鹼性蛋白酶的製作方法

2023-04-29 18:29:31

專利名稱：：鹼性蛋白酶的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種鹼性蛋白酶，特別涉及一種水解效率高的鹼性蛋白酶。
背景技術：
：大豆中含有40%的蛋白質，它可以提供動物所需要的8種必需胺基酸、多種維生素和礦物質。大豆蛋白資源十分豐富，原料成本低廉，具有乳化性、起泡性等功能特性。但同時，大豆蛋白含有一些引起過敏反應的抗原物質一一致敏因子，大豆蛋白引起過敏反應的主要抗原成分為大豆球蛋白和0-伴大豆球蛋白。解決的主要方法就是將其酶解，大豆蛋白經水解後其酶解物比胺基酸和蛋白質更易於消化吸收，還能改變其溶解性、降低粘度。水解大豆蛋白的方法有3種，酸法、鹼法和酶法。酸鹼法是用酸、鹼等化學試劑在一定溫度下促使蛋白質分子的肽鏈斷裂形成小分子物質。但由於鹼法水解使胺基酸大多消旋，無生物利用價值，因此不宜採用；而酸法多採用鹽酸、硫酸等強酸在高溫下反應，反應強烈，設備腐蝕嚴重，水解徹底，多生成胺基酸混合物，同時在高溫下色氨酸完全被破壞，目前漸被淘汰。酶法水解大豆蛋白的研究，最初是始於利用酶部分降解蛋白質，增加其分子內或分子間交聯或連接特殊功能基團，改變蛋白質的功能性質，以獲得良好加工特性的研究。到了80年代，隨著酶製劑工業和食品工業的迅猛發展，人們逐漸發現，利用酶法改性，不4又反應條件溫和，安全可靠，產品色淺，而且水解產物在營養、風味、工藝等方面均優於酸、鹼水解法，因而人們的注意力集中在蛋白水解產物多肽上。酶法選擇性較強，但水解率偏低。因此，需要發明一種新的鹼性蛋白酶以解決上述問題。
發明內容本發明的主要目的之一在於基於現有技術的不足而提供一種水解率高的鹼性蛋白酶。本發明提供一種鹼性蛋白酶，能在鹼性條件下水解蛋白質，其特徵在於，所述鹼性蛋白酶具有以下物理化學特性a)所述的鹼性蛋白酶由單一蛋白肽鏈所構成；b)所述的鹼性蛋白酶通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳確定的估測分子量為32kDa;c)所述的石威性蛋白酶的N端序列為ADYLKQSNPE;d)所述的鹼性蛋白酶是一種中高溫蛋白酶，在6(TC有最高的催化活性；所述的鹼性蛋白酶在低於40。C的條件下具有很好的穩定性，當環境溫度在50°C時，所述的鹼性蛋白酶會緩慢的失活，所述的鹼性蛋白酶的最適使用溫度為50°C;e)所述的鹼性蛋白酶在pH>8.0的範圍內有相對較強的催化活性，其最適作用pH在8.5~9.5範圍；該內肽酶在pH6.0~9.0的範圍內能保持很好的穩定性；f)苯曱基磺醯氟(Phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF)對所述的鹼性蛋白酶有非常顯著的抑制作用，所述的鹼性蛋白酶屬於絲氨酸蛋白酶家族；g)金屬離子對所述的鹼性蛋白酶活性並無顯著的促進作用；h)所述的鹼性蛋白酶在胰島素B鏈上擁有強弱不等的11個酶切位點；i)所述的鹼性蛋白酶由雅致放射毛黴AS3.2778分離提純得到。毛黴是我國傳統豆類發酵食品的主要生產菌種之一，有著悠久的應用歷史。由於長期受到環境條件(高蛋白培養基)的馴化，毛黴具有分泌多種胞外蛋白酶的能力；而且，其胞外蛋白酶系對大豆蛋白有相對較強的適應性，顯示出很強的水解能力；其水解大豆蛋白得到的產物主要以小肽為主，有很高的水解度，且不會產生苦味。本發明的鹼性蛋白酶(命名為Pbl)能夠解決大豆蛋白水解中的主要技術難題，水解效率高，水解產物沒有強烈的苦味。作為本發明的優選實施方式，所述的^s鹹性蛋白酶對三種底物的水解活性為酪蛋白(Casein)>大豆分離蛋白(soyproteinisolated,SPI)>牛血清白蛋白(BSA)。作為本發明的優選實施方式，所述的鹼性蛋白酶米氏常數Km為2.857g/L，活化能Ea為44.09kJ。本發明以雅致放射毛黴AS3.2778為對象，採用了多種層析梯:作相結合的方法，包括離子交換、疏水層析、分子篩等，從蛋白質性質的不同角度對毛黴鹼性蛋白酶組分進行純化，通過這些手段得到電泳純的鹼性蛋白酶，然後檢測該酶的酶學參數、水解蛋白的酶切位點、N端序列鑑定，及其對大豆蛋白的水解效率等，為其蛋白水解的應用提供具體參數。圖1為鹽析沉澱的電泳分析圖，泳道1為蛋白質marker,泳道2為80S蛋白沉澱，泳道3為75S蛋白沉澱，泳道4為70S蛋白沉澱，泳道5為65S蛋白沉澱，泳道6為60S蛋白沉澱，泳道7為50S蛋白沉澱，泳道8為45S蛋白沉澱，泳道9為40S蛋白沉澱，泳道10為35S蛋白沉澱；圖2為鹼性蛋白酶DEAE-Sepharose離子交換洗脫曲線圖，左起第一個峰為PM活性峰；圖3為鹼性組分PblCM-Sepharose離子交換洗脫曲線圖，左起第二個峰為Pbl活性峰；圖4為鹼性組分PblPhenyl-Sepharose疏水層析洗脫曲線圖；圖5為鹼性組分PblSepharose6B凝膠過濾洗脫曲線圖；圖6為鹼性蛋白酶Pbl的電泳分析圖，泳道1為蛋白marker,泳道2為粗酶液，泳道3為鹽析後樣品，泳道4為DEAE-Sepharose收集樣，泳道5為CM-Sepharose收集樣，泳道6為Phenyl-Sepharose收集樣，泳道7為Sepharose6B收集樣。具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。實施例1毛酶的發酵及粗酶的提取1.1菌種雅致放射毛黴AS3.2778,購於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。1.2種子培養基及種子活化250ml三角瓶中加入麩皮10g，水10ml，用玻棒攪拌混合均勻，並搗散較大的團塊(儘量做到顆粒均一)。12rC滅菌30min,乘熱取出後搖散，冷卻後備用。滅菌好的種子培養基每瓶接種一環試管斜面孢子，混合均勻，並儘量使培養基表面平整，培養基層厚度一致，然後置於28。C生化培養箱中培養3天。1.3孢子懸浮液製備在無菌條件下，向活化好的三角瓶種子加入100ml無菌水，振蕩，洗脫培養基表面的孢子，得到孢子懸浮液。1.4固體發酵滅菌好的發酵培養基接種lml孢子懸浮液，混和均勻後於設定的條件下培養。發酵培養基及條件每隻250ml三角瓶裝8g麩皮，其中添加1.23%麥芽糖，1.56%蛋白腖，0.74%KH2PO4,0.06%FeSO4.7H2O作為輔助營養物，培養基的起始含水量為每克麩皮添加0.79ml水，發酵溫度24.1。C,時間48h。1.5粗酶的提取稱取一定量的幹麩曲加入10倍重量的0.3M氯化鈉溶液，混勻後於4(TC水浴中抽提1.5h,紗布過濾後在7000g/min-4。C離心10min,取上清即得到粗酶液。鹽析結果表明目標蛋白(即酶蛋白)主要是在45S~80S這一區間析出，毛黴內肽酶的電泳條帶主要位於32kDa與35kDa之間的主蛋白條帶(電泳圖見附圖1)。1.6蛋白酶活性測定採用改良Anson法。lml稀釋酶液與2ml1.5%酪蛋白(溶於0.02M,pH7.0PBS)混和後在40。C反應10min,加入5ml10%的三氯乙酸終止反應，靜置15min後過濾，取濾液測定280nm吸光度。酶活單位定義在測定條件下，水解酪蛋白產生的吸光度變化量與l昭酪氨酸相當時所需要的酶量為一個活力單位。實施例2鹼性蛋白酶的分離純化2.1硫酸銨分段鹽析取一定體積的粗酶液，在冰水浴上緩慢加入固體硫酸銨到40%飽和度，充分溶解後在4。C冰箱中靜置3h,於4。C，12000g/min離心20min,取上清液繼續加入固體疏酸銨至85。/。飽和度，4。C水箱中靜置過夜，然後於4°C，12000g/min離心20min，蛋白沉澱用0.02M，pH7.5的Tris-HCl緩沖液溶解，並透析脫鹽。2.2DEAE-Sepharose陰離子交換用0.02M,pH7.5的Tris-HCl緩衝液平衡DEAE-Sepharose陰離子交換柱(平衡好的依據流出液pH7.5,電導率穩定)，取一定量鹽析脫鹽後的酶液，加樣陰離子交換柱。用0.02M，pH7.5的Tris-HCl緩沖液充分洗柱後(約300ml)，用0.5MNaCl溶液(溶於0.02M，pH7.5的Tris-HCl緩衝液)進行階梯等度洗脫，收集穿透蛋白峰，用超濾離心管(截留分子量10000Da)濃縮收集液，並用0.05M,pH5.0醋酸緩衝液調節其pH到5.0。2.3CM-Sepharose陽離子交換用0.05M，pH5.0醋酸緩衝液平衡CM-Sepharose陽離子交換柱，取上一步收集的濃縮酶液加樣陽離子交換柱。用平銜-緩衝液充分洗柱後，用0.5M的NaCl溶液(溶於0.05M,pH5.0醋酸緩沖液)進行梯度洗脫。收集第一個洗脫峰(即目標蛋白峰)，用超濾離心管濃縮收集的酶液。2.4Phenyl-Sepharose疏水層析用1.2M硫酸銨溶液(溶於0.05M,pH7.5的PBS緩沖液)平衡Phenyl-Sepharose疏水層析柱。將上一步收集的濃縮酶液與2.4M硫酸銨溶液(溶於0.1M,pH7.5的PBS緩沖液)等體積混和後加樣Phenyl-Sepharose疏水層析柱，用平衡緩衝液充分沖洗疏水柱，然後進行梯度洗脫。收集梯度洗脫的第二個蛋白峰，即為目標蛋白峰。用超濾離心管濃縮收集的酶液。2.5Sepharose6B凝膠過濾層析用0.02M,pH7.5的PBS緩衝液平衡Sepharose6B凝膠柱，加樣上一步收集的濃縮酶液，用0.02M,pH7.5的PBS緩衝液洗脫，。收集主要蛋白峰即為目標蛋白，用超濾離心管濃縮收集的樣品即得純化酶液。毛黴粗酶液經過多次層析純化，得到了一株鹼性蛋白酶Pbl,鹼性蛋白酶的層析過程及純化倍數見表1,層析洗脫曲線圖詳見附圖25。表1毛黴鹼性內肽酶組分Pbl的純化步驟tableseeoriginaldocumentpage102.6聚丙烯醯胺凝膠電泳利用SDS-PAGE檢測純化後的蛋白酶純度，並初步確定目標蛋白的分子量範圍。採用14%分離膠，5%濃縮膠。通過一系列的層析使得目標蛋白純度達到了電泳純。電泳的結果顯示(見附圖6),Pbl組分是由單一蛋白肽鏈所構成，其分子量約為32kDa。2.7鹼性蛋白酶N端序列測定純化後的樣品Pbl以溶液的形式送上海基康生物技術有限公司，經電泳及轉膜後對目標蛋白條帶進行N端測序分析。測序的實驗結果顯示，毛黴鹼性內肽酶組分Pbl的N端序列為ADYLKQSNPE。根據這一結果，在NCBI資料庫內進行序列比對，結果發現，在資料庫內找不到與之有100%匹配的目標蛋白，說明該內肽酶組分是一未曾報導的新蛋白。2.8串聯質譜分析純化的蛋白酶樣品Pbl進行SDS-PAGE電泳分析，經考馬斯亮藍染色後，分別從膠片上切取對應的目標蛋白條帶，置於1.5mlEP管中，送香港大學基因研究中心做串聯質譜分析。根據串聯質譜譜圖與現有資料庫中蛋白進行比對，毛黴鹼性蛋白酶組分Pbl與來源於釀酒酵母的YJR068W蛋白(功能不明確)似乎有較高的同源性，其顯著性指標C.I.Q/o可以達到95.508。然而，該蛋白的得分率並不高(僅為64),Pbl經胰蛋白酶酶解得到的主要肽段並不能與YJR068W蛋白相吻合，Pbl的分子量(32kD)與YJR068W蛋白(40kD)也相差較大，更為重要的是Pbl的N端序列與YJR068W蛋白不匹配。根據以上分析可以確定，純化的鹼性蛋ii頁白酶組分Pbl並不是YJR068W蛋白，它是一種未曾報導的新蛋白。實施例3毛黴鹼性蛋白酶Pbl催化性質的測定3.1鹼性蛋白酶的最適作用溫度按照酶活測定方法分別於不同的溫度(3070。C範圍)下測定毛黴鹼性蛋白酶的活性，考察溫度對毛黴鹼性蛋白酶活性的影響。根據實驗結果繪製溫度-活力曲線，並由此確定毛黴i鹹性蛋白酶的最適作用溫度。3.2毛黴4^性蛋白酶的最適作用pH按照酶活測定方法分別於不同pH緩衝條件下(pH3.0-5.0,0.05M乙酸緩沖鹽；pH6.0-7.0，0.05M磷酸緩沖鹽；pH8.0-9.0,0.02MTris-HCl;pH9.5-10.5,0.02Mglycine-NaOH)測定毛黴鹼性蛋白酶的活性，考察pH對毛黴鹼性蛋白酶活性的影響。根據實驗結果繪製pH-活力曲線，並由此確定毛黴鹼性蛋白酶的最適作用pH範圍。3.3毛黴鹼性蛋白酶的熱穩定性在鹼性蛋白酶的穩定pH條件下，將酶液分別於不同溫度(30~70°C範圍)下保溫30min,測定保溫前後鹼性蛋白酶活性的變化，考察溫度對鹼性蛋白酶穩定性的影響。以酶活殘留率對溫度作圖，繪製鹼性蛋白酶的熱失活曲線。毛黴鹼性內肽酶是一種中高溫蛋白酶，在60。C左右有最高的催化活性；該內肽酶組分在低於40。C的條件下具有很好的穩定性，當環境溫度在5(TC時，該內肽酶會緩慢的失活，而一旦溫度超過60。C則極不穩定，放置lh活性損失達80%左右，2h後活性幾乎完全喪失。綜合以上實驗結果，可以初步確定該12鹼性內肽酶的使用溫度在50。C左右。3.4pH對石成性蛋白酶穩定性的影響用不同的緩衝液分別調節酶液的pH到pH3.0，4.0，5.0，6.0,7.0,8.0，9.0，10.0,於室溫(25°C)放置約lh，然後鹼性蛋白酶組分的最適作用pH測定鹼性蛋白酶活性，計算酶活殘留率。以酶活殘留率對pH作圖，繪製鹼性蛋白酶的pH穩定性曲線。毛黴鹼性內肽酶組分在pH>8.0的範圍內有相對較強的催化活性，其最適作用pH在8.5~9.5範圍；該內肽酶在pH6.0~9.0的範圍內能保持很好的穩定性，而在pH低於5.0的酸性環境中則不穩定，隨pH降低其失活速度加快。3.5抑制劑對毛黴鹼性蛋白酶活性的影響在鹼性蛋白酶的穩定pH條件下，將酶液與不同類型的抑制劑混和，然後在室溫中放置約30min,測定加入抑制劑保溫後鹼性蛋白酶的活性。考察蛋白酶抑制劑對鹼性蛋白酶活性的影響。所用抑制劑購於Roche公司，結果如表2所示。表2抑制劑對毛黴鹼性內肽酶Pbl活性的影響Inhibitor濃度aRelativeactivity(%)None-100苯曱基磺醯氟(PMSF)lmmol/L0.97±0.43亮肽素(Leupeptin)lmmol/L96.6±1.234中肽酶(Aprotinin)15jimol/L106.6±2.11乙二胺四乙酸(EDTA)10mmol/L98.02±1.42蛋白酶抑制劑E-64雨pmol/L99.2±1.15抑肽素(P印statin)1nmol/L10U1.04二巰基蘇糖醇(DTT)100mmol/L92b±1.25聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)5%80.31±0.68十二烷基磺酸鈉(SDS)0.1%101.14±1.07十二烷基磺酸鈉(SDS)0.5%4.41±1.14(a終濃度b酶活採用紫外測定法)在所考察的四類蛋白酶抑制劑中，僅有PMSF對毛黴鹼性內肽酶Pbl有非常顯著的抑制作用，終濃度lmM的PMSF可以抑制99。/。的內肽酶活性。由此可以確定，毛黴鹼性內肽酶Pbl屬於絲氨酸蛋白酶家族。3.6金屬離子對鹼性蛋白酶活性的影響在鹼性蛋白酶的穩定pH條件下，將酶液與不同的金屬無機鹽混和，於室溫中放置30min後測定酶活，比較各種金屬離子對鹼性蛋白酶活性的影響。常見金屬離子對毛黴鹼性內肽酶活性並無顯著的促進作用。相反，某些金屬離子，如Ca^對其活性有弱的抑制作用。3.7毛黴鹼性蛋白酶的底物選擇性按照鹼性蛋白酶的活性測定方法，分別以Casein(酪蛋白)、SPI(大豆分離蛋白)和BSA(牛血清蛋白)為底物測定鹼性蛋白酶的活性，考察毛黴鹼性14蛋白酶對不同底物的水解活性。以不同的天然蛋白為底物，考察了毛黴鹼性內肽酶對不同蛋白底物的水解活性，結果如表3所示。表3毛黴鹼性內肽酶Pbl對不同蛋白底物的水解活性Protein(1.5%,W/V)相對酶活％Casein100SPI(soyproteinisolated)60.6±0.8BSA4.3士0.2毛黴鹼性內肽酶對不同蛋白底物的作用效果有很大的差異，在所選用的3種蛋白底物中，毛黴內肽酶對Casein的水解活性最高，其次為SPI，最差的是BSA。3.8毛黴鹼性蛋白酶的肽鍵選擇性耳又牛胰島素氧化B鏈(InsulinChainBOxidizedfrombovinepancreas)100嗎，用lml緩衝液溶解(0.02MpH5.0乙酸-乙酸銨緩衝液)，加入一定量酶液(約30u),混和後放置於40。C水浴酶解lh，沸水浴5min滅活。用0.1%曱酸溶液10倍稀釋上述水解液，然後利用質譜測定稀釋水解液中小肽片斷的分子量，將所得的結果與胰島素B鏈隨機片斷的分子量比對，據此確定毛黴鹼性蛋白酶在胰島素B鏈上的酶切位點。以牛胰島素氧化B鏈為模型底物，利用質譜對胰島素B鏈酶解片斷進行了分析，並通過此方法確定了毛黴鹼性內肽酶在胰島素B鏈上的酶切位點，結果如表4所示。15表4毛黴鹼性蛋白酶Pbl在胰島素B鏈上的切割位點胰島素B鏈序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKAPblttttt出！豬胃蛋白酶atff胰蛋白酶a十t木瓜蛋白酶atttt枯草桿菌蛋白酶at十桔青黴絲氨酸蛋白酶tttSubtilisinBPNt十納豆桿菌絲氨酸蛋白酶t十t彈性蛋白酶ttt(表中箭頭指示酶切位點，其粗細表示水解強度的大小十>十表3列出了毛黴蛋白酶Pbl及其它已報導蛋白酶在胰島素B鏈上的酶切位點，對它們進行比較分析可以看出毛黴鹼性蛋白酶Pbl在胰島素B鏈上的酶切位點與已報導的其它蛋白酶均不相同，其酶切位點相對較多，擁有強弱不等的11個酶切位點，這一結果說明毛黴蛋白酶具有更為廣泛的肽鍵選擇性。從位點的分布來看，毛黴鹼性蛋白酶Pb1在胰島素B鏈上的酶切位點分布象是綜合了多種不同類型蛋白酶的酶切位點。首先，其大多數酶切位點與枯草桿菌類絲氨酸蛋白酶相同，對胰島素B鏈上4-Gln+His-5、9-Ser+His-10、11-Leu+Val-12、17-Leu+Val-18、25-Phe+Tyr-26肽鍵有非常強的水解能力；不同的是，毛黴鹼性蛋白酶Pbl對肽鍵5-His+Leu-6、15-Leu+Tyr-16、16-Tyr+Leu-17沒有水解活性；其次，Pbl還具有與豬胃蛋白酶相似的酶切位點6-Leu+Cys-7和14-Ala+Leu-15;除此外，毛黴鹼性蛋白酶也具有自己較獨特的酶切位點20-Gly+Glu-21。分析以上酶切位點的特性可以看出毛黴鹼性蛋白酶具有絕大多數絲氨酸蛋白酶的共同特性，即對於由疏水胺基酸構成的肽鍵有較強的選擇性。如表3所示，毛黴鹼性蛋白酶對於牛胰島素B鏈上由亮氨酸及苯丙氨酸構成的肽鍵有相對較強的水解活性；除此外，毛黴鹼性蛋白酶對於pl位置有鹼性胺基酸(如組氨酸)的肽鍵也有較強的水解能力。實施例4毛黴鹼性蛋白酶Pbl動力學特性測定4.1米氏常數測定配製一系列不同濃度的酪蛋白溶液0g/L、0.5g/L、lg/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、16g/L、20g/L。分別在鹼性蛋白酶最適作用pH條件下，用不同濃度酪蛋白溶液為底物測定鹼性蛋白酶活性，考察底物濃度與鹼性蛋白酶活性的關係。根據實驗數據採用雙倒數作圖或曲線擬合的方法確定米氏方程中的參數(Vm和Km)。曲線擬合法求解Pbl米氏常數，確定出模型參數Vm=22.8pg/ml'min,Km=2.857g/L。4.2活化能的測定才艮據化學反應動力學理論，在酶的穩定性不受影響的前提下，溫度對酶促反應速度的影響符合阿累尼烏斯(Arrhenius)方程。根據上述實驗結果，毛黴鹼性蛋白酶在45。C內有較好的熱穩定性，在此溫度範圍內鹼性蛋白酶的失活速度很低，可以忽略，其酶促反應速率符合Arrhenius方程。另外，在通常情況下，酶活測定時其底物濃度Cs是遠遠過量的，Cs的微小變化對酶促反應速率的影響可以忽略，即反應速度不受底物濃度Cs的影響，此時的酶促反應遵循零級化學反應規律，對於反應*S~^P(4-1)則有速率方程r=%=&(4-2)才艮據Arrhenius方程A:=^4exp(—靜)(4-3)式中，A為指前因子；Ea為反應活化能；R為氣體常數，8.31J/mol'K;T為絕對溫度。由此可以看出，在酶的穩定性溫度範圍內，酶促反應速率lnr與溫度1/T成線性關係，其斜率為-學。根據這一理論，分別在不同溫度(20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C)下測定毛黴鹼性蛋白酶的活性。然後對實驗數據進行上述的線性擬合，從而可以確定毛黴鹼性蛋白酶的活化能Ea。根據Arrhenius方程，對實驗數據進行線性擬合，根據以上模型中的參數可計算出毛黴鹼性蛋白酶Pbl的活化能Ea=44.09kJ。實施例5毛黴鹼性內肽酶Pbl對大豆蛋白的水解5.1鹼性條件下的水解試驗用0.05MpH8.0磷酸緩沖液配製濃度為5%的大豆分離蛋白(SPI)，在沸水浴中熱處理15min。冷卻後按酶與底物比1000uZg加入蛋白酶Pbl，然後置於5(TC水浴條件下酶解，測定大豆蛋白水解度的變化。5.2pH對大豆蛋白水解的影響分別在pH6.0，8.0，10.0的條件下進行水解試驗，探討毛黴蛋白酶Pbl在不同pH條件下對大豆蛋白的水解情況。毛黴鹼性蛋白酶在不同的pH條件下對大豆蛋白的水解顯示出較大的差異。在pH6.0時，大豆蛋白的最終水解度僅能達到6.5%左右；在pH8.0時，大豆蛋白的最終水解度則可以達到13%以上；而在pH10.0時，其水解度可以達到15%左右。以上結果說明，當以大豆蛋白為底物，以水解度作為檢測目標時毛黴鹼性蛋白酶Pbl的合適作用pH在10.0左右。5.3溫度對大豆蛋白水解的影響分別在40°C,50°C，60。C的條件下進行水解試驗，考察毛黴蛋白酶Pbl在不同溫度下對大豆蛋白的水解情況。在不同的溫度下大豆蛋白的水解呈現出不同的變化趨勢，在50°C的條件下，毛黴鹼性蛋白酶Pbl對大豆蛋白具有最強的水解活性，水解5h後大豆蛋白的水解度可以達到15%左右；在60。C的條件下，大豆蛋白的水解度在前30min也出現了迅速增加的趨勢，而之後幾乎是維持變化，結果說明毛黴鹼性蛋白酶Pbl在60。C也具有相當強的活性，只不過該蛋白酶在此溫度下極不穩定，很快就變性失活了。根據以上結果，確定毛黴鹼性蛋白酶Pbl水解大豆蛋白的合適溫度在50。C左右。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。權利要求1.一種鹼性蛋白酶，能在鹼性條件下水解蛋白質，其特徵在於，所述鹼性蛋白酶具有以下物理化學特性a)所述的鹼性蛋白酶由單一蛋白肽鏈所構成；b)所述的鹼性蛋白酶通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳確定的估測分子量為32kDa；c)所述的鹼性蛋白酶的N端序列為ADYLKQSNPE；d)所述的鹼性蛋白酶是一種中高溫蛋白酶，在60℃有最高的催化活性；所述的鹼性蛋白酶在低於40℃的條件下具有很好的穩定性，當環境溫度在50℃時，所述的鹼性蛋白酶會緩慢的失活，所述的鹼性蛋白酶的最適使用溫度為50℃；e)所述的鹼性蛋白酶在pH>8.0的範圍內有相對較強的催化活性，其最適作用pH在8.5～9.5範圍；該內肽酶在pH6.0～9.0的範圍內能保持很好的穩定性；f)苯甲基磺醯氟對所述的鹼性蛋白酶有非常顯著的抑制作用，所述的鹼性蛋白酶屬於絲氨酸蛋白酶家族；g)金屬離子對所述的鹼性蛋白酶活性並無顯著的促進作用；h)所述的鹼性蛋白酶在胰島素B鏈上擁有強弱不等的11個酶切位點；i)所述的鹼性蛋白酶由雅致放射毛黴AS3.2778分離提純得到。2、如權利要求1所述的鹼性蛋白酶，其特徵在於，所述的鹼性蛋白酶對三種底物的水解活性為酪蛋白>大豆分離蛋白>牛血清白蛋白。3、如權利要求1所述的鹼性蛋白酶，其特徵在於，所述的鹼性蛋白酶米氏常數Km為2.857g/L,活化能Ea為44.09kJ。全文摘要本發明涉及一種鹼性蛋白酶，所述鹼性蛋白酶能在鹼性條件下水解蛋白質，具有特定的物理化學特性，其水解率高。文檔編號C12N9/50GK101487002SQ20091003747公開日2009年7月22日申請日期2009年3月2日優先權日2009年3月2日發明者潘進權,王小寧,王菊芳,羅曉春,謝明權申請人:華南理工大學