修飾的顯示增加的蛋白酶抗性的促紅細胞生成素(epo)多肽及其藥物組合物的製作方法

2023-05-12 12:21:46 4

專利名稱：修飾的顯示增加的蛋白酶抗性的促紅細胞生成素(epo)多肽及其藥物組合物的製作方法
修飾的顯示增加的蛋白酶抗性的促紅細胞生成素(EPO)多肽及其藥物組合物相關申請要求2008年5月四日提交的題為"Modified Erythropoietin (EPO) Polypeptides that Exhibit Increased Protease Resistance and Pharmaceutical Compositions Thereof"的美國臨時申請61/130，376的優先權，該臨時申請的申請人為Thierry Guyon， Giles Borrelly,Xavier Gallet，Lila Drittanti 和 Manuel Vega。允許時，上述申請的主題以其全文援引加入。本申請涉及2007年11月沘日提交的題為「MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF，，的美國申請 11/998，387，申請人為 Thierry Guyon,Giles Borrelly, Xavier Gallet，Lila Drittanti 和 Manuel Vega，本申請還涉及題為「MODIFIED ERYTHROPOIETIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF」的國際申請 PCT/GB2007/004520，申請人為 Thierry Guyon, Giles Borrelly, Xavier Gallet, Lila Drittanti 禾口 Manuel Vega, 其均要求2006年11月洲日提交的題為美國臨時申請60/861，615的優先權。本申請還涉及2005年7月6日提交的題為「RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY,THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES」 的美國申請 11/176，830，申請人 Rene Gantier, Thierry Guyon,Manuel Vega禾口 Lila Drittanti, 其公開為美國申請US 2006-0020116,其是2003年9月8日提交的題為「RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY,THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES」 的美國申請 10/658，834 的繼續申請，申請人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 和 Lila Drittanti，公開為美國申請 US-2004_013^77-A1。本申請也涉及 2005 年 8 月 2 日提交的題為 「RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING」 美國申請 11/196，067，申請人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 禾口 Lila Drittanti,公開為美國申請US-2006-0020396-A1，其為2003年9月8日提交的美國申請10/658，355的繼續申請， 申請人:Rene Gantier,Thierry Guyon,Hugo Cruz Ramos,Manuel Vega禾口Lila Drittanti, 題為"RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING」，公開為美國申請 2005-0202438。本申請還涉及2003年9月8日提交的美國申請10/658，834，以及公開的國際 PCT 申請 WO 2004/022593，申請人 Rene Gantier, Thierry Guyon, Manuel Vega 和 Lila Drittanti,題為「RATIONAL EVOLUTION OF CYTOKINES FOR HIGHER STABILITY, THE CYTOKINES AND ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES」。本申請還涉及 2003 年 9 月8日提交的美國申請10/658,355，以及國際PCT申請WO 2004/022747,申請人Rene Gantier, Thierry Guyon, Hugo Cruz Ramos, Manuel Vega 禾口 Lila Drittanti,題為 "RATIONAL DIRECTED PROTEIN EVOLUTION USING TWO-DIMENSIONAL RATIONAL MUTAGENESIS SCANNING」。上述申請的每一個的主題以其全文援引加入。發明領域本發明提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽。所述EPO多肽經修飾以顯示與相應的未修飾EPO多肽不同的物理性質和活性。編碼這些多肽的核酸分子也在本發明提供。還提供了利用所述多肽進行治療和診斷的方法。
背景技術：
臨床使用的治療性蛋白的有效遞送是對藥學科學的挑戰。一旦在血流中，這些蛋白通常在短時間內通過不同的生理過程從循環中清除，包括代謝以及利用正常蛋白清除途徑進行的清理，諸如腎過濾(例如腎小球)或血中的蛋白裂解。一旦到達消化道腔內，這些蛋白通常被腔內蛋白酶消化。後者可以是影響蛋白半壽期的限制性過程，所述的蛋白用作治療劑，用於口服施用或皮下、靜脈內或肌內注射中。與這些施用途徑相關的問題是已知的並且已經試圖利用多種策略來解決這些問題。此外，許多治療性蛋白是糖基化的，而製備糖基化治療性蛋白非常昂貴，高度可變並且很難進行。這些蛋白的非糖基化形式的製備通常由於蛋白降解而不可能實現。細胞因子家族是改善蛋白家族的施用和生物同化作用的臨床工作和研究的焦點， 其中包括促紅細胞生成素(EPO)。重組製備的EPO多肽被認可用於治療各種貧血，諸如腎衰、慢性感染、癌和AIDS導致的貧血等；但是，仍然非常需要更為穩定的促紅細胞生成素用於治療。促紅細胞生成素的血漿半壽期相對較短(Spivak，J.L.和Hogans，B. B.，Blood 73(1) :90-99(1989) ；McMahon, F. G. , et al.，Blood 76(9) 1718-1722 (1990))，因此，治療性血漿水平會迅速降低，必須重複靜脈內施用。由於天然存在的變體具有不良副作用以及施用、生物利用度以及短半壽期的問題，需要改善EPO的性質以用作生物治療劑。因此，在本發明的目的中，一個目的是提供修飾的EPO多肽和其它治療性多肽，其具有改善的治療性質。

發明內容
本發明提供了配製為口服施用的藥物組合物。所述組合物含有修飾的治療性多肽或者所述修飾多肽的活性片段，其中所述修飾在所述活性片段中。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以是糖基化的，部分糖基化的或去糖基化的(即未糖基化，如去除糖基化部分、抑制糖基化，以及在不糖基化所述多肽的宿主如細菌宿主中表達。所述治療性多肽或其活性片段是含有至少一個糖基化位點、含有鑑別為蛋白酶抗性並稱為鑑別為蛋白酶抗性的掩蔽的is-HIT殘基的掩蔽殘基處含有一或多個胺基酸修飾的多肽，且所述治療性多肽或其活性片段與不含有所述一或多個胺基酸修飾的未修飾的治療性多肽或其活性片段相比顯示增加的蛋白酶抗性。所述掩蔽的is-HIT殘基可以是所述多肽糖基化位點0-25人之內如 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 人之內的is-HIT殘基。所述藥物組合物中的修飾的治療性多肽或其活性片段在掩蔽的is-HIT殘基處可以含有 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 或更多個胺基酸修飾。其在掩蔽的 is-HIT 殘基處可以含有 2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19,20或更多個胺基酸修飾。在藥物組合物的一些實施方案中，所述修飾的治療性多肽或其活性片段含有至少2個胺基酸修飾，其中2個胺基酸修飾在被不同糖基化位點掩蔽的掩蔽is-HIT殘基處。
所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以是細胞因子或其活性片段。細胞因子包括但不限於促紅細胞生成素(EPO)、白細胞介素-1 β (IL-I)、白細胞介素2 (IL-2)、白細胞介素3 (IL-3)、白細胞介素4 (IL-4)、白細胞介素5 (IL-5)、白細胞介素6 (IL-6)、白細胞介素 9(IL-9)、幹擾素-β (IFN-β)、幹擾素-γ (IFN-γ)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板生成素(TPO)、 白血病抑制因子(LIF)、幹細胞因子(SCF)、制瘤素M(OSM)和血管內皮生長因子(VEGF)。這種治療性多肽的例子是選自包括 SEQ ID NO :2，237274，276，278，280，282，284，286，288， 290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 任一個、其活性片段、或序列如 SEQ ID NO :2， 237274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 任一所示的多肽的其他變體的等位基因變體、種的多肽的任意多肽。
當所述修飾的治療性多肽或其活性片段是SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :237所示的促紅細胞生成素(EPO)或其與具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237所示序列的多肽具有至少或至少大約 60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或更高序列相同性的等位基因變體或種變體或其他變體。所述EPO多肽中的掩蔽is-HIT殘基可以在在選自N24，N38, N83和SU6的一或多個糖基化位點被糖基化掩蔽的殘基處。這種掩蔽的is-HIT殘基包括但不限於相應於SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237的胺基酸殘基的殘基 R14, L16, L17, E18, K20, E21, E23, E31, L35, E37, P42, D43, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93, D96, K97, P121, P122, D123, P129, L130, R131，D136，F138，R139，K140，L141，F142，R143和Y145或者在等位基因變體和種變體中的對應殘基或其他殘基。掩蔽的is-HIT殘基被修飾的多肽的例子包括修飾的EPO多肽或活性片段，其中所述修飾是選自 R14H, R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I，L91V，L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H 和 Y145I，如 K20Q, L80I, P90S, L93I, L93V, D96Q, D123N, L130I, R131H, R131Q, D136N, R139H, R139Q, R143H 和 R143Q,或K20Q，L80I, L93I，L93V和R139H和等位基因變體、種變體和其他變體中的對應修飾的一或多個胺基酸修飾。例如，所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以是修飾的ΕΡ0， 其中所述修飾選自 R139H ；L93I ；K20Q/R139H ；K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/ R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V ；R139H/ L93I ；K20Q ；K20Q/L93I ；L80I ；L93V ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V,如 R139H, R139H/K20Q, K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/ R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V和R139H/L93I，和等位基因變體、種變體和其他變體中的對應修飾。
所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以進一步含有在非掩蔽is-HIT殘基處的一或多個胺基酸修飾以及增加所述多肽的蛋白酶抗性或改變所述多肽的另一種性質或活性的其他修飾。當所述修飾的治療性多肽或其活性片段是促紅細胞生成素(EPO)多肽時，舉例的非掩蔽is-HIT殘基可以選自相應於SEQ ID NO :2或237的胺基酸殘基P2， P3, R4, L5, C7, D8, RIO, L12, E13, Y15, C29, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155，Y156，E159，R162，D165和R166，以及等位基因變體、種變體和其他變體中的對應修飾。在非掩蔽is-HIT殘基處的舉例修飾包括P2A，P3S，P3A，R4H，R4Q，L5I，L5V，C7S， C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I, W51S, W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和 R166Q，如 R4H ；F48I ； K52Q ；K116T ；R150H ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；和 L153V 或 R4H，K52N, L153V和E159N，以及等位基因變體、種變體和其他變體中的對應修飾。舉例的修飾的治療性多肽或其活性片段。這種修飾的治療性多肽或其活性片段的例子是具有選自 R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/ K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/ R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ； L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/ K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E 159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/ K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/K52N/ L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/ L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V；R4H/K20Q/L93I/ R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H；K20Q/L93V/ R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,如 R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ； R139H/E159N；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/ E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/ R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/ R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/ K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/L153V；K20Q/L93V/R139H/ R4H；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/ R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V；K20Q/L93I/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/ K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V；R4H/K20Q/ L93I/R139H/K52N；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/ L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N 或 K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ； K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/ L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/ R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E 159N ； K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/K52N；K20Q/L801/Rl39H/E159N/ L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L931/Rl39H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H/ L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N； R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H；K20Q/L93V/R139H/E159N/ K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,和特別是 K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N,以及等位基因變體、種變體和其他變體中對應修飾的修飾的那些。
配製為口服施用的藥物組合物中所述修飾的EPO多肽或其活性片段可以進一步在糖基化位點N24，N38和N83的一或多個處包括或多個氨基修飾，其中所述修飾消除了在所述位點處的糖基化。這種修飾包括在選自NMH，N38H, N83H, N24K, N38K和N8!3K的殘基處的胺基酸置換和等位基因變體、種變體和其他變體中的對應修飾。
本發明還提供了特定的修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽。在提供活性片段時，其中發生修飾。所述修飾的多肽可以被配製在藥物組合物中，包括用於口服和胃腸外施用或任何合適施用途徑的那些。所述修飾的EPO多肽和/或其活性片段可以用於治療易於用EPO治療的疾病或病症。除了下文所述的修飾，本文提供的所述修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽還可以包括在糖基化位點 N24，N38和N83的一或多個處的一或多個氨基修飾，其中所述修飾消除了所述位點處的糖基化，如選自NMH，N38H, N83H, N24K, N38K和N8!3K的胺基酸置換。
本文提供的所述修飾的EPO多肽包括長度是160，161，162，163，164，165或166個胺基酸的那些多肽。所述未修飾的EPO多肽可以是具有或含有SEQ ID NO :2或237所示胺基酸序列的多肽，或可以是與具有SEQ ID NO :2或237所示序列的多肽具有至少或至少大 ^ 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列相同性的等位基因變體或種變體或其他變體。所述修飾的EPO多肽或其活性片段可以保留所述未修飾多肽的一或多種活性。所述修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽可含有除了下述之外的修飾，其中所述修飾是羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化或與聚乙二醇(PEG)部分綴合的一或多種。所述修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽可含有除了下述之外的修飾，其中所述額外的胺基酸修飾導致所述修飾的治療性多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、氧化、PEG化或蛋白酶抗性發生改變。
本發明提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽，其在EPO多肽、其等位基因變體或種變體或其他變體的掩蔽的is-HIT殘基處含有一或多個胺基酸修飾，其中所述在掩蔽的is-HIT殘基處的一或多個胺基酸修飾選自相應於SEQ ID NO 2 或 237 所示殘基的 R14H，L16I, L16V, L17I，L17V，E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, P42S, D43Q, D43H, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, D123H, D136Q, D136H, D136N, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, R143H, R143Q和Y145H ；以及所述修飾的EPO多肽與不包含所述一或多個胺基酸修飾的未修飾的EPO多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。所述在上述掩蔽的is-HIT殘基任一處的修飾可以是一種修飾。
本發明還提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在EPO多肽、或其等位基因變體或種變體或其他變體的掩蔽的is-HIT殘基處含有兩或多個胺基酸修飾，其中所述兩或多個胺基酸修飾在掩蔽的is-HIT殘基處，選自相應於SEQ ID NO 2 或 237 所示殘基的 R14H，R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I，L91V，L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H 和 Y145I ；且所述修飾的EPO多肽與不包含所述兩或多個胺基酸修飾的未修飾的EPO多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。這種多肽的例子是含有任一如下修飾的那些K20Q/R139H ；K20Q/R139H/L93I ； L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；R139H/ L80I ；R139H/L93V；R139H/L93I ；K20Q/L93I ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V。
本發明還提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的EPO 多肽，其在EPO多肽、或其等位基因變體或種變體或其他變體的掩蔽的is-HIT殘基處含有一或多個胺基酸修飾以及在非掩蔽的is-HIT殘基處的進一步修飾，其中所述在掩蔽的 is-HIT殘基處的一或多個胺基酸修飾選自相應於SEQ ID N0:2或237所示殘基的R14H， R14Q, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I，R131H， R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V,F142I，F142V，R143H，R143Q，Y145H和Y145I ；所述在非掩蔽的殘基處的一或多個胺基酸修飾選自 P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I, C7T, D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I，W51S，W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和R166Q ；且所述修飾的EPO多肽與不包含所述兩或多個胺基酸修飾的未修飾的EPO多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。這種多肽和其活性片段的例子是含有選自如下修飾的任意多肽或片段:R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/ R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ； L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V ；K20Q/ E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V；R4H/K20Q/ K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N,如 K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/ L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；K20Q/ L93V/R139H/E159N/K52N。
本發明還提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽，其在EPO多肽修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽或其等位基因變體或種變體或其他變體中含有一或多個胺基酸修飾，其中所述修飾選自K20Q/ R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80U/R139H/L93I ； L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/K52N/L80I/R139H ；K20Q/ L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/ L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L93I ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/ R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H；K20Q/R139H/E159N ；K52N ；K20Q/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N；K20Q/L93I/ R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/ R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N；R4H/K20Q/ L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；K20Q/ L80I ；K20Q/L93V ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
本發明還提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在EPO多肽、或其等位基因變體、種變體或其他變體中含有兩或多個修飾，其中至少一個修飾是相應於SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :237所示胺基酸殘基的R4H。其他修飾可以選自 P2S, P2A, P3S, P3A, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, E37N, P42S, P42A, D43H, K45T, W51S, W51H, K52T, M54V, M54I，E62Q，E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q， D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q，E159H，E159N，D165H，R166H，和 R166Q，如 K20Q ；F48I ；K52Q ；L80I ；P90S ；L93V ；L93I ； D96Q ；K116T ；L130I ；R131H ；R131Q ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；D136N ；E159N ；K116N ； K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；L16I ；L16V ；R139H ；R139Q ；和 L153V 或 K20Q ； F48I ；K52Q ；L80I ；L93V ；L93I ；K116T ；L130I ；R131H ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；E159N ； K116N ；K45N ；K52N ；D165H ；D165N ；L16I ；R139H ；R139Q ；禾口 L153V。舉例的 EPO 多肽和其活性片段是具有在如下處的修飾或具有相應於如下的修飾的那些R4H/R150H ；R4H/R143H ； R4H/E159N；R4H/R139H；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/L153V；R4H/ K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ；R4H/ D123N；R4H/D136N；R4H/P90S ；R4H/D165Q；R4H/D165H；R4H/D165N；R4H/K116N；R4H/R143H ； R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H ；R4H/R143Q/R150H 和 R4H/L93I/E159N。
本發明還提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽， 其在SEQ ID NO :2或237所示多肽的等位基因變體或種變體或其他變體中或在位置上具有修飾。
修飾的EPO多肽在EPO多肽或其等位基因變體或種變體或其他變體中包含一或多個胺基酸修飾，其中所述修飾的EPO多肽選自R4H/R150H ；R4H/R143H ；R4H/E159N ；；R4H/L130I ；R4H/L153V；R4H/K20Q ；R4H/ F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N ；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ；R4H/D123N ；R4H/ D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N；R4H/R143H；R4H/R166H； R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H；R4H/R143Q/R150H ；R4H/L93I/ E159N。
本發明還提供了編碼本文提供的修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽任一的核酸分子。本發明提供了含有所述核酸分子的載體和含有所述載體和或核酸分子的細胞。所述細胞可以是原核細胞或真核細胞，包括哺乳動物細胞和藻類細胞。
本發明還提供了含有本文提供的修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和/或是其活性片段的多肽和/或所述核酸、載體和/或細胞任一的藥物組合物。所述藥物組合物可以配製為用於任何施用途徑，如用於口服、胃腸外、靜脈內，皮內、皮下、口腔、吸入、黏膜內、直腸或局部施用。例如，所述組合物可以是液體、乳液、懸浮液、氣霧劑、片劑、錠劑或包囊的形式，如腸溶包衣的片劑或包囊。所述藥物組合物可以配製用於口服施用至胃腸道。
在本文所有實施方案中，包括藥物組合物和方法和修飾的多肽的如下實施方案可以選擇。當所述修飾的治療性多肽是EPO時，其長度可以是160，161，162，163，164，165或 166個胺基酸。所述未修飾的多肽可以是胺基酸序列如SEQ ID NO :2或237所示的EPO多肽。所述顯示增加的蛋白酶抗性的修飾的治療性多肽可以保留與修飾的治療性多肽在相同條件下的未修飾的治療性多肽的一或多種活性或其他性質，包括當所述未修飾的治療性多肽是完全糖基化的。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以對消化道的蛋白酶顯示增加的蛋白酶抗性。所述增加的蛋白酶抗性可以通過所述修飾的治療性多肽在其口服施用或存在於消化道中時來顯示。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以包括進一步的修飾，包括例如羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化、或與聚乙二醇(PEG)部分綴合的一或多種。所述修飾的治療性多肽或其活性片段可以含有導致修飾的治療性多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、氧化、 PEG化或蛋白酶抗性發生改變的一或多個額外的胺基酸修飾。
所述藥物組合物可以配製為固體、液體、凝膠或其他形式。當組合物配製為用於口服施用時，其可以配製為片劑或包囊，如腸溶包衣的片劑或包囊是腸溶包衣的。
本發明提供了治療方法，其中給對象施用本文提供的任意藥物組合物以治療易於用特定治療性多肽治療的疾病或病症。所述組合物可以任何合適途徑施用，包括但不限於胃腸外，如皮下，以及口服至消化道或配製為經口或鼻的黏膜施用。當所述修飾的治療性多肽或其活性片段是修飾的促紅細胞生成素(EPO)時，易於用EPO治療的疾病或病症包括伴隨腎衰竭、AIDS、惡性疾病和慢性炎症的貧血；圍手術期手術；鐵超載病症；異常止血；組織保護治療；神經性障礙；和自體捐血。貧血可以是地中海貧血，鐮刀細胞貧血，早產兒貧血， 伴隨順鉬化療的貧血，和大劑量放療和/或化療加骨髓移植後貧血。
附圖簡述

圖1顯示表示為帶狀的促紅細胞生成素的兩個視圖(A和B)。3個N-連接的糖基化位點NM，N38和N83以及被選用於修飾蛋白酶抗性的代表性相應的殘基(分別為K20Q， R139H和L80I)通過填充圖中的空白來顯示。被選用於蛋白酶抗性的另外的殘基也通過填充圖中的空白顯示(例如，R4H，L153V，E159N)。
圖2是鑑別為蛋白酶抗性的非掩蔽和掩蔽的is-HIT殘基的卡通圖示。所述非掩蔽殘基在暴露於蛋白酶解的位點並且可以是被突變以賦予對蛋白酶解增加的抗性的位點。所述掩蔽殘基是通過糖基化被正常屏蔽的位點，但是在所述多肽去糖基化時變成暴露的。所述掩蔽殘基是可以被突變以賦予對蛋白酶解增加的抗性的位點，且在所述多肽去糖基化或部分糖基化時(例如糖基化位點突變時，在不能糖基化的宿主中表達和/或在體內施用時暴露於葡糖苷酶)的狀態下對蛋白酶講解提供保護。所述圖是僅用來舉例的促紅細胞生成素(EPO)的卡通圖示，但是掩蔽和非掩蔽的is-HIT殘基可以在任何糖基化的治療性多肽中鑑別。
發明詳述 結構概述 A.定義 B.促紅細胞生成素(EPO) C.修飾的EPO多肽顯示增加的蛋白酶抗性 1.蛋白酶抗性 a.絲氨酸蛋白酶 b.基質金屬蛋白酶 C.通過去除蛋白酶解位點對蛋白酶解增加的抗性 d.修飾的EPO LEAD多肽顯示增加的蛋白酶抗性 2.Super-LEAD 3.其他EPO修飾 a.免疫原性 b.糖基化 C.額外或可選擇的修飾 D.通過治療性多肽的蛋白酶抗性修飾缺失的糖基化的補償 1.鑑別掩蔽殘基的方法 2.在掩蔽位點含有蛋白酶抗性修飾的EPO多肽 3.在掩蔽位點含有蛋白酶抗性修飾的其他治療性多肽 a.GM-CSF b.M-CSF C.G-CSF d.LIF e.白細胞介素1β f.白細胞介素2 g·白細胞介素3 h.白細胞介素4 i.白細胞介素5 j·白細胞介素6 k.制癌蛋白M 1.幹細胞因子 m.幹擾素β η.幹擾素Y 4.治療性多肽的其他修飾 a.增加溶解度的修飾 E.進化或修飾EPO多肽和其他修飾的治療性多肽的示例方法 1.非限制性理性誘變一維(ID)-掃描 2.二維QD)理性掃描(限制理性誘變) a.鑑別 in-silico HIT b.鑑別置換胺基酸 c.構建突變蛋白和生物學測定 3.三維(3D)掃描 a.同源性 b.3D-掃描(結構同源性)方法 4.Super-LEAD 禾口累力口定向誘變(additive directional mutagenesis) (ADM) 5.多重疊引物延伸 F.對蛋白酶解具有增加的抗性的EPO變體的評估 G.生產EPO多肽和其他治療性多肽 1.表達系統 a.原核表達 b.酵母 c.昆蟲和昆蟲細胞 d.哺乳動物細胞 e.植物 2.純化 3.融合蛋白 4.多肽修飾 5.核苷酸序列 H.評估修飾的EPO多肽性質和活性 1.體外測定 2.非人動物模型 3.臨床測定 I.配製/包裝/施用 1.施用修飾的EPO多肽和其他修飾的治療性多肽 2.施用編碼修飾的EPO多肽或其他修飾的治療性多肽的核酸(基因治療) J.治療應用 1.貧血 2.組織保護性治療 K.診斷應用 L.組合治療 M.產品和試劑盒 N.修飾的EPO多肽和其他修飾的治療性多肽的抗體 0.實施例 A.定義 除非另有說明，所有技術和科學術語都具有本領域技術人員常見的含義。所有專利，專利申請，公開出版物，GenBank序列，網站以及其他公開材料除非另有說明包含在此作為參考。如果本發明的術語有多種定義，以本部分中為準。描述URL或其他鑑定子或地址時，應理解所述鑑定子可改變並且網際網路上的具體信息隨時更新，相關信息可通過搜索網際網路找到。其公開內容可作為公眾所得的依據。
本發明中，「治療性多肽」是給動物諸如人對象施用的多肽，用於治療疾病或病症。 治療性多肽是本領域已知的，通常是具有體內活性的多肽，諸如細胞因子(例如，促紅細胞生成素(EPO))，並可經研究治療疾病或病症(即緩解疾病或病症的症狀)。所述多肽可通過任何方法製備，由此包括但不限於，重組產生的多肽，合成產生的多肽，治療性多肽，其提取自細胞或組織和其他來源。從任何來源分離或製備的成熟治療性多肽長度不同。治療性多肽的異源性根據所述治療性多肽的來源不同。由此治療性多肽指製備或分離的異源群體。 同源製備物將說明其為同源的。治療性多肽還涉及它們的單體、二聚體或其他形式的多聚體。
人治療性多肽包括等位基因變體同種型，編碼核酸分子產生的合成分子，分離自人組織和細胞的蛋白，合成蛋白及其修飾形式。示例性未修飾的成熟人治療性多肽包括但不限於，未修飾的和天然(即野生型)治療性多肽和包含信號肽的未修飾的以及天然前體治療性多肽和/或原肽，以及多形性天然治療性多肽。其他示例性人治療性多肽是在N-或 C-末端截短的那些。
治療性多肽也包括治療性多肽的等位基因變體或種變體，以及其截短形式或片段，其中含有除增加蛋白酶抗性的修飾以外的修飾。治療性多肽包括來自不同物種的同源多肽，包括但不限於動物，包括人和非人物種，諸如其他哺乳動物。與人治療性多肽一樣， 非-人治療性多肽也包括足夠長的治療性多肽的不同長度或片段或部分或包括保持全長成熟多肽的至少一種活性的適當區域。
非-人治療性多肽包括治療性多肽，等位基因變體同種型，從核酸製備的合成分子，從非人組織和細胞分離的蛋白，以及其修飾的形式。非人來源的治療性多肽包括但不限於，牛，綿羊，豬，馬，鼠，野兔，犬，貓，禽和其他靈長類，諸如黑猩猩和短尾猿來源的治療性多肽。
本發明中，「天然治療性多肽」指存在天然生物體中天然存在的基因編碼的治療性多肽，所述生物體包括人或其他動物。天然治療性多肽包括編碼的前體多肽，其片段或加工的形式，諸如缺乏信號肽的成熟形式以及任何翻譯前或翻譯後加工或修飾的形式。天然治療性多肽還包括經過翻譯後修飾的那些，所述修飾包括但不限於通過糖基化，羧化，羥基化，hasylation,氨甲醯化，硫酸化，和磷酸化修飾的那些。
本發明中，非-糖基化的多肽是不具有糖基化的多肽(即不含附著於蛋白糖基化位點的碳水化合物部分)。非糖基化多肽通過在宿主諸如原核宿主中表達產生，所述的宿主不糖基化所述多肽，或通過消除所有糖基化位點(例如糖基化位點突變)產生。
本發明中，糖基化位點指多肽中可連接碳水化合物部分的氨基位置。通常糖基化蛋白含有一或多個胺基酸殘基，諸如精氨酸或絲氨酸以連接碳水化合物部分。
本發明中，完全糖基化的多肽是在該多肽中所有天然糖基化位點均被糖基化的多肽。
本發明中，去糖基化的多肽與天然糖基化蛋白相比糖基化減少，因為其中附著多肽的碳水化合物部分較少，諸如由於通過突變去除了較少直到所有糖基化位點。去糖基化的多肽也包括其中一或多個碳水化合物部分通過化學或酶裂解去除或部分去除的多肽。
本發明中，天然糖基化位點指天然多肽天然生成時其中連接碳水化合物部分的氨基。
本發明中，「天然多肽」指生物體包括人或其他動物中天然存在的基因編碼的多肽。
本發明中，術語「在相同條件下產生」指利用相同的生產方法產生每種多肽來製備兩或多種多肽。
本發明中，「促紅細胞生成素」多肽(EPO)指任何促紅細胞生成素多肽，包括但不限於，重組產生的多肽，合成產生的多肽，天然EPO多肽，從細胞以及組織提取的促紅細胞生成素多肽，所述組織包括但不限於腎、肝、尿和血液。促紅細胞生成素的其他名稱包括印oietin。促紅細胞生成素簡稱包括EPO，hEPO (人促紅細胞生成素)，和rhuEP0(重組人促紅細胞生成素)。促紅細胞生成素包括不同物種的相關多肽，包括但不限於人或非人源動物。人促紅細胞生成素(hEPO)包括促紅細胞生成素，等位基因變體同種型，來自核酸的合成分子，分離自人組織和細胞的蛋白質，及其修飾形式。示例性未修飾的成熟人促紅細胞生成素多肽包括但不限於，未修飾的野生型天然促紅細胞生成素多肽(諸如包含序列SEQ ID NO :2或237的多肽)以及未修飾的包括信號肽的野生型前體促紅細胞生成素多肽(例如， SEQ ID N0:1的前體EPO多肽)。本領域技術人員理解成熟促紅細胞生成素多肽(SEQ ID NO 2)的位置與前體EPO多肽SEQ ID NO 1相差27個胺基酸殘基，SEQ ID NO :1是含有信號肽序列的促紅細胞生成素多肽。SEQ ID NO :2的第1個胺基酸殘基「對應」SEQ ID NO=I 的第觀個胺基酸殘基。術語「促紅細胞生成素」也包括從成熟EPO多肽(SEQ ID NO 2)通過蛋白酶解裂解C末端精氨酸製備的促紅細胞生成素多肽或C末端精氨酸已經去除的重組 EPO多肽(例如，SEQ ID NOS :236 (前體)和237 (成熟))。本發明的EPO多肽可進一步修飾，諸如通過化學修飾或翻譯後修飾。所述修飾包括但不限於，PEG化，白蛋白化，糖基化， 法尼基化(farnysylation)，羧化，羥基化，hasylation，氨甲醯化，硫酸化，磷酸化，和其它已知多肽修飾。本發明的EPO多肽可通過對一級胺基酸序列的缺失、添加或取代一或多個胺基酸進一步修飾。
任何物種的促紅細胞生成素包括促紅細胞生成素(本發明中，種變體)，包括人和非-人物種。非-人來源EPO多肽包括但不限於，鼠、犬、貓、野兔、禽、牛，綿羊，豬，馬， 魚，蛙和其他靈長類的促紅細胞生成素多肽。示例性非-人來源EPO多肽包括，例如，獼猴 (Macaca mulatta，例如，SEQ ID N0:202)，小鼠(Mus musculus，例如，SEQ ID N0:203)，大鼠(Rattusnorvegicus，例如，SEQ ID NO :204)，豬(Sus scrofa，例如，SEQ ID NO :205)， 犬(Canis familiaris，例如，SEQ ID NO :206)，貓(Felis catus，例如，SEQ ID NO :207)， 兔(Oryctolagus cuniculus，例如，SEQ ID NO :208)，公牛(Bos taurus，例如，SEQ ID N0:209)，馬(Equus caballus，例如，SEQ ID N0:210)，綿羊(Ovis aries，例如，SEQ ID NO: 211)，黑猩猩(Pan troglodytes，例如，SEQ ID NO :212)，斑馬魚(Danio rerio，例如， SEQ ID NO :213)，日本河飩魚(Takifugu rubripes，例如，SEQ ID NO :214)，猩猩(Pongo pygmaeus，例如，SEQ ID NO :225)，大猩猩(Gorilla gorilla，例如，SEQ ID NO :226)等 (例如，SEQ ID NOS :215-224)。通常，人EPO多肽種變體與人EPO多肽相比具有至少40%， 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高胺基酸相同性。
人和非-人EPO多肽包括EPO多肽，等位基因變體同種型，組織特異性同種型和等位基因變體，具有一或多個胺基酸突變、取代、缺失、插入或添加的合成變體，通過翻譯核酸製備的合成分子，分離自人和非人組織和細胞的蛋白，嵌合EPO多肽及其修飾形式。人和非-人EPO也包括足夠長的EPO的片段或部分或包括適宜區域以保持全長成熟多肽的至少一種活性。另外，本發明中的修飾EPO多肽的片段或部分包含一或多個本發明所述的胺基酸修飾(例如表3所示胺基酸修飾)。
本發明中，「成熟促紅細胞生成素」指缺乏信號序列的EPO多肽。通常信號序列靶向蛋白用於通過內質網(ER)高爾基途徑分泌並在插入ER中之後的翻譯過程中被裂解。因此，成熟EPO多肽通常是分泌型多肽。一個實例中，成熟人EPO多肽如SEQ ID N0:2所示。 SEQ ID NO 2所示胺基酸序列與SEQ ID NO 1所示前體多肽的區別在於SEQ ID N0:2缺少信號序列，所述信號序列包括SEQ ID NO 1的殘基1-觀。
本發明中，「天然促紅細胞生成素」指存在生物體包括人或其他動物中的天然EPO 基因編碼的EPO多肽。天然EPO多肽包括編碼的前體多肽，其片段，以及加工的形式，諸如缺乏信號肽的成熟形式以及任何翻譯前或翻譯後加工的或修飾的形式。例如，人表達ΕΡ0。 示例性天然人EPO序列是SEQ ID NO 1(具有信號肽的前體ΕΡ0)和SEQ ID NO 2 (缺乏信號肽的成熟ΕΡ0)。天然EPO多肽還包括經翻譯後修飾的那些，包括但不限於通過糖基化，羧化，羥基化，hasylation，氨甲醯化，硫酸化，和磷酸化修飾。天然EPO多肽也包括在SEQ ID NO 2的R166發生蛋白酶解裂解的那些。其他動物產生天然ΕΡ0，包括但不限於，靈長類，小鼠，大鼠，豬，狗，貓，兔，雞，牛，羊，蛙和魚。其他動物的示例性天然EPO序列如SEQ ID NOS 202-226 所示。
本發明中，「蛋白酶-抗性多肽」是與天然或野生型多肽相比其一級胺基酸序列中包含一或多種修飾並與沒有所述一或多個胺基酸取代的天然或野生型多肽相比顯示增加的蛋白酶解抗性的蛋白。
本發明中，經對一級結構的改變進行修飾而具有蛋白酶抗性的多肽指在多肽的一級序列中的一或多個胺基酸修飾的多肽，其賦予蛋白酶抗性。其中包括不導致在該位點的翻譯後修飾的改變。
對蛋白酶抗性增加可通過檢測暴露於胃腸道和/或血清中的具體蛋白酶之後的活性來評估。通常與缺乏賦予所述抗性的胺基酸序列中的改變的相同多肽相比，蛋白酶抗性增加至少約 1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，20%，30%，40%，50%， 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300%,400%, 500%,或更多。其他實施方案中，與缺乏賦予抗性的胺基酸序列改變的相同多肽相比，口服配製劑中變體多肽的蛋白酶抗性增加至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍，200倍，300倍， 400倍，500倍，600倍，700倍，800倍，900倍，1000倍，或更多。
本發明中，「蛋白酶解抗性」指多肽被蛋白酶解劑的裂解的任何量的降低，諸如蛋白酶。這可通過修飾易被具體蛋白酶裂解的多肽中的具體胺基酸殘基使得該多肽與沒有所述修飾的多肽在相同蛋白酶、相同條件下相比對裂解的易感性降低。顯示蛋白酶解抗性增加的修飾的多肽與缺乏所述胺基酸修飾的相同多肽相比顯示例如，1^,2% ,3^,4^,5%, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %,或更多的蛋白酶解抗性。
本發明中，「蛋白酶，」 「蛋白質酶」或「肽酶」可互換使用，指催化共價肽鍵的水解的酶。蛋白酶包括，例如，絲氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶或絲氨酸內肽酶構成一類肽酶，特徵是存在位於酶活性中心的絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶參與機體的多種功能，包括血液凝結、炎症以及原核生物和真核生物中的消化酶。「絲氨酸蛋白酶」裂解的機制基於絲氨酸對靶肽鍵的親核攻擊。半胱氨酸，蘇氨酸或與天冬氨酸或金屬結合的水分子也起到這樣的作用。絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的排列的側鏈形成大多數絲氨酸蛋白酶常見的催化三體。絲氨酸蛋白酶活性位點形狀是裂縫狀，其中結合有多肽底物。多肽底物N 末端到C末端的胺基酸殘基標記為(Pi,…，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，…，Pj)。代表性結合亞位點被標記(Si，...，S3，S2，S1，S1'，S2'，S3'，...，Sj)。裂解在Pl和PI，之間催化。
本發明中，基質金屬蛋白酶(MMP)指任何家族的金屬依賴性，諸如Si2+-依賴性，內肽酶，其降解細胞外基質(ECM)的組分。MMP包括四個類型膠原蛋白酶，基質降解酶，膜型金屬蛋白酶以及明膠酶。MMP和纖溶酶原激活物的蛋白裂解活性，以及其抑制物，對於保持 ECM完整性是重要的。細胞-ECM反應影響並介導多種過程，包括各種細胞類型的增殖，分化，粘附以及遷移。MMP也加工多種細胞表面因子，受體和其他可溶蛋白並參與組織重構，諸如創傷癒合，懷孕和血管生成。在體內生理條件下，MMP作為非活性前體(酶原)合成並被裂解以產生活性形式。此外，所述酶被稱為基質金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的內源性抑制物特異性調節。
本發明中，相應的殘基指與等位基因變體或種變體或其他同種型多肽相比而言的殘基。本領域技術人員可輕易鑑定所述多肽中的相應殘基。例如，通過排列EPO多肽的序列，本領域技術人員可鑑定相應的殘基，利用保守且相同的胺基酸殘基作為指引。例如，SEQ ID N0:2(成熟促紅細胞生成素)的Al對應SEQ ID NO :1 (前體促紅細胞生成素，其具有信號肽序列)的A28。另外的情況中可鑑定相應的區域。本領域技術人員可利用保守胺基酸作為指引發現人和非人序列中的相應胺基酸殘基。例如，前體人EPO SEQ ID N0:1的殘基 P148(成熟人EPO SEQ ID NO :2的殘基P121)對應前體小鼠EPO SEQ ID NO :203中的殘基 P147。
本發明中，促紅細胞生成素(EPO)多肽或其他治療性多肽的「活性部分或片段」指多肽的部分，其包括至少一種本發明的修飾並顯示活性，諸如全長多肽的一或多種活性或具有其他活性。例如，對於EPO多肽，所述活性包括但不限於，紅細胞生成或組織保護活性。 活性可為全長多肽活性的百分數(更多或更少)，包括但不限於與全長多肽相比1%，2%，3%,4%,5%, 10%, 20%, 30%,40%, 50%,60%, 70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 的活性，或更高的活性。所述活性可通過經驗確定。確定EPO多肽或其他修飾的治療性多肽的功能或活性的實驗包括本領域已知的那些，本發明中也進行了舉例說明。EPO多肽的測定包括，例如，但不限於紅細胞增殖實驗，細胞存活實驗或臨床試驗以測定治療性益處。活性也包括EPO多肽的片段或修飾的形式或其他修飾的治療性多肽具有而全長多肽或未修飾的EPO多肽不具有的活性。
本發明中，「未修飾的靶蛋白，」 「未修飾的蛋白，」 「未修飾的多肽，」 「未修飾的ΕΡ0，」 「未修飾的治療性多肽」以及其語法變體指這樣的起始多肽，其被選用於本發明所述的修飾。起始靶多肽可為天然存在的野生型多肽。此外，起始靶多肽可改變或突變，從而與天然野生型同種型不同，但相對於修飾的多肽在本文也稱為起始未修飾靶多肽。因此，本領域已知的存在蛋白被修飾從而與未修飾的參比多肽相比具有所需的具體活性或性質的增加或降低可被選出並用作起始未修飾靶蛋白。例如，這樣的蛋白可為靶蛋白通過一或多個但胺基酸改變對其天然形式修飾並具有所需的性質的增加或降低，諸如免疫原性降低(見例如，美國專利申請2004-0063917，2005-0220800，2006-035322，和 2006-0073563)或改變其胺基酸殘基以改變糖基化，在本文稱為未修飾的蛋白，以相同或不同性質的進一步修飾。本領域已知的示例性修飾的EPO多肽包括任何EPO多肽例如，美國專利 4，703，008，4，835，260，5，457，089，5，614，184，5，856，298，6，831，060，6，555，343， 6，831，060，和 7，041，794 ；美國專利申請 2004-0063917，2005-0107591，2005-0176627， 2006-029094,和 2006-0008872 ；國際專利公開 W08603520, EP0640619, W004003176, EP1228214, W005103076, W09424160W09012874 中所述的那些。
現有技術中已知的現存蛋白質可以如本文所述選擇和使用以鑑別在其它結構同源的靶蛋白質上的結構同源的基因座，所述現存蛋白質先前已被修飾以在特定生物學活性或性質中與未修飾的或參考蛋白質相比具有希望的改變如增加或降低。例如，已通過一或多個單胺基酸變化修飾並具有希望的性質或活性例如對蛋白酶解的抗性的增加或降低的蛋白質可以用於本文提供的方法中，以在結構同源的靶蛋白質上鑑別相應的結構同源的基因座，所述基因座可以用合適的置換胺基酸置換並測試其希望的活性的增加或降低。
如本文所用，EPO多肽或其他治療多肽的「活性」或「功能活性」是指由所述多肽顯示的任何活性。這種活性可以憑經驗確定。對於EPO多肽，這種活性包括但不限於促紅細胞生成或組織保護活性。活性可以用已知的測定體外或體內評估。例如，對於EPO多肽，活性可以通過體外或體內測量紅細胞增殖而評估。這種測定的表明多肽顯示活性的結果可以與多肽的體內活性相關，其中體內活性可以被稱為治療活性或生物學活性。修飾的多肽的活性可以是未修飾多肽活性的任何百分比水平，包括但不限於與未修飾多肽相比的活性、 2%,3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多活性。用於確定EPO修飾形式的功能性或活性的測定是本領域技術人員已知的。舉例性的評估EPO多肽活性的測定包括促紅細胞生成測定，其測量紅細胞增殖並在實施例中描述。
如本文所用，「治療活性」是指治療多肽的體內活性。通常，治療活性是用於治療疾病或病症的活性。修飾多肽的治療活性可以是未修飾多肽的治療活性的任何百分比水平，包括但不限於與未修飾多肽相比的1%活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%, 200 300%,400%, 500 %或更多治療活性。
如本文所用，糖基化對於「治療活性是所需的」或「對於治療活性是重要的」是指多肽的糖基化形式具有比治療多肽的去糖基化或非糖基化形式(即未糖基化的多肽形式， 如在細菌宿主中表達的多肽)更高的治療活性(當施用時的體內活性)。例如，如果糖基化多肽的治療活性高於非糖基化形式，特別是非糖基化形式不能用於治療時，糖基化是治療活性所需的。這種活性差異依賴於蛋白質，但是本領域技術人員能認識到特定蛋白質是否適合治療用途。這種蛋白質的舉例是促紅細胞生成素(EPO)，其是糖基化蛋白，並且作為糖基化蛋白治療性施用。糖基化治療蛋白形式與非糖基化形式的活性差異如所述依賴於蛋白質，但是可以比治療多肽的去糖基化或非糖基化形式的治療活性高15 %、25 %、30 %、50 %、 100%，包括至少或大約1倍，至少或大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、 20 倍、30 倍、40 倍、50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、 600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。
如本文所用，「顯示至少一種活性」或「保持至少一種活性」是指由修飾的多肽如修飾的EPO多肽或其它治療多肽顯示的與不含修飾的多肽相比的活性。保持未修飾多肽的活性的修飾多肽可以顯示改良的活性或保持未修飾多肽的活性(例如，EPO多肽的促紅細胞生成或組織保護活性)。在一些情況中，修飾多肽可以保持與未修飾多肽相比增加的活性。在一些情況中，修飾多肽可以保持與未修飾多肽相比降低的活性。修飾多肽的活性可以是未修飾多肽活性的任何百分比水平，包括但不限於與未修飾多肽相比的活性、2%、 3%,4%,5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高活性。例如，修飾 EPO 多肽保持至少大約或 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少 99% 的未修飾多肽的活性。在其它實施方案中，活性變化高於未修飾多肽至少大約2倍、3倍、4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、 200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。保持活性的測定取決於待保持的活性。這種測定可以體外或體內進行。活性可以例如用現有技術已知並且在下述實施例中描述的測定測量，例如但不限於細胞增殖和細胞存活活性。與未修飾多肽相比修飾多肽的活性也可以基於在施用多肽後體內治療或生物學活性或結果評估。例如，對於EPO多肽，這種活性包括但不限於血細胞比容水平、網織紅細胞計數、紅細胞質量、 血漿鐵周轉率、骨髓通過時間(marrow transit time)或血紅蛋白濃度(即血紅蛋白C合成刺激)或網織紅細胞應答刺激中的改變。
如本文所用，促紅細胞生成素或其它治療多肽的「性質」是指促紅細胞生成素多肽或治療多肽顯示的任何性質。這種性質包括但不限於蛋白質穩定性、蛋白酶解抗性、構象穩定性、熱耐受性及PH條件耐受性。性質變化可以改變多肽的「活性」。例如，治療多肽的蛋白酶抗性的變化可以改變體內治療多肽。
如本文所用，「蛋白質穩定性」是指在一或多種條件下增加的蛋白質半壽期，所述條件包括但不限於暴露於蛋白酶、增加溫度、特定PH條件和/或暴露於變性成分。由多肽顯示的增加的蛋白質穩定性可以體現為增加的蛋白酶抗性或增加的構象穩定性如增加的溫度、PH耐受性或對其它變性成分的耐受性。顯示體外或體內增加的蛋白質穩定性的修飾多肽比修飾多肽更穩定例如1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 100%,200%,300%,400%,500%或更高。多肽的蛋白質穩定性例如可以在蛋白酶抗性或構象穩定性(例如對溫度變化的抗性)測定中評估以確定多肽的活性是否改變，如下述實施例所述。例如，修飾多肽與野生型多肽相比對蛋白酶(例如α-胰凝乳蛋白酶，羧肽酶， 內蛋白酶Arg-C，內蛋白酶Asp-N，內蛋白酶Glu_C，內蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶)酶解的抗性可以憑經驗測試，其是通過用蛋白酶處理多肽一定時間，然後測試多肽的殘餘功能活性如促紅細胞生成或組織保護活性。
如本文所用，「血清穩定性」是指血清中的蛋白質穩定性。
如本文所用，「蛋白酶解抗性」是指蛋白酶解劑如蛋白酶對多肽裂解的任何量的降低。這可以通過修飾對特定蛋白酶裂解敏感的特定胺基酸殘基以使它們與在相同條件下由相同蛋白酶的裂解相比對裂解較不敏感。顯示增加的蛋白酶解抗性的修飾多肽顯示例如比未修飾多肽高 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%, 60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300 %、400 %、500 %或更多的蛋白酶解抗性。
如本文所用，「蛋白酶敏感位點」是多肽中對特定蛋白酶裂解敏感的胺基酸位置。 蛋白酶敏感位點在本文中與蛋白酶識別位點或蛋白酶裂解位點互換使用。
如本文所用，「構象穩定性」是指多肽對變性的耐受性的任何量的增加。這可以如下實現修飾對變性條件敏感的特定胺基酸殘基以使它們在相同條件下對變性較不敏感。 構象穩定性可以通過評估多肽對變性條件的抗性或易感性而確定，例如對溫度或PH的抗性。顯示增加的構象穩定性的修飾多肽顯示例如高於未修飾多肽1%、2%、3%、4%、5%、 6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多的抗性。
如本文所用，「變性」是指蛋白質結構中的任何非共價變化。這一變化可以改變多肽分子的二級、三級和/或四級結構。多肽的變性可以通過例如但不限於暴露於離液劑如脲和鹽酸胍、去汙劑、溫度、PH和裂解二硫橋的試劑如二硫蘇糖醇而實現。
如本文所用，「熱耐受性」是指任何溫度影響的或依賴的蛋白質穩定性的變化。例如，一種變化如增加的熱耐受性，可以反映在暴露於改變的(特別是增加的)溫度之後或與相同條件下的未修飾蛋白質相比降低的多肽變性的量。顯示增加的熱耐受性的修飾多肽顯示出在變化的溫度下與未修飾多肽相比高1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%,99%,100%,200%,300%,400%,500%或更高的穩定性。例如，修飾多肽當給對象施用時可以顯示與未修飾多肽相比增加的體內熱耐受性，由此顯示增加的血清半壽期。
如本文所用，"EC5tl」是指產生一半的最大應答所需的治療多肽的有效濃度。為本文目的，所測量的應當是EPO的任何活性，例如但不限於在促紅細胞生成或組織保護測定中的活性。
如本文所用，「半壽期」是指測量的參數如多肽分子的效力、活性和有效濃度下落到其原始水平的一半如其在0時間點的原始效力、活性或有效濃度的一半所需的時間。因此，多肽分子的參數如效力、活性或有效濃度通常隨時間測量。為本文目的，半壽期可以體外或體內測量。例如，治療多肽或修飾的治療多肽的半壽期可以體外測量，即在一定條件下，例如在暴露於蛋白酶或變性條件如溫度或PH下評估在保溫後隨時間增加的活性(例如促紅細胞生成或組織保護活性)。在另一個實施例中，治療多肽或修飾的治療多肽的半壽期可以在將多肽施用(例如靜脈內、皮下、十二指腸內、口服)給人類或其它動物後體內測量， 隨後隨時間取血樣以確定血樣中多肽的剩餘有效濃度和/或活性。
如本文所用，「治療多肽介導的疾病或病症」是指任何這樣的疾病或病症，其中用治療多肽(或修飾的治療多肽)治療改善了該疾病或病症的任何症狀或表現。
如本文所用，「促紅細胞生成素或EPO介導的疾病或病症」是指任何這樣的疾病或病症，其中用促紅細胞生成素(或修飾的促紅細胞生成素)治療改善了該疾病或病症的任何症狀或表現。舉例的促紅細胞生成素介導的疾病或病症包括但不限於貧血如慢性炎症、 腎衰竭、AIDS、惡性腫瘤導致的貧血或使用EPO多肽的組織保護活性以在應答性哺乳動物細胞、組織或器官損傷後保護抗損傷或功能恢復的疾病或病症。
如本文所用，「治療」患有疾病或病症的對象是指對象的症狀部分或完全減輕，或者在治療後保持穩定。因此治療包括預防、治療和/或治癒。預防是指防止潛在疾病或病症和/或防止症狀惡化或疾病或病症的進展。防止疾病或病症包括減輕或消除導致疾病或病症發生的一或多種風險因子。治療還包括本文提供的修飾的治療多肽和口服組合物的任何藥物學應用。
如本文所用，治療包括預防、治療和/或治癒。例如，治療包括本文提供的修飾的促紅細胞生成素或其它治療多肽及本文提供的其組合物的任何藥物學應用。
如本文所用，預防是指防止潛在疾病和/或防止症狀惡化或疾病的進展。
如本文所用，防止是指絕對防止特定疾病或病症。因為通常不能確定疾病或病症是否從未發生，因此防止還包括降低發生或患有疾病或病症的風險。
如本文所用，不包括外源加入的蛋白酶的組合物是未添加蛋白酶而配製的組合物。組合物中存在的任何另外的蛋白酶產生自配製方法。
如本文所用，「施用的治療有效量」或「治療有效劑量」是指至少足以在對象中產生治療作用的劑量配製品(dosage formulation)中的藥劑、化合物、材料的量。典型地，所述的量足夠高，以在血液中達到治療有效量。要達到的血液中的治療有效量對於方法中採用的許多治療多肽是已知的，針對未修飾多肽已建立劑量配製品有效劑量。對於修飾蛋白質， 用於治療的蛋白酶抗性多肽的治療有效量將根據被治療的特定條件、被治療的患者的年齡及物理條件、病症的嚴重性、治療持續時間、並行治療的性質、採用的特定蛋白酶抗性多肽、 特定的藥物學可接受賦形劑和/或主治醫師的知識和技能範疇內的因素而變化。
如本文所用，術語「藥物學可接受賦形劑」包括任何本領域技術人員已知的生理學惰性、藥物學無活性材料，其與選擇使用的特定蛋白酶抗性多肽的物理化學特徵相容。藥物學可接受賦形劑包括但不限於聚合物、樹脂、增塑劑、填充劑、潤滑劑、溶劑、共溶劑、緩衝系統、表面活性劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、藥物級染料或顏料及粘度劑。本文描述的藥物組合物中含有的藥物學可接受賦形劑的全部或部分可以是腸溶包衣的部分。
如本文所用，治療多肽的「 口服施用」或「 口服遞送」是指通過攝食而將治療多肽施用給胃腸道。典型地，本文提供的用於口服施用的組合物與黏膜遞送不同之處在於治療多肽被遞送至低位腸道以吸收進血液。
如本文所用，術語「低位腸道」是指小腸和大腸。
如本文所用，「黏膜施用」或「黏膜遞送」治療多肽是指將治療多肽施用黏膜表面， 包括鼻、肺、陰道、直腸、尿道和舌下或頰遞送。
如本文所用，「口腔黏膜(oromucosal)，，是指口腔和/或鼻咽腔的黏膜層。
如本文所用，術語「腸溶包衣」涉及藥物學可接受賦形劑的混合物，其施加於蛋白酶抗性多肽、與蛋白酶抗性多肽組合、與蛋白酶抗性多肽混合或其它方式加入到蛋白酶抗性多肽。腸溶包衣實現在低位腸道釋放蛋白酶抗性多肽並防止片劑、膠囊劑或其它口服劑型的早期消化或降解。包衣可以施加於蛋白酶抗性多肽的壓縮片劑、明膠膠囊和/或珠、顆粒(granules)、顆粒(particles)或凍乾粉末，所述凍乾粉末被包在澱粉或明膠膠囊中或壓縮成片劑。
因此，腸溶包衣可以施加於壓縮片劑，該壓縮片劑含有蛋白酶抗性多肽的顆粒 (granules)、顆粒(particles)或凍乾粉末；但是在顆粒(granules)或顆粒(particles) 本身在壓縮成片劑之前是腸溶包衣的情況下，則壓縮片劑自身的腸溶包衣是任選的。腸溶包衣還可施加於治療多肽珠或小顆粒上，其可以被包在澱粉或明膠膠囊中。如果希望，膠囊然後可以用腸溶包衣進行包衣。因為其腸溶包衣，這些口服配製品會阻止蛋白酶抗性多肽不希望地遞送到上胃腸道特別是口腔、咽和食道的黏膜和上皮組織。通過選擇組成包衣的賦形劑、其類型和/或其厚度，包衣還實現了將活性成分遞送到低位胃腸道的可以被本領域技術人員操作的點。
如本文所用，術語「延遲釋放」是蛋白酶抗性多肽的遞送，其通過將蛋白酶抗性多肽配製在藥物組合物中以便釋放在低位腸道的一些通常可預測的位置實現，所述位置遠離如果治療多肽的遞送無改變時會實現釋放的位置。用於實現活性成分的延遲釋放的舉例方法包括用一種物質包衣(或其它方式包囊)活性成分，所述物質不被吸收或不由胃腸液降解，從而直到到達小腸的特異希望地點才釋放活性成分。本文所用的延遲釋放配製品的舉例類型通過一種物質包衣活性成分的片劑、膠囊、或顆粒(particles)、顆粒(granules)或珠而實現，所述物質是PH依賴性的，即在小腸中通常存在的pH下降解，但是在口腔、咽、食道或胃通常存在的PH下不降解。但是，如果希望實現經口服施用含有蛋白酶抗性多肽的藥物組合物局部遞送至僅大腸中，或遞送至起自小腸的整個腸道，則可以如本文所述或通過本領域技術人員已知的任何方法變化或改變包衣材料的選擇和/或包衣或組合蛋白酶抗性多肽和選擇的包衣材料或其它藥物學可接受賦形劑的方法。
如本文所用，「治療作用」或「治療效益」是指治療症狀的正結果，可以包括例如臨床指標的有益變化，例如，在用EPO多肽治療的情況中，血細胞計數(RBC)、血小板計數、血細胞比容(HCT)、血紅蛋白水平(血紅蛋白C)以及主觀指標如疼痛降低、疲勞降低、體力改善或感覺改善。
如本文所用，「應答細胞」是指哺乳動物細胞，通過暴露於修飾的治療多肽，其功能或生存力可以被保持、促進、增強、再生或以任何其它方式受益。
如本文所用，待治療的「對象」包括人類及人類或非人動物。哺乳動物包括靈長類， 如人、黑猩猩、大猩猩和猴子；家養動物，如狗、馬、貓、豬、山羊、牛，和嚙齒類，如小鼠、大鼠、 倉鼠和沙鼠。
如本文所用，待治療的「患者」或「對象」包括人類或非人動物。哺乳動物包括靈長類，如人、黑猩猩、大猩猩和猴子；家養動物，如狗、馬、貓、豬、山羊、牛；和嚙齒類，如小鼠、 大鼠、倉鼠和沙鼠。
如本文所用，「定向進化(directed evolution)方法」是指「適應」蛋白質，包括天然蛋白質、合成蛋白質或蛋白質結構域的方法，以具有改變的比例，如在不同的或現存的天然或人工化學或生物學環境中起作用的能力和/或引起新功能和/或增加或降低給定活性和/或調節給定特徵。舉例的定向進化方法包括理性定向進化方法，如美國公開申請號US 2003-0134351A1 和 US-2004-0132977A1 所述。
如本文所用，「二維理性誘變掃描Q-D掃描)，，是指本文提供的方法，其中掃描特定蛋白質序列的二維(1) 一維是鑑別蛋白質序列上的特異胺基酸殘基以用不同胺基酸置換，稱為is-HIT靶位置，及( 第二維是選擇用於置換特定is-HIT靶的胺基酸類型，稱為置換胺基酸。
如本文所用，「in silico」是指用計算機進行的研究和實驗。h Silico方法包括但不限於分子建模研究和生物分子停靠實驗。
如本文所用，「is-HIT」是指在靶蛋白質序列上in silico鑑別的胺基酸位置，其已經基於i)待進化的特定蛋白質性質，ii)蛋白質的胺基酸序列，和/或iii)各個胺基酸的已知性質而鑑別。蛋白質序列上的這些is-HIT位置無需使用實驗生物學方法而鑑別。例如，一旦選擇了待優化的蛋白質特徵，使用各種信息來源或先前知識(即蛋白質一級、二級或三級結構、文獻、專利)確定易於通過用不同胺基酸置換而改善蛋白質適合性的那些胺基酸位置。這一步驟使用「in silico」蛋白質分析。靶蛋白質一級序列上可能參與被進化特徵的全部可能的候選胺基酸位置在本文中稱為「in silico HIT」( 「is-HIT」)。在這一步驟中鑑別的所有is-HIT的集合(文庫)代表了本文提供的二維掃描方法的第一維(靶殘基位置)。
如本文所用，「掩蔽的is-HIT」是指基於位於糖基化位點0-25人之內的所述治療性多肽的三維結構的特定性質或活性(例如蛋白酶抗性)鑑定的is-HIT位置。通常，掩蔽的is-HIT殘基距離或距離大約至少一個糖基化位點、有時是2個或多個糖基化位點1，2，3， 4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25 A。
如本文所用，「非掩蔽的is-HIT」是指不基於位於糖基化位點0-25人之內的所述治療性多肽的三維結構的特定性質或活性(例如蛋白酶抗性)鑑定的is-HIT位置。因此， 非掩蔽的is-HIT殘基不被糖基化屏蔽並可以是在甚至所述多肽是糖基化的時暴露在所述多肽表面的那些殘基。
如本文所用，在鑑別is-HIT上下文中的「易於提供進化的預定性質或活性」是指蛋白質上的胺基酸位置，其基於in silico分析被認為具有當被置換時導致進化的希望活性的性質或特徵。在鑑別置換胺基酸上下文中的短語「易於提供進化的預定性質或活性」是指特定胺基酸類型，其基於in silico分析被認為具有當用於置換未修飾起始蛋白質中的原始胺基酸時導致希望或預選的活性的進化的性質或特徵。
如本文所用，「高通量篩選」(HTQ是指一種方法，其測試大量樣品，如測試蛋白質或含有編碼感興趣蛋白質的核酸的細胞的樣品，以鑑別感興趣的結構或鑑別與變體蛋白質或含有它們的細胞相互作用的測試化合物。HTS運行易於自動化並且被典型地計算機化以處理樣品製備、測定程序和大容量數據的後續處理。
如本文所用，術語「受限制的」在鑑別選擇用於胺基酸置換的蛋白質胺基酸殘基的 is-HIT胺基酸位置和/或鑑別置換胺基酸的上下文中，是指蛋白質骨架上少於全部胺基酸被選擇進行胺基酸置換和/或少於全部其餘19個可用於置換未修飾起始蛋白質中存在的原始胺基酸的胺基酸被選擇用於置換。在本文提供的方法的特定實施方案中，is-HIT胺基酸位置是受限制的，從而蛋白質骨架上少於全部的胺基酸被選擇進行胺基酸置換。在其它實施方案中，置換胺基酸是受限制的，從而少於全部其餘19個可用於置換未修飾起始蛋白質中存在的天然胺基酸的胺基酸被選擇用於置換。在舉例的實施方案中，鑑別is-HIT胺基酸位置和置換胺基酸的兩種掃描是受限制的，從而蛋白質骨架上少於全部的胺基酸被選擇進行胺基酸置換以及少於全部其餘19個可用於置換天然胺基酸的胺基酸被選擇用於置換。
如本文所用，「候選LEAD」是突變蛋白質，其設計具有性質、活性或其它屬性中的改變，典型地是預定或預選的性質、活性或其它屬性，如尋求這種改變的化學、物理或生物學性質或活性。所述改變可以添加、改變、除去或其它方式改變多肽的性質、活性或其它屬性。 在本文方法中，候選LEAD通常通過用受限制的亞集或全部其餘19個胺基酸系統性置換蛋白質或其結構域中的is-HITS位置而產生，如用PAM分析所獲得。候選LEAD可以通過本領域技術人員已知的其它方法產生，由本文高通量方法測試。
如本文所用，「LEAD」是「候選LEAD」，其性質、活性或其它屬性已被改變、優化、改善、添加或消除。為本文目的，針對顯示這種活性或性質的未修飾多肽中的感興趣的性質或活性，「LEAD」典型地具有不同於修飾的和/或野生型(天然)蛋白質至少大約是或是1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更多的活性。在一些實施方案中，活性改變是高於未修飾和/或野生型(天然)蛋白質的活性的至少大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、 60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900 倍、1000倍或更多倍。希望的改變可以是活性增加或降低，取決於感興趣的功能或性質(例如至少大約是或是10 %，至少大約是或是20 %等)。LEAD可進一步通過置換相同蛋白質分子上的多個O個或多個)〃 is-HIT〃靶位置而優化以產生〃 super-LEAD"。
如本文所用，術語「super-LEAD」是指將兩個或多個LEAD分子中存在的單突變加入到一個單個蛋白質分子中而獲得的蛋白質突變體(變體)。因此，在本文提供的修飾蛋白質的上下文中，短語「包含一或多個單胺基酸置換的蛋白質」包括對一個相關蛋白質加入兩個或多個本文描述的突變。例如，本文提供的含有一或多個單胺基酸置換的修飾蛋白質可以具有在披露的置換位置的任意 2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19， 20或更多個胺基酸置換。super-LEAD突變體分子的集合被產生、測試和在可尋址陣列中逐一表型鑑定。Super-LEAD突變體分子是含有可變數目和類型LEAD突變的分子。展示對於被進化的特定特徵的進一步改善的適合性的那些分子被稱為super-LEAD。Super-LEAD 可以通過本領域技術人員已知的其它方法產生並由本文的高通量方法測試。為本文目的， super-LEAD典型地具有針對感興趣功能的活性，其與LEAD的改變的活性(或新活性或消除的活性)具有希望的量的不同，如與其所衍生的LEAD突變體不同至少大約是或是1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更多。與LEAD—樣，super-LEAD的活性變化取決於被「進化」的活性。希望的改變，其可以是活性的增加或降低，取決於感興趣的功能或性質。希望的改變還可以是性質或活性的添加或消除。
如本文所用，短語「改變的位置」是指LEAD或super-LEAD中用不同置換胺基酸置換以產生希望的改變表型或活性的is-HIT胺基酸位置。
如本文所用，「暴露的殘基」是指其15%以上的表面暴露於溶劑。
如本文所用，短語「結構同源性」是指兩個或多個蛋白質骨架之間空間一致程度。 採取相同蛋白質結構，摺疊，並且在三維結構重疊時顯示空間相似性的蛋白質骨架可被認為是結構同源的。結構同源性不是基於序列同源性，而是基於三維同源性。基於蛋白質之間的結構同源性而被稱為同源的兩個不同蛋白質中的兩個胺基酸不是必須位於基於序列的同源區域中。例如，在給定空間位置或限定區域彼此具有小於3. 5,3. 0,2. 5,2. 0、1. 7或 1.5埃的均方根(RMS)差的蛋白質骨架可以被認為是在該區域結構同源的，並在本文中稱為在它們的骨架間具有「高一致性」。本文中預期，位於共享一定程度結構同源性的兩個或多個不同蛋白質序列上的基本上等價的(例如「結構相關的」)胺基酸位置具有相當的功能任務；也在本文中稱為「結構同源位置」。這兩個胺基酸然後可被稱為是彼此「結構相似的」 或「結構相關的」，即使它們在胺基酸序列上的精確一級線性位置當對比它們的序列時不互相匹配。「結構相關的」胺基酸在一級蛋白質序列中可以彼此遠離，當這些序列根據經典序列同源性規則對比時。
如本文所用，「結構同系物」是由結構同源性識別的蛋白質。舉例的EPO結構同系物包括許多其它細胞因子，包括例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-3 (IL-3)、白細胞介素_4 (IL-4)、白細胞介素_5 (IL-5)、白細胞介素-13 (IL-13)、Flt3配體和幹細胞因子(SCF)。
如本文所用，兩個或多個多肽，如兩個EPO多肽或是EPO結構同系物的其它多肽上的「相應於結構相關的」位置，是指基於基於結構同源性確定的以最大化多肽之間的三維重疊的那些胺基酸位置。
如本文所用，「變體」、「治療多肽變體」、「修飾的治療多肽」和「修飾的治療蛋白質」 是指與未修飾治療多肽相比具有一或多個突變的治療多肽。「促紅細胞生成素」、「修飾的促紅細胞生成素多肽」和「修飾的促紅細胞生成素蛋白」是指與未修飾促紅細胞生成素多肽相比具有一或多個突變的EPO多肽。所述一或多個突變可以是一個或多個胺基酸置換、插入或缺失及其任何組合。典型地，修飾多肽與未修飾多肽相比在一級序列中具有一或多個修飾。例如，本文提供的修飾多肽與未修飾多肽相比可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、或更多個突變。任何長度的多肽均包括在內，只要所得多肽顯示至少一種與天然多肽相關的活性即可。
如本文所用，「單胺基酸置換，，是指一個胺基酸由另一個胺基酸置換。置換可以通過天然胺基酸或非天然胺基酸進行。當蛋白質中一個胺基酸由另一個胺基酸置換時，該蛋白質中的胺基酸總數不變。
如本文所用，短語「僅一個胺基酸置換發生在每個靶蛋白上」是指靶蛋白的修飾，從而其以單胺基酸改變與未修飾形式靶蛋白不同。例如，在一個實施方案中，通過置換蛋白質骨架上的僅一個is-HIT靶位置的單胺基酸殘基而進行誘變(例如在可尋址陣列中「逐一」)，從而所產生的每個突變體是每個單誘變反應的單產物。針對在每個is-HIT靶位置選擇的每個置換胺基酸，重複進行單胺基酸置換誘變反應。因此，產生多個突變蛋白質分子， 由此每個突變蛋白質含有在僅一個is-HIT靶位置的單胺基酸置換。
如本文所用，短語「假野生型」在單或多個胺基酸置換的上下文中，是這樣的胺基酸，它們儘管在給定胺基酸位置與原始(例如天然)胺基酸不同，但是可以置換該位置的天然胺基酸而不導入特定蛋白質活性的任何可測量的變化。
編碼突變分子集合的一群(文庫)核酸分子集合被產生並表型鑑定，以便選擇這樣的蛋白質，其具有不同於原始胺基酸的胺基酸序列，但是仍基本上相同水平(即至少大約是或是 10%,50%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%，根據蛋白質)和類型的與原始蛋白質一樣的希望活性。一個集合(或文庫)含有兩個、三個、四個、五個、10、50、100、500、1000、103、IO4或更多個修飾的治療多肽。
如本文所用，「相應於蛋白質的胺基酸位置的位置」，是指這樣的胺基酸位置，它們基於與具體的參考蛋白質的序列和/或結構對比被確定相應於彼此。例如，相應於SEQ ID NO 2所示人EPO的胺基酸位置的位置可以通過將SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列與感興趣的特定EPO多肽對比而憑經驗確定。相應位置可以由本領域技術人員使用手工對比或使用各種可獲得的對比程序(例如BLASTP)進行這種對比而確定。相應位置也可以基於結構對比，例如使用計算機模擬的蛋白質結構對比。定義多肽的胺基酸相應於一個公開序列中的胺基酸是指，使用標準對比算法如GAP算法對比所述多肽和所述公開序列以最大化相同性或同源性(當保守胺基酸進行對比時)而鑑別的胺基酸。
如本文所用，「相應於…的位置」是指一個核酸分子或蛋白質中的相對於另一個參考核酸或蛋白質中的位置的感興趣位置(即鹼基編號或殘基編號)。相應於另一個參考蛋白質中的位置的感興趣位置可以是例如在前體蛋白、等位基因變體、異源蛋白、來自另一物種的相同蛋白的胺基酸序列(即物種變體)中。相應位置可以通過比較和對比序列以最大化匹配的核苷酸或殘基數而確定，例如，從而序列間的相同性大於95 %，優選大於96 %，更優選大於97 %，還更優選大於98 %，最優選大於99 %。感興趣的位置然後被給予參考核酸分子中的編號。
如本文所用，術語「同源性」和「相同性」可互換使用，但是蛋白質的同源性可包括保守胺基酸變化。與鑑別相應位置中一樣，胺基酸序列被對比以便獲得最高級匹配 (參見例如!Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press, New York,1988 ；BiocomputinR :Informatics and Genome Projects, Smith，D. W.， ed.，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.，Humana Press，New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinie，G.，Academic Press，1987 ；and Sequence Analysis Primer，Gribskov, M. and Devereux, J.，eds.，M Stockton Press，New York， 1991 ；Carillo et al. (1988)SIAM J Applied Math 48 :1073)。
如本文所用，「序列相同性」是指在測試和參考多肽或多核苷酸之間比較中相同的胺基酸(或核苷酸鹼基)數。同源多肽是指預定數目的相同或同源胺基酸殘基。同源性包括保守胺基酸取代及相同殘基。序列相同性可以通過標準對比算法程序確定，使用每個供應商確立的默認缺口罰分。同源核酸分子是指預定數目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改變編碼的胺基酸的取代(即「沉默取代」)及相同殘基。基本上同源的核酸分子典型地在中等嚴格性或在高嚴格性在感興趣核酸分子全長上或感興趣核酸分子全長的至少大約 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%上雜交。還包括這樣的核酸分子，其含有簡併密碼子代替雜交核酸分子中的密碼子。(為確定蛋白質的同源性，保守胺基酸及相同胺基酸可以被對比；在這種情況中，相同性百分比和同源性百分比不同)。任何兩個核酸分子是否具有至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 「相同的」核苷酸序列(或者任何兩個多肽是否具有這樣的胺基酸序列)可以用已知的計算機算法如「FASTA」程序確定，使用例如Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)所述的默認參數(其它程序包括 GCG 禾呈(Devereux, J. ， et al. ， Nucleic Acids Research 12(1) :387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.，et al.，J. Molec. Biol. 215 :403(1990) :Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed.，Academic Press, San Diego (1994), and Carillo et al. SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。例如，National Center for Biotechnology ^formation資料庫的BLAST功能可用於確定相同性。其它商業或公共可利用程序包括DNA Star 「 MegAlign" program (Madison, WI)禾口 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffG) " Gap"程序(Madison WI))。蛋白質和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如用GAP電腦程式比較序列信息而確定(例如Needleman et al. J. Mol. Biol. 48 443(1970)，由 Smith and Waterman (Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)修正)。簡而言之，GAP 程序確定相似性是將相似的對比符號(即核苷酸或胺基酸)數除以兩個序列中較短者的符號總數而得到。GAP程序的默認參數可包括(1) 一元比較矩陣(1代表相同性，O代表非相同性)，Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14 :6745 (1986)的加權比較矩陣，如 khwartz and Dayhoff, eds. ， Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358(1979)所述；(2)每個缺口罰分 3. 0，每個缺口每個符號的另外0. 10罰分；及(3)末端缺口不罰分。
因此，如本文所用，術語「相同性」代表測試和參考多肽或多核苷酸之間的比較。在一個非限制性實施例中，「至少90%相同」是指相對於參考多肽從90至100%的相同性百分比。在90%或以上水平的相同性表明如下事實，假定為舉例目的，長度為100個胺基酸的測試和參考多肽被比較，測試多肽中不超過10% (即100個中的10個)胺基酸不同於參考多肽的胺基酸。類似的比較可以在測試和參考多核苷酸之間進行。這種差異可以是隨機分布於胺基酸序列全長的點突變，或者它們可以簇集在一或多個不同長度的位置，直至可允許的例如10/100個胺基酸差異(約90%相同性)。差異被定義為核酸或胺基酸取代、插入或缺失。在高於大約85-90%的同源性或相同性水平，結果應該不依賴於程序和缺口參數集； 這種高水平相同性可以容易地評估，通常無需依賴軟體。
如本文所用，短語「序列相關蛋白質」是指彼此具有至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列相同性或同源性的蛋白質。
如本文所用，非相關蛋白質或「序列不相關蛋白質」是指彼此具有小於50%、小於40%、小於30%、小於20%胺基酸相同性或同源性的蛋白質。
如本文所用，還應理解術語「基本上相同，，或「相似」隨上下文變化，相關領域技術人員理解這一點。
如本文所用，「裸多肽鏈」是指未進行翻譯後修飾或其它化學修飾僅含有共價連接的胺基酸的多肽。
如本文所用，多肽複合物包括由化學修飾或翻譯後修飾產生的多肽。這種修飾包括但不限於聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、hasylation，氨甲醯化、硫酸化、羧基化、羥基化、磷酸化及本領域已知的其它多肽修飾。
如本文所用，「輸出信號」是指可以隨時間被跟蹤及任選地定量的參數。例如，當重組蛋白被導入細胞中時，含有重組蛋白的細胞經歷許多變化。可以被監測及用於評估轉化或轉染的任何這種變化就是輸出信號，細胞被稱為報導細胞；編碼核酸被稱為報導基因； 包括編碼核酸的構建體是報導構建體。輸出信號包括但不限於酶活性、螢光、發光、產生的產物量和其它信號。輸出信號包括基因的表達或基因產物，包括插入到質粒構建體中的異源基因(轉基因)。輸出信號是時間("t")的函數，並且與用於組合物中的蛋白質量相關。對於較高濃度的蛋白質，輸出信號可以更高或更低。對於任何特定濃度，輸出信號作為時間的函數而增加直至達到穩態。輸出信號還可以測量細胞、表達異源基因和生物學物質之間的相互作用。
如本文所用，編碼突變體集合(或文庫)的核酸分子集合群是指攜帶(即編碼) 基因變體的質粒或其它運載體的集合。因此，個體質粒或其它個體運載體攜帶個體基因變體。集合的每個元件(或成員)在合適的可尋址陣列中與其它元件(或成員)物理分隔， 並作為獨立誘變反應的單產物產生。當涉及這種蛋白質集合(或文庫)時，其是如此聲明的。集合(或文庫)含有3、4、5、10、50、100、500、1000、IO3UO4或更多個修飾的EPO多肽或修飾的治療多肽。
如本文所用，「報導細胞」是應答一種條件而經歷變化的細胞。例如，應答將蛋白質或病毒暴露於其外部或內部環境的變化，報導細胞「報導」(即展示或顯示變化)。
如本文所用，「報導子」或「報導部分」是指使得可以檢測感興趣的分子如由細胞表達的蛋白質的任何部分。報導部分包括但不限於螢光蛋白(例如紅色、藍色和綠色螢光蛋白)、LacZ和其它可檢測蛋白質和基因產物。為在細胞中表達，編碼報導部分的核酸可以作為與感興趣的蛋白質的融合蛋白表達或者在感興趣的啟動子的控制下表達。
如本文所用，表型是指基因型(基因序列)的物理、生理或其它體現。在本文方法中，評估得自基因型改變的表型。
如本文所用，培養基是任何適於支持哺乳動物細胞離體存活性、生長、和/或分化的培養基。這種培養基是本領域技術人員已知的。培養基的例子包括但不限於 X-Vivol5 (Bioffhittaker), RPMI 1640, DMEM, Ham = sF12, McCoys 5A 禾口 Medium 199。培養基可以補加另外成分，包括血清、血清蛋白、生長抑制和生長促進物質如促有絲分裂單克隆抗體及選擇劑用於選擇遺傳工程或修飾的細胞。
如本文所用，在本文提供的各種胺基酸序列中存在的胺基酸根據其已知的三字母或單字母縮寫識別(表1)。在各種核酸片段中存在的核苷酸用本領域常規使用的標準單字母名稱命名。
如本文所用，「胺基酸」是一種有機化合物，其含有氨基和羧酸基團。多肽包含2或多個胺基酸。為本文目的，胺基酸包括20個天然發生的胺基酸、非天然胺基酸和胺基酸類似物(例如其中α-碳具有側鏈的胺基酸)。
如本文所用，任何保護基團、胺基酸及其它化合物的縮寫除非另有說明，均符合其常用法、認可的縮寫或 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem. 11 :1726。每個天然發生的L-胺基酸用標準三字母代碼(或單字母代碼)或標準三字母代碼(或單字母代碼)WpreEPO" L-"表示；preEPO" D-"表示胺基酸的立體異構形式是D。
如本文所用，「胺基酸殘基」是指在其肽鍵化學消化(水解)多肽形成的胺基酸。 本文描述的胺基酸殘基假定為「L」異構形式。「D」異構形式的殘基可以取代任何L-胺基酸殘基，只要希望的功能性質由多肽保持即可。"NH2」是指多肽的氨基末端存在的游離氨基。 「C00H」是指多肽的羧基末端存在的游離羧基。為與J. Biol. Chem.，243 :3552-3559 (1969) 描述的以及37C.F.R. § § 1.821-1. 822採用的標準多肽命名一致，胺基酸殘基縮寫如表1 所示 表1-對應表
符號1-字母3-字母胺基酸YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer絲氨酸IIle異亮氨酸LLeu亮氨酸TThr蘇氨酸VVal纈氨酸PPro脯氨酸KLys賴氨酸HHis組氨酸QGln穀氨醯胺EGlu穀氨酸ZGlxGlu 和/或 GlnWTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬醯胺BAsxAsn 和 /或 AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它 應理解本文由化學式代表的所有胺基酸殘基序列從左至右方向是常規的氨基末端至羧基末端方向。另外，短語「胺基酸殘基」廣泛定義為包括對應表(表1)列出的胺基酸以及修飾的和不尋常的胺基酸，入37C. F. R. § § 1.821-1. 822所指的那些，其引人本文做參考。另外，應注意在胺基酸殘基序列開頭或結尾的短橫線「_」是指與其它一或多個胺基酸殘基的序列、氨基末端基團如NH2或與羧基末端基團如COOH的肽鍵。
如本文所用，「天然存在的胺基酸」是指多肽中存在的20個L-胺基酸。
如本文所用，術語「非天然胺基酸」是指具有與天然胺基酸類似結構但已被結構修飾以模擬天然胺基酸的結構和反應性的有機化合物。非天然發生的胺基酸因此包括例如除 20個天然發生的胺基酸之外的胺基酸或胺基酸類似物，並包括但不限於胺基酸的D-立體異構體(isostereomer)。舉例的非天然胺基酸在本文描述並是本領域技術人員已知的。
如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括蛋白質核酸(PNA)及其混合物。 核酸可以是單鏈或雙鏈。當指代探針或引物時(任選地用可檢測標記物如螢光或放射標記物標記)，是指單鏈分子。這種分子典型具有這樣的長度，從而它們統計學獨特低拷貝數 (典型地小於5、通常小於3)，用於探查或引發文庫。通常探針或引物含有與感興趣基因互補或相同的至少10、15、20、25或30個連續核苷酸的序列。探針和引物可以是5、6、7、8、9、 10或更多、20或更多、30或更多、50或更多、100或更多個核苷酸長。
如本文所用，異源或外來核酸如DNA和RNA可互換使用，是指不是作為其所存在的基因組部分天然存在的，或者在不同於其天然存在的基因座中發現的。異源核酸包括不是其所導入的細胞內源性的而是從另一細胞獲得的或合成製備的核酸。通常，儘管不是必須的，這種核酸編碼不是正常由表達其的細胞產生的RNA和蛋白質。本文的異源DNA包括本領域技術人員認識到或認為是對於表達其的細胞或基因座是異源或外來的任何DNA或RNA。 異源DNA和RNA也可編碼通過影響轉錄、翻譯或其它可調節生物化學過程而介導或改變內源DNA表達的RNA或蛋白質。異源核酸的例子包括但不限於編碼可追蹤標記蛋白(例如賦予藥物抗性的蛋白質)的核酸，編碼治療有效物質(例如抗癌藥)、酶和激素的核酸，以及編碼其它類型蛋白質(例如抗體)的DNA。因此，本文中異源DNA或外來DNA包括不以在基因組中發現的相應DNA分子的精確方向和位置存在的DNA分子。其也可以指來自另一生物體或物種的DNA分子(即外源的)。
如本文所用，「關於核酸分子或多肽或其它生物分子是分離的」是指所述核酸或多肽已經與獲得所述多肽或核酸的遺傳環境分離開。其也可以表示從天然狀態改變。例如， 天然存在於活體動物中的多核苷酸或多肽不是「分離的」，但是與其天然狀態的共存材料分離開的相同多核苷酸或多肽是「分離的」，如本文採用的術語。因此，在重組宿主細胞內產生和/或包含的多肽或多核苷酸被認為是分離的。「分離的多肽」或「分離的多核苷酸」還意在包括已從重組宿主細胞或從天然來源部分或基本上純化的多肽或多核苷酸。例如，重組產生的化合物可以通過Smith et al.，Gene,67 :31-40(1988)所述的一步法基本上純化。 術語分離的和純化的可互換使用。
因此，「分離的」是指核酸不含那些基因的編碼序列，所述基因是在生物體的天然發生的基因組(如果有)中緊鄰編碼感興趣核酸的基因側翼的基因。分離的DNA可以是單鏈或雙鏈的，並可以是基因組DNA、cDNA、重組雜合DNA或合成DNA。其可以與起始DNA序列相同或者可以通過缺失、添加或取代一或多個核苷酸而與這種序列不同。
從生物細胞或宿主製備的「純化的」製備物是指含有指定的DNA或蛋白質的細胞提取物，包括感興趣的DNA或蛋白質的粗提取物。例如，在蛋白質的情況中，純化的製備物可以通過單項技術或一系列製備或生物化學技術獲得，感興趣的DNA或蛋白質可以以不同純度存在於這些製備物中。所述程序可以包括但不限於硫酸銨分級分離、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、密度梯度離心和電泳。
「基本上純的」或「分離的」DNA或蛋白質製備物是指基本上不含這種DNA或蛋白質天然正常結合的天然發生材料的製備物，其含有5%或更少的其它汙染物。
含有感興趣的DNA或蛋白質的細胞提取物是指得自表達所述蛋白質或含有感興趣DNA的細胞的勻漿製備物或無細胞製備物。術語「細胞提取物」意在包括培養基，特別是已除去細胞的用過的培養基。
如本文所用，「靶向劑」是指可以結合另一個靶分子的任何分子，如抗體、受體或配體。
如本文所用，「受體」是指特異地結合其它分子的生物學活性分子。術語「受體蛋白，，可以用於更具體地指示特異受體的蛋白質性質。
如本文所用，「重組體」是指由基因工程形成的任何子代。
如本文所用，「啟動子區」是指控制與其可操縱連接的DNA的轉錄的基因的部分。 啟動子區包括足以供RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始的特異序列。啟動子區的這一部分稱為「啟動子」。另外，啟動子區包括調節RNA聚合酶的這種識別、結合和轉錄起始的序列。 啟動子根據調節的性質可以是組成型的或者由順式作用或反式作用因子調節。
如本文所用，短語與核酸分子「可操縱地連接」通常是指序列或節段與單鏈或雙鏈形式的一段DNA共價結合，由此一個節段上的控制或調節序列控制或允許其它節段的表達或複製或其它這種控制。這兩個節段不必須是相鄰的。對於基因表達，DNA序列和調節序列的連接方式是這樣的，當合適的分子例如轉錄激活物蛋白與調節序列結合時，控制或允許基因表達。
如本文所用，「用重組DNA方法經重組方式產生」是指熟知的分子生物學方法表達由克隆的DNA編碼的蛋白質、包括基因的克隆表達的用途及方法。
如本文所用，剪接變體是由基因組DNA的初級轉錄物的差異加工產生的變體，所述差異加工產生超過一種類型的mRNA。
如本文所用，組合物是指兩個或多個產品或化合物(例如藥劑、調節物、調節物等)的任何混合物。其可以是溶液、懸液、液體、粉末、膏、水性或非水性配製品或其任何組合。
如本文所用，組合是指兩或多個項目的任何結合。用於施用給對象的組合的項目可以單獨或一起施用，同時或相繼使用，或者包裝在一起或分開包裝。
如本文所用，「製造品」是被製造和銷售的產品。在本申請中，該術語意在包括在包裝物品中含有的本文所述的修飾的EPO多肽或其它修飾的治療多肽和/或核酸的藥物組合物。
如本文所用，「試劑盒」是指提供在藥物組合物中的本文描述的修飾多肽或核酸分子與另一項目的組合，所述項目用於如下目的，所述目的包括但不限於施用、診斷和評價本文所述多肽的活性或性質。試劑盒任選地包括使用說明。
如本文所用，「與產物基本上相同」是指足夠相似，從而感興趣的性質足夠不變以便可以使用基本上相同的產物代替所述產物。
如本文所用，術語「載體」是指一種核酸分子，其能轉運與其連接的另一個核酸。一種類型的舉例的載體是附加體，即能染色體外複製的核酸。舉例的載體是能夠自主複製和/或表達其所連接的核酸的載體，這種載體典型地包括複製起點。載體還可設計用於整合進宿主染色體中。能指導與其可操縱連接的基因表達的載體在本文中稱為「表達載體」。表達載體通常是「質粒」形式，其通常是指環狀雙鏈DNA環，其在載體形式時不與染色體結合。 「質粒」和「載體」可互換使用，因為質粒是最常用形式的載體。其它這種形式的表達載體起等價作用並且是本領域已知的。
如本文所用，載體還包括「病毒載體」。病毒載體是工程病毒，其可操作地與外源基因連接以將該外源基因轉移(作為運載體或穿梭體)進細胞。
如本文所用，「等位基因」在本文中與「等位基因變體」可互換使用，是指基因或其部分在群體中的可變形式。等位基因佔據同源染色體上相同的基因座或位置。當對象具有一個基因的兩個相同等位基因時，該對象被稱為對該基因或等位基因是純合的。當對象具有一個基因的兩個不同等位基因時，該對象被稱為對該基因是雜合的。具體基因的等位基因可以互相有1個核苷酸或幾個核苷酸的不同，並且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因也可以是含有突變的基因形式。典型地，等位基因變體與野生型和/ 或來自相同物種的優勢形式具有至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高的胺基酸相同性。
如本文所用，術語「基因」或「重組基因」是指含有開放讀框並包括至少一個外顯子和任選地內含子編碼序列的核酸分子。基因可以是RNA或DNA。基因可以包括編碼區之前和之後的區域(前導序列和非轉錄尾區)。
如本文所用，「內含子」是指基因中存在的但在mRNA成熟過程中被剪接除去的DNA 片段。
如本文所用，「與編碼SEQ ID NO :1的胺基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列」是指編碼一種多肽的核酸鏈的互補鏈的核苷酸序列，所述多肽包括具有該特定SEQ ID NO 1的胺基酸序列。
術語「互補鏈」在本文中與術語「互補序列」可互換使用。核酸鏈的互補序列可以是編碼鏈的互補序列或非編碼鏈的互補序列。當指代雙鏈核酸時，編碼含有具有特定SEQ ID NO :1的序列的胺基酸殘基的核酸的互補序列是指編碼該特定SEQ ID NO :1的胺基酸序列的鏈的互補鏈，或者指含有該特定核酸序列的互補鏈的核苷酸序列的任何核酸分子。當指含有一核苷酸序列的單鏈核酸分子時，這一核酸的互補序列是具有與該特定核酸序列的序列互補的核苷酸序列的核酸。
如本文所用，術語「編碼序列」是指基因的編碼蛋白質中存在的胺基酸序列的部分。
如本文所用，「有義鏈」是指雙鏈核酸分子的一條鏈，其具有編碼由該雙鏈核酸分子編碼的胺基酸序列的mRNA序列。
如本文所用，術語「反義鏈」是指雙鏈核酸分子的一條鏈，其是編碼由該雙鏈核酸分子編碼的胺基酸序列的mRNA序列的互補序列。
如本文所用，「陣列」是指含有三個或多個成員的元件如核酸分子的集合。可尋址陣列是這樣的陣列，其中陣列的成員是可鑑別的，典型地通過在固相支持物上的位置或通過可鑑別或可檢測的標記而鑑別，所述可鑑別或可檢測的標記例如為顏色、螢光、電信號 (例如RF、微波或不顯著改變感興趣分子的相互作用的其它頻率)、條碼或其它象徵學、化學或其它這種標記。在某些實施方案中，陣列成員固定化到固相表面上的分立的可鑑別位置上，或者直接或間接與可鑑別標記連接或另外相關，如附於微球上或其它顆粒支持物上 (本文稱為珠)並懸浮於溶液或展開在表面上。
如本文所用，「支持物」(例如基質支持物、基質、不溶性支持物或固體支持物等) 是指任何固體或半固體或不溶支持物，感興趣的分子(例如生物分子、有機分子或生物特異性配體)與其連接或接觸。這種材料包括用作親和性基質或支持物以進行化學和生物學分子合成及分析的任何材料，例如但不限於聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、尼龍、玻璃、葡聚糖、幾丁質、沙、浮石、瓊脂糖、多糖、dendrimers, buckybal 1、聚丙烯醯胺、矽、橡膠和用作支持物以進行固相合成、親和分離和純化、雜交反應、免疫測定及其它這種應用的其它材料。本文的基質可以是顆粒狀的或者可以呈連續表面形式，如微滴定板或孔、玻片、矽晶片、 硝基纖維素片材、尼龍篩或其它這種材料。當是顆粒狀時，典型地所述顆粒的至少一維是 5-10mm範圍或更小。這種顆粒統稱為「珠」，通常但不是必須是球形。但是，這種指代不是限制基質的幾何形狀，其可以是任何形狀，包括隨機形狀、針狀、纖維和加長的。大概為球形的「珠」，特別是可用於液相的微球也包括在內。「珠」可以包括另外的成分，如用於用磁鐵進行分離的磁性或順磁性顆粒(參見例如Dynabeads (Dynal，Oslo, Norway))，只要所述另外成分不幹擾本文的方法和分析即可。
如本文所用，基質或支持物顆粒是指呈離散顆粒形式的基質材料。顆粒具有任何形狀和尺寸，但典型地具有至少一維尺寸為IOOmm或更小、50mm或更小、IOmm或更小、Imm或更小、IOOm或更小、50m或更小，典型地具有大小為IOOmm3或更小、50mm3或更小、IOmm3或更小、Imm3或更小、IOOm3或更小，並可以是立方微米級。這種顆粒統稱為「珠」。
如本文所用，對照是指與測試樣品基本上相同的樣品，除了其不用測試參數處理， 或如果是血漿樣品，其來自未患有感興趣病症的正常志願者。對照也可以是內部對照。
如本文所用，單數形式「一個」、「一種」和「所述」包括複數指代，除非上下文明確另外指出。因此，例如指代化合物時，包含「胞外結構域」包括具有一個或多個胞外結構域的化合物。
如本文所用，範圍和量可以表示為「大約」特定數值或範圍。大約也包括精確量。 因此「大約5個鹼基」意味著「大約5個鹼基」以及「5個鹼基」。
如本文所用，「任選的」或「任選地」意味著隨後描述的事件或情況發生或不發生， 以及所述描述包括所述事件或情況發生的情況和其不發生的情況。例如，任選地取代的基團意味著所述基團是未取代的或取代的。
如本文所用，對於任何保護基、胺基酸及其它化合物的縮寫除非另有說明，否則符合其慣用法、認可的縮寫或 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem.，11 :942-944。
B.促紅細胞生成素(EPO) 促紅細胞生成素(EPO)是作為激素起作用的造血生長因子家族的成員。其負責調節紅細胞生成並保持機體紅細胞量在優化水平。EPO生成由腎動脈循環中降低的氧含量刺激，由氧敏感的轉錄因子介導。EPO主要由腎臟的小管周毛細血管內皮細胞產生。分泌的 EPO結合骨髓紅系前體表面上的EPO受體，導致它們快速複製和成熟為功能性紅細胞。這一刺激導致紅細胞計數的快速上升和作為結果的血細胞比容(血液中的％紅細胞)的上升(D'Andrea et al. (1989)Cell 57 277-285 ；Lodish et al. (1995)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60 :93_104)。
最近，幾條線證據提示促紅細胞生成素作為細胞因子超家族的成員進行其它重要的生理學功能，這些功能由與促紅細胞生成素受體(EPOR)的相互作用介導。這些作用包括促有絲分裂、調節進入平滑肌細胞和神經細胞的鈣流入、紅細胞生成、血小板超活化、凝血細胞生成及對中間代謝的作用。據信促紅細胞生成素提供了補償應答，用於改善低氧細胞微環境以及調節由代謝應激導致的編程性細胞死亡。因此，除了其促紅細胞生成活性之外， EPO還顯示組織保護能力。另外，這種組織保護活性看起來不依賴於其造血功能。
人類EPO首先由Lin et al. (1985) Proc Nat Acad Sci USA 82 :7582_4and Jacobs et al. (1985) Nature 313 :806_810克隆並報導胺基酸序列。人類EPO是分子量大約30400 道爾頓的酸性糖蛋白。人EPO的前體序列是193個胺基酸多肽(SEQ ID N0:1所示)，包括相應於SEQ ID NO :1所示胺基酸序列中第1-27位胺基酸殘基的27個胺基酸的信號序列。 成熟多肽由166個胺基酸的單多肽鏈(SEQ ID NO :2所示)組成，其通過包括通過羧肽酶裂解166位精氨酸的翻譯後修飾被加工為165個胺基酸的多肽(SEQ ID NO :237所示)。因此， EPO以165個胺基酸的形式存在，但可以166個胺基酸的形式存在，或者是以165或166個胺基酸的不均一分子存在。EPO含有4個半胱氨酸殘基(在SEQ ID NO :2所示成熟蛋白質的位置 7、29、33 和 161)，其形成內部二硫鍵(Lai et al. (1986) J BiolChem 261 :3116_3121 ； Recny et al. (1987) J Biol Chem 262:17156-17163)。半胱氨酸 7 和 161 之間的二硫鍵對於促紅細胞生成活性是重要的。人類EPO的結構已在Cheetham et al. (1988)Nat Struct Biol 5:861-866 and Syed et al. (1998) Nature 395 :511_516 中報導及描述。人類 EPO 是4螺旋束，這在造血生長因子家族成員中是典型的。
在體內，EPO被糖基化翻譯後修飾。EPO的碳水化合物部分由在Asn24、38和83 的3個N聯糖及在Ser 126的1個0聯糖組成(參見例如Browne et al. (1986)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 693-702 ；Egrie et al. (1986) Immunbiology 172 213-224)。附著於EPO的碳水化合物結構是可變的，這一特徵稱為微不均一性。碳水化合物部分在分支模式、複雜性大小和電荷中的差異對EPO的藥動學和藥效學有深遠作用。 不同糖基化模式的作用已有很好研究(參見例如，Darling et al. (2002)Biochemistry 41 14524-14531 ；Storring et al. (1998)Br J Haematol 100 79-89 ；Halstenson et al. (1991 Clin Pharmacol Ther 50 702-712 ；Takeuchi et al. (1990)J Biol Chem265 12127-12130)。
通常，蛋白質的糖基化在賦予溶解性、穩定性、對免疫攻擊的保護和整體生物學活性是重要的。對於ΕΡ0，例如，糖蛋白中的糖基化位點涉及活性、生物合成和加工、半衰期、 維持活性構象和其歸巢至骨髓以及其生物學活性(Dube et al. (1988) J Biol. Chem.，263 17516-17521 ；Cointe et al. (2000)Glycobiology，10 :511_519)。例如，含有增加的碳水化合物含量的EPO多肽同種型通常顯示增加的血清半衰期。CHO細胞中產生的EPO多肽的血清半衰期與具有的半衰期以分鐘量度的非糖基化EOP相比是大約2小時。EPO糖基化形式的半衰期還顯示相對短的半衰期。因此，努力產生具有改良的半衰期的EPO多肽。
EPO在胎兒期間通過肝細胞產生，並也通過腎成纖維細胞和神經元細胞產生。人尿EPO和在細胞中重組產生的重組人EPO(rHuEPO)具有相同的一級序列，但是其糖基化模式不同。另外，不同的rHuEPO根據用於產生其的細胞系而含有不同的糖基化模式。rHuEPO 通過在CHO細胞(即下文討論的epoietin α和β)、幼倉鼠腎細胞(ΒΗΚ，即印oietin ω)； RPMI 1，788人類淋巴母細胞；COS非洲綠猴腎；MDCK犬腎；L929小鼠成纖維細胞和C127小鼠乳腺(Jelkmann et al. (2004) Internal Medicien，43 :649_659)中的重組工程產生。不同EPO製備物的糖基化的不同當EPO作為治療藥物施用時影響其體內存活。 EPO是主要的生物藥品，世界銷量達30億美元。其主要用於增強患者中紅細胞和紅細胞形成以治療與慢性腎衰竭、癌症化療、HIV感染、兒科應用、早產兒相關的貧血並用於降低經歷擇期非心臟和非血管手術的貧血患者對於輸血的需求。其他用於EPO治療的指示徵可以是與自體免疫疾病、AIDS、C型肝炎感染、充血性心臟衰竭或手術幹預相關的貧血。 在人中，用EPO劑量治療發現是安全且良好耐受的。
有多種可商購獲得的EPO多肽。許多EPO多肽具有與人EPO(rhEPO)相同的胺基酸序列並且生產方法和糖基化的變化可以區分這些產品。Epoetin α (產生自基因組DNA)和 epoetin β (產生自cDNA)在美國專利4，703，008和5，955，422中描述。這些多肽具有與人類EPO相同的胺基酸序列並且在中華倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生。Epoetina可以商品名 Procrit(Ortho Biotech),Eprex (Johnson&Johnson),Epogin (Chugai)或Epogen (Amgen)獲得。Epoetin β 可以商品名 Neorecormon 或Recormon(Hoffmann-La Roche) 獲得。其由Genetics Institute開發用於治療與腎病相關的貧血。Epoetin ω，在美國專利 5，688，679中描述，具有與人類EPO相同的胺基酸序列並在幼倉鼠腎細胞(ΒΗΚ-21)中產生。 Epoetin ω可以商品名Epomax(Elanex)獲得。通常，rHuEPOa禾PrHuEPO^當靜脈內或皮下施用時顯示6-8小時的半衰期。Dynepo (Epoetin δ ；由Transkaryotic Therapies (與 Aventis Pharma聯合)開發)是基因活化的人促紅細胞生成素，在人細胞培養物中產生，用於治療腎衰竭患者的貧血。
開發了其他EPO多肽試圖增加多肽的半衰期和生物利用度。Darb印oetina (也已知為 Novel Erythropoiesis Stimulating Protein, NESP)由 Amgen 開發並可以商品名 Aranesp 獲得(Macdougal 1(2002) Kidney Int Suppl. 80 :55_61)。其設計含有 5 個 N 連接碳水化合物鏈(比rhEPO多2個)。Aranesp⑧的胺基酸序列與rhEPO的不同在於5個胺基酸取代(A30N，H32T，P87V，W88N，P90T)，因此使得另外的寡糖附著於位置30和88的天冬醯胺殘基上。由於其增加的碳水化合物含量，Aranesp 不同於rhEPO，其有更高的分子量(37100，相比於30400道爾頓)、唾液酸含量(22，相比於14個唾液酸殘基)和增加的負電荷。Aranesp⑧增加的碳水化合物含量解釋了其獨特的生物化學和生物學活性，特別是當經靜脈內或皮下途徑施用時比其它促紅細胞生成素高3倍的循環半壽期，即24-26小時。 然而，相對EPO受體結合親和性與碳水化合物含量倒相關，Aranesp 展示比rhEPO低4. 3 倍的對EPO受體的相對親和性。在皮下施用後，Aranesp 吸收緩慢並是限速的，血清水平平均54小時達到最大。達到最大濃度的時間比報導的rhEPO的長，可能是因為Aranesp⑧ 分子大小增加。但是目前延長的循環半壽期使得Aranesp⑧比Procrit⑧有顯著的臨床優勢，因為其給藥頻率低。
進行了其他嘗試通過與聚乙二醇(PEG)的化學綴合來延長EPO的半衰期。PEG化的EPO儘管具有更長的半衰期，與非PEG化的EPO相比顯示改變的結構和降低的功能。例如，連續的促紅細胞生成素受體激活物(CERA ；由Roche開發)或R-744是第二代促紅細胞生成素，用於潛在治療與化療相關的貧血。CERA含有約30kDa的單個甲氧基聚乙二醇聚合物，其延長了這一藥劑的半壽期。增加半衰期的其他機制包括但不限於EPO與載體蛋白如白蛋白連接，2個完整EPO分子通過使用連接肽(3至17個胺基酸)、通過使用不同試劑的化學交聯或者通過組合EPO分子和人免疫球蛋白(Ig)的Fc片段作為融合蛋白的同二聚體化的形成。這些策略的每一種均導致與天然EPO相比所述EPO多肽具有改變的活性。 EPO可以口服、全身性、頰內、經皮、靜脈內、肌肉內和皮下施用，典型地，治療方案中使用多次施用。通常，商業可獲得的EPO治療劑通過皮下、靜脈內和腹膜內施用注射施用。典型地，皮下施用更有效，儘管天然EPO通過皮下施用的生物利用度僅是26%。由於相對短的半衰期，天然EPO必須一周3次注射施用。而且，配製品典型地儲存在冷藏(2-8°C) 條件以保證活性。因此，改善的EPO穩定性(半壽期)在施用條件(體內)如血清穩定性及體外(例如在生產過程中、純化和儲存條件下)可以改善其作為藥物的用途和效率。
C.顯示增加的蛋白質穩定性的修飾的EPO多肽 本文提供了通過對蛋白酶抗性評估顯示改善的穩定性的EPO多肽的變體(血液、 腸等)。增加的EPO多肽穩定性可以例如通過破壞蛋白酶靶殘基或序列、從而使得所述多肽在施用、純化或儲存時對於蛋白酶降解具有抗性而實現。通過在傾向於被蛋白酶降解的位點處改變其一級序列而修飾蛋白酶以成為蛋白酶抗性的。例如，蛋白酶靶殘基或序列的胺基酸置換導致蛋白酶靶殘基或序列的直接破壞。因此，本文提供了修飾的EPO多肽，其中一級胺基酸序列被修飾以賦予對蛋白酶的增加的抗性，而無其他翻譯後或其他修飾的額外需要。
本文提供的蛋白酶抗性EPO多肽僅用在所述多肽的一級序列中一些胺基酸改變 (在很多情況中僅單個改變)修飾。自身一級序列中的突變使得給予多肽蛋白酶抗性。而且，因為所述多肽僅含有一些改變，其能夠將其活性保持在與沒有所述突變的相同多肽的活性相同或在一些情況中大於沒有所述突變的相同多肽的活性的水平。這對於幾種原因而言是有利的。首先，這意味著實現治療作用所需的多肽的量(即劑量)不受所述多肽活性任何改變(即降低)的限制。這是使用許多治療性多肽例如peg化多肽具有的問題，其中對所述多肽的修飾使得蛋白質活性更低。因此，為實現治療作用，這種治療性多肽必須以更高劑量施用。
第二，僅對多肽一級序列的改變意味著沒有其他加工要求或混合所述治療性蛋白和製劑中其他化合物以實現蛋白酶抗性或吸收多肽進入血流的要求。因此，簡化了劑量製劑的工藝。例如，僅含有凍幹蛋白的片劑可以製備為用於口服施用，即所述蛋白酶抗性蛋白質自身是口服利用的。在腸溶包衣中包括多肽以進一步增加多肽對蛋白酶的抗性、特別是在口服施用時至胃腸道途徑時也可能是有利的。
所述修飾的EPO多肽通過對蛋白酶的抗性評估顯示改良的穩定性；所述顯示這些性質的修飾的EPO多肽因而具有增加的體外或體內蛋白質半衰期。所述修飾的EPO多肽 (本文也稱為變體)與未修飾的EPO多肽相比是更穩定的。本文提供的顯示增加的蛋白質穩定性的修飾的EPO多肽可以導致增加的體外(例如在生產、純化和儲存期間)或體內 (例如在施用對象後)多肽半壽期。例如，增加的半壽期可以在多肽被施用給對象如人類對象後發生。修飾的EPO多肽的增加的半壽期與未修飾EPO多肽的半壽期相比可以增加的量至少大約是或是 1% >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%, 300%、400%、500%或更高。在一些實施例中，修飾的EPO多肽的增加的半壽期與未修飾 EPO多肽的半壽期相比可以增加的量是至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、 50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍、100 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、600 倍、700 倍、800 倍、900倍、1000倍或更多倍。因此，本文提供的修飾的EPO多肽給EPO提供了優點，包括維持血清中足夠藥物水平所需的注射頻率降低，由此導致例如對象更高的舒適度和接受性， 更低的達到相當的生物學作用所需的劑量，及減輕了二級效應。 顯示改良的穩定性的EPO變體在施用條件中如在血流、胃腸道、口腔、喉和/或在儲存條件下具有增加的穩定性。穩定性(即蛋白體內半衰期)增加可以導致維持血清中足夠藥物水平所需的注射頻率降低，因而導致i)被治療對象、特別是人類對象更高的舒適性和接受性，ii)實現相當的生物學作用所需的劑量更低，和iii)結果是(劑量依賴性)二級效應減輕。而且，對蛋白酶的抗性使得多肽適於口服遞送，因為其傾向於被胃腸道中發現的蛋白酶消化。
因此，由於對胃腸道中蛋白酶的抗性，本文提供的EPO變體可以配製為口服施用。 對於沒有通過一級序列改變被修飾為是蛋白酶抗性的治療性蛋白質，沒有蛋白質可以通過口服施用施用以實現遞送治療有效量的天然或野生型多肽至血流。這是胃腸道蛋白酶對胃腸道中多肽的降解所導致的。儘管天然多肽如EPO可以用腸溶包衣配製，這也不足以實現對胃腸道中蛋白酶的抗性以允許釋放至血流。一旦腸溶包衣溶解並且所述天然多肽釋放至胃腸道內腔，所述多肽的高水平蛋白酶降解阻止了所述多肽自腸到血液的有效吸收。本文提供的EPO蛋白酶抗性多肽對於蛋白酶如胃腸道蛋白酶的降解是具有抗性的，因此可以被吸收和攝取進入血液。當釋放進胃腸道內腔時，所述蛋白酶抗性肽由於其對於腸蛋白酶的抗性而以高濃度存在。結果，治療有效量的蛋白酶可自腸吸收至血液。另外，對消化道和血流中的蛋白酶降解的抗性允許持續攝取所述蛋白酶抗性治療性多肽。因此，在血流中所述蛋白酶抗性多肽可以治療有效濃度在較長時間內被吸收和維持。因此，所述蛋白酶抗性多肽可以被口服施用。如本文所述，這種蛋白酶抗性EPO多肽可以配製為以片劑或膠囊口服施用。有利地，其包括保護抵抗胃的PH條件並允許有效遞送所述多肽至下段消化道的腸溶包衣。
增加蛋白酶抗性的修飾補償了可能由於蛋白質在不能糖基化的宿主中產生而發生的或者在施用及暴露於蛋白酶糖酵解作用後EPO多肽糖基化的缺失。因此，通常被糖基化掩蔽的蛋白酶敏感位點的修飾可以在這些位點沒有被掩蔽且暴露於蛋白酶(即血清、血清、腸)時對EPO多肽提供保護措施以提供與不含有這種修飾的多肽相比增加的多肽穩定性。因此，儘管糖基化位點可以將蛋白質與蛋白酶屏蔽並因而增加多肽的半衰期，沒有糖基化或部分糖基化的EPO多肽不被如此保護。因此，通過修飾EPO多肽以顯示增加的蛋白酶抗性，特別是在通常被糖基化掩蔽的位點，所述多肽與完全糖基化的EPO多肽相比被賦予保護或更好的保護。
1.蛋白酶抗性 將穩定的肽和蛋白質藥物遞送給患者是藥物工業的主要挑戰。這些類型的藥物在人體中經常由不同的生理過程包括內在化、腎小球濾過和蛋白酶解而消除或去掉。後者經常是影響用作經口施用或者靜脈內或肌肉內注射的治療劑的蛋白質的半壽期的限制過程。因此，感興趣的是增加蛋白質穩定性的治療蛋白質，所述蛋白質穩定性增加體現在增加的蛋白酶消化的抗性。治療蛋白質的修飾是增加抗蛋白酶消化的保護，但不破壞或消除一種或該種治療活性。這種變化對於生產更持久的治療蛋白質是有用的。因此，在一個方面中， 本文提供的EPO多肽已被修飾以增加對蛋白酶解的抗性，由此增加修飾的EPO多肽的體外 (例如生產、加工、儲存、測定等)或體內(例如血清穩定性)半壽期。因此，本文提供的修飾的EPO多肽可用作更持久的治療蛋白質。本文所述增加蛋白質對蛋白酶(血液、裂解物、 腸、血清等)的穩定性是意指對於特定蛋白質分子提供更長的體內半衰期並因此降低對對象所需施用的頻率。也意指通過賦予蛋白酶抗性增加蛋白酶穩定性產生可以口服施用的多肽。
蛋白酶(Proteases，proteinases)或肽酶催化共價肽鍵的水解。本文提供的修飾的EPO多肽顯示增加的對蛋白酶酶解的抗性，所述蛋白酶包括在體液和組織中存在的那些蛋白酶，所述體液和組織例如包括但不限於唾液、血液、血清、腸道、胃、血液、細胞裂解物、 細胞及其它。這些包括所有類型的蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶。
EP0多肽的修飾包括但不限於對一或多種蛋白酶的抗性，所述蛋白酶包括但不限於胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、氨肽酶、明膠酶B、明膠酶A、 α -胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、內蛋白酶Arg-C、內蛋白酶Asp-N、內蛋白酶Glu_C、內蛋白酶 Lys-C、內腔胃蛋白酶、微絨毛內肽酶(microvillar endop印tidase)、二肽基肽酶、腸肽酶 (enterop印tidase)、水解酶、NS3、因子Xa，粒酶(Granzyme) B、凝血酶、纖溶酶、尿激酶、tPA 禾P PSA0 本文提供的修飾的EPO多肽顯示對蛋白酶解，特別是存在於血清、血液、腸道、口腔和其它體液中的酶的蛋白酶解的抗性。這種抗性增加體現為EPO多肽半壽期與在體內 (人血液、人血清、唾液、消化液、腸道等)或含有一或多種蛋白酶的體外混合物中的未修飾或野生型EPO多肽相比增加的量至少大約是或是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%, 96%,97%,98%,99%UOO%,200%,300%、400%,500%或更高。典型地，本文提供的修飾的EPO多肽的體外或體內半壽期與在血液、血清、唾液或含有一或多種蛋白酶的體外製備物或混合物中的未修飾或野生型EPO多肽相比增加的量選自至少大約是或是1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% ,100%,200%,300%,400%,500%^； 更高。
典型地，本文提供的修飾的EPO多肽顯示與未修飾的或野生型EPO相比至少一種基本上不變(小於1%、5%或10%變化)的活性。在一些實施例中，與未修飾EPO相比活性增加。在其它實施例中，與未修飾EPO多肽相比活性降低。活性包括例如促紅細胞生成或組織保護活性，並且可以與未修飾多肽相比，所述未修飾多肽例如是成熟的野生型天然EPO 多肽(SEQ ID NO :2或237)，野生型前體EPO多肽(SEQ ID NO 1 or 236)或者用作起始材料的任何前體EPO多肽。
a.絲氨酸蛋白酶 絲氨酸蛋白酶參與機體一系列功能，包括血液凝集、炎症以及原核生物和真核生物中的消化酶。絲氨酸蛋白酶是序列特異性的。儘管蛋白酶級聯激活凝血和補體，其它蛋白酶參與信號途徑、酶激活和不同細胞或細胞外區室中的降解功能。
絲氨酸蛋白酶包括但不限於胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，彈性蛋白酶，NS3，因子Xa， 粒酶B，凝血酶，纖溶酶，尿激酶，tPA和PSA。胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和彈性蛋白酶由胰腺腺細胞合成，分泌在小腸中並且負責催化肽鍵水解。所有這三種酶由它們的X射線結構顯示結構類似。這些消化性絲氨酸蛋白酶的每一個靶向多肽鏈的不同區域，基於圍繞裂解位點的胺基酸殘基和側鏈而不同。絲氨酸蛋白酶的活性位點成形為裂縫，多肽底物結合在此。 胺基酸殘基是從多肽底物的N端到C端(Pi，…，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，…，Pj)及其各自的結合亞位點(Si，…，S3，S2，Si，Sl'，S2'，S3'，…，Sj)標記。裂解在Pl和 ΡΓ之間催化。胰凝乳蛋白酶水解兩側為大的疏水性胺基酸殘基肽鍵。特定的殘基包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，它們適合進貼緊的疏水口袋(snug hydrophobic pocket) 0胰蛋白酶水解兩側為陽性電荷的胺基酸殘基的肽鍵。代替具有胰凝乳蛋白酶疏水口袋，胰蛋白酶在口袋背部有一天冬氨酸殘基，其可以與陽性電荷殘基如精氨酸和賴氨酸相互作用。彈性蛋白酶水解兩側為小中性胺基酸殘基如丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸的肽鍵。與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相反，彈性蛋白酶含有用纈氨酸和蘇氨酸排列的口袋，使其只是收縮，其可以容納較小的胺基酸殘基。絲氨酸蛋白酶遍在於原核生物和真核生物中並起重要的不同的生物學功能如止血、纖維蛋白溶解、補體形成和飲食蛋白消化。
屬於絲氨酸蛋白酶家族的彈性蛋白酶展示與其它絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的廣泛的序列同源性。絲氨酸彈性蛋白酶優先裂解與脂族胺基酸殘基相鄰的多肽，典型地為丙氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸，以及程度差一些的亮氨酸和異亮氨酸。人類具有6種彈性蛋白酶基因，它們編碼結構相似的蛋白質，彈性蛋白酶1(ELA-1，也已知為胰腺彈性蛋白酶，PE，)，彈性蛋白酶2 (嗜中性粒細胞彈性蛋白酶，NE，也已知為PMN彈性蛋白酶，骨髓絲氨酸蛋白酶，medullasin，人白細胞彈性蛋白酶，HLE)，彈性蛋白酶2A(ELA_2A)， 彈性蛋白酶2B(ELA-2B)，彈性蛋白酶3A(ELA-3A，彈性蛋白酶IIIA，蛋白酶E)，和彈性蛋白酶-3B(ELA-3B，彈性蛋白酶IIIB，蛋白酶E)。具有彈性蛋白酶活性的其它絲氨酸蛋白酶包括但不限於蛋白酶-3 (PR-3)、內源血管彈性蛋白酶(EVE)和內皮細胞彈性蛋白酶(ECE)。
嗜中性初級嗜苯胺藍粒攜帶NE (ELA-2)和PR-3，它們在嗜中性粒細胞活化時被釋放。NE參與胞外基質(ECM)降解，包括彈性蛋白、軟骨蛋白聚糖、膠原蛋白和纖連蛋白的降解，以及通過吞噬作用吸收進細胞的材料的消化。NE還幫助降解蛋白質，如免疫球蛋白和表面活性劑脫輔蛋白。NE優先裂解Val-X鍵，以及程度差一些的Ala-X鍵。NE的異常或過量釋放已與結締組織更新、關節炎和炎症相聯繫。類似於NE，PR-3也激活酶原，如金屬蛋白酶和細胞因子如TNF-α，IL-I β和白細胞介素_8 (IL-8)。
胰腺彈性蛋白酶(ELA-I)優先裂解Ala-X鍵並主要在皮膚角質形成細胞中表達。 ELA的表達正常不在成人胰腺中發現，儘管其經常在胰腺癌中表達並用作胰腺癌的標記。 正常胰腺的彈性蛋白酶活性歸因於ELA-2A和ELA-2B。ELA-2A和ELA-2B優先裂解Leu_X， Met-X 禾口 Phe-X 鍵。
據信一些病理學症狀至少部分是由於彈性蛋白酶和它們的內源抑制劑之間失衡導致。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶特別是ELA-2導致的不受控蛋白酶降解參與多種病理學症狀，如肺氣腫、急性呼吸窘迫症候群、敗血性休克、多器官衰竭、類風溼性關節炎和囊性纖維化。
高濃度的彈性蛋白酶可在胃腸道和血液中發現。因此，經這些途徑施用的有效治療劑可以通過彈性蛋白酶裂解位點的修飾而實現。
b.基質金屬蛋白酶 基質金屬蛋白酶(MMP)是Zn2+和鈣依賴性內肽酶家族，其降解胞外基質(ECM)成分。另外，MMP還可以加工許多細胞表面細胞因子、受體和其它可溶蛋白。它們參與正常組織重塑過程如傷口癒合、懷孕和血管發生。在生理條件下，MMP作為無活性前體(酶原)產生並被加工成其活性形式。另外，所述酶由稱為基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)的內源抑制劑特異調節。MMP的蛋白酶解活性作為生理和病理條件中的組織重塑的效應物機制起作用，以及作為炎症介質起作用。這些蛋白質的過量合成和產生導致ECM的加速降解，其與各自疾病和病症相關，例如骨髓穩態、關節炎、癌症、多發性硬化和類風溼性關節炎。在神經炎性疾病中，MMP參與如下過程，例如(a)血腦屏障(BBB)和血液-神經屏障開放，(b)血液衍生的免疫細胞侵襲神經組織，(c)細胞因子和細胞因子受體脫落(shedding)，以及(d) 在周圍和中樞神經系統疾病中的直接細胞損害(L印pert et al. Brain Res. Rev. 36(2-3) 249-57(2001) ；Borkakoti et al. Prog. Biophys. Mol. Biol. 70 (1) :73_94 (1998)). MMP家族成員包括膠原蛋白酶、明膠酶、基質降解酶、基質溶解因子和膜結合MMP。 大多數MMP以無活性酶原形式分泌。分泌的酶原MMP可以通過幾種促炎性因子激活，促炎性因子例如氧化劑、蛋白酶包括彈性蛋白酶、纖溶酶和胰蛋白酶及其它MMP(Cuzner and Opdenakker. J. Neuroimmunol. 94(1-2) 1-14 (1999)) 在組織中，生理血 MMP 激活物包括組織或血漿蛋白酶或機會細菌蛋白酶。例如，纖溶酶原激活物/纖溶酶系統、包括遍在纖溶酶原和尿激酶(u-Pa)和組織型纖溶酶原激活物(t-Pa)是病理條件下pro-MMP的重要激活物。MMP活性可以由金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)抑制，由絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins) 抑制，及由非特異性蛋白酶抑制劑如α 2-巨球蛋白抑制。TIMP通過非共價結合MMP的活性鋅結合位點而抑制MMP活性。MMP和纖溶酶原激活物的蛋白酶解活性及其抑制劑在維持ECM完整性方面很重要，因為細胞-ECM相互作用影響和介導廣泛過程，包括各種細胞類型的增殖、分化、粘附和遷移。基質金屬蛋白酶的過量產生牽涉到組織損害和傷口癒合、炎性疾病、±曾生性疾病禾口自身免疫疾病中(St-Pierre et al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2(3) :206_215 (2003) ；Opdenakker, G. Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 59 (6) 489-514(1997))。
c.通過除去蛋白酶解位點導致的增加的蛋白酶解抗性 本領域技術人員已知任何方法如下文D部分所述方法可以用於修飾EPO多肽以增加蛋白酶抗性。例如，如本文實施例所述，2D掃描方法學已用於鑑別hEPO上的導致當用蛋白酶(血液、腸道等)、溶血產物或血清攻擊時穩定性增加的胺基酸改變。增加對蛋白酶 (血液、裂解物、腸道、血清等)的蛋白質穩定性包括在本文中，以提供特定蛋白質分子的更長的體內半壽期，由此降低對象所需給藥頻率。
設計蛋白酶解抗性hEPO突變體的第一步包括鑑別蛋白質序列上易受蛋白酶解攻擊的位點。基於選擇的血液、腸道或任何其它類型蛋白酶列表(表2)，首先in Silico確定 hEPO中可以被那些蛋白酶靶向的所有胺基酸和胺基酸序列的完全列表。這些蛋白酶靶位 (hEPO多肽上的胺基酸或胺基酸序列)被稱為in silico HIT(IS-HIT)0由於機體內蛋白酶混合物組成相當複雜，可以預期給定蛋白質序列中的大多數殘基可以被蛋白酶解靶向。
設計蛋白酶解抗性的hEPO的第二步包括鑑別合適的置換胺基酸以便如果它們置換了 is-HIT處的hEPO的天然胺基酸，所述蛋白(i)變得蛋白酶解抗性；以及(ii)引起至少與野生型hEPO多肽相當的活性水平。置換胺基酸的選擇必須考慮某些蛋白酶的廣譜靶特異性以及保持理化性質如hEPO中關鍵(例如催化行、結合等)殘基的疏水性、電荷和極性的需求。
「點接受的突變(Point Accepted Mutation)，，(PAM ；Dayhoff et al.，1978)可以用作2D掃描方法的部分。PAM值，最初用於產生蛋白質序列間的對比，可以以概率矩陣形式獲得，其反映了胺基酸之間的進化距離。參考序列中的殘基的保守取代是這樣的取代，其與相應的參考殘基物理學和功能上相似，即具有相似的大小、形狀、電荷和/或化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵和其它相互作用的能力。保守取代顯示以最高評分適合可接收點突變形式的PAM矩陣標準。PAM250矩陣用於2D掃描框架中以鑑別用於is_HIT的候選置換胺基酸，以產生不影響蛋白質功能的保守突變。選擇了至少兩個胺基酸用於在每個is-HIT進行置換，所述胺基酸在PAM250矩陣中具有相應於保守取代或可接受點突變的最高值。明確避免胺基酸由半胱氨酸置換，因為這一變化可以導致分子間二硫鍵形成。
簡而言之，使用PR0TE0L 算法(在線得自 infobiogen. fr 和 bioinfo. hku. hk/ services/analyseq/cgi-bin/proteol_in. pi)，建立了在 166 個胺基酸的成熟 hEPO 多肽 (SEQ ID NO 2)上的可以被識別為蛋白酶(血液、腸道等)的底物的殘基的列表，見表2。 該算法基於蛋白酶、蛋白酶的蛋白酶解特異性以及被輸入的多肽胺基酸序列生成了蛋白酶消化圖。表2示出是用選擇的蛋白酶和化學處理進行的蛋白酶解的靶位胺基酸位置的in silico 鑑別。
表2
胺基酸位置蛋白酶或化學處理
AspND內蛋白酶Asp-N
Chymo(F，W，Y，M，L) P胰凝乳蛋白酶
ClosR梭菌蛋白酶
CnBrM溴化氰
IBzOW鄰碘苯甲酸
MyxoKMyxobacter
ΝΗ20ΗFgWM
ρΗ2. 5FpρΗ 2. 5
ProEnP脯氨酸內肽酶
權利要求
1.一種修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽，其包含在被不同糖基化位點掩蔽的掩蔽is-Hit殘基處的2個胺基酸修飾；和在非掩蔽is-Hit殘基處的一或多個額外的胺基酸修飾，條件是所述修飾不是選自 R4H/K20Q/R139H/L80I ；E159N/K20Q/R139H/L93I ；L153V/K20Q/R139H/L80I ；和 E159N/ K20Q/R139H/L80I。
2.權利要求1的修飾的EPO多肽，其中所述修飾選自K20Q/R139H/R4H；K20Q/R139H/ K52N ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/ R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/ L153V；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/ K52N/L80I/R139H ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N；K20Q/L93V/R139H/ K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/ L153V；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ； K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/K52N/L80I/ R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H；K20Q/R139H/K52N/L153V ； R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
3.權利要求1或2的修飾的EPO多肽，其中所述修飾選自K20Q/L80I/R139H/E159N； K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/ R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ； K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；和 K20Q/L93V/R139H/ E159N/K52N。
4.一種修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽，其在未修飾的EPO多肽中包含選自L80I/ R139H/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/L93I ；K20Q/L153V ；K20Q/E159N ；K20Q/R4H ； K20Q/K52N ；K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V 的 2 或多個胺基酸修飾。
5.權利要求1-4任一項的修飾的EPO多肽，其中所述多肽是糖基化的、部分糖基化的或去糖基化的。
6.權利要求5的修飾的EPO多肽，其中所述多肽由於在糖基化位點NM、N38或N83的一或多個處的一或多個進一步的氨基修飾而是部分糖基化的或去糖基化的，其中所述修飾消除了該位點的糖基化。
7.權利要求6的修飾的EPO多肽，其中所述修飾是選自N24H，N38H,N83H, N24K, N38K 和N8I的胺基酸置換。
8.—種修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽，其在未修飾的EPO多肽中包含選自R4H/ R150H ；R4H/R143H ；R4H/E159N ；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/L153V ； R4H/K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q ；R4H/K45N ；R4H/K52N ； R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/K116T ； R4H/D123N；R4H/D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N ；R4H/ R143H ；R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q；R4H/L93I/R150H ；R4H/R143Q/R150H ；和R4H/L93I/E159N的2或多個胺基酸修飾。
9.一種修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽，其在EPO多肽中包含2或多個修飾，其中至少一個修飾是相應於SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :237所示胺基酸殘基的R4H。
10.權利要求9的修飾的EPO多肽，其中所述一或多個額外的胺基酸修飾選自P2S， P2A, P3S, P3A, R4Q, L5I，L5V，C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I, E13Q, E13H, E13N, R14H, R14Q, Y15H, Y15I, L16I, L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E23N, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, E31Q, E31H, E31N, L35V, L35I，E37Q，E37H, E37N, P42S, P42A, D43H, K45T, W51S, W51H, K52T, M54V, M54I, E62Q, E62H, E62N, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, E89N, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I, D96Q, D96H, D96N, K97Q, K97T, K97N, L102V, L102I, R103H, R103Q, L105I, L105V, L108I, L108V, L109I, L109V, R110H, R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123H, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H, Y145I, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, D165H, R166H，和 R166Q。
11.權利要求10的修飾的EPO多肽，其中所述額外的胺基酸修飾選自K20Q；F48I ； K52Q ；L80I ；P90S ；L93V ；L93I ；D96Q ；K116T ；L130I ；R131H ；R131Q；R143H ；R143Q ；R150H ； D123N ；D136N ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；L16I ；L16V ；R139H ； R139Q ；和 L153V。
12.權利要求11的修飾的EPO多肽，其中所述額外的胺基酸修飾選自K20Q;F48I； K52Q ；L80I ；L93V ；L93I ；K116T ；L130I ；R131H ；R143H ；R143Q ；R150H ；D123N ；E159N ；K116N ； K45N ；K52N ；D165H ；D165N ；L16I ；R139H ；R139Q ；禾口 L153V。
13.權利要求9-12任一項的修飾的EPO多肽，其中所述修飾的EPO選自R4H/R150H； R4H/R143H ；R4H/E159N ；R4H/R139H ；R4H/R139Q ；R4H/L93I ；R4H/D96Q ；R4H/L130I ；R4H/ L153V ；R4H/K20Q ；R4H/F48I ；R4H/R131Q；R4H/K45N；R4H/K52N ；R4H/K52Q ；R4H/L80I ；R4H/ K116T；R4H/D123N；R4H/D136N ；R4H/P90S ；R4H/D165Q ；R4H/D165H ；R4H/D165N ；R4H/K116N ； R4H/R143H ；R4H/R166H ；R4H/L16I ；R4H/L16V ；R4H/L93I/R143Q ；R4H/L93I/R150H ；R4H/ R143Q/R150H和 R4H/L93I/E159N。
14.權利要求1-13任一項的修飾的EPO多肽，其中所述未修飾的EPO多肽長度是160， 161，162，163，164，165 或 166 個胺基酸。
15.權利要求1-14任一項的修飾的EPO多肽，其中所述EPO多肽包含SEQID NO :2或 237所示胺基酸序列或與具有SEQ ID NO 2或237所示序列的多肽具有至少或具有至少大 ^ 60 %, 70 %, 75 %, 80 % , 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 或更高序列相同性的變體。
16.權利要求1-15任一項的修飾的EPO多肽，其中所述未修飾的EPO多肽包含SEQID NO :2或237所示胺基酸序列。
17.權利要求1-16任一項的修飾的EPO多肽，其中所述多肽被進一步修飾，且所述修飾是羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化、氧化或綴合聚乙二醇(PEG)部分的一或多種。
18.權利要求1-17任一項的修飾的EPO多肽，其中所述多肽含有導致該多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、氧化、PEG化或蛋白酶抗性發生改變的一或多個額外的胺基酸修飾。
19.編碼權利要求1-18任一項的修飾的EPO多肽的核酸分子。
20.一種載體，其包含權利要求19的核酸分子。
21.一種細胞，其包含權利要求19的核酸分子。
22.一種細胞，其包含權利要求20的載體。
23.權利要求21或22的細胞，其是原核細胞或真核細胞。
24.一種藥物組合物，其包含權利要求1-18任一項的修飾的EPO多肽。
25.權利要求對的藥物組合物，其中所述組合物是液體、溶液、懸浮液、氣霧劑、片劑、 錠劑或膠囊的形式。
26.權利要求25的藥物組合物，其中所述組合物是片劑或膠囊的形式。
27.權利要求沈的藥物組合物，其中所述片劑或膠囊是腸溶包衣的。
28.權利要求對-27任一項的藥物組合物，其配製為口服、胃腸外、靜脈內、皮下、口腔、 吸入、肌內、直腸或局部施用。
29.權利要求觀的藥物組合物，其配製為口服施用。
30.權利要求四的藥物組合物，其中所述藥物組合物配製口服施用至胃腸道。
31.一種治療方法，包括施用權利要求M-30任一項的藥物組合物，其中所述疾病或病症可被促紅細胞生成素(EPO)治療。
32.權利要求31的治療方法，其中口服施用所述藥物組合物。
33.權利要求31或32的治療方法，其中所述疾病或病症選自伴隨腎衰竭、AIDS、惡性疾病和慢性炎症的貧血；圍手術期手術；鐵超載病症；異常止血；組織保護治療；神經性障礙； 和自體捐血。
34.權利要求33的方法，其中所述貧血選自地中海貧血，鐮刀細胞貧血，早產兒貧血， 伴隨順鉬化療的貧血，和大劑量放療和/或化療加骨髓移植後貧血。
35.一種配製為口服施用的藥物組合物，其包含修飾的治療性多肽或所述多肽的活性片段，所述活性片段中含有一或多個修飾，其中所述治療性多肽或其活性片段是含有至少一個糖基化位點的多肽；所述治療性多肽或其活性片段在一或多個掩蔽的is-HIT殘基處包含一或多個胺基酸修飾；及所述治療性多肽或其活性片段與不包含所述一或多個胺基酸修飾的未修飾的治療性多肽相比顯示增加的蛋白酶抗性。
36.權利要求35的藥物組合物，其中所述掩蔽的is-HIT殘基選自在所述多肽的糖基化位點0_25人之內的is-HIT殘基。
37.權利要求35或36的藥物組合物，其中所述掩蔽的is-HIT殘基選自在所述多肽的糖基化位點 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 或 25人之內的is-HIT殘基。
38.權利要求35-37任一項的藥物組合物，其中所述修飾的治療性多肽是糖基化的、部分糖基化的或去糖基化的。
39.權利要求35-38任一項的藥物組合物，其中所述治療性多肽是細胞因子。
40.權利要求39的藥物組合物，其中所述治療性多肽選自促紅細胞生成素(ΕΡ0)，白細胞介素-1 β (IL-I)，白細胞介素-2 (IL-2)，白細胞介素-3 (IL-3)，白細胞介素_4 (IL-4)，白細胞介素-5(IL-5)，白細胞介素-6(IL-6)白細胞介素_9 (IL-9)，幹擾素-β (IFN-β)，幹擾素-Y (IFN-γ)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)， 巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)，血小板生成素(TPO)，白血病抑制因子(LIF)，幹細胞因子(SCF)，制瘤素M(OSM)和血管內皮生長因子(VEGF)。
41.權利要求40的藥物組合物，其中所述治療性多肽選自SEQID Ν0:2，237 274,276, 278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304 和 306 的任一個，其活性片段，或與 SEQ ID NO 2,237 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300，302，304和306任一所示多肽具有至少或至少大約60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 95%，96%，97%，98%，99%或更高序列相同性的變體。
42.權利要求35-41任一項的藥物組合物，其中所述治療性多肽包含至少2個胺基酸修飾，及所述2個胺基酸修飾在被不同糖基化位點掩蔽的掩蔽is-HIT殘基處。
43.權利要求35-42任一項的藥物組合物，其中所述治療性多肽是SEQID NO :2或SEQ ID NO :237所示的促紅細胞生成素(EPO)多肽，或者是與具有SEQ ID NO :2或237所示序列的多肽具有至少或至少大約 60 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %， 99%或更高序列相同性的變體。
44.權利要求43的藥物組合物，其中所述EPO多肽中的掩蔽is-HIT殘基選自被在選自 N24，N38, N83和SU6的一或多個糖基化位點的糖基化掩蔽的殘基。
45.權利要求44的藥物組合物，其中所述掩蔽is-Hit殘基選自相應於SEQID NO 2 或SEQ ID而237中胺基酸殘基的胺基酸殘基1 14丄16丄17』18，1(20工21工23工31丄；35， E37, P42, D43, E62, W64, L67, L69, L70, E72, L75, R76, L80, L81, P87, W88, E89, P90, L91, L93，D96，K97，P121，P122，D123，P129，L130，R131，D136，F138，R139，K140，L141，F142，R143 和 Y145。
46.權利要求45的藥物組合物，其中所述掩蔽is-HIT殘基被選自R14H，R14Q，L16I， L16V, L17I, L17V, E18Q, E18H, E18N, K20Q, K20T, K20N, E21Q, E21H, E21N, E23Q, E23H, E31Q, E31H, L35V, L35I, E37Q, E37H, P42S, P42A, D43Q, D43H, E62Q, E62H, W64S, W64H, L67I, L67V, L69V, L69I, L70I, L70V, E72Q, E72H, L75V, L75I, R76H, R76Q, L80V, L80I, L81I, L81V, P87S, P87A, W88S, W88H, E89Q, E89H, P90S, P90A, L91I, L91V, L93V, L93I，D96Q，D96H, K97Q, K97T, P121S, P121A, P122S, P122A, D123H, D123N, P129S, P129A, L130V, L130I, R131H, R131Q, D136Q, D136H, D136N, F138I, F138V, R139H, R139Q, K140N, K140Q, L141I, L141V, F142I, F142V, R143H, R143Q, Y145H和Y145I的一或多個胺基酸修飾修飾。
47.權利要求46的藥物組合物，其中所述掩蔽is-HIT殘基被選自K20Q，L80I,P90S， L93I, L93V, D96Q, D123N, L130I, R131H, R131Q, D136N, R139H, R139Q, R143H 和 R143Q 的一或多個胺基酸修飾修飾。
48.權利要求47的藥物組合物，其中所述掩蔽is-HIT殘基被選自K20Q，L80I,L93I，L93V和R139H的一或多個胺基酸修飾修飾。
49.權利要求48的藥物組合物，其中所述治療性多肽是選自R139H;L93I；K20Q/ R139H ；K20Q/R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/ L80I/R139H/L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V ；R139H/L93I ；K20Q ；K20Q/L93I ；L80I ；L93V ； K20Q/L80I ；和 K20Q/L93V 的修飾的 ΕΡ0。
50.權利要求49的藥物組合物，其中所述治療性多肽是選自R139H，R139H/K20Q，K20Q/ R139H/L93I ；L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L80I ；K20Q/R139H/L93V ；K20Q/L80I/R139H/ L93I ；R139H/L80I ；R139H/L93V 禾口 R139H/L93I 的修飾的 ΕΡ0。
51.權利要求35-50任一項的藥物組合物，其中所述治療性多肽在非掩蔽is-HIT殘基處進一步包含一或多個胺基酸修飾。
52.權利要求51的藥物組合物，其中所述治療性多肽是促紅細胞生成素(EPO)多肽且所述非掩蔽is-HIT殘基選自相應於 SEQ ID NO :2 或 237 的胺基酸殘基 P2，P3，R4, L5，C7，D8，RIO, L12, E13, Y15, C29, K45, F48, Y49, W51, K52, R53, M54, E55, L102, R103, L105, L108, L109, R110, L112, K116, E117, F148, L149, R150, K152, L153, K154, L155, Y156, E159, R162, D165，和 R166。
53.權利要求52的藥物組合物，其中所述在非掩蔽is-HIT殘基處的進一步修飾選自 P2A, P3S, P3A, R4H, R4Q, L5I, L5V, C7S, C7V, C7A, C7I，C7T，D8Q, D8H, D8N, R10H, R10Q, L12V, L12I，E13Q，E13H, E13N, Y15H, Y15I, C29S, C29V, C29A, C29I, C29T, K45Q, K45T, K45N, F48I, F48V, Y49H, Y49I，W51S，W51H, K52Q, K52T, K52N, R53H, R53Q, M54V, M54I, E55Q, E55H, E55N, E62N, L102V, L102I，R103H，R103Q,L105I，L105V，L108I，L108V，L109I，L109V，R110H,R110Q, L112V, L112I, K116Q, K116T, K116N, E117Q, E117H, E117N, D123Q, F148I, F148V, L149I, L149V, R150H, R150Q, K152Q, K152T, K152N, L153I, L153V, K154Q, K154T, K154N, L155V, L155I, Y156H, Y156I, E159Q, E159H, E159N, R162H, R162Q, D165Q, D165H, D165N, R166H，和 R166Q0
54.權利要求53的藥物組合物，其中所述在非掩蔽is-HIT殘基處的進一步修飾選自 R4H ；F48I ；K52Q ；K116T ；R150H ；E159N ；K116N ；K45N ；K52N ；D165Q ；D165H ；D165N ；R166H ；和 L153V。
55.權利要求M的藥物組合物，其中所述在非掩蔽is-HIT殘基處的進一步修飾選自 R4H, K52N, L153V 和 E159N。
56.權利要求51-55任一項的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽:R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/ R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/ R139H/E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/ E159N ；L93V/R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/ E159N ；K20Q/L93I/R139H/K52N；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/ L80I/R139H/E159N ；K20Q/K52N/80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/L153V；K20Q/L93V/R139H/ R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/ R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/R139H/L153V；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L153V；K20Q/ E159N ；K20Q/R4H ；K20Q/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/K52N/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/ E159N/R4H；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/ K52N/L80I/R139H ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
57.權利要求56的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽R139H/R4H ；R139H/K52N ；R139H/L153V ；R139H/E159N ；K20Q/R139H/R4H ；K20Q/ R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ；L80I/R139H/R4H ；L80I/R139H/ E159N ；L80I/R139H/K52N ；L80I/R139H/L153V ；L93V/R139H/R4H ；L93V/R139H/E159N ；L93V/ R139H/K52N ；L93V/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N；K20Q/ L93I/R139H/K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/ E159N ；K20Q/L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/ L93V/R139H/K52N ；K20Q/L93V/R139H/L153V ；L93I/R139H/E159N ；L93I/R139H/K52N ；L93I/ R139H/L153V ；L93I/R139H/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/E159N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/ L153V/R4H ；K20Q/L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/R139H/E159N/L153V ；K20Q/L931/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H/L93I ；K20Q/R139H/L153V/ R4H；K20Q/R139H/K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/ L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/ K52N。
58.權利要求57的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽K20Q/R139H/R4H ；K20Q/R139H/K52N ；K20Q/R139H/L153V ；K20Q/R139H/E159N ； L80I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H ；K20Q/L93I/R139H/E159N ；K20Q/L93I/R139H/ K52N ；K20Q/L93I/R139H/L153V ；R4H/K20Q/L80I/R139H ；K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/ L80I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H；K20Q/L80I/ R139H/E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/E159N/L93I ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/ L80I/R139H/L153V/L93I ；K20Q/R139H/E159N/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/ R139H/E159N/L153V ；R4H/K20Q/L801/Rl39H/L931 ；K20Q/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/ K52N/L153V ；R4H/K20Q/L93I/R139H/K52N ；R4H/K20Q/L93I/R139H/L153V ；K20Q/L93V/ R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N ；和 K20Q/R139H/R4H/K52N。
59.權利要求58的藥物組合物，其中所述治療性多肽是具有選自如下修飾的修飾的 EPO 多肽K20Q/L80I/R139H/E159N ；K20Q/L801/Rl39H/E159N/R4H ；K20Q/L80I/R139H/ E159N/K52N ；K20Q/L80I/R139H/L153V/R4H ；K20Q/R139H/E159N/K52N ；K20Q/R139H/E159N/ L153V ；K20Q/L93I/R139H/E159N/R4H ；K20Q/L93I/R139H/E159N/K52N ；K20Q/L93I/R139H/ E159N/L153V ；K20Q/L93V/R139H/E159N/K52N。
60.權利要求43-59任一項的藥物組合物，其在糖基化位點N24、N38和N83的一或多個處進一步包含一或多個氨基修飾，其中所述修飾消除了在該位點的糖基化。
61.權利要求60的藥物組合物，其中所述修飾是選自NMH，N38H,N83H, N24K, N38K和 N83K的胺基酸置換。
62.權利要求43-61任一項的藥物組合物，其中所述未修飾的EPO多肽長度是160， 161，162，163，164，165 或 166 個胺基酸。
63.權利要求43-62任一項的藥物組合物，其中所述未修飾的EPO多肽包含SEQID NO: 2或237所示胺基酸序列。
64.權利要求35-63任一項的藥物組合物，其中所述修飾的治療性多肽被進一步修飾且所述修飾是羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化白蛋白化、氧化或綴合聚乙二醇(PEG)部分的一或多種。
65.權利要求35-64任一項的藥物組合物，其中所述修飾的治療性多肽含有導致修飾的治療性多肽的免疫原性、羧基化、羥基化、hasylation、氨甲醯化、硫酸化、磷酸化、氧化、 PEG化或蛋白酶抗性發生改變的一或多個額外的胺基酸修飾。
66.權利要求35-65任一項的藥物組合物，其配製為片劑或膠囊。
67.權利要求66的藥物組合物，其中所述片劑或膠囊是腸溶包衣的。
68.權利要求35-67任一項的藥物組合物，其配製為液體。
69.一種治療方法，其包含口服施用權利要求35-68任一項的藥物組合物，其中所述疾病或病症可被所述治療性多肽治療。
70.權利要求69的治療方法，其中所述藥物組合物中的修飾的治療性多肽是修飾的促紅細胞生成素(EPO)且所述疾病或病症選自伴隨腎衰竭、AIDS、惡性疾病和慢性炎症的貧血；圍手術期手術；鐵超載病症；異常止血；組織保護治療；神經性障礙；和自體捐血。
71.權利要求70的方法，其中所述貧血選自地中海貧血，鐮刀細胞貧血，早產兒貧血， 伴隨順鉬化療的貧血，和大劑量放療和/或化療加骨髓移植後貧血。
72.權利要求M-30或35-68任一項的藥物組合物，其配製為用於治療可用所述促紅細胞生成素(EPO)多肽或所述治療性多肽治療的疾病或病症的藥物。
73.權利要求M-30或35-68任一項的藥物組合物，其用於治療可用所述促紅細胞生成素(EPO)多肽或所述治療性多肽治療的疾病或病症。
全文摘要
提供了修飾的促紅細胞生成素(EPO)多肽和其它修飾的治療性多肽。所述EPO多肽和其它治療性多肽經修飾分別顯示與未修飾的EPO多肽和其它未修飾的治療性多肽不同的物理性質和活性。還提供了編碼這些多肽的核酸分子。還提供了利用所述多肽的治療和診斷方法。
文檔編號C12N15/12GK102186879SQ200980129823
公開日2011年9月14日 申請日期2009年5月29日 優先權日2008年5月29日
發明者T·居永, G·伯雷利, X·加萊, L·德裡坦提, M·維嘉 申請人:韓諾生物制約株式會社