血管生成蛋白及其應用的製作方法

2023-05-04 02:12:36

專利名稱：血管生成蛋白及其應用的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及血管生成蛋白，及血管生成蛋白的激動劑或拮抗劑。本發明還涉及鑑別血管生成蛋白活性的激動劑或拮抗劑的篩選方法。
相關現有技術新血管形成，或稱血管發生是胚胎發育，生長及組織修復所必需的。血管法生也是某些病理變化如瘤(即腫瘤和神經膠質瘤)的基本部分。異常血管發生與其它疾病如炎症，類風溼性關節炎，銀屑病，和糖尿病視網膜病變相關〔Flkman，J.和Klagsbrun，M.，科學235442-447(1987)〕。
酸性和鹼性成纖維細胞生長因子分子均是內皮細胞和其它類型細胞的促分裂原。Angiotropin和血管生成素能誘導血管發生，儘管其功能還不清楚〔Flkman，J.，癌症醫學，Lea和Febiger出版社，pp153-170(1993)〕。血管內皮細胞的高度選擇性促分裂原是血管內皮細胞生長因子或VEGF〔Ferrara，N.等，內分泌研究1319-32(1992)〕，其還已知是血管通透性因子(VPF)。
血管內皮生長因子是一種分泌的血管生長促分裂原，其靶細胞特異限定為血管內皮細胞。小鼠VEGF基因已經定性，且其在胚胎發生中的表達模式已經分析。VEGF的持續表達在透明內皮細胞附近的上皮細胞中觀測到，例如在脈絡膜血管和腎小球中。此資料與VEGF作為內皮細胞生長與分化的多重調節劑的作用相一致〔Breier，G.等，發育114521-532(1992)〕。
VEGF與血小板衍生的生長因子，PDGFa和PDGFb呈序列同源〔Leung，D.W.，等，科學2461306-1309(1989)〕。同源程度分別為大約21％和23％。有助於二硫鍵形成的8個半胱氨酸殘基在這些蛋白質中是嚴格保守的。儘管是相似的，但在VEGF和PDGF之間仍有特異差別。PDGF是結締組織的主要生長因子，而VEGF對內皮細胞是高度特異性的。VEGF和PlGF及PDGF的可變剪接的mRNAs已經鑑別，且這些不同剪接產物的生物活性和受體結合特異性不同。VEGF和PDGF有同源二聚體或異源二聚體功能，並與受體結合，且在受體二聚體化之後激發內在的酪氨酸激酶活性。
由於可變剪接，VEGF有121，165，189，和206個胺基酸的4種不同形式。VEGF121和VEGF165是可溶的，並能促進血管發生，而VEGF189和VEGF206在細胞表面與含有蛋白聚糖的肝素結合。VEGF的時間和空間表達與血管的生理增殖相關〔Gajdusek，C.M.，和Carbon，S.J.，細胞生理139570-579(1989)；McNeil，P.L.，等，細胞生物學雜誌109811-822(1989)〕。其高親和性結合位點只位於組織切片中的內皮細胞中〔Jakeman，L.B.，等，Clin.Invest.89244-253(1989)〕。此因子可分離自垂體細胞及一些腫瘤細胞系，並包含於一些人體神經膠質瘤中〔Plate，K.H.，自然359845-848(1992)〕。令人感興趣的是VEGF121或VEGF165的表達授與中國倉鼠卵巢細胞在裸鼠體內形成腫瘤的能力〔Ferrara，N.等，臨床研究雜誌91160-170(1993)〕。通過抗VEGF單克隆抗體對VEGF功能的抑制示出在免疫缺陷小鼠中抑制腫瘤生長〔Kim，K.J.，自然362841-844(1993)〕。另外，VEGF受體的顯性陰性的突變體示出在小鼠體內抑制神經膠質瘤生長。
也發現血管通透性因子(VPF)即使在創傷停止後，仍可對血漿蛋白有持續微血管高通透性應答，這是正常傷口癒合的一個典型特徵。由此推測VPF是傷口癒合的一個重要因子。Brown，L.F.等，實驗醫學雜誌1761375-1379(1992)。
VEGF的表達在血管性組織(如肺，心，胎盤和固體腫瘤)中較高，並與時間性及空間性血管發生相關。VEGF還示出在體內誘導血管發生。由於血管發生是正常組織尤其脈管組織修復所必需的，因此VEGF已用於促進脈管組織修復(如在動脈粥樣硬化中)在1991年12月17日授權的Chen等的美國專利No.5073492中，揭示了一種在適當環境中協同性增強內皮細胞生長的方法，包括在環境中加入VEGF，效應器和血清衍生的因子。同樣，血管內皮細胞生長因子C亞單位DNA已通過聚合酶鏈反應製備。此DNA編碼的蛋白質可以是異源二聚體或同源二聚體。此蛋白質是一種哺乳動物血管內皮細胞促分裂原，並由此用於促進血管發育和修復，如1992年4月30日公布的歐洲專利申請No.92302750.2所述。
近年增加到血管內皮生長因子家族的蛋白質包括VEGF-3，VEGF-D和VEGF-E。VEGF-3生長因子是促進血管內皮細胞和/或中胚層細胞增殖的強促分裂原，如在1996年12月12日出版的Hu等的國際出版物No.WO96/39421所述。VEGF-D是血管內皮細胞生長因子家族的另一成員，並具有刺激和/或增強內皮細胞增殖或分化的能力，如1998年2月26日出版的國際出版物No.WO98/07832所揭示。最近Meyer等公布了一種血管內皮生長因子家族的新成員，稱為VEGF-E。VEGF-E是一種潛在的血管生成因子，其選擇性地與VEGF受體-2(KDR)結合〔Meyer等，EMBO雜誌，18363-374(1999)〕。
因此，需要促進或抑制血管生成蛋白的療法。
發明概述本發明涉及VEGF/PDGF蛋白質家族的成員及相關蛋白質，統稱為「血管生成蛋白」或「血管生成多肽」，以及涉及血管生成蛋白的激動劑和/或拮抗劑。
根據本發明的另一方面，提供了利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸，例如治療性用於刺激血管發生，傷口癒合，損傷的骨和組織的生長，及促進血管組織修復的方法。尤其提供了利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸治療周圍動脈疾病的方法，如治療關鍵肢體局部缺血和冠狀動脈缺血性心臟病。根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的激動劑，其可用於增強這種多肽的作用，如促進血管發生，淋巴管發生，或促進血管組織修復。本發明還涉及編碼多肽的抗原性或免疫原性表位的上述多肽的變體。
根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的激動劑，其可用於增強或促進這種多肽的作用，例如阻止腫瘤血管發生，並因此抑制腫瘤生長，治療糖尿病視網膜病變，炎症，類風溼性關節炎，和銀屑病。根據本發明的又一方面，提供了這種多肽的激動劑，其可用於增強這種多肽的作用，例如促進血管發生，淋巴管發生，或促進血管組織修復。
根據本發明的另一方面，提供了抗這種多肽的抗體，和生產這種抗體的方法。根據本發明的又一方面，提供了利用這抗體治療性用途的方法例如刺激血管生成，傷口癒合，損傷的骨和組織生長，促進血管組織修復，及刺激淋巴管發生。尤其提供了利用這種抗體治療周圍動脈疾病如關鍵肢體局部缺血和冠心病。
根據本發明的另一方面，提供了這種多肽的拮抗劑，其可用於抑制這種多肽的作用，例如阻止腫瘤血管生成並因此抑制腫瘤生長，治療糖尿病視網膜病變，炎症，類風溼性關節炎和銀屑病。
根據本發明的另一方面，提供了新的成熟多肽及其具有生物活性和診斷性或治療性用途的片段，類似物和衍生物。本發明的多肽是人源的。
根據本發明的另一方面，提供了分離的核酸分子，其包含編碼全長或截短的具有表1所示胺基酸序列的血管生成多肽的多核苷酸。本發明還涉及血管生成蛋白的生物活性及診斷或治療性用途的片段，類似物和衍生物。
根據本發明的另一方面，提供了通過重組方法生產這種多肽的方法，包括在促進所述蛋白質表達的條件下，培養含有編碼本發明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞，隨後回收所述蛋白質。
根據本發明的又一方面，提供了包含足夠長而特異雜交本發明的核酸序列的核酸分子的核酸探針。根據本發明的另一方面，提供了診斷與本發明的核酸序列或由此核酸序列編碼的蛋白質中突變相關的疾病，或對此疾病易感的方法。
根據本發明的另一方面，提供了一種利用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸進行與科學研究、DNA合成及DNA載體生產等體外目的的方法。
根據本發明的另一方面，提供了篩選血管生成蛋白的激動劑和/或拮抗劑的方法，這些激動劑和/或拮抗劑可增強或抑制所需活性。
本發明的這些及其它方面本領域技術人員通過本文教導將顯而易見。
附圖簡述以下附圖舉例說明了本發明的實施方案，並無限制本發明權利要求所涵蓋的範圍。


圖1A-1E示出VEGF2的全長核苷酸(SEQ ID NO15)和推導的胺基酸(SEQ ID NO16)序列。此多肽包含大約419個胺基酸殘基，其中23個代表前導序列。使用標準單字母縮寫形式。用Model373自動DNA測序儀(應用生物系統公司)進行測序。序列精確性預計高於97％。
圖2A-2D示出VEGF2的截短的生物活性形式的核苷酸(SEQID NO25)和推導的胺基酸(SEQ ID NO26)序列。此多肽包含大約350個胺基酸殘基，其中前24個胺基酸代表前導序列。
圖3A-3C舉例說明了在以下序列間的胺基酸序列同源性PDGF-A(SEQ ID NO2)，PDGF-B(SEQ ID NO4)，P1GF(SEQID NO6)，PlGF-2(SEQ ID NO8)，GDGF(SEQ ID NO10)，VEGF(SEQ ID NO12)，VEGF-A(SEQ ID NO14)，VEGF-2(SEQ ID NO16)，VEGF-3(SEQ ID NO18)，VEGF-D(SEQID NO20)，VEGF-D1(SEQ ID NO22)，和VEGF-E(SEQ IDNO24)。框區代表保守的序列和8個保守的半胱氨酸殘基的位置。
優選實施方案詳述定義根據本發明的一方面，提供了多肽分子，其包含PDGF和VEGF家族的成員。更特別地，PDGF和VEGF家族成員包括血小板衍生的生長因子A(PDGF-A)(SEQ ID NO1-2)，如歐洲專利號EP-682110所揭示；血小板衍生的生長因子B(PDGF-B)(SEQ IDNO3-4)，如歐洲專利號EP-282317所揭示；胎盤生長因子(PlGF)(SEQ ID NO5-6)，如國際出版物WO92/06194所揭示；胎盤生長因子2(PlGF-2)(SEQ ID NO7-8)，如Hauser等，生長因子4259-268(1993)；神經膠質瘤衍生的生長因子(GDGF)，如歐洲專利號EP-399816所揭示(SEQ ID NO9-10)；血管內皮生長因子(VEGF)(SEQ ID NO11-12)，如國際出版物WO90/13649所揭示；血管內皮生長因子A(VEGF-A)(SEQ ID NO13-14)，如歐洲專利號EP-506477所揭示；血管內皮生長因子2(VEGF-2)(SEQ ID NO15-16)，如國際出版物WO96/39515所揭示；血管內皮生長因子3(VEGF-3)(SEQ ID NO17-18)，如國際出版物WO96/39421所揭示；血管內皮生長因子D(VEGF-D)(SEQ IDNO19-20)，如國際出版物WO98/07832所揭示；血管內皮生長因子D1(VEGF-D1)(SEQ ID NO21-22)，如國際出版物WO98/02543所揭示；和血管內皮生長因子E(VEGF-E)(SEQ ID NO23-24)，如德國專利DE19639601所揭示，並在此統稱為「血管生成蛋白」或「血管生成多肽」。以上所述參考文獻在此以其全文併入參考。
本文所用術語「激動劑」是指促進或增強血管生成蛋白所需活性的任何多核苷酸，多肽，抗體或分子，包括小分子。本文所用術語「拮抗劑」是指削弱或抑制血管生成蛋白所需活性的任何多核苷酸，多肽，抗體或分子，包括小分子。
本文所用術語「所需活性」是指與血管生成蛋白的天然活性相關的，激動劑和/或拮抗劑促進內皮細胞增殖(血管生成或淋巴管發生)，或抑制內皮細胞增殖(血管生成或淋巴管發生)的活性。血管生成蛋白的激動劑和拮抗劑本發明涉及血管生成蛋白的激動劑和/或拮抗劑。
血管生成蛋白激動劑的一實施方案包括抗體，其結合多肽並促進或增強所需活性。這些激動劑例如包括特異血管生成多肽的單克隆或多克隆抗體，其結合血管生成多肽並促進這些多肽的血管生成活性，例如通過穩定血管生成蛋白的二聚體化形式，或通過聚集結合抗體的多肽，從而濃縮或集中血管生成多肽的活性。
另一潛在的血管生成蛋白激動劑包括促進或增強血管生成蛋白活性的小分子。這種小分子激動劑可參與例如與血管生成蛋白受體，或者相關的受體的結合，並從而增強血管生成蛋白的活性。
在另一實施方案中，血管生成蛋白激動劑包括增強血管生成蛋白活性的多肽。這種多肽激動劑可包含於與血管生成蛋白結合受體中，或者例如相關的受體中，並從而增強血管生成蛋白的活性。
另外血管生成蛋白激動劑例如包括促進或增強血管生成蛋白所需活性的反義構建。
潛在的血管生成蛋白拮抗劑包括與多肽結合併有效刺激血管蛋白活性的抗體，或者在一些情況中的寡核苷酸。或者，潛在的拮抗劑可以是結合血管生成蛋白受體的密切相關的蛋白質，然而，它們是多肽的滅活形式，並從而阻止血管生成蛋白的作用。這些拮抗劑例如包括血管生成蛋白多肽的負顯性突變體，例如血管生成蛋白的異源二聚體形式的一個鏈可以是顯性的，並可以是突變的，由此生物活性不保留。負顯性突變體例如包括截短形式的二聚體血管生成蛋白，其能與另一二聚體相互作用，形成野生型血管生成蛋白，然而所得同源二聚體是失活的，並且不能呈現所需的特徵性活性。
另一潛在的血管生成蛋白的拮抗劑是用反義技術製備的一種反義構建。反義方法可用於通過三螺旋形成或反義DNA或RNA控制基因表達，這兩種方法基於多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，編碼本發明成熟多肽的多核苷酸序列的5』編碼部分，可用於設計長度為大約10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設計的DNA寡核苷酸與包含於轉錄中的基因的一區域互補(三螺旋，見Lee等，核酸研究63073(1979)；Cooney等，科學241456(1988)；和Dervan等，科學2511360(1991)，從而阻止轉錄和血管蛋白產生。反義RNA寡核苷酸在體內與m RNA雜交，並阻斷m RNA分子翻譯為血管生成蛋白質多肽(反義，Okano，神經化學雜誌56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)。上述寡核苷酸也可送遞細胞中，這樣反義RNA或DNA可在體內表達以抑制血管生成蛋白的產生。
在另一實施方案中，血管生成蛋白拮抗劑還包括一種小分子，其結合併佔據多肽的活性位點，從而使催化部位不可及底物，由此阻止正常生物活性。這種小分子例如包括但非限於小肽或類肽分子。
拮抗劑可用於限制固體腫瘤轉移所必需的血管生成。因為血管生成和新血管化是固體腫瘤生長的必需步驟，因此抑制血管生成蛋白的活性對阻止固體腫瘤的進一步生長，延緩或者甚至退化固體腫瘤是非常有效的。
本發明還涉及一種篩選化合物的方法，以鑑別這種化合物是血管生成蛋白的激動劑還是拮抗劑。這種方法例如有利於血管生成蛋白明顯刺激人內皮細胞在存在共促分裂原ConA的情況下的增殖。獲得內皮細胞並在96孔平底培養平板(Costar，Cambridge，MA)中，在補加ConA(Calbiochem，La Jolla，CA)的反應混合物中培養。加入Con-A，本發明的多肽和要篩選的化合物。在37℃溫育之後，將培養物用1Fci的3〔H〕胸苷(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)脈衝足夠的時間，以摻入3〔H〕，並經玻璃纖維濾膜過濾收集(Cambridge Technology，Watertown，MA)。三份培養物的摻入的3〔H〕胸苷平均值(cpm)用液態閃爍計數儀確定(BeckmanInstruments，Irvjne，CA)，與對照分析(其中不包括要篩選的化合物)相比，有效的摻入的3〔H〕胸苷值表明刺激內皮細胞增殖。
為分析激動劑，進行上述分析，化合物在存在血管生成蛋白的情況下，具有促進3〔H〕胸苷摻入的能力，則表明此化合物是血管生成蛋白的激動劑。相反，為分析拮抗劑，進行上述分析，化合物在存在血管生成蛋白的情況下，具有抑制3〔H〕胸苷摻入的能力，則表明此化合物是血管生成蛋白的拮抗劑。或者，可通過將血管生成蛋白的拮抗劑血管生成蛋白和潛在的拮抗劑與膜結合血管生成蛋白受體或重組受體組合，在適當條件下進行競爭性抑制分析而檢測。血管生成蛋白可被標記，如經放射性標記，由此與受體結合的血管生成蛋白分子的數目可確定潛在拮抗劑的效力或者，測定已知第二信使系統的應答及隨後的血管生成蛋白與受體的相互作用，並將有或無要篩選的化合物的情況作對比。這種第二信使系統包括但非限於cAMP鳥苷酸環化酶，離子通道，或磷酸肌酸酯水解。在另一種方法中，將表達血管生成蛋白受體的哺乳動物細胞或膜製品，在存在篩選化合物的情況下用標記的血管蛋白溫育。然後測定此化合物增強或阻斷這種相互作用的能力。表位和抗體本發明涵蓋的多肽，包含或由具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽的表位，或由ATCC中保藏號No.97149或75698的多核苷酸編碼的多肽的表位，或由與SEQ ID NO1或3序列的補體或ATCC中保藏號No.97149或75698的序列的補體在前述嚴格雜交條件下或較低嚴格雜交條件下雜交的多核苷酸編碼的多肽的表位組成。含有SEQ ID NO2或4序列的一代表性克隆於1994年3月4日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，保藏號No.75698；及於1995年5月12日保藏於ATCC，保藏號No.97149。ATCC位於美國佛吉尼亞州馬納薩斯市。大學道20110-2209，郵編10801。ATCC保藏遵循國際共識的布達佩斯條約。本發明還涵蓋了以下多核苷酸序列編碼本發明多肽序列表位的多核苷酸序列(例如SEQ IDNO1或3所示序列)，編碼本發明表位的多核苷酸序列互補鏈的多核苷酸序列，和在前述嚴格雜交條件或較低嚴格雜交條件下與此互補鏈雜交的多核苷酸序列。
本文所用術語「表位」指在動物，優選哺乳動物，更優選在人體內具有抗原性或免疫原性活性的多肽的一部分。在一優選的實施方案中，本發明涵蓋一種多肽，其包含表位，以及編碼此多肽的多核苷酸。本文所用術語「免疫原性表位」是指在動物體內激發抗體應答的蛋白質的一部分，其可通過本領域已知的任何方法確定，例如通過前述產生抗體的方法確定〔見例如Geysen等，美國科學院院報813998-4002(1983)〕。術語「抗原性表位」是指其作為抗原，抗體能特異地與之結合的蛋白質的一部分，其可通過本領域熟知的任何方法確定，例如通過本文所述的免疫分析法。免疫特異性結合不包括非特異性結合，但非必需不包括與其它抗原的交叉反應。抗原性表位非必需是免疫原性的。
作為表位的片段可通過常規方法產生〔見例如Houghten，美國科學院院報825131-5135(1985)〕，另外見於美國專利No.4631211所述〕。
在本發明中，抗原性表位優選含有至少4，5，6，7個，更優選至少8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，40，50個，最優選大約15-30個胺基酸。包含免疫原性或抗原性表位的優選多肽的長度至少為10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100個胺基酸。另外非排外的優選抗原性表位包括本文所揭示的抗原性表位，以及其一部分。抗原性表位例如用於產生特異結合表位的抗體，包括單克隆抗體。優選的抗原性表位包括本文所揭示的表位，以及2，3，4，5或多個這些抗原性表位的任意組合。抗原性表位可用作免疫分析中的靶分子〔見例如，Wilson等，細胞37767-778(1984)；Sutclffe等，科學219660-666(1983)〕。
相似地，免疫原性表位例如可用於誘導抗體，根據本領域熟知的方法〔見例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；Chow等，美國科學院院報82910-914；和Bittle等，基因病毒學雜誌662347-2354(1985)〕。優選的免疫原性表位包括本文所揭示的免疫原性表位，以及2，3，4，5或多個這些免疫原性表位的任意組合。包含1或多個免疫原性表位的多肽可與載體蛋白如白蛋白一起，激發動物系統(如兔或小鼠)的抗體應答，或者如果多肽足夠長(至少大約25個胺基酸)，此多肽可不用載體。然而包含少如8-10個胺基酸的免疫原性表位，已示出足以產生能至少結合變性的多肽如在Western印跡中)中的線性表位的抗體。
本發明具有表位的多肽可用於誘導抗體，根據本發明熟知的方法，包括但非限於體內免疫接種，體外免疫接種和噬菌體展示方法。見例如Sutcliffe等，如前；Wilson等，如前；和Bittle等，基因病毒學雜誌662347-2354(1985)。如果使用體內免疫接種，可用游離肽接種動物；然而抗肽抗體滴定可通過將肽與大分子載體偶聯而加強，所述載體如是匙孔嘁血籃蛋白(KLH)或破傷風毒素。例如，含有半胱氨酸殘基的肽可用接頭與載體偶聯，接頭如間一馬來醯亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)，而其它肽可用一般的連接劑如戊二醛與載體偶聯。將動物如兔，大鼠和小鼠用游離或偶聯載體的肽免疫接種，例如通過腹膜內和/或皮內注射含有大約100μg肽或載體蛋白，和Freund’s佐劑或其它刺激免疫應答的任何佐劑的乳劑。可需要一些增強注射，例如間隔大約2周，以提供可例如經ELISA分析檢測的抗肽抗體的有效滴定，ELISA分析是用吸附於固體表面的游離肽。通過選擇抗肽抗體，例如根據本領域熟知方法將肽吸附於固體支持物並洗脫選擇的抗體，可提高免疫接種動物血清中抗肽抗體的效價。
本領域技術人員意識到及如上所述，包含免疫原性或抗原性表位的多肽可融合於其它多肽序列。例如，本發明的多肽可與免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的恆定區，或其一部分(CH1，CH2，CH3或其任意組合，及其一部分)融合，產生嵌合多肽。這種融合蛋白可易於純化並提高在體內的半衰期。已示出嵌合蛋白由人CD4-多肽的前兩個結構域和哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈恆定區的各種機構域組成。見例如EP394827；Traunecker等，自然，33184-86(1988)所述。在抗原(如胰島素)與FcRn結合配體如IgG或Fc片段綴合的情況下，抗原穿經上皮細胞壁至免疫系統的輸送增強已證實(見例如PCT出版物WO96/22024和WO99/04813所述)。由於IgG部分脫硫鍵而具有二硫鍵連的二聚體結構的IgG融合蛋白，也已發現比只是單體多肽或其片段在結合及中性化其它分子中更有效。見例如Fountoulakis等，生物化學雜誌2703958-3964(1995)。編碼上述表位的核酸也可與作為表位標記〔如血凝素(HA)標記或flag標記〕的相應基因重組，以助於檢測和純化表達的多肽。例如，由Janknecht等所述的系統可易於純化在人體細胞系中表達的非變性的融合蛋白(Janknecht等，1991，美國科學院院報888972-897)。在此系統中，將相應的基因亞克隆入豆苗重組質粒中，這樣基因的開發讀框翻譯性的融合於由6個組氨酸殘基組成的氨基末端標記中。此標記作為融合蛋白的基質結合結構域。將用重組豆苗病毒感染的細胞的提取物加樣於Ni2+次氮基乙酸—瓊酯糖層析柱中，且組氨酸標記的蛋白質可用含有咪唑的緩衝液選擇性洗脫。
本發明的其它融合蛋白可通過基因改組，基序改組，外顯子改組，和/或密碼子改組(統稱DNA改組)而產生。DNA改組可用於調節本發明多肽的活性，這種方法可用於產生具有改變活性的多肽，以及多肽的激動劑和拮抗劑。見美國專利No.5605793；58 11238；5830721；5834252；和5837458，和Patten等，生物技術學通用觀點8724-33(1997)；Harayama，生物技術趨勢16(2)76-82(1998)；Hansson等，分子生物學雜誌287265-76(1 999)；和Lorenzo和Blasco，生物技術24(2)308-13(1998)所述(這些專利及文獻均以全文併入參考)。在一實施方案中，相當於SEQ ID NO1或3的多核苷酸，及由這些多核苷酸編碼的多肽的變化，可通過DNA改組進行。DNA改組包括通過同源或位點特異性重組裝配2或多個DNA節段，以在多核苷酸序列中產生變化。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸或其編碼的多肽，可通過易錯PCR，隨機插入核苷酸，或其它方法隨機誘變，之後進行重組而改變。在另一實施方案中，編碼本發明多肽的多核苷酸的一或多種成分，基序，節段，部分，結構域，片段等，可與一或多種異源分子的一或多種成分，基序節段，部分，結構域，片段等重組。抗體本發明的另外的多肽涉及抗體和T細胞抗原受體(TCR)，其免疫特異性地結合本發明SEQ ID NO2或4的多肽，多肽片段或變體，和/或表位(通過本領域熟知的免疫分析方法分析特異性抗體—抗原結合)。本發明的抗體包括但非限於多克隆抗體，單克隆抗體，多特異性抗體，人抗體，人化抗體或嵌合抗體，單鏈抗體，Fab片段，F(ab』)片段，由Fab表達文庫產生的片段，抗獨特型(抗Id)抗體(包括本發明抗體的抗Id抗體)，和以上任何結合表位的片段。本文所用術語「抗體」是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性地結合抗原的抗原結合位點的分子。本發明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，類別(如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亞類別的免疫球蛋白分子。
更優選的抗體是本發明結合抗原的人抗體片段，包括但非限於Fab，Fab』，和F(ab』)2，Fd，單鏈Fvs(scFV)，單鏈抗體，二硫鍵連的Fvs(sdFv)和包含VL或VH結構域的片段。結合抗原的抗體片段，包括單鏈抗體，可只包含可變區域或與以下完整區域或其一部分組合絞鏈區，CH1，CH2和CH3結構域。本發明還包括結合抗原的片段，其也包含可變區與絞鏈區，CH1，CH2和CH3結構域的任意組合。本發明的抗體可來源於任何動物，包括鳥和哺乳動物。優選地，抗體來源於人，鼠(如小鼠和大鼠)，驢，兔，山羊，豚鼠，駱駝，馬或雞。本文所用術語「人」抗體包括具有人免疫球蛋白胺基酸序列的抗體，及包括分離自人免疫球蛋白文庫的抗體，或分離自用—或多種人免疫球蛋白轉基因且不表達內源性免疫球蛋白的動物的抗體，如前述及例如Kucherlapati等的美國專利No.5939598所述。
本發明的抗體可以是單特異性，雙特異性，三特異性或更多特異性的。多特異性抗體可特異於本發明多肽的不同表位，或特異於本發明的兩種多肽，以及異源表位，如異源多肽或固體支持物。見例如PCT出版物WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt等，免疫學雜誌，14760-69(1991)；美國專利No.4474893；4714681；4925648；5573920；5601819；Kostelny等，免疫學雜誌1481547-1553(1992)。
本發明的抗體可以它們識別或特異結合的表位或本發明多肽的一部分等術語闡述。表位或多肽的一部分在本文特別通過N-末端和C-末端位，通過連續胺基酸殘基的大小加以闡述，或在圖表中列出。
在一實施方案中，可用於產生PDGF-A特異性抗體的抗原性多肽或肽包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO2的大約Lys72-Leu80，SEQ ID NO2的大約Ile82-Ile88，SEQ ID NO2的大約Pro106-Ser114，SEQ ID NO2的大約Lys139-Val145，SEQ IDNO2的大約Arg159-Lys165，和SEQ ID NO2的大約Serl83--Thr211胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PDGF-A蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO2的大約Ile82-Ile88胺基酸殘基。
可用於產生PDGF-B特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性地例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO4的大約Arg39-Gln45，Asp51-Asp56，Thr65-Gly71，Leu110-Ala116，Ser131-Thr144，Pro188-Thr206，Arg216-Lys227，Thr229-Leu235胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PDGF-B蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO4的大約Arg39-Gln45，Asp51-Asp56，Thr65-Gly71的胺基酸殘基。
可用於產生PlGF特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO6的大約Val46-Cys52，Arg110-Ser1 16，Val126-Asp144的胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PlGF蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO6的大約Val 46-Cys52胺基酸序列。
可用於產生PlGF-2特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO8的大約Val46-Cys52，Arg110-Serl 16，Val126-Asp159的胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶PlGF-2蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO8的大約Val 46-Cys52胺基酸殘基。
可用於產生GDGF特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO10的大約Thr30-Ala36，Tyr46-Cys5 1，Glu63-Ile68，Ser125-Cys142，Pro144-His151，Gln155-Lys172，Asn179-Arg190胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶GDGF蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO10的大約Thr30-Ala36，Tyr46-Cys5 1胺基酸殘基。
可用於產生VEGF特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO12的大約Glu64-Ile69，Gly85-Gly91，His125-Cys143，Pro145-His152，Glu156-Lys173，Asn180-Arg191胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF蛋白的抗原性表位。
可用於產生VEGF-A特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO14的大約Thr30-Ala36，Tyr46-Cys51，Glu63-Ile68，Ser125-Val143，Gly145-Cys166，Pro 168-His 175，Gln179-Lys196，Asn203-Arg214胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-A蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO14的大約Thr30-Ala36，和Tyr46-Cys51胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-2特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO16的大約Asp40-Ala45，Lys 54-Leu60，Gln84-Gly89，Arg94-Thr106，Ile122-Cys131，Asn175-Leu181，Gln237-Pro244，Asp267-Phe276，Pro282-Asp287，Ser303-Ser314，Ala330-Thr338，Arg345-Cys358，Gly373-Cys395，Pro410-Ser419胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-A蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO16的Asp40-Ala45，Lys 54-Leu60，Gln84-Gly89，Arg94-Thr106，和Ile122-Cys131胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-3特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO18的Ser 24-Lys34，Ala45-Arg50，Arg125-Ala138，Prol41-Ser149，和His167-Pro172胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-3蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO18的大約Ser 24-Lys34，Ala45-Arg50，胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-D特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO20的大約Metl-Gln14，His29-Arg41，Met48-Thr58，Glu75-Thr87，Leu95-Phe103，Pro181-Lys191，Trp199-Cys204，Asp281-Thr293，Pro310-Ala316，Gly318-Pro325胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-D蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO20的大約Metl-Gln14，His29-Arg41，Met48-Thr58，Glu75-Thr87胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-D1特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO22的大約Ser22-Gln43，His58-Arg70，Met77-Thr87，Glu104-Thr116，Leu124-Phe132，Pro210-Lys220，Trp228-Cys233，Asp310-Thr322，Pro339-Ala345，Gly347-Pro354胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-D1蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO22的大約Ser22-Gln43，His58-Arg70，和Met77-Thr87，胺基酸殘基。
可用於產生VEGF-E特異性抗體的抗原性多肽或肽非限制性例如包括包含以下胺基酸殘基的多肽SEQ ID NO24的大約Asp 21-Trp26，Asp46-Phe56，Gly68-Ser74，Pro121-Arg132胺基酸殘基。這些多肽片段通過使用缺失參數經Jameson-Wolf抗原指數分析，已確定攜帶VEGF-E蛋白的抗原性表位。
在一優選的實施方案中，抗原性表位包括SEQ ID NO24的大約Asp 21-Trp26胺基酸殘基。
特異性結合本發明的任何表位或多肽的抗體也排除在外。因此，本發明包括特異結合本發明多肽的抗體，並又可不包括這種抗體。
本發明的抗體還可以交叉反應性加以闡述。本發明包括不結合本發明多肽的任何其它類似物，直向同源物，或同源物的抗體。本發明還包括結合與本發明多肽有至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％相同性的多肽的抗體(相同性是通過本領域已知及本文所述方法計算的)。在特異的實施方案中，本發明的抗體與人體蛋白及其相應表位的小鼠，大鼠和/或兔同源物交叉反應。本發明還包括不結合與本發明多肽有少於95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，50％相同性的多肽的抗體(相同性是通過本領域已知及本文所述方法計算的)。在一特異的實施方案中，上述交叉反應性與任一種特異抗原性或免疫原性多肽，或2，3，4，5或多種特異抗原性或免疫原性多肽組合相關。本發明另外包括結合由在嚴格條件下與本發明多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽的抗體。本發明的抗體還可以其與本發明多肽的結合親和性加以闡述。優選的結合親和性包括解離常數或Kd少於以下數值的親和性5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，或10-15M。
本發明還提供了競爭性抑制抗體與本發明表位結合的抗體，以確定例如本文所述免疫分析中的競爭性結合，競爭性抑制是通過本領域已知方法確定的。在優選的實施方案中，抗體競爭競爭性抑制與表位結合的至少95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％或50％。
本發明抗體還作為本發明多肽的激動劑或拮抗劑。例如，本發明包括部分或完全破壞受體/配體與本發明多肽相互作用的抗體。優選地，本發明的抗體結合本文所述的抗原性表位或其一部分。本發明以受體特異性抗體和配體特異性抗體為特色。本發明還以阻止配體結合但阻止受體活化的受體特異性抗體為特色。受體活化(即信號化)可通過本文所述方法或本領域已知其它方法確定。例如，受體活化可通過檢測受體或其底物在通過免疫沉澱及隨後的Western印跡分析(如前述)後的磷酸化(如酪氨酸或絲氨酸/蘇氨酸)而確定。在特異的實施方氨中，所提供的抗體抑制的配體活性或受體活性比沒有抗體的情況下至少抑制95％，90％，85％，80％，75％，70％，60％或50％。
本發明還以受體特異性抗體為特色，其阻止配體結合及受體活化，還以識別受體-配體複合物且優選不特異識別未結合的受體或未結合的配體的抗體為特色。另外，本發明包括中和抗體，其結合配偶體並阻止配體與受體的結合，以及包括結合配偶體從而阻止受體活化，但不阻止配體與受體結合的抗體。本發明另外包括激活受體的抗體。這些抗體可作為受體激動劑，即促進或活化配體介導的受體活化的所有或部分生物活性，配體介導的受體活化例如通過誘導受體二聚體化而活化。抗體可以生物活性包括本發明肽的特有生物活性的激動劑，拮抗劑或反向激動劑加以闡述。上述抗體激動劑可用本領域已知方法產生。見例如PCT出版物WO96/40281；美國專利No.5811097；Deng等，血液92(6)1981-1988(1998)；Chen等，癌症研究58(16)3668-3678(1998)；Harrop等，免疫學雜誌161(4)1786-1794(1998)；Zhu等，癌症研究58(15)3209-3214(1998)；Yoon等，免疫學雜誌160(7)3170-3179(1998)；Prat等，細胞科學雜誌111(Pt2)237-247(1998)；Pitard等，免疫學方法雜誌205(2)177-190(1997)；Liautard等，細胞因子9(4)233-241(1997)；Carlson等，生物化學雜誌272(17)11295-11301(1997)；Taryman等，神經元14(4)755-762(1995)；Muller等，結構6(9)1153-1167(1998)；Bartunek等，細胞因子8(1)14-20(1996)所述，以上文獻均以全文併入參考。
本發明的抗體可例如但非限制性用於純化，檢測及定向本發明的多肽，包括在體外和體內診斷及治療方法中。例如，抗體用於免疫分析中以定量及定性測定生物樣品中本發明多肽的水平。見例如Harlovo等，抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，第二版，1988)所述，以其全文併入參考。
如以下更詳細的闡述，本發明的抗體可單獨或與其它組合物組合使用。抗體還可在N或C末端經重組融合於異源多肽，或化學綴合於(包括共價和非共價綴合)多肽或其它組合物。例如本發明的抗體可重組融合或綴合於在檢測分析中用作標記的分子，和效應器分子，如異源多肽，藥物，放射性核素或毒素。見例如PCT出版物WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美國專利No.5314995；和EP396387。
本發明的抗體包括經修飾的衍生物，即通過將任何類型的分子共價吸附於抗體，這種共價吸附不阻止抗體產生抗獨特型應答。例如但非限制性地，抗體衍生物包括已經修飾的抗體，例如通過糖基化，乙醯化，Pegylation，磷酸化，醯胺化，通過已知防護/阻斷基團的衍生化，蛋白酶切，與細胞配體或其它蛋白質連接等加以修飾。可通過已知方法進行任何化學修飾，包括但非限於特異性化學切割，乙醯化，甲醯化，衣黴素的代謝合成等。另外，衍生物可含有一或多個非經典胺基酸。本發明的抗體可以通過本領域已知的任何適當方法產生。相應抗原的多克隆抗體可通過本領域熟知的各種方法生產。例如，可將本發明的多肽施用於各種宿主動物，包括但非限於兔，小鼠，大鼠等，以誘導含有特異於抗原的多克隆抗體的血清產生。根據宿主物種可使用各種佐劑以提高免疫應答，佐劑包括但非限於Freund’s(完全性及不完全性)佐劑，礦物質凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂，pluronic多醇，聚陰離子，肽，油乳液，匙孔嘁血籃蛋白，二硝基苯酚，和潛在用於人體的佐劑如BCG(卡介苗)和parvum棒桿菌。這些佐劑本領域已熟知。
單克隆抗體可用各種已知方法製備，包括使用雜交瘤，重組及噬菌體展示等方法，或組合使用這些方法。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法生產，包括本領域已知的及例如Harlow等，抗體實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，第二版，19880；Hammerling等，單克隆抗體及T細胞雜交瘤563-681(Elsevier，N.Y.，1981)所述方法，所述文獻以其全文併入參考。本文所用術語「單克隆抗體」非限於通過雜交瘤方法生產的抗體。術語「單克隆抗體」是指衍生自一個單一克隆包括真核，原核或噬菌體克隆的抗體，而不是指由何種方法產生的抗體。
用雜交瘤方法生產和篩選特異性抗體的方法對本領域而言是常規且熟知的，並在實施例中加以詳細闡述。在一非限制性實施例中，可用本發明的多肽或表達這種肽的細胞免疫接種小鼠。一旦檢測到免疫應答，例如在小鼠血清中檢測到特異於抗原的抗體，則收集小鼠脾組織並分離脾細胞。然後將脾細胞通過熟知的方法融合於任何適當的骨髓瘤細胞，例如得自ATCC的sp20細胞系的細胞。選擇雜交瘤並通過限制稀釋而克隆。然後通過本領域已知方法分析雜交瘤克隆的分泌能結合本發明多肽的抗體的細胞。通常含有高水平抗體的腹水可用陽性雜交瘤克隆免疫接種小鼠而產生。
因此，本發明提供了產生單克隆抗體的方法，以及由這些方法產生的抗體，所述方法包括培養分泌本發明抗體的雜交瘤細胞，其中優選雜交瘤細胞是通過將脾細胞與骨髓瘤細胞融合而產生的，所用脾細胞分離自用本發明抗原免疫接種的小鼠，然後篩選經融合所得雜交瘤中分泌能結合本發明多肽的抗體的雜交瘤克隆。
識別特異表位的抗體片段可通過已知方法產生。例如，本發明的Fab和F(ab』)2片段可通過對免疫球蛋白分子進行蛋白酶切而產生，使用的酶如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)，或胃蛋白酶(產生F(ab』)2片段)。F(ab』)2片段含有可變區，輕鏈恆定區和重鏈的CH1結構域。
例如，本發明的抗體還可用本領域已知的各種噬菌體展示法產生。在噬菌體展示方法中，將功能性抗體結構域展示於攜帶編碼其的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面。在一特殊的實施方案中，這種噬菌體可用於展示表達自抗體文庫所有組成成分或組合抗體文庫(如人或小鼠)的抗原結合結構域。表達結合相應抗原的抗原結合結構域的噬菌體，可用抗原選擇或鑑別，如用標記的抗原或結合或捕捉於固體表面或玻珠的抗原。這些方法中使用的噬菌體是典型的絲狀噬菌體，包括fd和M13結合結構域，其表達自具有Fab，Fv或二硫鍵穩定的Fv抗體結構域，重組融合於噬菌體基因IV或基因VIII蛋白的噬菌體。可使用的產生本發明抗體的噬菌體展示法包括Brinkman等，免疫學方法雜誌18241-50(1995)；Ames等，免疫學方法雜誌184177-186(1995)；Kettleborough等，歐洲免疫學雜誌24952-958(1994)；Persic等，基因187，9-18(1997)；Burton等，免疫學進展57191-280(1994)；PCT出版物No.PCT/GB91/01134；PCT出版物WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美國專利No.5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516637；5780225；5658727；5733743和5969108所述方法；所述文獻以其全文併入參考。
如上述參考文獻所述，在噬菌體選擇後，可從噬菌體中分離抗體編碼區，以產生完整抗體，包括人抗體，或任何其它所需的抗原結合片段，並在任何所需宿主中表達，包括哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，酵母和細菌，如以下詳細論述。例如，也可使用本領域已知的重組產生Fab，Fab』和F(ab』)2片段的方法，如PCT出版物WO WO92/22324；MuUinax等，生物技術12(6)864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 3426-34(1995)；和Better等，科學2401041-1043(1988)所述方法，所述文獻以其全文併入參考。
可用於產生單鏈Fvs和抗體的方法例如包括美國專利4946778和5258498；Huston等，酶學方法20346-88(1991)；Shu等，PNAS907995-7999(1993)；和Skerra等，科學2401038-1040(1988).。在包括在人體內使用抗體及體外檢測分析中，優選使用嵌合的人化的或人抗體。嵌合抗體是一種分子，其中抗體的不同部分衍生自不同物種動物，如具有可變區的抗體衍生自小鼠單克隆抗體和人免疫球蛋白恆定區。本領域已知產生嵌合抗體的方法。見例如Morrison，科學2291202(1985)；Oi等，生物技術4214(1986)；GiUies等(1989)，免疫學方法雜誌125191202；美國專利No.5807715；4816397所述方法，以上文獻以其全文併入參考。人化的抗體是來自結合所需抗原的非人抗體的抗體分子，所需抗原具有一或多個非人物種的互補決定區(CDRs)和一個人免疫球蛋白分子的框架區。通常地，人框架區中的框架殘基由CDR供體抗體的相應殘基取代，以改變優選改良抗原結合。這些框架取代是通過本領域熟知方法鑑別的，例如通過模仿CDR與框架殘基的相互作用，以鑑別框架殘基對抗原結合的重要性，並對比序列以鑑別在特殊位置的異常框架殘基。(見例如Queen等，美國專利No.5585089；Riechmann等，自然332323(1988)，以其全文併入參考)。抗體可以用本領域已知的各種方法人化，包括例如CDR-移植(EP239400；PCT出版物WO 91/09967；美國專利No.5225539，5530101和5585089)；鑲飾或換裝新表面(EP592106；EP519596；Padlan，分子免疫學28(4/5)489-498(1991)；Studnicka等，蛋白質工程7(6)805-814；Roguska等，PNAS 91969-973(1994)，和鏈改組(美國專利No.5565332)。
完全性人抗體是為治療人患者所特別需要的人抗體可通過本領域已知任何方法產生，包括上述噬菌體展示法，使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗體文庫。見例如美國專利No.4444887和4716111；和PCT出版物WO98/46645，WO98/50433，WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735，和WO91/10741；以上文獻均全文併入參考。
人抗體也可用轉基因小鼠產生，該小鼠不能表達功能性內源性免疫球蛋白，但能表達人免疫球蛋白基因。例如，可將人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物，隨機導入或同源重組於小鼠胚胎幹細胞中。或者，除了人重鏈和輕鏈基因之外，可將人可變區，恆定區和多樣性區導入小鼠胚胎幹細胞中。可對小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因非功能性分別或同時通過同源重組導入人免疫球蛋白基因座。尤其地，JH區的純合缺失阻止內源性抗體產生。擴展修飾的胚胎幹細胞，並微注射入成纖維細胞中以產生嵌合小鼠。然後繁育此嵌合小鼠以產生表達人抗體的純合子代。將轉基因小鼠用選擇的抗原以通常方式免疫接種，所用抗原例如是全部或部分本發明的多肽。直接抗抗原的單克隆抗體可得自用常規雜交瘤方法免疫接種的轉基因小鼠。由轉基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉基因，在B細胞分化期間重新排列，隨後進行類別轉換和體細胞突變。因此使用這種方法可產生有治療用途的IgG，IgA，IgM和IgE抗體。產生人抗體的這種方法參見Lonberg和Huszar，免疫學研究綜述1365-93(1995)。生產人抗體和人單克隆抗體的方法見例如PCT出版物WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；歐洲專利No.0598877；美國專利No.5413923；5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；5814318；5885793；5916771；和5939598所述，以其全文併入參考。另外，如Abgenix公司(Freemont，cA)和Genpharm公司(San Jose，c A)可提供直接抗選擇的抗原的人抗體，使用的方法類似於以上所述方法。
識別選擇表位的完全人抗體可使用稱為「指導選擇」的方法產生。在此方法中，選擇的非人單克隆抗體如小鼠抗體，用於指導選擇識別相同表位的完全人抗體〔Jespers等，生物/技術12899-903(1988)〕。
另外，本發明的抗體反過來可用於產生「模擬」本發明多肽的抗獨特型抗體，使用本領域熟知的方法(見例如Greenspan Bona，FASEB雜誌，7(5)437-444(1989)，和Nissinoff，免疫學雜誌147(8)2429-2438(1991))。例如，結合併完全抑制多肽多聚體化和/或本發明多肽與配體結合的抗體，可用於產生抗獨特型抗體，其「模擬」多肽多聚體化和/或結合結構域，從而結合併中和多肽和/或其配體。這種中和抗獨特型抗體或其Fab片段，可用於治療性中和多肽配體。例如，這種抗獨特型抗體可用於結合本發明的多肽和/或結合其配體/受體，從而阻斷其生物活性。編碼抗體的多核苷酸本發明還提供了包含編碼本發明抗體及其片段的核苷酸序列。本發明還涵蓋了在嚴格或較低嚴格雜交條件下，與編碼抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸，所述抗體優選特異結合本發明多肽的抗體，優選結合具有SEQ ID NO2或4胺基酸序列的多肽的抗體。
通過本領域已知方法可獲得多核苷酸，並確定此多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果已知抗體的核苷酸序列，可從化學合成的寡核苷酸中裝配編碼抗體的多核苷酸〔例如Kutmeier等，生物技術17242(1994)〕，簡而言之包括合成含有編碼抗體的部分序列的重疊寡核苷酸，退火併連接這些寡核苷酸，然後通過PCR擴增連接的寡核苷酸。
或者，編碼抗體的多核苷酸可產生自適當來源的核酸。如果含有編碼特殊抗體的核酸的克隆不適合，但抗體分子的序列已知，則編碼免疫球蛋白的核酸可化學合成或得自適當來源(如產生自表達抗體的任何組織或細胞的抗體c DNA文庫，或c DNA文庫，或分離自表達抗體的任何組織或細胞的核酸，優選聚A+RNA，如選擇的表達本發明抗體的雜交瘤細胞)，使用可與序列的3』和5』末端雜交的合成引物通過PCR擴增而獲得，或使用特異於特殊基因序列的寡核苷酸探針通過克隆而獲得，以例如從編碼抗體的c DNA文庫中鑑別-c DNA克隆。然後可將通過PCR產生的擴增的核酸，通過本領域熟知的任何方法克隆入可複製的克隆載體中。
一旦確定抗體的核苷酸序列及相應的胺基酸序列，對抗體的核苷酸序列可用本領域熟知方法進行人工操縱，以產生具有不同胺基酸序列的抗體，例如產生胺基酸取代，缺失和/或插入，所用操縱方法例如重組DNA方法，位點直接誘變，PCR等(見例如Sambrook等，1990，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY；和Ausubel等編輯，1998，分子生物學通用方法，John WileySons，NY所述方法，所述文獻以其全文併入參考)。
在一特異的實施方案中，對重和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列進行檢測，以鑑別互補決定區(CDRs)的序列，通過本領域熟知的方法，例如通過與其它重和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行對比，以確定序列的高變區。使用常規重組DNA方法，可將一或多個CDRs插入框架區中，例如插入人框架區以人化非人抗體，如前所述。框架可以是天然發生的或是共有框架區，優選是人框架區(見例如Chothia等，分子生物學雜誌278457-479(1998)列出了人框架區)。優選地，通過組合框架區與CDRs而產生的多核苷酸，編碼特異結合本發明多肽的抗體。優選地，如前所述，可在框架區內產生一或多個胺基酸取代，並優選地，此胺基酸取代改良抗體與其抗原的結合。另外，這種方法可用於產生胺基酸取代，或缺失一或多個參與鏈內二硫鍵的可變區半胱氨酸殘基，以產生缺失一或多個鏈內二硫鍵的抗體分子。多核苷酸的其它改變也涵蓋在本發明內，並為技術人員熟知。
另外，可使用產生「嵌合抗體」的方法(Morrison等，美國科學院院報81851-855(1984)；Neuberger等，自然312604-608(1984)；Takeda等，自然314452-454(1985))，通過將來自適當抗原特異性的小鼠抗體分子的基因，與來自適當生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起而產生。如前所述，嵌合抗體是一種分子，其中不同部分衍生自不同動物物種，如具有衍生自小鼠mAb的可變區和人免疫球蛋白恆定區的抗體，例如人化抗體。
或者，可使用生產單鏈抗體的方法生產單鏈抗體(美國專利No.4946778；Bird，科學242423-42(1988)；Huston等，美國科學院院報855879-5883(1988)；和Ward等，自然334544-54(1989))。單鏈抗體是通過胺基酸橋連接Fv區的重和輕鏈片段，產生單鏈多肽而形成的。也可使用在大腸桿菌內裝配功能性Fv片段的方法〔Skerra等，科學2421038-1041(1988)〕。生產抗體的方法本發明的抗體可通過本領域任何已知合成抗體的方法生產，尤其通過化合或優選通過重組表達方法。重組表達本發明的抗體，或其片段，衍生物或類似物(如本發明抗體的重鏈或輕鏈，或本發明的單鏈抗體)，要求構建含有編碼抗體的多核苷酸的表達載體。一旦獲得編碼本發明抗體分子或其重鏈或輕鏈，或其一部分(優選含有重或輕鏈可變結構域)的多核苷酸，生產抗體分子的載體可通過本領域熟知的重組DNA方法產生。因此，本文闡述了通過表達含有抗體編碼核苷酸序列的多核苷酸而製備蛋白質的方法。可使用本領域技術人員熟知的方法構建含有抗體編碼序列和適當轉錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法例如包括體外重組DNA方法，合成方法，和體內遺傳重組。因此本發明提供了可複製載體，其包含編碼本發明抗體分子或其重或輕鏈，或重或輕鏈可變結構域的核苷酸序列，其可操縱地連於啟動子。這種載體可包括編碼抗體分子恆定區的核苷酸序列(見例如PCT出版物WO86/05807；PCT出版物WO89/01036；和美國專利No.5122464)，且抗體的可變區可克隆入這種載體中以表達完整輕或重鏈。
將表達載體通過常規方法移至宿主細胞中，然後通過常規方法培養轉染的細胞，以產生本發明的抗體。因此，本發明包括含有編碼本發明抗體，或其重或輕鏈，或單鏈抗體的多核苷酸的宿主細胞，該多核苷酸可操縱地連於異源啟動子。在表達雙鏈抗體的優選實施方案中，可將編碼重和輕鏈的載體共同在宿主細胞中表達，以表達完整免疫球蛋白分子，如下所述。
可使用各種宿主表達載體系統以表達本發明的抗體分子。這種宿主表達系統代表可產生並隨後純化相應編碼序列的載體，也可代表當用適當的核苷酸編碼序列轉化或轉染時，可在原位表達本發明抗體分子的細胞。這些細胞包括但非限於微生物如細菌(例如大腸桿菌，B.枯草桿菌)，該細菌用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA，質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化；酵母，(如Saccharomyces，Pichia)，其用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉化；昆蟲細胞系統，該細胞用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(如杆狀病毒)感染；植物細胞系統，該細胞用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒CaMV；菸草花葉病毒TMV)感染，或用含有抗體編碼序列的重組質粒表達載體(如Ti質粒)轉化；或哺乳細胞系統(如COS，CHO，BHK，293，3T3細胞)，該細胞具有含有衍生自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)，或衍生自哺乳動物病毒的啟動子(如腺病毒晚期啟動子，痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達構建體。優選地，細菌細胞如大腸桿菌細胞，更優選真核細胞，尤其表達整個重組抗體分子的真核細胞，用於表達重組抗體分子。例如，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，與載體如人巨細胞病毒的主要中間早期基因啟動子因子締合，是抗體的一種有效表達系統(Foecking等，基因45101(1986)；Cockett等，生物/技術82(1990))。
在細菌系統中，根據對被表達的載體的預期使用，可優選一些表達載體。例如，當為產生抗體分子的藥物組合物而大量生產這種蛋白質時，需要指導易於純化的融合蛋白產物高水平表達的載體。這種載體包括但非限於大腸桿菌表達載體pUR 278(Ruther等，EMBO雜誌21791(1983))，其中抗體編碼序列可單獨連接於載體中具有lacZ編碼區的框架中，以便產生融合蛋白；pIN載體(Inouye Inouye，核酸研究133101-3109(1985)；Van Heeke Schuster，生物化學雜誌245503-5509(1989))；等。還可使用pGEX載體以表達作為與穀胱甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白的外源多肽。一般地，這種融合蛋白是可溶的並且可易於從裂解的細胞中純化，通過附著並結合穀胱甘肽瓊脂糖珠，接著在存在游離穀胱甘肽的情況下洗脫而進行。設計的pGEX載體包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點，以便克隆的靶基因產物可從GST組分中釋放。
在昆蟲系統中，首苜銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcNPV)用作表達外源基因的載體。此病毒生長於Spodoptera frugiperda細胞中。抗體編碼序列可單獨克隆入病毒的非必需區域(如多角體蛋白基因)，並在AcNPV啟動子(如多角體蛋白啟動子)的控制下置放。
在哺乳動物宿主細胞中，可使用一些基於病毒的表達系統。在腺病毒用作表達載體的情況中，相應的抗體編碼序列可連接於腺病毒轉錄/翻譯控制複合物，如晚期啟動子和三聯前導序列。然後將此嵌合基因通過體外或體內重組插入腺病毒基因組中。在非必需區中插入病毒基因組(如在E1或E3區)產生一種重組病毒，其在感染的宿主中是可生存的並能表達抗體分子。(見Logan Shenk，美國科學院院報81355-359(1984))。為高效翻譯插入的抗體編碼序列，還需要特異的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。另外，起始密碼子必須是具有所需編碼序列的讀框的狀態，以確保翻譯完整的插入體。這些內源性翻譯控制信號和起始密碼子可以是各種來源的，天然的及合成的均可。表達效力可通過包含適當轉錄增強子，轉錄終止子等而得以加強(見Bittner等，酶學方法15351-544(1987))。
另外，可選擇調節插入序列表達，或以特異所需方式修飾及加工基因產物的宿主細胞菌株。對蛋白質產物的這種修飾(如糖基化)和加工(如裂解)對蛋白質的功能是重要的。不同的宿主細胞具有特徵性及特異性的翻譯後加工和修飾蛋白質和基因產物的機制。可選擇適當的細胞系或宿主系統，以確保正確修飾和加工所表達的外源蛋白質。為此，可使用具有正確加工原始轉錄物，糖基化和磷酸化基因產物的細胞機制的真核宿主細胞。這種哺乳動物宿主細胞包括但非限於CHO，VERY，BHK，Hela，COS，MDCK，293，3T3，WI38，尤其包括乳腺癌細胞系如BT483，Hs578T，HTB2，BT20和T47D，和正常乳腺細胞系如CRL7030，和Hs578Bst。
為長期高產量產生重組蛋白質，優選穩定的表達。例如，可對穩定表達抗體分子的細胞系基因工程化。除了使用含有病毒複製起源的表達載體，宿主細胞可用由適當表達控制因子(如啟動子，增強子，序列，轉錄終止子，聚腺苷酸化位點等)控制的DNA，和一可選擇標記轉化。在導入外源DNA之後，使基因工程化的細胞在滋養培養基中生長1-2天，然後轉換為選擇性培養基。重組質粒中的可選擇標記授與對選擇的抗性，並使細胞穩定地將質粒整合入其染色體中，並生長形成foci，其反過來可克隆入細胞系中並擴展。色體中，並生長形成foci，其反過來可克隆入細胞系中並擴展。此方法可用於基因工程化表達抗體分子的細胞系。這種工程化的細胞系尤其用於篩選和評價直接或間接與抗體分子相互作用的化合物。
可使用一些選擇系統，包括但非限於單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，細胞11223(1977))，次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska Szybalski，美國科學院院報48202(1992))，和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等，細胞22817(1980))基因，可分別用於tk-hgprt-或aprt細胞中。同樣，抗體謝物抗性可用作選擇以下基因的基礎dhfr，其授與氨甲喋呤抗性(Wigler等，美國科學院院報77357(1980)；O』Hare等，美國科學院院報781527(1981))；gpt，其授與黴酚酸抗性(Mulligan Berg，美國科學院院報782072(1981))；neo，其授與氨基糖苷G-418抗性(臨床藥理學12488-505；Wu和Wu，生物治療387-95(1991)；Tolstoshev，藥物毒性分析研究32573-596(1993)；Mulligan，科學260926-932(1993)；和Morgan及Anderson，生物化學分析研究62191-217(1993)；May，1993，TIBTECH 11(5)155-215)；hygro，其授與潮黴素抗性(Santerre等，基因30147(1984))。本領域已知的重組DNA方法可常規用於選擇所需的重組克隆，這種方法例如由Ausubel等編輯，分子生物學通用方法，John Wiley Sons，NY(1993)；Kriegler，基因轉移和表達實驗手冊，Stockton出版社，NY(1990)；及Dracopoli等編輯，人體遺傳學通用方法，John Wiley Sons，NY(1994)中第12章和第13章；Colberre-Garapin等，分子生物學雜誌1501(1981)所述，以上文獻均以全文併入參考。
抗體分子的表達水平可通過載體擴增而提高(參見Bebbington和Hentschel，使用基於基因擴增的載體在哺乳動物細胞中表達克隆的基因，DNA克隆，第三卷(科學出版社，紐約，1987))。當表達抗體的載體系統中的標記是可擴增的時，提高宿主細胞培養物中抑制劑的水平，將提高標記基因的拷貝數。由於擴增的區域與抗體基因相締合，因此抗體的產量也隨之提高(Crouse等，分子細胞生物學3257(1983))。
宿主細胞可用本發明的兩個表達載體共轉染，第一個載體編碼重鏈衍生的多肽，第二個載體編碼輕鏈衍生的多肽。這兩個載體可含有相同的可選擇標記，其能相同表達重鏈和輕鏈多肽。或者，可使用一個單一載體，其編碼並能表達重鏈和輕鏈多肽。在這種情況中，輕鏈應置於重鏈之前，以避免過量的毒性游離重鏈(Proudfoot，自然32252(1986)；Kohler，美國科學院院報772197(1980))。重鏈和輕鏈編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
一旦已經通過動物，化學合成，或重組表達產生本發明的抗體分子，其可通過本領域已知的任何純化免疫球蛋白分子的方法純化，例如通過層析(如離子交換層析，親和層析，尤其在蛋白A之後特異性抗原層析，及規格柱層析)，離心，差異溶解性，或通過純化蛋白質的任何其它方法純化。另外，本發明的抗體或其片段可與本文所述或本領域已知的其它異源多肽序列融合，以易於純化。
本發明涵蓋了重組融合於或化學綴合於(包括共價和非共價綴合)本發明多肽(或其一部分，優選多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100個胺基酸)的抗體，以產生融合蛋白。此融合非必需直接融合，可通過接頭序列產生。此抗體可特異於除了本發明多肽(或其一部分，優選多肽的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90或100個胺基酸)的抗原。例如，抗體可用於在體外或體內將本發明多肽定向於特殊細胞類型，通過將本發明的多肽融合或綴合於特異於特殊細胞表面受體的抗體而進行。融合或綴合於本發明多肽的抗體還可用本發明已知方法用於體外免疫分析和純化方法中，見例如Harbor等，如前，和PCT出版物WO93/21232；EP 439095；Naramura等，免疫學通訊3991-99(1994)；美國專利5474981；Gillies等，PNAS 891428-1432(1992)；Fell等，免疫學雜誌1462446-2452(1991)，所述文獻以其全文併入參考。
本發明還包括一種組合物，其包含融合或綴合於抗體除可變區之外的結構域的本發明多肽。例如，本發明的多肽可融合於或綴合於抗體Fc區域，或其一部分。融合於本發明多肽的抗體部分可包含恆定區，絞鏈區，CH1功能域，CH2功能域，和CH3結構域或者完整結構域或其一部分的任意組合。多肽也可融合或綴合於上述抗體部分以形成多聚體。例如，融合於本發明多肽的Fc部分可通過Fc部分之間的二硫鍵形成二聚體。通過多肽與IgA和IgM部分融合可形成較高多聚體。本領域已知將本發明多肽融合或綴合於抗體部分的方法。見例如美國專利No.5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP 307434；EP 367166；PCT出版物WO96/04388；WO 91/06570；Ashkenazi等，美國科學院院報8810535-10539(1991)；Zheng等，免疫學雜誌1545590-5600(1995)；和Vil等，美國科學院院報8911337-11341(1992)，所述文獻均以全文併入參考。
如前所述，相當於SEQ ID NO2或4的多肽，多肽片段或變體，可融合或綴合於上述抗體部分，以提高多肽在體內的半衰期或用於免疫分析中。另外，相當於SEQ ID NO2或4的多肽，多肽片段或變體，可融合或綴合於上述抗體部分以易於純化。一報導的實施例闡述了由人CD-4多肽的前兩個結構域和哺乳動物免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恆定區的各種結構域組成的嵌合蛋白(EP 39482)；Traunecken等，自然33184-86(1988)。融合或綴合於具有二硫鍵聯的二聚體結構的抗體(由於IgG所致)的本發明多肽，也可比單體分泌的蛋白質或單獨的蛋白質片段更有效地結合與中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學雜誌2703958-3964(1995))。在許多情況中，融合蛋白中Fc部分在治療和診斷中是有益的，因此例如可改善藥物動力學性質。(EP A 232 262)。或者，在融合蛋白已被表達，檢測和純化後缺失的Fc部分，將是所需的。例如，如果融合蛋白用作免疫抗原，則Fc部分可阻礙治療和診斷。在藥物開發中，例如在高產量篩選分析中人體蛋白如hIL-5已與Fc部分融合，以鑑別hIL-5的拮抗劑(見Bennett等，分子識別雜誌852-58(1995)；Johanson等，生物化學雜誌2709459-9471(1995)。
另外，本發明的抗體或其片段可融合於標記序列如肽以易於純化。在優選的實施方案中，標記胺基酸序列是6組氨酸肽，如在pQE載體中提供的標記(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)，其中許多是可商購的。如Gentz等，美國科學院院報86821-824(1989)所述，6-組氨酸可進行常規純化融合蛋白。用於純化的其它肽標記包括但非限於「HA」標記，其相當於衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，細胞37767(1984))，和「flag」標記。
本發明還涵蓋了綴合於診斷或治療劑的抗體或其片段。抗體可診斷性地例如用於監測腫瘤的發生和轉移，作為臨床檢測方法的一部分以例如確定給定的治療方案的效力。可通過將抗體偶聯於可檢測物質而便於進行檢測。可檢測物質例如可包括各種酶，輔基，螢光物，發光物，生物發光物，放射性物質，用各種正電子發射斷層顯象法的發射正電子金屬，和非放射性順磁金屬離子。使用本領域已知方法，將可檢測物質直接偶聯或綴合於抗體(或其片段)，或間接通過中間物(例如本領域已知的接頭)偶聯或綴合於抗體(或其片段)，見例如美國專利No.4741900闡述了可綴合於抗體根據本發明可用於診斷的金屬離子。適當的酶例如包括辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙醯膽鹼脂酶；適當的輔基複合物包括鏈親和素/生物素，和親和素/生物素；適當的螢光物包括傘形酮，螢光素，異硫氰酸螢光素，羅丹明，二氯三嗪胺螢光素，丹磺醯氯；適當的發光物包括魯米諾；生物發光物例如包括螢光素酶，螢光素和水母蛋白；適當的放射性物質例如包括125I，131I，111In，或99Tc。
另外，抗體或其片段可綴合於治療性組分如細胞毒素，例如細胞靜止或殺細胞性製劑，治療性製劑或放射性金屬離子如α-發射物例如213Bi。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞不利的任何製劑。例如包括paclitaxol，細胞松馳素B，短桿菌肽D，溴化乙錠，吐根鹼，絲裂黴素，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，表鬼臼毒噻吩糖苷長春新鹼，長春花鹼，秋水仙素，阿黴素，道諾紅菌素，二羥炭疽菌素，mitoxantrone，光神黴素，放線菌素D，1-脫氫睪酮，糖皮質激素，procaine，tetracaine，lidocaine，propranolol，和嘌呤黴素及它們的類似物或同源物。治療劑包括但非限於抗代謝物(如氨甲喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，cytarbine，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化劑(如mechlorethamine，thioepachlorambucil，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥，carmustine(BSNU)和lomustine(CCNU)，cyclothosphamide，busulfan，dibromomannitol，streptozotocin，絲裂黴素C，和順-二胺二氯鉑(II)(DDP)順鉑)，anthracyclines(如道諾紅菌素(道諾黴素前體)和阿黴素)，抗生素(如dactinomycin(放線菌素前體)，博來黴素，光神黴素，和氨茴黴素(AMC))，和抗有絲分裂劑(如長春新鹼和長春花鹼)。
本發明的綴合物可用於修飾給定的生物應答。治療劑或藥物組分非限於如傳統化學治療劑般構建。例如，藥物組分可以是具有所需生物活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括例如毒素如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假單胞桿菌外毒素，或白喉毒素；蛋白質如腫瘤壞死因子，α-幹擾素，β-幹擾素，神經生長因子，血小板衍生生長因子，組織纖溶酶原激活物，細胞程序死亡劑如TNF-α，TNF-β。AIMI(見國際出版物No.WO97/33899)，IMII(見國際出版物No.WO97/34911)，Fas配體(Takahashi等，免疫學進展61567-1574(1994))，VEGI(見國際出版物No.WO 99/23105)，thrombotic劑或抗血管生成劑如angiostatin或endostatin；或生物應答修飾劑例如淋巴因子，白細細介素-1(IL-1)，白細胞介素-2(IL-2)，白細胞介素-6(IL-6)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生長因子。
抗體可附著於特別用於免疫分析或純化靶抗原的固體支持物。這種固體支持物包括但非限於玻璃，纖維素，聚丙烯醯胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。
本領域熟知將這種治療組分綴合於抗體的方法，見例如Arnon等，「在癌症治療中免疫定向藥物的單克隆抗體」，單克隆抗體和癌症治療，Reisfeld等編輯，p243-56(Alan R.Liss公司，1985)；Hellstrom等，「藥物輸送抗體」，控制的藥物輸送(第2版)，Robinson等編輯，p623-53(Marcel Dekker公司，1987)；Thonpe，「癌症治療中胞毒劑的抗體載體綜述」，單克隆抗體』84生物和臨床應用，Pinchera等編輯，p475-506(1985)；「在癌症治療中治療性使用放射標記的抗體的分析，結果和特徵」，檢測和治療癌症中的單克隆抗體，Baldwin等編輯，p303-16(科學出版社，1985)，和Thorpe等，「抗體—毒素綴合物的製備和胞毒性」，免疫學綜述62119-58(1982)。
或者，抗體可綴合於另一種抗體以形成抗體異源綴合物，如Segal的美國專利No.4676980所述，以其全文併入參考。
有或無治療組分綴合於其的抗體，可單獨施用或與胞毒因子和/或細胞因子組合施用，以進行治療。
免疫表型本發明的抗體可用於對細胞系和生物樣品進行免疫表型。本發明基因的翻譯產物可用作細胞特異性標記，或更特別地作為細胞標記，其在特殊細胞類型的分化和/或成熟的各個階段不同表達。直接抗特異性表位或表位組合的單克隆抗體，可以篩選表達此標記的細胞群。可利用各種使用單克隆抗體的方法篩選表達標記的細胞群，包括用抗體包被的磁性珠磁性分離，用附著於固體基質(即平板)的抗體「淘選」，和流式細胞計量(見例如美國專利5985660；和Morrison等，細胞96737-49(1999))。
這些方法可以篩選特殊細胞群，如可發現血液惡性腫瘤(即急性白血病患者最小殘餘病(MRD))，和移植中的「非自身」細胞以預防移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者，這些方法可篩選能經歷增殖和/或分化的造血幹細胞和祖細胞，如可在人臍帶血中發現的細胞。
抗體結合分析可通過本領域已知的任何方法分析本發明抗體的免疫特異性結合。可使用的免疫分析包括但非限於競爭性和非競爭性分析系統，所用方法如Western印跡，放射免疫分析，ELISA(酶聯免疫吸附測定)，「夾心」免疫分析，免疫沉澱分析，沉澱素反應，凝膠擴散沉澱素反應，免疫擴散分析，凝集分析，補體固定分析，免疫放射分析，螢光免疫分析，蛋白A免疫分析等等。這些分析在本領域是常規且熟知的。(見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wiley Sons，Inc.，紐約，以其全文併入參考)。以下簡要舉例簡述了一些免疫分析(非限制性)。
免疫沉澱方法通常包括裂解在裂解緩衝液中的細胞群，裂解緩衝液如補加蛋白質磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(如EDTA，PMSF，抑蛋白酶肽，釩酸鈉)的RIPA緩衝液(1％ NP-40或Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH 7.2，1％Trasylol)，將相應抗體加入細胞裂解物中，在4℃溫育一段時間(如1-4小時)，向細胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠，在4℃溫育大約1小時或更長時間，在裂解緩衝液中衝洗此珠，並將此珠再懸浮於SDS/樣品緩衝液中。相應抗體免疫沉澱特殊抗原的能力可通過例如Western印跡分析確定。本領域技術人員已知可對參數加以修改以提高抗體與抗原的結合，並減少背景(如用瓊脂糖珠預先澄清細胞裂解物)。關於免疫沉澱的進一步論述見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wiley Sons，Inc.，紐約，在10.6.1中所述。
Western印跡分析通常包括製備蛋白質樣品。在聚丙烯醯胺凝膠中電泳此蛋白質樣品(如根據抗原分子量使用8％-20％SDS-PAGE)，將蛋白質樣品從聚丙烯醯胺凝膠中移至膜上如硝酸纖維素膜，PVDF膜或尼龍膜，將此膜在封阻液中封阻(如具有3％BSA或脫脂乳的PBS)，在衝洗液中衝洗此膜(如PBS-Tween 20)，用在封阻液中稀釋的原始抗體(相應抗體)封阻此膜，在衝洗液中衝洗此膜，用二級抗體封阻此膜，二級抗體是在封阻液中稀釋的綴合於酶促底物(如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸)或放射性分子(如32p或125I)的抗體，其識別原始抗體如是抗人抗體，將此膜在衝洗液中衝洗，並檢測抗原存在情況。本領域技術人員已知可對參數加以修改，以提高信號檢測並降低背景幹擾。關於Western印跡方法的進一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wilety Sons，Inc.，紐約，在10.8.1中所述。
ELISA包括製備抗原，用抗原包被96孔微滴定平板的孔，向孔中加入綴合於可檢測化合物如酶促底物(如辣根氧化物酶或鹼性磷酸酶)的相應抗體，溫育一段時間，檢測抗原的存在情況。在ELISAs中，相應抗體非必須綴合於可檢測化合物；可將綴合於可檢測化合物的二級抗體(其識別相應抗體)加入孔中。另外，可用抗體包被孔代替用抗原包被孔。在這種情況中，綴合於可檢測化合物的另一種抗體可在加入相應抗體之後加入包被的孔中。本領域技術人員已知可對參數加以修改以提高信號檢測及對ELISA可作其它改變。關於ELISA的進一步闡述見例如Ausubel等編輯，1994，分子生物學通用方法，第1卷，John Wiley Sons，Inc.，紐約，11.2.1所述。
抗體與抗原的結合親和性和抗體抗原相互作用的off-rate可通過競爭性結合分析確定。競爭性結合分析例如是放射性免疫分析，包括用相應的抗體在存在增加量未標記的抗原的情況下，溫育標記的抗原(如3H或125I)，並檢測與標記的抗原結合的抗體。相應抗體與特殊抗原的結合親和性及結合off-rate可通過Scatchard印跡分析的結果確定。與另一種抗體的競爭也可用放射免疫分析確定。在這種情況中，抗原用綴合於標記的化合物(如3H或125I)的相應抗體，在存在增加量未標記的另一種抗體的情況下溫育。
治療應用本發明還小及一種基於抗體的治療方法，包括將本發明的抗體施用於動物，優選哺乳動物，更優選病人，以治療一或多種所述的疾病，功能失調或病理狀態。本發明的治療化合物包括但非限於本發明的抗體(包括其片段，類似物和衍生物)，和編碼本發明抗體的核酸。本發明可用於治療，抑制或預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病，功能失調或病理狀態，包括但非限於本文所述的一或多種疾病，功能失調或病理狀態。治療或預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病，功能失調或病理狀態，包括但非限於改善與這些疾病，功能失調或病理狀態相關的症狀。本發明的抗體可以製成藥學合適的組合物，如本領域已知或本文所述。
本發明抗體可治療性應用的途徑包括將本發明的多核苷酸或多肽局部或全身性地結合於體內，或通過抗體的直接胞毒性，例如由補體細胞(CDC)或效應細胞(ADCC)介導。這些方法在下文加以詳細闡述。根據本文教導，本領域技術人員知道怎樣使用本發明的抗體進行診斷，監測或治療，而不需要過多的試驗。
本發明的抗體可與其它單克隆或嵌合抗體，或與淋巴因子或造血生長因子(如IL-2，IL-3和IL-7)組合應用，例如可提高與抗體相互作用的效應細胞的數目或活性。
本發明的抗體可單獨施用或與其它類型的治療方法組合施用(如放療，化療，激素療法，免疫療法和抗腫瘤劑)。通常地，施用的產物的來源或物種反應性(在抗體的情況下)優選是與病人相同的物種的。因此在一優選的實施方案中，將人抗體，其片段、衍生物，類似物或核酸施用於人，以進行治療或預防。
優選使用抗本發明多肽或多核苷酸的高親和性和/或潛在體內抑制和/或中和抗體，其片段或區域，以進行免疫分析和治療與本發明多核苷酸或多肽包括其片段相關的疾病。這種抗體，片段或區域優選與本發明的多肽或多核苷酸有親和性。優選的結合親和性包括解離常數或kd小於以下數值5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。
基因治療在一特異的實施中，施用包含編碼抗體或其功能性衍生物的序列的核酸，通過基因療法治療，抑制或預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病或功能失調。基因療法是指通過為治療對象施用表達的或可表達的核酸而進行治療的方法。在本發明的這種實施方案中，核酸產生其編碼的蛋白質介導治療作用。
根據本發明可使用本領域中任何適當的基因治療方法。例如以下所述的方法關於基因治療的一般論述見於Gold spiel等，臨床藥理學12488-505(1993)；Wu和Wu，生物治療387-95(1991)Tolstoshev，藥物毒性分析研究32573-594(1993)；Mulligan，科學260926-932(1993)；May，TIBITECH 11(5)155-215(1993)。可使用的本領域已知的重組DNA方法見於Ausubel等編輯，分子生物學通用方法，John Wiley Sons，NY(1993)；和Kriegler，基因轉移和表達實驗手冊，Stockton出版社，NY(1990).
優選的一方面，化合物包含編碼抗體的核酸序列，所述核酸序列是在適當宿主中表達抗體或其片段或嵌合蛋白或重鏈或輕鏈的表達載體的一部分。尤其地，這種核酸序列具有可操縱地連於抗體編碼區的啟動子，所述啟動子是可誘導的或組成型的，及任選地是組織特異性的。在另一特殊的實施方案中，使用的核酸分子其中抗體編碼序列和任何其它所需序列，位於基因組中所需位點啟動同源重組的區域兩則，因此可使抗體編碼核酸在染色體內表達(Koller和Smithies，美國科學隆隆報868932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342435-438(1989)。在特異的實施方案中，表達的抗體分子是一單鏈抗體；或者，核酸序列包括編碼抗體的重鏈和輕鏈，或其片段的序列。
將核酸施用於患者可通過直接或間接方式，直接方式是將患者直接曝露於核酸或攜帶核酸的載體，間接方式是將細胞首先用核酸在體外轉化，然後移植到患者體內。這兩種方法分別稱為體內或源於體內的基因療法。
在一特異的實施方案中，將核酸序列直接在體內施用，其在體內被表達從而產生編碼的產物。這可通過本領域已知的許多方法進行，例如將它們構建為適當的表達載體的一部分，並施用由此成為胞內一部分，例如通過用缺陷的或弱化的逆轉錄病毒或其它病毒感染(見美國專利NO.4980286)，或通過直接注射裸DNA，或通過使用微粒轟擊(如基因槍，Biolistic，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被，在脂質體微粒或微膠囊化，或與已知進入細胞核的肽連接而施用，與配體連接進行受體介導的胞吞作用而施用(見例如Wu和Wu，生物化學雜誌2624429-4432(1987))(其可用於定向特異表達受體而細胞類型)，等等。在另一實施方案中，可形成核酸一配體複合物，其中配體包含融合病毒肽以破壞核內體，使核酸免於被溶酶體降解。在另一實施方案中，核酸可在體內通過定向特異受體的特異定向，以進行細胞特異性吸收和表達(見例如PCT出版物WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/1188，WO93/20221)。或者，可通過同源重組將核酸導入細胞內和摻入宿主細胞DNA中以進行表達(Koller和Smithies，美國科學院院報868932-8935(1989)；Zijlstra等，自然342435-438(1989))。
在一特異的實施方案中，使用含有編碼本發明抗體的核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(見Niller等，酶學方法217581-599(1993))。這些逆轉錄病毒載體含有正確包裝病毒基因組和整合入宿主細胞DNA所必需的組分。將在基因療法中使用的編碼抗體的核酸序列克隆入一或多個載體中，該載體易於將基因輸送於病人。關於逆轉錄病毒載體的更詳細論述見於Boesen等，生物治療6291-302(1994)，其闡述了使用逆轉錄病毒載體將mdrL基因輸送於造血幹細胞；以使幹細胞對化療更有抗性。在基因治療中使用逆轉錄病毒載體的其它參考文獻例如是Clowes等，臨床研究雜誌93644-651(1994)；Kiem等，血液831467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人體基因治療4129-141(1993)；和Grossman和Wilson，遺傳和發育通用觀點3110-114(1993)。
腺病毒是可用於基因治療的另一種病毒載體。腺病毒是將基因輸送於呼吸道上皮的特別適合的載體。腺病毒自然感染呼吸道上皮導致輕微疾病。基於腺病毒的輸送系統的基它靶器官是肝，中樞神經系統，內皮細胞和肌。腺病毒具有能感染未分化細胞的優勢。Kozarsky和Wilson，遺傳與發育通用觀點3499-503(1993)提出了一種基於腺病毒的基因療法。Bout等，人體基因治療53-10(1994)論證了使用腺病毒載體將基因移至哮喘猴的呼吸道上皮。在基因治療中使用腺病毒的基它實例見於Rosenteld等，科學252431-434(1991)；Rosenteldt，68143-155(1992)；和Wang等，基因治療2775-783(1995)。在一優選的實施方案中，使用腺毒載體。
腺伴隨病毒(AAV)也已用於基因治療中(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204-289-300(1993)；美國專利No.5436 146)。
基因治療的另一方法包括將基因移至組織培養物中的細胞中，通過如電穿孔，脂染，磷酯鈣介導的轉染，或病毒感染等方法。轉移方法一般包括將可選擇標記移至細胞中。然後將細胞選擇放置以分離那些吸收並表達轉移的基因的細胞，然後將這些細胞輸送於患者。
在此實施方案中，將核酸導入細胞中，之後在體內施用所得重組細胞。這種導入可通過本領域已知的任何方法進行，包括但非限於轉染，電穿孔，微注射，用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染，細胞融合，染色體介導的基因轉移，微細胞介導的基因轉移，原生質球融合等。本領域已知許多將外源基因導入細胞的方法(見例如Loeffier和Behr，酶學方法217599-618(1993)；Cohen等，酶學方法217618-644(1993)；Cline.，藥物治療2969-92m(1985)，根據本發明可以使用這些方法，保證受體細胞的基本發育和生理功能不被破壞。所用方法應穩定地將核酸移至細胞，以使核酸可由細胞表達，並優選可由其細胞子代遺傳和表達。
所得重組細胞可通過本領域已知的各種方法輸送於患者。重組血細胞(如造血幹細胞或祖細胞)優選靜脈內施用。細胞用量根據所需效應，病人狀態等而定，並可由本領域技術人員確定。
可導入核酸以進行基因治療的細胞包括任何所需的適當細胞類型，包括但非限於上皮細胞，內皮細胞，角質形成細胞，成纖維細胞，肌細胞，肝細胞；血細胞如T淋巴細胞，B淋巴細胞，單核細胞，巨噬細胞，嗜中性白細胞，嗜酸性粒細胞，巨核細胞，粒細胞；各種幹細胞或祖細胞，尤其造血幹細胞或祖細胞，如得自骨髓，臍帶血，周圍血，胎兒肝臟等的造血幹細胞或祖細胞。
在一優選的實施方案中，用於基因治療的細胞是患者自身的。
在基因治療中使用重組細胞的一實施方案中，將編碼抗體的核酸序列導入細胞中，這樣其可由細胞或細胞子代表達，然後將重組細胞在體內施用以進行治療。在一特異的實施方案中，使用幹細胞或祖細胞。根據本發明的此實施方案可潛在使用可在體外分離和保持的任何幹細胞和/或祖細胞(見例如PCT出版物WO94/08598；Stemple和Anderson，細胞71937-985(19892)；Rheinwald，細胞生物學方法21A229(1980)；和Pittelkow和Scott，Aayo Clinic Proc.61771(1986))。
在一特異的實施方案中，在基因治療中導入的核酸包含可操縱地連於編碼區的可誘導啟動子，這樣核酸的表達可通過控制適當轉錄誘導子的存在與否而加以控制。論證治療或預防活性。
本發明的化合物或藥物組合物優選在體外測試，然後在體內測試所需的治療或預防活性，之後再用於人體，例如，在體外分析論證化合物或藥物組合物的治療或預防活性，包括化合物對細胞系或患者組織樣品的作用。化合物或組合物對細胞系和/或組織樣品的作用，可通過本領域已知方法確定，包括但非限於花結形成分析和細胞裂解分析。根據本發明，可使用的確定特異化合物的施用是否是指定的體外分析，包括體外細胞培養分析，其中將病人組織樣品生長於培養基中，曝露於或另外施用化合物，觀測這種化合物對組織樣品的作用。
治療性/預防性施用及組合物本發明提供了通過為治療對象施用有效量的本發明化合物或藥物組合物，優選本發明抗體，以進行治療，抑制和預防的方法。優選的一方面，化合物是基本純化的(如基本沒有限制其作用或產生非所需副作用的物質)。治療對象優選是動物，包括但非限於牛、豬、馬、雞、貓、狗等，優選是哺乳動物，更優選是人。
當化合物包含核酸或免疫球蛋白時，可應用的施用配方和方法如上所述；其它適當的配方和施用途徑可選自以下所述。
已知許多輸送系統並可用於施用本發明的化合物，例如在脂質體、微粒、微囊中膠囊化，能表達化合物的重組細胞，受體介導的胞吞(見例如Wu和Wu，生物化學雜誌，2624429-4432(1987))，將核酸構建為逆錄病毒或其它載體的一部分等，導入方法包括但非限於皮內，肌內，腹膜內，靜脈內，皮下，鼻內，epidural和口服。化合物或組合物可通過任何常規途徑施用，例如通過融合或大丸注射，通過上皮或黏膜與皮膚界線(如口腔黏膜，直腸和小腸黏膜等)吸收，及可與其它生物活性劑一起施用。可系統或局部施用。另外，可通過任何適當途徑將本發明的藥物化合物或組合物導入中樞神經系統，包括靜脈內和動脈內注射；靜脈內注射可通過靜脈內導管注射，例如附著於貯液槽如Ommaya貯液槽，也可使用肺部施用，如通過使用吸入器或噴霧器，及使用具有霧化劑的配方。
在一特異的實施方案中，可將本發明的藥物化合物或組合物局部施用於需要治療的部位；這可例如但非限於通過在手術期間局部灌注，局部應用如在手術後與傷口加壓結合，通過注射，利用導管，利用栓劑，或利用移植體，所述移植體是有孔，無孔或凝膠物，包括膜如sialastic膜或纖維。優選地，當施用本發明的蛋白質包括抗體時，必須注意使用該蛋白質不吸收的物質。
在另一實施方案中，化合物或組合物可在載體中輸送，尤其在脂質體中(見Langer，科學2491527-1533(1990))；Treat等，感染性疾病和癌症治療中的脂質體，Lopez-Berestein和Fidler編輯，Liss，紐約，pp 3353-35(1989)；Lopez-Berstein，如上，pp 317-327；如上)。
在另一實施方案中，化合物或組合化合物可在控制釋放系統中輸送。在一實施方案中，可使用泵(見Langer，如前；Sefton，CRCCrit.Ret.Biomed.Eng.1420l(1987)；Buchwald等，外科學88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實施方案中，可使用多聚體物質(見控制釋放的醫學應用，Langer和Wise編輯，CRC出版社，Boca Raton，Floride(1974)；控制的藥物生物適應性，藥品設計與生產，Smolen和Ball編輯，Wiley，紐約(1984)；Ranger和Pdppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；也見於Levy等，科學228190(1985)；During等，神經學分析25351(1989)；Howard等，神經藥物雜誌71105(1989)。在另一實施方案中，控制的釋放系統可置於治療靶器官的鄰近，即腦組織中，因此只需要全身劑量的一部分(見例如Goodson，控制釋放的醫學應用，如前，第2卷，pp 115-138(1984))。
其它控制釋放系統參見Langre所述(科學2491527-1533(1990))。
在一特異的實施方案中，其中本發明的化合物是編碼蛋白質的核酸，可將核酸在體內施用以促進其編碼的蛋白質表達，通過將其構建為適當核酸表達載體的一部分，並將其施用，以使其成為胞內一部分，例如使用逆轉錄病毒載體(見美國專利No.4980286)或通過直接注射，或使用微粒轟擊(如基因槍，Biolistic，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被，或與已知進入細胞核的類同源核的類同源框肽連接而施用(見例如Joliot等，美國科學院院報881864-1868(1991))等。或者，可通過同源重組將核酸導入細胞內或摻入宿主細胞DNA中表達。
本發明還提供了藥物組合物。這種組合物包含治療有效量的化合物，和藥物適當的載體。在一特異的實施方案中，術語「藥物適當的」是指聯邦政府或政府部門管理機構批准的，或美國藥曲或其它公認藥典中所列的可用於動物尤其是人的物品。術語「載體」指與治療劑一起施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或運載體。這種藥物載體可以是無菌液體如水和油，包括石油，動物油，植物油或合成油，如花生油、豆油、礦物油，芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可用作液體載體，尤其可注射溶液。適當的藥物賦形劑包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽糖，米，麵粉，石灰，矽膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油，滑石，氯化鈉，無水脫脂乳，甘油，丙烯，二醇，水，乙醇等。如果需要，組合物也可含有少量溼化或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以是溶液，懸浮液，乳液，片劑，丸劑，膠囊、粉末，緩釋配方等。組合物可用傳統結合劑和載體如甘油三酯配製為栓劑。口服配方可包括標準載體如藥物梯度的甘露糖醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂、糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。適當的藥物載體例如由E.W.Martin的「Remington’s藥物科學」所述。這種組合物含有治療有效量的化合物，優選純化形式的，及適量的載體，以提供施用於患者的適當形式。配方應適於施用方式。
在優選的實施方案中，組合物是根據配製適於靜脈內施用於人體的藥物組合物的常規方法配製的。典型地，靜脈內施用的組合物是在無菌等滲水溶液緩衝液中的溶液。如果需要，組合物也可包括增溶劑和局部麻醉劑如Lignocaine，以減輕注射部位的疼痛。通常地，單獨或以單位劑量形式混合的配料，例如在密封的容器中乾燥凍幹的粉末或無水濃縮物，密封的容器如是表明活性數量的安瓿或Sachette。在通過灌注施用組合物之處，其可用含有無菌藥物級水或鹽水的灌注瓶分液。在通過注射施用組合物之處，可提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，以在施用前將配料混合。
本發明的化合物可以中性或鹽形式配製，藥物適當的鹽包括陰離子如產生自鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等，和與陽離子如產生自NaOH，KOH，NH4OH，Ca(OH)2，Fe(OH)2，異丙胺，三乙胺，2-乙氨乙醇，組胺，procaine等形成的鹽。
可通過標準臨床方法確定本發明化合物的數量，該數量在治療，抑制和預防與本發明多肽異常表達和/或活性相關的疾病或功能失調中是有效的。另外，可任選地應用體外分析，以助於鑑別最佳劑量範圍。配方中所應用的實際劑量根據施用途徑，疾病程度而定，並應根據醫生診斷和每個病人的狀況而定。有效劑量可從體外或動物模型測式系統產生的劑量應答曲線中推斷。
就抗體而言，施用於患者的劑量為0.1mg/kg體重-100mg/kg體重。優選地，施用於患者的劑量為0.1mg/kg體重-20mg/kg體重，更優選為1mg/kg體重-10mg/kg體重。通常地，人抗體比其它物種的抗體在人體內的半衰期長，這是因為對外源多肽的免疫應答所致。因此，通常可以非頻繁施用較少劑量的人抗體。另外，本發明抗體施用劑量和頻率，可通過對抗體加以修飾例如脂質化，而增強吸收和進入組織(如進入腦組織)的能力，從而減少施用本發明抗體的劑量和頻率。
本發明還提供了一種藥物包裝或試劑盒，其包含一或多個充填本發明藥物組合物的一或多種配料的容器。這種容器中有一份由政府管理生產，使用或銷售藥物或生物製品的機構所準許的告示，反映該藥物可用於人體。
診斷和顯影特異結合相應多肽的標記的抗體，及其衍生物和類似物，可用於檢測，診斷或監測與本發明多肽的異常表達和/或活性相關的疾病，功能失調和/或病理狀態。本發明提供了檢測相應多肽異常表達的方法，包括(a)用一或種特異於相應多肽的抗體，分析在個體的細胞或體液中相應多肽的表達，和(b)將此基因表達水平與標準基因表達水平相對比，分析的多肽基因表達水平與標準表達水平相比提高或降低，表明是異常表達。
本發明提供了論斷疾病的分析方法，包括(a)用特異於相應多肽一或多種抗體，分析在個體的細胞或體液中相應多肽的表達，和(b)將此基因表達水平與標準基因表達水平相對比，從而分析的多肽基因基因表達水平與標準表達水平相比提高或降低，表明特定疾病的存在。就癌症而言，個體活檢組織中存在相對高數量的轉錄物，可表明疾病發生的傾向，或提供在實際臨床症狀出現之前檢測疾病的一種方法。這種診斷方法更明確可使醫生早期應用預防措施或大膽治療，從而防止癌症發生或進一步轉移。
可使用本發明的抗體分析生物樣品中蛋白質水平，使用本領域已知的傳統免疫組織學方法(見例如Jalkanen等，細胞生物學雜誌101976-985(1985)Jaldanen等，細胞生物學雜誌1053087-3096(1987))。用於檢測蛋白質基因表達的其它基於抗體的方法包括免疫分析，如酶聯免疫吸附測定(ELISA)，和放射免疫分析(RIA)。本領域已知適當的抗體分析標記，並包括酶標記，如葡糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(112In)和鍺(99Tc)發光標記，如魯米諾；和螢光標記，如螢光素和羅丹明和生物素。
本發明的一個方面是檢測和論斷在動物體，優選哺乳動物，更優選在人體與相應肽異常表達相關的疾病或功能失調。在一實施方案如，診斷方法包括a)為治療對象施用(例如經非腸道，皮下或腹膜內施用)有效量的特異結合相應多肽的標記的分子；b)施用後間隔一段時間，以使標記的在治療對象體內表達多肽的部位優選濃縮(並從背景水平清除未結合的標記的分子)；c)確定背景水平；和d)檢測治療對象中標記的分子，這樣檢測標記的分子高於背景水平，表明對象具有與相應多肽異常表達相關的特殊病症或功能失調。可通過各種方法確定背景水平，包括將檢測的標記的分子的數量與預先在特定系統中確定的標準值相對比。
本領域知道根據對象的大小和使用的顯影系統，確定產生診斷圖像所需的顯影組分的數量。在放射性同位素組分的情況下，對人而言，注射的放射性物質的數量通常為大約5-20毫居裡的99mTc。然後標記的抗體或抗體片段優先在含有特異蛋白質的細胞累積。體內腫瘤顯影見S.W.Burchiel等，「放射標記的抗體及其片段的免疫藥物學」，(腫瘤顯影癌症的放射性化學檢測，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編輯，Masson出版公司(1982))所述。
根據各種變化，包括使用的標記類型和施用模式，在施用後以使標記的分子優先在對象一定部位濃縮，及從背景水平清除未結合的標記的分子，所間隔的時間為6-48小時或6-24小時，或6-12小時。在另一實施方案中，施用後的間隔時間為5-20天或5-10天。
在一實施方案中，監測疾病或功能失調是通過重複診斷疾病的方法進行的，例如在開始診斷後1個月，6個月，1年等重複一次。
可使用本領域已知體內掃描方法檢測病人體內標記的分子的存在情況。這些方法依賴於所使用的標記類型。熟練技術人員可確定檢測特殊標記的適當方法。可用於本發明診斷方法和設備包括但非限於CT，全身掃描如正電子發射斷層顯象(PET)，核磁共振顯像(MRI)和聲像。
在一特異的實施方案中，分子是用放射性同位素標記的，並用輻射應答外科儀器在病人體內檢測的(Thruston等，美國專利No.5441050)。在另一實施方案中，分子是用螢光化合物標記的，並用螢光應答掃描儀在病人體內檢測的。在另一實施方案中，分子是用發射正電子金屬標記的，並用正電子發射斷層顯象在病人體內檢測。在另一實施方案中，分子是用順磁性標記標記的，並用核磁共振顯象(MRI)在病人體內檢測。
試劑盒本發明提供了可在上述方法中使用的試劑盒。在一實施方案中，試劑盒包含一或多個裝有本發明的抗體，優選純化的抗體的容器。在一特異的實施方案中，本發明的試劑盒含有一基本分離的多肽，其包含與試劑盒中的抗體特異性免疫反應的表位。優選地，本發明的試劑盒還包含對照抗體，其不與相應多肽反應。在另一特異的實施方案中，本發明的試劑盒含有一種檢測抗體與相應多肽結合的方法(例如，可將抗體與可檢測物如螢光化合物，酶底物，放射性化合物或發光化合物綴合，或者可將識別第一種抗體的第二種抗體與可檢測底物綴合)。
在本發明另一特異的實施方案中，試劑盒是一種用於篩選含有抗體的血清的診斷試劑盒，該抗體特異抗增殖性和/或癌性多核苷酸和多肽。這種試劑盒可包括基本分離的多肽抗原，其包含與至少一種抗多肽抗原抗體特異性免疫反應的表位。另外，這種試劑盒包括檢測所述抗體與抗原結合的方法(例如，可將抗體與螢光化合物綴合，如可通過流式細胞計量術檢測的螢光素或羅丹明)。在特異的實施方案中，試劑盒可包括重組產生的或化學合成的多肽抗原。試劑盒的多肽抗原也可附著於固體支持物。
在更特異的實施方案中，上述試劑盒的檢測方法包括一固體支持物，所述多肽抗原附著於其。這種試劑盒還可包括非附著的報導分子標記的抗人抗體。在此實施方案中，抗體與多肽抗原的結合可通過所述報導分子標記的抗體的結合而檢測。
在另一實施方案中，本發明包括用於篩選血清的診斷試劑盒，該血清含有本發明多肽的抗原。此診斷試劑盒包括基本分離的與多肽或多核苷酸抗原特異性免疫反應的抗體，和檢測多核苷酸或多肽抗原與抗體結合的方法。在一實施方案中，抗體附著於固體支持物。在一特異的實施方案中，抗體可以是單克隆抗體。試劑盒的檢測方法可包括另一種標記的單克隆抗體。或者，或另外，檢測方法可包括標記的競爭抗原。
在一診斷性構型中，測試血清與通過本發明方法獲得的表面結合抗原的固相試劑反應。在特異性抗原抗體與試劑結合，並通過衝洗除去未結合的血清成分後，試劑與報導分子標記的抗人抗體反應，報導分子與試劑的結合與固體支持物上結合的抗抗原抗體的數量成比例。將此試劑再次衝洗以除去未結合的標記的抗體，並確定與試劑相關的報導分子數量。典型地，報導分子是一種酶，其可通過在存在適當的螢光性，發光性或比色底物的情況下，溫育此固相支持物而檢測(Sigma，St.Louis，MO)。
上述分析中的固體表面試劑，是通過將蛋白質附著於固體支持物的已知方法製備的，固體支持物如聚合物珠，96孔平板或濾膜。這些附著方法一般包括將蛋白質非特異性吸附於支持物，或通過游離氨基將蛋白質共價附著於固體支持物上的化學反應基團，如活化的羧基，羥基，或醛基。或者，可使用鏈親和素包被的平板與生物素醯化的抗原。
因此，本發明提供了進行這種診斷方法的分析系統或試劑盒。此試劑盒通常包括具有表面結合重組抗原的支持物，和報導分子標記的抗人抗體，以檢測表面結合的抗抗原抗體。
多核苷酸包含本發明多核苷酸的分離的核酸分子包括血小板衍生生長因子A(PDGF-A)，如歐洲專利EP-682110(SEQ ID NO1)所揭示；血小板衍生生長因子B(PDGF-B)，如歐洲專利EP-282317(SEQ ID NO3)所揭示；胎盤生長因子(PlGF)，如國際出版物WO 92/06194(SEQ ID NO5)所揭示；胎盤生長因子-2(PlGF-2)，如Hauser等，生長因子4259-268(1993)(SEQ ID NO7)所揭示；膠質瘤衍生生長因子(GDGF)，如歐洲專利EP-399816(SEQID NO9)所揭示；血管內皮生長因子(VEGF)，如國際出版物WO90/13649(SEQ ID NO11)所揭示；血管內皮生長因子-A(VEGF-A)，如歐洲專利EP-506477(SEQ ID NO13)所揭示；血管內皮生長因子-2(VEGF-2)，如國際出版物WO96/39515(SEQ IDNO15)所揭示；血管內皮生長因子-3(VEGF-3)，如國際出版物WO96/39421(SEQ ID NO17)所揭示；血管內皮生長因子-D(VEGF-D)，如國際出版物WO98/07832(SEQ ID NO19)所揭示；血管內皮生長因子-D1(VEGF-D1)，如國際出版物WO98/02543(SEQ ID NO21)所揭示；和血管內皮生長因子-E(VEGF-E)，如德國專利DE 19639601(SEQ ID NO23)所揭示。以上所提及的文獻均以全文併入參考。
本發明的血管生成蛋白均是結構相關的。尤為重要的是在VEGF/PDGF家族的所有成員中，所有8個半胱氨酸殘基均是保守的(見圖3A-3C的方框區域)。另外，PDGF/VEGF家族的特徵，PXCVXXXRCXGCC(SEQ ID NO29)，在本文所揭示的所有血管生成蛋白中均是保守的(見圖3A-3C)。
本發明的血管生成多肽包括全長多肽和多核苷酸序列，多核苷酸序列編碼全長多肽的任何前導序列和活性片段。
本發明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，DNA包括cDNA，基因組DNA，和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈的，可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼成熟多肽的編碼序列可以與表1的核苷酸序列的編碼序列相同，或者可以是不同的編碼序列，是由編碼與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23的DNA相同的成熟多肽的遺傳密碼豐餘或簡併產生的。
編碼圖3A-3C的代表性成熟多肽的多核苷酸可包括只是代表性成熟多肽的編碼序列；代表性成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導或分泌序列或前蛋白序列；代表性成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)及非編碼序列，如內含子或成熟多肽編碼序列的5』和/或3』非編碼序列。
因此，術語「編碼多肽的多核苷酸」涵蓋了只包括多肽編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變體，其編碼具有圖3A-3C推導的胺基酸序列的多肽的片段，類似物和衍生物。多核苷酸可以是天然發生的多核苷酸的等位基因變體，或非天然發生的多核苷酸。
因此，本發明包括編碼與圖3A-3C所示相同的代表性成熟多肽的多核苷酸，以及這種多核苷酸的變體，此變體編碼圖3A-3C所示多肽的片段，衍生物或類似物。這種核苷酸變體包括缺失變體，取代變體，和添加或插入變體。
如上所述，多核苷酸可具有一種編碼序列，該序列是SEQ IDNO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23編碼序列的天然發生的等位基因變體。如本領域所知，等位基因變體是多核苷酸序列的另一種形式，其具有一或多個核苷酸取代，缺失或添加，但基本不改變所編碼的多肽的功能。
本發明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可融合於多核苷酸的相同讀框，有助於在宿主細胞表達和分泌多肽，例如，前導序列作為分泌序列以控制多肽轉運至細胞。具有前導序列的多肽是一種前蛋白，並可具有由宿主細胞裂解的前導序列，以形成多肽的成熟形式。此多核苷酸還可編碼是成熟蛋白加上另外的5』胺基酸殘基組成的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一蛋白原，且是失活形式的蛋白質。一旦序列原裂解，保留活性成熟蛋白。
因此，例如本發明的多核苷酸可編碼成熟蛋白，編碼具有序列原的蛋白質，或編碼具有序列原和前序列(前導序列)的蛋白質。
本發明的多核苷酸也可具有融合於標記序列框中的編碼序列，以純化本發明的多肽。標記序列可以是由PQE-9載體提供的6組氨酸標記，以在細菌宿主的情況中純化融合於標記的成熟多肽，或者例如當使用哺乳動物宿主如COS-7細胞時，標記序列可以是血凝素(HA)標記。HA標記相當於衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson.，I.等，細胞37767(1984))。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO2所示大約1-211位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO4所示大約1-241位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO6所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO6所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO6所示大約1-149位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO8所示大約1-170位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO10所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO10所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO10所示大約1-190位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO12所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO12所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO12所示大約1-191位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO14所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO14所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO14所示大約1-214位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO16所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO16所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO16所示大約1-419位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有由ATCC保藏號97149的cDNA克隆編碼的胺基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼具有ATCC保藏號97149的cDNA克隆編碼的胺基酸序列的成熟VEGF2多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有ATCC保藏號97149的cDNA克隆編碼的胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；或(g)互補於(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO18所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO18所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO18所示大約1-207位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO20所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO20所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO20所示大約1-325位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO22所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO22所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO22所示大約1-354位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發明的其它實施例方案包括分離的核酸分子，其包括具有與以下序列有至少95％，優選至少96％，97％，98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO24所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO24所示胺基酸序列，但缺失N末端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO24所示大約1-132位氨酸序列的多肽的核苷酸序列；或(d)互補於(a)，(b)或(c)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。
具有與編碼血管生成多肽的參照核苷酸序列有例如至少95％「相同性」的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，除了此多核苷酸可包括編碼血管生成多肽的參照核苷酸序列的每100個核苷酸有5個點突變。換而言之，為獲得含有與參照核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中5％的核苷酸可缺失或用另外核苷酸取代，或者可將佔參照序列中總核苷酸數5％的核苷酸插入參照序列中。參照序列的這些突變可發生在參照核苷酸序列的5』或3』末端，或這些末端之間的任一之處，單獨分散於參照序列的核苷酸之間，或以一或多個連續基因存在於參照序列間。
實際上，任何特殊核酸分子是否至少95％、96％、97％，98％或99％與例如SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核苷酸序列相同，可用已知電腦程式常規確定，例如Bestfit程序(Wisconsin序列分析程序，Version8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源序列對比(Advances in Applied Mathematies 2482-489(1981))，發現二個序列間的最佳同源節段。當使用Bestfit或任何其它序列對比程序，以確定特殊序列是否與本發明的參照序列例如有95％相同性時，當然要設定參數，這樣在全長參照核苷酸序列之上計算相同性百分率，並允許有佔參照序列總核苷酸數5％的同源缺口。
血管生成「多核苷酸」還包括那結能在嚴格雜交條件下，與SEQID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示序列，或例如ATCC保藏號97149或75698的cDNA克隆所含序列，或其互補序列雜交的多核苷酸。「嚴格雜交條件」指在42℃，在包含50％甲醯胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5x Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20μg/ml變性的剪切的鮭精DNA的溶液中溫育過夜，隨後用0.1×SSC在65℃衝洗濾膜。
核酸分子也可在較低嚴格雜交條件下與血管生成多核苷酸雜交。雜交嚴格性和信號檢測中的變化，可通過人為操縱甲醯胺濃度(甲醯胺百分率低導致較低嚴格性)；鹽條件，或溫度而加以調節。例如，較低嚴格條件包括在37℃在含有6x SSPE(20×SSPE＝3MNaCl；0.2M Na2HPO4；0.02M EDTA，pH7.4)，0.5％SDS，30％甲醯胺，100μg/ml鮭精封阻DNA的溶液中溫育過夜；隨後在50℃用1×SSPE，0.1％SDS衝洗。另外，為達到更低嚴格性，可在嚴格雜交後用更高鹽濃度進行衝洗(如5×SSC)。
注意上述條件的變化可通過包含和/或用另一種封阻劑取代而達到，用於抑制雜交試驗中的背景水平。典型的封阻劑包括Denhardt’s試劑，BLOTTO，肝素，變性的鮭精DNA，和可商購的Proprietary配方。包含特異的封阻劑需要修改上述雜交條件，因為相容性的問題。
當然，只與聚A+序列(如序列表中所示cDNA的任何3』末端聚A+序列段)，或只與T(或U)殘基的互補序列雜交的多核苷酸，不包括在所述「多核苷酸」內，因為這種多核苷酸與含有聚A序列或其互補序列(如任何雙鏈cDNA克隆)的任何核酸分子均雜交。
與多核苷酸的「一部分」雜交的多核苷酸是指與參照的多核苷酸的至少大約15個，優選至少大約20個，更優選至少大約30個，最優選大約30-70個核苷酸雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些多核苷酸如上述用作診斷探針和引物，並在下文詳細闡述。
例如長度至少為20nt」的多核苷酸部分，是指參照多核苷酸的核苷酸序列(如表1的核苷酸序列)的20或更多個連續核苷酸。當然，只與聚A序列(如SEQ ID NOX的3』末端聚(A)段)，或只與T(或U)殘基的互補序列雜交的多核苷酸，不包括在本發明用於雜交本發明核酸一部分的多核苷酸內，因為這種多核苷酸與含有聚(A)序列或其互補序列的任何核酸分子均雜交(如任何雙鏈的cDNA基隆)。
然而，優選的是具有與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核苷酸序列，或與編碼具有血管生成蛋白活性的多肽的保藏的cDNA的核酸序列，有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的核酸分子。「具有血管生成活性的多肽」是指在特殊的生物學分析中呈血管生成活性的多肽。例如，血管生成蛋白活性可用例如促分裂原分析或內皮細胞遷移分析加以測定。見例如Olofsson等，美國科學院院報932576-2581(1996)和Joukovt，EMBO雜誌5290-298(1996)。「具有淋巴管生成活性的多肽」是指在特殊的生物學活性分析中呈淋巴管生成活性的多肽。例如，血管生成蛋白活性可例如促分裂原分析和內皮細胞遷移分析加以測定。見例如Olofsson等，美國科學院院報932576-2581(1996)和Joukov等，EMBO雜誌5290-298(1996)。
當然，由於遺傳密碼的簡併，本領域技術人員可立即意識到大量具有與保藏的cDNA的核酸序列或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示核酸序列，有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的核酸分子，將編碼「具有血管生成蛋白活性」的多肽。事實上，由於這些核苷酸序列的簡併變體均編碼相同多肽，對此技術人員不需進行上述對比分析就清楚。本領域另外意識到，不是簡併的這種核酸分子，有許多也編碼具有血管生成蛋白活性的多肽。這是因為本領域技術人員充分意識到胺基酸取代很少或幾乎不明顯影響蛋白質功能(如用一個脂肪族胺基酸置換另一個脂肪族胺基酸)。
例如，關於怎樣產生表型沉默胺基酸取代見Bowie，J.U.等「譯解蛋白質序列中信息對胺基酸取代的耐受性」，科學2471304-1310(1990)所述，其中作者指明蛋白質非常耐受胺基酸取代。
因此，本發明涉及一種多核苷酸，其與編碼SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24所示多肽的多核苷酸，有至少70％，優選至少90％，更優選至少95％，96％，97％或98％相同性，本發明還小及這種多核苷酸的片段，該片段具有至少30個優選至少50個鹼基，另外本發明還涉及由這種多核苷酸編碼的多肽。
「相同性」具有本領域所公認的含義並可用公布的方法計算(見例如(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lest，A.M.ed.，牛津大學出版社，紐約(1988)；BIOCOMPUTINGINFORMATICSAND GENOME PROJECTS，Smith，D.W.，ed.，科學出版社，紐約(1993)；COMPUTE ANALYSIS OF SEQVENCE DATA，PARTI，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編輯，Humana出版社，新澤西(1994)；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，科學出版社(1987)；和SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M.和Devereux J.編輯，M Stockton出版社，紐約(1991))。這呈現了許多測定兩個多核苷酸或多肽序列間相同性的方法，術語「相同性「為本領域技術人員所熟知(Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAMJ.Applied Math.481073(1988))。通常使用的測定兩序列間相同性或相似性的方法包括但非限於「Guide to Huge Computers」，MartinJ.Bishop編輯，科學出版社，San Diego(1994)，和Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAM J.Applied Math.481074(1988)。對比多核苷酸或多肽序列的電腦程式包括GCG程序包(Devereux，J.，等，核酸研究12(1)287(1984))，BLASTD，BLASTN，FASTA(Atschul，S.F.等，分子生物學雜誌215403(1990))，Bestfit程序(Wisconsin序列分析程序包，VERSRON8 FOR Unix.Genetics Computer Group.UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison)，WI 53711(使用Smith和Waterman的局部同源序列對比，應用數學進展2482-489(1981))。具有與本發明參照核苷酸序列有例如至少95％「相同性」的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，除了其包核苷酸序列相對於編碼血管生成多肽的參照核苷酸序列的每100個核苷酸中最多有5個點突變。換而言之，為獲得具有與參照核苷酸序列有至少95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，參照序列中最多5％的核苷酸可缺失或用另外的核苷酸取代，或者佔參照序列總核苷酸數最多5％的核苷酸可插入參照序列中。參比序列可以是SEQ ID NO1，3，4，7，9，11，13，15，17，19，21或23的完整序列，ORF(開放讀框)，或本文所述的任何片段。
實際上，任何特殊的核酸分子或多肽是否與本發明的核苷酸序列有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，可通過已知電腦程式常規確定。確定參比序列(本發明序列)與目標序列之間的是佳完全匹配的方法，也稱總體序列對比，優選使用基於Brutlag等的序列對比方法的FASTDB電腦程式(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))。在序列對比中，參比序列與目標序列均是DNA序列。RNA序列可通過將U’s轉換為T’s加以對比。所述總體序列對比的結果是相同性百分率。DNA序列的FASTDB序列對比中所用的計算相同性百分率的參數優選是Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization GroupLength＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window S ize＝500或目標核苷酸序列長度，無論哪個更短。
如果因為5』或3』缺失而非內部缺失導致目標序列比參比序列短，要進行手工校正，因為FASTDB程序當計算相同性百分比時不計算目標序列的5』和3』的短缺。對於目標序列相對於查詢序列5』和3』端的短缺，百分比性的校正是通過計算不匹配的位於目標序列5』或3』端的參比序列的鹼基數，以作為參比序列總鹼基數的百分比。通過FASTDB序列對比的結果來確定一個核苷酸是否匹配。然後將此百分數從相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比結果。此校正的結果可用於本發明。FASTDB序列對比中所顯示出的，只有在目標序列5』或3』端外側的鹼基，它們不與參比序列匹配，才用於計算以手工調節百分比相同性結果。例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列對比以確定相同性百分比。缺失發生於目標序列的5』末端。因此FASTDB比對不顯示出5』端前10個鹼基的匹配。這10個不匹配的鹼基相當於序列的10％(5』或3』端不匹配的鹼基數/參比序列中的鹼基總數)，因而從FASTDB程序計算的相同性百分比中減去這10％。如果剩餘的90個鹼基都完全匹配，那麼最終的相同性百分比就是90％。再例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列相比較，這時缺的的是內部的核苷酸，因而目標序列的5』或3』端鹼基沒有與參比序列不匹配的。在這種情況下，FASTDB程序計算的相同性百分比不需手工校正。再強調一次，只有目的序列的5』或3』端鹼基與參比序列不匹配時才需要手工校正。對於本發明不需要進行其它的手工校正。
對於一個多肽，其所含的胺基酸序列與本發明的參比胺基酸序列具有例如至少95％「相同性」是指，除了相對於參比胺基酸序列的每100個胺基酸，該目標多肽序列可包含最多5個胺基酸改變這外，該目標多肽的基酸序列與參比序列相同。換言之，為獲得具有與參比胺基酸序列至少95％相同性的胺基酸序列的多肽，在目標序列中最多5％的胺基酸殘基可插入，缺失或用另外胺基酸取代。這些參照序列上的變化可發生在參照胺基酸序列的胺基酸端或羧基端，或位於末端之間的任何位置，可以是在參照序列的殘基間各自分散的，或在參照序列上呈連續的一組或多組。
實際上，任一特定的多肽與例如表1所示的胺基酸序列，或保藏的DNA克隆編碼的胺基酸序列是否具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性，可以方便地利用已知的電腦程式確定。測定參比序列(本發明的序列)與目標序列間最佳匹配的方法，也稱為總體序列對比，可優選使用基於Brutlag等的序列對比方法的FASTDB電腦程式確定(Comp.App.Biosci.(1990)6237-245)。在序列對比中參比序列和目標序列均是核苷酸序列或均是胺基酸序列。所述總體序列對比的結果是相同性百分率。用於FASTDB胺基酸序列對比中的參數優選為Matrix＝PAM 0)k-tuple＝2，MismatchPenalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，CutoffScore＝1，Window Size＝序列長度，Gap Penalty＝5，Gap SizePenalty＝0.05，Window Size＝500或目標胺基酸序列長度，無論哪個更短。
如果因為N或C缺失而非內部缺失導致目標序列比參比序列短，要進行手工校正，因為FASTDB程序當計算相同性百分比時不計算目標序列的N和C的短缺。對於目標序列相對於查詢序列N和C端的短缺，百分比性的校正是通過計算不匹配的位於目標序列N或C端的參比序列的鹼基數，以作為參比序列總鹼基數的百分比。通過FASTDB序列對比的結果來確定一個核苷酸是否匹配。然後將此百分數從相同性百分比中減去，從而獲得最終的相同性百分比結果。此校正的結果可用於本發明。FASTDB序列對比中所顯示出的，只有在目標序列N或C端外側的鹼基，它們不與參比序列匹配，才用於計算以手工調節百分比相同性結果。例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列對比以確定相同性百分比。缺失發生於目標序列的C末端。因此FASTDB比對不顯示出C，端前10個鹼基的匹配。這10個不匹配的鹼基相當於序列的10％(N或C端不匹配的鹼基數/參比序列中的鹼基總數)，因而從FASTDB程序計算的相同性百分比中減去這10％。如果剩餘的90個鹼基都完全匹配，那麼最終的相同性百分比就是90％。再例如，一個90個鹼基的目標序列與一個100個鹼基的參比序列相比較，這時缺的的是內部的核苷酸，因而目標序列的N或C端鹼基沒有與參比序列不匹配的。在這種情況下，FASTDB程序計算的相同性百分比不需手工校正。再強調一次，只有目的序列N或C端鹼基與參比序列不匹配時才需要手工校正。對於本發明不需要進行其它的手工校正。
血管生成多肽本發明還涉及具有圖3A-3C推導的胺基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段，類似物和衍生物。
在本發明中，「多肽片段」是指包含於SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24中，或由保藏的克隆中cDNA編碼的短基酸。蛋白質片段可以是「free stanging」，或包含於較大片段中，其片段形成一部分或區域，優選一個單獨的連續區域。本發明多肽片段代表性例如包括1-20，21-40，41-60，61-80，81-100，102-120，121-140，141-160，161-180，181-200，201-220，221-240，241-260，261-280或281-編碼區末端的胺基酸組成的片段。另外，多肽片段長度可以是大約20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150個胺基酸。在文中「大約」包括在一端或兩端可多或少12個(5，4，3，2或1)個胺基酸的特定範圍(見表1)。
血管生成蛋白表1
優選的多肽片段包括分泌的血管生成蛋白以及其成熟形式。另外優選的多肽片段包括分泌的血管生成蛋白或其成熟形式，其氨基端或羧基端或這兩端均連續缺失殘基。例如分泌的血管生成蛋白多肽或成熟形式的氨基端可缺失1-60個範圍內的任何數目的胺基酸。相似地，分泌的血管生成蛋白多肽或成熟形式的羧基端可缺失1-40個範圍內的任何數目的胺基酸。另外，優選以上氨基和羧基端缺失的任意組合。相似地，編碼這些血管生成多肽片段的多核苷酸片段也是優選的。
特徵在於結構或功能結構域的血管生成多肽和多核苷酸片段也是優選的，如包含α-螺旋和α-螺旋形成區，β-摺疊和β-摺疊形成區，轉角區和轉角形成區，捲曲和捲曲形成區，親水區，疏水區，α兩親區，β兩親區，柔性區，表面形成區，底物結合區，和高抗原指數區。在保守的結構域內的SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的多肽片段是本發明特別期望的。(見圖3A-3C)。另外，表面這些結構域的多核苷酸片段也是期望的。
其它優選的片段是生物活性的血管生成蛋白片段。生物活性片段是那些與揭示的血管生成多肽之一活性相似，但不必相同的片段。片段的生物活性可包括改良所需活性，或降低非所需活性。
本發明的多肽可以是重組多肽，天然多肽，或合成多肽，優選重組多肽。
本領域意識到血管生成多肽的一些胺基酸序列可以發生變化，但不明顯影響蛋白質的結構或功能。如果序列中的這種差異是期望的，應記得這是蛋白質上確定活性的關鍵部位。
因此，本發明還包括血管生成多肽的變體，其呈現血管生成多肽的基本活性，或包括血管生成多肽如下所述蛋白質部分的區域。這種突變包括缺失，插入，轉換，重複和類型取代。如上所述，關於胺基酸變化可以是表型沉默取代的文獻參見Bowie，J.U.等，「譯解蛋白質序列中的信息耐受胺基酸取代」，科學2471306-1310(1990)。
因此，表1的多肽的片段，衍生物，或類似物可以是(i)其中一或多個胺基酸殘基被保守的或非保守的胺基酸殘基(優選保守的胺基酸殘基)取代，這種取代的胺基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的；或(ii)其中一或多個胺基酸殘基包括取代基；或)iii)其中成熟多肽融合於另一種化合物，如提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的胺基酸融合於成熟多肽，如前導序列或分泌序列或用於純化成熟多肽的序列或蛋白原序列；或(v)其中包含少量SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示胺基酸殘基，及保留保守的基序，並還保留VEGF/PDGF多肽家族的活性特點。根據本發明教導，這種片段，衍生物和類似物包括在本領域技術範圍內。
特別感興趣的是用另一種荷電的胺基酸及用中性或陰性荷電的胺基酸前導荷電的胺基酸。後者導致蛋白質帶還原的陽性電荷，以改良血管生成蛋白的特性。特別需要防止聚集反應。蛋白質的聚集不僅導致活性喪失，當製備藥物配方時也是問題，因為它們可以是免疫原性的。(Pinckard等，免疫學臨床試驗233l-340(1967)；Robbins等，糖尿病36838-845(1987)；Cleland等，治療性藥物載體系統評價10307-377(1993))。
胺基酸置換也可改變與細胞表面受體結合的選擇性。Ostade等，自然361266-268(1993)闡述了一些突變導致TNF-α只與兩種已知的TNF受體之一選擇性結合。因此，本發明的血管生成蛋白可包括一或多個胺基酸取代，缺失或添加，自然突變或人為操作。
如上所述，變化優選是最自然的，如保守胺基酸取代，其不明顯影響蛋白質的摺疊或活性(見表2)。
表2保守胺基酸取代
當然，技術人員可根據許多因素包括上述那些因素確定胺基酸取代的數目。一般來講，給定的任何血管生成多肽的取代數目不超過50，40，30，25，20，15，10，5或3個。
本發明血管生成蛋白中的基本功能性胺基酸，可通過本領域已知方法鑑別，如位點直接誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989))。後一方法介紹了在分子的每個殘基進行單一丙氨酸突變。然後測試所得突變分子的生物活性如受體結合或在體外或體內增殖活性。配體—受體結合的關鍵位點也可通過結構分析確定，如結晶，核磁共振或光親和標記(Smith等，分子生物學雜誌224899-904(1992)和Vos等，科學255306-312(1992))。
本發明的多肽和多核苷酸優選以分離形式提供，並優選純化為均質。
術語「分離的」是指從其原始環境中(如其天然發生的環境)獲得的物質。例如，存活動物中天然發生的多核苷酸或多肽不是分離的，但分離自自然系統中一些或所有共存物的相同多核苷酸或DNA或多肽，是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，並在這種載體或組合物不是其一部分的天然環境中仍是分離的。
在特異的實施方案中，本發明的多核苷酸長度少於300，200，100，50，15，10或7.5kb。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸包含所揭示的血管生成蛋白的編碼序列的至少15個連續核苷酸，但不包含特定血管生成蛋白的所有或部分內含子。在另一實施方案中，包含特定血管生成蛋白編碼序列的核酸，不包含基因組側翼基因的編碼序列(即基因組中特定血管生成蛋白基因的5』或3』序列)。
本發明的多肽包括SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示多肽(尤其其成熟形式多肽)，以及與SEQ IDNO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24所示多肽有至少70％相似性(優選至少70％相同性)，優選有至少90％相似性(優選至少95％相同性)，更優選有至少95％相似性(優選至少90％相同性)的多肽，並還包括這種多肽的一部分，多肽的這一部分通常含有至少30個胺基酸，更優選含有至少50個胺基酸。
如本領域已知，兩個多肽之間的「相似性」是通過將一個多肽的胺基酸序列及其保守的胺基酸取代與另一多肽的序列相對比取代的。
本發明多肽的片段或一部分可通過肽合成生產相應的全長多肽；因此，可將此片段用作生產全長多肽的中間物。本發明多核苷酸的片段或一部分可用於合成本發明全長多核苷酸。氨基端和羧基端缺失另外，可應用蛋白質基因工程改良或改變天然血管生成蛋白的一或多種彈特性。羧基端胺基酸的缺失可增強蛋白質的活性。一個例子是γ-幹擾素，通過蛋白質的羧基端缺失10個胺基酸，顯示出活性提高將近10倍。(Dobeli等，生物技術學雜誌7199-216(1988))。因此，本發明的一個方面是提供血管生成蛋白的多肽類似物，和編碼類似物的核苷酸序列，這種類似物與天然血管生成蛋白相比穩定性增強(例如，當暴露於典型的pH，熱度條件或其它貯存條件時，穩定性增強)。
本發明還包括N或C末端均缺失胺基酸的缺失突變體。這種突變體包括下述形式的N末端缺失突變體和C末端缺失突變體的所有組合。這些組合可用本領域已知的重組方法成產生。
特別地，血管生成蛋白的N末端缺失可以以下通式闡述1)m2-211，其中m2是1-210之間的任一整數，其中m2相當於SEQ ID NO2中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n2闡述，其中n2是2-211之間的任一整數，n2相當於SEQ IDNO2中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m2-n2殘基，其中n2和m2是如上述的整數。
2)m4-241，其中m4是1-240之間的任一整數，其中m4相當於SEQ ID NO4中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n4闡述，其中n4是2-241之間的任一整數，n4相當於SEQ IDNO4中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m4-n4殘基，其中n4和m4是如上述的整數。
3)m6-149，其中m6是1-148之間的任一整數，其中m6相當於SEQ ID NO6中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n6闡述，其中n6是2-149之間的任一整數，n6相當於SEQID NO6中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m6-n6殘基，其中n6和m6是如上述的整數。
4)m8-170，其中m8是1-169之間的任一整數，其中m8相當於SEQ ID NO8中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n8闡述，其中n8是2-170之間的任一整數，n8相當於SEQ ID NO8中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m8-n8殘基，其中n8和m8是如上述的整數。
5)m10-190，其中m10是1-189之間的任一整數，其中m10相當於SEQ ID NO10中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n10闡述，其中n10是2-190之間的任一整數，n10相當於SEQ ID NO10中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m10-n10殘基，其中n10和m10是如上述的整數。
6)m12-191，其中m12是1-190之間的任一整數，其中m12相當於SEQ ID NO12中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n12闡述，其中n12是2-191之間的任一整數，n12相當於SEQ ID NO12中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m12-n12殘基，其中n12和m12是如上述的整數。
7)m14-214，其中m14是1-213之間的任一整數，其中m14相當於SEQ ID NO14中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n14闡述，其中n14是2-214之間的任一整數，n14相當於SEQ ID NO14中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m14-n14殘基，其中n14和m14是如上述的整數。
8)m16-419，其中m16是1-418之間的任一整數，其中m16相當於SEQ ID NO16中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n16闡述，其中n16是2-419之間的任一整數，n16相當於SEQ ID NO16中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m16-n16殘基，其中n16和m16是如上述的整數。
特別優選的是包含SEQ ID NO16的F32-R226胺基酸殘基的多肽片段，以及編碼這種多肽的多核苷酸。同樣，另一優選的實施方案包含SEQ ID NO16的S228-S419胺基酸。編碼這些多肽的多核苷酸也是優選的。另外，SEQ ID NO16多肽的F32-R226優選與SEQ ID NO16多肽的S228-S419締合。可通過二硫鍵，共價或非共價相互作用，通過接頭連接(如絲氨酸，甘氨酸，脯氨酸連接)，或通過抗體進行締合。
9)m18-207，其中m18是1-206之間的任一整數，其中m18相當於SEQ ID NO18中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n18闡述，其中n18是2-207之間的任一整數，n18相當於SEQ ID NO18中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m18-n18殘基，其中n18和m18是如上述的整數。
10)m20-325，其中m20是1-324之間的任一整數，其中m20相當於SEQ ID NO20中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n20闡述，其中n20是2-325之間的任一整數，n20相當於SEQ ID NO20中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m20-n20殘基，其中n20和m20是如上述的整數。
11)m22-354，其中m22是1-353之間的任一整數，其中m22相當於SEQ ID NO22中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n22闡述，其中n22是2-354之間的任一整數，n22相當於SEQ ID NO22中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m22-n22殘基，其中n22和m22是如上述的整數。
12)m24-132，其中m24是1-131之間的任一整數，其中m24相當於SEQ ID NO24中鑑別的胺基酸位置。另外，C末端缺失也可以通式1-n24闡述，其中n24是2-132之間的任一整數，n24相當於SEQ ID NO24中鑑別的胺基酸位置。另外，本發明還提供了氨基端和羧基端均缺失一或多個胺基酸的多肽，其通常闡述為具有m24-n24殘基，其中n24和m24是如上述的整數。
本發明另一方面包括N末端和C末端均缺失胺基酸的缺失突變體。這種突變體包括上述N末端突變體和C末端突變體的所有組合。
本發明的另一方面，揭示的血管生成多肽的突變體用作篩選劑，以檢測血管生成活性的激動劑和/或拮抗劑，或者，將其修飾用作揭示的血管生成多肽的血管生成活性的激動劑和/或拮抗劑，或者可與其它製劑聯合應用，如與特異於揭示的血管生成多肽的單克隆抗體聯合應用，例如結果可以是揭示的血管生成多肽的血管生成活性的激動劑和/或拮抗劑。
本發明的另一方面，可產生其它參考的和揭示的本發明血管生成多肽，SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，或24的片段，以產生可用作激動劑和/或拮抗劑的突變體，調節揭示的血管生成多肽的活性。另外，這些多肽突變體可與其它製劑聯合應用，如特異於揭示的血管生成多肽的單克隆抗體聯合應用，例如增強或降低特異的所需活性。
術語「基因」是指涉及多肽鏈產生的DNA片段；它包括在編碼區之前和之後的區域(前導和加尾區)以及各個編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
本發明進一步是指分離的本文所述的核酸分子片段。一個分離的具有如SEQ ID NO1或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21或23所示的核苷酸序列的核酸分子片段，應當至少15nt的片段，並且優選的是長度至少約20nt，更為優選的為至少約30nt，再更為優選的為約40nt，它可用作本文所述的診斷探針和引物。當然也可以根據本發明使用更大的、與大多數，如非全部的如SEQ IDNO1或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23所示的核苷酸序列相應的50，75，100，125，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1025，1050，1075，1100，1125，1150，1175，1200，1225，1250，1275，1300，1325，1350，1375，1400，1425，1475，1500，1525，1550，1575，1600，1625，或者1650nt長度的片段。例如，一個長度為至少20nt的片段，是指包括有來自如SEQ ID NO1或SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，或23所示的核苷酸序列的20個或者更多個連續鹼基的片段。
文中的「大約的」包括該特別提到的範圍、在一端或者兩端再大幾個或小几個(5，4，3，2，或1個)核苷酸。優選地，這些片段編碼具有生物學活性的多肽。
本發明全長基因的片段可用作cDNA文庫的雜交探針，以分離全長cDNA及分離其它與此基因具有高度序列相似性或相似生物活性的cDNA。這類探針優選具有至少30個鹼基，並可含有例如50或更多個鹼基。此探針還可用於鑑別相當於全長轉錄物的cDNA克隆和基因組克隆或含有完整基因的克隆，所述完整基因包括調節區，啟動子區，外顯子，和內含子。篩選例如包括通過使用已知DNA序列分離基因的編碼區，以合成寡核苷酸探針。具有互補於本發明基因的序列的標記的寡核苷酸，用於篩選人類cDNA，基因組DNA或mRNA的文庫，以取代探針與文庫的哪個成員雜交。融合蛋白任何揭示的血管生成多肽都可以用於產生融合蛋白。例如，血管生成多肽在與第二個蛋白融合時，可以用作抗原性標籤。針對該血管生成多肽產生的抗體可以通過與血管生成的結合用於對第二個蛋白間接檢測。而且，由於分泌蛋白根據轉運信號來進行細胞定位，所以血管生成多肽一旦與其他蛋白相融合就可以用作為靶向性分子。
可以與血管生成多肽融合的結構域的實例不僅包括異源性信號序列，還包括其他異源性功能區域。融合不一定必須是直接的，也可以通過接頭序列來實現。
而且，融合蛋白也可以通過操作而改進一或多種血管生成多肽的特性。例如，可以將添加的胺基酸區域，尤其是帶電荷的胺基酸，加到血管生成多肽N末端，從而在從宿主細胞中純化或者後續的操作和儲藏過程中提高其穩定性和持續性。另外，可以將肽半族添加到揭示的血管生成多肽上以利於純化。該區域可以在特定的血管生成多肽的最終製備之前去除。添加肽半族以利於多肽的操作是本領域中熟知的常規性技術。
而且，揭示的血管生成多肽，包括片段，和特異表位可以與免疫球蛋白(IgG)的部分恆定區域相結合，形成嵌合多肽。這些融合蛋白有利於純化並在體內顯示出延長了半衰期。一個已報導的實例描述了一種嵌合蛋白，它由人CD4多肽的前兩個區域和哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈上恆定區的不同結構域組成。(EPA 394，827；Traunecker等，自然，33184-86(1988))。含有二硫鍵連接的二聚體結構的融合蛋白(由於IgG)還可在結合和中和其他分子的過程中比單體的分泌蛋白或單獨的蛋白片段更為有效。(Fountoulakis等，生物化學雜誌，2703958-3964(1995)。
類似地，EP-A-0 464 533(Canadian counterpart 2045869)公開了含有免疫球蛋白分子的恆定區的不同部分育齡一個人蛋白或其部分一起所構成的融合蛋白。在多數情況下，融合蛋白的Fc部分對治療和診斷有利，因而可以，例如，改進遺傳藥理學特性。(EP-A 0232 262.)也可能需要對表達、檢測和純化後的融合蛋白去除Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能會阻礙治療和診斷。在藥物開發中，例如，人蛋白如hIL-5，曾與Fc部分融合，為的是進行高效率的掃描試驗以鑑定hIL-5的拮抗劑。(見D.Bennett等，分子識別雜誌，552-58(1995)；K.Johanson等，生物化學雜誌，2709459-9471(1995)。
而且，揭示的血管生成多肽可以與標記序列相融合，如有利於純化特定的血管生成多肽的肽。在優選的實施方案中，標記的胺基酸序列是一個六個組氨酸的肽，如pOE載體(QIAGEN，Inc.，9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)上所提供的標籤，等等，其中很多都可以商業購得。正如Gentz等，美國科學院研究進展，56821-824(1989)中所述，例如，六個組氨酸提供了對該融合蛋白的純化提供了方便。另一個用於純化的肽標籤是「HA」標籤，它相應於來自流感紅血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等，細胞，37767(1984)。
因此，可以用揭示的血管生成多核苷酸或多肽操作產生上述的任何融合形式。載體和宿主細胞本發明還涉及含有編碼揭示的血管生成蛋白的多核苷酸的載體、宿主細胞，以及應用重組技術，生產多肽的方法。載體例如可以是噬菌體，質粒，病毒，或逆轉錄病毒載體等。逆轉錄病毒可以是有複製能力的或是複製缺陷的。在後一情況中，病毒增殖通常只發生在補體宿主細胞中。
編碼揭示的血管生成蛋白的多核苷酸可與含有可選擇標記的載體連接，以在宿主中增殖。通常地，將質粒載體導入沉澱物中，如磷酸鈣沉澱，或與荷電脂質複合。如果載體是病毒，可將其在體外用適當的包裝細胞系包裝，然後轉導入宿主細胞中。
編碼揭示的血管生成蛋白的多核苷酸插入體應可操縱地連於適當的啟動子，如噬菌體λPL啟動子，大腸桿菌lac，trp，phoA，和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子，及逆轉錄病毒LTRs的啟動子等。本領域技術人員已知其它適當的啟動子。此表達構建體還含有轉錄起始，終止位點，和轉錄區內的核糖體結合位點以進行翻譯。由此構建體表達的轉錄物的編碼部分，優選包括在密碼子(UAA，UGA或UAG)的起端和末端的翻譯起始密碼子，密碼子(UAA，UGA或UAG)適當的位於翻譯多肽的末端。
如上所述，表達載體優選包括至少一個可選擇標記。這種標記包括用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶(DHFR)，G418或新黴素抗性基因，以及用於大腸桿菌或其他細菌培養的四環素，卡那黴素或氨苄青黴素抗性基因。適當的宿主例如包括但非限於細菌細胞，如大腸桿菌，鏈黴菌，和沙門氏菌typhimurium細胞；真菌細胞如酵母細胞；昆蟲細胞如果蠅S2，和Spodoptera Sf9細胞；動物細胞如CHO，COS，293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。本領域已知上述宿主細胞的適當培養基和培養條件。
在細菌中使用的優選載體包括得自QIAGEN公司的pQE70，pQE60和pQE-9；得自Stratagene克隆系統公司的pBluescript載體，Phagescript載體，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；和得自Pharmacia生物技術公司的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。優選的真核載體包括得自Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；和得自Pharmacia公司的pSVK3，Pbpv，pMSG和pSVL。本領域技術人員也易於知道其它適當載體。
將構建體導入宿主細胞可通過磷酸鈣轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，陽離子脂質介導的轉染，電穿孔，轉導，感染或其它方法進行。這種方法在許多標準實驗指導中均有闡述，見例如Davis等，分子生物學基本方法(1986)。特別期望的是揭示的血管生成多肽事實上可由無重組載體的宿主細胞表達。
通過已知方法可從重組細胞培養物中回收及純化揭示的血管生成多肽，包括硫酸銨或乙醇沉澱，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和凝集素層析。優選利用高效液相層析(HPLC)進行純化。
揭示的血管生成多肽，優選分泌形式的多肽，也可回收自純化自天然原料包括體液，組織和細胞的產物，無論是直接分離的還是培養的；化合產物；通過重組技術從原核或真核宿主中產生的產物，所述宿主包括例如細菌，酵母，高等植物，昆蟲，和哺乳動物細胞。根據重組技術中所用的宿主，揭示的血管生成多肽可以是或不是糖基化的。另外，揭示的血管生成多肽還可包括一個初始修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況下，是宿主介導的加工結果。因此，本領域熟知由翻譯起始密碼子編碼的N末端甲硫氨酸，通常在所有真核細胞中翻譯後從任何蛋白質中高效除去。在大多數蛋白質上的N末端甲硫氨酸也在大多數原核細胞中有效除去，對一些蛋白質而言，根據N末端甲硫氨酸共價連接的胺基酸的性質，這種從原核細胞除去甲硫氨酸的方法是無效的。
本發明除了涵蓋含有所述載體構建體的宿主細胞之外，還涵蓋了初級，二級，和無限增殖化的脊椎動物尤其哺乳動物宿主細胞，這種細胞已經工程化為缺失或置換內源性遺傳物質(例如血管生成蛋白編碼序列)，和/或工程化為包括遺傳物質(例如異源性多核苷酸序列)，該遺傳物質可操縱地與編碼本發明血管生成蛋白的多核苷酸締合，以激活，改變和/或擴增編碼血管生成蛋白的內源性多核苷酸。例如，可使用本領域已知的方法通過同源重組，將異源控制區(如啟動子和/或增強子)與編碼血管生成蛋白的內源性多核苷酸序列可操縱的締合(見例如1997年6月24日公布的美國專利No.5641670；1996年9月26日出版的國際出版物WO 96/29411；1994年8月4日出版的國際出版物WO94/12650；Koller等，美國科學院院報868932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342435-438(1989)，所述文獻以其全文併入參考)。
另外，本發明的多肽可用本領域已知的方法化學合成。(見例如Creighton，1983，蛋白質結構和分子原理，W.H.Freeman Co.，N.Y.和Hunkapiller，M.等，1984，自然310105-111)。例如，相當於本發明血管生成多肽的片段的肽，可使用肽合成儀合成。另外，如果需要，可以把非典型胺基酸或胺基酸的化學類似物作為替代物或附加物，引入編碼血管生成多肽的多核苷酸序列。不典型胺基酸包括，但不僅限於這些普通胺基酸的D型同分異構體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環己丙氨酸，b-丙氨酸，含氟胺基酸，含修飾基團的胺基酸，如b-甲基胺基酸，鈣-甲基胺基酸，鈉-甲基胺基酸，以及通常的胺基酸的類似物。再者，胺基酸既可以為D型(右旋)亦可以為L型(左旋)。
本發明所涉及的血管生成多肽，在翻譯或翻譯後可以進行修飾，如糖基化，醯基化，磷酸化，醯胺化，通過基團的保護或抑制而形成的衍生物，蛋白水解酶的裂解，與抗體分子或其它細胞配體的偶聯，等。許多化學修飾均可通過已知的技術方法來完成，包括以下方法(但不僅限於這些)溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，四氫硼化鈉(NaBH4)所引起的特異化學裂解；乙醯化，甲醯化，氧化，還原；衣黴素存在時所引起的代謝合成增加；等等。
本發明中也涉及到其他翻譯後的修飾，例如包括N-偶聯或O-偶聯的糖鏈，N末端或C末端的加工處理，化學小分子粘附於胺基酸的骨架上，N-或O-連接糖鏈的化學修飾，以及原核生物宿主細胞表達後，添加或去除N末端的甲硫氨酸殘基，均可以看成宿主細胞表達的增加。多肽還可以用檢測標記進行修飾，例如酶，螢光，同位素或親和標記，用於蛋白質的檢測和分離。
本發明還提供了化學修飾的血管生成蛋白的衍生物，它具有其他優點，如多肽的溶解性、穩定性和循環時間均增高，或免疫性降低(見美國專利第4179337號)。衍生的小片段可以從水溶性的多聚體中分離出來，如聚乙二醇，丙二醇/丙三醇共多聚物，羰甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯乙醇及其類似物。多肽可以在分子內任何位點進行隨機修飾，或在分子內預定的位點進行修飾，多肽分子可包括一個、兩個、三個或多個粘附的化學小分子。
多聚體可以有任何大小的分子量，並且可以有側鏈，也可以沒有側鏈。對聚乙二醇而言，優選的分子量在約1kD到100kD之間(「大約」一詞表明不同的聚乙二醇的製備，有些分子比所說的分子量重些，有些則輕些)，並較易處理和製備。也可使用其他大小的分子，要根據治療方案而定(如要求持續釋放的時程，效應，如果有的話，取決於生物學活性，易於操作，抗原性的大小或缺失，以及其他已知的聚乙二醇對某種治療性蛋白或蛋白類似物的效應)。
聚乙二醇分子(或其他化學小分子)應當與蛋白質結合，應當考慮到對蛋白質的功能或抗原性結構域的影響。對本領域熟練的技術人員而言，有許多結合方法，如EP0401384，並附有參考文獻(PEG與G-CSF偶聯)，還可以參見Malik等，實驗血液學，1992，201028-1035(用tresyl chloride報告GM-CSF的pegylation)。例如，聚乙二醇可以與胺基酸殘基上的反應基團共價結合，例如游離的氨基或羰基。反應基團是那些活化的聚乙二醇可與之結合的分子。帶有游離的氨基的胺基酸殘基，包括賴氨酸殘基和N末端胺基酸殘基；帶有游離羰基的胺基酸包括天冬氨酸殘基，穀氨酸殘基和C-末端胺基酸殘基。磺酸基團還可以作為粘附聚乙二醇分子的反應基團。聚乙二醇治療用時優選的分子是連接在氨基，如粘附在N末端或賴氨酸基團上。
人們特別希望在蛋白質N末端進行化學修飾。聚乙二醇作為現有組份的實例，你可以從各種不同的聚乙二醇分子中進行挑選(根據分子量，側鏈，等)，混合物中，聚乙二醇與蛋白質(或多肽)分子的比例，所進行的pegylation反應類型，以及獲得選擇的N端pegylated蛋白質分子的方法。獲得N端pegylated標本的方法(即必要時，就將這種分子與其他monopegylated分子分離開)為通過把N末端pegylated成分從大量的pegylated分子中純化出來。選擇那些在N端發生化學修飾的蛋白質是通過還原烷基化實現的，還原烷基化為檢測不同原始氨基基團的類型(賴氨酸比N末端)的分化的反應性，這些基團為某種特異蛋白質的衍化物。在適當的反應條件下，可以有選擇性的獲得蛋白質的衍生物，這類蛋白質為N末端攜帶羰基，並含有多聚體。
本發明的血管生成多肽可以是單體或多聚體(即二聚體，三聚體，四聚體和更大的多聚體)。因此，本發明與本發明中VEGF-2多肽的單體和多聚體，它們的分離製備，以及它們的組成(尤其是指藥理成分)有關。在特殊的實例中，本發明的多肽為多基因，二聚體，三聚體或四聚體。在另外的實例中，本發明的多聚體至少是二聚體，三聚體或四聚體。
本發明所涉及的多聚體可以是同聚體或異聚體。本文這裡所使用的「同聚體」術語，是指僅含有本發明的血管生成多肽(包括本文這裡所述的VEGF-2片段，變異體，不同的剪接產物和融合蛋白)。這些同聚體為含有相同或不同的胺基酸序列的血管生成多肽。在一個特殊的實例中，本發明的一個同聚體為一個僅含有血管生成多肽的多聚體，後者含有相同的胺基酸序列。在另一個特殊的實例中，本發明的一個同聚體為一個含有VEGF-2多肽的多聚體，而後者含有不同的胺基酸序列。在特殊的實例中，本發明的多聚體為一同源二聚體(例如，含有相同或不同的胺基酸序列的血管生成多肽)或一同源三聚體(如，含有相同和/或不同的胺基酸序列的血管生成多肽)。在另外的實例中，本發明的同聚物性多聚體至少應是一個同源二聚體，同源三聚體或同源四聚體。
「異聚體」這一術語，在本文是指一個除含有本發明的血管生成多肽外，還含有一個或多個異源性多肽的多聚體(即不同的蛋白多肽)。在一個特殊的實例中，本發明的多聚體為異源二聚體，異源三聚體，或異源四聚體。在另外的實例中，本發明的同源多聚體至少為一個同源二聚體，同源三聚體，或同源四聚體。
本發明的多聚體是由親水，疏水，離子和/或共價連接和/或間接連接，例如通過脂質體的形成。因此，在一個實施例中，本發明的多聚體，如，同源多聚體或異源多聚體在本發明的多肽在溶液中與另一個分子接觸時，就可以形成多聚體。在另一個實施例中，本發明的異源多聚體，例如，在溶液中，本發明的多肽與此肽的抗體接觸(包括針對本發明的融合蛋白中的異源多肽序列的抗體)就可以形成異源三聚體或四聚體。在另外一些實施例中，本發明的多聚體可以通過與和/或本發明的VEGF-2多肽之間的共價連接形成。這些共價連接包括一個或多個存在於該多肽內的胺基酸殘基(如，引自SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22或24的多肽中)。在某種情況下，共價連接為位於多肽序列內的半胱氨酸殘基之間的交聯，它們在天然狀態下就發生作用(即自然發生)。而在另一種情況下，共價連接為化學或重組操作的結果。另外，這些共價連接含有一個或多個存在於血管生成融合蛋白的異源多肽序列中的胺基酸殘基。在一個實施例中，共價連接是位於本發明中的一個融合蛋白的異源序列之間(見，如美國專利號為5478925)。在一個特殊實施例中，共價連接為位於本發明中的一個血管生成多肽-Fc融合蛋白的異源序列之間(見本文所述)。在另一個實施例中，本發明融合蛋白的共價連接存在於另一個TNF家族的配體/受體家族成員的異源序列多肽之間，該序列能夠形成共價連接的多聚體，例如osteroprotegetin(見，例如，國際出版，世界專利第98/49305，這裡的所有內容均附有參考文獻)。
本發明的多聚體應用本領域所熟知的化學技術方法可以合成。例如，存在於本發明多聚體中的多肽，應用本領域中所熟知的連接子分子和連接子分子長度最佳技術，進行化學交聯(見，如美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。再者，本發明的多肽應用在多肽的C末端或N末端增加半胱氨酸或生物素方法，可進行常規修飾，本領域的這些技術可用於合成含有一個或多個此類修飾的多肽的多聚體(見，例如美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。另外，這些本領域所熟知的技術可用於合成含有多肽的脂質體，而多肽存在於本發明的多聚體中(見，例如，美國專利號5478925，本文附有全部的參考文獻)。
另一方面，本發明的多聚體可以應用本領域所熟知的遺傳工程技術進行合成。在一個實施例中，存在於本發明的多聚體中的多肽，使用本文所述的融合蛋白技術可以進行重組合成(美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。在一個特殊的實施例中，編碼本發明的同源二聚體的多核苷酸序列可通過以下技術進行合成，即將一個編碼本發明的多肽的多核苷酸連接到一個編碼連接子多肽的序列上，然後再連接到一個人工合成的可以翻譯成多肽產物的序列中，而該多肽為反向排列的，即從C末端到N末端(無前導序列)(見，例如，美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。在另一個實施例中，本文所述的重組技術或其他本領域中所熟知的技術可用於合成本發明的含有一個跨膜結構域的重組多肽(或疏水或前導肽)，並且通過膜的重組技術可以整合脂質體中(見，例如，美國專利號5478925，本文附有完整的參考文獻)。血管生成多肽的生物學活性血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以用於檢測一種或多種生物學活性的試驗。如果在某個試驗中血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑表現出活性，血管生成多核苷酸或多肽就可能與該生物學活性相關的疾病有關聯。因此，血管生成多肽可以用來治療相關疾病。以下所述的生物活性包括於血管生成蛋白「所需活性」中。免疫活性血管生成多肽或多核苷酸，或其激動劑或拮抗劑，通過激活或抑制免疫細胞的增殖、分化或激動(趨藥性)，可以用於治療免疫系統的缺陷或紊亂。免疫細胞通過造血作用發育，由多能幹細胞產生脊髓細胞(血小板、紅細胞、嗜中性粒細胞、和巨噬細胞)和淋巴細胞(B和T淋巴細胞)。這些免疫缺陷或疾病的發病原因可能是遺傳性的、體細胞的，如癌症或自身免疫性疾病，獲得性(如化療或毒素引起的)，或感染性的。再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以作為某種特異的免疫系統疾病或紊亂的一種標記或檢測物。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測造血細胞的缺陷或功能異常。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於提高造血細胞的分化和增殖，包括多能幹細胞，試圖用於治療那些與某種(或多種)類型造血細胞有關的疾病。免疫缺陷症候群的實例包括，但不僅限於這些血紅蛋白病(如丙種球蛋白缺乏症，丙種球蛋白異常症)，共濟失調性毛細血管擴張症，常見的變異性免疫缺陷症，Digeorge症候群，HIV(人免疫缺陷病毒)感染，HTLV-BLV(人T淋巴細胞-B淋巴細胞)感染，白細胞粘附缺陷症候群，淋巴細胞減少症，吞噬細胞殺傷功能異常，重症聯合免疫缺陷症(SCIDs)，Wiskott-Adrich病，貧血，血小板減少症，或血紅蛋白尿。
再者，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於調節止血(中止出血)或血栓活性(血栓形成)。例如，通過提高止血或血栓活性，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以用於治療血液凝固性疾病(如纖維蛋白原缺乏症，凝血因子缺陷)，血小板異常(如血小板減少症)，或由外傷，手術或其他原因造成的創傷。另一方面，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可降低止血或血栓活性，可用於抑制或溶解血栓，這在治療心臟病發作(心肌梗塞)，中風或疤痕形成時，非常重要。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，還可用於治療或檢測自身免疫性疾病。許多自身免疫性疾病起源於免疫細胞將自身的組織作為外源性的異物進行的異常識別。這種異常識別導致宿主組織破壞的免疫應答。因此，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以抑制免疫應答，尤其抑制T細胞的增殖、分化或趨化，所以血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑在預防自身免疫性疾病時，可能是一種有效的治療措施。
可以治療或診斷的自身免疫性疾病的實例包括，但不僅限於這些艾迪森氏病，溶血性貧血，抗磷脂症候群，類風溼性關節炎，皮炎，過敏性腦脊髓炎，腎小球腎炎，Goodpasture症候群，Graves病，多發性硬化，重症肌無力，神經炎，眼炎，大天皰樣瘡，天皰瘡，多內分泌腺病，紫癜，Reiter病，Stiff-Man症候群，自身免疫性甲狀腺炎，系統性紅斑狼瘡，自身免疫性肺部炎症，格林-巴裡(Guillain-Barre)症候群，胰島素依賴的糖尿病和自身免疫性炎性眼病。
同樣地，過敏反應和疾病，例如哮喘(尤其是過敏性哮喘)或其他呼吸系統疾病，也可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑進行治療。再者，這些分子還可用於治療過敏反應，抗原分子或血型不符所引起的超敏反應。
血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑還可用於治療和/或預防器官排斥或移植物抗宿主反應(GVHD)。器官排斥反應是宿主的免疫細胞通過免疫應答破壞移植組織的反應。同樣地，GVHD還會發生另一種免疫應答，而此時卻是外源移植物的免疫細胞破壞宿主組織。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可以抑制免疫應答，尤其可以抑制T細胞的增殖、分化或趨化，因此可以作為預防器官排斥或GVHD的一種有效的治療手段。
同樣，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑還可用於調節炎症反應。例如，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以抑制參與炎症反應的細胞的增殖與分化。這些分子可用於治療急性和慢性炎性疾病，包括與炎症相關的感染(如感染性敗血症性休克，膿毒症，或全身炎性反應症候群(SIRS)，缺血-再灌注性損傷，內毒素性損害，關節炎，補體介導的超急排斥反應，腎炎，細胞因子或趨化因子引起的肺損傷，炎性腸病，克隆(Crohn)病，或細胞因子生成過多引起的疾病(如TNF或IL-1)。過度增殖性疾病血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測過度增殖性疾病，包括腫瘤。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，通過直接或間接作用，可以抑制此類疾病的增殖。另一方面，血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑可以使其他細胞增殖，而這些細胞可以抑制過度增殖性疾病。
例如，通過提高免疫應答，尤其是提高過度增殖性疾病的抗原質量或通過使T細胞的增殖，分化或動員，用於過度增殖性疾病的治療。通過提高現有的免疫應答，或啟動新的免疫應答，均可提高這種免疫應答。另一種情況，降低免疫應答還可作為治療過度增殖性疾病的一種方法，如化療藥物。血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療或檢測過度增殖性疾病的實例包括，但不僅限於以下部位的腫瘤腹部，骨骼，乳腺，消化道，肝臟，胰腺，腹膜，內分泌腺(腎上腺，甲狀旁腺，垂體，睪丸，卵巢，胸腺，甲狀腺)，眼睛，頭頸部，神經(中樞和周圍神經)，淋巴系統，盆腔，皮膚，軟組織，脾臟，胸部和泌尿生殖器。
同樣地，其他過度增殖性疾病還可用血管生成多核苷酸或多肽，或其激動劑或拮抗劑治療或檢測。這些過度增殖性疾病的實例包括，但不僅限於以下這些情況高丙種球蛋白血症，淋巴增殖性疾病，異型蛋白血症，紫癜，結節病，Sezary症候群，Waldenstron巨球蛋白血症，Gaucher(高雪)氏病，組織細胞增多症，以及其他所有過度增殖性疾病，還包括位於上述所列舉的各器官、系統的腫瘤。心血管疾病血管生成多肽或多核苷酸，或其激動劑或拮抗劑，可用於治療心血管疾病，包括周圍動脈血管疾病，例如四肢缺血。
心血管疾病包括心血管的異常，例如動脈—動脈瘻，動靜脈瘻，腦動靜脈畸形，先天性心臟病，肺動脈閉鎖和Scimitar症候群。先天性心臟病包括主動脈狹窄，cortriatriatum，冠狀血管異常，十字心臟(crisscross heart)，右位心，動脈導管閉鎖不全，Ebstein(愛波斯坦)異常，Eisenmenger(埃森曼格)綜合症，發育不全性的左心症候群，左位心，法樂氏四聯症，大血管轉位，雙流出道的右心室，三尖瓣閉鎖，持續性腹主動脈關閉不全和心臟間隔缺損，例如主動脈—肺動脈間隔缺損，心內膜墊缺損，Lutembacher症候群，法樂氏三聯症，心室間隔缺損。
心血管疾病還包括心臟病，例如心律失常，瘤樣心臟病，高心輸出量，低心輸出量，心包填塞，心內膜炎(包括細菌性)，心血管瘤，心臟停搏，充血性心力衰竭，充血性心肌病，陣發性呼吸困難，心源性水腫，心肌肥大，左心室肥大，右心室肥大，梗塞後心臟破裂，室間隔破裂，心瓣膜病，心肌病變，心肌缺血，心包積液，心包炎(包括縮窄性和結核性)，心包積氣，心包切除後症候群，肺心病，風溼性心臟病，心室功能失常，充血，妊娠期心血管併發症，Scimitar症候群，梅毒性心臟病和結核性心臟病。
心律失常包括竇性心律失常，房顫(心房顫動)，房撲(心房撲動)，心動過緩，期前收縮，阿—斯(Adams-Strokes)症候群，束枝阻滯，竇房阻滯，長QT症候群，收縮，Lown-Ganong-Levine症候群，Mahaim型的預激症候群，Wolff-Parkinson-White症候群，病竇症候群，心動過速和室顫(心室顫動)。心動過速包括陣發性心動過速，室上性心動過速，進行性心室自發節律，房室結折返性心動過速，異位交界性心動過速，竇房結折返性心動過速，竇性心動過速，Torsades de Poiners，和室性心動過速。
心瓣膜疾病包括主動脈瓣關閉不全，主動脈瓣狹窄，心臟雜音，主動脈瓣脫垂，二尖瓣脫垂，三尖瓣脫垂，二尖瓣關閉不全，二尖瓣狹窄，肺動脈閉鎖，肺動脈瓣關閉不全，肺動脈瓣狹窄，三尖瓣閉鎖，三尖瓣關閉不全和三尖瓣狹窄。
心肌病變包括酒精性心肌病，擴張型心肌病，肥厚型心肌病，主動脈瓣膜下狹窄，肺動脈瓣膜下狹窄，限制型心肌病，Chagas心肌病，心內膜下纖維組織增生，心內膜纖維化，