911337-11341(1992)，所述文獻均以全文併入參考。
如前所述，相當於SEQ ID NO2或4的多肽，多肽片段或變體，可融合或綴合於上述抗體部分，以提高多肽在體內的半衰期或用於免疫分析中。另外，相當於SEQ ID NO2或4的多肽，多肽片段或變體，可融合或綴合於上述抗體部分以易於純化。一報導的實施例闡述了由人CD-4多肽的前兩個結構域和哺乳動物免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恆定區的各種結構域組成的嵌合蛋白(EP 39482)；Traunecken等，自然33184-86(1988)。融合或綴合於具有二硫鍵聯的二聚體結構的抗體(由於IgG所致)的本發明多肽，也可比單體分泌的蛋白質或單獨的蛋白質片段更有效地結合與中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學雜誌2703958-3964(1995))。在許多情況中，融合蛋白中Fc部分在治療和診斷中是有益的，因此例如可改善藥物動力學性質。(EP A 232 262)。或者，在融合蛋白已被表達，檢測和純化後缺失的Fc部分，將是所需的。例如，如果融合蛋白用作免疫抗原，則Fc部分可阻礙治療和診斷。在藥物開發中，例如在高產量篩選分析中人體蛋白如hIL-5已與Fc部分融合，以鑑別hIL-5的拮抗劑(見Bennett等，分子識別雜誌852-58(1995)；Johanson等，生物化學雜誌2709459-9471(1995)。
另外，本發明的抗體或其片段可融合於標記序列如肽以易於純化。在優選的實施方案中，標記胺基酸序列是6組氨酸肽，如在pQE載體中提供的標記(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，其中許多是可商購的。如Gentz等，美國科學院院報86821-824(1989)所述，6-組氨酸可進行常規純化融合蛋白。用於純化的其它肽標記包括但非限於「HA」標記，其相當於衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，細胞37767(1984))，和「flag」標記。
本發明還涵蓋了綴合於診斷或治療劑的抗體或其片段。抗體可診斷性地例如用於監測腫瘤的發生和轉移，作為臨床檢測方法的一部分以例如確定給定的治療方案的效力。可通過將抗體偶聯於可檢測物質而便於進行檢測。可檢測物質例如可包括各種酶，輔基，螢光物，發光物，生物發光物，放射性物質，用各種正電子發射斷層顯象法的發射正電子金屬，和非放射性順磁金屬離子。使用本領域已知方法，將可檢測物質直接偶聯或綴合於抗體(或其片段)，或間接通過中間物(例如本領域已知的接頭)偶聯或綴合於抗體(或其片段)，見例如美國專利No.4741900闡述了可綴合於抗體根據本發明可用於診斷的金屬離子。適當的酶例如包括辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙醯膽鹼脂酶；適當的輔基複合物包括鏈親和素/生物素，和親和素/生物素；適當的螢光物包括傘形酮，螢光素，異硫氰酸螢光素，羅丹明，二氯三嗪胺螢光素，丹磺醯氯；適當的發光物包括魯米諾；生物發光物例如包括螢光素酶，螢光素和水母蛋白；適當的放射性物質例如包括125I，131I，111In，或99Tc。
另外，抗體或其片段可綴合於治療性組分如細胞毒素，例如細胞靜止或殺細胞性製劑，治療性製劑或放射性金屬離子如α-發射物例如213Bi。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞不利的任何製劑。例如包括paclitaxol，細胞松馳素B，短桿菌肽D，溴化乙錠，吐根鹼，絲裂黴素，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷長春新鹼，長春花鹼，秋水仙素，阿黴素，道諾紅菌素，二羥炭疽菌素，mitoxantrone，光神黴素，放線菌素D，1-脫氫睪酮，糖皮質激素，procaine，tetracaine，lidocaine，propranolol，和嘌呤黴素及它們的類似物或同源物。治療劑包括但非限於抗代謝物(如氨甲喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，cytarbine，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化劑(如mechlorethamine，thioepachlorambucil，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥，carmustine(BSNU)和lomustine(CCNU)，cyclothosphamide，busulfan，dibromomannitol，streptozotocin，絲裂黴素C，和順-二胺二氯鉑(II)(DDP)順鉑)，anthracyclines(如道諾紅菌素(道諾黴素前體)和阿黴素)，抗生素(如dactinomycin(放線菌素前體)，博來黴素，光神黴素，和氨茴黴素(AMC))，和抗有絲分裂劑(如長春新鹼和長春花鹼)。
本發明的綴合物可用於修飾給定的生物應答。治療劑或藥物組分非限於如傳統化學治療劑般構建。例如，藥物組分可以是具有所需生物活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括例如毒素如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假單胞桿菌外毒素，或白喉毒素；蛋白質如腫瘤壞死因子，α-幹擾素，β-幹擾素，神經生長因子，血小板衍生生長因子，組織纖溶酶原激活物，細胞程序死亡劑如TNF-α，TNF-β。AIMI(見國際出版物No.WO97/33899)，IMII(見國際出版物No.WO97/34911)，Fas配體(Takahashi等，免疫學進展61567-1574(1994))，VEGI(見國際出版物No.WO 99/23105)，thrombotic劑或抗血管生成劑如angiostatin或endostatin；或生物應答修飾劑例如淋巴因子，白細細介素-1(IL-1)，白細胞介素-2(IL-2)，白細胞介素-6(IL-6)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生長因子。
抗體可附著於特別用於免疫分析或純化靶抗原的固體支持物。這種固體支持物包括但非限於玻璃，纖維素，聚丙烯醯胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
本領域熟知將這種治療組分綴合於抗體的方法，見例如Arnon等，「在癌症治療中免疫定向藥物的單克隆抗體」，單克隆抗體和癌症治療，Reisfeld等編輯，p243-56(Alan R.Liss公司，1985)；Hellstrom等，「藥物輸送抗體」，控制的藥物輸送(第2版)，Robinson等編輯，p623-53(Marcel Dekker公司，1987)；Thonpe，「癌症治療中胞毒劑的抗體載體綜述」，單克隆抗體』84生物和臨床應用，Pinchera等編輯，p475-506(1985)；「在癌症治療中治療性使用放射標記的抗體的分析，結果和特徵」，檢測和治療癌症中的單克隆抗體，Baldwin等編輯，p303-16(科學出版社，1985)，和Thorpe等，「抗體—毒素綴合物的製備和胞毒性」，免疫學綜述62119-58(1982)。
或者，抗體可綴合於另一種抗體以形成抗體異源綴合物，如Segal的美國專利No.4676980所述，以其全文併入參考。
有或無治療組分綴合於其的抗體，可單獨施用或與胞毒因子和/或細胞因子組合施用，以進行治療。
免疫表型本發明的抗體可用於對細胞系和生物樣品進行免疫表型。本發明基因的翻譯產物可用作細胞特異性標記，或更特別地作為細胞標記，其在特殊細胞類型的分化和/或成熟的各個階段不同表達。直接抗特異性表位或表位組合的單克隆抗體，可以篩選表達此標記的細胞群。可利用各種使用單克隆抗體的方法篩選表達標記的細胞群，包括用抗體包被的磁性珠磁性分離，用附著於固體基質(即平板)的抗體「淘選」，和流式細胞計量(見例如美國專利5985660；和Morrison等，細胞96737-49(1999))。
這些方法可以篩選特殊細胞群，如可發現血液惡性腫瘤(即急性白血病患者最小殘餘病(MRD))，和移植中的「非自身」細胞以預防移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，這些方法可篩選能經歷增殖和/或分化的造血幹細胞和祖細胞，如可在人臍帶血中發現的細胞。
抗體結合分析可通過本領域已知的任何方法分析本發明抗體的免疫特異性結合。可使用的免疫分析包括但非限於競爭性和非競爭性分析系統，所用方法如Western印跡，放射免疫分析，ELISA(酶聯免疫吸附測定)，「夾心」免疫分析，免疫沉澱分析，沉澱素反應，凝膠擴散沉澱素反應，免疫擴散分析，凝集分析，補體固定分析，免疫放射分析，螢光免疫分析，蛋白A免疫分析等等。這些分析在本領域是常規且熟知的。(見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wiley Sons，Inc.，紐約，以其全文併入參考)。以下簡要舉例簡述了一些免疫分析(非限制性)。
免疫沉澱方法通常包括裂解在裂解緩衝液中的細胞群，裂解緩衝液如補加蛋白質磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(如EDTA，PMSF，抑蛋白酶肽，釩酸鈉)的RIPA緩衝液(1％ NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH 7.2，1％Trasylol)，將相應抗體加入細胞裂解物中，在4℃溫育一段時間(如1-4小時)，向細胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠，在4℃溫育大約1小時或更長時間，在裂解緩衝液中衝洗此珠，並將此珠再懸浮於SDS/樣品緩衝液中。相應抗體免疫沉澱特殊抗原的能力可通過例如Western印跡分析確定。本領域技術人員已知可對參數加以修改以提高抗體與抗原的結合，並減少背景(如用瓊脂糖珠預先澄清細胞裂解物)。關於免疫沉澱的進一步論述見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wiley Sons，Inc.，紐約，在10.6.1中所述。
Western印跡分析通常包括製備蛋白質樣品。在聚丙烯醯胺凝膠中電泳此蛋白質樣品(如根據抗原分子量使用8％-20％SDS-PAGE)，將蛋白質樣品從聚丙烯醯胺凝膠中移至膜上如硝酸纖維素膜，PVDF膜或尼龍膜，將此膜在封阻液中封阻(如具有3％BSA或脫脂乳的PBS)，在衝洗液中衝洗此膜(如PBS-Tween 20)，用在封阻液中稀釋的原始抗體(相應抗體)封阻此膜，在衝洗液中衝洗此膜，用二級抗體封阻此膜，二級抗體是在封阻液中稀釋的綴合於酶促底物(如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸)或放射性分子(如32p或125I)的抗體，其識別原始抗體如是抗人抗體，將此膜在衝洗液中衝洗，並檢測抗原存在情況。本領域技術人員已知可對參數加以修改，以提高信號檢測並降低背景幹擾。關於Western印跡方法的進一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wilety Sons，Inc.，紐約，在10.8.1中所述。
ELISA包括製備抗原，用抗原包被96孔微滴定平板的孔，向孔中加入綴合於可檢測化合物如酶促底物(如辣根氧化物酶或鹼性磷酸酶)的相應抗體，溫育一段時間，檢測抗原的存在情況。在ELISAs中，相應抗體非必須綴合於可檢測化合物；可將綴合於可檢測化合物的二級抗體(其識別相應抗體)加入孔中。另外，可用抗體包被孔代替用抗原包被孔。在這種情況中，綴合於可檢測化合物的另一種抗體可在加入相應抗體之後加入包被的孔中。本領域技術人員已知可對參數加以修改以提高信號檢測及對ELISA可作其它改變。關於ELISA的進一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wiley Sons，Inc.，紐約，11.2.1所述。
抗體與抗原的結合親和性和抗體抗原相互作用的off-rate可通過競爭性結合分析確定。競爭性結合分析例如是放射性免疫分析，包括用相應的抗體在存在增加量未標記的抗原的情況下，溫育標記的抗原(如3H或125I)，並檢測與標記的抗原結合的抗體。相應抗體與特殊抗原的結合親和性及結合off-rate可通過Scatchard印跡分析的結果確定。與另一種抗體的競爭也可用放射免疫分析確定。在這種情況中，抗原用綴合於標記的化合物(如3H或125I)的相應抗體，在存在增加量未標記的另一種抗體的情況下溫育。
治療應用本發明還小及一種基於抗體的治療方法，包括將本發明的抗體施用於動物，優選哺乳動物，更優選病人，以治療一或多種所述的疾病，功能失調或病理狀態。本發明的治療化合物包括但非限於本發明的抗體(包括其片段，類似物和衍生物)，和編碼本發明抗體的核酸。本發明可用於治療，抑制或預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病，功能失調或病理狀態，包括但非限於本文所述的一或多種疾病，功能失調或病理狀態。治療或預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病，功能失調或病理狀態，包括但非限於改善與這些疾病，功能失調或病理狀態相關的症狀。本發明的抗體可以製成藥學合適的組合物，如本領域已知或本文所述。
本發明抗體可治療性應用的途徑包括將本發明的多核苷酸或多肽局部或全身性地結合於體內，或通過抗體的直接胞毒性，例如由補體細胞(CDC)或效應細胞(ADCC)介導。這些方法在下文加以詳細闡述。根據本文教導，本領域技術人員知道怎樣使用本發明的抗體進行診斷，監測或治療，而不需要過多的試驗。
本發明的抗體可與其它單克隆或嵌合抗體，或與淋巴因子或造血生長因子(如IL-2，IL-3和IL-7)組合應用，例如可提高與抗體相互作用的效應細胞的數目或活性。
本發明的抗體可單獨施用或與其它類型的治療方法組合施用(如放療，化療，激素療法，免疫療法和抗腫瘤劑)。通常地，施用的產物的來源或物種反應性(在抗體的情況下)優選是與病人相同的物種的。因此在一優選的實施方案中，將人抗體，其片段、衍生物，類似物或核酸施用於人，以進行治療或預防。
優選使用抗本發明多肽或多核苷酸的高親和性和/或潛在體內抑制和/或中和抗體，其片段或區域，以進行免疫分析和治療與本發明多核苷酸或多肽包括其片段相關的疾病。這種抗體，片段或區域優選與本發明的多肽或多核苷酸有親和性。優選的結合親和性包括解離常數或kd小於以下數值5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。
基因治療在一特異的實施中，施用包含編碼抗體或其功能性衍生物的序列的核酸，通過基因療法治療，抑制或預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病或功能失調。基因療法是指通過為治療對象施用表達的或可表達的核酸而進行治療的方法。在本發明的這種實施方案中，核酸產生其編碼的蛋白質介導治療作用。
根據本發明可使用本領域中任何適當的基因治療方法。例如以下所述的方法關於基因治療的一般論述見於Gold spiel等，臨床藥理學12488-505(1993)；Wu和Wu，生物治療387-95(1991)Tolstoshev，藥物毒性分析研究32573-594(1993)；Mulligan，科學260926-932(1993)；May，TIBITECH 11(5)155-215(1993)。可使用的本領域已知的重組DNA方法見於Ausubel等編輯，分子生物學通用方法，John Wiley Sons，NY(1993)；和Kriegler，基因轉移和表達實驗手冊，Stockton出版社，NY(1990).
優選的一方面，化合物包含編碼抗體的核酸序列，所述核酸序列是在適當宿主中表達抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表達載體的一部分。尤其地，這種核酸序列具有可操縱地連於抗體編碼區的啟動子，所述啟動子是可誘導的或組成型的，及任選地是組織特異性的。在另一特殊的實施方案中，使用的核酸分子其中抗體編碼序列和任何其它所需序列，位於基因組中所需位點啟動同源重組的區域兩則，因此可使抗體編碼核酸在染色體內表達(Koller和Smithies，美國科學隆隆報868932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342435-438(1989)。在特異的實施方案中，表達的抗體分子是一單鏈抗體；或者，核酸序列包括編碼抗體的重鏈和輕鏈，或其片段的序列。
將核酸施用於患者可通過直接或間接方式，直接方式是將患者直接曝露於核酸或攜帶核酸的載體，間接方式是將細胞首先用核酸在體外轉化，然後移植到患者體內。這兩種方法分別稱為體內或源於體內的基因療法。
在一特異的實施方案中，將核酸序列直接在體內施用，其在體內被表達從而產生編碼的產物。這可通過本領域已知的許多方法進行，例如將它們構建為適當的表達載體的一部分，並施用由此成為胞內一部分，例如通過用缺陷的或弱化的逆轉錄病毒或其它病毒感染(見美國專利NO.4980286)，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊(如基因槍，Biolistic，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被，在脂質體微粒或微膠囊化，或與已知進入細胞核的肽連接而施用，與配體連接進行受體介導的胞吞作用而施用(見例如Wu和Wu，生物化學雜誌2624429-4432(1987))(其可用於定向特異表達受體而細胞類型)，等等。在另一實施方案中，可形成核酸一配體複合物，其中配體包含融合病毒肽以破壞核內體，使核酸免於被溶酶體降解。在另一實施方案中，核酸可在體內通過定向特異受體的特異定向，以進行細胞特異性吸收和表達(見例如PCT出版物WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/1188，WO93/20221)。或者，可通過同源重組將核酸導入細胞內和摻入宿主細胞DNA中以進行表達(Koller和Smithies，美國科學院院報868932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342435-438(1989))。
在一特異的實施方案中，使用含有編碼本發明抗體的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(見Niller等，酶學方法217581-599(1993))。這些逆轉錄病毒載體含有正確包裝病毒基因組和整合入宿主細胞DNA所必需的組分。將在基因療法中使用的編碼抗體的核酸序列克隆入一或多個載體中，該載體易於將基因輸送於病人。關於逆轉錄病毒載體的更詳細論述見於Boesen等，生物治療6291-302(1994)，其闡述了使用逆轉錄病毒載體將mdrL基因輸送於造血幹細胞；以使幹細胞對化療更有抗性。在基因治療中使用逆轉錄病毒載體的其它參考文獻例如是Clowes等，臨床研究雜誌93644-651(1994)；Kiem等，血液831467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人體基因治療4129-141(1993)；和Grossman和Wilson，遺傳和發育通用觀點3110-114(1993)。
腺病毒是可用於基因治療的另一種病毒載體。腺病毒是將基因輸送於呼吸道上皮的特別適合的載體。腺病毒自然感染呼吸道上皮導致輕微疾病。基於腺病毒的輸送系統的基它靶器官是肝，中樞神經系統，內皮細胞和肌。腺病毒具有能感染未分化細胞的優勢。Kozarsky和Wilson，遺傳與發育通用觀點3499-503(1993)提出了一種基於腺病毒的基因療法。Bout等，人體基因治療53-10(1994)論證了使用腺病毒載體將基因移至哮喘猴的呼吸道上皮。在基因治療中使用腺病毒的基它實例見於Rosenteld等，科學252431-434(1991)；Rosenteldt，68143-155(1992)；和Wang等，基因治療2775-783(1995)。在一優選的實施方案中，使用腺毒載體。
腺伴隨病毒(AAV)也已用於基因治療中(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204-289-300(1993)；美國專利No.5436 146)。
基因治療的另一方法包括將基因移至組織培養物中的細胞中，通過如電穿孔，脂染，磷酯鈣介導的轉染，或病毒感染等方法。轉移方法一般包括將可選擇標記移至細胞中。然後將細胞選擇放置以分離那些吸收並表達轉移的基因的細胞，然後將這些細胞輸送於患者。
在此實施方案中，將核酸導入細胞中，之後在體內施用所得重組細胞。這種導入可通過本領域已知的任何方法進行，包括但非限於轉染，電穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染，細胞融合，染色體介導的基因轉移，微細胞介導的基因轉移，原生質球融合等。本領域已知許多將外源基因導入細胞的方法(見例如Loeffier和Behr，酶學方法217599-618(1993)；Cohen等，酶學方法217618-644(1993)；Cline.，藥物治療2969-92m(1985)，根據本發明可以使用這些方法，保證受體細胞的基本發育和生理功能不被破壞。所用方法應穩定地將核酸移至細胞，以使核酸可由細胞表達，並優選可由其細胞子代遺傳和表達。
所得重組細胞可通過本領域已知的各種方法輸送於患者。重組血細胞(如造血幹細胞或祖細胞)優選靜脈內施用。細胞用量根據所需效應，病人狀態等而定，並可由本領域技術人員確定。
可導入核酸以進行基因治療的細胞包括任何所需的適當細胞類型，包括但非限於上皮細胞，內皮細胞，角質形成細胞，成纖維細胞，肌細胞，肝細胞；血細胞如T淋巴細胞，B淋巴細胞，單核細胞，巨噬細胞，嗜中性白細胞，嗜酸性粒細胞，巨核細胞，粒細胞；各種幹細胞或祖細胞，尤其造血幹細胞或祖細胞，如得自骨髓，臍帶血，周圍血，胎兒肝臟等的造血幹細胞或祖細胞。
在一優選的實施方案中，用於基因治療的細胞是患者自身的。
在基因治療中使用重組細胞的一實施方案中，將編碼抗體的核酸序列導入細胞中，這樣其可由細胞或細胞子代表達，然後將重組細胞在體內施用以進行治療。在一特異的實施方案中，使用幹細胞或祖細胞。根據本發明的此實施方案可潛在使用可在體外分離和保持的任何幹細胞和/或祖細胞(見例如PCT出版物WO94/08598；Stemple和Anderson，細胞71937-985(19892)；Rheinwald，細胞生物學方法21A229(1980)；和Pittelkow和Scott，Aayo Clinic Proc.61771(1986))。
在一特異的實施方案中，在基因治療中導入的核酸包含可操縱地連於編碼區的可誘導啟動子，這樣核酸的表達可通過控制適當轉錄誘導子的存在與否而加以控制。論證治療或預防活性。
本發明的化合物或藥物組合物優選在體外測試，然後在體內測試所需的治療或預防活性，之後再用於人體，例如，在體外分析論證化合物或藥物組合物的治療或預防活性，包括化合物對細胞系或患者組織樣品的作用。化合物或組合物對細胞系和/或組織樣品的作用，可通過本領域已知方法確定，包括但非限於花結形成分析和細胞裂解分析。根據本發明，可使用的確定特異化合物的施用是否是指定的體外分析，包括體外細胞培養分析，其中將病人組織樣品生長於培養基中，曝露於或另外施用化合物，觀測這種化合物對組織樣品的作用。
治療性/預防性施用及組合物本發明提供了通過為治療對象施用有效量的本發明化合物或藥物組合物，優選本發明抗體，以進行治療，抑制和預防的方法。優選的一方面，化合物是基本純化的(如基本沒有限制其作用或產生非所需副作用的物質)。治療對象優選是動物，包括但非限於牛、豬、馬、雞、貓、狗等，優選是哺乳動物，更優選是人。
當化合物包含核酸或免疫球蛋白時，可應用的施用配方和方法如上所述；其它適當的配方和施用途徑可選自以下所述。
已知許多輸送系統並可用於施用本發明的化合物，例如在脂質體、微粒、微囊中膠囊化，能表達化合物的重組細胞，受體介導的胞吞(見例如Wu和Wu，生物化學雜誌，2624429-4432(1987))，將核酸構建為逆錄病毒或其它載體的一部分等，導入方法包括但非限於皮內，肌內，腹膜內，靜脈內，皮下，鼻內，epidural和口服。化合物或組合物可通過任何常規途徑施用，例如通過融合或大丸注射，通過上皮或黏膜與皮膚界線(如口腔黏膜，直腸和小腸黏膜等)吸收，及可與其它生物活性劑一起施用。可系統或局部施用。另外，可通過任何適當途徑將本發明的藥物化合物或組合物導入中樞神經系統，包括靜脈內和動脈內注射；靜脈內注射可通過靜脈內導管注射，例如附著於貯液槽如Ommaya貯液槽，也可使用肺部施用，如通過使用吸入器或噴霧器，及使用具有霧化劑的配方。
在一特異的實施方案中，可將本發明的藥物化合物或組合物局部施用於需要治療的部位；這可例如但非限於通過在手術期間局部灌注，局部應用如在手術後與傷口加壓結合，通過注射，利用導管，利用栓劑，或利用移植體，所述移植體是有孔，無孔或凝膠物，包括膜如sialastic膜或纖維。優選地，當施用本發明的蛋白質包括抗體時，必須注意使用該蛋白質不吸收的物質。
在另一實施方案中，化合物或組合物可在載體中輸送，尤其在脂質體中(見Langer，科學2491527-1533(1990))；Treat等，感染性疾病和癌症治療中的脂質體，Lopez-Berestein和Fidler編輯，Liss，紐約，pp 3353-35(1989)；Lopez-Berstein，如上，pp 317-327；如上)。
在另一實施方案中，化合物或組合化合物可在控制釋放系統中輸送。在一實施方案中，可使用泵(見Langer，如前；Sefton，CRCCrit.Ret.Biomed.Eng.1420l(1987)；Buchwald等，外科學88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實施方案中，可使用多聚體物質(見控制釋放的醫學應用，Langer和Wise編輯，CRC出版社，Boca Raton，Floride(1974)；控制的藥物生物適應性，藥品設計與生產，Smolen和Ball編輯，Wiley，紐約(1984)；Ranger和Pdppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也見於Levy等，科學228190(1985)；During等，神經學分析25351(1989)；Howard等，神經藥物雜誌71105(1989)。在另一實施方案中，控制的釋放系統可置於治療靶器官的鄰近，即腦組織中，因此只需要全身劑量的一部分(見例如Goodson，控制釋放的醫學應用，如前，第2卷，pp 115-138(1984))。
其它控制釋放系統參見Langre所述(科學2491527-1533(1990))。
在一特異的實施方案中，其中本發明的化合物是編碼蛋白質的核酸，可將核酸在體內施用以促進其編碼的蛋白質表達，通過將其構建為適當核酸表達載體的一部分，並將其施用，以使其成為胞內一部分，例如使用逆轉錄病毒載體(見美國專利No.4980286)或通過直接注射，或使用微粒轟擊(如基因槍，Biolistic，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被，或與已知進入細胞核的類同源核的類同源框肽連接而施用(見例如Joliot等，美國科學院院報881864-1868(1991))等。或者，可通過同源重組將核酸導入細胞內或摻入宿主細胞DNA中表達。
本發明還提供了藥物組合物。這種組合物包含治療有效量的化合物，和藥物適當的載體。在一特異的實施方案中，術語「藥物適當的」是指聯邦政府或政府部門管理機構批准的，或美國藥曲或其它公認藥典中所列的可用於動物尤其是人的物品。術語「載體」指與治療劑一起施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或運載體。這種藥物載體可以是無菌液體如水和油，包括石油，動物油，植物油或合成油，如花生油、豆油、礦物油，芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可用作液體載體，尤其可注射溶液。適當的藥物賦形劑包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽糖，米，麵粉，石灰，矽膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油，滑石，氯化鈉，無水脫脂乳，甘油，丙烯，二醇，水，乙醇等。如果需要，組合物也可含有少量溼化或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以是溶液，懸浮液，乳液，片劑，丸劑，膠囊、粉末，緩釋配方等。組合物可用傳統結合劑和載體如甘油三酯配製為栓劑。口服配方可包括標準載體如藥物梯度的甘露糖醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂、糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。適當的藥物載體例如由E.W.Martin的「Remington’s藥物科學」所述。這種組合物含有治療有效量的化合物，優選純化形式的，及適量的載體，以提供施用於患者的適當形式。配方應適於施用方式。
在優選的實施方案中，組合物是根據配製適於靜脈內施用於人體的藥物組合物的常規方法配製的。典型地，靜脈內施用的組合物是在無菌等滲水溶液緩衝液中的溶液。如果需要，組合物也可包括增溶劑和局部麻醉劑如Lignocaine，以減輕注射部位的疼痛。通常地，單獨或以單位劑量形式混合的配料，例如在密封的容器中乾燥凍幹的粉末或無水濃縮物，密封的容器如是表明活性數量的安瓿或Sachette。在通過灌注施用組合物之處，其可用含有無菌藥物級水或鹽水的灌注瓶分液。在通過注射施用組合物之處，可提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，以在施用前將配料混合。
本發明的化合物可以中性或鹽形式配製，藥物適當的鹽包括陰離子如產生自鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等，和與陽離子如產生自NaOH，KOH，NH4OH，Ca(OH)2，Fe(OH)2，異丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，組胺，procaine等形成的鹽。
可通過標準臨床方法確定本發明化合物的數量，該數量在治療，抑制和預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病或功能失調中是有效的。另外，可任選地應用體外分析，以助於鑑別最佳劑量範圍。配方中所應用的實際劑量根據施用途徑，疾病程度而定，並應根據醫生診斷和每個病人的狀況而定。有效劑量可從體外或動物模型測式系統產生的劑量應答曲線中推斷。
就抗體而言，施用於患者的劑量為0.1mg/kg體重-100mg/kg體重。優選地，施用於患者的劑量為0.1mg/kg體重-20mg/kg體重，更優選為1mg/kg體重-10mg/kg體重。通常地，人抗體比其它物種的抗體在人體內的半衰期長，這是因為對外源多肽的免疫應答所致。因此，通常可以非頻繁施用較少劑量的人抗體。另外，本發明抗體施用劑量和頻率，可通過對抗體加以修飾例如脂質化，而增強吸收和進入組織(如進入腦組織)的能力，從而減少施用本發明抗體的劑量和頻率。
本發明還提供了一種藥物包裝或試劑盒，其包含一或多個充填本發明藥物組合物的一或多種配料的容器。這種容器中有一份由政府管理生產，使用或銷售藥物或生物製品的機構所準許的告示，反映該藥物可用於人體。
診斷和顯影特異結合相應多肽的標記的抗體，及其衍生物和類似物，可用於檢測，診斷或監測與本發明多肽的異常表達和/或活性相關的疾病，功能失調和/或病理狀態。本發明提供了檢測相應多肽異常表達的方法，包括(a)用一或種特異於相應多肽的抗體，分析在個體的細胞或體液中相應多肽的表達，和(b)將此基因表達水平與標準基因表達水平相對比，分析的多肽基因表達水平與標準表達水平相比提高或降低，表明是異常表達。
本發明提供了論斷疾病的分析方法，包括(a)用特異於相應多肽一或多種抗體，分析在個體的細胞或體液中相應多肽的表達，和(b)將此基因表達水平與標準基因表達水平相對比，從而分析的多肽基因基因表達水平與標準表達水平相比提高或降低，表明特定疾病的存在。就癌症而言，個體活檢組織中存在相對高數量的轉錄物，可表明疾病發生的傾向，或提供在實際臨床症狀出現之前檢測疾病的一種方法。這種診斷方法更明確可使醫生早期應用預防措施或大膽治療，從而防止癌症發生或進一步轉移。
可使用本發明的抗體分析生物樣品中蛋白質水平，使用本領域已知的傳統免疫組織學方法(見例如Jalkanen等，細胞生物學雜誌101976-985(1985)Jaldanen等，細胞生物學雜誌1053087-3096(1987))。用於檢測蛋白質基因表達的其它基於抗體的方法包括免疫分析，如酶聯免疫吸附測定(ELISA)，和放射免疫分析(RIA)。本領域已知適當的抗體分析標記，並包括酶標記，如葡糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(112In)和鍺(99Tc)發光標記，如魯米諾；和螢光標記，如螢光素和羅丹明和生物素。
本發明的一個方面是檢測和論斷在動物體，優選哺乳動物，更優選在人體與相應肽異常表達相關的疾病或功能失調。在一實施方案如，診斷方法包括a)為治療對象施用(例如經非腸道，皮下或腹膜內施用)有效量的特異結合相應多肽的標記的分子；b)施用後間隔一段時間，以使標記的在治療對象體內表達多肽的部位優選濃縮(並從背景水平清除未結合的標記的分子)；c)確定背景水平；和d)檢測治療對象中標記的分子，這樣檢測標記的分子高於背景水平，表明對象具有與相應多肽異常表達相關的特殊病症或功能失調。可通過各種方法確定背景水平，包括將檢測的標記的分子的數量與預先在特定系統中確定的標準值相對比。
本領域知道根據對象的大小和使用的顯影系統，確定產生診斷圖像所需的顯影組分的數量。在放射性同位素組分的情況下，對人而言，注射的放射性物質的數量通常為大約5-20毫居裡的99mTc。然後標記的抗體或抗體片段優先在含有特異蛋白質的細胞累積。體內腫瘤顯影見S.W.Burchiel等，「放射標記的抗體及其片段的免疫藥物學」，(腫瘤顯影癌症的放射性化學檢測，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編輯，Masson出版公司(1982))所述。
根據各種變化，包括使用的標記類型和施用模式，在施用後以使標記的分子優先在對象一定部位濃縮，及從背景水平清除未結合的標記的分子，所間隔的時間為6-48小時或6-24小時，或6-12小時。在另一實施方案中，施用後的間隔時間為5-20天或5-10天。
在一實施方案中，監測疾病或功能失調是通過重複診斷疾病的方法進行的，例如在開始診斷後1個月，6個月，1年等重複一次。
可使用本領域已知體內掃描方法檢測病人體內標記的分子的存在情況。這些方法依賴於所使用的標記類型。熟練技術人員可確定檢測特殊標記的適當方法。可用於本發明診斷方法和設備包括但非限於CT，全身掃描如正電子發射斷層顯象(PET)，核磁共振顯像(MRI)和聲像。
在一特異的實施方案中，分子是用放射性同位素標記的，並用輻射應答外科儀器在病人體內檢測的(Thruston等，美國專利No.5441050)。在另一實施方案中，分子是用螢光化合物標記的，並用螢光應答掃描儀在病人體內檢測的。在另一實施方案中，分子是用發射正電子金屬標記的，並用正電子發射斷層顯象在病人體內檢測。在另一實施方案中，分子是用順磁性標記標記的，並用核磁共振顯象(MRI)在病人體內檢測。
試劑盒本發明提供了可在上述方法中使用的試劑盒。在一實施方案中，試劑盒包含一或多個裝有本發明的抗體，優選純化的抗體的容器。在一特異的實施方案中，本發明的試劑盒含有一基本分離的多肽，其包含與試劑盒中的抗體特異性免疫反應的表位。優選地，本發明的試劑盒還包含對照抗體，其不與相應多肽反應。在另一特異的實施方案中，本發明的試劑盒含有一種檢測抗體與相應多肽結合的方法(例如，可將抗體與可檢測物如螢光化合物，酶底物，放射性化合物或發光化合物綴合，或者可將識別第一種抗體的第二種抗體與可檢測底物綴合)。
在本發明另一特異的實施方案中，試劑盒是一種用於篩選含有抗體的血清的診斷試劑盒，該抗體特異抗增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽。這種試劑盒可包括基本分離的多肽抗原，其包含與至少一種抗多肽抗原抗體特異性免疫反應的表位。另外，這種試劑盒包括檢測所述抗體與抗原結合的方法(例如，可將抗體與螢光化合物綴合，如可通過流式細胞計量術檢測的螢光素或羅丹明)。在特異的實施方案中，試劑盒可包括重組產生的或化學合成的多肽抗原。試劑盒的多肽抗原也可附著於固體支持物。
在更特異的實施方案中，上述試劑盒的檢測方法包括一固體支持物，所述多肽抗原附著於其。這種試劑盒還可包括非附著的報導分子標記的抗人抗體。在此實施方案中，抗體與多肽抗原的結合可通過所述報導分子標記的抗體的結合而檢測。
在另一實施方案中，本發明包括用於篩選血清的診斷試劑盒，該血清含有本發明多肽的抗原。此診斷試劑盒包括基本分離的與多肽或多核苷酸抗原特異性免疫反應的抗體，和檢測多核苷酸或多肽抗原與抗體結合的方法。在一實施方案中，抗體附著於固體支持物。在一特異的實施方案中，抗體可以是單克隆抗體。試劑盒的檢測方法可包括另一種標記的單克隆抗體。或者，或另外，檢測方法可包括標記的競爭抗原。
在一診斷性構型中，測試血清與通過本發明方法獲得的表面結合抗原的固相試劑反應。在特異性抗原抗體與試劑結合，並通過衝洗除去未結合的血清成分後，試劑與報導分子標記的抗人抗體反應，報導分子與試劑的結合與固體支持物上結合的抗抗原抗體的數量成比例。將此試劑再次衝洗以除去未結合的標記的抗體，並確定與試劑相關的報導分子數量。典型地，報導分子是一種酶，其可通過在存在適當的螢光性，發光性或比色底物的情況下，溫育此固相支持物而檢測(Sigma，St.Louis，MO)。
上述分析中的固體表面試劑，是通過將蛋白質附著於固體支持物的已知方法製備的，固體支持物如聚合物珠，96孔平板或濾膜。這些附著方法一般包括將蛋白質非特異性吸附於支持物，或通過游離氨基將蛋白質共價附著於固體支持物上的化學反應基團，如活化的羧基，羥基，或醛基。或者，可使用鏈親和素包被的平板與生物素醯化的抗原。
因此，本發明提供了進行這種診斷方法的分析系統或試劑盒。此試劑盒通常包括具有表面結合重組抗原的支持物，和報導分子標記的抗人抗體，以檢測表面結合的抗抗原抗體。
多核苷酸包含本發明多核苷酸的分離的核酸分子包括血小板衍生生長因子A(PDGF-A)，如歐洲專利EP-682110(SEQ ID NO1)所揭示；血小板衍生生長因子B(PDGF-B)，如歐洲專利EP-282317(SEQ ID NO3)所揭示；胎盤生長因子(PlGF)，如國際出版物WO 92/06194(SEQ ID NO5)所揭示；胎盤生長因子-2(PlGF-2)，如Hauser等，生長因子4259-268(1993)(SEQ ID NO7)所揭示；膠質瘤衍生生長因子(GDGF)，如歐洲專利EP-399816(SEQID NO9)所揭示；血管內皮生長因子(VEGF)，如國際出版物WO90/13649(SEQ ID NO11)所揭示；血管內皮生長因子-A(VEGF-A)，如歐洲專利EP-506477(SEQ ID NO13)所揭示；血管內皮生長因子-2(VEGF-2)，如國際出版物WO96/39515(SEQ IDNO15)所揭示；血管內皮生長因子-3(VEGF-3)，如國際出版物WO96/39421(SEQ ID NO17)所揭示；血管內皮生長因子-D(VEGF-D)，如國際出版物WO98/07832(SEQ ID NO19)所揭示；血管內皮生長因子-D1(VEGF-D1)，如國際出版物WO98/02543(SEQ ID NO21)所揭示；和血管內皮生長因子-E(VEGF-E)，如德國專利DE 19639601(SEQ ID NO23)所揭示。以上所提及的文獻均以全文併入參考。
本發明的血管生成蛋白均是結構相關的。尤為重要的是在VEGF/PDGF家族的所有成員中，所有8個半胱氨酸殘基均是保守的(見圖3A-3C的方框區域)。另外，PDGF/VEGF家族的特徵，PXCVXXXRCXGCC(SEQ ID NO29)，在本文所揭示的所有血管生成蛋白中均是保守的(見圖3A-3C)。
本發明的血管生成多肽包括全長多肽和多核苷酸序列，多核苷酸序列編碼全長多肽的任何前導序列和活性片段。
本發明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，DNA包括cDNA，基因組DNA，和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼成熟多肽的編碼序列可以與表1的核苷酸序列的編碼序列相同，或者可以是不同的編碼序列，是由編碼與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的DNA相同的成熟多肽的遺傳密碼豐餘或簡併產生的。
編碼圖3A-3C的代表性成熟多肽的多核苷酸可包括只是代表性成熟多肽的編碼序列；代表性成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導或分泌序列或前蛋白序列；代表性成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)及非編碼序列，如內含子或成熟多肽編碼序列的5』和/或3』非編碼序列。
因此，術語「編碼多肽的多核苷酸」涵蓋了只包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變體，其編碼具有圖3A-3C推導的胺基酸序列的多肽的片段，類似物和衍生物。多核苷酸可以是天然發生的多核苷酸的等位基因變體，或非天然發生的多核苷酸。
因此，本發明包括編碼與圖3A-3C所示相同的代表性成熟多肽的多核苷酸，以及這種多核苷酸的變體，此變體編碼圖3A-3C所示多肽的片段，衍生物或類似物。這種核苷酸變體包括缺失變體，取代變體，和添加或插入變體。
如上所述，多核苷酸可具有一種編碼序列，該序列是SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23編碼序列的天然發生的等位基因變體。如本領域所知，等位基因變體是多核苷酸序列的另一種形式，其具有一或多個核苷酸取代，缺失或添加，但基本不改變所編碼的多肽的功能。
本發明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可融合於多核苷酸的相同讀框，有助於在宿主細胞表達和分泌多肽，例如，前導序列作為分泌序列以控制多肽轉運至細胞。具有前導序列的多肽是一種前蛋白，並可具有由宿主細胞裂解的前導序列，以形成多肽的成熟形式。此多核苷酸還可編碼是成熟蛋白加上另外的5』胺基酸殘基組成的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一蛋白原，且是失活形式的蛋白質。一旦序列原裂解，保留活性成熟蛋白。
因此，例如本發明的多核苷酸可編碼成熟蛋白，編碼具有序列原的蛋白質，或編碼具有序列原和前序列(前導序列)的蛋白質。
本發明的多核苷酸也可具有融合於標記序列框中的編碼序列，以純化本發明的多肽。標記序列可以是由PQE-9載體提供的6組氨酸標記，以在細菌宿主的情況中純化融合於標記的成熟多肽，或者例如當使用哺乳動物宿主如COS-7細胞時，標記序列可以是血凝素(HA)標記。HA標記相當於衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson.，I.等，細胞37767(1984))。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO2所示大約1-211位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO4所示大約1-241位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO6所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO6所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO6所示大約1-149位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO8所示大約1-170位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO10所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO10所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO10所示大約1-190位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO12所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO12所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO12所示大約1-191位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO14所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO14所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO14所示大約1-214位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO16所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO16所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO16所示大約1-419位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號97149的cDNA克隆編碼的胺基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼具有ATCC保藏號97149的cDNA克隆編碼的胺基酸序列的成熟VEGF2多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有ATCC保藏號97149的cDNA克隆編碼的胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；或(g)互補於(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO18所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO18所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO18所示大約1-207位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO20所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO20所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO20所示大約1-325位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO22所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO22所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO22所示大約1-354位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO24所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO24所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO24所示大約1-132位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
具有與編碼血管生成多肽的參照核苷酸序列有例如至少95％「相同性」的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，除了此多核苷酸可包括編碼血管生成多肽的參照核苷酸序列的每100個核苷酸有5個點突變。換而言之，為獲得含有與參照核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中5％的核苷酸可缺失或用另外核苷酸取代，或者可將佔參照序列中總核苷酸數5％的核苷酸插入參照序列中。參照序列的這些突變可發生在參照核苷酸序列的5』或3』末端，或這些末端之間的任一之處，單獨分散於參照序列的核苷酸之間，或以一或多個連續基因存在於參照序列間。
實際上，任何特殊核酸分子是否至少95％、96％、97％，98％或99％與例如SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核苷酸序列相同，可用已知電腦程式常規確定，例如Bestfit程序(Wisconsin序列分析程序，Version8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源序列對比(Advances in Applied Mathematies 2482-489(1981))，發現二個序列間的最佳同源節段。當使用Bestfit或任何其它序列對比程序，以確定特殊序列是否與本發明的參照序列例如有95％相同性時，當然要設定參數，這樣在全長參照核苷酸序列之上計算相同性百分率，並允許有佔參照序列總核苷酸數5％的同源缺口。
血管生成「多核苷酸」還包括那結能在嚴格雜交條件下，與SEQID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示序列，或例如ATCC保藏號97149或75698的cDNA克隆所含序列，或其互補序列雜交的多核苷酸。「嚴格雜交條件」指在42℃，在包含50％甲醯胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5x Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20μg/ml變性的剪切的鮭精DNA的溶液中溫育過夜，隨後用0.1×SSC在65℃衝洗濾膜。
核酸分子也可在較低嚴格雜交條件下與血管生成多核苷酸雜交。雜交嚴格性和信號檢測中的變化，可通過人為操縱甲醯胺濃度(甲醯胺百分率低導致較低嚴格性)；鹽條件，或溫度而加以調節。例如，較低嚴格條件包括在37℃在含有6x SSPE(20×SSPE＝3MNaCl；0.2M Na2HPO4；0.02M EDTA，pH7.4)，0.5％SDS，30％甲醯胺，100μg/ml鮭精封阻DNA的溶液中溫育過夜；隨後在50℃用1×SSPE，0.1％SDS衝洗。另外，為達到更低嚴格性，可在嚴格雜交後用更高鹽濃度進行衝洗(如5×SSC)。
注意上述條件的變化可通過包含和/或用另一種封阻劑取代而達到，用於抑制雜交試驗中的背景水平。典型的封阻劑包括Denhardt’s試劑，BLOTTO，肝素，變性的鮭精DNA，和可商購的Proprietary配方。包含特異的封阻劑需要修改上述雜交條件，因為相容性的問題。
當然，只與聚A+序列(如序列表中所示cDNA的任何3』末端聚A+序列段)，或只與T(或U)殘基的互補序列雜交的多核苷酸，不包括在所述「多核苷酸」內，因為這種多核苷酸與含有聚A序列或其互補序列(如任何雙鏈cDNA克隆)的任何核酸分子均雜交。
與多核苷酸的「一部分」雜交的多核苷酸是指與參照的多核苷酸的至少大約15個，優選至少大約20個，更優選至少大約30個，最優選大約30-70個核苷酸雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些多核苷酸如上述用作診斷探針和引物，並在下文詳細闡述。
例如長度至少為20nt」的多核苷酸部分，是指參照多核苷酸的核苷酸序列(如表1的核苷酸序列)的20或更多個連續核苷酸。當然，只與聚A序列(如SEQ ID NOX的3』末端聚(A)段)，或只與T(或U)殘基的互補序列雜交的多核苷酸，不包括在本發明用於雜交本發明核酸一部分的多核苷酸內，因為這種多核苷酸與含有聚(A)序列或其互補序列的任何核酸分子均雜交(如任何雙鏈的cDNA基隆)。
然而，優選的是具有與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核苷酸序列，或與編碼具有血管生成蛋白活性的多肽的保藏的cDNA的核酸序列，有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的核酸分子。「具有血管生成活性的多肽」是指在特殊的生物學分析中呈血管生成活性的多肽。例如，血管生成蛋白活性可用例如促分裂原分析或內皮細胞遷移分析加以測定。見例如Olofsson等，美國科學院院報932576-2581(1996)和Joukovt，EMBO雜誌5290-298(1996)。「具有淋巴管生成活性的多肽」是指在特殊的生物學活性分析中呈淋巴管生成活性的多肽。例如，血管生成蛋白活性可例如促分裂原分析和內皮細胞遷移分析加以測定。見例如Olofsson等，美國科學院院報932576-2581(1996)和Joukov等，EMBO雜誌5290-298(1996)。
當然，由於遺傳密碼的簡併，本領域技術人員可立即意識到大量具有與保藏的cDNA的核酸序列或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核酸序列，有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的核酸分子，將編碼「具有血管生成蛋白活性」的多肽。事實上，由於這些核苷酸序列的簡併變體均編碼相同多肽，對此技術人員不需進行上述對比分析就清楚。本領域另外意識到，不是簡併的這種核酸分子，有許多也編碼具有血管生成蛋白活性的多肽。這是因為本領域技術人員充分意識到胺基酸取代很少或幾乎不明顯影響蛋白質功能(如用一個脂肪族胺基酸置換另一個脂肪族胺基酸)。
例如，關於怎樣產生表型沉默胺基酸取代見Bowie，J.U.等「譯解蛋白質序列中信息對胺基酸取代的耐受性」，科學2471304-1310(1990)所述，其中作者指明蛋白質非常耐受胺基酸取代。
因此，本發明涉及一種多核苷酸，其與編碼SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24所示多肽的多核苷酸，有至少70％，優選至少90％，更優選至少95％，96％，97％或98％相同性，本發明還小及這種多核苷酸的片段，該片段具有至少30個優選至少50個鹼基，另外本發明還涉及由這種多核苷酸編碼的多肽。
「相同性」具有本領域所公認的含義並可用公布的方法計算(見例如(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lest，A.M.ed.，牛津大學出版社，紐約(1988)；BIOCOMPUTINGINFORMATICSAND GENOME PROJECTS，Smith，D.W.，ed.，科學出版社，紐約(1993)；COMPUTE ANALYSIS OF SEQVENCE DATA，PARTI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編輯，Humana出版社，新澤西(1994)；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，科學出版社(1987)；和SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M.和Devereux J.編輯，M Stockton出版社，紐約(1991))。這呈現了許多測定兩個多核苷酸或多肽序列間相同性的方法，術語「相同性「為本領域技術人員所熟知(Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAMJ.Applied Math.481073(1988))。通常使用的測定兩序列間相同性或相似性的方法包括但非限於「Guide to Huge Computers」，MartinJ.Bishop編輯，科學出版社，San Diego(1994)，和Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAM J.Applied Math.481074(1988)。對比多核苷酸或多肽序列的電腦程式包括GCG程序包(Devereux，J.，等，核酸研究12(1)287(1984))，BLASTD，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.等，分子生物學雜誌215403(1990))，Bestfit程序(Wisconsin序列分析程序包，VERSRON8 FOR Unix.Genetics Computer Group.UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison)，WI 53711(使用Smith和Waterman的局部同源序列對比，應用數學進展2482-489(1981))。具有與本發明參照核苷酸序列有例如至少95％「相同性」的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，除了其包核苷酸序列相對於編碼血管生成多肽的參照核苷酸序列的每100個核苷酸中最多有5個點突變。換而言之，為獲得具有與參照核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中最多5％的核苷酸可缺失或用另外的核苷酸取代，或者佔參照序列總核苷酸數最多5％的核苷酸可插入參照序列中。參比序列可以是SEQ ID NO1，3，4，7，9，11，13，15，17，19，21或23的完整序列，ORF(開放讀框)，或本文所述的任何片段。
實際上，任何特殊的核酸分子或多肽是否與本發明的核苷酸序列有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，可通過已知電腦程式常規確定。確定參比序列(本發明序列)與目標序列之間的是佳完全匹配的方法，也稱總體序列對比，優選使用基於Brutlag等的序列對比方法的FASTDB電腦程式(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))。在序列對比中，參比序列與目標序列均是DNA序列。RNA序列可通過將U’s轉換為T’s加以對比。所述總體序列對比的結果是相同性百分率。DNA序列的FASTDB序列對比中所用的計算相同性百分率的參數優選是Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization GroupLength＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window S ize＝500或目標核苷酸序列長度，無論哪個更短。
如果因為5』或3』缺失而非內部缺失導致目標序列比參比序列短，要進行手工校正，因為FASTDB程序當計算相同性百分比時不計算目標序列的5』和3』的短缺。對於目標序列相對於查詢序列5』和3』端的短缺，百分比性的校正是通過計算不匹配的位於目標序列5』或3』端的參比序列的鹼基數，以作為參比序列總鹼基數的百分比。通過FASTDB序列對比的結果來確定一個核苷酸是否匹配。然後將此百分數從相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比結果。此校正的結果可用於本發明。FASTDB序列對比中所顯示出的，只有在目標序列5』或3』端外側的鹼基，它們不與參比序列匹配，才用於計算以手工調節百分比相同性結果。例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列對比以確定相同性百分比。缺失發生於目標序列的5』末端。因此FASTDB比對不顯示出5』端前10個鹼基的匹配。這10個不匹配的鹼基相當於序列的10％(5』或3』端不匹配的鹼基數/參比序列中的鹼基總數)，因而從FASTDB程序計算的相同性百分比中減去這10％。如果剩餘的90個鹼基都完全匹配，那麼最終的相同性百分比就是90％。再例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列相比較，這時缺的的是內部的核苷酸，因而目標序列的5』或3』端鹼基沒有與參比序列不匹配的。在這種情況下，FASTDB程序計算的相同性百分比不需手工校正。再強調一次，只有目的序列的5』或3』端鹼基與參比序列不匹配時才需要手工校正。對於本發明不需要進行其它的手工校正。
對於一個多肽，其所含的胺基酸序列與本發明的參比胺基酸序列具有例如至少95％「相同性」是指，除了相對於參比胺基酸序列的每100個胺基酸，該目標多肽序列可包含最多5個胺基酸改變這外，該目標多肽的基酸序列與參比序列相同。換言之，為獲得具有與參比胺基酸序列至少95％相同性的胺基酸序列的多肽，在目標序列中最多5％的胺基酸殘基可插入，缺失或用另外胺基酸取代。這些參照序列上的變化可發生在參照胺基酸序列的胺基酸端或羧基端，或位於末端之間的任何位置，可以是在參照序列的殘基間各自分散的，或在參照序列上呈連續的一組或多組。
實際上，任一特定的多肽與例如表1所示的胺基酸序列，或保藏的DNA克隆編碼的胺基酸序列是否具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，可以方便地利用已知的電腦程式確定。測定參比序列(本發明的序列)與目標序列間最佳匹配的方法，也稱為總體序列對比，可優選使用基於Brutlag等的序列對比方法的FASTDB電腦程式確定(Comp.App.Biosci.(1990)6237-245)。在序列對比中參比序列和目標序列均是核苷酸序列或均是胺基酸序列。所述總體序列對比的結果是相同性百分率。用於FASTDB胺基酸序列對比中的參數優選為Matrix＝PAM 0)k-tuple＝2，MismatchPenalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，CutoffScore＝1，Window Size＝序列長度，Gap Penalty＝5，Gap SizePenalty＝0.05，Window Size＝500或目標胺基酸序列長度，無論哪個更短。
如果因為N或C缺失而非內部缺失導致目標序列比參比序列短，要進行手工校正，因為FASTDB程序當計算相同性百分比時不計算目標序列的N和C的短缺。對於目標序列相對於查詢序列N和C端的短缺，百分比性的校正是通過計算不匹配的位於目標序列N或C端的參比序列的鹼基數，以作為參比序列總鹼基數的百分比。通過FASTDB序列對比的結果來確定一個核苷酸是否匹配。然後將此百分數從相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比結果。此校正的結果可用於本發明。FASTDB序列對比中所顯示出的，只有在目標序列N或C端外側的鹼基，它們不與參比序列匹配，才用於計算以手工調節百分比相同性結果。例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列對比以確定相同性百分比。缺失發生於目標序列的C末端。因此FASTDB比對不顯示出C，端前10個鹼基的匹配。這10個不匹配的鹼基相當於序列的10％(N或C端不匹配的鹼基數/參比序列中的鹼基總數)，因而從FASTDB程序計算的相同性百分比中減去這10％。如果剩餘的90個鹼基都完全匹配，那麼最終的相同性百分比就是90％。再例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列相比較，這時缺的的是內部的核苷酸，因而目標序列的N或C端鹼基沒有與參比序列不匹配的。在這種情況下，FASTDB程序計算的相同性百分比不需手工校正。再強調一次，只有目的序列N或C端鹼基與參比序列不匹配時才需要手工校正。對於本發明不需要進行其它的手工校正。
血管生成多肽本發明還涉及具有圖3A-3C推導的胺基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段，類似物和衍生物。
在本發明中，「多肽片段」是指包含於SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24中，或由保藏的克隆中cDNA編碼的短基酸。蛋白質片段可以是「free stanging」，或包含於較大片段中，其片段形成一部分或區域，優選一個單獨的連續區域。本發明多肽片段代表性例如包括1-20，21-40，41-60，61-80，81-100，102-120，121-140，141-160，161-180，181-200，201-220，221-240，241-260，261-280或281-編碼區末端的胺基酸組成的片段。另外，多肽片段長度可以是大約20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150個胺基酸。在文中「大約」包括在一端或兩端可多或少12個(5，4，3，2或1)個胺基酸的特定範圍(見表1)。
血管生成蛋白表1
優選的多肽片段包括分泌的血管生成蛋白以及其成熟形式。另外優選的多肽片段包括分泌的血管生成蛋白或其成熟形式，其氨基端或羧基端或這兩端均連續缺失殘基。例如分泌的血管生成蛋白多肽或成熟形式的氨基端可缺失1-60個範圍內的任何數目的胺基酸。相似地，分泌的血管生成蛋白多肽或成熟形式的羧基端可缺失1-40個範圍內的任何數目的胺基酸。另外，優選以上氨基和羧基端缺失的任意組合。相似地，編碼這些血管生成多肽片段的多核苷酸片段也是優選的。
特徵在於結構或功能結構域的血管生成多肽和多核苷酸片段也是優選的，如包含α-螺旋和α-螺旋形成區，β-摺疊和β-摺疊形成區，轉角區和轉角形成區，捲曲和捲曲形成區，親水區，疏水區，α兩親區，β兩親區，柔性區，表面形成區，底物結合區，和高抗原指數區。在保守的結構域內的SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的多肽片段是本發明特別期望的。(見圖3A-3C)。另外，表面這些結構域的多核苷酸片段也是期望的。
其它優選的片段是生物活性的血管生成蛋白片段。生物活性片段是那些與揭示的血管生成多肽之一活性相似，但不必相同的片段。片段的生物活性可包括改良所需活性，或降低非所需活性。
本發明的多肽可以是重組多肽，天然多肽，或合成多肽，優選重組多肽。
本領域意識到血管生成多肽的一些胺基酸序列可以發生變化，但不明顯影響蛋白質的結構或功能。如果序列中的這種差異是期望的，應記得這是蛋白質上確定活性的關鍵部位。
因此，本發明還包括血管生成多肽的變體，其呈現血管生成多肽的基本活性，或包括血管生成多肽如下所述蛋白質部分的區域。這種突變包括缺失，插入，轉換，重複和類型取代。如上所述，關於胺基酸變化可以是表型沉默取代的文獻參見Bowie，J.U.等，「譯解蛋白質序列中的信息耐受胺基酸取代」，科學2471306-1310(1990)。
因此，表1的多肽的片段，衍生物，或類似物可以是(i)其中一或多個胺基酸殘基被保守的或非保守的胺基酸殘基(優選保守的胺基酸殘基)取代，這種取代的胺基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的；或(ii)其中一或多個胺基酸殘基包括取代基；或)iii)其中成熟多肽融合於另一種化合物，如提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的胺基酸融合於成熟多肽，如前導序列或分泌序列或用於純化成熟多肽的序列或蛋白原序列；或(v)其中包含少量SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示胺基酸殘基，及保留保守的基序，並還保留VEGF/PDGF多肽家族的活性特點。根據本發明教導，這種片段，衍生物和類似物包括在本領域技術範圍內。
特別感興趣的是用另一種荷電的胺基酸及用中性或陰性荷電的胺基酸前導荷電的胺基酸。後者導致蛋白質帶還原的陽性電荷，以改良血管生成蛋白的特性。特別需要防止聚集反應。蛋白質的聚集不僅導致活性喪失，當製備藥物配方時也是問題，因為它們可以是免疫原性的。(Pinckard等，免疫學臨床試驗233l-340(1967)；Robbins等，糖尿病36838-845(1987)；Cleland等，治療性藥物載體系統評價10307-377(1993))。
胺基酸置換也可改變與細胞表面受體結合的選擇性。Ostade等，自然361266-268(1993)闡述了一些突變導致TNF-α只與兩種已知的TNF受體之一選擇性結合。因此，本發明的血管生成蛋白可包括一或多個胺基酸取代，缺失或添加，自然突變或人為操作。
如上所述，變化優選是最自然的，如保守胺基酸取代，其不明顯影響蛋白質的摺疊或活性(見表2)。
表2保守胺基酸取代
當然，技術人員可根據許多因素包括上述那些因素確定胺基酸取代的數目。一般來講，給定的任何血管生成多肽的取代數目不超過50，40，30，25，20，15，10，5或3個。
本發明血管生成蛋白中的基本功能性胺基酸，可通過本領域已知方法鑑別，如位點直接誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989))。後一方法介紹了在分子的每個殘基進行單一丙氨酸突變。然後測試所得突變分子的生物活性如受體結合或在體外或體內增殖活性。配體—受體結合的關鍵位點也可通過結構分析確定，如結晶，核磁共振或光親和標記(Smith等，分子生物學雜誌224899-904(1992)和Vos等，科學255306-312(1992))。
本發明的多肽和多核苷酸優選以分離形式提供，並優選純化為均質。
術語「分離的」是指從其原始環境中(如其天然發生的環境)獲得的物質。例如，存活動物中天然發生的多核苷酸或多肽不是分離的，但分離自自然系統中一些或所有共存物的相同多核苷酸或DNA或多肽，是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，並在這種載體或組合物不是其一部分的天然環境中仍是分離的。
在特異的實施方案中，本發明的多核苷酸長度少於300，200，100，50，15，10或7.5kb。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸包含所揭示的血管生成蛋白的編碼序列的至少15個連續核苷酸，但不包含特定血管生成蛋白的所有或部分內含子。在另一實施方案中，包含特定血管生成蛋白編碼序列的核酸，不包含基因組側翼基因的編碼序列(即基因組中特定血管生成蛋白基因的5』或3』序列)。
本發明的多肽包括SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示多肽(尤其其成熟形式多肽)，以及與SEQ IDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示多肽有至少70％相似性(優選至少70％相同性)，優選有至少90％相似性(優選至少95％相同性)，更優選有至少95％相似性(優選至少90％相同性)的多肽，並還包括這種多肽的一部分，多肽的這一部分通常含有至少30個胺基酸，更優選含有至少50個胺基酸。
如本領域已知，兩個多肽之間的「相似性」是通過將一個多肽的胺基酸序列及其保守的胺基酸取代與另一多肽的序列相對比取代的。
本發明多肽的片段或一部分可通過肽合成生產相應的全長多肽；因此，可將此片段用作生產全長多肽的中間物。本發明多核苷酸的片段或一部分可用於合成本發明全長多核苷酸。氨基端和羧基端缺失另外，可應用蛋白質基因工程改良或改變天然血管生成蛋白的一或多種彈特性。羧基端胺基酸的缺失可增強蛋白質的活性。一個例子是γ-幹擾素，通過蛋白質的羧基端缺失10個胺基酸，顯示出活性提高將近10倍。(Dobeli等，生物技術學雜誌7199-216(1988))。因此，本發明的一個方面是提供血管生成蛋白的多肽類似物，和編碼類似物的核苷酸序列，這種類似物與天然血管生成蛋白相比穩定性增強(例如，當暴露於典型的pH，熱度條件或其它貯存條件時，穩定性增強)。
本發明還包括N或C末端均缺失胺基酸的缺失突變體。這種突變體包括下述形式的N末端缺失突變體和C末端缺失突變體的所有組合。這些組合可用本領域已知的重組方法成產生。
特別地，血管生成蛋白的N末端缺失可以以下通式闡述1)m2-211，其中m2是1-210之間的任一整數，其中m2相當於SEQ ID NO2中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n2闡述，其中n2是2-211之間的任一整數，n2相當於SEQ IDNO2中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m2-n2殘基，其中n2和m2是如上述的整數。
2)m4-241，其中m4是1-240之間的任一整數，其中m4相當於SEQ ID NO4中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n4闡述，其中n4是2-241之間的任一整數，n4相當於SEQ IDNO4中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m4-n4殘基，其中n4和m4是如上述的整數。
3)m6-149，其中m6是1-148之間的任一整數，其中m6相當於SEQ ID NO6中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n6闡述，其中n6是2-149之間的任一整數，n6相當於SEQID NO6中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m6-n6殘基，其中n6和m6是如上述的整數。
4)m8-170，其中m8是1-169之間的任一整數，其中m8相當於SEQ ID NO8中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n8闡述，其中n8是2-170之間的任一整數，n8相當於SEQ ID NO8中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m8-n8殘基，其中n8和m8是如上述的整數。
5)m10-190，其中m10是1-189之間的任一整數，其中m10相當於SEQ ID NO10中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n10闡述，其中n10是2-190之間的任一整數，n10相當於SEQ ID NO10中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m10-n10殘基，其中n10和m10是如上述的整數。
6)m12-191，其中m12是1-190之間的任一整數，其中m12相當於SEQ ID NO12中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n12闡述，其中n12是2-191之間的任一整數，n12相當於SEQ ID NO12中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m12-n12殘基，其中n12和m12是如上述的整數。
7)m14-214，其中m14是1-213之間的任一整數，其中m14相當於SEQ ID NO14中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n14闡述，其中n14是2-214之間的任一整數，n14相當於SEQ ID NO14中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m14-n14殘基，其中n14和m14是如上述的整數。
8)m16-419，其中m16是1-418之間的任一整數，其中m16相當於SEQ ID NO16中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n16闡述，其中n16是2-419之間的任一整數，n16相當於SEQ ID NO16中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m16-n16殘基，其中n16和m16是如上述的整數。
特別優選的是包含SEQ ID NO16的F32-R226胺基酸殘基的多肽片段，以及編碼這種多肽的多核苷酸。同樣，另一優選的實施方案包含SEQ ID NO16的S228-S419胺基酸。編碼這些多肽的多核苷酸也是優選的。另外，SEQ ID NO16多肽的F32-R226優選與SEQ ID NO16多肽的S228-S419締合。可通過二硫鍵，共價或非共價相互作用，通過接頭連接(如絲氨酸，甘氨酸，脯氨酸連接)，或通過抗體進行締合。
9)m18-207，其中m18是1-206之間的任一整數，其中m18相當於SEQ ID NO18中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n18闡述，其中n18是2-207之間的任一整數，n18相當於SEQ ID NO18中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m18-n18殘基，其中n18和m18是如上述的整數。
10)m20-325，其中m20是1-324之間的任一整數，其中m20相當於SEQ ID NO20中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n20闡述，其中n20是2-325之間的任一整數，n20相當於SEQ ID NO20中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m20-n20殘基，其中n20和m20是如上述的整數。
11)m22-354，其中m22是1-353之間的任一整數，其中m22相當於SEQ ID NO22中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n22闡述，其中n22是2-354之間的任一整數，n22相當於SEQ ID NO22中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m22-n22殘基，其中n22和m22是如上述的整數。
12)m24-132，其中m24是1-131之間的任一整數，其中m24相當於SEQ ID NO24中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n24闡述，其中n24是2-132之間的任一整數，n24相當於SEQ ID NO24中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m24-n24殘基，其中n24和m24是如上述的整數。
本發明另一方面包括N末端和C末端均缺失胺基酸的缺失突變體。這種突變體包括上述N末端突變體和C末端突變體的所有組合。
本發明的另一方面，揭示的血管生成多肽的突變體用作篩選劑，以檢測血管生成活性的激動劑和/或拮抗劑，或者，將其修飾用作揭示的血管生成多肽的血管生成活性的激動劑和/或拮抗劑，或者可與其它製劑聯合應用，如與特異於揭示的血管生成多肽的單克隆抗體聯合應用，例如結果可以是揭示的血管生成多肽的血管生成活性的激動劑和/或拮抗劑。
本發明的另一方面，可產生其它參考的和揭示的本發明血管生成多肽，SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的片段，以產生可用作激動劑和/或拮抗劑的突變體，調節揭示的血管生成多肽的活性。另外，這些多肽突變體可與其它製劑聯合應用，如特異於揭示的血管生成多肽的單克隆抗體聯合應用，例如增強或降低特異的所需活性。
術語「基因」是指涉及多肽鏈產生的DNA片段；它包括在編碼區之前和之後的區域(前導和加尾區)以及各個編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
本發明進一步是指分離的本文所述的核酸分子片段。一個分離的具有如SEQ ID NO1或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示的核苷酸序列的核酸分子片段，應當至少15nt的片段，並且優選的是長度至少約20nt，更為優選的為至少約30nt，再更為優選的為約40nt，它可用作本文所述的診斷探針和引物。當然也可以根據本發明使用更大的、與大多數，如非全部的如SEQ IDNO1或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23所示的核苷酸序列相應的50，75，100，125，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1025，1050，1075，1100，1125，1150，1175，1200，1225，1250，1275，1300，1325，1350，1375，1400，1425，1475，1500，1525，1550，1575，1600，1625，或者1650nt長度的片段。例如，一個長度為至少20nt的片段，是指包括有來自如SEQ ID NO1或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23所示的核苷酸序列的20個或者更多個連續鹼基的片段。
文中的「大約的」包括該特別提到的範圍、在一端或者兩端再大幾個或小几個(5，4，3，2，或1個)核苷酸。優選地，這些片段編碼具有生物學活性的多肽。
本發明全長基因的片段可用作cDNA文庫的雜交探針，以分離全長cDNA及分離其它與此基因具有高度序列相似性或相似生物活性的cDNA。這類探針優選具有至少30個鹼基，並可含有例如50或更多個鹼基。此探針還可用於鑑別相當於全長轉錄物的cDNA克隆和基因組克隆或含有完整基因的克隆，所述完整基因包括調節區，啟動子區，外顯子，和內含子。篩選例如包括通過使用已知DNA序列分離基因的編碼區，以合成寡核苷酸探針。具有互補於本發明基因的序列的標記的寡核苷酸，用於篩選人類cDNA，基因組DNA或mRNA的文庫，以取代探針與文庫的哪個成員雜交。融合蛋白任何揭示的血管生成多肽都可以用於產生融合蛋白。例如，血管生成多肽在與第二個蛋白融合時，可以用作抗原性標籤。針對該血管生成多肽產生的抗體可以通過與血管生成的結合用於對第二個蛋白間接檢測。而且，由於分泌蛋白根據轉運信號來進行細胞定位，所以血管生成多肽一旦與其他蛋白相融合就可以用作為靶向性分子。
可以與血管生成多肽融合的結構域的實例不僅包括異源性信號序列，還包括其他異源性功能區域。融合不一定必須是直接的，也可以通過接頭序列來實現。
而且，融合蛋白也可以通過操作而改進一或多種血管生成多肽的特性。例如，可以將添加的胺基酸區域，尤其是帶電荷的胺基酸，加到血管生成多肽N末端，從而在從宿主細胞中純化或者後續的操作和儲藏過程中提高其穩定性和持續性。另外，可以將肽半族添加到揭示的血管生成多肽上以利於純化。該區域可以在特定的血管生成多肽的最終製備之前去除。添加肽半族以利於多肽的操作是本領域中熟知的常規性技術。
而且，揭示的血管生成多肽，包括片段，和特異表位可以與免疫球蛋白(IgG)的部分恆定區域相結合，形成嵌合多肽。這些融合蛋白有利於純化並在體內顯示出延長了半衰期。一個已報導的實例描述了一種嵌合蛋白，它由人CD4多肽的前兩個區域和哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈上恆定區的不同結構域組成。(EPA 394，827；Traunecker等，自然，33184-86(1988))。含有二硫鍵連接的二聚體結構的融合蛋白(由於IgG)還可在結合和中和其他分子的過程中比單體的分泌蛋白或單獨的蛋白片段更為有效。(Fountoulakis等，生物化學雜誌，2703958-3964(1995)。
類似地，EP-A-0 464 533(Canadian counterpart 2045869)公開了含有免疫球蛋白分子的恆定區的不同部分育齡一個人蛋白或其部分一起所構成的融合蛋白。在多數情況下，融合蛋白的Fc部分對治療和診斷有利，因而可以，例如，改進遺傳藥理學特性。(EP-A 0232 262.)也可能需要對表達、檢測和純化後的融合蛋白去除Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能會阻礙治療和診斷。在藥物開發中，例如，人蛋白如hIL-5，曾與Fc部分融合，為的是進行高效率的掃描試驗以鑑定hIL-5的拮抗劑。(見D.Bennett等，分子識別雜誌，552-58(1995)；K.Johanson等，生物化學雜誌，2709459-9471(1995)。
而且，揭示的血管生成多肽可以與標記序列相融合，如有利於純化特定的血管生成多肽的肽。在優選的實施方案中，標記的胺基酸序列是一個六個組氨酸的肽，如pOE載體(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)上所提供的標籤，等等，其中很多都可以商業購得。正如Gentz等，美國科學院研究進展，56821-824(1989)中所述，例如，六個組氨酸提供了對該融合蛋白的純化提供了方便。另一個用於純化的肽標籤是「HA」標籤，它相應於來自流感紅血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等，細胞，37767(1984)。
因此，可以用揭示的血管生成多核苷酸或多肽操作產生上述的任何融合形式。載體和宿主細胞本發明還涉及含有編碼揭示的血管生成蛋白的多核苷酸的載體、宿主細胞，以及應用重組技術，生產多肽的方法。載體例如可以是噬菌體，質粒，病毒，或逆轉錄病毒載體等。逆轉錄病毒可以是有複製能力的或是複製缺陷的。在後一情況中，病毒增殖通常只發生在補體宿主細胞中。
編碼揭示的血管生成蛋白的多核苷酸可與含有可選擇標記的載體連接，以在宿主中增殖。通常地，將質粒載體導入沉澱物中，如磷酸鈣沉澱，或與荷電脂質複合。如果載體是病毒，可將其在體外用適當的包裝細胞系包裝，然後轉導入宿主細胞中。
編碼揭示的血管生成蛋白的多核苷酸插入體應可操縱地連於適當的啟動子，如噬菌體λPL啟動子，大腸桿菌lac，trp，phoA，和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子，及逆轉錄病毒LTRs的啟動子等。本領域技術人員已知其它適當的啟動子。此表達構建體還含有轉錄起始，終止位點，和轉錄區內的核糖體結合位點以進行翻譯。由此構建體表達的轉錄物的編碼部分，優選包括在密碼子(UAA，UGA或UAG)的起端和末端的翻譯起始密碼子，密碼子(UAA，UGA或UAG)適當的位於翻譯多肽的末端。
如上所述，表達載體優選包括至少一個可選擇標記。這種標記包括用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶(DHFR)，G418或新黴素抗性基因，以及用於大腸桿菌或其他細菌培養的四環素，卡那黴素或氨苄青黴素抗性基因。適當的宿主例如包括但非限於細菌細胞，如大腸桿菌，鏈黴菌，和沙門氏菌typhimurium細胞；真菌細胞如酵母細胞；昆蟲細胞如果蠅S2，和Spodoptera Sf9細胞；動物細胞如CHO，COS，293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。本領域已知上述宿主細胞的適當培養基和培養條件。
在細菌中使用的優選載體包括得自QIAGEN公司的pQE70，pQE60和pQE-9；得自Stratagene克隆系統公司的pBluescript載體，Phagescript載體，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；和得自Pharmacia生物技術公司的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。優選的真核載體包括得自Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；和得自Pharmacia公司的pSVK3，Pbpv，pMSG和pSVL。本領域技術人員也易於知道其它適當載體。
將構建體導入宿主細胞可通過磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，陽離子脂質介導的轉染，電穿孔，轉導，感染或其它方法進行。這種方法在許多標準實驗指導中均有闡述，見例如Davis等，分子生物學基本方法(1986)。特別期望的是揭示的血管生成多肽事實上可由無重組載體的宿主細胞表達。
通過已知方法可從重組細胞培養物中回收及純化揭示的血管生成多肽，包括硫酸銨或乙醇沉澱，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和凝集素層析。優選利用高效液相層析(HPLC)進行純化。
揭示的血管生成多肽，優選分泌形式的多肽，也可回收自純化自天然原料包括體液，組織和細胞的產物，無論是直接分離的還是培養的；化合產物；通過重組技術從原核或真核宿主中產生的產物，所述宿主包括例如細菌，酵母，高等植物，昆蟲，和哺乳動物細胞。根據重組技術中所用的宿主，揭示的血管生成多肽可以是或不是糖基化的。另外，揭示的血管生成多肽還可包括一個初始修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況下，是宿主介導的加工結果。因此，本領域熟知由翻譯起始密碼子編碼的N末端甲硫氨酸，通常在所有真核細胞中翻譯後從任何蛋白質中高效除去。在大多數蛋白質上的N末端甲硫氨酸也在大多數原核細胞中有效除去，對一些蛋白質而言，根據N末端甲硫氨酸共價連接的胺基酸的性質，這種從原核細胞除去甲硫氨酸的方法是無效的。
本發明除了涵蓋含有所述載體構建體的宿主細胞之外，還涵蓋了初級，二級，和無限增殖化的脊椎動物尤其哺乳動物宿主細胞，這種細胞已經工程化為缺失或置換內源性遺傳物質(例如血管生成蛋白編碼序列)，和/或工程化為包括遺傳物質(例如異源性多核苷酸序列)，該遺傳物質可操縱地與編碼本發明血管生成蛋白的多核苷酸締合，以激活，改變和/或擴增編碼血管生成蛋白的內源性多核苷酸。例如，可使用本領域已知的方法通過同源重組，將異源控制區(如啟動子和/或增強子)與編碼血管生成蛋白的內源性多核苷酸序列可操縱的締合(見例如1997年6月24日公布的美國專利No.5641670；1996年9月26日出版的國際出版物WO 96/29411；1994年8月4日出版的國際出版物WO94/12650；Koller等，美國科學院院報868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)，所述文獻以其全文併入參考)。
另外，本發明的多肽可用本領域已知的方法化學合成。(見例如Creighton，1983，蛋白質結構和分子原理，W.H.Freeman Co.，N.Y.和Hunkapiller，M.等，1984，自然310105-111)。例如，相當於本發明血管生成多肽的片段的肽，可使用肽合成儀合成。另外，如果需要，可以把非典型胺基酸或胺基酸的化學類似物作為替代物或附加物，引入編碼血管生成多肽的多核苷酸序列。不典型胺基酸包括，但不僅限於這些普通胺基酸的D型同分異構體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環己丙氨酸，b-丙氨酸，含氟胺基酸，含修飾基團的胺基酸，如b-甲基胺基酸，鈣-甲基胺基酸，鈉-甲基胺基酸，以及通常的胺基酸的類似物。再者，胺基酸既可以為D型(右旋)亦可以為L型(左旋)。
本發明所涉及的血管生成多肽，在翻譯或翻譯後可以進行修飾，如糖基化，醯基化，磷酸化，醯胺化，通過基團的保護或抑制而形成的衍生物，蛋白水解酶的裂解，與抗體分子或其它細胞配體的偶聯，等。許多化學修飾均可通過已知的技術方法來完成，包括以下方法(但不僅限於這些)溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，四氫硼化鈉(NaBH4)所引起的特異化學裂解；乙醯化，甲醯化，氧化，還原；衣黴素存在時所引起的代謝合成增加；等等。
本發明中也涉及到其他翻譯後的修飾，例如包括N-偶聯或O-偶聯的糖鏈，N末端或C末端的加工處理，化學小分子粘附於胺基酸的骨架上，N-或O-連接糖鏈的化學修飾，以及原核生物宿主細胞表達後，添加或去除N末端的甲硫氨酸殘基，均可以看成宿主細胞表達的增加。多肽還可以用檢測標記進行修飾，例如酶，螢光，同位素或親和標記，用於蛋白質的檢測和分離。
本發明還提供了化學修飾的血管生成蛋白的衍生物，它具有其他優點，如多肽的溶解性、穩定性和循環時間均增高，或免疫性降低(見美國專利第4179337號)。衍生的小片段可以從水溶性的多聚體中分離出來，如聚乙二醇，丙二醇/丙三醇共多聚物，羰甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯乙醇及其類似物。多肽可以在分子內任何位點進行隨機修飾，或在分子內預定的位點進行修飾，多肽分子可包括一個、兩個、三個或多個粘附的化學小分子。
多聚體可以有任何大小的分子量，並且可以有側鏈，也可以沒有側鏈。對聚乙二醇而言，優選的分子量在約1kD到100kD之間(「大約」一詞表明不同的聚乙二醇的製備，有些分子比所說的分子量重些，有些則輕些)，並較易處理和製備。也可使用其他大小的分子，要根據治療方案而定(如要求持續釋放的時程，效應，如果有的話，取決於生物學活性，易於操作，抗原性的大小或缺失，以及其他已知的聚乙二醇對某種治療性蛋白或蛋白類似物的效應)。
聚乙二醇分子(或其他化學小分子)應當與蛋白質結合，應當考慮到對蛋白質的功能或抗原性結構域的影響。對本領域熟練的技術人員而言，有許多結合方法，如EP0401384，並附有參考文獻(PEG與G-CSF偶聯)，還可以參見Malik等，實驗血液學，1992，201028-1035(用tresyl chloride報告GM-CSF的pegylation)。例如，聚乙二醇可以與胺基酸殘基上的反應基團共價結合，例如游離的氨基或羰基。反應基團是那些活化的聚乙二醇可與之結合的分子。帶有游離的氨基的胺基酸殘基，包括賴氨酸殘基和N末端胺基酸殘基；帶有游離羰基的胺基酸包括天冬氨酸殘基，穀氨酸殘基和C-末端胺基酸殘基。磺酸基團還可以作為粘附聚乙二醇分子的反應基團。聚乙二醇治療用時優選的分子是連接在氨基，如粘附在N末端或賴氨酸基團上。
人們特別希望在蛋白質N末端進行化學修飾。聚乙二醇作為現有組份的實例，你可以從各種不同的聚乙二醇分子中進行挑選(根據分子量，側鏈，等)，混合物中，聚乙二醇與蛋白質(或多肽)分子的比例，所進行的pegylation反應類型，以及獲得選擇的N端pegylated蛋白質分子的方法。獲得N端pegylated標本的方法(即必要時，就將這種分子與其他monopegylated分子分離開)為通過把N末端pegylated成分從大量的pegylated分子中純化出來。選擇那些在N端發生化學修飾的蛋白質是通過還原烷基化實現的，還原烷基化為檢測不同原始氨基基團的類型(賴氨酸比N末端)的分化的反應性，這些基團為某種特異蛋白質的衍化物。在適當的反應條件下，可以有選擇性的獲得蛋白質的衍生物，這類蛋白質為N末端攜帶羰基，並含有多聚體。
本發明的血管生成多肽可以是單體或多聚體(即二聚體，三聚體，四聚體和更大的多聚體)。因此，本發明與本發明中VEGF-2多肽的單體和多聚體，它們的分離製備，以及它們的組成(尤其是指藥理成分)有關。在特殊的實例中，本發明的多肽為多基因，二聚體，三聚體或四聚體。在另外的實例中，本發明的多聚體至少是二聚體，三聚體或四聚體。
本發明所涉及的多聚體可以是同聚體或異聚體。本文這裡所使用的「同聚體」術語，是指僅含有本發明的血管生成多肽(包括本文這裡所述的VEGF-2片段，變異體，不同的剪接產物和融合蛋白)。這些同聚體為含有相同或不同的胺基酸序列的血管生成多肽。在一個特殊的實例中，本發明的一個同聚體為一個僅含有血管生成多肽的多聚體，後者含有相同的胺基酸序列。在另一個特殊的實例中，本發明的一個同聚體為一個含有VEGF-2多肽的多聚體，而後者含有不同的胺基酸序列。在特殊的實例中，本發明的多聚體為一同源二聚體(例如，含有相同或不同的胺基酸序列的血管生成多肽)或一同源三聚體(如，含有相同和/或不同的胺基酸序列的血管生成多肽)。在另外的實例中，本發明的同聚物性多聚體至少應是一個同源二聚體，同源三聚體或同源四聚體。
「異聚體」這一術語，在本文是指一個除含有本發明的血管生成多肽外，還含有一個或多個異源性多肽的多聚體(即不同的蛋白多肽)。在一個特殊的實例中，本發明的多聚體為異源二聚體，異源三聚體，或異源四聚體。在另外的實例中，本發明的同源多聚體至少為一個同源二聚體，同源三聚體，或同源四聚體。
本發明的多聚體是由親水，疏水，離子和/或共價連接和/或間接連接，例如通過脂質體的形成。因此，在一個實施例中，本發明的多聚體，如，同源多聚體或異源多聚體在本發明的多肽在溶液中與另一個分子接觸時，就可以形成多聚體。在另一個實施例中，本發明的異源多聚體，例如，在溶液中，本發明的多肽與此肽的抗體接觸(包括針對本發明的融合蛋白中的異源多肽序列的抗體)就可以形成異源三聚體或四聚體。在另外一些實施例中，本發明的多聚體可以通過與和/或本發明的VEGF-2多肽之間的共價連接形成。這些共價連接包括一個或多個存在於該多肽內的胺基酸殘基(如，引自SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的多肽中)。在某種情況下，共價連接為位於多肽序列內的半胱氨酸殘基之間的交聯，它們在天然狀態下就發生作用(即自然發生)。而在另一種情況下，共價連接為化學或重組操作的結果。另外，這些共價連接含有一個或多個存在於血管生成融合蛋白的異源多肽序列中的胺基酸殘基。在一個實施例中，共價連接是位於本發明中的一個融合蛋白的異源序列之間(見，如美國專利號為5478925)。在一個特殊實施例中，共價連接為位於本發明中的一個血管生成多肽-Fc融合蛋白的異源序列之間(見本文所述)。在另一個實施例中，本發明融合蛋白的共價連接存在於另一個TNF家族的配體/受體家族成員的異源序列多肽之間，該序列能夠形成共價連接的多聚體，例如osteroprotegetin(見，例如，國際出版，世界專利第98/49305，這裡的所有內容均附有參考文獻)。
本發明的多聚體應用本領域所熟知的化學技術方法可以合成。例如，存在於本發明多聚體中的多肽，應用本領域中所熟知的連接子分子和連接子分子長度最佳技術，進行化學交聯(見，如美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。再者，本發明的多肽應用在多肽的C末端或N末端增加半胱氨酸或生物素方法，可進行常規修飾，本領域的這些技術可用於合成含有一個或多個此類修飾的多肽的多聚體(見，例如美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。另外，這些本領域所熟知的技術可用於合成含有多肽的脂質體，而多肽存在於本發明的多聚體中(見，例如，美國專利號5478925，本文附有全部的參考文獻)。
另一方面，本發明的多聚體可以應用本領域所熟知的遺傳工程技術進行合成。在一個實施例中，存在於本發明的多聚體中的多肽，使用本文所述的融合蛋白技術可以進行重組合成(美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。在一個特殊的實施例中，編碼本發明的同源二聚體的多核苷酸序列可通過以下技術進行合成，即將一個編碼本發明的多肽的多核苷酸連接到一個編碼連接子多肽的序列上，然後再連接到一個人工合成的可以翻譯成多肽產物的序列中，而該多肽為反向排列的，即從C末端到N末端(無前導序列)(見，例如，美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。在另一個實施例中，本文所述的重組技術或其他本領域中所熟知的技術可用於合成本發明的含有一個跨膜結構域的重組多肽(或疏水或前導肽)，並且通過膜的重組技術可以整合脂質體中(見，例如，美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。血管生成多肽的生物學活性血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以用於檢測一種或多種生物學活性的試驗。如果在某個試驗中血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑表現出活性，血管生成多核苷酸或多肽就可能與該生物學活性相關的疾病有關聯。因此，血管生成多肽可以用來治療相關疾病。以下所述的生物活性包括於血管生成蛋白「所需活性」中。免疫活性血管生成多肽或多核苷酸，或其激動劑或拮抗劑，通過激活或抑制免疫細胞的增殖、分化或激動(趨藥性)，可以用於治療免疫系統的缺陷或紊亂。免疫細胞通過造血作用發育，由多能幹細胞產生脊髓細胞(血小板、紅細胞、嗜中性粒細胞、和巨噬細胞)和淋巴細胞(B和T淋巴細胞)。這些免疫缺陷或疾病的發病原因可能是遺傳性的、體細胞的，如癌症或自身免疫性疾病，獲得性(如化療或毒素引起的)，或感染性的。再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以作為某種特異的免疫系統疾病或紊亂的一種標記或檢測物。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測造血細胞的缺陷或功能異常。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於提高造血細胞的分化和增殖，包括多能幹細胞，試圖用於治療那些與某種(或多種)類型造血細胞有關的疾病。免疫缺陷症候群的實例包括，但不僅限於這些血紅蛋白病(如丙種球蛋白缺乏症，丙種球蛋白異常症)，共濟失調性毛細血管擴張症，常見的變異性免疫缺陷症，Digeorge症候群，HIV(人免疫缺陷病毒)感染，HTLV-BLV(人T淋巴細胞-B淋巴細胞)感染，白細胞粘附缺陷症候群，淋巴細胞減少症，吞噬細胞殺傷功能異常，重症聯合免疫缺陷症(SCIDs)，Wiskott-Adrich病，貧血，血小板減少症，或血紅蛋白尿。
再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於調節止血(中止出血)或血栓活性(血栓形成)。例如，通過提高止血或血栓活性，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以用於治療血液凝固性疾病(如纖維蛋白原缺乏症，凝血因子缺陷)，血小板異常(如血小板減少症)，或由外傷，手術或其他原因造成的創傷。另一方面，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可降低止血或血栓活性，可用於抑制或溶解血栓，這在治療心臟病發作(心肌梗塞)，中風或疤痕形成時，非常重要。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於治療或檢測自身免疫性疾病。許多自身免疫性疾病起源於免疫細胞將自身的組織作為外源性的異物進行的異常識別。這種異常識別導致宿主組織破壞的免疫應答。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以抑制免疫應答，尤其抑制T細胞的增殖、分化或趨化，所以血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑在預防自身免疫性疾病時，可能是一種有效的治療措施。
可以治療或診斷的自身免疫性疾病的實例包括，但不僅限於這些艾迪森氏病，溶血性貧血，抗磷脂症候群，類風溼性關節炎，皮炎，過敏性腦脊髓炎，腎小球腎炎，Goodpasture症候群，Graves病，多發性硬化，重症肌無力，神經炎，眼炎，大天皰樣瘡，天皰瘡，多內分泌腺病，紫癜，Reiter病，Stiff-Man症候群，自身免疫性甲狀腺炎，系統性紅斑狼瘡，自身免疫性肺部炎症，格林-巴裡(Guillain-Barre)症候群，胰島素依賴的糖尿病和自身免疫性炎性眼病。
同樣地，過敏反應和疾病，例如哮喘(尤其是過敏性哮喘)或其他呼吸系統疾病，也可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療。再者，這些分子還可用於治療過敏反應，抗原分子或血型不符所引起的超敏反應。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑還可用於治療和/或預防器官排斥或移植物抗宿主反應(GVHD)。器官排斥反應是宿主的免疫細胞通過免疫應答破壞移植組織的反應。同樣地，GVHD還會發生另一種免疫應答，而此時卻是外源移植物的免疫細胞破壞宿主組織。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以抑制免疫應答，尤其可以抑制T細胞的增殖、分化或趨化，因此可以作為預防器官排斥或GVHD的一種有效的治療手段。
同樣，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑還可用於調節炎症反應。例如，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以抑制參與炎症反應的細胞的增殖與分化。這些分子可用於治療急性和慢性炎性疾病，包括與炎症相關的感染(如感染性敗血症性休克，膿毒症，或全身炎性反應症候群(SIRS)，缺血-再灌注性損傷，內毒素性損害，關節炎，補體介導的超急排斥反應，腎炎，細胞因子或趨化因子引起的肺損傷，炎性腸病，克隆(Crohn)病，或細胞因子生成過多引起的疾病(如TNF或IL-1)。過度增殖性疾病血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測過度增殖性疾病，包括腫瘤。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，通過直接或間接作用，可以抑制此類疾病的增殖。另一方面，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以使其他細胞增殖，而這些細胞可以抑制過度增殖性疾病。
例如，通過提高免疫應答，尤其是提高過度增殖性疾病的抗原質量或通過使T細胞的增殖，分化或動員，用於過度增殖性疾病的治療。通過提高現有的免疫應答，或啟動新的免疫應答，均可提高這種免疫應答。另一種情況，降低免疫應答還可作為治療過度增殖性疾病的一種方法，如化療藥物。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測過度增殖性疾病的實例包括，但不僅限於以下部位的腫瘤腹部，骨骼，乳腺，消化道，肝臟，胰腺，腹膜，內分泌腺(腎上腺，甲狀旁腺，垂體，睪丸，卵巢，胸腺，甲狀腺)，眼睛，頭頸部，神經(中樞和周圍神經)，淋巴系統，盆腔，皮膚，軟組織，脾臟，胸部和泌尿生殖器。
同樣地，其他過度增殖性疾病還可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑治療或檢測。這些過度增殖性疾病的實例包括，但不僅限於以下這些情況高丙種球蛋白血症，淋巴增殖性疾病，異型蛋白血症，紫癜，結節病，Sezary症候群，Waldenstron巨球蛋白血症，Gaucher(高雪)氏病，組織細胞增多症，以及其他所有過度增殖性疾病，還包括位於上述所列舉的各器官、系統的腫瘤。心血管疾病血管生成多肽或多核苷酸，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療心血管疾病，包括周圍動脈血管疾病，例如四肢缺血。
心血管疾病包括心血管的異常，例如動脈—動脈瘻，動靜脈瘻，腦動靜脈畸形，先天性心臟病，肺動脈閉鎖和Scimitar症候群。先天性心臟病包括主動脈狹窄，cortriatriatum，冠狀血管異常，十字心臟(crisscross heart)，右位心，動脈導管閉鎖不全，Ebstein(愛波斯坦)異常，Eisenmenger(埃森曼格)綜合症，發育不全性的左心症候群，左位心，法樂氏四聯症，大血管轉位，雙流出道的右心室，三尖瓣閉鎖，持續性腹主動脈關閉不全和心臟間隔缺損，例如主動脈—肺動脈間隔缺損，心內膜墊缺損，Lutembacher症候群，法樂氏三聯症，心室間隔缺損。
心血管疾病還包括心臟病，例如心律失常，瘤樣心臟病，高心輸出量，低心輸出量，心包填塞，心內膜炎(包括細菌性)，心血管瘤，心臟停搏，充血性心力衰竭，充血性心肌病，陣發性呼吸困難，心源性水腫，心肌肥大，左心室肥大，右心室肥大，梗塞後心臟破裂，室間隔破裂，心瓣膜病，心肌病變，心肌缺血，心包積液，心包炎(包括縮窄性和結核性)，心包積氣，心包切除後症候群，肺心病，風溼性心臟病，心室功能失常，充血，妊娠期心血管併發症，Scimitar症候群，梅毒性心臟病和結核性心臟病。
心律失常包括竇性心律失常，房顫(心房顫動)，房撲(心房撲動)，心動過緩，期前收縮，阿—斯(Adams-Strokes)症候群，束枝阻滯，竇房阻滯，長QT症候群，收縮，Lown-Ganong-Levine症候群，Mahaim型的預激症候群，Wolff-Parkinson-White症候群，病竇症候群，心動過速和室顫(心室顫動)。心動過速包括陣發性心動過速，室上性心動過速，進行性心室自發節律，房室結折返性心動過速，異位交界性心動過速，竇房結折返性心動過速，竇性心動過速，Torsades de Poiners，和室性心動過速。
心瓣膜疾病包括主動脈瓣關閉不全，主動脈瓣狹窄，心臟雜音，主動脈瓣脫垂，二尖瓣脫垂，三尖瓣脫垂，二尖瓣關閉不全，二尖瓣狹窄，肺動脈閉鎖，肺動脈瓣關閉不全，肺動脈瓣狹窄，三尖瓣閉鎖，三尖瓣關閉不全和三尖瓣狹窄。
心肌病變包括酒精性心肌病，擴張型心肌病，肥厚型心肌病，主動脈瓣膜下狹窄，肺動脈瓣膜下狹窄，限制型心肌病，Chagas心肌病，心內膜下纖維組織增生，心內膜纖維化，Kearns症候群，心肌再灌注損傷，心肌炎。
心肌缺血包括冠心病，例如心絞痛，冠狀動脈瘤，冠狀動脈粥樣硬化，冠狀血栓，冠狀動脈痙攣，心肌梗塞和心臟驟停。
心血管疾病還包括血管疾病，如動脈瘤，多發性血管瘤，杆狀多發性血管瘤，Hippel-Lindau病，Klippel-Trenaunay-Weber症候群，Sturge-Weber症候群，血管神經瘤性水腫，Takayasu動脈炎，主動脈炎，Leriche症候群，動脈閉塞性疾病，動脈炎，杵臼動脈炎，結節性多發性動脈炎，腦血管疾病，糖尿病性血管病，糖尿病性視網膜病，栓塞，血栓，紅斑性肢痛症，痔瘡，肝靜脈阻塞性疾病，高血壓，低血壓，缺血，外周血管疾病，靜脈炎，肺靜脈阻塞性疾病，雷諾(Raunaud)氏病，CREST症候群，視網膜靜脈阻塞，Scimitar症候群，上腔靜脈症候群，毛細血管擴張症，共濟失調性毛細血管擴張症，遺傳性出血性毛細血管擴張症，精索靜脈曲張，靜脈曲張，靜脈曲張潰瘍，脈管炎和靜脈功能不全。
動脈瘤包括分割性動脈瘤，假性動脈瘤，感染性動脈瘤，破裂性動脈瘤，主動脈瘤，腦動脈瘤，冠狀動脈瘤，心臟室壁瘤和髂動脈瘤。
動脈阻塞性疾病包括動脈粥樣硬化，間歇性跛行，頸動脈狹窄，纖維肌肉發育不全，間質血管阻塞，Moyamoya病，腎動脈阻塞，視網膜動脈阻塞，血栓閉塞性脈管炎。
腦血管疾病包括頸動脈疾病，腦血管澱粉樣病，腦動脈瘤，腦缺氧，腦動脈粥樣硬化，腦動靜脈畸形，腦動脈疾病，腦栓塞和血栓，頸動脈血栓，竇血栓，Wallenberg症候群，腦出血，腦梗塞，腦缺血(包括短暫性的腦缺血)，鎖骨下動脈改道症候群，腦室leukomalacia，血管性頭疼，叢集性頭疼，偏頭疼和椎基底動脈供血不足。
栓塞包括氣拴，羊水栓塞，膽固醇栓塞，肺栓塞和血栓栓塞。血栓包括冠狀血管血栓，肝靜脈血栓，視網膜靜脈阻塞，頸動脈血栓，竇性血栓，Walenberg症候群和血栓性靜脈炎。
缺血包括腦缺血，缺血性結腸炎，腦室症候群，前腦室症候群，心肌梗塞，灌注性損傷和周圍四肢缺血。血管炎包括主動脈炎，動脈炎，Behcet症候群，Churg-Strauss症候群，黏膜淋巴結症候群，血栓閉塞性脈管炎，高反應性血管炎，Schoenlein-Henoch紫癜，過敏性皮膚血管炎和Wegener肉芽腫。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑對治療危急的肢體缺血和冠心病特別有效。如實施例中所述，將血管生成多核苷酸和多肽施用於實驗誘導的缺血兔的後肢，可恢復血壓，血流，血管造影分值和毛細血管密度。
血管生成多肽可用本領域已知的方法施用，包括但非限於在輸送位點直接針注，靜脈內注射，局部施用，導管灌注，biolistic注射器，顆粒加速器，海綿，其它商購的海綿，滲透泵，口服或栓劑固體藥物配方，在手術期間倒入或局部應用，氣霧劑應用。本領域已知這種方法。血管生成多肽可作為藥物組合物的一部分施用，如以下詳細闡述。以下詳細闡述了輸送血管生成多核苷酸的方法。抗血管生成活性在內源性血管生成刺激劑和抑制劑之間天然發生的平衡，是其中抑制性影響佔優勢。Rastinejad等，細胞56345-355(1989)。在新血管形成是在正常生理條件下發生的那些罕見的情況中，如傷口癒合，器官再生，胚胎發育，和女性生殖過程，血管生成是嚴格控制的，並在空間和時間上確定界限的。在病理性血管生成的條件下，如固體腫瘤生長階段，這些調節性控制無效。未調節的血管生成成為病理性的，並成為許多腫瘤和非腫瘤疾病進展的支柱。許多嚴重疾病是由異常新血管發生引起的，包括固體腫瘤生長和轉移，關節炎，一些眼部疾病和銀屑病。見例如Moses等，生物技術9630-634(1991)；Folkman等，N.Engl.J.Med.3331757-1763(1995)；Auerbach等，微血管研究雜誌29401-411(1985)；Folkman，癌症研究進展，Klein和Weinhouse編輯，科學出版社，紐約，pp175-203(1985)；Patz，Am.J.Opthalmol 94715-743(1982)；和Folkman等，科學221719-725(1983)。在許多病理狀態下，血管生成的過程決定疾病的狀態。例如，已積累的有意義的數據推斷，固體腫瘤的生長依賴於血管生成。Folkman和Klagsbrun，科學235442-447(1987)。
本發明提供了治療與新血管發生相關的疾病或功能失調的方法，是通過施用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療的。可用本發明的多核苷酸和多肽，或其激動劑或拮抗劑治療的惡性和轉移腫瘤包括但非限於惡性腫瘤，固體腫瘤，和本文及本領域已知的其它癌症(參見Fishman等，醫學，第二版，J.B.LippincottCo.，Philadelphia(1985))。
可用本發明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激動劑或拮抗劑治療的，與新血管發生相關的眼功能失調包括但非限於新生血管性青光眼，糖尿病視網膜病變，眼癌，眼晶狀體纖維增生，眼色素層炎，超前黃斑變性的視網膜病變，角膜移植物新血管發生，以及其它眼部炎症疾病，眼部腫瘤和與脈絡膜或虹膜新血管發生相關的疾病。見例如Waltman等，Am.J.Ophthal.85704-710(1978)和Gartner等，Surv.Ophthal.22291-312(1978)。
另外，可用本發明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激動劑或拮抗劑治療的功能失調包括但非限於血管瘤，關節炎，銀屑病，血管纖維瘤，動脈硬化，傷口癒合延遲，粒細胞性血友病關節炎，過度生長的瘢痕，骨不連骨折，Osler-Weber症候群，化膿性肉芽瘤，硬皮病，沙眼，和血管粘連。
再者，可用本發明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激動劑或拮抗劑治療的功能失調和/或病理狀態，包括但非限於固體腫瘤，血生腫瘤如白血病，腫瘤轉移，Kaposi’s肉瘤，良性腫瘤，例如血管瘤，聽神經瘤，神經纖維瘤，沙眼，和化膿性肉芽瘤，類風溼性關節炎，銀屑病，眼部血管生成疾病例如糖尿病視網膜病變，超前黃斑變性的視網膜病變，角膜移植物排斥反應，新生血管性青光眼，眼晶狀體纖維增生，虹膜炎，眼癌和眼色素層炎，傷口癒合延遲，子宮內膜異位，血管發生，granulations，過度生長的瘢痕(瘢痕瘤)，骨不連骨折，硬皮病，沙眼，血管粘連，心肌血管生成，冠狀動脈側支形成，腦動脈側支形成，動靜脈畸形，局部缺血肢體血管生成，Olser-Webber症候群，新血管生成斑，毛細血管擴張，血友病關節炎，血管纖維瘤，纖維肌性發育不良，傷口凸凹不平，Crohn’s病，動脈硬化，通過阻止胚胎植入所需的血管生成控制月經的出生控制劑，血管生成導致病理結果如貓抓病(Rochele minalia quintosa)，巴爾通氏體病和杆狀血管瘤。在細胞水平的疾病可用本發明的血管生成多核苷酸和多肽，或其激動劑或拮抗劑治療的，與細胞存活性提高或細胞程序死亡抑制相關的疾病，包括癌症(如濾泡淋巴瘤，具有p53突變的癌症，和激素依賴型腫瘤，包括但非限於結腸癌，心臟腫瘤，胰腺癌，黑素瘤，眼癌，惡性膠質瘤，肺癌，小腸癌，睪丸癌，胃癌，成神經細胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，內皮瘤，成骨細胞瘤，破骨細胞瘤，骨肉瘤，軟骨肉瘤，腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫功能失調(如多發性硬化，Sjogren’s症候群，Hashimoto’s甲狀腺炎，膽道硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多發性肌炎，系統性紅斑狼瘡和免疫相關的腎小球腎炎和類風溼性關節炎)，和病毒感染(如皰疹病毒，牛痘病毒和腺病毒)，炎症，移植物抗宿主病，急性移植物排斥反應，和慢性移植物排斥反應。在一優選的實施方案中，本發明的血管生成多核苷酸，多肽和/或拮抗劑用於抑制癌症的生長，進展和/或轉移，尤其上述那些癌症。
可用本發明的血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑治療或檢測的，與細胞存活性提高相關的疾病或功能失調，包括但非限於惡性腫瘤的進展和/或轉移，及相關的功能失調如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細胞白血病，急性粒細胞白血病(包括原粒細胞，promyelocytic，myelomonocytic，monocytic，和紅細胞白血病))，和慢性白血病(例如慢性中幼粒細胞(粒細胞性)白血病，和慢性淋巴細胞白血病))，紅細胞增多症，淋巴瘤(例如Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)，多發性肌瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，重鏈病，和固體腫瘤包括但非限於肉瘤和癌，如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤，軟骨瘤，血管肉瘤，內皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴內皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，Ewing’s腫瘤，平滑肌肉瘤，骨骼肌肉瘤，結腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺癌，脂肪腺癌，乳頭樣癌，乳頭樣腺癌，囊腺癌，骨髓癌，支氣管癌，腎細胞癌，肝細胞瘤，膽管癌，絨毛膜癌，精原細胞瘤，胚胎樣癌，Wilm’s腫瘤，宮頸癌，睪丸癌，肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，膠質瘤，星細胞瘤，成神經管細胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細胞瘤，聽神經瘤，少枝膠質瘤，menangioma，黑素瘤，成神經細胞瘤，和眼癌。
可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑治療或檢測的，與細胞程序死亡增加相關的疾病，包括AIDS；神經變性疾病(如Alzheimer’s病，Parkinson’s病，Amyotrophic晚期硬化，視網膜色素細胞瘤，小腦變性，和腦腫瘤或相關疾病)；自身免疫功能失調(如多發性硬化，Sjogren’s症候群，Hashimoto’s甲狀腺炎，膽管硬化，Behcet’s病，Crohn’s病，多發性肌炎，系統性紅斑狼瘡和免疫相關的腎小球腎炎，和類風溼性關節炎)，myelodysplastic症候群(如aplastic貧血)，移植物抗宿主病，缺血性損傷(如由心肌梗塞，休克和再灌注損傷所致)，肝損傷(例如肝損傷相關的肝炎，缺血性/再灌注損傷，cholestosis(膽管損傷)，和肝癌)；毒素誘導的肝臟疾病(如由乙醇所致)，敗血病休克，惡病質，和厭食。傷口癒合和上皮細胞增殖本發明的另一方面提供了一種利用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療的方法，例如，刺激上皮細胞和基底角質形成細胞增殖，以促進傷口癒合，及刺激毛囊產生和皮膚傷口癒合。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可臨床用於刺激傷口癒合包括手術傷口，切口，深度傷口包括損傷真皮和表皮的傷口，眼組織傷口，牙周組織傷口，口腔傷口，糖尿病潰瘍，皮膚潰瘍，前臂潰瘍，動脈潰瘍，靜脈曲張潰瘍，燙傷或化學物質燒傷，及其它異常傷口癒合狀態，如尿毒症，營養不良，維生素缺乏，和與全身施用類固醇，放療和抗腫瘤藥和抗代謝物進行治療相關的併發症。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於在皮膚損傷後促進皮膚再生。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可用於提高皮膚移植物與傷口床的粘著，並刺激傷口床的再上皮化。以下是可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，提高與傷口床粘著的移植物類型自身移植物，人造移植物，同種異體移植物，自皮移植物，自上皮移植物，avacular移植物，Blair-Brown移植物，骨移植物，胚胎期形成的移植物，真皮移植物，延遲的移植物，皮膚移植物，上皮移植物，帶狀移植物，全層移植物，異源移植物，異種移植物，同源移植物，增生性移植物，片層移植物，網眼移植物，黏膜移植物，Ollier-Thiersch移植物，omenpal移植物，片狀移植物，帶蒂移植物，penetrating移植物，分離皮膚移植物，全層分離移植物。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於促進皮膚強度，並改進年老皮膚的外觀。
確信血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，對肝細胞增殖，和肺，乳房，胰腺，胃，小腸和大腸中上皮細胞增殖也產生改變。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可促進上皮細胞增殖如sebocytes，毛囊，肝細胞，II型肺泡細胞，產生粘液素的杯狀細胞，和其它上皮細胞及其包含於皮膚，肺，肝和胃腸道中的祖細胞。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可促進內皮細胞，角質形成細胞和基底角質形成細胞增殖。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於降低由放療，化療或病毒感染所產生的內臟毒素的副作用。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，對小腸黏膜還具有細胞防護性作用。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可刺激由化療和病毒感染所產生的黏膜炎(口腔潰瘍)的傷口癒合。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於在全層或部分皮膚缺損的情況中完全再生皮膚，包括燒傷(即毛囊，汗腺和皮脂腺的再生)，治療其它皮膚缺損如銀屑病。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療大皰性表皮鬆解症，這是一種表皮與下層真皮粘著缺失，產生多發的開放的疼痛的水皰，這是通過促進這些損害的再上皮化進行治療的。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於治療胃和十二指腸潰瘍，並有助於其癒合，這是通過黏膜下層瘢痕形成及腺黏膜和十二指腸黏膜下層更迅速再生進行的。腸道炎症如Crohn’s病和潰瘍性結腸炎，分別是由小腸和大腸的黏膜表面破壞所致的疾病。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於促進黏膜表面再生，以助於更迅速癒合並阻止腸道炎症進展。用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療，期望對胃腸道粘液產生有明顯作用，並可用於保護小腸黏膜免於咽下的或手術後有害物質損傷。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療與血管生成多肽低表達相關的疾病。
另外，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於預防和癒合由各種病理狀態所致的肺部損傷。生長因子如血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，其可刺激肺泡和支氣管上皮增殖和分化並促進其修復，以預防或治療急性或慢性肺部疾患。例如，肺氣腫，是由肺泡漸進性喪失和吸入性傷害所致的疾病，即由吸菸和灼傷所致的，導致支氣管上皮和肺泡壞死，這種疾病可由血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療。同樣，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於刺激II型肺泡細胞增殖和分化，這可有助於治療或預防如透明膜病，如新生兒呼吸窘迫症候群，和早產兒支氣管肺不張。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可刺激肝細胞增殖和分化，因此可用於減輕或治療肝臟疾病和病變，如由爆發性肝硬化，由肝炎病毒和毒性物質(即對乙醯氨基酚，四氯化碳和其它本領域已知肝毒性物質)所致的肝臟損傷。
另外，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或預防糖尿病併發症發生。在新診斷的仍保留一些胰島細胞功能的I型和II型糖尿病患者中，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於保持胰島功能以減輕，延遲或預防此疾病的持久表現。同樣，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用作胰島細胞移植中的輔助劑，以改進或促進胰島細胞功能。感染性疾病血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測傳染病原體。例如，通過提高免疫應答，尤其是提高B和/或T細胞的增殖和分化，治療感染性疾病。通過提高現有的免疫應答，或啟動新的免疫應答，均可提高這種免疫應答。另外，VEGF-2的多核苷酸或多肽還可直接抑制感染性病原體，而不產生免疫應答。
病毒是一種可以引起疾病或症狀的感染性病原體，此類疾病可以用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療或檢測。例如包括但非限於以下DNA或RNA病毒家族蟲媒病毒科，腺病毒科，動脈病毒，雙節RNA病毒科，布尼亞病毒科，杯狀病毒科，Circoviridae，冠狀病毒科，黃病毒科，DNA肝病毒科(肝炎病毒)，皰疹病毒科(例如，巨細胞病毒，單純皰疹病毒，帶狀皰疹病毒)，Mononegavirus(如，副粘病毒科，麻疹病毒，彈狀病毒科)，正粘病毒科(如流感病毒)，乳多空病毒科，細小病毒科，小RNA病毒科，痘病毒科(如水痘或牛痘病毒)，呼腸孤病毒科(如輪狀病毒)逆轉錄病毒科(HTLV-I，HTLV-II，慢病毒)和外衣病毒科(如風疹病毒)。上述不同種類的病毒可以引起各種各樣的疾病或症狀，包括，不僅限於這些關節炎，細支氣管炎，腦炎，眼部感染(如結膜炎，角膜炎)，慢性疲勞症候群，肝炎(甲、乙、丙、戊、慢性活動性肝炎、非甲非B型肝炎)，腦膜炎，機會感染(如愛滋病)，肺炎，Burkitt淋巴瘤，水痘，出血熱，麻疹，腮腺炎，副流感，狂犬病，普通感冒，脊髓灰質炎，白血病，風疹，性傳播疾病，皮膚病(如卡波氏瘤，疣)，病毒血症。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測所有疾病和症狀。
同樣，細菌或真菌也可以引起疾病或症狀，並能用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑治療或檢測，包括但非限於以下革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌和真菌，放線菌(如棒狀桿菌，分枝桿菌，奴卡氏菌)，麴黴菌，芽孢桿菌(如炭疽桿菌，梭狀芽孢桿菌)，多形杆狀菌，芽生菌，博代桿菌，疏螺旋體菌，布魯桿菌，念珠菌，彎曲桿菌，球孢子菌，隱球菌，Dermatocycoses，腸桿菌(如克雷伯桿菌，沙門氏菌，沙雷氏菌，耶爾森氏菌)，丹毒絲菌，螺桿菌，軍團菌，鉤端螺旋體，李斯特菌，支原體，奈瑟氏菌(如不動桿菌，淋球菌，腦膜炎球菌)，巴斯德菌感染(如放線桿菌，嗜血桿菌，巴斯德菌)，假單胞菌，立克次氏體，衣原體，梅毒和葡萄球菌。這些桿菌或真菌可引起以下疾病和症狀，包括但不僅限於這些菌血症，心內膜炎，眼部感染(結膜炎，結核，葡萄膜炎)，牙齦炎，機會感染(如愛滋病相關的感染)，甲溝炎，修復術有關的感染，Reiter病，呼吸道感染，如百日咳或膿胸，敗血症，萊姆病，貓抓病，痢疾，副傷寒，食物中毒，傷寒，肺炎，淋病，腦脊膜鹽炎，衣原體病，梅毒，白喉，麻風病，類結核，結核，狼瘡，肉毒素中毒，壞疽，破傷風，膿皰病，風溼熱，猩紅熱，性傳播疾病，皮膚病(如蜂窩組織炎，Dermatocycoses)，毒血症，尿路感染，傷口感染。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以治療或檢測上述任何疾病和症狀。
再者，寄生蟲引起的疾病和症狀也可以用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑治療或診斷，包括但非限於以下疾病，阿米巴病，巴貝蟲病，球蟲病，Cryptosporidiosis，雙核阿米巴病，Dourine，體外寄生蟲病，賈第鞭毛蟲病，蠕蟲病，利什曼原蟲病，Theileriasis，弓形體病，錐蟲病和毛滴蟲病。這些寄生蟲可以引起多種疾病和症狀，包括但不僅限於這些，疥瘡，Trombiculiasis，眼部感染，腸病(如痢疾，賈第鞭毛蟲病)，肝病，肺病，機會性感染(如愛滋病相關的)，瘧疾，妊娠期併發症，弓形體病。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測這些症狀和疾病。
優選的方法，用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療，既可通過給患者使用有效劑量的血管生成多肽，也可通過先從患者體內取出細胞，將血管生成多核苷酸裝入此種細胞，再將這些「工程」細胞輸回患者體內(間接體內治療)。再者，血管生成多核苷酸或多肽可以作為疫苗的一種抗原，提高機體抗感染性疾病的免疫應答。再生血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於誘導細胞的分化、增殖，以及吸引細胞，促進組織的再生(見科學，1997，27659-87)。組織再生可用於修復、取代或保護由以下原因造成的組織損傷先天性缺陷，創傷(傷口，燒傷，切口或潰瘍)，衰老，疾病(如骨質疏鬆症，骨關節炎，牙周疾病，肝功衰竭)，手術，包括美容整形術，纖維化，再灌注性損傷，或系統性細胞因子受損。
使用本發明可以使組織再生，包括器官(如胰腺，肝臟，腸，腎臟，皮膚，內皮)，肌肉(平滑肌，骨骼肌或心肌)，血管(包括血管內皮)，淋巴管(包括淋巴管內皮)，神經，造血器官，骨骼(骨骼，軟骨，肌腱和韌帶)組織。尤其是，再生不伴有或降低疤痕的形成。再生還包括血管生成。
再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以促進難癒合組織的再生。例如，肌腱/韌帶再生能力的提高，可以加快損傷後痊癒時間。本發明的V血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於預防，避免損傷。用於一些特殊疾病的治療，包括肌腱炎，腕管症候群和其他腱或韌帶缺損。還有一些不癒合性傷口的組織再生的實例，包括緊張性潰瘍，血管缺損性潰瘍，手術和外傷。
同樣地，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以使神經和腦組織再生，因為它可以使神經細胞增殖和分化。使用該方法治療的疾病包括中樞和周圍神經系統疾病，神經病變，或機械性和外傷性疾病(如，脊索疾病，頭外傷，腦血管病和中風)。尤其是與周圍神經損傷有關的疾病，周圍神經病(如由化療或其他療法引起)局部神經病和中樞神經系統疾病(如阿爾茲海默病，帕金森病，亨廷頓病，肌萎縮性脊髓側索硬化症和Shy-Drager症候群)，均可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療。趨化性血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑具有趨化活性。趨化分子可以吸引或動員細胞(如單核細胞，成纖維細胞，中性粒細胞，T細胞，肥大細胞、嗜酸性粒細胞，上皮細胞和/或內皮細胞)到達體內特定的位點，如炎症，感染或過度增殖等部位。動員的細胞繼而對抗和/或癒合特異的損傷或異常。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以提高某些特定細胞的趨化活性。這些趨化分子繼而又通過提高細胞到達體內特異靶組織位點的數量治療炎症、感染、過度增殖性疾病，或任何免疫系統疾病。例如，趨化分子通過吸引免疫細胞到達受損部位，可以治療傷口和其他組織創傷。VEGF-2作為一種趨化分子還可吸引成纖維細胞用於治療傷口。
還應該考慮到血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以抑制趨化活性。這些分子還用於疾病的治療。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以作為一種趨化抑制劑。結合活性血管生成多肽可用於篩選結合血管生成多肽的分子，或血管生成多肽結合的分子。血管生成多肽與分子的結合可以活化(激動劑)、提高、抑制(拮抗劑)、或降低血管生成多肽或結合分子的活性。這樣的分子實例包括抗體、寡核苷酸、蛋白質(如受體)、或小分子。
優選，對這些分子的篩選，包括生成可表達血管生成多肽的細胞，血管生成多肽既可以作為一種分泌蛋白，也可以是一種膜結合蛋白。優選的細胞包括哺乳動物，酵母，果蠅，或大腸桿菌的細胞。表達血管生成多肽的細胞(或含有表達多肽的細胞膜)優先與一種檢測化合物作用，該化合物具有潛在的結合、刺激，或抑制血管生成多肽或分子本身活性的分子。
該分析方法可以很容易地檢測備選化合物與血管生成多肽的結合，可通過某種標記進行檢測，或通過與標記的競爭物的競爭來分析測定。再者，該方法可以檢測備選化合物是否導致結合血管生成多肽的信號。
另一種情況，還可以用不含細胞的標本，與固相結合的多肽/分子，化學製劑文庫，或天然產品混合物進行測試。該方法非常簡單，僅包括以下步驟將備選化合物與含有血管生成多肽的溶液混合，檢測血管生成多肽/分子的活性或結合，以及將血管生成多肽/分子活性或結合與標準物比較。
應用單克隆抗體或多克隆抗體，優選ELISA(酶聯免疫吸附試驗)法，來檢測樣本(如生物樣本)中血管生成多肽的量或活性。抗體通過直接或間接地結合血管生成多肽，或與血管生成多肽競爭結合底物，用來檢測血管生成多肽的水平或活性。
另外，血管生成多肽結合的受體可通過本領域技術人員已知的許多方法鑑別，例如配體淘選和FACS分選(見Colihan等，當代免疫學方法，1(2)第五章，1991)。例如，應用表達克隆，其中聚腺苷酸化的RNA製備自對此多肽應答的細胞，例如NIH3T3細胞，其已知含有FGF家族蛋白的多個受體，和SC-3細胞，將產生自此RNA的cDNA文庫分為集合庫，用於轉染COS細胞或其它對此多肽不應答的細胞。將在玻片上生長的轉染細胞，在標記後暴露於本發明的多肽。此多肽可通過各種方法標記，包括用碘標記或包含位點特異性蛋白激酶的識別位點。
在固定和溫育後，將此玻片進行放射自顯影分析。鑑別陽性集合體，並製備亞集合體，用重複的亞集合和再篩選方法再轉染，，最後產生一個編碼推定的受體的單一克隆。
鑑別受體的另一種方法是，將標記的多肽與表達受體分子的細胞膜或提取物光親和性連接。交聯物通過PAGE分析解離，並暴露於X光片。切下含有多肽受體的標記的複合物，解離為肽片段，並進行蛋白質微量測序。得自蛋白質微量測序的胺基酸序列用於設計一系列簡併的寡核苷酸探針，以篩選cDNA文庫，鑑別編碼推定的受體的基因。
另外，本發明提供了一種篩選化合物的方法，以鑑別調節本發明多肽作用的化合物。這種分析例如包括將哺乳動物成纖維細胞，本發明的多肽，要篩選的化合物，3〔H〕胸苷，在成纖維細胞正常增殖的細胞培養條件下組合。在無要篩選的化合物的情況下進行對照分析，並與存在要篩選的化合物的情況下成纖維細胞增殖的數量相對比，通過確定在每種情況下3〔H〕胸苷的吸收，從而確定此化合物是否刺激增殖。成纖維細胞增殖的數量是通過液體閃爍層析測定的，該層析測定3〔H〕胸苷的摻入情況。激動劑和拮抗劑均可通過此方法鑑別。
在另一方法中，將表達本發明多肽受體的哺乳動物細胞或膜製備物，用標記的本發明多肽在存在化合物的情況下溫育。然後測定此化合物增強或阻斷此反應的能力。或者，在篩選化合物與本發明血管生成多肽受體相互作用後，測定已知第二信使系統的應答，並測定此化合物結合受體並激發第二信使應答的能力，從而確定此化合物是否是潛在的激動劑或拮抗劑。這種第二信使系統包括但非限於cAMP鳥苷酸環化酶，離子通道或磷酸肌醇水解。
上述所有的檢測方法可以作為診斷或預後的指標。用這些方法發現的分子，通過活化或抑制血管生成多肽/分子，可治療疾病或給患者帶來某種特殊後果(如血管生長)。再者，這些檢測方法可以發現某些可以抑制或增加血管生成多肽從合適的細胞或組織中合成的物質。
因此，本發明包括一種鑑別與血管生成多肽結合的化合物的方法，包括以下步驟(a)將一種備選的具有結合功能的化合物與血管生成多肽一起溫育；(b)如果已經結合，進行檢測。再者，本發明包括一種識別激動劑/拮抗劑的方法，有以下幾步(a)將一種備選化合物與血管生成多肽一起溫育，(b)確定血管生成多肽的生物學活性是否已經發生變化。反義和核酶(拮抗劑)在特異的實施方案中，本發明的拮抗劑是相當於SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23中包含的序列或其互補鏈的核酸。在一實施方案中，反義序列是通過有機質產生的，在另一實施方案中，反義序列是單獨施用的(見例如O』Connor，神經化學雜誌56560(1991)。寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)。可使用反義方法通過反義DNA或RNA，或通過三螺旋形成，控制基因表達。反義方法例如Okano，神經化學雜誌56；560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)所述。三螺旋形成見例如Lee等，核酸研究63073(1979)；Cooney等，科學241456(1988)；和Dervan等，科學2511300(1991)所述。此方法基於多核苷酸與互補DNA或RNA的集合。
例如，編碼本發明成熟多肽的多核苷酸的5』編碼部分，可用於設計長度為大約10-40個鹼基對的反義RNA寡核苷酸。將DNA寡核苷酸設計為與轉錄中包含的基因的一區域互補，從而阻止轉錄和受體產生。此反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內雜交並阻斷mRNA翻譯為受體多肽。
在一實施方案中，本發明的血管生成反義核酸是通過從外源序列轉錄在細胞內產生的。例如，轉錄載體或其一部分，產生本發明的反義核酸(RNA)。這種載體含有編碼血管生成反義核酸的序列。這種載體可保留附加體，或成為經染色體整合的，只要其可被轉錄產生所需的反義RNA。這種載體可通過本領域標準的重組DNA方法構建。載體可以是質粒，病毒，或其它本領域已知載體，用於在脊椎動物細胞中表達和複製。編碼血管生成蛋白的序列或其片段的表達，可通過本領域已知的任何啟動子進行，以在脊椎動物優選人體細胞中起作用。這種啟動子可以是可誘導的或組成型的。這種啟動子包括但非限於SV40早期啟動子區域(Bernoist和Chambon，自然29304-310(1981))，包含於Rous肉瘤病毒的3』長末端重複中的啟動子(Yamamoto等，細胞22；787-797(1980))，皰疹胸苷啟動子(Wagner等，美國科學院院報781441-1445(1981))，金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等，自然29639-42(1982))等。
本發明的反義核酸包含與血管生成基因的RNA轉錄物的至少一部分互補的序列。然而，絕對互補儘管是優選的，但不需要。「與RNA的至少一部分互補」的序列，是指具有充分互補性能與RNA雜交，形成穩定雙螺旋的序列；在雙鏈反義核酸定向編碼血管生成蛋白的抗RNA轉錄物的情況下，可測試單鏈的雙螺旋DNA，或可分析三螺旋形成。雜交能力依賴於反義核酸的互補程度和長度。通常地，雜交分子越大，與血管生成RNA的錯配越多，並仍形成穩定的雙螺旋(或三螺旋)。本領域技術人員通過使用標準方法確定雜交的複合物的熔點，可確定可容忍的錯配程度。
互補於信使5』末端如5』未翻譯區直至並包括AUG起始密碼子的寡核苷酸，，在抑制翻譯方面更有效。然而，互補於mRNA的3』未翻譯序列的序列已示出在抑制mRNA翻譯方面一樣有效。見Wangner，R.，1994，自然372333-335。因此，與圖3A-3C所示血管生成蛋白的5』或3』未翻譯的非編碼區互補的寡核苷酸，可用於反義技術，以抑制編碼血管生成蛋白的內源性mRNA翻譯。互補於mRNA的5』未翻譯區的寡核苷酸應包括AUG起始密碼子的補體。互補於mRNA編碼區的反義寡核苷酸是低效的翻譯抑制劑，但根據本發明可以使用。不論是與血管生成mRNA的5』，3』序列還是與編碼區雜交，反義核酸長度應至少為6個核苷酸，並優選寡核苷酸的長度在6-50個核苷酸範圍。寡核苷酸的長度至少為17，25或50個核苷酸。
本發明的多核苷酸可以是DNA或RNA，或嵌合混合物或其衍生物或修飾的形式，可以是單鏈或雙鏈的。對寡核苷酸可在鹼基組分，糖組分或磷酸主鏈進行修飾，以例如改進分子的穩定性，雜交等。此寡核苷酸可包括其它附加的基團如肽(例如在體內定向宿主細胞)，或促進轉運經過細胞膜的製劑(見例如Letsinger等，1989，美國科學院院報866553-6556；Lemaitre等，1987，美國科學院院報84648-652；PCT出版物WO88/09810，1988年12月15日出版)，或促進轉運經過血腦屏障的製劑(見例如PCT出版物WO89/10134，1988年4月25日出版)，觸發雜交的裂解劑(見例如Krol等，1988，生物技術6958-976)或嵌入劑(見例如Zon，1988，藥物研究5539-549)。總而言之，此寡核苷酸可綴合於其它分子，例如肽，觸發雜交的交聯劑，轉運劑，觸發雜交的裂解劑等。
反義寡核苷酸可包含至少一個修飾的鹼基組分，其選自以下基團，包括但非限於5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，xantine，4-乙醯胞嘧啶，5-(羧羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖queosine，肌苷，N6-異戊烯腺苷，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺苷，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6腺苷，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖queosine，5』-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲基硫-N6-異戊烯腺苷，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸，(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp)w，和2，6-二氨基嘌呤。
反義寡核苷酸也可包含至少一個修飾的糖組分，選自以下基團，包括但非限於阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。
另一方面，反義寡核苷酸包含至少一個修飾的磷酸主鏈，選自以下基團，包括但非限於硫代磷酸鹽，二硫代磷酸鹽，硫代磷酸銨，磷酸銨，磷酸二銨，甲基磷酸鹽，烷基磷酸三酯，和formacetal或其類似物。
在另一實施方案中，反義寡核苷酸是一種端基異構寡核苷酸。端基異構寡核苷酸與互補RNA形成特異的雙鏈雜合體，其中與通常的b-單位相反，此雙鏈彼此互相平行(Gautier等，1987，核酸研究156625-6641)。此寡核苷酸是2』-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究156131-6148)，或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，FEBS通信215327-330)。
本發明的多核苷酸可通過本領域已知的標準方法合成，例如通過自動DNA合成儀(如購自Biosearch，Applied Biosystems，等，)。例如，硫代磷酸鹽寡核苷酸可通過Stein等所述方法合成(1988，核酸研究163209)，甲基磷酸鹽寡核苷酸可通過使用控制網眼玻璃聚酯支持物製備(Sarin等，1988，美國科學院院報857448-7451)等。
當使用互補於編碼血管生成蛋白的編碼區序列的反義核苷酸時，最優選互補於轉錄的未翻譯區的寡核苷酸。
本發明的潛在拮抗劑還包括催化的RNA，或核酶(見例如PCT國際出版物WO90/11364，1990年10月4日出版；Sarver等，科學2471222-1225(1990))。當使用在特異識別序列位點裂解mRNA的核酶，以破壞編碼血管生成蛋白的mRNA時，優選使用錘頭核酶。錘頭核酶裂解位於與靶mRNA形成互補鹼基對的區域兩側mRNAs。唯一的要求是靶mRNA具有以下兩個鹼基的序列5』-UG-3』。本領域已知錘頭核酶的構建和產生，詳見Haseloff和Gerlach，自然334585-591(1988)所述。在編碼血管生成蛋白的核苷酸序列內(SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23)有許多潛在的錘頭核酶切割位點。優選地，核酶是工程化的，以便切割位點位於編碼血管生成蛋白的mRNA的5』末端附近；即提高效力，和最大限度的減少非功能性mRNA轉錄物的胞內積累。
在反義方法中，本發明的核酶可以由修改的寡核苷酸組成(例如為改進穩定性，定向等)，並輸送至在體內表達血管生成蛋白的細胞。編碼核酶的DNA構建體可以與上述導入反義編碼DNA相同方式導入細胞。輸送的優選方法包括使用在強組成型啟動子的控制下的編碼核酶的DNA構建體，如polIII或polII啟動子，以便轉染的細胞產生足量的核酶，以破壞編碼血管生成蛋白的內源性信息，並抑制其翻譯。與反義分子不同，核酶是催化性的，因此需要較低的胞內濃度以更加有效。
拮抗劑/激動劑化合物可用於抑制腫瘤細胞生長和本發明多肽在腫瘤細胞和組織上的增殖作用，即刺激腫瘤的血管生成，因此延遲或預防例如在腫瘤形成或生長中異常細胞生長和增殖。
拮抗劑/激動劑也可用於預防過度血管化的疾病，並預防在白內障囊外摘除術後晶狀體上皮細胞的增殖。在一些情況中也需要阻止本發明多肽的促分裂原活性，如在氣囊血管成形術後再狹窄。
拮抗劑/激動劑也可用於預防在傷口癒合期間疤痕組織的生長。
拮抗劑/激動劑也可用於治療本文所述的疾病。其它活性本發明的多肽，由於具有刺激血管內皮細胞生長的能力，可用於刺激缺血組織再血管化，缺血組織是由於各種疾病所致的如血栓，動脈硬化及其它心血管疾病。這些多肽還可用於刺激血管發生和側支重建，如上所述。
本發明的多肽還可用於治療由於創傷，燒傷，組織修復術後，和潰瘍所致的傷口，因為其具有是各種不同來源的細胞的促分裂原的能力，如成纖維細胞和骨骼肌細胞，因此促進損傷或病變組織的修復或更新。
本發明的多肽還可用於刺激神經元生長，及治療和預防神經元損傷，如發生在中樞神經系統疾病或神經退化疾病如Alzheimer’s疾病，Parkinson’s疾病，和AIDS相關的症候群。血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，可具有刺激軟骨細胞生長的能力，並因此可用於增強骨和牙周膜重建，及有助於組織移植或骨移植。
本發明的多肽也可通過刺激角質形成細胞生長，用於預防由於日曬所致的皮膚老化。
血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，也可在移植之前用於維持器官，或支持原始組織的細胞培養物。
本發明的多肽也可用於誘導早期胚胎中胚層組織分化。
血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，也可提高或降低除造血細胞系之外胚胎幹細胞的分化或增殖，如上所述。
血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，也可用於調節哺乳動物特性，如身高，體重，發色，眼睛顏色，皮膚，脂肪組織百分率，膚色，大小和形狀(如美容外科)。相似地，血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，可通過影響分解代謝，合成代謝，加工，利用和能量貯存，用於調節哺乳動物代謝。
血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，可通過影響生物節律，caricadic節律，壓力(包括憂鬱症)，暴力傾向，痛閾，生殖力(優選通過活化素或類抑制素活性)，激素或內分泌水平，食慾，性慾，記憶力，應激力或其它感知性，用於改變哺乳動物的精神狀態或自然狀態。
血管生成蛋白，其激動劑和/或拮抗劑，也可用作食物添加劑或防腐劑，如提高或降低貯存力，脂肪含量，脂質，蛋白質，碳水化合物，維生素，無機鹽，輔因子或其它營養成分。
上述應用可用於眾多宿主中。這種宿主包括但非限於人，鼠，兔，山羊，豚鼠，駱駝，馬，小鼠，大鼠，倉鼠，豬，小豬，雞，牛，綿羊，狗，貓，非人靈長類動物，和人。在特異的實施方案中，宿主是小鼠，兔，山羊，豚鼠，雞，大鼠，倉鼠，豬，綿羊，狗或貓。在優選的實施方案中，宿主是哺乳動物。在更優選的實施方案中，宿主是人。治療應用本發明的血管生成蛋白是血管和淋巴內皮細胞的潛在的促分裂原。因此，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可通過促進血管發生用於治療血管損傷。例如，刺激進行冠脈搭橋術處移植的組織生長。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於促進傷口癒合，尤其使損傷組織再生血管，或在缺血期間刺激間接血流，及用於需要形成新毛細血管處。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可用於治療全層傷口，如皮膚潰瘍包括壓痛，靜脈潰瘍，和糖尿病潰瘍。另外，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可用於治療全層燒傷和損傷，其中使用皮膚移植物或皮瓣修復這種燒傷和損傷。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於整形手術，例如修復破口，手術或其它外傷。另外，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可用於促進傷口癒合和眼外傷以及治療眼病。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於誘導損傷的骨，牙周膜或韌帶組織生長。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於重建例如由牙周病或外傷所傷的牙周組織，包括牙骨質和牙周膜。
由於血管生成對保持傷口清潔和非感染是重要的，因此血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可與手術聯合應用及隨後修復切口。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於治療腹部傷口，腹部傷口感染危險性高。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可用於在血管移植術中促進內皮化。在使用移植的或合成物的血管移植情況中，血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可用於移植物表面或接合處，以促進血管內皮細胞生長。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於修復由於心肌梗塞所損傷的心肌組織。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於修復缺血後的心血管系統。血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於治療由冠心病及周圍和CNS血管疾病。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於包被植入機體內的人造prostheses或自然器官，以使排斥移植物反應最小，並刺激移植物血管發生。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於修復損傷的血管組織，例如在動脈硬化期間發生的血管損傷，及用於在血管損傷處進行氣囊血管成形術後。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於治療周圍動脈疾病。因此，本發明另一方面提供了利用血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，治療周圍動脈疾病的方法。優選地，將血管生成多肽與激動劑共同施用於個體，以減輕或治療周圍動脈疾病。適當的劑量，配方和施用途徑見下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於促進淋巴組織和淋巴管的內皮功能，如治療淋巴管損傷，淋巴管閉塞，和淋巴管瘤。血管生成多肽與激動劑也可用於刺激淋巴細胞產生。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於治療新生兒血管瘤。因此，本發明另一方面提供了利用血管生成多肽與激動劑和/或拮抗劑共同治療新生兒血管瘤的方法。優選地，將血管生成多肽與激動劑聯合施用於個體，以減輕或治療新生兒血管瘤。適當的劑量，配方和施用途徑見下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於預防或治療早產新生兒異常視網膜發育。因此，本發明另一方面提供了利用血管生成多肽與激動劑或拮抗劑聯合治療早產新生兒異常視網膜發育。優選地，將血管生成多肽與激動劑或拮抗劑聯合施用於個體，以減輕或治療早產新生兒異常視網膜發育。適當的劑量，配方和施用途徑見下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，可用於治療原發性(獨特型)淋巴腺瘤，包括Milroy’s病和早發的淋巴腺瘤。因此，本發明另一方面提供了利用血管生成多肽與激動劑聯合治療原發性(獨特型)淋巴腺瘤，包括Milroy’s病和早發的淋巴腺瘤的方法。優選地，將血管生成多肽與激動劑聯合施用於個體，以減輕或治療原發性(獨特型)淋巴腺瘤包括Milroy’s病或早發的淋巴腺瘤。血管生成多肽與激動劑也可用於治療水腫以及影響動物血壓。適當的劑量，配方和施用途徑見下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於治療二級壽命(受阻礙的)，包括由(i)除去淋巴結和淋巴管，(ii)治療癌症的放療和手術，和(iii)損傷和感染所致的二級壽命。因此本發明另一方面提供了利用血管生成多肽與激動劑聯合治療二級壽命(受阻礙的)，包括由(i)除去淋巴結和淋巴管，(ii)治療癌症的放療和手術，和(iii)損傷和感染所致的二級壽命。優選地，將血管生成多肽與激動劑聯合施用於個體，以治療二級壽命(受阻礙的)，包括由(i)除去淋巴結和淋巴管，(ii)治療癌症的放療和手術，和(iii)損傷和感染所致的二級壽命。適當的劑量，配方和施用途徑見下述。
血管生成蛋白，或其生物活性部分，及其激動劑和/或拮抗劑，也可用於治療Kaposi’s肉瘤。因此本發明另一方面提供了利用血管生成多肽與激動劑聯合治療Kaposi’s肉瘤的方法。優選地，將血管生成多肽與激動劑聯合施用於個體，以減輕或治療Kaposi’s肉瘤。適當的劑量，配方和施用途徑見下述。
血管生成多肽的拮抗劑可通過抑制支持癌症和腫瘤生長所必需的血管發生，用於治療癌症。基因治療方法本發明的另一方面是治療功能失調，疾病和病理狀態的基因療法。基因療法涉及將核酸(DNA，RNA和反義DNA或RNA)序列導入動物體，以表達本發明的血管生成多肽。此方法需要操縱性連於啟動子的編碼血管生成多肽的多核苷酸，和通過靶組織表達多肽所必需的任何其它遺傳因子。本領域已知這種基因療法和輸送方法，見例如WO 90/11092，以其全文併入參考。
因此，例如可將患者的細胞用包含可操縱地連於源自體內的血管生成多肽的啟動子的多核苷酸(DNA或RNA)工程化，然後將工程化的細胞施用於患者以用多肽進行治療。本領域熟知這種方法。例如見Belldegrun，A.，等，J.Natl.Cancer Inst.85207-216(1993)；Ferrantini，M.等，癌症研究531107-1112(1 993)；Ferrantini，M.等，免疫學雜誌1534604-4615(1994)；Kaido，T.，等Int.J.Cancer60221-229(1995)；Ogura，H.，等，癌症研究505102-5106(1990)；Santodonato，L.，等，人體基因治療71-10(1996)；Santodonato，L，基因治療41246-1255(1997)；和Zhang，J.，-F等，癌症基因治療331-38(1996)，所述文獻以其全文併入參考。在一實施方案中，工程化的細胞是動脈細胞。可通過直接注射入動脈，動脈周圍組織，或通過導管注射，將此動脈細胞再導入患者體內。
如下文更詳細的闡述，可通過將可注射物質輸送至動物細胞的任何方法輸送血管生成多核苷酸構建體，如注射入組織間隙內(心，肌，皮膚，肺，肝等)。血管生成多核苷酸可在藥物適當液體或水溶液載體中輸送。
在一實施方案中，血管生成多核苷酸以裸多核苷酸方式輸送。術語「裸」多核苷酸，DNA或RNA是指游離自任何有助於，促進或易於進入細胞內的輸送載體的序列，包括病毒序列，病毒顆粒，脂質體配方，Lipofectin試劑或沉澱劑等。然而，血管生成多核苷酸也可在脂質體配方和Lipofectin配方中輸送，脂質體配方和Lipofectin配方可通過本領域熟知的方法製備。這種方法例如美國專利No5593972，5589466和5580859所述，以其全文併入參考。
基因療法中使用的血管生成多核苷酸載體構建體優選是即不整合入宿主基因組，也不含有進行複製的序列的構建體。適當的載體包括得自Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；得自Pharmacia公司的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL；及得自Invitrogen公司的pEF1/V5，pcDNA3.1和pRc/CMV2。其它適當的載體也為本領域技術人員所顯而易見。
可使用本領域已知的任何強啟動子以驅動血管生成DNA表達。適當的啟動子包括腺病毒啟動子，如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；可誘導啟動子如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人球蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；逆轉錄病毒LTRs；β-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。啟動子也可以是編碼給定血管生成蛋白的代表基因的天然啟動子。
與其它基因療法不同，將裸核酸序列導入靶細胞的一個主要優點是細胞中多核苷酸合成的短時性。研究表明可將非複製的DNA序列導入細胞中，以在6個月以上的時間產生所需的多肽。
可將血管生成多核苷酸構建體輸送至動物組織間隙內，包括肌，皮膚，腦，肺，肝，脾，骨髓，胸腺，心，淋巴，血液，骨，軟骨，胰腺，腎，膀胱，胃，小腸，睪丸，卵巢，子宮，直腸，神經系統，眼，腺體和結締組織。組織間隙內包含細胞內液，組織液，器官組織的網狀纖維中的粘多糖基質，血管或腔壁中的彈性纖維，纖維性組織中的膠原纖維，或包裹肌細胞或骨松質內的結締組織內相同基質。此間隙內還有循環血漿和淋巴管道內的淋巴液。由於下述原因優選輸送至肌組織間隙內。便於通過注射至包含這些細胞的組織內而輸送。優選將其輸送至分化的未分開的細胞中並持久表達，儘管可輸送至未分化的或未晚期分化的細胞中並表達，例如血幹細胞或皮膚成纖維細胞。在體內肌細胞能吸收並表達多核苷酸。
為注射裸核苷酸序列，DNA或RNA的有效劑量在大約0.05mg/kg體重-50mg/kg體重範圍內。優選的劑量為大約0.005mg/kg體重-20mg/kg體重，更優選大約0.05mg/kg體重-5mg/kg體重。當然，本領域技術人員意識道，此劑量將根據注射的組織位置加以變化。本領域技術人員易於確定適當的和有效的劑量，並可根據治療的疾病和施用途徑加以確定。
優選的施用途徑是非腸道經注射至組織間隙內。然而，也可使用其它非腸道途徑，如以氣霧劑配方吸入而特別輸送至肺或支氣管組織，咽喉或鼻黏膜。另外，血管生成DNA構建體可在血管成形術期間通過導管輸送至動脈中。
裸多核苷酸可通過本領域已知的任何方法輸送，包括但非限於在輸送部位直接針注，靜脈內注射，局部施用，導管灌注，和所謂的「基因槍」。本領域已知這些輸送方法。
現已證實在體內施用裸VEGF-2核酸序列，可在兔的股動脈中充分表達VEGF-2。
此構建體也可用輸送載體輸送，如病毒序列，病毒顆粒，脂質體配方，Lipofectin試劑，沉澱劑等。本領域已知這種方法。
在一些實施方案中，血管生成多核苷酸構建體是與脂質體製品複合的。本發明中使用的脂質體製品包括陽離子(正電荷)，陰離子(負電荷)和中性製品。然而，尤為優選陽離子脂質體，因為在陽離子脂質體和聚陰離子核酸之間可形成緊密的荷電複合物。陽離子脂質體已示出介導以功能形式的質粒DNA(Felgner等，美國科學院院報(1987)847413-7416，以其全文併入參考)；mRNA(Malone等，美國科學院院報(1989)866077-6081，以其全文併入參考)；和純化的轉錄因子(Debs等，生物化學雜誌(1990)26510189-10192，以其全文併入參考)的胞內輸送。
陽離子脂質體是易於獲得的。例如N-〔1-(2，3-二油醯氧)丙基〕-N，N，N-氯化三甲銨(DOTMA)脂質體是特別適用的，並可得自GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.，商標為Lipofectin(見Felgner等，美國科學院院報(1987)847413-7416，以其全文併入參考)。其它可商購脂質體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boehringer)。
使用本領域已知方法可從易得物質中製備其它陽離子脂質體。見例如PCT出版物No.WO90/11092(以其全文併入參考)闡述了DOTAP〔1-(2，3-二油醯氧)丙基〕-N，N，N-氯化三甲銨丙烷〕脂質體的合成。闡述DOTMA脂質體製備的文獻見例如P.Felgner等，美國科學院院報847413-7417所述，以其全文併入參考。可使用相似的方法從其它陽離子脂質中製備脂質體。
相似地，陰離子和中性脂質體也是易得的，如得自Avanti PolarLipids(Birmingham，Ala.)，或可使用易得物簡單製備。這種物質包括磷脂醯膽鹼，膽固醇，磷脂醯乙醇胺，二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)，二油醯磷脂醯甘油(DOPG)，二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)，等。這些物質也可以適當比例與DOTMA和DOTAP起始物混合。本領域熟知使用這些物質產生脂質體的方法。
例如，可使用商購的二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)，二油醯磷脂醯甘油(DOPG)，二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)的各種組合物，加入或不加入膽固醇產生常規的脂質體。因此，例如DOPG/DOPC小泡可通過在將氮氣流入超聲瓶，乾燥50mg DOPG和50mg DOPC而製備。將此樣品置於真空泵中過夜，並在第二天用去離子水水合。然後將此樣品在蓋上蓋的小瓶中超聲2小時，使用裝備轉動杯(沐浴型)探針的Heat Systems350型超聲發生器，在最大設定進行超聲，沐浴循環在15℃。或者，可不用超聲裝備陰離子小泡，以產生多薄片小泡，或通過核孔膜排擠產生不連續規格的單薄片小泡。本領域已知其它方法。
脂質體可包含多薄片小泡(MLVs)，小單薄片小泡(SUVs)，或大單薄片小泡(LUVs)，SUVs是優選的。各種脂質體—核酸複合物是通過本領域已知方法製備的。見例如Straubinger等，免疫學方法(1983)，101512-527，以其全文併入參考。例如，含有核酸的MLVs可通過將磷脂薄膜置於在玻璃管壁上，接著用此物質的溶液水合以膠囊化。SUVs是通過長期超聲MLVs製備的，以產生同源單薄片脂質體群。將截留物加入預先製備的MLVs懸浮液中，然後超聲。當使用含有陽離子脂質的脂質體時，將乾燥的脂質薄膜再懸浮於適當的溶液中，如無菌水或等滲緩衝液如10mM Tris/NaCl中，超聲，然後將預先製備的脂質體與DNA直接混合。由於陽離子的脂質體與陽離子的DNA結合，脂質體和DNA形成非常穩定的複合物。SUVs發現與小核酸片段一起使用。LUVs是通過本領域已知的許多方法製備的。通常使用的方法包括Ca2+-EDTA螯合(Papahadjopoulos等，生物化學生物生理學學報(1975)394483；Wilson等，細胞(1979)1777)；乙醚注射(Deamer，D.，和Bangham，A.，生物化學生物生理學學報(1976)443-629；Ostro等，生物化學生物生理學研究綜述(1977)76836；Fraley等，美國科學院院報(1979)763348)；去汙劑透析(Enoch，H.，和Strittmatter，P.，美國科學院院報(1979)76145)；和反向蒸發(REV)(Fraley等，生物化學雜誌(1980)2551043 1；Szoka，F.，和Papahadiopoulos，D.，美國科學院院報(1978)75145；Schaefer-Ridder等，科學(1982)215166)，所述文獻以其全文併入參考。
DNA與脂質體的比率通常為大約10∶1-1∶10。優選地，此比率為大約5∶1-1∶5。更優選地，此比率為大約3∶1-1∶3。最優選地，此比率為大約1∶1。
美國專利No.5676954(以其全文併入參考)報導了將遺傳物質與陽離子脂質體載體複合，注射至小鼠體內。美國專利No.4897355，4946787，5049386，5459127，5589466，5693622，5580859，5703055，和國際出版物WO 94/9469(以其全文併入參考)，提供了陽離子脂質，用於將DNA轉染至細胞和哺乳動物中。美國專利No.5589466，5693622，5580859，5703055和國際出版物WO 94/9469(以其全文併入參考)，提供了將DNA-陽離子脂質複合物輸送至哺乳動物的方法。
在一些實施方案中，細胞是用含有RNA的逆轉錄病毒顆粒在體內基因工程化的，所述RNA包含編碼血管生成蛋白的序列。可衍生逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄病毒包括但非限於Moloney鼠白血病病毒，脾壞死病毒，Rous肉瘤病毒，Harvby肉瘤病毒，禽白血病病毒，長臂猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳腺腫瘤病毒。
逆轉錄病毒質粒載體用於轉導包裝細胞系，以形成生產細胞系。可被轉導的包裝細胞系例如包括但非限於PE501，PA317，R-2，R-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，RCRE，RCRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN細胞系，如Miller，人體基因治療1∶5-14(1990)所述，以其全文併入參考。載體可通過本領域已知任何方法轉導包裝細胞。這種方法包括但非限於電穿孔，使用脂質體和CaPO4沉澱。或者，逆轉錄病毒質粒載體可在脂質體中膠囊化，或與脂質偶聯，然後施用於宿主。
生產細胞系產生感染性逆轉錄病毒載體顆粒，其包括編碼血管生成蛋白的多核苷酸。然後用這種逆轉錄病毒載體顆粒在體外或體內轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達血管生成蛋白。
在一些其它實施方案中，細胞是在體內用包含於腺病毒載體中的血管生成多核苷酸基因工程化的。對腺病毒可進行人為操縱為編碼和表達血管生成蛋白，並同時在正常病毒壽命裂解周期中其複製能力是失活的。不用將病毒DNA整合入宿主細胞染色體即可達到腺病毒表達，從而減輕插入誘變。另外，腺病毒作為活腸道疫苗已使用許多年，具有完好的安全性(Schwartz，A.R.等，(1974)Am.Rev.Respir.Dis.109233-238)。最後，腺病毒介導的基因轉移在許多情況中已證實，包括將α-1-抗胰蛋白酶和CFTR移至棉田鼠的肺部(Rosenfeld，M.A.等(1991)科學252431-434；Rosenfeld等，(1992)細胞68143-155)。另外，嘗試將腺病毒設立為人體癌症的致病劑的敏感性研究，均是陰性的(Green，M.等，(1979)美國科學院院報766606)。
用於本發明的適當腺病毒載體例如是由Kozarsky和Wilson，遺傳發育通用觀點3499-503(1993)；Rosenfeld等，細胞68143-155(1992)；Engelhardt等，人體基因治療4759-769(1993)；Yang等，自然遺傳7362-369(1994)；Wilson等，自然365691-692(1993)；和美國專利No.5652224所述，以其全文併入參考。例如，可使用腺病毒載體Ad2，且可在人293細胞中生長。這些細胞含有腺病毒的E1區域，並組成型表達E1a和E1b，E1a和E1b通過提供缺失自載體的基因產物與缺陷性腺病毒互補。除了Ad2之外，本發明也可使用其它腺病毒的變體(如Ad3，Ad5，和Ad7)。
優選地，本發明使用的腺病毒是複製缺陷的。複製缺陷的腺病毒需要藉助於幫助病毒和/或包裝細胞系以形成感染性顆粒。所得病毒能感染細胞並能表達相應的多核苷酸，該核苷酸可操縱地連於啟動子，例如本發明的HARP啟動子，但在大多數細胞中不能複製。複製缺陷腺病毒可缺失以下一或多個基因的全部或部分E1a，E1b，E3，E4，E2a，或L1-L5。
在一些其它實施方案中，細胞是在體內用腺伴隨病毒(AAV)基因工程化的。AAVs是天然發生的缺陷病毒，其需要幫助病毒產生感染性顆粒(Muzyczka，N.，分子生物免疫學通用論題15897(1992))。其也是可將其DNA整合入未分開的細胞中的少數病毒之一。含有少如300個鹼基對的AAV的載體可包裝並整合，但外源性DNA的空間限為大約4.5kb。本領域已知產生和使用這種AAVs的方法。見例如美國專利No.5139941，5173414，5354678，5436146，5474935，5478745和5589377所述。
例如，用於本發明的適當AAV載體，包括DNA複製，衣殼化，和宿主細胞整合所必需的所有序列。使用標準克隆方法將血管生成多核苷酸構建體插入AAV載體中，如Sambrook等，分子克隆實驗手冊，冷泉港出版社(1989)所述方法。然後將重組AAV載體轉染入用幫助病毒感染的包裝細胞中，使用任何幫助方法轉染，包括脂染，電穿孔，磷酸鈣沉澱等。適當的幫助病毒包括腺病毒，巨細胞病毒，痘苗病毒或皰疹病毒。一旦幫助細胞被轉染和感染，它們將產生含有血管生成多核苷酸個體的感染性AAV顆粒。任何將這些病毒顆粒在體內用於轉導真核細胞。轉導的細胞含有真核入其基因組的血管生成多核苷酸構建體，並表達血管生成蛋白。
基因治療的另一方法包括通過同源重組可操縱地聯合異源對照區與內源性多核苷酸序列(如編碼血管生成蛋白的序列)(見例如1997年6月24日公布的美國專利No.5641670；1996年4月26日出版的國際出版物WO 96/29411；1994年8月4日出版的國際出版物WO94/12650；Koller等，美國科學院院報868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)所述)。此方法包括活化在靶細胞中呈遞的基因，但該基因在此細胞中不正常表達，或低水平表達。
使用本領域已知的標準方法產生多核苷酸構建體，該構建體含有啟動子，啟動子兩側具有定向序列。適當的啟動子如本文所述。定向序列充分互補於內源性序列，以用內源性序列同源重組啟動子定向的序列。定向序列十分鄰近血管生成蛋白的所需內源性多核苷酸序列的5』末端，因此啟動子通過同源重組可操縱地連於內源性序列。
啟動子和定向序列可使用PCR擴增。優選地，擴增的啟動子在5』和3』末端含有明顯的限制酶位點。優選地，第一個定向序列的3』末端含有與擴增的啟動子的5』末端相同的限制酶位點，第二個定向序列的5』末端含有與擴增的啟動子的3』末端相同的限制酶位點。將擴增的啟動子和定向序列消化並連接在一起。
將啟動子—定向序列構建體以裸多核苷酸或與轉染促進劑一起輸送至細胞，轉染促進劑如以上詳細闡述的脂質體，病毒序列，病毒顆粒，全病毒，脂染劑，沉澱劑等。P啟動子—定向序列可通過任何方法輸送，包括直接針注，靜脈內注射，局部施用，導管灌注，顆粒加速器等。此方法在以下加以詳細闡述。
啟動子—定向序列構建體由細胞吸收。在構建體和內源性序列之間發生同源重組，這樣編碼血管生成蛋白的內源性序列在啟動子的控制下置放。然後啟動子驅動內源性血管生成序列表達。
編碼血管生成蛋白的多核苷酸可與編碼其它血管生成蛋白的其它多核苷酸一起施用。
優選地，編碼血管生成蛋白的多核苷酸含有一分泌信號序列，其促進蛋白質的分泌。典型地，信號序列位於被表達的多核苷酸的編碼區周圍，或在編碼區的5』末端。此信號序列可以同源或異源於相應多核苷酸，並可以同源或異源於轉染的細胞。另外，此信號序列可以是用本領域已知方法化學合成的。
可使用施用以上所述的多核苷酸構建體的任何方式，只要此方式導致一或多種分子以足夠數量表達，產生治療效應。這種施用方式包括直接針注，全身注射，導管灌注，biolistic注射器，顆粒加速器(即基因槍)，明膠海綿紗布補給，其它商購補給物，滲透泵(如Alza微泵)，口服或栓劑固體(片劑或藥丸)藥物配方，和在手術期間輕輕倒入或局部應用。例如，將裸磷酸鈣沉澱的質粒直接注射入大鼠肝和脾中，或將蛋白質包被的質粒直接注射入門靜脈中，已經在大鼠肝臟中產生外源基因表達(Kaneda等，科學243375(1989))。
優選的局部施用方法是直接注射。優選地，與輸送載體複合的本發明的重組分子，是通過直接注射入動脈內或在動脈局部施用的。在動脈局部施用組合物是指將組合物注射入釐米優選毫米範圍內的動脈。
局部施用的另一方法是將本發明的多核苷酸構建體施用於外科手術傷口處或其周圍。例如，病人經歷手術，將此多核苷酸構建體包被於傷口內側組織表面，或將構建體注射入傷口內側組織中。
用於全身施用的治療組合物包括與本發明定向的輸送載體複合的本發明的重組分子。全身施用的適當輸送載體包括將載體定向於特定部位的配體。
優選的全身施用方法包括靜脈內注射，氣霧劑，口服和經皮(局部)輸送。可使用本領域已知的標準方法進行靜脈內注射。氣霧劑輸送也可使用本領域已知的標準方法進行(見例如Stribling等，美國科學院院報18911277-11281，1992，以其全文病人參考)。口腔服用可通過將本發明的多核苷酸構建體與載體複合進行，所述載體在動物消化道中能抵擋消化酶降解。這種載體例如包括本領域已知的塑膠囊或片劑。局部輸送可通過將本發明的多核苷酸構建體與親脂劑(如DMSO)混合而進行，所述親脂劑能穿過皮膚。
確定所施用物質的有效量可依賴於許多因素，例如包括施用物質的化學結構和生物活性，動物年齡和體重，需要治療的準確病情及其嚴重度，及施用途徑。治療頻率依賴於許多因素，如每劑施用的多核苷酸構建體的數量，以及對象的健康狀態和病史。準確數量，劑量數，和時間由主治醫生確定。
本發明的治療組合物可施用於任何動物，優選哺乳動物和鳥類。優選的哺乳動物包括人，狗，貓，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛，馬和豬，優選人。藥物組合物血管生成多肽，多核苷酸及激動劑和拮抗劑可與適當的藥物載體組合應用。這種組合物包括治療有效量的多肽或激動劑或拮抗劑，和藥物適當的載體或賦形劑。這種載體包括但非限於鹽水，緩衝鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其組合物。配方應適於施用模式。
本發明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包含一或多個充填本發明藥物組合物的一或多種配料的容器。這種容器內有政府管理生產，使用或銷售藥物或生物製品的機構的告示，該告示反映了生產，使用或銷售藥物或生物製品管理機構準許施用於人。另外，藥物組合物可與其它治療化合物聯合應用。
藥物組合物可以常規方式施用，如通過局部施用，靜脈內，腹膜內，肌內，腫瘤內，皮下，鼻內，或皮內施用。藥物組合物以有效治療和/或預防特定疾病的數量施用。通常地，藥物組合物的施用劑量為至少大約10mg/kg體重，在大多數情況下施用數量每天不超過大約8mg/kg體重。考慮施用途徑，症狀等，在大多數情況下施用劑量為大約每天10mg/kg體重-1mg/kg體重。
血管生成多肽，及是多肽的激動劑或拮抗劑，根據本發明也可通過在體內表達這種多肽而應用，通常稱之為「基因治療」，如上所述。
因此，例如細胞如骨髓細胞可在體內用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)基因工程化，然後將基因工程化的細胞施用於患者，用此多肽進行治療。本領域熟知這種方法。例如，細胞可通過本領域已知方法，使用含有編碼本發明多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒基因工程化。
相似地，細胞可在體內基因工程化，以在體內表達多肽，例如通過本領域已知方法。如本領域所知，可將生產細胞施用於患者以在體內基因工程化細胞，並在體內表達多肽，所述生產細胞產生含有編碼本發明多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒。本領域技術人員通過本發明的教導，可理解施用本發明多肽的這些及其它方法。例如，基因工程細胞的表達載體除了逆轉錄病毒顆粒之外，可以是腺病毒，其與適當輸送載體組合後可用於在體內基因工程化細胞。
從中可產生手術逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄病毒，包括但非限於Moloney鼠白血病病毒，脾壞死病毒，逆轉錄病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，類人猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳腺腫瘤病毒。
載體包括一或多個啟動子。可應用的適當啟動子包括但非限於逆轉錄病毒LTR；SV40啟動子；和人巨細胞病毒(CMV)啟動子，如Miller等，生物技術7；980-990(1989)；或任何其它啟動子(例如細胞啟動子如真核細胞啟動子包括但非限於組蛋白，pol III和β-肌動蛋白啟動子)。可應用的其它病毒啟動子包括但非限於腺病毒啟動子，胸苷激酶(TK)啟動子，和B19細小病毒啟動子。根據本發明教導，本領域技術人員可選擇適當的啟動子。
編碼本發明多肽的核酸序列在適當啟動子的控制下。可應用的適當啟動子包括但非限於腺病毒啟動子如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；可誘導啟動子如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人球蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子如單純皰疹胸苷激酶啟動子；逆轉錄病毒LTRs(包括上述修改的逆轉錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。啟動子還可以是控制編碼多肽的基因的天然啟動子。
使用逆轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系，以形成生產細胞系。可被轉染的包裝細胞系例如包括但非限於PE501，PA317，y-2，y-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，yCRE，yCRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN細胞系，如Miller，人體基因治療1∶5-14(1990)所述，以其全文併入參考。載體可通過本領域任何已知方法轉導包裝細胞系。這種方法包括但非限於電穿孔，使用脂質體，和磷酸鈣沉澱。在一實施方案中，可將逆轉錄病毒質粒載體在脂質體中膠囊化，或偶聯於主治，然後施用於宿主。
生產細胞系產生感染性逆轉錄病毒載體顆粒，其包括編碼多肽的核酸序列。然後用這種逆轉錄病毒載體顆粒在體外或體內轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達編碼多肽的核酸序列。可轉導的真核細胞包括但非限於胚胎幹細胞，胚胎癌細胞，以及造血幹細胞，血細胞，成纖維細胞，成肌細胞，角質細胞，內皮細胞和支氣管上皮細胞。診斷分析本發明還涉及使用編碼血管生成蛋白的基因作為診斷分析的一部分，以檢測與編碼血管生成蛋白的核酸序列中突變相關的疾病或對這種疾病的易感性。
攜帶編碼血管生成蛋白的基因中突變體的個體，可通過各種方法在DNA水平檢測。用於診斷的核酸可得自患者細胞如來自血液，尿液，唾液，組織活檢和屍檢物質。可直接使用基因組DNA進行檢測，或經PCR酶促擴增(Saiki等，自然324163-166(1986))，之後進行分析。也可使用RNA或cDNA。例如，互補於編碼血管生成蛋白的核酸的PCR引物，可用於鑑別和分析其突變體。例如，可通過擴增產物與正常基因型相比大小發生變化而檢測缺失或插入。鑑別點突變可通過將擴增的DNA與放射標記的編碼血管生成蛋白的RNA雜交，或者，與特異於編碼血管生成蛋白的RNA的放射標記的反義DNA序列雜交而進行。完全匹配的序列可通過RNase A消化或通過熔點不同，從錯配的雙鏈體中區分。
基於DNA序列不同的遺傳測試，可通過檢測有或無變性劑的凝膠中DNA片段的電泳遷移率的變化而進行。少量序列缺失和插入可通過高分辨凝膠電泳觀測。不同序列的DNA片段可在變性甲醯胺梯度凝膠上區分，其中不同DNA片段的遷移率根據其特異熔解或部分熔解溫度阻滯在凝膠的不同位置(見例如Myers等，科學2301242(1985))。
在特異位置的序列變化也可通過核酸酶保護分析顯示，如RNase和S1保護或化學裂解方法(例如Cotton等，PNAS，美國854397-4401(1985))。
因此，可通過如以下方法檢測特異的DNA序列，如雜交，RNase保護，化學裂解，直接DNA測序或使用限制酶(例如限制性片段長度多態性(RFLP))及Southern印跡基因組DNA。
除了更常規的凝膠電泳和DNA測序，突變也可通過原位分析檢測。
本發明還涉及檢測各種阻滯中血管生成蛋白水平的變化的診斷分析，因為與正常對照組織樣品相比蛋白質的過表達，可檢測疾病或對疾病的易感性，例如異常細胞分化。本領域技術人員熟知檢測得自宿主的樣品中血管生成蛋白水平的分析方法，包括放射免疫分析，競爭結合分析，Western印跡分析，ELISA分析和「夾心」分析。ELISA分析(Coligan等，免疫學通用方法1(2)，第6章，(1991))包括製備通特異於血管生成蛋白抗原的抗體，優選單克隆抗體。另外製備抗此單克隆抗體的報導分子抗體。與此報導分子抗體吸附的是可檢測試劑如放射性，螢光試劑，在此實施例中是辣根過氧化物酶。自宿主取樣品，並在結合樣品中蛋白質的固體支持物上溫育，如聚苯乙烯平皿。然後用非特異性蛋白質如牛血清白蛋白溫育覆蓋平皿上任何游離蛋白結合位點。接著，將單克隆抗體在此平皿中溫育，在此期間單克隆抗體附著於吸附於聚苯乙烯平皿上的任何血管生成蛋白。用緩衝液衝洗掉所有未結合的單克隆抗體。將與辣根過氧化物酶連接的報導分子抗體置於平皿中，使報導分子抗體與結合血管生成蛋白的任何單克隆抗體結合。衝洗掉未吸附的報導分子抗體。然後將過氧化物酶底物加入平皿，在給定時間內發生的顏色量，與標準曲線相比，測定給定體積的患者樣品中血管生成蛋白數量。
可使用競爭分析，其中特異於血管生成蛋白的抗體附著於固體支持物。然後標記本發明的多肽，例如放射性標記，將得自宿主的樣品經過固體支持物，例如通過液體閃爍層析檢測的標記數量，與樣品中血管生成蛋白的數量相關。
「夾心」分析類似於ELISA分析。在「夾心」分析中，將血管生成蛋白數量的經過固體支持物並與附著於固體支持物的抗體結合。然後將第二種抗體與血管生成蛋白結合。然後將標記的並特異於第二種抗體的第三種抗體經過固體支持物，並與第二種抗體結合，然後定量。多核苷酸鑑別本發明的序列對染色體鑑別也有價值。此序列是靶特異性的，能與人的某一染色體上特異位點雜交。另外，當前還用於鑑別染色體上的特異位點。目前根據實際的序列數據(重複序列的多態性)，還幾乎不能對染色體進行定位。根據本發明對染色體進行DNA作圖，對那些與疾病有關的基因序列而言，是至關重要的第一步。
簡而言之，作圖通過從cDNA製備PCR引物(優選15-25bp)，可以對染色體的序列進行作圖。用計算機cDNA進行分析，可以迅速選擇在基因組DNA中不跨越一個以上外顯子的引物，否則使擴增過程變得複雜。然後將這些引物用於PCR篩選含有人染色體的體細胞雜合體。只有那些含有相當於引物的人類基因的雜合體才能產生擴增的片段。
體細胞雜交體的PCR作圖，在確定某個特異的染色體上的一個特異的DNA時，是非常快速的。按相同方式，藉助於來自特異染色體的一組片段或許多大的基因組克隆，可以獲得進一步定位。其它的類似染色體作圖策略包括原位雜交，用標記的流式染色體預篩選，並通過雜交預選，來構建體染色體的cDNA特異性文庫。
cDNA克隆與展開的有絲分裂中期的染色體進行螢光原位雜交(FISH)，可以只用一個步驟就可對染色體進行精確定位。此方法可與來自長度僅50或60bp的cDNA探針一起使用。此方法的綜述參見Verma等，人類染色體基本技術手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
某一序列一旦在染色體上精確作圖定位，該序列在染色體上的物理位置應符合遺傳作圖數據。這種數據見例如V.McKusick，人類的孟德爾遺傳(可以在網上從約翰霍普金斯大學的Welch醫學圖書館獲得)。在基因和已經在同一染色體的部位作圖定位的疾病之間的關係可以通過連鎖分析進行鑑定(物理位置相近的共遺傳)。
再者，有必要確定在發生異常和未發生異常的個體之間cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或全部發生異常的個體(而不是所有正常個體)中均發現存在突變，則此突變可能是導致疾病的因素。根據現有的物理作圖和異常作圖技術的解析度，將與某種疾病有關的，精確定位在染色體上的某個cDNA可能只是50-500種可能病因之一(假定100萬個鹼基對的作圖解析度和每20kb一個基因)。
對比正常和異常的個體通常包括首先尋找染色體中的結構變化，如缺失或移位，可以從展開的染色體上觀測或用基於此cDNA序列的PCR技術檢測。最後，證實在多個個體的基因的完整序列哪個存在突變，並把突變與多態性區別開。
通過以下實施例，將更易於理解本發明，以下實施例只是舉例說明而無限制之意。血管生成蛋白實施例實施例1血管生成蛋白的體外表達實施例1A血管生成蛋白的細菌表達和純化編碼血管生成蛋白的DNA序列可用相當於加工的蛋白(減去信號肽序列)的5』序列的PCR寡核苷酸引物，和相當於基因3』序列的載體擴增。將相當於基因的另外的核苷酸加入5』和3』序列中。可將此PCR產物克隆入pQE60(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA91311)。
限制酶位點相當於細菌表達載體pQE60上的限制酶位點。PQE60編碼抗生素抗性(Ampr)，細菌複製起點(ori)，IPTG-可調節啟動子操縱子(P/O)，核糖體結合位點(RBS)，6-組氨酸標記和限制酶位點。然後將pQE60用NcoI和BglII消化。將擴增的序列連接於pQE-60，並插入具有編碼組氨酸標記和核糖體結合位點(RBS)的序列的框架中。將連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)中通過Sambrook，J.等，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989)所述方法進行。M15/rep4含有質粒pREP4的多個拷貝，其表達1acI阻抑物並還授予卡那黴素抗性(Kanr)。通過在LB平板上的生長能力鑑別轉化體，並選擇氨苄青黴素/卡那黴素抗性菌落。分離質粒DNA，並通過限制分析證實。將含有所需構建體的克隆在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的液體LB培養基中生長過夜(O/N)。將O/N培養物以1∶100-1∶250比率接種大培養基。細胞生長至光密度600(O.D.600)為0.4-0.6。然後加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至終體積為1mM。IPTG通過滅活1acI阻抑物，清除P/O而提高基因表達。將細胞另外生長3-4修飾。然後通過離心收集細胞。將細胞粒狀沉澱溶解於離液劑6M鹽酸胍中。在澄清後，從此溶液中純化溶解的血管生成肽，在使含有6-組氨酸標記的蛋白質緊密結合的條件下，通過Nickel-螯合層析柱層析進行(Hochμli，E.等，層析雜誌411177-184(1984))。將蛋白質在6M鹽酸胍pH5.0中從層析柱洗脫，並為復性而調節為3M鹽酸胍，100mM磷酸鈉，10mM穀胱甘肽(還原的)和2mM穀胱甘肽(氧化的)。在此溶液中溫育12修飾後，將蛋白質用10mM磷酸鈉透析。
除了上述表達載體之外，本發明還包括一種稱為pHE4a的表達載體，其包含操縱性地連於編碼血管生成多肽的多核苷酸的噬菌體操縱基因和和啟動子因子(於1998年2月25日保藏於ATCC，登記號No209645)，此載體包含1)作為選擇標記的新黴素磷酸轉移酶基因，2)大腸桿菌複製起點，3)T5噬菌體啟動子序列，4)兩個1ac操縱基因序列，5)Shine-Delgamo序列，和6)乳糖操縱子阻抑物基因(1acIq)。複製起點(oriC)衍生自pUC19(LTI，Gaithersburg，MD)。此啟動子序列和操縱基因序列是合成的。
DNA可插入pHEa中，通過用XbaI，BamHI，XhoI或Asp718限制載體，將限制產物置於凝膠上，並分離較大的片段(填充片段應大約310bp)。DNA插入體是根據上述PCR方法，用具有NodI(5』引物)和XbaI，BamHI，XhoI或Asp718(3』引物)的限制位點的PCR引物產生。PCR引物是凝膠純化的並用相容酶限制的。將此插入體和載體根據標準方法連接。
在上述方法中可用基因工程化的載體代替以在細菌系統中表達蛋白質。實施例1B在杆狀病毒病毒系統中克隆和病毒血管生成蛋白將編碼全長血管生成蛋白的DNA序列用相當於基因5』和3』序列的PCR寡核苷酸引物擴增。
將擴增的序列用商購的試劑盒(Geneclean，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)從1％瓊脂糖凝膠中分離。然後將此片段用代表性的內切酶消化，並再在1％瓊脂糖凝膠上純化。此片段稱為F2。
將載體pA2(pVL941載體的修飾體，見下述)用於通過杆狀病毒病毒系統表達蛋白質(參見Summers，M.D.和Smith，G.E.1987，杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養方法手冊，德克薩斯州農業試驗基地報告No1555)。此表達載體含有苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)的強多角體啟動子，後接限制性內切酶BamHI和XbaI的識別位點。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用於有效聚腺苷酸化。為易於選擇重組病毒，將大腸桿菌的β-半乳糖苷酶以與多角體蛋白相同方向插入，後接多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列位於病毒序列的兩側，以經細胞介導同源重組共轉染的野生型病毒DNA。可用一些其它的杆狀病毒代替pA2，如pRG1，pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒學，17031-39)。
將質粒通過本領域已知方法用限制酶消化，並用小牛小腸磷酸酶去磷酸化。然後將DNA用商購的試劑盒(Geneclean，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)從1％瓊脂糖凝膠中分離。此載體DNA稱為V2。
將片段F2和去磷酸化的質粒V2用T4 DNA連接酶連接。然後轉化大腸桿菌DH5α細胞，並用代表性的限制酶鑑別含有質粒的細菌。克隆的片段的序列通過DNA測序取確定。
將5μg的質粒用1.0μg的商購線性化的杆狀病毒(BacμloGold杆狀病毒DNA，Pharmingen，San Diego，CA)共轉染(Felgner等，美國科學院院報847413-7417(1987))。
將1μg BacμloGold病毒DNA和5μg質粒，在含有50μl無血清Grace’s培養基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定平板的無菌孔中混合。然後加入10μl Lipofectin和90μ1 Grace’s培養基，混合，並在室溫溫育15分鐘。將轉染混合物滴加入Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL 1711)中，Sf9細胞種植於具有1ml無血清Grace’s培養基的35mm組織培養皿中。將此平皿前後搖動以混合新加入的溶液。然後將此平皿在27℃溫育5修飾。在轉染5修飾後，將溶液從平皿中除去，並加入補加10％胎牛血清的1ml的Grace’s昆蟲培養基。將平皿再放入溫育器中，並在27℃持續培養4天。
在4天後，收集上清並通過類似於Summers和Smith(如前)所述進行噬斑分析。使用經「Blue Gal」(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)修飾的瓊脂糖凝膠，其易於分離藍染的噬斑。(關於「噬斑分析」的詳細論述也可見於由Life Technologies Inc.，Gaithersburg所提供的昆蟲細胞培養和杆狀病毒學的使用指導，p9-10)。
在系列稀釋4天後，將病毒加入細胞中，並用Eppendorf移液管尖挑取藍染的噬斑。然後將含有重組病毒的瓊脂再懸浮於含有200μl Grace’s培養基的Eppendorf試管中。通過簡單離心除去瓊脂，並將含有重組杆狀病毒的上清用於種植於35mm平皿當中昆蟲細胞中。4天後，收集之下培養平皿的上清然後在4℃貯存。
將Sf9細胞在補加10％熱滅活的FBS的Grace’s培養基中。將細胞用重組杆狀病毒以感染複數(MOI)為2進行感染。6小時後，除去培養基並更換為減去甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培養基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)。42小時後，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(Amersham)。將細胞進一步溫育16小時，之後通過離心收集並通過SDS-PAGE和放射自顯影分析標記的蛋白質。
對純化的蛋白質的氨基末端的胺基酸序列進行微測序，可用於確定產生的血管生成蛋白的氨基末端序列。實施例1C在哺乳動物細胞中表達重組血管生成蛋白在COS細胞中克隆和表達質粒X-HA(X代表相應的血管生成蛋白)的表達，衍生自含有以下結構的載體pcDNA3/Amp(Invitrogen)1)SV40的複製起點，2)氨苄青黴素抗性基因，3)大腸桿菌複製起點，4)CMV啟動子後接多接頭區，SV40內含子和聚腺苷酸化位點。將編碼血管生成蛋白全部前體的DNA片段和在框架中融合於3』末端的HA標記，克隆入載體的多接頭區域，由此重組蛋白表達在CMV啟動子的指導下。HA標記相當於衍生自流感血凝素蛋白的表位，如前所述(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，細胞37767(1984))。HA標記與靶蛋白的融合可易於檢測具有識別HA表位的抗體的重組蛋白。
質粒構建策略如下所述編碼血管生成多肽的DNA序列是用兩種引物通過PCR構建的5』引物含有BamHI位點後接起自起始密碼子的18個核苷酸的編碼序列；3』引物含有互補於XhoI位點的序列，翻譯終止密碼子，HA標記和血管生成蛋白編碼序列的後18個核苷酸(不包括起始密碼子)。因此，PCR產物含有一個BamHI位點，編碼序列，後接融合於框架中的HA標記，翻譯終止密碼子後接HA標記和一個XhoI位點。
將經PCR擴增的DNA片段和載體pcDNA3/Amp用限制性內切酶消化並連接。將此連接混合物轉化入大腸桿菌SURE(得自Stratagene克隆系統，La Jolla，CA 92037)，將轉化培養物鋪板於氨苄青黴素培養平板上並選擇抗性集落。從轉化體中分離質粒DNA並通過限制分析檢測適當片段的存在與否。為表達重組血管生成多肽，將COS細胞用表達載體通過DEAE-DEXTRAN方法轉染(J.Ssmbrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989))。X-HA蛋白的表達通過放射標記和免疫沉澱方法檢測(E.Harlow，D.Lane，抗體實驗手冊，冷泉港實驗室出版社(1988))。將細胞在轉染2天後，用35S-半胱氨酸標記8小時。然後收集培養基並將細胞用去汙劑(RIPA緩衝液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)裂解(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。將細胞裂解物和培養基均用HA特異性單克隆抗體沉澱。沉澱的蛋白質在15％SDS-PAGE凝膠上分析。在其它哺乳動物細胞中克隆和表達血管生成多肽可在哺乳動物細胞中表達。一典型的哺乳動物表達載體含有介導mRNA轉錄的開始的啟動子因子，蛋白質編碼序列，和終止轉錄及轉錄物聚腺苷酸化所需的信號。其它因子包括增強子，Kozak序列和RNA剪接供體和受體兩側的間插序列。使用SV40的早期和晚期啟動子，逆轉錄病毒的長末端重複(LTRs)和巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子可達到高效轉錄，逆轉錄病毒如是RSV，HTLVI，HIVI。然而也可使用細胞因子(如人肌動蛋白啟動子)。
本發明實際應用的適當表達載體例如包括pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pRSVcat(37152ATCC)，pSV2DHFR(ATCC37146)，pBC12MI(ATCC67109)，pCMVSport2.0，和pCMVSport3.0。可使用的哺乳動物宿主包括人Hela，293，H9和Jurkat細胞，小鼠NIH3T3和C127細胞，Cos 1，Cos 7和CV1，quail QC1-3細胞，小鼠L細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
或者，血管生成多肽可在穩定細胞系中表達，穩定細胞系含有編碼整合入染色體中的血管生成多肽的多核苷酸。用可選擇的標記如DHFR，gpt，新黴素，潮黴素共轉染可鑑別和分離轉染的細胞。
編碼血管生成多肽的轉染的基因也可擴增以表達大量的編碼蛋白。DHFR(二氫葉酸還原酶)標記用於開發攜帶幾百個或幾千個相應基因拷貝的細胞系(見例如Alt，F.W.，等，生物化學雜誌2531357-1370(1978)；Hamlin，J.L和Ma，C.，生物化學及生物物理學學報，1097107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，生物技術964-68(1991))。其它有效的選擇標記是穀氨醯胺合酶(GS)(Murphy等，生物化學雜誌227277-279(1991)；Bebbington等，生物/技術10169-175(1992))。使用這些標記，將哺乳動物細胞生長於選擇性培養基中，並選擇最高抗性的細胞。這些細胞系含有整合入染色體的擴增的基因。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和NSO細胞通常用於生產蛋白質。
質粒pSV2-DHFR(ATCC登記號No37146)的衍生物，表達載體pC4(ATCC登記號No209646)和pC6(ATCC登記號No209647)含有Rous肉瘤病毒的強啟動子(LTR)(Cμllen等，分子和細胞生物學，438-447(1985年3月))，加上CMV-增強子的片段(Boshart等，細胞41521-530(1985))。如具有限制酶切割位點BamHI，XbaI和Asp718的多克隆位點，促進編碼血管生成多肽的基因的克隆。載體還含有3』內含子，鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化和終止信號，和在SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。
特別地，通過本領域已知方法，將質粒pC6或pC4用適當的限制酶消化，然後用牛小腸磷酸酶去磷酸化。然後從1％瓊脂糖凝膠中分離載體。
將編碼全長血管生成蛋白的cDNA序列，用相當於基因5』和3』序列的PCR寡核苷酸引物擴增。如果使用天然發生的信號序列產生分泌的蛋白質，，載體不需要第二種信號肽。或者，如果不使用天然發生的信號序列，載體可修飾為包括異源信號序列，以努力從細胞中分泌蛋白質(見例如WO 96/34891)。
將擴增的片段用適當的限制酶消化，並用商購的試劑盒在1％瓊脂糖凝膠上純化(Geneclean，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)。然後將分離的片段和去磷酸化的載體用T4 DNA連接酶連接。將大腸桿菌HB 101或XL-1Blue細胞轉化，並例如用限制酶分析鑑別含有插入質粒pC6或pC4的片段的細菌。
將缺失活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細胞用於轉染。將5μg的表達質粒pC6或pC4用0.5μg的質粒pSVneo通過脂染法共轉染(Felgner等，如前)。質粒pSV-2-neo含有顯性可選擇標記，來自Tn5的neo基因，Tn5編碼授予一組抗生素抗性的酶，包括G418。將細胞種植於補加1mg/ml G418的α負MEM中。2天後，將細胞用胰蛋白酶消化，並種植於補加10，25或50ng/ml氨甲喋呤+1mg/mlG418的α負MEM中的雜交瘤克隆平板中(Greiner，德國)。在大約10-14天後，將單個克隆用胰蛋白酶消化，然後種植於具有不同濃度氨甲喋呤(50，100，200，400，800nM)的6孔培養皿或10ml燒瓶中。然後將在最高濃度氨甲喋呤生長的克隆移至新的含有更高濃度氨甲喋呤(1uM，2uM，5uM，10mM，20mM)的6孔平板中。重複相同步驟直至獲得在100-200uM濃度氨甲喋呤中生長的克隆。例如通過SDS-PAGE和Western印跡或通過反向HPLC分析方法分析血管生成多肽的表達。實施例2分離編碼血管生成多肽的基因組克隆將人基因組P1文庫(基因組系統公司)根據Sambrook所述方法通過PCR篩選，選擇使用cDNA序列分別相當於SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的引物。實施例3血管生成多肽的組織分布血管生成蛋白的mRNA表達的組織分布，通過Sambrook所述Northern印跡分析起點。例如，將特異於編碼相應血管生成蛋白的基因的探針，用P32通過rediprimeTMDNA標記系統(Amersham LifeScience)標記，根據說明書使用。在標記後，根據說明書PT1200-1，將探針用CHROMA SPIN-100TM層析柱(ClontechLaboratories，Inc.)純化。然後將純化的探針用於檢測各種人體組織的mRNA表達情況。
將含有各種人體組織(H)或人免疫系統組織(IM)的多組織Northern(MTN)(Clontech)印跡，根據說明書PT1190-1，用標記的探針通過ExpressHybTM雜交液(Clontech)進行檢測。在雜交及衝洗後，計數印跡並在-70℃暴露於膠片過夜，根據標準方法研究此膠片。實施例4血管生成蛋白的染色體圖根據SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的5』末端序列，分別設計寡核苷酸引物系列。這種引物優選跨越大約100個核苷酸。然後將這種引物系列在以下條件下用於聚合酶鏈反應30秒95℃；1分鐘56℃；1分鐘70℃。將此循環重複32次，然後進行一次5分鐘70℃循環。除了含有個體染色體或染色體片段的體細胞雜交體組之外，將人，小鼠和倉鼠DNA用作模板。在8％聚丙烯醯胺凝膠或3.5％瓊脂糖凝膠上分析此反應。染色體圖通過在特殊體細胞雜交體中存在一大約100 bp的PCR片段而確定。實施例5從包含體中純化血管生成多肽當血管生成多肽以包含體形式存在時，以下方法可用於純化在大腸桿菌中表達的血管生成多肽。除非特別說明，以下所有步驟均在4-10℃進行。
在大腸桿菌發酵生產階段完成基礎上，將細胞培養物冷卻至4-10℃，並通過在15000rpm連續離心收集細胞(Heraeus Sepatech)。在每單位重量細胞糊產生期望量的蛋白質，和所需純化的蛋白質的數量的基礎上，將適量(重量)的細胞糊懸浮於含有100Mm Tris，50mM EDTA的緩衝液pH7.4中。用高剪切混合器將細胞分散為均勻的懸浮液。
將細胞在4000-6000psi通過微液化儀(Microfuidics，Corp.或APV Gaμlin，Inc.)溶液兩次而裂解。然後將此均勻混合物與NaCl溶液混合至終濃度為0.5M NaCl，隨後在7000×g離心15分鐘。所得沉澱再用0.5M NaCl，100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4衝洗。
將所得經衝洗的包含體在1.5M鹽酸胍(GuHCl)中溶解2-4小時。在7000×g離心15分鐘後，將沉澱棄去並將含有多肽的上清在4℃溫育過夜，以進行進一步GuHCl提取。
在高速離心(30000×g)除去可溶顆粒後，通過將GuHCl提取物與20體積含有50mM鈉，pH4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的緩衝液經用力攪拌快速混合，將GuHCl溶解的蛋白質再摺疊。將再摺疊的稀釋的蛋白質溶液不混合在4℃保持12小時，之後進行進一步純化步驟。
為澄清再摺疊的多肽溶液，使用預先製備的裝備具有適當表面積的0.16um濾膜的切向過濾單位(如Filtron)，該單位用40mM乙酸鈉pH6.0平衡。將過濾的樣品加樣於陽離子交換樹脂上(如PorosHS-50，Perseptive Biosystems)。將次層析柱用40mM乙酸鈉，pH6.0衝洗，並用在相同緩衝液中250mM，500mM，1000mM，和1500mMNaCl梯度洗脫。連續監測流出物在280nm的吸光度。收集級分並通過SDS-PAGE進一步分析。
然後集合含有血管生成多肽的級分，並與4體積水混合。將稀釋的樣品加樣於預先製備的強陰離子(Poros HQ-50，PerseptiveBiosystems)和弱陰離子(Poros CM-20，Perseptive Biosystems)交換樹脂的一前一後層析柱中。將層析柱用40mM乙酸鈉，pH6.0平衡。將這兩個層析柱均用40mM乙酸鈉，pH6.0，200mM NaCl衝洗。然後將CM-20層析柱用10層析柱體積的以從0.2M NaCl，50mM乙酸鈉，pH6.0至1.0M NaCl，50mM乙酸鈉，pH6.5的線性梯度洗脫。在恆定A280監測流出物下收集級分。然後集合含有多肽的級分(例如通過16％SDS-PAGE確定的)。
在上述再摺疊和純化步驟之後，所得血管生成多肽應呈現高於95％純度。當加樣5μg純化的蛋白質時，從Commassie藍染的16％SDS-PAGE凝膠中應觀測到無主要汙染物的條帶。也可對純化的血管生成蛋白進行內毒素/LPS汙染測試，典型地，根據LAL分析LPS含量少於0.1ng/ml。實施例6構建N-末端和/或C-末端缺失突變體以下一般方法可用於克隆血管生成蛋白的N-末端或C-末端缺失突變體。一般地，分別從SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的多核苷酸的所需5』和3』位衍生兩種大約15-25個核苷酸的寡核苷酸引物。引物的5』和3』位是基於編碼血管生成多肽的所需多核苷酸片段確定的。如果需要，將一起始和終止密碼子分別加入5』和3』引物中，以表達由此多核苷酸片段編碼的血管生成多肽片段。
也可將含有限制位點，以促進編碼血管生成多肽的多核苷酸片段在所需載體中克隆的其它核苷酸，加入5』和3』引物序列中。編碼血管生成多肽的多核苷酸片段擴增自基因組DNA或cDNA克隆，使用適當的PCR寡核苷酸引物及本文所述或本領域已知的條件。由本發明適當多核苷酸片段編碼的血管生成多肽片段可以與全長多肽相同方式表達和純化，儘管由於特別片段和全長多肽之間化學和物理性質的不同而必需進行常規修飾。
將擴增的多核苷酸片段和表達載體用識別引物中位點的限制酶消化。然後將消化的多核苷酸連接在一起。將編碼血管生成多肽的多核苷酸片段插入限制表達載體中，優選以將血管生成多肽片段編碼區置於啟動子的下遊。將此連接混合物轉化入感受態大腸桿菌細胞中，使用標準方法及本文實施例所述方法轉化。從抗性集落中分離質粒DNA，並通過限制性分析，PCR和DNA測序確定克隆的DNA的相同性。實施例7血管生成多肽的蛋白質融合血管生成多肽優選融合於其它蛋白質。這些融合蛋白質可用於各種應用中。例如，血管生成多肽與His標記，HA標記，蛋白質A，IgG結構域，和麥芽糖集合蛋白的融合促進純化。(見實施例5；也見於EP A 394827；Traunecker等，自然33184-86(1988))。相似地，與IgG-1，IgG-3，和白蛋白的融合提高在體內的半衰期。融合於血管生成多肽的核定位信號可將蛋白質定向於特異的亞細胞定位，而共價異源二聚體或同源二聚體可提高或降低融合蛋白的活性。融合蛋白還可產生具有一種以上功能的嵌合分子。最後，融合蛋白與非融合蛋白相比，可提高融合蛋白的溶解性和/或穩定性。上述所有類型的融合蛋白可通過以下修改方法或實施例中所述的方法產生，修改方法概述了多肽與IgG分子的融合。
簡而言之，人IgG分子的Fc部分可通過PCR擴增，使用跨越下述序列5』和3』末端的引物進行。這些引物還應具有常規限制酶位點，以易於克隆入表達載體，優選哺乳動物表達載體中。
例如，如果使用pC4(登記號No209646)，人Fc部分可連接於BamHI克隆位點中。注意3』BamHI位點應破壞。接著，含有人Fc部分的載體再用BamHI限制，線性化載體，並將通過PCR分離的編碼血管生成多肽的多核苷酸連接於此BamHI位點中。注意多核苷酸不用終止密碼子克隆，否則不產生融合蛋白。
如果天然發生的信號序列用於產生分泌的蛋白質，pC4不需要第二種信號肽。或者，如果不使用天然發生的信號序列可將載體修飾為包括異源信號序列(見例如WO96/34891)。人IgG Fc區域GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO 30)。實施例8抗體的產生實施例8A雜交瘤方法本發明的抗體可通過各種方法製備。(見通用方法，第二章)。這些方法之一例如是將表達血管生成多肽的細胞施用於底物，以誘導含有多克隆抗體的血清產生。在一優選的實施方案中，製備血管生成蛋白製品並純化以使其基本沒有天然的汙染物。然後將這種製品導入動物體以產生較高特異活性的多克隆抗血清。
在最優選的方法中，本發明的抗體是單克隆抗體(或其蛋白質結合片段)。這種單克隆抗體可以用雜交瘤方法製備(Kohler等，自然256495(1975)；Kohler等，歐洲免疫學雜誌6511(1976)；Kohler等，歐洲免疫學雜誌6292(1976)；Hammerling等，單克隆抗體和T細胞雜交瘤，Elsevier，N.Y.，pp563-681(1981))。通常地，這種方法包括用血管生成多肽或更優選用表達分泌的血管生成多肽的細胞，免疫接種動物(優選小鼠)。這種細胞可在任何適當組織培養基中培養；然而，優選將細胞在Earle’s修改的Eagle’s培養基中培養，該培養基補加了10％小牛血清(在大約56℃滅活)，10g/l非必需胺基酸，大約1000U/ml青黴素，和大約100μg/ml鏈黴素。
提取這種小鼠的脾細胞並用適當骨髓瘤細胞系融合。根據本發明可使用任何適當的骨髓瘤細胞系；然而優選使用得自ATCC的親代骨髓瘤細胞系(SP2O)。在融合後，將所得雜交瘤細胞選擇性保持在HAT培養基中，然後通過如Wands等所述限制性稀釋克隆(Gastroenterology80225-232(1981))。然後分析通過這種選擇獲得的雜交瘤細胞，以鑑別分泌能結合血管生成多肽的抗體的克隆。或者，能結合血管生成多肽的其它抗體可用抗獨特型抗體以兩步方法產生。這種方法中，抗體是其自身抗原，因此可能獲得結合另一種抗體的抗體。根據這種方法，將蛋白質特異性抗體用於免疫接種動物，優選小鼠。然後將這種動物的脾細胞用於產生雜交瘤細胞，並篩選雜交瘤細胞以鑑別產生抗體的克隆，其結合血管生成蛋白特異性抗體的努力可由血管生成蛋白阻斷。這種抗體包括血管生成蛋白特異性抗體的抗獨特型抗體，並可用於免疫接種動物以誘導進一步的血管生成蛋白特異性抗體的形成。
應意識到，根據本文所述方法，可使用本發明抗體的Fab和F(ab』)2和其它片段。這種片段典型是通過蛋白酶切產生的，使用如木瓜酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab』)片段)。或者，結合分泌的血管生成蛋白的片段可通過重組DNA方法或合成化學產生。
為在人體內使用抗體，優選使用「人化的」嵌合單克隆抗體。這種抗體可用衍生自產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞的遺傳構建體產生。本領域已知產生嵌合抗體的方法。(參見Morrison，科學2291202(1985)；Oi等，生物技術4214(1986)；Cabilly等，美國專利No4816567；Taniguchi等等，EP171496；Morrison等，EP173494；Neuberger等，WO8601533；Robinson等，WO8702671；Boμlianne等，自然312643(1984)；Neuberger等，自然314268(1985))。實施例8B從scFvs文庫中分離直接抗血管生成多肽的抗體片段將分離自人PBLs的天然發生的V-基因，構建入含有抗血管生成多肽抗體片段的大文庫中，其含有抗血管生成多肽反應性，供體可以或不暴露於此文庫(見例如美國專利5885793，以其全文併入參考)。文庫的拯救
scFvs文庫構建自人PBLs的RNA，如WO92/01047所述。為拯救展示抗體片段的噬菌體，將大約109個攜帶噬菌粒的大腸桿菌用於接種含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青黴素的50ml 2xTY(2xTY-AMP-GLU)，並搖動生長至O.D.為0.8。將5ml此培養物用於接種50ml的2xTY-AMP-GLU，加入2×108TU的δ基因3輔助子(M13δ基因III，見WO921047)，在37℃將此培養物不搖動培養45分鐘，然後在37℃將此培養物搖動培養45分鐘。將此培養物在4000rpm離心10分鐘，並將沉澱再懸浮於2升含有100μg/ml氨苄青黴素和50μg/ml卡那黴素的2xTY中，並生長過夜。如WO92/01047所述製備噬菌體。
如下製備M13δ基因M13δ基因III輔助噬菌體不編碼基因III蛋白，因此展示噬菌粒的抗體片段具有結合抗原的較強親和力。感染性M13δ基因III顆粒是通過將輔助噬菌體在具有pUC19衍生物的細胞中生長而產生的，pUC19衍生物在噬菌體形態發生期間提供野生型基因III蛋白。將培養物在37℃不搖動培養1小時，然後在37℃搖動培養4小時。將細胞上下轉動(IEC-Centra8，4000revs/分10分鐘)，再懸浮於300ml含有100μg氨苄青黴素/ml和25μg卡那黴素/ml的2xTY肉湯中(2xTY-AMP-KAN)，並在37℃搖動培養過夜。純化噬菌體顆粒並通過兩次PEG-沉澱從培養基中濃縮(Sambrook等，1990)，在懸浮於2ml PBS中，並經過0.45um濾膜(Minisart NML；Sartorius)過濾，以提供終濃度為大約1013轉導單位/ml(氨苄青黴素抗性克隆)。文庫的淘選將免疫試管(Nunc)在PBS中用4ml的100μg/ml或10μg/ml的本發明多肽包被過夜。將試管用2％Marvel-PBS在37℃封阻2小時，然後在PBS中衝洗3次。將大約1013TU噬菌體用於試管中，並在室溫上下翻動溫育30分鐘，然後靜置1.5小時。將試管用PBS 0.1％Tween-20衝洗10次，及用PBS衝洗10次。通過加入1ml 100mM三乙胺及上下翻動15分鐘，之後將此溶液立即用0.5ml 1.0MTris-HCl，pH7.4中和，從而洗脫噬菌體。然後通過用細菌將洗脫的噬菌體在37℃溫育30分鐘，而將噬菌體用於感染10ml的對數中期大腸桿菌TG1。然後將大腸桿菌鋪板於含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青黴素的TYE平板上。所得細菌文庫然後用δ基因III輔助噬菌體拯救，以製備進行下一選擇循環的噬菌體。然後重複4次親和純化，在第3和4次循環中用PBS，0.1％Tween-20衝洗試管增加至20次，用PBS衝洗20次。結合體的定性將在第3和第4次選擇中洗脫的噬菌體用於感染大腸桿菌2151HB，並從單獨的集落中生產可溶的scFv(Marks等，1991)進行分析。用在50mM碳酸氫鹽中10pg/ml的本發明多肽包被的微滴定平板進行ELISAs。在ELISA中是陽性的的克隆通過PCR指紋分析(見WO92/01047)然後通過測序而定性。實施例9產生血管生成蛋白進行篩選分析以下方法產生了一種含有被測試的血管生產多肽的上清。此上清然後可用於實施例14-21所述的篩選分析中。
首先，將聚-D-賴氨酸(644587 Boehringer-Mannheim)母液(在PBS中1mg/ml)在PBS中以1∶20稀釋(w/o鈣或鎂17-516FBiowhittaker)，使反應液為50μg/ml。將200μl此溶液加入每個孔中(24孔平板)，在室溫溫育20分鐘。確保此溶液分布於每個孔(注可使用在每個通道均具有尖端的12通道移液器)。抽吸出聚-D-賴氨酸溶液，並用1mlPBS(磷酸鹽緩衝鹽水)漂洗。PBS應保持在孔中，直至鋪板細胞之前，平板可以是預先用聚—賴氨酸包被兩周以上時間的。
在5ml DMEM(Dμlbecco’s改進的Eagle培養基)(具有4.5G/L葡萄糖和L-穀氨醯胺(12-604F Biowhittaker))/10％熱滅活的FBS(14-503F Biowhittaker)/1×Penstrep(17-602E Biowhittaker)中，鋪板293T細胞(不攜帶P+20細胞)。使這些細胞生長過夜。
第二天，在無菌溶液池中將以下物質混合在一起300μlLipofectamine(18324-012 Gibco/BRL)和5ml Optimem I(31985070Gibco/BRL)/96孔平板。用小體積的多通道移液器，在每個孔中加入50μl Lipofectamine-Optimem I混合物。將移液器輕輕上下翻動以混合。在室溫溫育15-45分鐘。在大約20分鐘後，用多通道移液器在每個孔中加入150μl Optimem I。作為對照，將一個平板的缺失插入體的載體DNA用每種轉染方法轉染。
優選地，轉染應通過以下標記組進行。通過標記組，時間減半，且細胞在PBS上不需花費太多時間。首先，一個人(A)從細胞的4個24孔平板中抽吸出培養基，然後另一個人(B)用0.5-1ml PBS漂洗每個孔。然後A抽吸出PBS漂洗液，B用每個通道均具有尖端的12-通道移液器，首先在排列在24孔平板中的奇數孔然後在偶數孔中加入200μl的DNA/Lipofectamine/Optimem I複合物。在37℃溫育6小時。
當溫育細胞時，製備適當的培養基在具有1×penstrep的DMEM中1％BSA，或HGSCHO-5培養基(116.6mg/L CaCl2(無水)；0.00130mg/L CuSO4-5H2O；0.050mg/L Fe(NO3)3-9H2O；0.417mg/LFeSO4-7H2O；311.80mg/L KCl；28.64mg/L MgCl2；48.84mg/LMgSO4；6995.50mg/L NaCl；2400.0mg/L NaHCO3；62.50mg/LNaH2PO4-H2O；71.02mg/L Na2HPO4；0.4320mg/L ZnSO4-7H2O；0.002mg/L花生四烯酸；1.022mg/L膽固醇；0.070mg/L DL-α-生育酚-乙酸鹽；0.0520mg/L亞油酸；0.010mg/L亞麻酸；0.010mg/L豆蔻酸；0.010mg/L油酸；0.010mg/L棕櫚酸；100mg/L Pluronic F-68；0.010mg/L硬脂酸；2.20mg/L Tween 80；4551mg/L D-葡萄糖；130.85mg/ml L-丙氨酸；147.50mg/ml L-鹽酸精氨酸；7.50mg/ml L-天冬醯胺-H2O；6.65mg/ml L-天冬氨酸；29.56mg/ml L-半胱氨酸-HCl-H2O；31.29mg/ml L-半胱氨酸-2HCl；7.35mg/ml穀氨酸；365.0mg/ml L-穀氨醯胺；18.75mg/ml甘氨酸；52.48mg/ml L-組氨酸-HCl-H2O；106.97mg/ml L-異亮氨酸；111.45mg/ml L-亮氨酸；163.75mg/ml L-鹽酸賴氨酸；32.34mg/ml L-甲硫氨酸；68.48mg/ml L-苯丙氨酸；40.0mg/ml L-脯氨酸；26.25mg/ml L-絲氨酸；101.05mg/ml L-蘇氨酸；19.22mg/ml L-色氨酸；91.79mg/ml L-Tryrosine-2Na-2H2O；和99.65mg/ml L-纈氨酸；0.0035mg/L生物素；3.24mg/L D-泛酸鈣；11.78mg/L氯化膽鹼；4.65mg/L葉酸；15.60mg/Li-肌醇；3.02mg/L煙酸醯胺；3.00mg/L鹽酸吡哆醛；0.031mg/L吡哆醇；0.319mg/L核黃素；3.17mg/L鹽酸硫胺素；0.365mg/L胸苷；0.680mg/L VB12；25mM HEPES緩衝液；2.39mg/L次黃嘌呤鈉；0.105mg/L硫辛酸；0.081mg/L腐胺鈉-2HCl；55.0mg/L丙酮酸鈉；0.0067mg/L亞硒酸鈉；20uM乙醇胺；0.122mg/L檸檬酸鐵；41.70mg/L與亞油酸複合的甲基-B-環糊精；33.33mg/L與油酸複合的甲基-B-環糊精；；10mg/L與retinal acetate複合的甲基-B-環糊精。用2mm穀氨醯胺和1×penstrep將同滲容摩調節為327mOsm。(10％BSA母液是將100gm BSA(81-068-3 Bayer)溶解於1L DMEM中)。過濾培養基並收集50μl在15ml聚苯乙烯錐形瓶中進行內毒素分析。在溫育末期優選通過標記組終止轉染反應。一個人(A)抽吸出轉染培養基，同時另一個人(B)在每個孔中加入1.5ml適當培養基。根據使用的培養基在37℃溫育45或72小時1％BSA溫育45小時或CHO-5溫育72小時。
在第四天，用300μl多通道移液器將600μl等分置於一個1ml深孔平板中，並將剩餘上清置於2ml深孔中。然後將取自每個孔的上清用於實施例10-12所述的分析中。
特別指出的是，當在下述使用上清的任何分析中獲得活性時，此活性可直接源自血管生產多肽(如作為分泌的蛋白質)，或通過血管生產多肽誘導其它蛋白質表達，然後分泌入上清中。因此，本發明還提供了在上清中鑑別特徵在於在特殊分析中有活性的蛋白質。實施例10鑑別小分子濃度和膜通透性變化的篩選分析配體與受體的結合已知改變小分子的胞內水平，如鈣離子，鉀離子，鈉離子和pH，以及改變膜電壓。這些改變在分析中可測定，以鑑別與特殊細胞受體結合的上清。儘管以下方法闡述了一種鈣離子分析，但可對此方法加以簡單修改以檢測鉀離子，鈉離子，pH，膜電壓，或可通過螢光探針檢測的任何其它小分子的變化。
以下分析使用螢光顯影平板Reader(FLIPR)，測定結合小分子螢光分子(分子探針)中的改變。明顯地，可使用檢測小分子的任何螢光分子代替在此使用的鈣螢光分子，fluo-3。
就貼壁細胞而言，將細胞以10000-20000個細胞/孔種植於Co-star黑色透明底的96孔平板中。將此平板在CO2溫育器溫育20小時。在Biotek衝洗器中，將貼壁細胞用200μl HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)衝洗兩次，在最終衝洗後剩下100μl緩衝液。
1mg/ml fluo-3母液是在10％ pluronic acid DMSO中產生的。為用fluo-3加樣細胞，將50μl的12μg/ml fluo-3加入每個孔中。將平板在溫育器中在37℃溫育60分鐘。將平板在Biotek衝洗器中用剩餘的100μl緩衝液HBSS衝洗4次。
就非貼壁細胞而言，將細胞從培養基中旋下。將細胞在50ml錐形試管中用HBSS再懸浮為2-5×106個細胞/ml。將在10％ pluronicacid DMSO中4μl的1mg/ml fluo-3溶液加入每ml細胞懸浮液中。任何將試管置於37℃水浴中30-60分鐘。用HBSS將細胞衝洗兩次，再懸浮為1×106個細胞/ml，並分散於100μl/孔的微平板中。將此平板在1000rpm離心5分鐘。然後將此平板在Denley細胞衝洗器中用200μl衝洗一次，隨後經抽吸至終體積為100μl。
就非細胞基礎的分析而言，每個孔含有螢光分子如fluo-3。將上清加入孔中，並檢測螢光變化。
為測定胞內鈣離子的螢光性，將FLIPR設定為以下參數(1)系統gain為300-800mW；(2)曝光時間為0.4秒；(3)Camera F/stop為F/2；(4)激發光譜為488nm；(5)發射光譜為530nm；及(6)加入樣品為50μl。在530nm發射增加表明由分子所致的胞外信號結果，所述分子是血管生成多肽或由血管生成多肽誘導的分子，其導致胞內鈣離子濃度增加。實施例11鑑別酪氨酸激酶活性的篩選分析蛋白質酪氨酸激酶(PTK)代表跨膜和胞質激酶的不同組群。在受體蛋白質酪氨酸激酶(RPTK)中是一系列促分裂原性和代謝性生長因子的受體，包括PDGF，FGF，EGF，NGF，HGF和胰島素受體亞家族。另外有一個PDTKs的大家族的相應配體還未知。PDTKs的配體主要包括分泌的小蛋白質，但還包括膜結合的和胞外基質蛋白。
通過配體激活RPTK包括配體介導的受體二聚體化，導致受體亞單位轉磷酸化，並活化胞質酪氨酸激酶。胞質酪氨酸激酶包括src家族的受體相關的酪氨酸激酶(如src，yes，lck，lyn，fyn)，及非受體連接的和胞質蛋白質酪氨酸激酶，如Jak家族，其成員介導由受體細胞因子超家族(例如白細胞介素，幹擾素，GM-CSF和Leptin)引發的信號轉導。
由於能刺激酪氨酸激酶活性的已知因子有很多，因此感興趣鑑別血管生成多肽或由血管生成多肽誘導的分子是否能激活酪氨酸激酶信號轉導途徑。因此，設計以下方法鑑別能激活酪氨酸激酶信號轉導途徑的這種分子。
將靶細胞(如原始角質形成細胞)以大約25000個細胞/孔的密度，種植於購自Nalge Nunc(Naperville，IL)的96孔Loprodyne沉默篩選平板中。將平板用100％乙醇漂洗30分鐘兩次而滅菌，用水漂洗並乾燥過夜。將一些平板用購自Sigma Chemicals(St.Louis，MO)的100ml的細胞培養梯度I型膠原(50mg/ml)，明膠(2％)或聚賴氨酸(50mg/ml)，或購自Becton Dickinson(Bedford，MA)的10％Matrigel，或牛血清包被2小時，用PBS漂洗並貯存在4℃。對在這些平板中生長的細胞進行分析，可通過將細胞以5000個細胞/孔種植於生長培養基中，並在48小時後使用alamarBlue間接確定細胞數目進行，alamarBlue由Alamar Biosciences公司(Sacramento，CA)生產。將得自Becton Dickinson(Bedford，MA)的Falcon平板蓋#3071蓋在Loprodyne沉默篩選平板上。Falcon MicrotestIII細胞培養平板也可用於一些增殖試驗中。
為製備提取物，將A431細胞種植於Loprodyne平板的尼龍膜上(20000/200ml/孔)，並在完全培養基中培養過夜。將細胞通過在無血清的基本培養基中溫育24小時而靜止。在用EGF(60ng/ml)或50μl實施例12中製備的上清處理5-20分鐘後，除去培養基，在每個空中加入100ml提取緩衝液(20mM HEPES pH7.5，0.15M NaCl，1％Triton X-100，0.1％SDS，2mMNa3VO4，2mM Na4P2O7，和得自Boeheringer Mannheim(Indianapolis，IN)蛋白酶抑制劑的混合物(#1836170))，將平板在4℃在旋轉搖動器中搖動5分鐘。然後將平板置於真空轉移多支管中，並用真空室將提取物通過每個孔的0.45mm膜底過濾。將提取物收集在真空多支管底的96孔捕獲/分析平板中，並立即置於冰上。為很多通過離心澄清的提取物，在用去汙劑溶解5分鐘後，除去每個孔的內容物，並在4℃以16000×g離心15分鐘。
對經過濾的提取物測試酪氨酸激酶活性的水平。儘管已知許多檢測酪氨酸激酶活性的方法，但本發明仍闡述了一種方法。
通常地，上清中酪氨酸激酶活性，是通過確定其對特異底物(生物素醯化的肽)上酪氨酸殘基的磷酸化能力而評定的。所用生物素醯化的肽包括PSK1(相當於細胞分裂激酶cdc2-p34的6-20位胺基酸)，和PSK2(相當於胃泌素的1-17位胺基酸)。這兩種肽均是酪氨酸激酶的底物，並可得自Boehringer Mannheim。酪氨酸激酶反應通過依次加入以下成分而設立。首先，加入10μl的5uM生物素醯化的肽，然後加入10μl ATP/Mg2+(5mM ATP/50mM MgCl2)，接著加入10μl的5×分析緩衝液(40mM鹽酸咪唑，pH 7.3，40mMβ-甘油磷脂，1mM EGTA，100mM MgCl2，5mM MnCl2，0.5mg/mlBSA)，然後加入5μl釩酸鈉(1mM)，接著加入5μl水。輕輕混合組分，並將此反應混合物在30℃預溫育2分鐘。加入10μl對照酶或過濾的上清開始反應。
然後通過加入10μl的120mM EDTA終止酪氨酸激酶分析反應，並將反應物置於冰上。
通過將50μl反應混合物等分移至微滴定平板(MTP)組件中，並在37℃溫育20分鐘，從而確定酪氨酸激酶活性。這使鏈親和素包被的96孔平板與生物素醯化的肽相關。用300μl/孔PBS將MTP組件衝洗4次。接著在每個孔中加入75μl與辣根過氧化物酶綴合的抗磷酸酪氨酸抗體(抗P-Tyr-POD(0.5u/ml))，並在37℃溫育1小時。如上衝洗此孔。
接著加入100μl過氧化物酶底物溶液(Boehringer Mannheim)，並在室溫溫育至少5分鐘(至30分鐘)。用ELISA讀器測定樣品在405nm的吸光度。用ELISA讀器定量確定結合的過氧化物酶活性水平，並反映酪氨酸激酶活性的水平。實施例12鑑別磷酸化活性的篩選分析作為對實施例11所述的蛋白質酪氨酸激酶活性分析的潛在改變和/或完善分析，可使用檢測主要胞內信號轉導中間物的活化(磷酸化)的分析。例如，如以下所述的一種特殊分析可檢測Erk-1和Erk-2激酶的酪氨酸磷酸化。然而，其它分子的磷酸化，如Raf，JNK，p38MAP，Map激酶(MEK)，MEK激酶，Src，肌特異性激酶(MuSK)，IRAK，Tec和Janus，以及任何其它磷酸絲氨酸，磷酸酪氨酸或磷酸蘇氨酸分子，可通過在以下分析中用Erk-1或Erk-2取代這些分子而檢測。
特別地，分析平板是通過用0.1ml蛋白質G(1μg/ml)在室溫包被96孔ELISA平板2小時而產生的。將平板用PBS漂洗並用3％BSA/PBS在室溫封阻1小時。然後將蛋白質G平板用抗Erk-1和Erk-2的兩個商業單克隆抗體(100ng/ml)在室溫處理1小時(SantaCruz Biotechnology)。(為檢測其它分子，可將此步驟通過替換檢測任何上述分子的單克隆抗體而簡單修改)。在用PBS漂洗3-5次後，將平板在4℃貯存直至使用。
將A431細胞以20000/孔種植於96孔Loprodyne濾板中，並在生長培養基中培養過夜。將細胞在基本培養基(DMEM)中飢餓48小時，然後用EGF(6ng/ml)或50μl實施例12中所得上清處理5-20分鐘。然後將細胞溶解並將提取物直接過濾到分析平板中。
在用在室溫溫育1小時後，將孔再次漂洗。作為陽性對照，用商業製備的MAP激酶(10ng/ml)代替A431提取物。然後將平板用商業多克隆(兔)抗體(1μg/ml)在室溫處理1小時，所用抗體特異識別Erk-1和Erk-2激酶的磷酸化表位。此抗體是通過標準方法生物素醯化的。然後用Wallac DELFIA設備中的銪鏈親和素和銪螢光增強劑連續溫育，確定結合的多克隆抗體數量。高於背景的螢光信號表明血管生成多肽或由血管生成多肽誘導的分子的磷酸化。實施例13確定編碼血管生成多肽的基因中變化的方法分離自具有相應表型(如疾病)的全部家族或個體病人的RNA是分離的。然後通過本領域已知方法從這些RNA樣品中產生cDNA(見Sambrook)。將此cDNA用作PCR模板，使用編碼代表性血管生成多肽的核苷酸系列中相應的區域作引物。設定PCR條件為35次循環95℃ 30秒，52-58℃60-120秒，70℃ 60-120秒，使用Sidransky，D.等，科學252706(1991)所述的緩衝液。
然後使用在其5』末端用T4多核苷酸激酶標記的引物，應用SequiTherm聚合酶(Epicentre Technologies)，對PCR產物測序。對編碼血管生成多肽的基因的選擇的外顯子的內含子—外顯子邊界也進行確定，並分析基因組PCR產物以證實此結果。將攜帶編碼血管生成多肽的基因中可疑突變的PCR產物克隆並測序，以證實直接測序的結果。
將編碼血管生成多肽的基因的PCR產物克隆入T-有尾載體中，如Holton，T.A.和Graham，M.W.，核酸研究191156(1991)所述，並用T7聚合酶(United States Biochemical)測序。感染的個體通過編碼血管生成多肽的基因中的突變而鑑別，未感染的個體中沒有此突變。
通過確定編碼血管生成多肽的基因中的變化，還觀測到基因組的重新排列。框架實施例2分離的基因組克隆是用洋地黃毒苷脫氧—尿苷5』-三磷酸(Boehringer Manheim)和FISH切口平移的，如Johnson，Cg.等，細胞生物學方法3573-99(1991)所述進行。用標記的探針進行雜交是用大量的特異雜交編碼血管生成多肽的基因組基因座的人cot-1 DNA進行的。
用4，6-二氨基-2-苯基lidole和亞丙基碘化物對染色體進行對染，產生C-和R-帶的組合。使用三帶濾膜系列(ChromaTechnology，Brattleboro，VT)，組合冷卻的偶聯電荷的照相機(Photometrics，Tucson，AZ)和可變發射波長濾膜(Johnson，Cv.等，Genet.Anal.Tech.App1.875(1991))，可獲得序列對比圖像的精確作圖。圖像收集，分析和染色體分級長度測定是使用IseeGraphical程序系統(Inovision公司，Durham，NC.)進行的。編碼血管生成多肽(通過探針雜交的)的基因的基因組區域的染色體變化，經鑑別是插入，缺失和轉運。這些變化用作相關疾病的診斷標記。實施例14檢測生物樣品中血管生成多肽的異常水平的方法血管生成多肽可在生物樣品中檢測，且如果檢測到血管生成多肽水平提高或降低，則此多肽是特殊表型的標記。檢測方法有許多，因此本領域技術人員根據其特殊需要可對以下分析加以修改。
例如，使用抗體夾心ELISAs檢測樣品優選生物樣品中的血管生成多肽。微滴定平板的孔用血管生成多肽的特異抗體包被，抗體終濃度為0.2-10μg/ml。抗體是單克隆或多克隆抗體，且是由實施例8所述方法產生的。將孔封阻以便降低血管生成多肽與孔的非特異性結合。
將包被的孔在室溫用含有血管生成多肽的樣品溫育2小時以上。優選地，將連續稀釋的樣品用於證實結果。然後將平板用去離子水或蒸餾水衝洗3次，以除去未結合血管生成多肽。
接著，將50μl的抗體—鹼性磷酸酶綴合物，以25-400ng的濃度加入，並在室溫溫育2小時。將平板再用去離子水或蒸餾水衝洗3次，以除去未結合的綴合物。
在每個孔中加入75μl的4-methylumbelliferyl phosphate(MUP)或p-nitrophenyl phosphate(NPP)底物，並在室溫溫育1小時。通過微滴定平板讀器測定反應。使用連續稀釋的對照樣品製備標準曲線，X軸表示血管生成多肽濃度(對數值)，Y軸表示螢光型或吸光度(線性值)。使用標準曲線添加樣品中血管生成多肽濃度。實施例15配方本發明還提供了治療和/或預防疾病，功能失調和/或病理狀況(例如本文所述的一或多種疾病，功能失調和/或病理狀況)的方法，通過為受試者施用有效量的治療劑而進行。治療劑是指本發明的多核苷酸或多肽(包括片段和變體)，其激動劑或拮抗劑，和/或其抗體，組合藥物適當的載體(如無菌載體)。
結合各個患者的臨床狀況(尤其單用此治療劑進行治療的副作用)，輸送位置，施用方法，施用順序，及從業者已知的其它因素，以取得良好療效的方式配製及確定治療劑的劑量。「有效量」因此是通過這些條件確定的。
一般而言，非腸道施用的治療劑的每劑總藥物有效量在大約1μg/kg體重/天——10mg/kg體重/天，雖然如上所述要進行治療性評價。優選地，此劑量為證實至少0.01mg/kg體重/天，更優選對人而言為0.01-1mg/kg體重/天激素。如果連續施用，治療劑典型以大約1μg/kg體重/小時-50μg/kg體重/小時的劑量施用，每天注射1-4次，或連續皮下灌注，例如使用微泵。也可使用靜脈內輸液。需根據產生的治療效果觀測變化和間隔，從而根據所需效應對治療長度加以變化。
治療劑可經口腔，直腸，非腸道，膀胱內，陰道內，腹膜內，局部(如通過粉末，藥膏，凝膠，滴劑或經皮貼)，面頰或者經口腔或鼻腔噴霧而施用。「藥物適當載體」是指非毒性的固體，半固體或液體充填劑，稀釋劑，膠囊物或任何類型的配方輔助劑。本文所用術語「非腸道」是指包括靜脈內，肌內，腹膜內，胸骨內，皮下和動脈內注射及灌注的施用模式。
本發明的治療劑適於通過緩釋系統施用。緩釋的治療劑例如是通過口腔，直腸，非腸道，膀胱內，陰道內，腹膜內，局部(如通過粉末，藥膏，凝膠，滴劑或經皮貼)，面頰或者經口腔或鼻腔噴霧而施用。「藥物適當載體」是指非毒性的固體，半固體或液體充填劑，稀釋劑，膠囊物或任何類型的配方輔助劑。本文所用術語「非腸道」是指包括靜脈內，肌內，腹膜內，胸骨內，皮下和動脈內注射及灌注的施用模式。
本發明的治療劑也適於通過緩釋系統施用。緩釋的治療劑例如包括適當的聚合物(例如成形物形式的半透性聚合物基質，如覆以薄膜，或膠囊物)，適當的疏水物(例如在適當油中的乳狀液)，或離子交換樹脂，及可溶的衍生物(例如可溶的鹽)。
緩釋基質包括polyactides(美國專利No3773919，EP58481)，L-穀氨酸和γ-乙基-穀氨酸的共聚物(Sidman，U.等，生物聚合物22547-556(1983))，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸(R.Langer，化學教學1298-105(1982))，乙基乙烯乙酸鹽(R.Langer等)或聚-D-(-)-3-羥丁酸(EP133988)。
緩釋的治療劑還包括本發明脂質體包載的治療劑(見Langer，科學2491527-1533(1990)；Treat等，感染性疾病和癌症治療中的脂質體，Lopez-Berestein和Fidler編輯，Liss，紐約，pp317-327和353-365(1989))。含有治療劑的脂質體上通過已知方法製備的，參見3218121DE；Epstein等，美國科學院院報823688-3692(1985)；Hwang等，美國科學院院報774030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本專利申請83-118008；美國專利No4485045和4544545；及EP102324。通常地，脂質體是小unilamellar型(大約200-800埃)，其中脂質含量高於30mol/膽固醇，調整所選擇的比例以達到最佳治療。
在另一實施方案中，本發明的治療劑是通過泵輸送的(見Langer，如前；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201(1987)；Buchwald等，外科88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。
其它控制的釋放系統參見Langer所述(科學2491527-1533(1990))。
為非腸道施用，在一個實施方案中，治療劑一般通過將其在所需純度，以單位劑量可注射形式(溶液，懸浮液或乳狀液)，與藥物適當載體混合，所述載體即在所用劑量和濃度對受體無毒性，並與配方中其它配料可相容的載體。例如，配方優選不包括氧化劑或其它已知對治療劑有害的化合物。
通常地，配方是通過將治療劑均勻及密切地與液體載體或充分分散的固體載體或二者接觸而製備的。然後如果需要，將產物在所需配方中成形。優選地，此載體是非腸道載體，更優選是與受體血液等滲的溶液。這種載體例如包括水，鹽水，Ringer’s液，和葡萄糖溶液。本發明還使用非水性載體如固定脂和乙基油酸，以及脂質體。
載體適當的含有少量添加劑，如增強等滲性和化學穩定性的物質。這種物質在所用劑量和濃度對受體無毒性，包括緩衝液如磷酸，檸檬酸，琥珀酸，乙酸和其它有機酸或其鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量多肽(少於大約10個殘基)如聚精氨酸或三肽；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸，穀氨酸，天冬氨酸或精氨酸；單糖，二糖，及其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子如Na+；和/或非離子表面活性劑如polysorbates，poloxamers，或PEG。
在這種載體中治療劑典型的以0.1-100mg/ml濃度，優選1-10mg/ml，pH為大約3-8配製。應知使用上述的一些賦形劑，載體或穩定劑將導致多肽鹽形成。
使用的治療劑是無菌的。可通過無菌濾膜(如0.2微米膜)過濾達到無菌狀態。通常將治療性多肽組合物置於具有無菌通道的容器中，例如具有通過皮下注射針頭可穿過的塞子的靜脈內注射溶液袋或小瓶。治療性多肽通常貯存在單位或多劑量容器中，例如密封的安瓶或小瓶，以水溶液存在或以凍幹配方重建。例如凍幹配方是將10ml小瓶充填5ml無菌過濾的1％(w/v)治療劑水溶液，並將所得混合物凍幹。通過用無菌注射用水重建凍幹的治療劑製備灌注液。
本發明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包含一或多個充填本發明一或多種配料的容器。與此容器相關的是由政府對藥物或生物製品的生產，使用或銷售的告示，其反映了由政府批准的施用於人的藥物或生物製品的生產，使用或銷售機構。另外，治療劑可與其它治療性化合物聯合使用。
本發明的治療劑可單獨使用或與佐劑組合使用。可與本發明治療劑組合使用的佐劑包括但非限於明礬，明礬+脫氧膽酸(免疫Ag)，MTP-PE(Biocine公司)，QS21(Genentech公司)，BCG，和MPL。在一特異的實施方案中，本發明的治療劑與明礬組合施用。在另一特異的實施例方案中，本發明的治療劑與QS21組合施用。可與本發明的治療劑組合施用的其它佐劑包括但非限於單磷醯脂免疫調製劑，AdjuVax 100a，QS21，QS18，CRL1005，鋁鹽，MF59，和病毒體佐劑方法。可與本發明治療劑組合施用的疫苗包括但非限於抗MMR(麻疹，腮腺炎，風疹)，脊髓灰質炎，水痘，破傷風/白喉，A型肝炎，B型肝炎，B型嗜血桿菌流感，百日咳，肺炎，流感，Lyme’s病，輪狀病毒感染，霍亂，黃熱病，乙型腦炎，脊髓灰質炎，狂犬病，傷寒，和百日咳的疫苗。可伴隨組合施用如分別但同時混合施用；或相繼組合施用。這包括組合劑是作為治療性混合物一起施用的，還包括組合劑是分別但同時施用的，如提供分別的靜脈通道同時輸入一個個體中。「組合」施用還包括先施用所供化合物或製劑之一，再施用第二種。
本發明的治療劑可單獨或與其它治療劑組合施用。可與本發明組合物組合施用的治療劑包括但非限於TNF家族的其它成員，化療劑，抗生素，類固醇或非類固醇抗炎劑，常規免疫治療劑，細胞因子和/或生長因子。可伴隨組合施用如分別但同時混合施用；或相繼組合施用。這包括組合劑是作為治療性混合物一起施用的，還包括組合劑是分別但同時施用的，如提供分別的靜脈通道同時輸入一個個體中。「組合」施用還包括先施用所供化合物或製劑之一，再施用第二種。
在一實施方案中，本發明的治療劑與TNF家族的其它成員組合施用。可與本發明組合物組合施用的TNF，TNF相關的或類TNF分子包括但非限於可溶形式的TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也稱為TNF-β)，LT-β(在LT-α2-β異源三聚體複合物中發現的)，OPGL，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，DcR3，OX40L，TNF-γ(國際出版物WO 96/14328)，AIM-I(國際出版物WO97/33899)，內因子-α(國際出版物WO 98/07880)，TR6(國際出版物WO 98/30694)，OPG，和neutrokine-α(國際出版物WO98/18921)，OX40，和神經生長因子(NGF)，及可溶形式的Fas，CD30，CD27，CD40和4-IBB，TR2(國際出版物WO 96/34095)，DR3(國際出版物WO 97/33904)，DR4(國際出版物WO 98/32856)，TR5(國際出版物WO 98/30693)，TR6(國際出版物WO 98/30694)，TR7(國際出版物WO 98/41629)，TRANK，TR9(國際出版物WO 98/56892)，TR10(國際出版物WO 98/54202)，312C2(國際出版物WO98/06842)，和TR12，及可溶形式的CD154，CD70，和CD153。
在一些實施方案中，本發明的治療劑與抗逆轉錄病毒劑，核苷逆轉錄酶抑制劑，非核苷逆轉錄酶抑制劑，和/或蛋白酶抑制劑組合施用。可與本發明治療劑組合施用的核苷逆轉錄酶抑制劑包括但非限於RETROVIRTM(zidovudine/AZT)，VIDEXTM(2』，3』-雙脫氧肌苷/ddI)，HIVIDTM(2』，3』-雙脫氧胞苷/ddC)，ZERITTM(雙脫氧胸苷/d4T)，EPIVIRTM(lamivudine/3TC)，和COMBIVIRTM(zidovudine/lamivudine)。可與本發明治療劑組合施用的非核苷逆轉錄酶抑制劑包括但非限於VIRAMUNETM(nevirapine)，RESCRIPTORTM(delavirdine)，和SUSTIVATM(efavirenz)。可與本發明治療劑組合施用的蛋白酶抑制劑包括但非限於CRIXIVANTM(indinavir)，NORVIRTM(ritonavir)，INVIRASETM(saquinavir)，和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在一特異的實施方案中，抗逆轉錄病毒劑，核苷逆轉錄酶抑制劑，非核苷逆轉錄酶抑制劑，和/或蛋白酶抑制劑可與本發明治療劑組合施用，以治療AIDS和/或預防或治療HIV感染。
在其它實施方案中，本發明的治療劑可與抗機會感染劑組合施用。可與本發明治療劑組合施用的抗機會感染劑包括但非限於TRIMETHOPRIM-S M LFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，ATOVAQUONETM，ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，ETHAMBUTOLTM，RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，AZITHROMYCINTM，GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，CIDOFOVIRTM，FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，KETOCONAZOLETM，ACYCLOVIRTM，FAMCICOLVIRTM，PYRIMETHAMINETM，LEUCOVORINTM，NEUPOGENTM(filgrastim/G-CSF)，和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一特異的實施方案中，本發明的治療劑可與TRIMETHOPRIM-S M LFAMETHOXAZOLETM，DAPSONETM，PENTAMIDINETM，和/或ATOVAQUONETM任意組合施用，以預防性治療或預防機會性肺囊蟲屬carinii肺部感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與ISONIAZIDTM，RIFAMPINTM，PYRAZINAMIDETM，和/或ETHAMBUTOLTM任意組合施用，以預防性治療或預防分支桿菌avium複合感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與RIFABUTINTM，CLARITHROMYCINTM，和/或AZITHROMYCINTM任意組合施用，以預防性治療或預防分支桿菌tubercμlosis感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與GANCICLOVIRTM，FOSCARNETTM，和/或CIDOFOVIRTM任意組合施用，以預防性治療或預防機會性巨細胞病毒感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與FLUCONAZOLETM，ITRACONAZOLETM，和/或KETOCONAZOLETM任意組合施用，以預防性治療或預防機會性真菌感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與ACYCLOVIRTM，和/或FAMCICOLVIRTM任意組合施用，以預防性治療或預防機會性I型或II型單純皰疹病毒感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與PYRIMETHAMINETM，和/或LEUCOVORINTM任意組合施用，以預防性治療或預防機會性弓形體gondii感染。在另一特異的實施方案中，本發明的治療劑與LEUCOVORINTM，和/或NEUPOGENTM任意組合施用，以預防性治療或預防機會性細菌感染。
在另一實施方案中，本發明的治療劑與抗病毒劑組合施用。可與本發明治療劑組合施用的抗病毒劑包括但非限於無環鳥苷，病毒唑，金剛烷胺和remantidine。
在另一實施方案中，本發明的治療劑與抗生素組合施用。可與本發明治療劑組合施用的抗生素包括但非限於阿莫西林，β-內醯胺酶，氨基糖苷，β-內醯胺(糖肽)，β-內醯胺酶，氯林可黴素，氯黴素，頭胞菌素，卷鬚黴素，erythromycin，氟喹諾酮，大環內酯類，甲硝唑，青黴素，喹諾酮類，利福平，鏈黴素，磺胺類，四環素，三甲氧苄二氨嘧啶，三甲氧苄二氨嘧啶-sulfamthoxazole，和萬古黴素。
可與本發明組合物組合施用的常規免疫抑制劑包括但非限於類固醇，cycloporine，cycloporine類似物，環磷醯胺，甲基強的松，強的松，咪唑硫嘌呤，FK-506，15-deoxyspergualin，和其它通過抑制T細胞應答功能而起作用的免疫抑制劑。
在特異的實施方案中，本發明的治療劑與免疫抑制劑組合施用。可與本發明治療劑組合施用的免疫抑制劑製品包括但非限於ORTHOCLONETM(OKT3)，SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(cycloporine)，PROGRAFTM(血流譜)，CELLCEPTTM(mycophenolate)，咪唑硫嘌呤，glucorticosteroids，和RAPAMNETM(sirolimus)。在一特異實施方案中，免疫抑制劑可用於預防器官或骨髓移植的排斥反應。
在另一實施方案中，本發明的治療劑單獨施用或與一或多種靜脈內免疫球蛋白製品組合施用。可與本發明治療劑組合施用的靜脈內免疫球蛋白製品包括但非限於GAMMARTM，IVEEGAMTM，SANDOGLOBMLINTM，GAMMAGARD S/DTM，和GAMIMUNETM。在一特異實施方案中，本發明的治療劑與靜脈內免疫球蛋白製品組合施用在移植療法中(如骨髓移植)。
在另一實施方案中，本發明的組合物與抗生素組合施用。可與本發明組合物組合施用的抗生素包括但非限於四環素，甲硝唑，阿莫西林，β-內醯胺酶，氨基糖甙類，大環內酯類，喹諾酮類，氟基喹諾酮類，頭胞菌素，erythromycin，卷鬚黴素，和鏈黴素。
在另一實施方胺中，本發明的組合物單獨施用或與抗炎劑組合施用。可與本發明組合物組合施用的抗炎劑包括但非限於糖皮質激素和非類固醇抗炎劑，氨基芳香羧酸衍生物，芳香乙酸衍生物，芳香丁酸衍生物，芳香羧酸，芳香丙醯酸衍生物，吡唑，吡唑啉酮，水楊酸衍生物，thiazinecarboxamides，e-acetamidocaproic acid，S-醯苷甲硫氨酸，3-氨基-4羥丁酸，amixetrine，苯吲酸，炎痛靜，丁基環己基巴比妥，difenpiramide，雙苯唑醇，emorfazone，愈創奧，nabumetone，nimesulide，orgotein，oxaceprol，paranyline，perisoxal，pifoxime，蛋白酶，和tenidap。
在另一實施方案中，本發明的組合物與化療劑組合施用。可與本發明組合物組合施用的化療劑包括但非限於抗生素衍生物(如阿黴素，博來黴素，道諾紅菌素和更生黴素)；抗雌激素(如三苯氧胺)；抗代謝物(如氟尿嘧啶，5-FU，氨甲喋呤，5氟脫氯尿苷，α幹擾素-2b，穀氨酸，plicamycin，巰基嘌呤，和6-硫鳥嘌呤)；胞毒劑(如亞硝基氮芥，BCNU，環己亞硝脲，CCNU，胞核嘧啶阿拉伯糖苷，環磷醯胺，estramustine，羥基脲，甲基苄肼，絲裂黴素，二甲磺酸丁酯，順鉑，和長春新鹼硫酸鹽)；激素(如甲孕酮，estramustine磷酸鈉，乙炔基雌二醇，雌二醇，乙酸基孕甾酮，甲基睪甾酮，二磷酸己烯雌酚，三對甲氧苯氯乙烯和睪丸內酯)；氮芥衍生物(如mephalen，chorambucil，二氯甲基二乙胺(氮芥)和三胺硫磷)；類固醇及其組合物(如bethamethasone磷酸鈉)；及其它物質(如dicarbazine，天冬醯胺酶，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷，硫酸長春新鹼，硫酸長春鹼，和etoposide)。
在一特異的實施方案中，本發明的治療劑與CHOP(環磷醯胺，阿黴素，長春新鹼，強的松)或任意組合的CHOP組分組合施用。在另一實施方案中，本發明的治療劑與Rituximab組合施用。在另一實施方案中，本發明的治療劑與Rituxmab和CHOP組合施用，或與Rituxmab和任意組合的CHOP組分組合施用。
在另一實施方案中，本發明的組合物與細胞因子組合施用。可與本發明的組合物組合施用的細胞因子包括但非限於IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL12，IL13，IL15，抗-CD40，CD40L，IFN-γ，和TNF-α。在另一實施方案中，本發明的治療劑可與任何白細胞介素組合施用，包括但非限於IL1-α，IL1-β，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9，IL10，IL11，IL12，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL18，IL19，IL20，和IL21。
在另一實施方案中，本發明的組合物與血管生成蛋白組合施用。可與本發明組合物組合施用的血管生成蛋白包括但非限於神經膠質瘤衍生生長因子(GDGF)，如歐洲專利EP-399816所述；血小板衍生生長因子-A(PDGF-A)，如歐洲專利EP-682110所述；血小板衍生生長因子-B(PDGF-B)，如歐洲專利EP-282317所述；胎盤生長因子(PlGF)，如國際出版物WO92/06194所述；胎盤生長因子-2(PlGF-2)，如Hauser等，生長因子4259-268(1993)；血管內皮細胞生長因子(VEGF)，如國際出版物WO90/13649所述；血管內皮細胞生長因子-A(VEGF-A)，如歐洲專利EP-506477所述；血管內皮細胞生長因子-2(VEGF-2)，如國際出版物WO96/39515所述；血管內皮細胞生長因子B-186(VEGF-B186)，如國際出版物WO96/26736所述；血管內皮細胞生長因子-D(VEGF-D)，如國際出版物WO98/07832所述；和血管內皮細胞生長因子-E(VEGF-E)，如德國專利DE19639601所述。上述文獻以其全文併入參考。
在另一實施方案中，本發明的組合物與成纖維細胞生長因子組合施用。可與本發明組合物組合施用的成纖維細胞生長因子包括但非限於FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14，和FGF-15。
在另一實施方案中，本發明的組合物與其它治療性或預防性方法組合施用，例如放射療法。實施例16治療血管生成蛋白水平降低的方法本發明還涉及一種治療需要提高機體內血管生成多肽活性水平的個體的方法，包括為這種個體施用包含治療有效量的血管生成多肽或其激動劑的組合物。
另外，應意識到由個體內血管生成多肽低於標準或正常表達水平所導致的疾病，可通過施用血管生成多肽優選分泌形式的多肽而加以治療。因此，本發明還提供了一種治療需要提高血管生成多肽水平的個體的方法，包括為這種個體施用包含一定量血管生成多肽的藥物組合物，以提高這種個體中血管生成多肽的活性水平。
例如，對血管生成多肽水平降低的患者每天施用0.1-100μg/kg的此多肽，連續6天。優選此多肽是分泌形式的。基於施用和配方的服用方式見實施例15所述。實施例17治療血管生成蛋白水平增高的方法本發明還涉及一種治療需要降低機體內血管生成多肽活性水平的個體的方法，包括為這種個體施用包含治療有效量血管生成多肽拮抗劑的組合物。用於本發明的優選拮抗劑是血管生成多肽特異性抗體。
反義技術用於抑制血管生成多肽的產生。此技術是降低各種病原學如癌症中血管生成多肽水平的方法之一，此血管生成多肽優選是分泌形式的。
例如，對血管生成多肽水平異常增高的患者，在靜脈內施用0.5，1.0，1.5，2.0和3.0mg/kg/天的反義多核苷酸，共21天。如果對此治療良好耐受，在休息7天後重複此治療。此反義多核苷酸的配方見實施例15所述。實施例18使用體內基因治療的方法基因治療的一種方法是將能表達血管生成多肽的成纖維細胞移植到患者體內。通常地，成纖維細胞得自皮膚活檢組織樣品。將所得組織置於組織培養基中，並分離成小片。將小塊組織置於組織培養瓶的溼表面上，每個培養瓶放置近10片。將此培養瓶倒置，密封並在室溫過夜。在室溫下24小時後，將此培養瓶倒轉，組織片仍固定於瓶底，加入新鮮培養基(如具有10％FBS，青黴素和鏈黴素的Ham’s F12培養基)。然後，將此培養瓶在37℃溫育近1周時間。
在此期間，加入新鮮培養基，並每隔幾天更換一次。在另外培養2周後，形成一層成纖維細胞。將此單層細胞用胰蛋白酶消化，並分散置於較大的培養瓶中。
將在Moloney鼠肉瘤病毒長末端重複兩側的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，用EcoHI和HindIII消化，接著用牛鹼性磷酸酶處理。將此線性載體用玻珠在瓊脂糖凝膠上分級分離並純化。
編碼血管生成多肽的cDNA可用PCR引物擴增，所用引物如實施例1所述分別相當於5』和3』末端序列。優選地，5』引物含有一個EcoRI位點，3』引物含有一個HindIII位點。將等量的Moloney鼠肉瘤病毒線性主鏈和擴增的EcoRI和HindIII片段，在存在T4 DNA連接酶的情況下加在一起。將此連接混合物保持在在適當條件下以連接這兩個片段。然後將此連接混合物用於轉化細菌HB101，接著將其鋪板於含有卡那黴素的瓊脂上，以確定載體含有正確插入的編碼血管生成多肽的基因。
將兼嗜性pA317或GP+am12包裝細胞，在具有10％牛血清(CS)，青黴素和鏈黴素的Dμlbecco’s修改的Eagles培養基(DMEM)中生長，至組織培養物達到鋪滿密度。然後將含有編碼血管生成多肽的基因的MSV載體加入培養基中，並用此載體轉導包裝細胞。這時包裝細胞產生含有編碼血管生成多肽的基因的感染性病毒顆粒(此時包裝細胞稱為生成細胞)。
將新鮮培養基加入轉導的生產細胞中，並接著從鋪滿生產細胞的10cm平板中收集培養基。將含有感染性病毒顆粒的失效培養基通過微孔濾膜過濾，以除去脫附的生產細胞，然後用此培養基用於感染成纖維細胞。從亞鋪滿成纖維細胞的平板中除去培養基，並迅速用取自生產細胞的培養基代替。除去此培養基並代以新鮮培養基。如果病毒的效價高，實際上所用成纖維細胞被感染，且不需要進行選擇。如果效價非常低，則必需使用具有可選擇標記如neo或his的逆轉錄病毒載體。一旦成纖維細胞已經有效感染，對此成纖維細胞進行分析，以確定血管生成蛋白是否產生。然後將基因工程化的成纖維細胞移植到宿主中，單獨移植或在cytodex3微載體珠上生長至鋪滿後移植。實施例19使用編碼血管生成蛋白的內源性基因的基因治療本發明的另一種基因治療方法包括通過同源重組，可操縱地將編碼血管生成蛋白的內源性序列與啟動子締合，如美國專利No5641670，1997年6月24日發布；國際出版物WO96/29411，1996年9月26日出版；國際出版物WO94/12650，1994年8月4日出版；Koller等，美國科學院院報868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)所述。此方法包括激活一種基因，該基因存在於靶細胞中，但其不在此細胞中表達，或在此細胞中以低於所需水平表達。
產生含有一個啟動子和的多核苷酸構建體，靶序列同源於編碼血管生成多肽的內源性基因的5』非編碼序列，位於啟動子的兩側。將靶序列緊位於基因的5』末端附近，以便啟動子在同源重組之上可操縱的與內源性序列連接。啟動子和靶序列可用PCR擴增。優選地，擴增的啟動子在5』和3』末端含有獨特的限制酶位點。優選地，第一個靶序列的3』末端含有與擴增的啟動子5』末端相同的限制酶位點，第二個靶序列的5』末端含有與擴增的啟動子3』末端相同的限制酶位點。將擴增的啟動子和擴增的靶序列用適當的限制酶消化，接著用牛小腸磷酸酶處理。在存在T4 DNA連接酶的情況下，將消化的啟動子和消化的靶序列加在一起。所得混合物在適於這兩個片段連接的條件下保持。將構建體在瓊脂糖凝膠上按大小分級分離，然後通過苯酚提取和乙醇沉澱而純化。
在此實施例中，多核苷酸構建體通過電穿孔以裸多核苷酸施用。然而，多核苷酸構建體還可與促進轉染劑如脂質體，病毒序列，病毒顆粒，沉澱劑等組合施用。本領域已知這種輸送方法。
一旦細胞被轉染，進行同源重組，使啟動子可操縱的連接於內源性基因序列。這導致血管生成多肽在細胞中表達。表達可通過免疫染色，或本領域已知任何其它方法檢測。
成纖維細胞得自皮膚活檢組織樣品。將所得組織置於DMEM+10％胎牛血清中。將按指數規律生長的或早期穩定期的成纖維細胞用胰蛋白酶消化，並用營養培養基從塑料表面衝洗下。移出等份細胞懸浮液進行計數，剩餘細胞進行離心。抽吸申請並將沉澱再懸浮於5ml電穿孔緩衝液中(20mM HEPES pH 7.3，137mM NaCl，5mMKCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖)。將細胞再離心，抽吸上清，並將細胞再懸浮於含有1mg/ml乙醯化的牛血清白蛋白的電穿孔緩衝液中。最終細胞懸浮液含有大約3×106個細胞/ml。在再懸浮後應立即進行電穿孔。
根據標準方法製備質粒DNA。例如，為構建定向於編碼血管生成蛋白的基因所位於的基因座的質粒，將質粒pUC18(MBIFermentas，Amherst，NY)用HindIII消化。將CMV啟動子通過PCR擴增，XbaI位點在5』末端，BamHI位點在3』末端。將兩個血管生成蛋白非編碼序列通過PCR擴增一個血管生成蛋白非編碼序列(血管生成蛋白片段1)擴增，BamHI位點在5』末端，Xba位點在3』末端；另一個血管生成蛋白非編碼序列(血管生成蛋白片段2)擴增，BamHI位點在5』末端，HindIII位點在3』末端。將CMV啟動子和血管生成蛋白片段用適當酶消化(CMV啟動子-XbaI和BamHI；血管生成蛋白片段1-XbaI；血管生成蛋白片段2-BamHI)，並連接在一起。將所得產物用HindIII消化，並用HindIII消化的pUC18質粒連接在一起。
將質粒DNA加入具有0.4cm電缺口的無菌樣品池(Bio-Rad)中。最終DNA濃度一般為至少120μg/ml。然後在樣品池中加入0.5ml細胞懸浮液(含有大約1.5×106個細胞)，並將細胞懸浮液與DNA溶液輕輕混合。用Gene-Pμlser設備(Bio-Rad)進行電穿孔。電容和電壓分別設為960μF和250-300V。隨著電壓升高，細胞存活力降低，但穩定將導入的DNA摻入其基因組中的存活細胞的百分率明顯提高。給定這些參數，應觀測到大約14-20mSec的脈衝時間。
將電穿孔的細胞在室溫保持大約5分鐘，然後用無菌移液管輕輕除去樣品池的內容物。將細胞直接加入10cm平皿中10ml預溫的營養培養基中(具有10％牛血清的DMEM)，並在37℃溫育。第二天國，抽吸培養基，並用10ml新鮮培養基更換，另外溫育16-24小時。
然後將基因工程化的成纖維細胞注射入宿主體內，單獨施用或在cytodex3微載體珠上生長至鋪滿後施用。這時成纖維細胞產生蛋白質產物。然後將成纖維細胞導入患者體內，如上所述。實施例20使用體內基因治療的方法本發明的另一方面是使用體內基因療法以治療功能失調，疾病和病理狀況。此基因療法涉及將編碼血管生成多肽的裸核酸(DNA，RNA，和反義DNA或RNA)序列導入動物體，以提高或降低血管生成多肽的表達。編碼血管生成多肽的多核苷酸可操縱的連接於啟動子或通過靶組織表達血管生成多肽所必需的其它遺傳因子。本領域已知這種基因治療和輸送方法，見例如WO90/11092，WO98/11779；美國專利No5693662，5705151，5580859；Tabata H.等，(1997)心血管研究35(3)470-479，Chao J等(1997)，藥學研究35(6)517-522，Wolff J.A.(1997)，神經肌功能失調7(5)314-318，Schwartz B.等，(1996)基因專利3(5)；405-411，TsurumiY等(1996)循環94(12)3281-3290所述，以上文獻以其全文併入參考。
含有編碼血管生成多肽的基因的多核苷酸構建體，可通過將可注射物輸送至動物細胞的任何方法輸送，如注射入組織的間隙內(心臟，肌，皮膚，肺，肝，小腸等)。另外，多核苷酸構建體可在藥物適當的液體或水性載體中輸送。
術語「裸」多核苷酸，DNA或RNA指游離自任何輸送載體的序列，該載體幫助，促進或易於使序列進入細胞中，包括病毒序列，病毒顆粒，脂質體配方，脂質轉染試劑或沉澱劑等。然而，編碼血管生成多肽的多核苷酸也可在脂質體配方中輸送(如Felgner P.L.等(1995)，Ann.NY Acad.Sci.772126-139和Abdallah B.等(1995)生物細胞85(1)1-7)，脂質體配方可通過本領域熟知的方法製備。
用於基因療法中含有編碼血管生成多肽的基因的多核苷酸載體構建體，優選是即不整合入宿主基因組又不含有進行複製的序列的構建體。可以使用本領域已知的任何強啟動子，以驅動DNA表達。與其它基因療法不同，將裸核酸序列導入靶細胞的一個優點是細胞中多核苷酸合成的時間短。研究還示出可將非複製DNA序列導入細胞中，以使所需多肽生產6個月以上。
含有編碼血管生成多肽的基因的多核苷酸構建體可輸送至動物體內組織間隙中，包括肌，皮膚，腦，肺，肝，脾，骨髓，胸腺，心臟，淋巴，血液，骨，軟骨，胰腺，腎，膽囊，胃，小腸，睪丸，卵巢，子宮，直腸，神經系統，眼，腺體和結締組織。組織間隙包括細胞內液，器官組織網狀纖維中的粘多糖基質，血管或心腔壁中的彈性纖維，纖維性組織的膠原纖維，或摻入肌細胞內的或骨松質中結締組織中的相同基質。相似地，此間隙由循環血漿和淋巴管道內的淋巴液佔據。根據以下原因優選輸送至肌組織間隙內。因為它們可通過注射輸送至包含這些細胞的組織中。優選將它們輸送至並在持續未分開的分化的細胞中表達，儘管可在未分化或未全分化的細胞中間隙輸送和表達，如血液或皮膚成纖維細胞的幹細胞。在體內的肌細胞是其進行並表達多核苷酸的能力中的重要成分。
為注射編碼血管生成多肽的裸多核苷酸，DNA或RNA的有效劑量在大約0.05g/kg體重-50mg/kg體重之間。此劑量優選在大約0.005mg/kg-20mg/kg，更優選在0.05mg/kg-5mg/kg之間。當然，技術人員意識到此劑量可根據注射的組織位置而加以變化。核酸序列的適當和有效劑量可易於為本領域技術人員根據病情和施用途徑所確定。優選的施用途徑是通過非腸道途徑注射至組織間隙內。然而，也可使用其它非腸道途徑，如吸入氣霧劑配方特別輸送至肺或支氣管組織，咽喉或鼻黏膜。另外，含有編碼血管生成多肽的基因的裸多核苷酸構建體可在血管成形術期間通過導管輸送至動脈中。
在體內肌內注射的編碼血管生成多肽的多核苷酸的劑量應答效應如下確定。根據標準重組DNA方法製備編碼血管生成多肽的適當的模板DNA，以產生編碼血管生成多肽的mRNA。此模板DNA可以是環形或線性的，其可用作裸DNA或與脂質體複合。然後用各種數量的模板DNA注射小鼠的四頭肌。
將5-6周齡的雌性和雄性Balb/C小鼠通過腹膜內注射0.3ml的2.5％Avertin麻醉。在前肢上做一個1.5cm的切口，並直接顯現四頭肌。將在0.1ml載體中編碼血管生成多肽的模板DNA，在1cc注射器中通過27號針頭注射1分鐘以上時間，從肌注位至膝大約0.5cm，注射深度為大約0.2cm。在注射位進行縫合以進一步定位，並用不鏽鋼夾子封閉皮膚。
在適當的溫育時間後(如7天)後，通過切下整個四頭肌製備肌提取物。將各個四頭肌的每15um橫切面進行組織染色，以觀測血管生成多肽表達。血管生成多肽表達的時間經過以相似方式進行，除了在不同時間收集不同小鼠的四頭肌。在注射後肌中編碼血管生成多肽的DNA的持續性，可在從經注射的及對照的小鼠中製備總細胞DNA和HIRT上清後，通過Southern印跡分析確定。在小鼠中進行的以上試驗結果，可用於推斷在人體和其它動物使用編碼血管生成多肽的裸DNA的正確劑量及其它治療參數。實施例21血管生成多肽轉基因動物血管生成多肽也可在轉基因動物中表達。任何物種的動物包括小鼠，大鼠，兔，倉鼠，豚鼠，豬，小豬，山羊，牛和非人靈長類動物如狒狒，猴，和黑猩猩，可用於產生轉基因動物。在一特異的實施方案中，使用本文所述的及本領域已知的其它方法在人體中表達本發明的多肽，作為基因治療方法的一部分。
可使用本領域已知的任何方法將轉基因(即本發明的多核苷酸)導入動物體，以產生轉基因動物的創始系。這種方法包括但非限於前核微注射法(Paterson等，應用微生物學生物技術40691-698(1994)；Carver等，生物技術(NY)111263-1270(1993)；Wright等，生物技術(NY)9830-834(1991)；和Hoppe等，美國專利No4873191(1989))；將逆轉錄病毒介導的基因移至微生物系(Van derPutten等，美國科學院院報826148-6152(1985))，胚泡或胚胎中；胚胎幹細胞中基因定向(Thompson等，細胞56313-321(1989))；電穿孔細胞或胚胎(Lo，1983，分子細胞生物學31803-1814(1983))；使用基因槍導入本發明的多核苷酸(見例如Ulmer等，科學2591745(1993))；將核酸構建體導入胚胎多能性幹細胞中及將此幹細胞反過來移至胚泡中；和精子介導的基因轉移(Lavitrano等，細胞57717-723(1989)；等。這種方法參見Gordon，「轉基因動物」，Intl.Rev.Cytol.115171-229(1989)，以其全文併入參考。
可使用本領域已知的任何方法產生含有本發明多核苷酸的轉基因克隆，例如將核移至經培養的胚胎，胎兒，或成體細胞的的核仁的去核卵母細胞中，誘導為靜止態。(Campell等，自然38064-66(1996)；Wilmut等，自然385810-813(1997))。
本發明提供了在其所有細胞中均攜帶轉基因的轉基因動物，以及在其一些而非全部細胞中攜帶轉基因的動物，即嵌合動物。可將轉基因整合為單一基因或多拷貝如多聯體，例如頭—頭串聯或頭—尾串聯。也可選擇性將轉基因導入特殊細胞類型中並激活，例如通過Lasko所述方法(Lasko等，美國科學院院報896232-6236(1992))。這種細胞類型特異性激活所需的調節序列依賴於相應的細胞類型，本領域技術人員已知這一點。當需要將多核苷酸轉基因整合入內源性基因的染色體位點中時，優選基因定向方法。
簡而言之，當利用這種方法時，設計含有與內源性基因同源的一些核苷酸序列的載體，以通過與染色體序列同源重組而整合入並破壞內源性基因的核苷酸序列的功能。也可選擇性將轉基因導入特殊細胞類型中，由此滅活只在該細胞類型中的內源性基因，例如通過Gu等，所述方法(Gu等，科學265103-106(1994))。這種細胞類型特異性激活所需的調節序列依賴於相應的細胞類型，本領域技術人員已知這一點。所述文獻均以全文併入參考。
一旦產生轉基因動物，可利用標準方法分析重組基因的表達。初始篩選可通過Southern印跡分析或PCR方法分析動物組織，以證實已經發生整合。在轉基因動物組織中轉基因的mRNA表達水平也可使用以下方法評定，包括但非限於對得自動物的組織樣品進行Northern印跡分析，原位雜交分析，和逆轉錄酶-PCR(rt-PCR)。也可對表達轉基因的組織樣品通過使用特異於轉基因產物的抗體而進行免疫細胞化學性或免疫組織化學性評價。
一旦產生創始動物，，將它們繁殖，生育，遠系繁殖或異種交配，以產生特殊動物集落。這種繁殖方法例如包括但非限於遠系繁殖具有一個以上整合位點的創始動物，以建立分離的體系；使分離的體系生育以產生較高水平表達轉基因的化合物轉基因，轉基因以較高水平表達是由於每個轉基因的加成表達所致；異種交配雜種轉基因動物以產生與給定整合位點純合的動物，以增加表達和不需要通過DNA分析篩選動物；進行繁殖以將轉基因置於獨特的背景中，該背景適於相應的試驗模型。
本發明轉基因動物的用途包括但非限於用作動物模型系統，以詳細闡述血管生成多肽的生物功能，研究與異常血管生成多肽表達相關的疾病，及篩選可改善這種疾病的化合物。實施例22血管生成蛋白剔除動物內源性血管生成蛋白基因表達也可使用定向同源重組，通過滅活或「剔除」編碼血管生成蛋白的基因和/或其啟動子而降低。(見例如Smithies等，自然317230-234(1985)；Thomas和Capecchi，細胞51503-512(1987)；Thompson等，細胞5313-321(1989)；以上文獻均以全文併入參考)。例如可使用一種有或無可選擇標記和/或陰性可選擇標記的突變體，以轉染在體內表達本發明多肽的細胞，這種突變體是位於與內源性多核苷酸序列(基因的編碼區或調節區)同源的DNA兩側的本發明的非功能性多核苷酸。在另一實施方案中，使用本領域已知方法在細胞中進行剔除，該細胞含有但不表達相應的基因。通過定向同源重組摻入DNA構建體，導致定向的基因滅活。這種方法特別適用於研究和農業領域，其中對胚胎幹細胞進行修飾可用於產生具有滅活的定向基因的動物子代(見例如Thomas和Capecchi，1987及Thompson 1989，如前)。但此方法可常規用於人體，將重組DNA構建體用本領域技術人員熟知的適當病毒載體，直接施用於或定向於在體內所需位點。
在本發明的另一實施方案中，將經遺傳工程化而表達本發明多肽的細胞，或經遺傳工程化(如剔除)而不表達本發明多肽的細胞，在體內施用於患者。這種細胞可得自患者(即動物包括人)或MHC相容供體，並可包括但非限於成纖維細胞，骨髓細胞，血細胞(如淋巴細胞)，脂肪細胞，肌細胞，內皮細胞等。細胞在體外使用重組DNA方法基因工程化，以將本發明多肽的編碼序列導入細胞中，或者破壞與本發明多肽相關的編碼序列和/或內源性調節序列，例如通過轉導(使用病毒載體，優選將轉基因整合入細胞基因組中的載體)或轉染方法，包括但非限於質粒，粘粒，YACs，裸DNA，電穿孔，脂質體等轉染。本發明多肽的編碼序列可在強組成型或可誘導型啟動子或啟動子/增強子的控制下置放，以表達優選分泌血管生成多肽。表達及優選分泌本發明多肽的工程化細胞，可全身性導入患者體內，如經血液循環或經腹膜內施用。
或者，細胞可摻入基質中，並植入機體中，如基因工程化的成纖維細胞可作為皮膚移植體的一部分植入；基因工程和的內皮細胞可作為淋巴或血管移植體的一部分植入(見例如Anderson等，美國專利No5399349；和Mulligan和Wilson，美國專利No5460959，所述文獻均以全文併入參考)。
當施用的細胞是非自身或非MHC相容細胞時，可用熟知的方法施用，以防止宿主抗導入細胞的免疫應答產生。例如，細胞可以膠囊形式導入，這樣可與相鄰的胞外環境交換組分，使導入細胞不被宿主免疫系統識別。
本發明的剔除動物的用途包括但非限於作為動物模型系統，用於詳細闡述血管生成多肽的生物功能，研究與血管生成蛋白異常表達相關的疾病，及篩選可改善這種疾病的化合物。實施例23血管生成多肽生物效應成纖維細胞和內皮細胞分析 人體肺成纖維細胞得自Clonetics(San Diego，CA)，並保持在得自Clonetics的生長培養基中。皮膚微血管內皮細胞得自Cell Applications(San Diego，CA)。為進行增殖分析，可將人體肺成纖維細胞和皮膚微血管內皮細胞，以5000個細胞/孔在96孔平板在生長培養基中培養一天。然後將細胞在0.1％BSA基本培養基中溫育一天。在用新鮮0.1％BSA培養基更換原來的培養基後，將細胞用測試蛋白溫育3天。在每個孔中加入Alamar藍至終濃度為10％。將細胞溫育4小時。通過CytoFluor螢光讀器測定細胞生存力。為進行PGE2分析，將人體肺成纖維細胞以5000個細胞/孔在96孔平板中培養一天。在將培養基更換為0.1％BSA基本培養基後，將細胞用FGF-2或有或無IL-1α的血管生成多肽溫育24小時。收集上清並通過EIA試劑盒(Cayman，Ann Arbor，MI)分析PGE2。為進行IL-6分析，將人體肺成纖維細胞以5000個細胞/孔在96孔平板中培養一天。在將培養基更換為0.1％BSA基本培養基後，將細胞用FGF-2或有或無IL-1α的血管生成多肽溫育24小時。收集上清並通過ELISA試劑盒(Endogen，Cambridge，MA)分析PGE2。
將人體肺成纖維細胞用FGF-2或血管生成多肽在基本培養基中培養3天，之後加入Alamar藍確定對成纖維細胞生長的作用。FGF-2應示出在10-2500ng/ml的刺激作用，這可用於與血管生成多肽對比刺激作用。實施例24血管生成多肽對血管內皮細胞生長的作用在第一天，將人體臍靜脈內皮細胞(HUVEC)以2-5×104個細胞/35mm平皿密度，種植於含有4％胎牛血清(FBS)，16單位/ml肝素，和50單位/ml內皮細胞生長上清(ECGS，Biotechnique，Inc.)的M199培養基中。在第二天，將培養基用含有10％FBS，8單位/ml肝素的M199更換，加入各種濃度的血管生成多肽和陽性對照如鹼性FGF(bFGF)。在第4和第6天，更換培養基。在第8天，用Coulter計數器確定細胞數目。
HUVEC細胞數目增加表示血管生成多肽可增殖血管內皮細胞。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例25血管生成多肽對血管內皮細胞增殖的刺激作用為評價生長因子的促分裂原活性，用電子偶聯試劑PMS(吩嗪硫酸甲酯)進行比色MTS(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-5-(3-羧甲基苯基)-2-(4-硫代苯基)2H-四唑)分析(CellTiter96 AQ，Promega)。將細胞種植於96孔平板的0.1ml補加血清的培養基中(5000個細胞/孔)，使其附著過夜。在0.5％FBS中血清飢餓12小時後，將有或無肝素(8U/ml)的條件(在0.5％FBS中的bFGF，VEGF165或血管生成多肽)加入孔中48小時。在每個孔中加入20mg的MTS/PMS混合物(1∶0.05)，並在37℃溫育1小時，之後用ELISA平板讀器測定在490nm的吸光度。減去得自對照孔(相同培養基，無細胞)的的背景吸光度，對每種條件在7個孔中並列進行。見Leak等，體外細胞發育生物學，30A512-518(1994)。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例26抑制PDGF誘導的血管平滑肌細胞增殖刺激作用HAoSMC增殖可例如通過BrdUrd摻入而測定。簡而言之，將在4通道玻片上生長的亞鋪滿的靜止細胞用CRP或FITC標記的AT2-3LP轉染。然後，將細胞用10％小牛血清和6mg/ml BrdUrd脈衝。24小時後，使用BrdUrd染色試劑盒(Zymed實驗室)進行免疫細胞化學分析。簡而言之，將細胞暴露於變性溶液後，用生物素醯化的小鼠抗BrdUrd抗體在4溫育2小時，然後用鏈親和素-過氧化物酶和二氨基聯苯胺溫育。
在用蘇木精對染後，將細胞製成標本用顯微鏡檢查，並計數BrdUrd陽性細胞。以BrdUrd陽性細胞與總細胞數的百分比計算BrdUrd指數。另外，對各個細胞進行BrdUrd染色(核)和FITC吸收(胞質)的刺激性檢測，通過伴隨使用明視野照明和暗視野-UV螢光照明進行。見Hayashida等，生物化學雜誌6271(36)21985-21992(1996)。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例27刺激內皮遷移本實施例用於探究血管生成多肽可刺激淋巴內皮細胞遷移的可能性。
用48孔微趨化室進行內皮細胞遷移分析(Neuroprobe Inc.。CabinJohn，MD；Falk，W.，等，免疫學方法雜誌1980；33239-247)。將8um孔規格的無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜，用0.1％明膠在室溫包被至少6小時，並在無菌空氣中乾燥。將測試物在補加0.25％牛血清白蛋白(BSA)的M199中稀釋為適當濃度，並將25ul終稀釋液置於修改的Boyden設備的下面腔室內。將亞鋪滿的，早期傳代(2-6)HUVEC或BMEC培養物進行衝洗，並用胰蛋白酶消化達到細胞分離所需的最少的時間。在將濾膜置於下面和上面腔室之間後，將懸浮於含有1％FBS的50ul M199中的2.5×105個細胞種植於上面間隔間中。然後將此設備在37℃在5％ CO2的潮溼腔中溫育，以使細胞遷移。在溫育階段後，除去濾膜並將濾膜上面未遷移的細胞用橡膠刮棒刮掉。將濾膜用甲醇固定並用Giemsa溶液染色(Diff-Quick，Baxter，McGraw Park，IL)。通過計數在每個孔中3個隨機高能域(40×)的細胞數對遷移進行定量，所有組均以一式四份進行。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例28；通過內皮細胞刺激氧化氮產生由血管內皮釋放的氧化氮確信是血管內皮鬆弛的中介體。因此，血管生成蛋白活性可通過確定由內皮細胞對血管生成多肽應答而產生的氧化氮而分析。
氧化氮是在96孔平板中測定的，該平板鋪滿飢餓24小時接著暴露於各種水平陽性對照物和血管生成多肽4小時的微血管內皮細胞。在通過硝酸鹽還原酶還原氧化氮產生的硝酸鹽後，使用Griess試劑測定總硝酸鹽，從而確定培養基中的氧化氮。血管生成多肽對氧化氮釋放的作用在HUVEC上檢測。
簡而言之，從培養的HUVEC單層細胞中釋放的氧化氮是用氧化氮特異性極譜儀電極與氧化氮儀表(Iso-NO，World PrecisionInstruments Inc.)連接而測定的。氧化氮的校準根據以下等式進行
2KNO2+2KI+2H2SO462NO+I2+H2O+2K2SO4標準校正曲線是通過在含有KI和H2SO4的校準溶液中加入梯度濃度的KNO2(0，5，10，25，50，100，250，和500nmol/L)而獲得的。Iso-NO電極對氧化氮的特異性預先通過測定真正氧化氮氣體中的氧化氮(1050)而確定。除去培養基並將HUVECs用Dulbecco’s磷酸鹽緩衝鹽水衝洗兩次。然後將細胞在6孔平板中的5ml過濾的Krebs-Henseleit溶液中水浴，並將細胞平板保持在玻片溫熱器中(Lab Line Instruments Inc.)。溫度保持在37℃。將氧化氮傳感器探針垂直插入孔中，保持電極尖端在溶液下2mm，之後加入不同條件。將S-亞硝基乙醯基青黴素胺(SNAP)用作陽性對照物。釋放的氧化氮數量以pmol/1×106個內皮細胞表示。報導的所有數值均是在每組中進行4-6次測定的平均值(細胞培養孔的數目)。見Leak等，生物化學和生物生理學研究綜述21796-105(1995)。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例29血管生成多肽對血管形成中條索形成的作用血管形成的另一步驟是條索形成，表現為內皮細胞分化。本生物分析測定當在體外培養時，微血管內皮細胞形成類毛細管結構(中空結構)的能力。
CADMEC(微血管內皮細胞)購自Cell Applications，Inc.作為增殖(2期)細胞，並在Cell Applications的CADMEC數值培養基中培養，及在5期使用。為進行體外血管生成分析，將48孔細胞培養平板的孔用Cell Applications的吸附因子培養基(200ml/孔)在37℃包被30分鐘。將CADMEC以7500個細胞/孔種植於包被的孔中，並在生長培養基中培養過夜。然後將生長培養基用含有對照緩衝液或血管生成多肽(0.1-100ng/ml)的300mg Cell Applications的條索形成培養基中置換，並將細胞另外培養48小時。類毛細管條索的數目和長度通過使用Boeckeler VIA-170圖像顯影分析儀而定量。所有分析均一式三份。
商購(RD)的VEGF(50ng/ml)用作陽性對照。b-雌二醇(1ng/ml)用作陰性對照。將適當的緩衝液(無蛋白質)也用作對照。本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例30對雞絨毛尿囊膜的血管生成作用雞絨毛尿囊膜(CAM)是檢測血管生成的一完好建立的系統。在CAM上的血管形成易於觀測及可定量。可在CAM中檢測血管生成多肽刺激血管生成的能力。將白來亨雞(Gallus gallus)和日本qual(Coturnix coturnix)的受精卵在37.8℃和80％溼度溫育。將16天齡雞和13天齡qual胚胎的分化的CAM用以下方法研究。在發育的第4天，在雞蛋的蛋殼上穿一個洞。選擇正常發育的胚胎並用cellotape將雞蛋密封。將其進一步溫育直至第13天。將Thermanox蓋玻片(Nunc，Naperville，IL)切割為直徑大約為5mm的圓片。將無菌和無鹽生長因子溶解於蒸餾水中並用移液管將大約3.3mg/5ml滴至圓片上。在空氣中乾燥後，將圓片倒轉置於CAM上。3天後，將樣品在3％戊二醛和2％甲醛中固定，並用0.12M 甲次砷酸鈉緩衝液衝洗。將其用立體顯微鏡〔Wild M8〕照相，並包埋如上述作半及超薄切片。對照組是用只有載體的圓片進行的。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例31在小鼠中用matrigel植入體進行血管生成分析對血管生成多肽的體內血管生成分析，測定現有的毛細血管網在植入的小鼠胞外基質物的膠囊(Matrigel)中形成新血管的能力。將蛋白質與液態Matrigel在4℃混合，然後將混合物皮下注射至小鼠，在注射處其凝固。7天後，除去Matrigel的固體「栓」，並檢測其中新血管的存在情況。Matrigel購自Becton DickinsonLabware/Collaborative Biomedical Products。
當在4℃解凍時，Matrigel物是液態的。將Matrigel與血管生成多肽以150ng/ml在4℃混合，並抽吸入冷卻的3ml針管中。將大約8周齡的雌性C57B1/6小鼠，用Matrigel和試驗蛋白的混合物在腹部中間的兩處位置注射(0.5ml/處)。7天後，將小鼠通過頸部脫臼而處死，除去Matrigel栓並清潔(即除去所有黏性膜和纖維組織)。將複製的整個栓子在中性緩衝的10％甲醛中固定，包埋於石臘中，並在用Masson’sTrichrome染色後，用於製備組織切片。從每個栓子的3個不同區域進行橫切面。將選擇的切片染色以檢測vWF的存在情況。此分析的陽性對照是牛鹼性FGF(150ng/ml)。單獨Matrigel用於確定血管形成的基本水平。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例32在兔下肢模型中拯救局部缺血為研究血管生成多肽對局部缺血的體內作用，兔下肢局部缺血模型通過手術除去一條股動脈而產生的(Takeshita，S.等，AmJ.Pathol1471649-1660(1995))。切除股動脈導致血栓逆向增殖及髂外動脈閉塞。結果，血液流向局部缺血肢體依賴於源自髂內動脈的側支血管(Takeshita，S.等，Am J.Pathol1471649-1660(1995))。間隔10天使兔在手術後恢復及內源性側支血管產生。在手術後10天(0天)，進行基線血管造影后，將局部缺血肢體的髂內動脈，用500mg編碼血管生成多肽的裸表達質粒，使用水凝膠包被的氣囊導尿管，通過動脈基因轉移方法轉染(Riessen，R.等，人體基因治療4749-758(1993)；Leclerc，G.等，臨床研究雜誌90936-944(1992))。當在此處理中使用編碼血管生成多肽的DNA時，將一丸500mg血管生成蛋白或對照物在1分鐘以上的時間，通過導尿管灌注輸送至局部缺血肢體的髂內動脈中。在第30天，在這些兔中測定各種參數(a)BP比率—局部缺血肢體與正常肢體的收縮壓比率；(b)血流與流量—靜止FL在未加寬條件下血流和最大FL在充分加寬條件下血流(也是間接測定血管數量)和流量是通過最大FL與靜止FL的比率表示；(c)angiographic血管造影結果—這是通過側支血管造影測定的。此結果是通過覆蓋載網中循環百分率確定的，此覆蓋載網中具有由兔股動脈總數分開的交叉的不透明的動脈；(d)毛細管密度—側支毛細管數目在取自下肢的光學顯微鏡切片中確定。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例33血管生成蛋白對血管舒張的作用由於血管內皮的擴張對降低血壓是重要的，因此檢測血管生成多肽在自發高血壓大鼠(SHR)中影響血壓的能力。將增加劑量的血管生成多肽(0，10，30，100和900mg/kg)施用於13-14周齡的自發高血壓大鼠(SHR)中。數據以平均值+/-SEM表示。用成對t-試驗進行統計學分析，及有統計學意義的是對單獨緩衝液應答的p＜0.05。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例34大鼠局部缺血皮瓣模型評價參數包括皮膚血流，皮膚溫度，和因子VIII免疫組織化學或內皮鹼性磷酸酶反應。在皮膚局部缺血期間血管生成蛋白的表達使用原位雜交法研究。
此模型中的研究分為以下三部分a)局部缺血b)局部缺血皮膚傷口c)正常傷口試驗方法包括a)取3×4cm，單一血管的全層隨機皮瓣(動物下肢的myocutaneous皮瓣)b)在局部缺血皮膚(皮瓣)中作一切口(直徑4-6mm)c)用1mg-100mg劑量範圍的血管生成多肽對切口(在作切口0，1，2，3，4天後)進行局部處理d)在作切口3，5，7，10，14和21天後收集傷口組織，以進行組織學，免疫組織化學和原位研究。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例35周圍動脈疾病模型使用血管生成多肽的血管生成性治療是一種新的治療方法，以在周圍動脈疾病情況下，在局部缺血周圍重建血流。實驗方法包括a)將一側股動脈結紮使該下肢肌產生局部缺血，其它下肢作為對照。
b)將劑量在20-500mg範圍內的血管生成蛋白，每周經靜脈內和/或肌內注射3次(可更多次)，連續2-3周。
c)在結紮股動脈1，2和3周後收集局部缺血的肌組織，分析血管生成蛋白的表達和組織學分析。對照下肢的正常肌組織也進行活檢。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例36局部缺血性心肌疾病模型血管生成多肽經評價是能在冠狀動脈閉塞後刺激側支血管發生並重建新血管的潛在促分裂原。血管生成蛋白表達的變化是在原位檢測的。實驗方法包括a)在大鼠經左側胸廓切開術暴露心臟。立即用細縫合線(6-0)結紮左側冠狀動脈並關閉胸腔。
b)將劑量為將劑量在20-500mg範圍內的血管生成蛋白，每周經靜脈內和/或肌內注射3次(可更多次)，連續2-3周。
c)在手術後30天，除去心臟並作橫切面以進行形態學和原位分析。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例37大鼠角膜傷口癒合模型動物模型示出血管生成多肽對新血管生成的作用。實驗方法包括a)在角膜中心作一長度為1-1.5mm的切口至基質層。
b)在切口邊緣下插入spatula貼在眼角膜外。
c)作一口袋(其底部是在眼緣1-1.5mm形成)。
a)將含有50ng-5ug血管生成多肽的小球置於口袋內。
b)也可在角膜傷口局部以20mg-500mg劑量進行血管生成多肽處理(日一次共5天)。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例38糖尿病小鼠和糖皮質激素減少的傷口癒合模型A.糖尿病db+/db+小鼠模型為證實血管生成多肽可促進癒合過程，使用遺傳性糖尿病小鼠傷口癒合模型。在db+/db+小鼠中的全層傷口癒合模型是經充分定性，臨床相應和可再生的削弱的傷口癒合模型。糖尿病傷口癒合除了組織收縮外依賴於組織粗糙表面形成和再上皮化(Gartner，M.H.等，外科學研究雜誌52389(1992)；Greenhalgh，D.G.等，病理學雜誌1361235(1990))。
糖尿病動物有許多在II型糖尿病mellitus中觀測到的特徵。純合(db+/db+)小鼠比其孿生的正常雜種(db+/+m)肥大。突變的糖尿病(db+/db+)小鼠在第4染色體(db+)上有一單獨的常染色體隱性突變(Coleman等，美國科學院院報77283-293(1982))。動物表現為多食，多飲，多尿症。突變的糖尿病小鼠(db+/db+)血糖高，胰島素水平提高或正常，細胞免疫受抑制(Mandel等，免疫學雜誌，1201375(1978)；Debray-Sachs，M.等，免疫學臨床實驗51(1)1-7(1983)；Leiter等，病理學雜誌11446-55(1985))。在這些動物體內已闡述有周圍神經病變，心肌病變等併發症，和微血管損害，基底膜增厚和腎小球濾過異常(Norido，F.等，實驗神經學83(2)221-232(1984)；Robertson等，糖尿病29(1)60-67(1980)；Giacomelli等，實驗進展40(4)460-473(1979)；Coleman，D.L.糖尿病31(Suppl)1-6(1982))。這些純合糖尿病小鼠產生高血糖症，其對與人II型糖尿病相似的胰島素有抗性。
由在這些動物中觀測的特徵推斷，在此模型中的傷口癒合可與在人糖尿病患者中觀測的傷口癒合相似(Greenhalgh等，病理學雜誌1361235-1246(1990))。
在此項研究中(Jackson實驗室)使用遺傳的糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠及其孿生非糖尿病(db+/+m)雜種。購買6周齡的動物，並在8周齡開始研究。將動物置於單室中並無限制的給予食物和水。所有操作均使用無菌方法進行。根據人體基因組科學公司動物飼養和使用委員會的條例和指導，及實驗動物的飼養和使用指導進行實驗。
根據先前報導的方法產生傷口(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，實驗方法雜誌172245-251(1990))。簡而言之，在產生傷口當天，將動物經腹膜內注射溶解於去離子水中的Avertin(0.01mg/ml)，2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇而麻醉。刮削動物的脊背區域，並用70％乙醇溶液和碘酒衝洗皮膚。在產生傷口之前將手術部位用無菌紗布使其乾燥。然後用Keyes組織打孔器產生一8mm全層傷口。在傷口產生後，立即將周圍皮膚輕輕伸展以消除傷口擴展。在試驗期間將傷口開放保持。從產生傷口當天連續5天局部應用給定的處理方法。在處理之前，將傷口輕輕用無菌鹽水和紗布清潔。
在手術當天及之後間隔2天的固定間隔時間，對傷口進行觀測和照相。在第1-5天和第8天，每天測定傷口閉合情況。使用校準的Jameson測徑器水平及垂直地測定傷口。如果可觀測到的粗糙表面的組織不是很長，且傷口由連續上皮覆蓋，則可認為傷口癒合。
將血管生成多肽在載體中，以每處傷口每天施用4mg-500mg範圍內不同劑量的血管生成多肽，連續8天。對照組施用50ml的載體溶液。
將動物在第8天經腹膜內注射戊巴比妥鈉(300mg/kg)而安樂死。然後收集傷口和周圍皮膚進行組織學和免疫組織化學分析。將組織樣品置於活檢組織盒中10％中性緩衝的福馬林中以進一步加工。對3組每組10隻動物(5隻糖尿病及5隻非糖尿病對照)進行評價1)載體安慰劑對照2)血管生成蛋白通過在垂直軸和水平軸測定範圍和所得傷口總面積對傷口閉合情況進行分析。然後通過確定在開始(0天)傷口面積和處理後(第8天)的傷口面積之間的差異，評價傷口收縮情況。在0天傷口面積為64mm2，相當於在皮膚上打孔大小。用以下公式進行計算〔在第8天開放面積〕-〔在第1天開放面積〕/〔在第1天開放面積〕。樣品固定於10％緩衝的福馬林中，並將石臘包埋的樣品垂直於傷口表面切片(5mm)，並使用Reichert-Jung切片機切割。對截開的傷口組織的橫切面進行常規HE染色。對傷口組織進行組織學測試，以確定通過用血管生成多肽處理是否改變所修復皮膚的癒合過程和形態學表現。此確定包括確認細胞積聚，炎症細胞，毛細管，成纖維細胞，再上皮化和表皮完備情況(Greenhalgh，D.G.等，病理學雜誌1361235(1990))。目測不準可使用校準的透鏡測微計。
將組織切片也用多克隆兔抗人角蛋白抗體，經ABC Elite檢測系統進行免疫組織化學染色。將人體皮膚用作陽性組織對照而非免疫IgG用作陰性對照。角質細胞生長通過用校準的透鏡測微計檢測傷口的再上皮化情況而確定。
皮膚樣品中增殖細胞核抗原/細胞周期蛋白(PCNA)通過使用抗PCNA抗體(1∶50)，經ABC Elite檢測系統證實。人結腸癌作為陽性對照，人腦組織用作陰性對照。每個樣品包括具有原始抗體omission和非免疫小鼠IgG取代的切片。這些切片基於增殖情況排列在0-8刻度，較低刻度表示輕度增殖，較高刻度表示強度增殖。實驗數據使用不成對的t檢驗分析。P值＜0.05表示有效。B.類固醇削弱的大鼠模型通過類固醇抑制傷口癒合已在各種體外和體內系統中充分證明(Wahl，S.M.糖皮質激素和傷口癒合，抗炎類固醇作用基本和臨床方面，280-302(1989)；Wahl，S.M.等，免疫學雜誌115476-481(1975)；Werb，Z.等，實驗方法雜誌1471684-1694(1978))。糖皮質激素通過抑制血管形成，降低血管通透性(Ebert，R.H.，等，An.Intern.Med.37701-705(1952))，成纖維細胞增殖和膠原合成(Beck，L.S.等，生長因子5295-304(1991)；Haynes，B.F.等，臨床進展雜誌61703-797(1978))，並產生循環血中單核細胞瞬時減少(Haynes，B.F.等，臨床進展雜誌61703-797(1978)；Wahl，S.M.，「糖皮質激素和傷口癒合」，抗炎類固醇作用基本和臨床方面，科學出版社，紐約，pp.280-302(1 989))，從而阻礙傷口癒合。對癒合力下降的傷口系統性施用類固醇在大鼠中已是充分確定的現象(Beck，L.S.等，生長因子5295-304(1991)；Haynes，B.F.等，臨床進展雜誌61703-797(1978)；Wahl，S.M.「糖皮質激素和傷口癒合」，抗炎類固醇作用基本和臨床方面，科學出版社，紐約，pp.280-302(1989)；Pierce，G.F.等，美國科學院院報862229-2233(1989))。
為證實血管生成多肽可促進癒合過程，對在大鼠全層皮膚切口處重複局部應用血管生成多肽的作用進行確定，其中傷口癒合已通過系統施用甲基強的松龍而削弱。
在此實施例中使用年幼的雄性Sprague Dawley大鼠重250-300g(Charles River實驗室)。在8周齡購買動物並在9周齡開始研究。大鼠中傷口癒合應答通過在創傷時系統性施用甲基強的松龍(肌注17mg/kg/鼠)而削弱。將動物單室飼養並無限制給予食物和水。所有操作均用無菌方法進行。此研究根據人體基因組科學公司動物飼養和使用委員會的條例和指導，及實驗動物的飼養和使用指導進行實驗。
創傷方法根據以上A章節所述進行。在創傷當天，將動物通過肌注酮亞胺(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉。削刮該動物的脊背區並用70％乙醇和碘酒溶液衝洗皮膚。手術區域在創傷之前用無菌紗布乾燥。用Keyes組織打孔器產生一8mm全層傷口。在試驗期間將傷口保持開放。在產生當天對試驗動物開始局部每天施用給定方法連續7天，隨後施用甲基強的松龍。在處理之前，將傷口用無菌鹽水和紗布輕輕清潔。
在手術當天及處理結束期間以固定間隔時間，對傷口進行觀測和照相。在第1-5天和第8天，每天測定傷口閉合情況。使用校準的Jameson測徑器水平及垂直地測定傷口。如果可觀測到的粗糙表面的組織不是很長，且傷口由連續上皮覆蓋，則可認為傷口癒合。
將血管生成多肽在載體中，以每處傷口每天施用4mg-500mg範圍內不同劑量的血管生成多肽，連續8天。對照組施用50ml的載體溶液。
將動物在第8天經腹膜內注射戊巴比妥鈉(300mg/kg)而安樂死。然後收集傷口和周圍皮膚進行組織學和免疫組織化學分析。將組織樣品置於活檢組織盒中10％中性緩衝的福馬林中以進一步加工。
對4組每組10隻動物(5隻用甲基強的松龍處理及5隻未用糖皮質激素處理)進行評價1)未處理組
2)載體安慰劑處理3)血管生成多肽處理組通過在垂直軸和水平軸測定範圍和所得傷口總面積對傷口閉合情況進行分析。然後通過確定在開始(0天)傷口面積和處理後(第8天)的傷口面積之間的差異，評價傷口收縮情況。在0天傷口面積為64mm2，相當於在皮膚上打孔大小。用以下公式進行計算〔在第8天開放面積〕-〔在第1天開放面積〕/〔在第1天開放面積〕樣品固定於10％緩衝的福馬林中，並將石臘包埋的樣品垂直於傷口表面切片(5mm)，並使用Reichert-Jung切片機切割。對截開的傷口組織的橫切面進行常規HE染色。對傷口組織進行組織學測試，以確定通過用血管生成多肽處理是否改善所修復皮膚的癒合過程和形態學表現。目測不準可使用校準的透鏡測微計。
實驗數據使用不成對的t檢驗分析。P值＜0.05表示有效。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例39淋巴腺瘤動物模型本實驗方法的目的是產生一適當的和一致的淋巴腺瘤模型，以測試血管生成多肽在大鼠後肢淋巴管發生和淋巴循環系統的重建中的治療作用。通過受影響的肢體的膨脹體積，淋巴管定量，總血漿蛋白和組織病理學測定作用效果。對急性淋巴腺瘤觀測7-10天。也許更重要地，腺瘤的慢性進程在隨後的3-4周。在開始手術之前，抽取血壓樣品急性蛋白質濃度分析。將約重350g的雄性大鼠施用戊巴比妥。接著，將右肢從膝至臀削刮。削刮區域用在70％EtOH中浸溼的紗布擦拭。抽取血壓以進行總蛋白測試。在標記兩個測定水平(足跟上0.5cm，脊背與腳爪中間)之後，測定周長和體積，之後將染料注射腳爪中。將右腳爪和左腳爪均皮內注射0.05ml的1％Evan’s藍。在將染料注射入腳爪後測定周長和體積。
以膝關節為界，對腿中部腹股溝作環形切口以定位股動脈。用鑷子和止血鉗剝離和分離皮瓣。在定位股動脈後，定位與股動脈伴行的淋巴管。然後將在此區域內的主要淋巴管電凝或縫合結紮。
使用顯微鏡對腿後肌肉(在半腱肌和內收肌附近)鈍性分離。然後定位膕窩部淋巴結。通過縫合結紮2條最接近的和2條末梢淋巴管和膕窩淋巴結末梢血供。然後通過切除結締組織抽取膕窩淋巴結及任何附屬脂肪組織。
注意控制在此方法中產生的任何輕微出血現象。在淋巴管閉塞之後，將皮瓣用液態皮膚(Vetbond)(AJ Buck)密封。將分離的皮膚邊緣密封於肌組織之下，在腿周圍剩餘約0.5cm的縫隙。當需要時，也可將皮膚通過縫合於肌組織之下而固定。
為避免感染，將動物單獨置於網眼室中(無草墊)。每日通過最佳水腫峰值檢測恢復的動物，最佳水腫峰值典型的發生在第5-7天。然後觀測穩定的水腫峰值。為估計淋巴腺瘤密度，在處理之前和之後7天，在每個腳爪上2個指定位置測定周長和體積。測定血漿蛋白對淋巴腺瘤的作用，及研究蛋白質分析是否是有益的測試周長。在2個位置評價對照和水腫肢體的重量。以盲試進行分析。
測定周長將動物用氣體簡單麻醉以預防肢體活動，用布帶測定肢體周長。2個不同的人在踝骨和腳爪進行測定，然後對這兩個結果進行平均。結果得自對照組和水腫肢體。
測定體積；在手術當天，在手術之前將動物用戊巴比妥麻醉並測試。為每日測定體積，將動物用三氟溴氯乙烷簡單麻醉(迅速固定並迅速恢復)，對兩腿進行削刮並用防水標記在腿上相等標記。將腿首先浸在水中，然後將腿浸於儀器中至每個標記水平，接著通過Buxco水腫軟體(Chen/Victor)進行測定。一個人記錄數據，另一人將肢體浸至標記部位。
血漿蛋白測定在手術前抽取血液，旋轉，並分離血清，然後測定總蛋白並對比Ca2+。
肢重對比在抽取血液後，製備動物以收集組織。將肢體用quillitine切除，然後將試驗和對照腿在繃帶處切割並稱重。分離tibiocacaneal關節再稱重，並稱重足部。
組織學製備將位於膝後部(膕窩)的橫紋肌分割，並備於金屬模子中，用冷凍凝膠充填，浸於冷凍甲基丁烷中，在-80℃置於標記的樣品包中直至切片。依賴於切片，在螢光顯微鏡下觀測肌組織所含淋巴情況。本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例40通過血管生成多肽抑制TNF-α誘導的粘著分子表達炎症和血管發生部位淋巴細胞的募集包括在淋巴細胞上細胞表面粘著分子(CAMs)與血管內皮之間的特異性受體—配體相互作用。在正常和病理狀態下的粘著過程及隨後的多步級聯，包括在內皮細胞(EC)上胞內粘著分子-1(ICAM-1)，血管細胞粘著分子-1(VCAM-1)和內皮白細胞粘著分子-1(E-selectin)表達。這些分子和其它分子在血管內皮上的表達確定在炎症應答發生期間，白細胞可粘著於局部血管並從血管中滲入局部組織中。細胞因子和生長因子的局部濃度參與調節這些CAMs的表達。
腫瘤壞死因子α(TNF-α)，一種潛在的前炎症細胞因子，是內皮細胞上所有三種CAMs的刺激劑，並可包含於各種炎症應答中，通常產生病理結果。
對血管生成多肽抑制TNF-α應答的CAM表達的潛力可進行檢測。當用血管生成蛋白家族成員共刺激時，應用一種修改的ELISA分析測定在TNF-α處理的Ecs上CAM表達的數量，修改的ELISA分析使用ECs作固相吸收劑。為進行試驗，人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)培養物得自集合的臍帶，並在37℃保持於含有5％CO2的溼化的溫育器中補加10％FCS和1％青黴素/鏈黴素的生長培養基中(EGM-2；Clonetics，San Diego，CA)。將HUVECs在37℃，以1×104個細胞/孔的密度種植於96孔平板中EGM培養基中，溫育18-24小時或直至鋪滿。接著將此單層細胞用補加100U/ml青黴素和100mg/ml的無血清RPMI-1640溶液衝洗3次，並用給定的細胞因子和/或生長因子在37℃處理24小時。在溫育後，評價細胞CAM表達情況。
將人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)種植於標準96孔平板中至鋪滿。從細胞中除去生長培養基，並用90ul的199培養基(10％FBS)更換。將測試樣品和陽性或陰性對照物一式三份加入平板中(10ul體積)。將平板在37℃溫育5小時(選擇蛋白和整聯蛋白表達)或24小時(只是整聯蛋白表達)。從平板中吸出培養基並將100ul的0.1％低聚甲醛-PBS(具有Ca2+和Mg2+)加入每個孔中。將平板在4℃保持30分鐘。然後從孔中除去固定劑，並將孔用PBS(具有Ca2+和Mg2+)+0.5％BSA衝洗一次，並排出液體。不要使孔乾燥。向測試孔和對照孔中加入10ul稀釋的原始抗體。使用10ug/ml的抗-ICAM-1-食物素，抗-VCAM-1-生物素和抗-E-選擇蛋白-生物素(0.1mg/ml原種抗體的1∶10稀釋液)。將細胞在溼化環境下在37℃溫育30分鐘。將孔用PBS(具有Ca2+和Mg2+)+0.5％BSA衝洗3次。
然後將20ul稀釋的ExtrAvidin-鹼性磷酸酶(1∶5000稀釋度)加入每個孔中，並在37℃溫育30分鐘。將孔用PBS(具有Ca2+和Mg2+)+0.5％BSA衝洗3次。將一片p-硝基苯酚磷酸鹽(pNPP)溶解於5ml甘氨酸緩衝液(pH10.4)中。將甘氨酸緩衝液中100ul pNPP底物加入每個測試孔中。用甘氨酸緩衝液中以下稀釋度的ExtrAvidin-鹼性磷酸酶一式三份製備標準孔1∶5000(100)＞10-0.5＞10-1＞10-1.5。將5ul每種稀釋液加入一式三份孔中，每個孔中所得AP含量為5.50ng，1.74ng，0.55ng，0.18ng。然後必須將100ul pNPP加入每個標準孔中。平板必須在37℃溫育4小時。將50ul的3M NaOH加入所有孔中。在405nm在平板讀器上對結果進行定量。對只用甘氨酸緩衝液充填的空白孔中使用減少選項背景。設立模板以表明在每個標準孔中AP-綴合物的濃度(5.50ng；1.74ng；0.55ng；0.18ng)。結果以每個樣品中結合的AP-綴合物數量表示。
本實施例中所述研究是在血管生成蛋白中測試活性。然而，本領域技術人員對例證的研究可加以修改，以測試編碼血管生成多肽(如基因治療)，其激動劑，和/或拮抗劑的多核苷酸活性。實施例41免疫接種小鼠以產生單克隆抗體將動物單室飼養並無限制給予食物和水。所有操作均以無菌方法進行。根據人體基因組科學公司動物飼養和使用委員會的條例和指導，及實驗動物的飼養和使用指導進行實驗。
將蛋白質在350ul磷酸鹽緩衝液(PBS)或其它中性緩衝液中稀釋，至終濃度為0.43mg/ml。用0.35ml Freund’s完全佐劑，乳化佐劑和蛋白質溶液10分鐘，使用3cc玻璃針管和3路可任意使用的活塞(Baxter Cat.No.2C6240)。為定性測試乳化，將50ul乳化液置於傾口燒杯中冰水表面。如果乳化液不保持完整白色滴狀，則需要進一步混合。
將所有乳狀液抽吸入一個針管中，使用27號針頭，用總量為200ul的乳狀液皮下注射小鼠的4-8處，包括腋窩和腹股溝區，頸後和背部。
在2-3周後，用Freund’s不完全佐劑(與Freund’s完全佐劑相對)重複上述注射步驟。
又2-3周後，再進行第三次上述注射步驟，使用Freund’s不完全佐劑。
在第三次注射後10-14天，通過將小鼠尾靜脈放血獲得100-200ul血液。將血液在37℃溫育60分鐘，然後在4℃冷卻過夜。在4℃溫育後，將血液離心10分鐘。將血清移至新試管中，並測試小鼠血清滴定。如果發現滴定較低，可間隔二周腹膜內(ip)注射一次。為進行ip注射，在200-400ul的PBS/小鼠中製備10-20ug蛋白質/小鼠。使用1cc針管和26號針頭將此溶液注射入小鼠中。在注射後10-14天進行第二次尾部靜脈放血，並再測試小鼠血清滴定。實施例42小鼠血清滴定ELISA用2ug/mlPBS的純化的抗原以50ul/孔包被ELISA平板。將ELISA平板用石臘膜包被並在溼化腔中在4℃溫育過夜。在溫育後，用200ul/孔PBS將平板衝洗4次。用3％BSA以200ul/孔在室溫封阻60分鐘。搖動出封阻液。
將在含有0.1％BSA的PBS中稀釋10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，和10-7的血清樣品，以50ul/孔雙份加入。空白緩衝液以及陽性和陰性對照血清均以上述稀釋度稀釋。在室溫溫育1-2小時。用PBST(具有0.05％ Tween的PBS)以250ul/孔衝洗4次。
將在含有0.1％BSA和2％馬血清的PBST中，濃度為0.5ug/ml的生物素腺化的抗小鼠IgG以50ul/孔加入。在室溫溫育30-60分鐘。用PBST衝洗平板4次。
向平板中加入50ul/ml ABC試劑(Vector Cat.No.PK-6100)並在室溫溫育30分鐘。用PBST衝洗平板6次。
將1片四甲基聯苯胺二鹽酸(TMB)(Sigma Cat.No.T-3405)溶解於5ml的ddH2O中以製備底物進行ELISA檢測。加入5ml的0.1M磷酸檸檬酸鹽緩衝液(25.7ml的0.2M NaH2PO4，24.3ml的0.1M檸檬酸單水合物，pH5.0)。加入2ul新鮮30％過氧化氫，旋動並立即使用。
在溫育和衝洗平板之後，加入100ul底物溶液並在室溫溫育大約15-30分鐘。通過加入25ul/孔 2M H2SO4終止反應，並在30分鐘內在450nm讀平板。實施例43產生雜交瘤的融合方法在融合前一周，生產P3X培養基(1X DMEM 0％(GibcoCat.No.11965-019)，5-10％胎牛血清，1X L-穀氨醯胺(BiofluidsCat.NO.300)，和1X丙酮酸鈉(Biofluids Cat.NO.333))。將一新瓶P3X小鼠骨髓瘤細胞在6孔平皿的一個孔中解凍(見前述解凍方法)，並在P3X生長培養基中擴展它們。如果生存力良好，第二天將它們移至一100mm平皿中。細胞密度必須不超過106個細胞/ml或更高。另外，這些細胞的細胞膜外觀不應是粒狀的。在進行融合步驟當天，應有5-8×105個細胞/ml的6-8個平板。在HAT培養基中測試一些P3X細胞是一個好主意。所有細胞應在大約4天內死亡。如果不，則應將P3X細胞在含有15ug/ml 8-氮鳥嘌呤的P3X培養基中生長以消除回復體。
在進行融合步驟前4天，應將小鼠經ip注射大約10ug高純度蛋白質而免疫。
在融合前一天，將P3X細胞割裂並將它們用所需新鮮培養基供養，以便使細胞健康並在第二天生長於對數期。
在融合當天，將50ml P3X培養基，PEG溶液和HAT培養基(1×DMEM0％，20％胎牛血清，補加BM Condimed HI的4％雜交瘤(Boehringer Mannheim)，1×NEAA，1×丙酮酸鈉，1×HAT(SigmaCat.No.H0262)，1×0.05M 2ME，和1×青黴素—鏈黴素)置於37℃水浴中。可使用大約100ml冷卻的DMEM0％。
對所有P3X細胞平板檢測可能的汙染情況並確定細胞健康狀況。從4個平板或燒瓶中將細胞再懸浮，並組合在50ml試管中。在200×G離心10分鐘。吸儲使其。用10ml DMEM0％將每個試管再懸浮併集合。用臺盼藍生存染色計數活細胞數(生存力應高於90％)。細胞總數應為2-4×107個細胞。如果沒有足夠的細胞，用更多的平板重複進行此方法。將細胞置於周圍室溫(ART)中直至需要進行下一步驟。
製備hood，其中脾用以下物質除去70％EtOH，無菌儀器包括濾網和栓塞，2個含有10ml DMEM0％的培養皿和15ml離心管(2個)。
將小鼠處死，然後從屍體中收集脾。將脾組織置於含有DMEM0％的培養皿中。將濾網置於另一含有10ml DMEM0％的的平皿中，並用平板蓋覆蓋。用無菌forecep對和帶有針頭的針管將脾組織移至濾網上，整理分開的脾組織以使細胞散落於培養基中。然後，用另一栓塞輕輕將脾組織壓過濾網。避免將脾組織研磨經過濾網，因為這樣將導致巨大的成纖維細胞生長。
除去濾網並將脾細胞懸浮液移至15ml離心管中。用5ml DMEM0％從平皿中衝洗剩餘的細胞，並加入試管中。將試管靜置5分鐘以使大碎片沉於底部。然後將沒有碎片的細胞懸浮液移至另一15ml試管中。將此試管在200×G離心15分鐘。抽吸s/n並將脾細胞再懸浮於5ml DMEM0％中。加入5ml以上的DMEM0％，並將全部體積移至50ml試管中。
除去10ul脾細胞懸浮液，並加入500ul的臺盼藍以計數淋巴細胞數。(注意正常脾產生108個淋巴細胞)。
融合在含有脾細胞的50ml離心管中加入足夠的P3X細胞，以使淋巴細胞與P3X細胞的比率為5∶1(例如108個淋巴細胞需要2×107個P3X細胞)。用DMEM0％將總體積加至45-50ml，並在200×G離心10分鐘。用定時器，溫PEG，溫P3X培養基，和一燒杯大約38-40℃的水製備轉移hood。從P3X-淋巴細胞沉澱中抽吸所有上清，並輕彈試管使沉澱鬆開。將試管置於小水浴中。將融合試管保持在溫水中，輕輕搖動，在1分鐘以上的時間內滴加入1ml PEG。然後，將試管靜置1-2分鐘，偶爾搖動一下，接著在1分鐘以上的時間內滴加入1mlP3X培養基。接著，在1分鐘以上的時間內滴加入3mlP3X培養基，隨後在1分鐘以上的時間內滴加入10ml P3X培養基。
輕輕加入P3X培養基使總體積為45ml。將試管靜置10分鐘，然後在200×G離心10分鐘。抽吸上清並將沉澱輕輕再懸浮於5ml或更少的HAT培養基中。將細胞懸浮液移至含有400ml的HAT培養基的燒瓶中並旋動混合。將一些細胞懸浮液倒入無菌貯液槽中。
用具有過濾吸頭的12道移液器，將細胞以200ul/孔置於96孔平板中。將平板置於溫育器中。每天監測平板的雜交瘤生長或汙染情況。將平板溫育3天。在第7天第一次供養(更換培養基)，用8多支管在每個孔中吸出大約一半的培養基，並更換為100-150ul/孔的HT培養基。供養一周或至第一次篩選之前，以助於稀釋任何由未融合的淋巴細胞產生的抗體，發現未融合的淋巴細胞在培養2周後持續產生抗體。當集落充填孔的一半以上，及上清已變為桔黃色/黃色時，將一些或所有孔均製成樣品，以在融合後2周內進行篩選。實施例44對小鼠雜交瘤進行ELISA篩選為篩選小鼠雜交瘤，將ELISA平板(Immulon 2「U」形底微滴定平板(Dynatech Cat.No.011-010-3555))用2ug/mlPBS的抗原以50ul/孔包被。用塑料蓋覆蓋ELISA平板並在4℃溫育過夜。在溫育後，每次用200ul/孔/的PBS將平板衝洗4次。用3％BSA以200ul/孔在室溫封阻60分鐘。搖動出封阻液。
以150ul/孔將雜交瘤上清加入Corning96孔分析平板中，然後從Corning分析平板的每個孔中移出50ul的上清至ELISA平板中。ELISA平板包括空白培養基以及陽性和陰性小鼠血清對照。在室溫溫育1-2小時，或在4℃溫育過夜。用PBST(PBS+0.05％Tween)以250ul/孔衝洗4次。
加入50ul/孔生物素醯化的抗小鼠IgG H+L，濃度為在含有0.1-0.3％BSA和1％馬血清的PBST中0.5ug/ml。在室溫溫育30-60分鐘。用PBST衝洗平板4次。
在平板中加入50ul/孔的ABC試劑(Vector Cat.No.PK-6100)，並在室溫溫育30分鐘。用PBST衝洗平板6次。
製備進行ELISA檢測的底物，將1片四甲基聯苯胺二鹽酸(TMB)(Sigma Cat.No.T-3405)溶解於5ml ddH2O中。加入5ml的0.1M磷酸檸檬酸鹽緩衝液(25.7ml的0.2M NaH2PO4，24.3ml的0.1M檸檬酸單水合物，pH5.0)。加入2ul新鮮的30％過氧化氫，旋動並立即使用。
在溫育和衝洗平板後，加入100ul底物溶液並在室溫溫育大約15-30分鐘。加入25ul/孔的2M H2SO4終止反應，並在30分鐘內在450nm讀與對照物相對的平板。實施例45測試衍生自培養物上清的單克隆的相對親和性A.確定包被抗原濃度產生大約1ml的抗原，濃度為4ug/mlPBS。移至微稀釋試管中。在9個微稀釋管中均加入0.5mlPBS，然後進行1/2系列稀釋，通過將此管中0.5mlPBS移至起始的4ug/ml試管中進行。使這9個試管含有4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03，0.015，和0.0075ug/ml抗原。將平板用上述濃度的抗原以50ul/孔包被，每個平板包被6個孔。
將平板蓋上並在4℃溫育過夜。在溫育後，每次用200ul/孔PBS將平板衝洗4次。用3％BSA以200ul/孔在室溫封阻60分鐘。搖出封阻液。
觀測對抗原是陽性的小鼠血清的滴定曲線。確定在滴定曲線頂部血清稀釋度。在B-D排，2-11柱中，加入在含有0.1％BSA的PBS中此稀釋度的陽性小鼠血清，50ul/孔。包括以上稀釋度的陰性對照血清在E-G排，2-11柱。在4℃溫育過夜。在溫育之後，在陽性對照血清數值中減去陰性對照血清數值。在線性範圍繪製抗抗原濃度的平均值(O.D.450)。確定提供亞最大O.D.值的抗原包被濃度。這即是由於相關親和分析的包被濃度。B.使用Boehringer Mannheim Biochemica試劑盒「小鼠-IgGELISA」(Cat.No.1333 151)，確定雜交瘤上清樣品的小鼠IgG濃度用ddH2O將包被緩衝液濃縮物稀釋1/10。需要10-20ml。獲取捕捉抗體等份。將3個試管的包被後緩衝液濃縮物(封阻液)解凍。需要12個孔作為標準及對4-6個孔的上清進行測試。計算假定50ul/孔包被體積所需的稀釋的捕捉抗體的ml數。稀釋的捕捉抗體比例如下25ul捕捉抗體/1ml包被緩衝液＝X ul捕捉抗體/# ml包被緩衝液用溶液包被Nunc平板並在室溫在搖動器中溫育30分鐘。用ddH2O將包被緩衝液濃縮物稀釋1/10。用ELISA衝洗緩衝液衝洗平板(0.9％NaCl，0.1％Tween 20)，並用200ul/孔包被後緩衝液(封阻液)在室溫封阻15分鐘。將IgG標準物在包被後緩衝液(封阻液)中稀釋為以下濃度0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125和0.00625ug/ml。
將上清在封阻液中稀釋至終濃度為1/100和1/1000。在封阻後，衝洗平板並以雙份加入50ul/孔稀釋的IgG標準物和稀釋的上清。在搖動器中在室溫溫育30分鐘。
將綴合溶液在包被後緩衝液(封阻液)中根據以下比例稀釋50ul綴合物/1ml封阻液＝X ul綴合物/#ml封阻液衝洗平板並加入50ul/孔綴合物。將平板在搖動器中在室溫溫育30分鐘。
將一片底物溶解於5ml底物緩衝液中。衝洗平板並加入50ul/孔底物。在搖動器中在室溫溫育30分鐘，並在405nm讀取。A.相關親和分析用預先確定濃度的抗原在4℃將適當的ELISA平板包被過夜。如上封阻平板。在PBS+0.1％BSA測試上清中產生1/3系列稀釋液。
以雙份或三份在ELISA平板中加入50ul/孔上清樣品稀釋液，包括為稀釋的樣品。陽性對照組由少量含有相同濃度陽性對照小鼠血清的孔組成，由於確定抗原包被濃度。陰性對照組由少量含有稀釋的緩衝液的孔組成。在4℃包被及溫育過夜。
在4個適當參數曲線上繪製抗平均值(O.D.450)的每個上清的IgG濃度。偏於左側的上清曲線是最高親和性的上清。實施例46在小鼠體內產生腹水雜交瘤細胞應是健康的且在對數期生長以產生腹水。將細胞移至15ml試管中並計數。確定含有4×106個細胞的體積，並將此體積移至另一試管中，將細胞離心。將沉澱在0.9ml HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)中再懸浮並移至微量離心管中。
用1cc針管抽取細胞懸浮液並如下對小鼠進行ip注射如果起始細胞數為4×106則每隻小鼠注射0.2cc，如果起始細胞數為3×106則每隻小鼠注射0.3cc。當腹部非常膨大且觸之如氣球時(通常在第9或10天，但有時晚至第14天)，此時為對小鼠進行放腹水的時候。
A.放腹水左手握小鼠，並用酒精棉球擦拭小鼠左後肢上方的腹部區域。將小鼠握在15ml離心管口上，將19號針頭插入腹部。應將腹水立即經針頭末端滴至離心管中。一隻小鼠平均應產生3-6ml的腹水。
B.加工和貯存腹水集合收集自每隻小鼠的腹水(所有小鼠均用相同雜交瘤注射)，並置於室溫下1-2小時，或在37℃放置15-30分鐘。然後將腹水在4℃放置過夜以形成凝塊。將凝集的腹水離心10分鐘。將液體腹水移至50ml離心管中，並在-20℃貯存。接著可將流出物加入此50ml試管中。當處死所有小鼠後，可解凍集合的腹水，再旋轉，並將等份長期貯存於-20℃或-70℃。通過ELISA對腹水進行滴定。
實施例47冷凍和解凍小鼠雜交瘤和骨髓瘤細胞的方法A.冷凍冷凍的細胞應是健康的，在對數期生長且濃度為5-8×105個細胞/ml。將取自6孔平板或燒瓶的再懸浮的細胞移至15ml試管中並計數。計算總細胞數，並分為每瓶1-3×106個細胞，以確定將冷凍的瓶數。
在200-3000×G將細胞離心5-10分鐘。從沉澱中吸出上清並再懸浮於充分冷凍的培養基中(DMEM中50％FBS，10％DMSO；或Origen DMSO冷凍培養基(IGEN)，Fisher Cat.No.IG-50-0715)，以達到所需的每ml細胞數/瓶(細胞密度應在5×105-1×107個細胞/瓶範圍)。立即將細胞懸浮液移至冷凍瓶中，1ml/瓶，並置於冰上。將冷凍瓶置於控制速度冷凍器中，並將冷凍器置於-70℃過夜。24小時後，將冷凍瓶移至液氮槽中或在-130℃冷凍器中長期貯存。
B.解凍將10ml冷凍培養基(如P3X培養基)加入15ml試管中。取含有冷凍細胞的冷凍瓶並置於乾冰上直至進行解凍。將置於37℃水浴中迅速解凍。在解凍期間握住冷凍瓶並輕輕搖動，直至冷凍瓶中只剩下少量冰塊。不要使內容物超過4℃。在冷凍瓶外用乙醇用無菌巴氏吸管且不接觸冷凍瓶的邊緣，將瓶中細胞懸浮液移至10ml冷凍培養基中。在200-300×G離心5-10分鐘。吸出上清並將沉澱再懸浮於6ml HT克隆培養基中(如前)。移至6孔平皿的1個孔中。在24小時後確定生存力。生存力應不小於50％。實施例48體外分析血管生成蛋白的活性以下分析是檢測血管生成蛋白活性，優選VEGF-2活性。例如，通過將編碼Flt-4受體胞外結構域的核苷酸(SEQ ID NO27)(Galland等，基因組13(2)475-478(1992)，以其全文併入參考)，與編碼Flk-1的跨膜域和胞內域的核苷酸(SEQ ID NO28)(Davis-Smith等，EMBO雜誌15(18)4919-4927(1996)，以其全文併入參考)融合，產生嵌合受體。因此，嵌合抗體包括分別融合於SEQ IDNO28的765-1356位胺基酸的SEQ ID NO27的1-775位胺基酸。
或者，可如上設計嵌合受體，但用紅細胞生成素受體(EPOR)的跨膜域和胞內域代替Flk-1受體的跨膜域和胞內域，如Pacifici等，JBC269(3)1571-1574(1994)所述，以其全文併入參考(見圖1)。
將編碼嵌合受體的所得DNA克隆入適當的哺乳動物，杆狀病毒，或細菌表達載體中，例如pC4，pCDNA3，或pA2中，如前所述。可用於表達嵌合受體的哺乳動物宿主細胞包括NIH3T3(如前)，或前B細胞系BaF3(Achen等，PNAS95(2)548-553(1998)，以其全文併入參考)。
為測試活性，將血管生成蛋白與表達嵌合受體的細胞系或其提取物接觸。然後，可通過測定由嵌合受體轉導的任何所得信號，檢測與嵌合受體結合的血管生成蛋白。
本領域技術人員清楚對本發明可以與前述不同方式實行。根據上述教導及在所附權利要求範圍內，可對本發明加以各種修改和變化。
在發明背景，發明詳述，和實施例中所列舉的各種文獻(包括專利，專利申請，雜誌文章，摘要，實驗手冊，書籍或其它揭示)均以其全文併入參考。另外，文中所列序列併入參考。另外，美國發明應用系列No08/207412，正在申請的美國專利No5817485和08/803926均以全文併入參考。
序列表110人體基因科學有限公司，等120血管生成蛋白及其應用130PF112PCT5140Unassigned1412000-06-0115060/137，7961511999-06-0316030170PatentIn Ver.2.121012111308212DNA213Homo sapiens4001tccgcaaata tgcagaatta ccggccgggt cgctcctgaa gccagcgcgg ggaggcagcg 60cggcggcggc cagcaccggg aacgcaccga ggaagaagcc cagcccccgc cctccgcccc 120ttccgtcccc acccccatcc cggcggccca ggaggctccc cgcgctggcg cgcactccct 180gtttctcctc ctcctggctg gcgctgcctg cctctccgca ctcactgctc gccgggcgcc 240gtccgccagc tccgtgctcc ccgcgccacc ctcctccggg ccgcgctccc taagggatgg 300tactgatttt cgccgccaca ggagaccggc tggagcgccg ccccgcggcc tcgcctctcc 360tccgagcagc cagcgcctcg ggacgcgatg aggaccttgg cttgcctgct gctcctcggc 420tgcggatacc tcgcccatgt tctggccgag gaagccgaga tcccccgcga ggtgatcgag 480aggctggccc gcagtcagat ccacagcatc cgggacctcc agcgactcct ggagatagac 540tccgtaggga gtgaggattc tttggacacc agcctgagag ctcacggggt ccatgccact 600aagcatgtgc ccgagaagcg gcccctgccc attcggagga agagaagcat cgaggaagct 660gtccccgctg tctgcaagac caggacggtc atttacgaga ttcctcggag tcaggtcgac 720cccacgtccg ccaacttcct gatctggccc ccgtgcgtgg aggtgaaacg ctgcaccggc 780tgctgcaaca cgagcagtgt caagtgccag ccctcccgcg tccaccaccg cagcgtcaag 840gtggccaagg tggaatacgt caggaagaag ccaaaattaa aagaagtcca ggtgaggtta 900gaggagcatt tggagtgcgc ctgcgcgacc acaagcctga atccggatta tcgggaagag 960gacacgggaa ggcctaggga gtcaggtaaa aaacggaaaa gaaaaaggtt aaaacccacc 1020taaagcagcc aaccagatgt gaggtgagga tgagccgcag ccctttcctg ggacatggat 1080gtacatggcg tgttacattc ctgaacctac tatgtacggt gctttattgc cagtgtgcgg 1140tctttgttct cctccgtgaa aaactgtgtc cgagaacact cgggagaaca aagagacagt 1200gcacatttgt ttaatgtgac atcaaagcaa gtattgtagc actcggtgaa gcagtaagaa 1260gcttccttgt caaaaagaga gagagagaaa agaaaaaaaa aggaattc 1308210 2211 211212 PRT213 Homo sapiens400 2Met Arg Thr Leu Ala Cys Leu Leu Leu Leu Gly Cys Gly Tyr Leu Ala1 5 10 15His Val Leu Ala Glu Glu Ala Glu Ile Pro Arg Glu Val Ile Glu Arg20 25 30Leu Ala Arg Ser Gln Ile His Ser Ile Arg Asp Leu Gln Arg Leu Leu35 40 45Glu Ile Asp Ser Val Gly Ser Glu Asp Ser Leu Asp Thr Ser Leu Arg50 55 60Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu65 70 75 80Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys85 90 95Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro100 105 110Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg115 120 125Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg130 135 140Val His His Arg Ser Val Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys145 150 155 160Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu165 170 175Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp
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660 665 670Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys675 680 685Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn690 695 700Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg705 710 715 720Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr725 730 735Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe740 745 750Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu755 760 765Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile770 775 780Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly785 790 795 800Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His805 810 815Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp820 825 830Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val835 840 845Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr850 855 860Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg865 870 875 880Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu885 890 895Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu900 905 910Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu915 920 925Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg930 935 940Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys945 950 955 960Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly965 970 975Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro980 985 990Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr99510001005Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys101010151020Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn1025 103010351040Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp104510501055Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met106010651070Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val107510801085Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser109010951100Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys1105 111011151120Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr112511301135Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr114011451150Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala115511601165Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu117011751180Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser1185 119011951200Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn120512101215Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg122012251230Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu123512401245Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu125012551260Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro1265 127012751280Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser128512901295Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp130013051310Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys131513201325Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser Thr Ala Gln Ile Leu Gln133013351340Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val1345 135013552102921113212PRT213Homo sapiens220221SITE222(2)223Xaa equals any amino acid220221SITE222(5)223Xaa equals any amino acid220221SITE222(6)223Xaa equals any amino acid220221SITE222(7)223Xaa equals any amino acid220221SITE222(10)223Xaa equals any amino acid40029Pro Xaa Cys Val Xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys Cys1 5 1021030211733212DNA213Homo sapiens40030gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720gactctagag gat733
134表關於微生物保藏的說明(PCT細則13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏號97149加拿大申請人請求專利局長僅當基於一項申請的加拿大專利被授權時或者該申請被駁回或放棄或不再恢復或被撤回時，才授權將該申請中提及的保藏的生物材料的樣品提供給由局長指明的獨立專家，申請人必須在國際申請公布的技術準備完成之前以書面聲明形式通知國際局。挪威申請人在此請求僅當申請被公開(由挪威專利局)或最終由挪威專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。此項請求應由申請人在不遲於根據挪威專利法第22款和33(3)款公開時遞交到挪威專利局。如果申請人遞交了這種請求，第三方提出的要求提供樣品的請求需指明所使用的專家。專家可以是挪威專利局認可的專家名單上的任何人或個案中申請人同意的任何人。澳大利亞申請人在此指出微生物樣品僅在專利授權前或在專利申請被放棄、拒絕或撤回前提供給在本發明中沒有利益的熟練技術人員(澳大利亞專利法3.25(3)款)。芬蘭申請人在此請求僅當申請被公開(由國家專利局)或最終由國家專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。聯合王國申請人在此請求僅向專家提供微生物樣品。申請人必須在國際申請公布的技術準備完成之前以書面聲明形式通知國際局有關此項請求。丹麥申請人在此請求僅當申請被公開(由丹麥專利局)或最終由丹麥專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。此項請求應由申請人在不遲於根據丹麥專利法第22款和33(3)款公開時遞交到丹麥專利局。如果申請人遞交了這種請求，第三方提出的要求提供樣品的請求需指明所使用的專家。專家可以是丹麥專利局認可的專家名單上的任何人或個案中申請人同意的任何人。瑞典申請人在此請求僅當申請被公開(由瑞典專利局)或最終由瑞典專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。此項請求應在優先權日起16個月內遞交到國際局(最好用PCT申請人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申請人遞交了這種請求，第三方提出的要求提供樣品的請求需指明所使用的專家。專家可以是瑞典專利局認可的專家名單上的任何人或個案中申請人同意的任何人。荷蘭申請人請求僅當荷蘭專利被授權時或者該申請被拒絕或撤回或失效時，才能根據專利法31F(1)款將樣品提供給專家。此項請求必須由申請人在根據荷蘭王國專利法第22C款或25款公開前遞交到荷蘭工業產權局，以兩者中較早日為準。
關於微生物保藏的說明(PCT細則13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏號75698加拿大申請人請求專利局長僅當基於一項申請的加拿大專利被授權時或者該申請被駁回或放棄或不再恢復或被撤回時，才授權將該申請中提及的保藏的生物材料的樣品提供給由局長指明的獨立專家，申請人必須在國際申請公布的技術準備完成之前以書面聲明形式通知國際局。挪威申請人在此請求僅當申請被公開(由挪威專利局)或最終由挪威專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。此項請求應由申請人在不遲於根據挪威專利法第22款和33(3)款公開時遞交到挪威專利局。如果申請人遞交了這種請求，第三方提出的要求提供樣品的請求需指明所使用的專家。專家可以是挪威專利局認可的專家名單上的任何人或個案中申請人同意的任何人。澳大利亞申請人在此指出微生物樣品僅在專利授權前或在專利申請被放棄、拒絕或撤回前提供給在本發明中沒有利益的熟練技術人員(澳大利亞專利法3.25(3)款)。芬蘭申請人在此請求僅當申請被公開(由國家專利局)或最終由國家專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。聯合王國申請人在此請求僅向專家提供微生物樣品。申請人必須在國際申請公布的技術準備完成之前以書面聲明形式通知國際局有關此項請求。丹麥申請人在此請求僅當申請被公開(由丹麥專利局)或最終由丹麥專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。此項請求應由申請人在不遲於根據丹麥專利法第22款和33(3)款公開時遞交到丹麥專利局。如果申請人遞交了這種請求，第三方提出的要求提供樣品的請求需指明所使用的專家。專家可以是丹麥專利局認可的專家名單上的任何人或個案中申請人同意的任何人。瑞典申請人在此請求僅當申請被公開(由瑞典專利局)或最終由瑞典專利局決定不予公開時，才向本領域專家提供樣品。此項請求應在優先權日起16個月內遞交到國際局(最好用PCT申請人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申請人遞交了這種請求，第三方提出的要求提供樣品的請求需指明所使用的專家。專家可以是瑞典專利局認可的專家名單上的任何人或個案中申請人同意的任何人。荷蘭申請人請求僅當荷蘭專利被授權時或者該申請被拒絕或撤回或失效時，才能根據專利法31F(1)款將樣品提供給專家。此項請求必須由申請人在根據荷蘭王國專利法第22C款或25款公開前遞交到荷蘭工業產權局，以兩者中較早日為準。
權利要求
1.一種分離的核酸分子，包含具有與選自以下一組的序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)SEQ ID NOX的多核苷酸片段，其可與SEQ ID NOX雜交；(b)編碼SEQ ID NOY的多肽片段的多核苷酸，其可與SEQ IDNOX雜交；(c)編碼SEQ ID NOY的多肽結構域的多核苷酸，其可與SEQ IDNOX雜交；(d)編碼SEQ ID NOY的多肽表位的多核苷酸，其可與SEQ IDNOX雜交；(e)編碼SEQ ID NOY的多肽的多核苷酸，其可與SEQ ID NOX雜交，具有生物活性；(f)是SEQ ID NOX變體的多核苷酸；(g)是SEQ ID NOX等位基因變體的多核苷酸；(h)編碼SEQ ID NOY種間同源物的多核苷酸；(i)在嚴格雜交條件下，能與(a)-(h)中所述任一種多核苷酸雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在嚴格雜交條件下不與只有A殘基或只有T殘基的核苷酸序列的核酸分子雜交。
2.權利要求1的分離的核酸分子，其中多核苷酸片段包含編碼分泌蛋白的核苷酸序列。
3.權利要求1的分離的核酸分子，其中多核苷酸片段包含編碼與SEQ ID NOY的序列的核苷酸序列，其可與SEQ ID NOX雜交。
4.權利要求1的分離的核酸分子，其中多核苷酸片段包含SEQ IDNOX的完整核苷酸序列，其可與SEQ ID NOX雜交。
5.權利要求2的分離的核酸分子，其中核苷酸序列包含在C末端或N末端的順序核苷酸缺失。
6.權利要求3的分離的核酸分子，其中核苷酸序列包含在C末端或N末端的順序核苷酸缺失。
7.一種重組的載體，其包含權利要求1的分離的核酸分子。
8.一種產生包含權利要求1的分離的核酸分子的重組宿主細胞的方法。
9.一種通過權利要求8的方法產生的重組宿主細胞。
10.權利要求9的重組宿主細胞，其包含載體序列。
11.一種分離的多肽，包含與選自以下一組的序列至少95％相同的胺基酸序列(a)SEQ ID NOY的多肽片段；(b)具有生物活性的SEQ ID NOY的多肽片段，；(c)SEQ ID NOY的多肽結構域；(d)SEQ ID NOY多肽表位；(e)SEQ ID NOY的分泌形式；(f)SEQ ID NOY的全長蛋白質；(g)SEQ ID NOY的變體；(h)SEQ ID NOY的等位基因變體；或(i)SEQ ID NOY的種間同源物。
12.權利要求11的分離的多肽，其中分泌形式或全長蛋白質包含在C末端或N末端的順序胺基酸缺失。
13.一種分離的抗體，其特異性結合權利要求11的分離的多肽。
14.一種重組的宿主細胞，其表達權利要求11的分離的多肽。
15.一種製備分離的多肽的方法，包括(a)在所述多肽被表達的條件下培養權利要求14的重組宿主細胞；及(b)回收所述多肽。
16.通過權利要求15的方法產生的多肽。
17.一種預防，治療或改善醫學症狀的方法，包括對哺乳動物受試者施用治療有效量的權利要求11的多肽或權利要求1的多核苷酸。
18.一種診斷受試者中病理狀態或對病理狀態易感性的方法，包括(a)確定權利要求1的多核苷酸中是否有突變；及(b)基於有或無所述突變診斷病理狀態或對病理狀態易感性。
19.一種診斷受試者中病理狀態或對病理狀態易感性的方法，包括(a)確定生物樣品中權利要求11的多肽的表達的存在或表達量；和(b)基於多肽表達的存在或量診斷病理狀態或對病理狀態易感性。
20.一種鑑別權利要求11的多肽的結合配偶體的方法，包括(a)將權利要求11的多肽與結合配偶體接觸；及(b)確定結合配偶體是否對多肽活性有作用。
21.相應於SEQ ID NOY的cDNA序列的基因。
22.一種鑑別生物分析中活性的方法，其中包括(a)在細胞中表達SEQ ID NOX；(b)分離上清；(c)檢測生物分析中活性；及(d)鑑別上清中具有所述活性的蛋白質。
23.通過權利要求20的方法產生的產物。
全文摘要
本發明公開了人血管生成多肽、其生物活性的、診斷或治療有用的片段、類似物或衍生物，以及編碼所述血管生成多肽的DNA(RNA)。還提供了經重組技術生產這些多肽的方法，以及這些多肽的抗體、激動劑和拮抗劑。這些多肽和多核苷酸可治療性應用而刺激傷口癒合和血管組織修復。本發明還提供了使用抗體和拮抗劑抑制腫瘤血管發生因而抑制腫瘤生長、炎症、糖尿病性視網膜病、類風溼性關節炎和銀屑病的方法。本發明還涉及使用抗體和激動劑促進血管發生和淋巴管發生的方法。拮抗劑還可用於治療由血管通透性增加引起的慢性炎症。除了這些疾病，拮抗劑還可用於治療與糖尿病相關的視網膜病、類風溼性關節炎和銀屑病。激動劑和/或拮抗劑可與藥物可接受載體例如本文描述的載體組合在組合物中使用。
文檔編號A61P9/04GK1402733SQ00811238
公開日2003年3月12日 申請日期2000年6月1日 優先權日1999年6月3日
發明者克雷格·A·羅森, 史蒂文·M·魯賓, 胡靜珊, 曹亮 申請人:人體基因組科學有限公司