一種改良黃顙魚生長性狀的複合育種方法與流程

2023-12-05 07:35:51 1

本發明涉及一種改良黃顙魚生長性狀的複合育種方法，屬於黃顙魚遺傳育種領域。
背景技術：
：黃顙魚(pelteobagrusfulvidraco)隸屬於鯰形目(siluriformes)、鱨科(bagridae)、黃顙魚屬(pelteobagrus)，是我國重要的水產養殖品種，在長江水系廣為分布，是我國較重要的底層小型經濟魚類。由於肉味鮮美，肉質細嫩，營養豐富，肌間刺少，離水後可存活一段時間，可鮮活上市，已越來越受到我國人民的喜愛和歡迎，並保持較高的市場需求和銷售價格。因此，已成為我國很有養殖前途的主導品種之一。目前，隨著黃顙魚養殖規模的擴大，該魚開始出現種質退化、生長個體變小、抗逆性變差等現象，急需對黃顙魚進行遺傳改良，培育出生長速度快、當年苗種能長到商品規格、適應性強的黃顙魚新品系(種)來滿足市場需求。鑑於雜交育種已成為提高魚類產量和改善魚類品質的重要手段，目前已有關於黃顙魚×烏蘇里擬鱨、黃顙魚×粗唇鮠、黃顙魚×瓦氏黃顙魚遠緣雜交和黃顙魚和yy超雄黃顙魚選育的相關報導。黃顙魚雌魚和yy超雄黃顙魚雄魚的子代(「全雄1號」黃顙魚)已達到規模化繁育水平，但其生產成本過高，已報導的黃顙魚雌魚和瓦氏黃顙魚雄魚雜交子代體型厚實，生長優勢極其顯著，但同時也存在受精率低、畸形率高、孵化率低的問題。鑑於近些年全國各地繁養殖戶對雜交黃顙魚的認可和市場需求的不斷擴大，有必要對現在已有的關於黃顙魚雌魚和瓦氏黃顙魚雄魚雜交制種技術進一步改良。技術實現要素：發明目的：針對上述技術問題，本發明對現有的一種黃顙魚雌魚和瓦氏黃顙魚雄魚雜交育種方法進行改進，通過對親本的群體選育，並用微衛星標記和金屬數碼晶片技術篩選出供雜交繁育的親本，保證了雜交黃顙魚的生長性狀和雜種優勢均高於普通黃顙魚，為黃顙魚新品種的培育提供了一條新的途徑。技術方案：本發明公開了一種改良黃顙魚生長性狀的複合育種方法，包括以下步驟：首先，通過二代群體選育獲得優質的黃顙魚和瓦氏黃顙魚親本庫；接著利用微衛星標記檢測黃顙魚和瓦氏黃顙魚親本，挑選遺傳相似度在90％以上的親本個體作為繁殖群體；然後以黃顙魚雌魚為母本，瓦氏黃顙魚雄魚為父本進行雜交制種。優選，所述二代群體選育的方法為：選擇不同來源的黃顙魚和瓦氏黃顙魚通過人工催產和人工授精，分段培育到至少2齡，培育分三階段選擇，第一階段選擇率60％，第二階段分雌雄選擇，選擇率50％，第三階段選擇率40％。總選擇率為1.2％；將一代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚按上述方法再選擇一次，得到二代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚群體。優選，所述利用微衛星標記檢測黃顙魚和瓦氏黃顙魚親本，挑選遺傳相似度在90％以上的親本個體作為繁殖群體的方法為：使用seqidno:1～41所示的擴增引物，分別以選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚基因組dna為模板進行螢光pcr擴增，經基因分析儀進行基因型分析，利用cervus3.0等軟體對所選微衛星進行群體遺傳多樣性分析和聚類圖的構建，篩選出遺傳相似度在90％以上的親本個體作為繁殖群體。優選，所述黃顙魚雌魚與瓦氏黃顙魚雄魚雜交制種配比比例數量為300:2。優選，所述雜交制種過程中包括親本培育、親本選擇、親本催產、人工授精、人工孵化和魚苗培育及養成。進一步優選，所述親本選擇的標準為：二代選育的黃顙魚繁殖群體至少1000尾，其中黃顙魚雌魚體質量不低於80g；二代選育的瓦氏黃顙魚繁殖群體至少200尾，其中瓦氏黃顙魚雄魚體質量不低於500g。進一步優選，所述親本催產的方法為：對黃顙魚雌魚和瓦氏黃顙魚雄魚採用激素藥物外源注射法進行人工催產。具體的育種方法如下：1、黃顙魚和瓦氏黃顙魚的群體選育選擇不同來源的黃顙魚和瓦氏黃顙魚通過人工催產和人工授精，分段培育到至少2齡，培育分三階段選擇，第一階段選擇率60％，第二階段分雌雄選擇，選擇率50％，第三階段選擇率40％。總選擇率為1.2％(見圖1和圖2)。將一代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚按上述方法再選擇一次，得到二代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚群體。2、黃顙魚和瓦氏黃顙魚的遺傳檢測利用微衛星標記(見表1)對二代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚群體抽樣進行遺傳相似度檢測，分別挑選出遺傳相似度在90％以上的親本個體作為繁殖群體。表1用於檢測黃顙魚和瓦氏黃顙魚親魚群體遺傳相似度的微衛星引物其中pcr所用的螢光通用引物核苷酸序列為：m13(-21)：5』-tgtaaaacgacggccagt-3』(seqidno.41)。使用在線軟體misa(microsatellite,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)挖掘瓦氏黃顙魚轉錄組序列中的微衛星標記；採用primer5.0設計軟體對篩選出的ssr序列設計引物，進行pcr擴增，確定各個引物的退火溫度。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。pcr體系為20μl體系，包括：dna模板(1μl)，正反引物各(0.8μl)，ddh2o(7.4μl)，2×taqmix(10μl)。pcr擴增的反應程序：95℃預變性5min；32個循環，每個循環包括94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min，4℃保存。擴增產物經瓊脂糖凝膠法檢驗後，4℃保存。將符合要求的est-ssr引物利用黃顙魚和瓦氏黃顙魚的32個體進行pcr擴增，採用8％的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳驗證多態性，從中篩選出多態性高的est-ssr位點(見表1)。3、雜交黃顙魚制種(見圖3)(1)親本培育雌雄親魚單養或混養，可適當搭配濾食性魚類。時間選擇在10月份或翌年的3月，水溫要求在15℃以上。繁殖季節放養密度以200kg/667m3～400kg/667m3為宜，非繁殖季節放養密度以500kg/667m3～750kg/667m3為宜。保持水質清新，透明度以40cm～50cm為宜，溶氧量達到5.0mg/l以上，催產前的一個月間隔5d～7d衝新水一次，以刺激親魚性腺發育。(2)親本選擇選擇80克以上體色黃黑間隔明顯、活力強的、體型正常，體格健壯，體表光滑、無疾病、無畸形的2齡黃顙魚雌魚作為雌性親本。選擇500克以上體表無損傷的、體型正常、活力強的、健康的2齡以上瓦氏黃顙魚作為雄性親本。(3)親本催產水溫在22℃～30℃時，選擇腹部膨大，仰腹可見卵巢輪廓明顯，生殖孔擴張、紅腫、寬而圓，用手輕輕擠壓魚腹，腹部鬆軟而富彈性，體色較豔，體型短粗的黃顙魚雌魚，體型瘦長，腹部不膨大，生殖突尖而長、末端有細孔呈紅色充血狀的，體表條紋明顯的瓦氏黃顙魚雄魚採用激素藥物外源注射法進行人工催產。母本的注射量依據水溫而定(見表2)，父本注射劑量為母本的30％～50％。水溫高於26℃時雄魚可不注射催產激素。肌肉直射在親魚背部肌肉或腹腔注射，注射部位為胸鰭基部或背部肌肉。注射後將親魚放入小網箱或面積在4m2～20m2之內，水深0.6m～0.8m的培育池中培育，配備充氣式增氧設備。不同水溫下的效應時間不同，效應時間的長短依據表3確定。表2黃顙魚雌魚在不同水溫下的推薦注射次數、針距和劑量表3水溫與效應時間的關係水溫，℃20～2122～2324～2526～2728～2930～32效應時間，h28～3222～2420～2416～1912～1510～12(4)人工授精輕壓雌魚腹部，洩殖孔中有卵粒流出時，即可人工授精。將成熟度適中的雄性親本剖腹，取出精巢並剪成碎片，稱重後放在孔徑0.25mm～0.35mm的金屬絲網篩上研磨，濾去精巢組織殘渣。每克精巢用5ml，ph＝7.17的精子稀釋液(表4)攪拌後在4℃～8℃下避光保存備用。與此同時，將開始排卵的雌性親本用紗布裹住，使其腹部外露，用手由前向後擠壓其腹部，將卵全部擠出，放入已滅菌的乾燥玻璃器皿中。取卵子體積約1/3左右濃度為0.8％的生理鹽水，將精子放入生理鹽水中攪拌3s～5s，激活精子，再放入到卵中攪拌30s～40s進行受精。每1000g卵加入2ml稀釋後的精子，受精後的卵均勻地撒在規格60cm×40cm、孔徑0.35mm～0.45mm的網片上，轉移至孵化池孵化，或經10％～15％的黃泥漿脫粘處理後放入孵化桶孵化。表4精子稀釋液配製方法配方劑量nacl7.8gcacl20.21gkcl0.2gnahco30.021g蒸餾水1000ml(5)人工孵化將已粘附卵的魚巢，使用10ppm高錳酸鉀浸泡15min後，置於孵化池中流水充氧孵化或直接放入經清塘消毒後的池塘中孵化；在受精8小時後使用10ppm亞甲基藍浸泡3min。水泥池靜水孵化放卵密度為每立方米水體4×104粒～6×104粒，微流水孵化放卵密度為每立方米水體1.5×105粒～2×105粒。孵化桶孵化放卵密度為每立方米水體1×106粒～1.5×106粒。孵化用水應用網孔尺寸0.25mm的尼龍或乙綸網布過濾，嚴防敵害生物進入。池水溫差≤1.5℃，溶氧在6mg/l以上。70h後移出孵化設備，移至培育池內進行培育。魚苗孵化時間依水溫高低、孵化方式而定(表5)。在魚苗出膜15h後，將水泥池水位降至30cm左右，孵化桶孵化的魚苗轉移至水泥池暫養。暫養過程保持微流水和充氣式增氧。表5水溫、孵化方式和脫膜時間的關係(6)魚苗培育及下塘魚苗的培育採取分段式培育，第一階段：魚苗破膜至全長1cm，放養密度一般為0.5×104尾/立方米～1.5×104尾/立方米。仔魚脫膜後1～3d不需要進食，3天後投餵3～4克/立方米水體滷蟲作為開口餌料。仔魚開口後，每天進行吸汙，日換水1/4～1/3。第二階段：夏花的培育，放養密度為每畝1.5～2萬尾，水花下池後每畝用2㎏～3㎏定點豆漿潑灑一周，5～6d後用粉料成團池塘四周投喂，養殖20天左右，長至3釐米以上，及時分池。第三階段：幼魚到成魚的培育，放養密度為每畝1～1.2萬尾，分苗後需要重新馴化飼料。每天投餵前需要抽汙，投餵時關氣泵。每隔15d～20d加換新水一次，保持水透明度在25cm～30cm之間。也可參照《黃顙魚養殖技術規程》水產行業標準(ny/t1351-2007)進行養殖。技術效果：相對於現有技術，本發明採用經二代群體選育的黃顙魚雌魚和瓦氏黃顙魚雄魚可將雜交受精率提高至80％以上，還能減少親本雄魚的宰殺數量，提高雄魚的使用效率，間接性的提高經濟效益。對雜交魚苗採用分段式培育，明顯提高了魚苗的成活率，雜交魚苗畸形減少至2％以下，雜交黃顙魚的生長速度比普通黃顙魚快20％以上，達到改良了普通黃顙魚的生長性狀的目的。附圖說明圖1：瓦氏黃顙魚群體選育技術路線圖；圖2：黃顙魚群體選育技術路線圖；圖3：雜交黃顙魚制種技術路線與工藝圖。具體實施方式下面通過具體實施例對本發明所述的技術方案給予進一步詳細的說明，但有必要指出以下實施例只用於對
發明內容的描述，並不構成對本發明保護範圍的限制。實施例1：一、黃顙魚和瓦氏黃顙魚的群體選育選擇不同來源的黃顙魚和瓦氏黃顙魚通過人工催產和人工授精，分段培育到至少2齡，培育分三階段選擇，第一階段選擇率60％，第二階段分雌雄選擇，選擇率50％，第三階段選擇率40％。總選擇率為1.2％(見圖1和圖2)。將一代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚按上述方法再選擇一次，得到二代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚群體。二、黃顙魚和瓦氏黃顙魚的遺傳檢測利用微衛星標記(見表1)對二代選育的黃顙魚和瓦氏黃顙魚群體抽樣進行遺傳相似度檢測，分別挑選出遺傳相似度在90％以上的親本個體作為繁殖群體。三、雜交黃顙魚制種(見圖3)1、親本選擇2月底，選擇2年齡體表無損傷的、體型正常、活力強的、健康的、規格在80克以上選育二代以上的黃顙魚雌魚作為雌性親本。選擇3年齡體表無損傷的、體型正常、活力強的、健康的、規格在500克以上選育二代以上的瓦氏黃顙魚雄魚作為雄性親本，在面積20m2，水深1.5m的水泥池塘馴養。早晚各巡塘一次，觀察天氣、水質變化、親魚活動和攝食情況，定期檢查性腺發育情況。2、人工催產5月下旬，當水溫高於22℃時開始人工催產，選擇腹部膨大，仰腹可見卵巢輪廓明顯，生殖孔擴張、紅腫、寬而圓，用手輕輕擠壓魚腹，腹部鬆軟而富彈性，體色較豔，體型短粗的黃顙魚雌魚，體型瘦長，腹部不膨大，生殖突尖而長、末端有細孔呈紅色充血狀的，體表條紋明顯的瓦氏黃顙魚雄魚採用激素藥物外源注射法進行人工催產。在親魚背部肌肉分兩次注射。黃顙魚第一針的注射量為：22μg/kg促黃體素釋放激素(lhrh-a2)、3mg/kg馬來酸地歐酮(dom)。第二針的注射量為：22μg/kg促黃體素釋放激素(lhrh-a2)、10mg/kg馬來酸地歐酮(dom)，2200iu/kg絨毛膜促性腺激素(hcg)，瓦氏黃顙魚的激素用量為黃顙魚的30％。注射後將親魚放入面積為10m2，水深0.6m～0.8m，氧氣充足的水泥池中培育，24h後檢查催產效果，達到產卵時期進行人工取卵取精。3、人工授精雌性黃顙魚到達效應期後，取瓦氏黃顙魚雄魚，剪斷下頜處動脈放血30s，取出精巢，擦乾精巢表面液體，稱重後放在孔徑0.35mm的金屬絲網篩上研磨，濾去精巢組織殘渣。每克精巢用5ml的精子稀釋液加入ph7.17的精子稀釋液攪拌後在4℃下避光保存備用。與此同時，將開始排卵的雌性親本用紗布裹住，使其腹部外露，用手由前向後擠壓其腹部，將卵擠入到乾燥、乾淨的容器中。取卵子體積約1/3左右0.5％的生理鹽水，將精子放入生理鹽水中攪拌5s，激活精子，再放入到卵中攪拌40s進行受精。每500g卵加入2ml稀釋後的精子。受精後的卵均勻地撒在規格60cm×40cm、孔徑0.35mm～0.45mm的網片上，轉移至孵化池孵化。4、人工孵化孵化用水用網孔尺寸0.25mm的尼龍或乙綸網布過濾，嚴防敵害生物進入。將人工授精卵放入25℃水溫的孵化網進行流水孵化，將已粘附卵的魚巢，使用10ppm高錳酸鉀浸泡15min後，置於孵化池中流水充氧孵化；孵化期間為防治受精卵得水黴病，在受精8小時後使用10ppm亞甲基藍浸泡3min，在出膜前的10小時以上進行「抖卵」，將發黴的卵和死卵，抖掉並用吸管虹吸出來，防止水質變壞，留下好的受精卵等待出膜；將已脫粘的魚卵放入孵化缸中孵化，放卵密度為每立方米水體1×106粒～1.5×106粒。池水溫差≤1.5℃，溶氧在6mg/l以上。在魚苗出膜15h後，將水泥池水位降至30cm左右，70h後移出孵化設備，移至培育池內進行培育。5、雜交黃顙魚魚苗培育及養成魚苗破膜至全長1cm，放養密度一般為0.5×104尾/立方米～1.5×104尾/立方米。仔魚脫膜後1～3d不需要進食，3天後按照3～4克/立方米水體投餵滷蟲作為開口餌料。仔魚開口後，每天進行吸汙，日換水1/4～1/3。待魚苗生長至3cm長左右進行分池，放養密度為1.5～2萬尾/畝，水花下池後水花下池後每畝用2kg～3kg定點豆漿潑灑一周，5～6d後用粉料成團池塘四周投喂。魚苗下塘3天後，加注新水10cm～15cm，以後每4d～5d加一次，等水位達到90cm左右時，採取換水方式來調節水質，保持水透明度在25cm～30cm之間。雜交魚苗養殖到60天左右便可看出其兼具了雙親的優良性狀，具有顯著雜交優勢：體色誘人(偏母本)、生長快速(偏父本)。一冬齡魚抽樣檢測30條，雜交黃顙魚平均規格達到150克以上，平均生長速度比普通黃顙魚快20％以上(見表6)。表61冬齡雜交黃顙魚和普通黃顙魚的體重及形態差異比較體重和形態體徵比較雜交黃顙魚普通黃顙魚平均體重(g)150.485.6體型生長快，體型大生長慢，體型小吻部吻部突出，呈馬蹄型吻鈍，呈月牙型胸鰭後緣有鋸齒，前緣不太明顯前後緣都有鋸齒sequencelisting南京師範大學一種改良黃顙魚生長性狀的複合育種方法2017.0441patentinversion3.3120dna人工序列1ggactggaacacaacaggct20220dna人工序列2cccaaaccgcacattatttc20321dna人工序列3gctttttatcatgcagtgtgg21421dna人工序列4gaaaattcagcatttccaagc21520dna人工序列5caggctaaccttggcttgac20619dna人工序列6cagtcccagtcagctctgc19720dna人工序列7ccgtacacagttgctctcca20820dna人工序列8caaaacactccagcagtcca20920dna人工序列9ctgtcacactcgccttcaaa201020dna人工序列10ttactcgcagtgcattttgg201120dna人工序列11gctgagaactgaaaccctgc201220dna人工序列12acatggacctcccattgtgt201320dna人工序列13tttcaatggcctcctgattt201420dna人工序列14ttcttccctttttccctcgt201520dna人工序列15gccaagacgacatcacagaa201620dna人工序列16tgtgccaggttgtgtacgtt201720dna人工序列17tcggtcagttcagatcacca201820dna人工序列18cacacaacacaatctgccaa201920dna人工序列19gatgaaagaaacccggaaca202020dna人工序列20tggagagaaagaaggccaga202120dna人工序列21caacgactggaggtcaaaca202221dna人工序列22agctgacggaactgttactgc212320dna人工序列23tgaaatagcttgccgttgtg202420dna人工序列24tggattgttgtgaggttgga202520dna人工序列25gggattagggtgtagggagc202620dna人工序列26ccctaagttgagcgccttta202720dna人工序列27tcactaccggggactgactt202820dna人工序列28taaaaattcaccggccattc202920dna人工序列29agcattggagccgatcatac203020dna人工序列30aggcaccctcagtaagagca203120dna人工序列31agcagcctcttcaaccgtta203221dna人工序列32caggtagagtgggagtgatgg213320dna人工序列33tcaaactgggcaaaaactcc203420dna人工序列34aacgaagggggttttcagat203520dna人工序列35ttttctgaaggagacgtcgg203619dna人工序列36ccaggcaggatggttacct193720dna人工序列37cttcccagaagtctgaacgg203820dna人工序列38tccaggatcaggacatcaca203920dna人工序列39ccactggcaaaacattgaaa204020dna人工序列40tcagacccgccttaatatgc204118dna人工序列41tgtaaaacgacggccagt18當前第1頁12