一種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-11-30 16:07:41

一種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白，稱為BhSMP1，來源於苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea?hygrometrica），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；（b）將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明篩選到一個受乾旱誘導表達的BhSMP1基因及其編碼的蛋白，該蛋白及其編碼基因對於培育抗旱、抗鹽性提高的作物、林草等新品種具有重要的理論及實際意義，可用於農牧業和生態環境治理所需的抗性植物品種的培育與鑑定。
【專利說明】一種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因與 應用。

【背景技術】
[0002] 隨著全球水資源的缺乏和極端氣候事件的增長，乾旱對作物的產量和品質的影響 日趨顯著。因此，通過分子操作技術提高作物的抗旱性日顯重要。
[0003] 生物體受到乾旱脅迫或其它不良環境因素後，會通過不同途徑抵抗不良脅迫。種 子成熟過程中也伴隨著這耐旱性的獲得，包括耐旱相關蛋白的合成與積累，保護物質的產 生，有害物質的清除等。種子成熟蛋白的含量與植物的耐旱性的形成具有重要作用，且能提 高逆境中的萌發率。
[0004] 復甦植物因其可以忍受極度乾旱的條件，待水份充足時又能很快恢復正常生命活 動的特性而被認為是研究抗逆機制和提供抗逆基因的極好的植物資源。旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)是在我國分布的一種苦苣苔科復甦植物，該植物的葉片具有很強的耐旱復 蘇能力，在室溫、相對空氣溼度為〇的條件下生長72小時後，葉片相對含水量降為3%左右， 葉片面積皺縮至原葉片面積的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新給水，葉片就可以吸 水伸展，並恢復成未處理前的葉片表觀狀態和生理狀態(包括光合作用的恢復)。


【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供一種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因。
[0006] 本發明提供的蛋白，稱為BhSMPl，來源於苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)，是如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
[0008] (b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。
[0009] 上述蛋白中，所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多 於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發明保護的範圍。
[0011] 上述DNA分子是如下（1)- (3)中任意一種的DNA分子：
[0012] (1)編碼區為序列表中序列1自5'末端第36-272位核苷酸所示的DNA分子；
[0013] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA 分子；
[0014] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
[0015] 上述DNA分子也可以按照如下方法製備：用引物 5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3' 和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以序列 表中的序列1所示的DNA分子為模板，擴增得到的PCR產物，再經過BamH I和EcoR I雙酶 切，得到DNA分子。
[0016] 上述嚴格條件為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然後用2XSSC， 0· 1%SDS 和 1 X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0017] 上述序列表中的序列1由443個鹼基組成，其開放閱讀框架（0RF)為自5'末端第 36-272位鹼基，編碼具有序列表中序列2的胺基酸序列的BhSMPl。
[0018] 含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護 的範圍。
[0019] 上述重組載體為將上述DNA分子替換掉表達載體Binl9-35S-LEA-polyA中 的LEA片段，得到表達上述蛋白的重組載體。在本發明的實施例中，上述重組載體具體 可為將上述DNA分子取代Binl9-35S-LEA-polyA的BamH I和EcoR I酶切識別位點 間的小片段（LEA片段）得到的重組質粒。上述DNA分子為按照如下方法製備：用引物 5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3' 和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以序列 表中的序列1所示的DNA分子為模板，擴增得到的PCR產物，再經過BamH I和EcoR I雙酶 切，得到DNA分子。
[0020] 擴增上述BhSMPl基因全長或其任一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。
[0021] 用於構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種雙元農桿菌載體或可用於 植物微彈轟擊的載體等，如 pBinl9、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300 或其 它衍生植物表達載體。
[0022] 使用BhSMPl基因構建重組表達載體時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種 增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、泛生 素基因 Ubiquitin啟動子（pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此 夕卜，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強 子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列 的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣 泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
[0023] 為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因（GUS基因、GFP基 因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等）或 是抗化學試劑標記基因（如抗除莠劑基因）等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0024] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控 植物耐逆性中的應用也是本發明保護的範圍；在上述應用中所述調控植物耐逆性具體為提 高植物耐逆性；所述耐逆性具體為耐旱性；上述耐旱性通過如下體現：在PEG2000脅迫作用 下轉基因植物種子的萌發率大於所述目的植物。上述植物具體為雙子葉植物或單子葉植 物，上述雙子葉植物進一步具體為擬南芥。
[0025] 本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法，為將編碼上述蛋白的 DNA分子導入目的植物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高於所述目的植物。
[0026] 上述方法中，所述耐逆性為耐旱性；
[0027] 編碼上述蛋白的DNA分子通過上述的重組載體導入目的植物。
[0028] 上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為 擬南芥。
[0029] 上述耐旱性通過如下體現：在PEG2000脅迫作用下轉基因植物種子的萌發率大於 所述目的植物。
[0030] 攜帶有本發明的與植物抗旱、抗鹽相關蛋白編碼基因 BhSMPl的植物表達載體可 通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生 物學方法轉化到植物細胞或組織中。被轉化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、菸草、玉 米、油菜、高粱、棉花等農作物，也可以是苜蓿、三葉草、冰草等牧草以及草莓、西紅柿等果蔬 花卉植物。
[0031] 本發明的實驗證明，本發明從復甦植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)中篩選 到一個受乾旱誘導表達的BhSMPl基因，將該基因導入擬南芥，得到轉BhSMPl擬南芥，轉 BhSMPl擬南芥的耐旱性明顯高於未轉基因的擬南芥，說明BhSMPl是與植物耐旱性相關的 蛋白。因此，該蛋白及其編碼基因對於培育耐旱性提高的作物、林草等新品種具有重要的理 論及實際意義，可用於農牧業和生態環境治理所需的抗性植物品種的培育與鑑定。
[0032] 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為BhSMPl基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)乾旱復甦過程中的表達情 況
[0034] 圖2為T2代轉BhSMPl擬南芥的RT-PCR檢測結果
[0035] 圖3為T2代轉BhSMPl擬南芥種子萌發過程中PEG8000耐受能力鑑定

【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038] 實施例1、BhSMPl基因的獲得及在乾旱脅迫處理中的表達
[0039] 一、BhSMPl基因的獲得
[0040] 提取經乾旱脅迫(將土培苗小心清洗乾淨，放於光照培養箱中自然乾燥， 溫度：22. 0°C，溼度：50%RH，光周期：16光照/8黑暗）處理8小時的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，記載在如下文獻中：Deng Xin, Hu Z, Wang H(1999):mRNA differential display visualized by silver staining tested on gene expression in resurrection plant Boea hygrometrica. Plant Mol Biol Repl7:279.公眾可從中國科 學院植物研究所獲得）葉片的總RNA，利用ZAP-cDNA?文庫構建試劑盒（Stratagene，La Jolla，CA)構建 cDNA 文庫。從中隨機挑選 4800 個基因，用 BioGrid robot (BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)自動化點樣在 Hybond-礦尼龍膜（Amersham Biosciences， Freiburg，Germany)上，製成cDNA微陣列（cDNA晶片）。將該cDNA晶片分別與未經乾旱處 理正常生長的旋蒴苣苔葉片和經乾旱脅迫處理8小時的旋蒴苣苔葉片的polyA-RNA所製備 的33P標記的探針進行雜交，分析它們在正常條件及乾旱誘導後基因表達的動態變化。結果 發現，有1個經乾旱誘導上調的基因。
[0041] 提取經乾旱脅迫處理8小時的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)葉片的總RNA 並以其為模板，用基因特異性引物GSP-Race 1:5 ' -GGCGTCCTCCACCTTTTCTT-3 '進行反轉 錄。反應體系為：總 RNA (2μ g/μ 1) 1. 0μ 1，GSP-Racel (ΙμΜ) 2μ 1，dNTP (2mM) 5μ 1， DEPC-H206.0 y 1，5XM-MLV buffer4y 1，RNase 抑制劑（5ιι/μ 1，購自 Takara 公司）1μ 1， M-MLV (購自Promega公司）1μ 1。37°C反應lh後再65°C lOmin，純化回收(三博PCR產物 回收試劑盒）後加 C 尾。反應體系為：cDNA5y 1，DEPC-H2013. 5μ l，5Xbuffer5y 1，dCTP (10πιΜ)0·5μ1。75°C反應 5min後加入 Ιμ? TdT (購自 takara 公司），再 37°C反應 lh，得 到加 C尾的cDNA序列。
[0042] 以上述獲得的加 C尾的cDNA序列為模板，進行PCR擴增。所用反應體系為： cDNAl μ 1，10XPCR bufferl μ 1，dNTP (2mM) 1 μ 1，引物 GSP-Race2:5, -GAATCGGTCCAGGTC ATCTTTAC-3 '（10μΜ)0·5μ1，多聚 G 錨定引物 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACG-3 '（ 10 μ Μ) 0. 5μ l，Taq酶(購自takara公司）0. 1μ 1。反應條件為：先95°C預變性4min，然後94°C變 性30秒，55°C退火30秒，再72延伸2分鐘，共35個循環；最後72°C延伸10分鐘。將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果得到450bp左右的條帶；回收該450bp左右的條帶，與 載體pGEM-T (購自promega公司）連接後進行測序，得到443bp的PCR產物。
[0043] 根據測序結果設計引物5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3，和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以乾旱脅迫處理8小時的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)葉片的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板（也可以以序列表中的序列1 所示的DNA分子為模板)，用上述引物進行PCR擴增，反應體系為：cDNAl μ 1，10 X PCR bufferl μ 1，dNTP (2mM) 1 μ 1，引物各 0· 5 μ 1，Taq 酶(購自 takara 公司）0· 1 μ 1。程序為： 95°C預變性4min，94°C變性45秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共27個循環；最後再 72 °C延伸10分鐘。
[0044] 得到250bp左右的產物，經過測序，該PCR產物具有序列表中序列1自5'末端第 36-272位的核苷酸，該PCR產物即為BhSMPl基因全序列，分析發現BhSMPl基因全序列包含 完整的BhSMPl基因的開放閱讀框（0RF)、5, -UTR(5' -非翻譯區）和3' -UTR，其BhSMPl基 因0RF為序列1自5'末端第36-272位的脫氧核糖核苷酸，編碼蛋白命名為BhSMPl，該蛋 白的胺基酸殘基序列如序列表中序列2所示。
[0045] 二、BhSMPl基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)乾旱復甦過程中的表達情況
[0046] 對旋蒴苣苔進行8種不同程度的乾旱處理，分別為：新鮮植株（F)，新鮮植株土裡 慢速乾旱5天(不澆水處理5天，SD5d)，新鮮植株土裡慢速乾旱14天(不澆水處理14天 SD14d)。分別提取3種處理旋蒴苣苔葉片的總RNA、反轉錄獲得cDNA。用基因特異性引物 BhSMPl-f5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3'，和 BhSMPl-r5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGT G-3'進行Q-PCR擴增。並以18S rRNA基因為內參，擴增引物為18S-f5' -CTTAGTTGGTGGAG CGATTTG-3 '，和 5 ' -CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3 '。反應體系為：cDNA 1 μ 1，10 μ 12 X SYBR Green Master Mix，引物各 0·5μ1，（Μ 水 8·5μ1。程序為：95°C預變性 30 秒，95°C變性 5 秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30分鐘，共50個循環。
[0047] 結果如圖1所示，其中，F表示新鮮未處理的旋蒴苣苔，SD5d、SD14d分別表示脫水 5天和14天，可以看出該基因明顯受乾旱誘導。
[0048] 實施例2、轉BhSMPl擬南芥的獲得及其功能研究
[0049] 一、轉BhSMPl擬南芥的獲得
[0050] 1、重組載體pBinl9-BhSMPl的獲得
[0051] 用引物 5 ' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3 ' 和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以序列表中的序列1所示的DNA分子為模板，得到 258bp的PCR產物。
[0052] 重組載體pBinl9-BhSMPl具體構建方法如下：
[0053] 1)將258bp的PCR產物經BamH I和EcoR I (購自大連寶生物公司）雙酶切後，回 收約258bp的片段(具有序列表中序列1自5'末端第36-272位的核苷酸）；
[0054] 2)將含CaMV35Sq啟動子和pA 的載體Binl9-35S-LEA_polyA(Liu X.，Wang Z, Wang L. L. , ffu R. H. Phillips J.and Deng X〇 LEA4group genes from the resurrection plant Boea hygrometrica confer dehydration tolerance in transgenic tobacco, Plant Sciencel76 (2009) 90 - 98 ;公眾可從中國科學院植物研究所獲得）用BamH I和EcoR I酶 切去掉LEA片段，回收約13kb的載體骨架，將載體骨架與1)得到的258bp的片段連接，獲 得重組載體pBinl9-BhSMPl (用BamH I和EcoR I酶切驗證，得到258bp為陽性)。
[0055] 經過測序，該重組載體pBinl9-BhSMPl為將258bp的片段(具有序列表中序列1自 5'末端第36-272位的核苷酸）取代載體Binl9-35S-LEA-polyA的BamH I和EcoR I酶切 位點間的小片段（LEA片段)，得到的載體。
[0056] 該重組載體 pBinl9-BhSMPl 受 35S 啟動子（Odell, JI^Nagy^iChi^NH-identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus35S promoter. Nature. 313 (2005) : 810 - 812)控制。
[0057] 2、重組菌的獲得
[0058] 將上述1得到的重組載體pBinl9-BhSMPl轉化到農桿菌Gv3101細胞(公眾可 從中國科學院植物研究所獲得，記載在如下文獻中：Holsters M，Silva B，Van Vliet F,Genetello C, De Block M, Dhaese P,Depicker A,Inz6D, Engler G,Vi 1laroel R, Van Montagu M, Schell J(1980)The functional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid3:212-230)中，用含有 50 μ g/ml 硫酸卡那黴素、 50 μ g/ml慶大黴素和50 μ g/ml利福平的YEB固體平板培養基進行篩選，得到轉化子，提 取轉化子的質粒送去測序，質粒為pBinl9-BhSMPl，則將含有該質粒的轉化子命名為重組菌 Gv3101/pBinl9-BhSMPl〇
[0059] 3、轉BhSMPl擬南芥的獲得及分子鑑定
[0060] 1)轉BhSMPl擬南芥的獲得
[0061] 將重組菌Gv3101/pBinl9-BhSMPl採用花器官浸泡法轉化野生型擬南芥Col-0 (ecotype Columbia, Arabidopsis thaliana;公眾可從中國科學院植物研究所獲得，記載 在如下文獻中：Arabidopsis, a useful weed. Meyerowitz EM，Cell (1989) 56:263-270.) 的花，得到TO代轉BhSMPl擬南芥。轉化方法如下：將重組菌50uL接種於50mL含35mg/L 利福平、50mg/L硫酸慶大黴素、50mg/L卡那黴素的YEB培養基中，28°C，160rpm搖至0D值 1. 5左右，離心收集菌體，用同體積的5%蔗糖重懸，並加入10uL助滲劑，將擬南芥花浸於重 旋液中浸泡1分鐘即可。完成浸花後用黑色塑膠袋遮光1天，第二天恢復自然光照，得到το 代轉BhSMPl擬南芥。
[0062] 將TO代轉BhSMPl擬南芥自交，收集T1代轉BhSMPl擬南芥種子，取100粒播種於 含有100 μ g/ml硫酸卡那黴素的MS培養基上，將在上述含有100 μ g/ml硫酸卡那黴素的MS 培養基上抗性分離比為3 :1的T1代轉BhSMPl擬南芥的成活幼苗移至溫室培養，收集種子， 播種，共獲得3個T2代轉BhSMPl擬南芥純合株系：0E10-4、0E26-3、0E31-2。
[0063] 2)轉BhSMPl擬南芥的分子鑑定
[0064] 提取50天苗齡的上述3個T2代轉BhSMPl擬南芥純合株系：0E10-4、0E26-3、 0E31-2的果莢的總RNA，反轉錄為cDNA為模板，以SMPl-f2
[0065] 5 '-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3,和 SMPl-r2
[0066] 5 '-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3'為引物進行RT-PCR，同時以未轉基因的野生 型擬南芥（WT)作為對照。
[0067] 內參基因為 Actin，引物為 actinF:5 '-AGGAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3'，actinR:5 '-CAGAGAAAGCACAGCCTGGATAG-3,。
[0068] PCR擴增程序為：95°C預變性4min，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30 秒，共28個循環；最後再72°C延伸10分鐘；同時以actin基因做為內參，PCR擴增程序為： 95°C預變性4min，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共28個循環；最後再 72 °C延伸10分鐘。
[0069] 對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，每組樣品進行2次重複，結果如圖2所示， 可以看出，未轉基因的野生型擬南芥（WT)中沒有擴增出條帶，T2代轉BhSMPl擬南芥純合 株系：0E10-4、0E26-3、0E31-2中，皆有258bp目的基因 BhSMPl表達。進一步證明，T2代轉 BhSMPl擬南芥純合株係為陽性轉基因植株。
[0070] 採用同樣的方法，將空載體Binl9-35S-LEA-polyA轉入野生型擬南芥中，得到T0 代轉pBinl9擬南芥；將TO代轉pBinl9擬南芥收種、播種，直到得到T2代轉pBinl9擬南 芥。
[0071] 二、轉BhSMPl擬南芥的耐旱研究
[0072] 檢測T2代轉BhSMPl擬南芥種子萌發過程中對PEG8000耐受能力從而體現出其耐 旱：
[0073] 將收穫一月後的上述一獲得的3個株系T2代轉BhSMPl擬南芥純合株系：0E10-4、 0E26-3、0E31-2、T2代轉pBinl9擬南芥和野生型擬南芥的種子分別均勻的撒播於含有15% (質量百分含量)、20% (質量百分含量）PEG8000的萌發盒中，4°C春化4天後，培養在22°C、 50%溼度、光照16h和黑暗8h的條件下，從培養開始第一天每天統計萌發率，5天後照相併 完成統計。實驗共設三次重複，每次重複中每個株系200顆種子。
[0074] 結果如圖3所示，A為含15%PEG的萌發盒中擬南芥的萌發率統計圖，B為含20%PEG 的萌發盒中擬南芥的萌發率統計，C為含15%PEG的萌發盒中擬南芥的萌發照片；
[0075] T2代轉BhSMPl擬南芥純合株系0E10-4在培養第1、2、3、4、5天的萌發率分別為 86. 91%、95. 92%、97. 83%、99. 85%、99. 85% ;
[0076] T2代轉BhSMPl擬南芥純合株系0E26-3在培養第1、2、3、4、5天的萌發率分別為 75. 63%、89. 31%、90. 68%、94. 12%、94. 72% ;
[0077] T2代轉BhSMPl擬南芥純合株系0E31-2在培養第1、2、3、4、5天的萌發率分別為 72. 13%, 86. 77%, 89. 77%, 97. 83%, 99. 03% ；
[0078] 野生型擬南芥（col)在培養第1、2、3、4、5天的萌發率分別為30·23%、46·85%、 55. 53%、61· 13%、62· 63%。
[0079] Τ2代轉pBinl9擬南芥和野生型擬南芥無顯著差異。
[0080] 從圖3中可以看出，T2代轉BhSMPl擬南芥種子比野生型擬南芥相比，在PEG8000 的脅迫下，萌發率提高，說明T2代轉BhSMPl擬南芥具有很強的耐PEG性，表明，T2代轉 BhSMPl擬南芥具有很強的耐旱性。
[0081] 結果表明，T2代轉BhSMPl擬南芥的耐旱性明顯優於野生型擬南芥，說明BhSMPl是 與植物耐旱相關的蛋白。
[0001] 序列表 〈11〇>中B科學院植物研究所 +-種與植物耐旱相關的蛋白及其編碼基因與應用 <160〉 2 <210〉 1 443 <212〉 DNA <213〉旋蒴苣苔（Soea A.ygrrmeirfca) 1 tccgaagaac aatatcgaat ccagtttact gaaggatgtc gggagctcaa ggaacacagc 60 cgccggagtc gttcacagct acgacttacg agtcagtggg gagcggagat aacaagacgc 120 ggcttgatat ccggtccaag gaagatgagg gcggaatcaa gatcgataaa ttgcaagaaa 180 aggtggagga cgccgccggg aaaggaggtc cagtcttcgg cgcaggcaag gatgatgaca 240 aagglgacll ggglgccacg ggcacagcll aaggcgllea Iccaacltgc cgtgllgali 300 gcatgctctt gttetettea acgttttgtt ttgttccctt agtctgttca tgtcttgtgt 360 tgatgaattt ctcctgtaaa tgggctttcg gatcggccct tgtatccgaa ctccacgctc 420 gtaatgaact tgatttcctc agt 413 2 78 PRT 〈213〉旋葡宦苔（Boea Jiygrcmetrica) 2 Met Ser Gly Ala Gin Gly Thr Gin Pro Pro Glu Ser Phe Thr Ala Thr 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Ser Val Gly Ser Gly Asp Asn Lys Thr Arg Leu Asp lie 20 25 30
[0002] Arg Ser Lys Glu Asp Glu Gly Gly lie Lys lie Asp Lys Leu Gin Glu 35 40 45 Lys Val Glu Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Pro Val Phe Gly Ala Gly 50 55 60 Lys Asp Asp Asp Lys Gly Asp Leu Gly Ala Thr Gly Thr Ala 65 70 75
【權利要求】
1. 一種蛋白，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (b) 將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。
2. 編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 如權利要求2所述的DNA分子，其特徵在於：所述DNA分子是如下（1)- (3)中任一 種的DNA分子： (1)編碼區為序列表中序列1自5'末端第36-272位核苷酸所示的DNA分子； (2 )在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分 子； (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同 源性且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
4. 含有權利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5. 如權利要求4所述的重組載體，其特徵在於： 所述重組載體為將權利要求2或3所述DNA分子替換掉表達載體 Binl9-35S-LEA-polyA中的LEA片段，得到表達權利要求1所述蛋白的重組載體。
6. 擴增權利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
7. 權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述DNA分子或權利要求4所述重組載體、表 達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控植物耐逆性中的應用； 所述耐逆性具體為耐旱性； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。
8. -種培育轉基因植物的方法，為將編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子導入目的植 物，獲得轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高於所述目的植物。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於：所述耐逆性為耐旱性； 所述編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子通過權利要求4或5所述的重組載體導入目 的植物。
10. 根據權利要求8或9所述的方法，其特徵在於： 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號】C07K14/415GK104119430SQ201310149496
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月26日 優先權日:2013年4月26日
【發明者】鄧馨, 李美靜 申請人:中國科學院植物研究所