基於核酸的化合物及其使用方法
2023-12-10 06:18:42
專利名稱：基於核酸的化合物及其使用方法
本申請要求2001年5月16日提交的美國臨時申請60/291,471的利益。
1.發明領域本發明涉及基於核酸的化合物。本發明的化合物用於各種治療應用，包括治療B型肝炎病毒。
2.背景技術B型肝炎病毒(HBV)是屬於嗜肝DNA病毒科的緻密有包膜的DNA病毒。該病毒是全世界慢性肝病和肝細胞癌的主要原因(Hoofnagle(1990)《新英格蘭藥物雜誌》(N.Eng.J.Med.)，323337-339)。HBV與急性和慢性肝炎和肝細胞癌有關且可能是獲得性免疫缺陷症候群發生中的輔因子(Dinestag等在《Harrison內科理論》(Harrison’sPrinciples of Internal Medicine)第13版中所述(Isselbacher等編輯)McGrw-Hill，NY，NY(1993)pp.1458-1483)。目前至少有4億人感染HBV。
然而，目前臨床使用的活性劑不能提供有效的療法或治癒HBV感染。已經將使用幹擾素的抗病毒療法用於慢性肝炎，但僅獲得了部分成功且由這類療法可以產生併發症。使用糖皮質激素的短期療法與幹擾素療法結合可能有利，但長期治療受到毒理學問題的限制(Dinestag等，文獻同上)。
由此需要擁有治療病毒感染的新活性劑。特別需要擁有治療B型肝炎病毒感染的新活性劑。
發明概述目前我們已經發現了特別用於治療病毒感染的化合物和組合物。本發明優選的化合物可以表現出對B型肝炎病毒的顯著活性。
本發明的化合物是基於核酸的小分子，它們含有至少兩個核苷單位且一般含有不超過約2個、3個、4個、5個或6個核苷酸單位、優選不超過約2個、3個或4個核苷酸單位、更優選總計為2個或3個核苷單位。本發明的化合物包括至少一個含有一種或多種對來自″天然″核酸的修飾的核苷酸單位。本發明優選的化合物包括那些帶有硫代磷酸酯(phosphorothioate)和/或氨基磷酸酯(phosphoramidate)核苷酸間連鍵的化合物。
本發明尤其優選的化合物包括下列化合物1、2和3及這類化合物的藥物上可接受的鹽 本發明還包括治療方法，該方法包括使用一種或多種本發明化合物的步驟。本發明的方法包括治療HBV感染，包括治療和預防(預防療法)與HBV-相關的疾患或疾病。
本發明的優選方法包括對病毒感染細胞、特別是人體細胞、尤其是感染了HBV的細胞給予治療有效量的本發明化合物。本發明的方法還包括對哺乳動物、特別是諸如人這樣的靈長類給予有效量的一種或多種本發明化合物。
本發明進一步提供了包括一種或多種本發明化合物和藥物上可接受載體的藥物組合物。
下文公開了本發明的其它方面。
發明詳述如上所述，我們已經發現了可以表現出顯著抗-HBV活性的新合成的寡核苷酸(至少兩個核苷酸單位)。
本發明的化合物包括來自天然″核酸″、即天然核苷酸間連鍵、G、C、T和U鹼基等的一種或多種修飾。修飾例如包括對核苷酸間連鍵、鹼基或糖部分等的修飾。
本發明的化合物適宜含有兩個或多個通過核苷酸間連鍵連接的脫氧核苷酸和/或核苷酸單體。本發明的化合物可以完全由脫氧核苷酸、完全由核苷酸或由脫氧核苷酸和核苷酸的組合構成，包括雜合化合物和反向的雜合化合物。雜合化合物含有核苷酸(例如1、2或3個單位)側翼區之間插入的脫氧核苷酸核心區(例如1、2或3個單位)。反向的雜化物含有脫氧核苷酸(例如1、2或3個單位)側翼區之間插入的核苷酸核心區(例如1、2或3個單位)。
可以通過一個單核苷酸戊糖環的5』與相鄰單核苷酸的3』之間標準的磷酸二酯核苷酸間連鍵連接本發明的核苷酸單位。還可以使用不同位點上的連接、包括5』與5』、3』與3』、2』與5』和2』與2』或其任意組合來建立這類鍵。除磷酸二酯鍵外，還可以通過烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代磷醯酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙醯胺酯或羧甲基酯的鍵或其任意組合連接所述的單核苷酸。如上所述，本發明優選的化合物包括至少一個硫代磷酸酯和/或氨基磷酸酯鍵。
可以將本發明的化合物構建成所有單核苷酸單位(例如總計2、3、4、5或6個單位)均通過相同類型的核苷酸間連鍵或通過不同核苷酸間連鍵的組合連接，包括嵌合或反向嵌合的寡核苷酸。本發明的嵌合化合物含有甲基磷酸酯或氨基磷酸酯側翼區之間插入的硫代磷酸酯核心區。本發明的反向嵌合化合物含有硫代磷酸酯側翼區之間插入的非離子核心區(例如烷基磷酸酯和/或氨基磷酸酯和/或磷酸三酯核苷酸間連鍵)。
本發明的化合物還可以由腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶單核苷酸構成。本發明的優選化合物可以由含有對所述單核苷酸鹼基和/或糖部分修飾的單核苷酸單位構成。對鹼基或糖的修飾包括含有1-3個獨立或稠合環和1-3個N、O或S原子的烷基、碳環芳基、雜芳基或雜脂環基的共價結合的取代基或雜環結構。
烷基優選含有1-約18個碳原子、更優選1-約12個碳原子且最優選1-約6個碳原子。烷基的具體實例包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。芳烷基包括上述被含有6個或6個以上碳的碳環芳基、例如苯基、萘基、菲基、蒽基等取代的烷基。
環烷基優選含有3-約8個環碳原子，例如環丙基、環戊基、環己基、環庚基、1，4-亞甲基環己烷、金剛烷基、環戊基甲基、環己基甲基、1-或2-環己基乙基和1-、2-和3-環己基丙基等。
舉例性的雜芳基和雜脂環基包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯並噻唑基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉代和吡咯烷基。
對糖基的優選修飾包括對核糖部分2』位的修飾，包括、但不限於2』-O-被含有1-6個飽和或不飽和碳原子的-O-低級烷基取代，被-O-芳基取代，或被含有2-6的碳原子的烯丙基取代，其中這類-O-烷基、芳基或烯丙基可以未被取代或可以被取代(例如被滷素、羥基、三氟甲基、氰基、硝基、醯基、醯氧基、烷氧基、羧基、甲氧基(carbalkoxyl)或氨基取代)；或其中2』-O-基被氨基或滷素取代。這些取代中就核糖而言含有天然2』-羥基或就脫氧核糖而言含有2』-H-。
含有修飾核苷酸單位的本發明優選化合物包括2』-O-甲基核苷酸(2』-OMe)和5-甲基化的脫氧胞嘧啶(5-Me-dC)。本發明特別優選的化合物在寡核苷酸3』末端上含有至少1個、優選1-5個2』-O-甲基核苷酸。此外，本發明的化合物可以進一步在5』-末端上含有至少1個、優選1-5個2』-O-甲基核苷酸。
本發明化合物的單核苷酸單位的糖基可以是天然的或修飾的(例如合成的)且為開鏈或環形式。糖基可以由單糖、二糖、寡糖或多糖組成，其中各單糖單位含有3-約8個碳、優選3-約6個碳、含有多羥基或多羥基和氨基。非限制性實例包括甘油、核糖、果糖、葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、纖維素二糖、蔗糖、澱粉、直鏈澱粉、支鏈澱粉、糖原和纖維素。羥基和氨基作為含有例如氫和/或滷素的游離或保護基存在。優選的保護基包括丙酮化合物、叔丁氧基羰基等。單糖糖基可以具有L或D構型且環單糖單位可以含有α或β構象中的5或6元環。二糖可以由兩個相同或兩個不相似的單糖單位組成。寡糖可以由2-10個單糖組成且可以是均聚物、雜聚物或環多糖。多糖可以是均聚糖(homoglycan)或雜聚糖且可以是支鏈或非支鏈的聚合鏈。
二糖、寡糖和多糖可以由14、16或14與16鍵的混合物組成。糖部分可以通過碳水化合物上的任意羥基或氨基與所述連接基團連接。
其它修飾包括本發明化合物內部或末端基上的那些修飾且包括核苷酸間磷酸鍵上分子的加成、諸如在兩個氨基之間含有不同數量碳殘基的膽甾烯基、膽固醇或二胺化合物以及裂解或交聯相反鏈或裂解或交聯結合病毒基因組的相關酶或其它蛋白質或的末端核糖、脫氧核糖和磷酸酯修飾。包括非核苷接頭的其它接頭包括、但不限於不同長度的聚乙二醇，例如三甘醇、一乙二醇、六甘醇(Ma等(1993)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)212585-2589；Benseler等(1993)《美國化學協會雜誌》(J.Am.Chem.Soc.)1158483-8484)、己胺和芪(Letsinger等(1995)《美國化學協會雜誌》(J.Am.Chem.Soc.)1177323-7328)或任意其它商購接頭，包括脫鹼基接頭或商購不對稱和對稱接頭(CloneTech，Palo Alto，California)(例如Glen Research Product Catalog，Sterling，VA)。
還可以使在寡核苷酸3』末端上以核糖加帽(capped with)的本發明化合物進行NaIO4氧化/還原氨基化。氨基化可以包括、但不限於下列部分精胺、亞精胺、三(2-氨基乙基)胺(TAEA)、DOPE、長鏈烷基胺類、冠醚類、輔酶A、NAD、糖類、肽類、樹枝狀聚合物。
本發明的化合物還可以在其3』末端和/或5』末端上被大取代基加帽或每個核苷酸在一個或兩個非橋聯的氧上含有取代。這類修飾可以位於某些或全部核苷酸間連鍵上且可以位於寡核苷酸一端或兩端和/或所述分子內部(綜述在Agrawal等(1992)的《生物技術趨勢》(TrendsBiotechnol.)10152-158中)。某些加帽類基團的非限制性實例包括3』-O-甲基、5』-O-甲基、2』-O-甲基及其任意組合。
本發明特別優選的化合物包括下列1-62的化合物
可以通過本領域中認可的方法製備本發明的化合物。例如，可以使用本領域中認可的技術、諸如可以通過手工操作或通過自動合成儀進行的氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)、H-磷酸酯或甲基氨基亞磷酸酯化學法(例如，參見Goodchild(1990)《生物軛合物化學》(Bioconjugate Chem.)2165-187；Uhlmann等(1990)《化學綜述》(Chem.Rev.)90543-584；Caruthers等(1987)《酶學方法》(Meth.Enzymol.)154287-313；美國專利US 5,149,798)共價結合核苷酸單位且然後處理(綜述在Agrawal等的(1992)《生物技術趨勢》(Trends Biotechnol.)10152-158中)。可以使用本領域中眾所周知的方法、諸如亞磷醯胺(例如，參見Agrawal等(1988)《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))857079-7083)或H-磷酸酯(例如，參見Froehler(1986)《四面體通訊》(TetrahedronLett.)275575-5578)化學法製備含有硫代磷酸酯鍵的本發明化合物。還可以使用Bergot等(《色譜雜誌》(J.Chromatog.)(1992)55935-42)所述的合成方法。可以按照公知方法製備含有其它類型的修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸(例如，參見Goodchild(1990)《生物軛合物化學》(Bioconjugate Chem.)2165-187；Agrawal等(1988)《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))857079-7083；Uhlmann等(1990)《化學綜述》(Chem.Rev.)90534-583；和Agrawal等(1992)《生物技術趨勢》(TrendsBiotechnol.)10152-158)。
如上所述，本發明提供了包括至少一種本發明化合物、優選至少一種本發明化合物與藥物上可接受載體的藥物組合物。具體的實施方案包括治療量的脂質載體。
如上所述，本發明化合物適用於各種治療應用，特別是適合於治療哺乳動物細胞、特別是人體細胞的病毒感染。本發明的化合物尤其用於控制或預防人體細胞內的肝炎病毒、特別是控制或預防B型肝炎病毒感染。
本發明的化合物還用於治療耐藥性病毒株，包括耐受現行療法的B型肝炎病毒株。
本發明的優選治療方法包括對細胞給予治療量的含有一種或多種本發明化合物的藥物組合物而由此抑制乃至治療B型肝炎病毒感染。在類似的方面中，本發明的化合物可以用於治療B型肝炎病毒感染，包括對受感染細胞或動物、特別是諸如人這樣的靈長類給予治療量的含有至少一種本發明化合物的藥物組合物。
本發明的化合物可以用於與其它藥物、諸如逆錄酶抑制劑、諸如雙脫氧核苷、例如3TC聯用的療法。
另外優選對受治療者給予本發明的多種不同的化合物作為協調治療方案的組成部分。特別優選對患者給予化合物1、2和3中的至少兩種或多種、優選全部三種作為協調治療方案的組成部分。
可以通過給予相同或不同藥物製劑或依次給予不同活性劑完成這類聯合療法、即本發明的化合物與不同活性劑、諸如3Tc或與本發明另一種化合物的聯合療法。然而，一般優選基本上同時對患者給予含有所述化合物的單位藥物組合物形式的多種不同活性劑。
可以通過各種適宜途經給予本發明的化合物，包括口服、局部(包括經皮、口含或舌下)、鼻部和非腸道(包括腹膜內、皮下、靜脈內、真皮內或肌內注射)，一般優選口服或非腸道給藥。還可以理解優選的給藥方法和劑量可以隨例如接受者情況和年齡的不同而改變。
本發明的化合物可以用於與其它有藥物活性的藥物、諸如另一種抗病毒藥或抗癌藥的聯合療法中。另外，儘管可以單獨給予本發明的一種或多種化合物，但是它們也可以作為與常用賦形劑、即藥物上可接受的有機或無機載體物質的混合物的藥物組合物的組成部分存在，所述的藥物上可接受的有機或無機載體物質適合於非腸道、口服或其它所需給藥且不與活性化合物發生有害反應且對其接受者而言無害。合適的藥物上可接受的載體包括、但不限於水、鹽溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸甘油單酯和甘油二酯、petroethral脂肪酸酯類、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。可以給藥物製劑滅菌且如果需要使藥物製劑與例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、溼潤劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑和/或芳香物質等這樣不與活性化合物發生有害反應的助劑混合。
就非腸道應用而言，特別合適的是溶液，優選油溶液或水溶液；以及混懸液、乳劑或植入物，包括栓劑。安瓿是常用的單位劑型。
就腸道應用而言，特別合適的是含有滑石和/或碳水化合物載體粘合劑等的片劑、糖錠或膠囊，所述的載體優選是乳糖和/或玉米澱粉和/或馬鈴薯澱粉。可以使用糖漿劑、酏劑等，其中使用增甜的載體。可以配製緩釋組合物，包括其中例如通過微囊包封、多層包衣等用不同可降解的包衣材料保護活性成分。
還可以將本發明的治療化合物混入脂質體。可以按照公知的脂質體製備步驟、例如超聲和擠壓混入。脂質體的適宜常用製備方法還公開在下列文獻中例如A.D.Bangham等，《分子生物學雜誌》(J.Mol.Biol.)，23238-252(1965)；F.Olson等，《生物化學和生物物理學學報》(Biochim.Biophys.Acta)，5579-23(1979)；F.Szoka等，《國家科學院學報》(Proc.Nat.Acad.Sci.)，754194-4198(1978)；S.Kim等，《生物化學和生物物理學學報》(Biochim.Biophys.Acta)，728339-348(1983)；和Mayer等，《生物化學和生物物理學學報》(Biochim.Biophys.Acta)，858161-168(1986)。
可以理解的是指定療法中所用的活性化合物的實際優選用量根據所用具體化合物、所配製的特定組合物、應用方式、給藥的具體部位等的不同而改變。本領域技術人員易於使用常規劑量測定試驗確定指定給藥方案的最佳給藥比例。
將本文所述的全部文獻引入本文作為參考。
通過下列實施例進一步解釋本發明。提供這些實施例有助於理解本發明而不對本發明起限定作用。
實施例1本發明化合物的合成使用標準氨基亞磷酸酯化學法(Beaucage(1993)《分子生物學方法》(Meth.Mol.Biol.)2033-61)在ABI 394 DNA/RNA合成儀(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、Pharmacia Gene AssemblerPlus(Pharmacia，Uppsala，Sweden)或Gene Assembler Special(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上應用製造商的標準方案和常用方法合成本發明的化合物。
實施例2生物測試用本發明的化合物處理(體外)受到感染的HBV-感染的人細胞(2.2.15細胞)。對包括化合物1、2和3在內的上述化合物觀察到所述細胞產生的胞外(病毒體)HBV DNA水平顯著受到抑制(大於對照組2-倍)。
參照本發明的優選實施方案具體描述了本發明。然而，應理解本領域技術人員在考慮到本說明書時可以在下面的權利要求中所述的本發明的實質和範圍內進行修改和改進。
權利要求
1.選自如上文具體定義的那些化合物的化合物1-62的組的化合物或其藥物上可接受的鹽。
2.權利要求1的化合物，其中該化合物是下面的化合物1或其藥物上可接受的鹽
3.權利要求1的化合物，其中該化合物是下面的化合物2或其藥物上可接受的鹽
4.權利要求1的化合物，其中該化合物是下面的化合物3或其藥物上可接受的鹽
5.如上文具體定義的且其中該化合物被修飾的選自下列化合物1-62的組的化合物或其藥物上可接受的鹽。
6.權利要求5的化合物，其中至少一種修飾出現在核苷酸間連鍵上。
7.權利要求6的化合物，其中所述的修飾包括至少一種核苷酸間連鍵，它選自烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙醯胺酯或羧甲基酯的鍵及其它們的組合組成的組。
8.權利要求6的化合物，其中所述的修飾包括至少一種硫代磷酸酯核苷酸間連鍵。
9.權利要求5的化合物，其中所述的化合物包括至少一種2』-O-甲基核苷酸。
10.權利要求5的化合物，其中所述的化合物含有至少一種肌苷核苷酸。
11.權利要求5的化合物，其中所述的化合物含有至少一種對至少一種單核苷酸糖部分的修飾。
12.權利要求5的化合物，其中所述的化合物含有至少一種對至少一種單核苷酸鹼基部分的修飾。
13.權利要求5的化合物，其中所述的化合物在5』上含有帽結構。
14.權利要求5的化合物，其中所述的化合物在3』上含有帽結構。
15.藥物組合物，包括權利要求1的化合物和藥物上可接受的載體。
16.治療HBV的方法，包括對含有HBV的細胞給予有效量的權利要求1的化合物或組合物的步驟。
17.權利要求16的方法，其中對所述細胞給予具有下列結構的下列化合物1、2或3之一或其藥物上可接受的鹽
18.治療患有或懷疑受到病毒感染的受治療者的方法，包括對該受治療者給予有效量的權利要求1的化合物或組合物的步驟。
19.治療患有或懷疑受到肝炎感染的受治療者的方法，包括對該受治療者給予有效量的權利要求1的化合物或組合物的步驟。
20.治療患有或懷疑受到HBV感染的受治療者的方法，包括對該受治療者給予有效量的權利要求1的化合物或組合物的步驟。
21.權利要求18的方法，其中對所述細胞給予下列化合物1、2或3之一或其藥物上可接受的鹽
22.權利要求18的方法，其中所述的受治療者患有或懷疑受到耐藥性病毒感染。
23.權利要求16的方法，其中在協同給藥方案中對所述的受治療者給予化合物1、2和3中的至少兩種化合物。
24.權利要求6的方法，其中對所述的受治療者給予3TC及化合物1-62中的一種或多種。
25.權利要求16的方法，其中所述的細胞或受治療者是人體細胞或人。
全文摘要
本發明提供了能夠治療肝炎感染、特別是B型肝炎病毒感染的化合物。本發明的化合物基於核酸且優選包括2、3、4、5或6個核苷單位。
文檔編號A61K31/7125GK1610553SQ02810843
公開日2005年4月27日 申請日期2002年5月15日 優先權日2001年5月16日
發明者R·P·伊耶爾, 金毅, A·羅蘭, W·周 申請人:米克羅洛吉斯生物技術公司