人纖維蛋白溶解酶原的凍幹製劑及其製備方法與流程
2023-11-30 00:56:26
本發明屬於生物製品生產
技術領域：
，具體涉及一種人纖維蛋白溶解酶原的凍幹製劑及其製備方法。
背景技術：
：人纖維蛋白溶酶原(Plasminogen,Pg)的等電點為7.0，由一條單鏈組成，分子量大約為90kD，鏈內有24個鏈內二硫鍵。天然的Glu-Pg含有791個胺基酸，由7個結構域構成：N端多肽(NTP)，5個同源三角區(K1-K5)以及SP區。在Pg的三角區存在賴氨酸結合位點(LBS)，可以介導與纖維蛋白，凝血酶，α2抗纖維蛋白溶酶(α2-AP)等的結合，從而在調節纖溶反應時發揮重要作用。人體內的Pg有兩種形式：Glu-Pg和Lys-Pg，人血漿中的Pg大多數是Glu-Pg。Lys-Pg是由Glu-Pg經過纖維蛋白溶酶(Pm)在Glu-Pg的N端切掉8kDa的多肽產生的。在這個切割過程中，Pg的構相由緊密的螺旋結構變為伸展的開放結構，從而更容易被纖溶酶原激活劑(Plasminogenactivator,PA)結合而被激活。在人體生理環境下，Glu-Pg的半衰期為2.2天，Lys-Pg的半衰期為0.8天。有研究證明在體外環境下，Glu-Pg在-20℃時可以存放半年，活力損失不超過10％；在室溫下放置8小時，活力仍然能保存90％，因此Glu-Pg可以考慮使用S/D法進行病毒滅活(該法要求製品在室溫下有較好的穩定性，6小時內活性無明顯損失)。Lys-Pg在室溫下6小時後則活性全部喪失，在4℃也只能保存4天左右。Pg單鏈上有兩種糖基化位點，一種是N糖基化位點，另外一種是O糖基化位點，循環血中的70％的Pg都只含有O糖基化位點，而剩下的Pg含有兩種糖基化位點。人纖溶酶原可以利用人血漿或者Cohn氏法的組分Ⅲ為原料來製備(宋鋼，宋後燕，人纖溶酶原結構和功能研究進展。國外醫學分子生物學分冊，1999，21(1)，39-42.)，或者從人胎盤中分離提取(PATRICKJ.GAFFNEY1998)。早期製備Pg多採用有機溶劑，鹽析，酸鹼處理，吸附，等電沉澱等方法，步驟繁瑣，回收率及純度均低。從上世紀70年代開始，研究者開發了多種層析的方法來製備Pg，如DEAE-Sephadex層析，或者是L-lysineSepharose4B親和層析(KlammtJ,2011)。而Pm可以使用合適的酶在適當的條件下轉化Pg得到。但是，如果利用Cohn氏法的組分Ⅲ為原料製備Pg會遇到一些問題，因為組分Ⅲ中含有大量脂類以及其他大分子雜質，既難於處理，又容易對層析介質造成嚴重汙染。並且組分Ⅲ容易向製品中引入人纖維蛋白溶酶原激活劑(PA)，從而降解Pg，使製品不穩定。同時使用組分Ⅲ分離Pg的收穫率低，據研究表明僅僅只能提取血漿中35％的Pg。發明人從人血漿中提取的Pg，產品的純度大於98％，其中雜質主要是IgG，IgM，HSA，產品純度高，活性保存時間長。凍幹是保護目標蛋白生物學活性的有效方法，凍幹後的製品可以對溫度等耐受能力增強，使得藥品的運輸使用更為便捷，但是凍幹研究的重點工作是凍幹保護劑研究，好的凍幹保護劑可以有效保護目標蛋白的活性。使得凍幹後製品外觀為乳白色疏鬆結構，易於復溶，復溶後的外觀為澄明液體。技術實現要素：為了克服上述缺陷一種人纖維蛋白溶解酶原的凍幹製劑的製備方法，其特徵在於，步驟為：1)取純化後的人纖維蛋白溶解酶原樣品，用含有氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇，pH7.4的緩衝液進行超濾透析，濃縮至人纖維蛋白溶解酶原濃度為3％～6％；2)在步驟1)所得溶液中添加凍幹保護成分；3)用0.45μm和0.2μm除菌濾膜過濾後，進行凍幹。其中，步驟2)中的凍幹保護成分選自甘氨酸、甘露醇、蔗糖或幾種的組合。其中，步驟2)中的凍幹保護成分的濃度為：甘氨酸的濃度為200～400mmol/L；甘露醇的濃度為80-140mmol/L；蔗糖濃度(w/v)為1％～5％；或甘氨酸濃度為200～300mmol/L，蔗糖濃度(w/v)為1％～5％。其中，步驟1)中的氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇濃度分別為0.01-0.2mol/L。其中，步驟2)的凍幹程序為預凍，-22℃退火，預凍，0℃一次升華，22℃二次升華。其中，步驟3)凍幹步驟之前的pH值為6.3-7.4。本發明另一個方面提供一種上述的製備方法獲得的人纖維蛋白溶解酶原的凍幹製劑。所述凍幹製劑為乳白色疏散結構，復溶後酶活力為15IU/ml，pH值為6.3-7.4，復溶時間小於30秒。本發明的方法效率高，成本低。本專利中的凍幹保護劑包括超濾時緩衝液中的氯化鈉、檸檬酸鈉以及在此基礎上的添加成分(超濾後加入到製品中的胺基酸和或糖等成分)，所有這些成分組合在一起構成保護劑。此外，本發明中的凍幹保護劑是分兩個階段加入的。步驟1)中加入氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇；步驟2)中加入在步驟1)所得溶液中凍幹保護成分，甘氨酸、甘露醇、蔗糖；這樣可以節約步驟1)中的緩衝液的用量。節約了成本，同時提高了過濾效率。附圖說明圖1為實施例1的結果圖。圖2為實施例2的結果圖。圖3為實施例3的結果圖。圖4為實施例4的結果圖。具體實施方式實施例1取純化後的人纖維蛋白溶解酶原樣品，用含有氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇(每種成分的濃度為0.01-0.2mol/L)，pH7.4的緩衝液進行超濾透析，濃縮至Pg的蛋白濃度為3％～6％，分成3組，按照下表分別補加甘氨酸至目標濃度範圍，用0.45+0.2μm除菌濾膜過濾後，進行凍幹。凍幹的程序為:預凍，-22℃退火，預凍，0℃一次升華，22℃二次升華。保護劑代號G1G2G3甘氨酸濃度(mmol/L)300～400200～300100～200pH7.217.237.25凍幹後外觀乳白色疏鬆結構乳白色疏鬆結構量少本發明優選甘氨酸濃度為200～400mmol/L，其中甘氨酸的最優選濃度為200～300mmol/L。實驗例2取純化後的人纖維蛋白溶解酶原樣品,用含有氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇(每種成分的濃度為0.01-0.2mol/L)，每種成分的濃度為0.01-0.2mol/L緩衝液進行超濾，濃縮透析至Pg的蛋白濃度為3％～6％,分別補加以下濃度的甘露醇，進行凍幹。凍幹的程序為:預凍，-22℃退火，預凍，0℃一次升華，22℃二次升華。保護劑代號M1M2M3甘露醇mmol/L110～14080～11050～80pH7.417.407.38凍幹後外觀乳白色疏鬆結構量偏少量少本發明優選甘露醇濃度為80-140mmol/L，其中甘露醇的最優選濃度為110～140mmol/L實驗例3取純化後的人纖維蛋白溶解酶原樣品,用含有氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇(每種成分的濃度為0.01-0.2mol/L)，緩衝液進行超濾透析，濃縮至Pg的蛋白濃度為3％～6％,分成2組，按照下表分別補加甘氨酸至目標濃度，用0.45+0.2μm除菌濾膜過濾後，進行凍幹。凍幹的程序為:預凍，-22℃退火，預凍，0℃一次升華，22℃二次升華。結合實施例1本發明優選pH為6.37～7.23。實驗例4取純化後的人纖維蛋白溶解酶原樣品，用含有氯化鈉、檸檬酸鈉、氨基丁三醇(每種成分的濃度為0.01-0.2mol/L)，緩衝液進行超濾透析，濃縮至Pg的蛋白濃度為3％～6％,分成2組，按照下表分別補加甘氨酸至目標濃度，用0.45+0.2μm除菌濾膜過濾後，進行凍幹。凍幹的程序為:預凍，-22℃退火，預凍，0℃一次升華，22℃二次升華。本發明優選保護劑種甘氨酸濃度為200～300mmol/L，蔗糖濃度為1％～5％。實驗例5觀察人纖維蛋白溶解酶原樣品凍幹後外觀，復溶後外觀、復溶時間等。並進行活性檢測。活性檢測結果顯示GS組和S組Pg活性最高，保護效果最優本發明優選保護劑中甘氨酸濃度為200～300mmol/L，蔗糖濃度為1％～3％。當前第1頁1 2 3