一種mlck定量檢測方法

2023-12-09 14:56:46 2

一種mlck定量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種MLCK定量檢測方法，建立定量檢測ＭＬＣＫ的雙抗夾心ＥＬＩＳＡ法，本發明的的ＥＬＩＳＡ法操作簡單便捷，成本低，靈敏度和特異性均較好，不失為一種檢測ＭＬＣＫ的好方法，目前ＭＬＣＫ的ＥＬＩＳＡ檢測試劑盒多為進口產品，國內類似試劑盒較少，進口產品價格昂貴，不利於對ＭＬＣＫ開展大規模研究，本發明建立ＭＬＣＫ的ＥＬＩＳＡ定量檢測方法，為血清ＭＬＣＫ檢測提供一種便捷簡單的方法。
【專利說明】—種MLCK定量檢測方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種MLCK定量檢測方法，屬於生物醫藥【技術領域】。

【背景技術】
[0002]MLCK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可由C a 2 + / C a M激活，使肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而參與包括平滑肌收縮、細胞黏附、細胞擴展及遷移、細胞胞漿運動等過程，對MLC K作用機制的認識將有助於了解與收縮過程相關疾病，如血管損傷、哮喘及心肌損傷等的發生發展，因此，血清M L C K含量的檢測顯得尤為重要。


【發明內容】

[0003]本發明的目的是:提供一種MLCK定量檢測方法，通過建立了M L C K定量檢測的ELIS A方法，其靈敏度和精密度均較好，為人血清M L C K的檢測提供了一種簡便快捷方法，以克服現有技術的不足。
[0004]本發明的技術方案
一種MLCK定量檢測方法，建立定量檢測M LCK的雙抗夾心EL I S A法。
[0005]前述的一種MLCK定量檢測方法中，用抗M L C K兔多克隆抗體包被酶標板，I %小牛血清白蛋白作為封閉液，抗M L C K羊多克隆抗體和H R P兔抗羊抗體分別為包被抗體和檢測抗體，建立雙抗體夾心E L I S A法。
[0006]由於採用上述技術方案，與現有技術相比，本發明的的E L I S A法操作簡單便捷，成本低，靈敏度和特異性均較好，不失為一種檢測M L C K的好方法，目前M L C K的EL I S A檢測試劑盒多為進口產品，國內類似試劑盒較少，進口產品價格昂貴，不利於對ML C K開展大規模研究，本發明建立ML C K的E L I S A定量檢測方法，為血清M LC K檢測提供一種便捷簡單的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]附圖1為包被抗體的檢測抗體工作濃度的選擇圖(0D值)；
附圖2為MLCK標準曲線圖；
附圖3為批內、批間精密度評價結果圖。

【具體實施方式】
[0008]下面結合附圖對本發明作進一步的詳細說明，但不作為對本發明的任何限制。
[0009]本發明的實施例:
I材料與方法
1.1主要試劑和儀器抗M LC K兔多抗和抗M LC K羊多抗(S antaCruzB1technology，Inc )、HRP 兔抗羊單克隆抗體(博士德)、M L C K重組蛋白(A b η ο vacorporat i ο η )、恆溫水浴箱(北京六一廠)及酶標儀(B i O-Rad 6 8 0 )。
[0010]1.2雙抗體夾心E L I S A方法建立 1.2.1雙抗體夾心E L I S A基本操作步驟
以抗M L C K兔多抗包被酶標板，每孔I O O μ I，4 °C過夜；P B S - T洗板5次，拍幹；I %B S A每孔2 O O μ 13 7 °C封閉2 h，洗板同上，加入M L C K重組蛋白標準品和待測血清，3 7 °C孵育I.5 h，洗板同上；加抗M L C K羊多抗，每孔I O O μ I，
37 °C孵育I.5 h，洗板同上；加入酶標抗體每孔IQQy I，3 7 °C孵育I.5 h ;每孔加入新鮮配製的鄰苯二胺(O P D )底物溶液I O O μ 1,37 1:避光顯色I 5 m i η，終止反應，用酶標儀讀取O D值,讀數波長4 9 O n m,參考波長6 5 O nm。
[0011]1.2.2包被抗體和檢測抗體工作濃度
用棋盤滴定實驗確定包被抗體和檢測抗體工作濃度，用包被緩衝液(P B S，P H7.4,0.1 5mo I / L )將包被抗體(抗M L C K兔多抗，2 O O m g / L )稀釋成1、
0.1和0.0 5 mg / L包被酶標板，用洗滌液P BS- T稀釋檢測抗體(抗M L C K羊多抗，2 O O m g / L)稀釋成1、0.1和0.0 5mg/L 3個濃度，固定M L C K重組蛋白濃度，陰性對照為P B S -T ,以O D值最高陽性孔，陰性對照O D值最低處為包被抗體和檢測抗體工作濃度。
[0012]1.2.3標準曲線用P B S - T將ML C K重組蛋白分
別稀釋成 18.33、36.67、55.0 0,9 1.60 及 110mg/L，每個濃度均做復孔，波長4 9 O n m處讀取O D值，以O D平均值為縱坐標，濃度的自然對數L N(X)為橫坐標繪製曲線。
[0013]1.3方法學評價 1.3.1檢測限評價
以零濃度孔重複測定I O次，計算O D平均值(X)及標準差(s)，X 土 2 s D在標準曲線上對應的濃度即為靈敏度。
[0014]1.3.2精密度評價
在線性範圍內取低、高2個濃度的血清樣本，連續測定6次，計算批內變異係數；取低、高2個濃度的血清樣本每天測定2次，連續3 d，計算批間變異係數。
[0015]2 結果
2.1包被抗體和檢測抗體工作濃度的選擇
根據棋盤滴定實驗結果(附圖1 )，以陽性孔O D值最高，空白孔O D值最低時抗體的濃度為最佳工作濃度，確定包被抗體的工作濃度為0.lmg/ L，檢測指示抗體稀釋度為
1m g / L。
[0016]2.2 標準曲線的繪製
通過M L C K重組蛋白的濃度自然對數I n (X)為橫坐標與O D值為縱坐標，繪製標準曲線(附圖2)，回歸方程為y = 0.4 5 7 X + 0.465 ,R2=0.995。
[0017]2.3.1 檢測限
根據制定的標準曲線，空白孔(X +2 s)D對應的濃度為5.1 6mg/L，即為該方法的檢測限。
[0018]2.3.2 精密度
該方法低、高濃度樣本批內變異係數分別為5.9 %和6.1 %,平均批內變異係數為6.0% ;低、高濃度樣本批間變異係數分別16.0 %和I 9.8 %，平均批間變異係數為
I7.9 %，滿足批內精密度< I O %，批間精密度< 2 O % (見附圖3)。
[0019]3 討論
MLC K作為調節肌肉收縮的重要酶，與高血壓、血小板功能異常、糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、哮喘等許多臨床疾病具有一定關係，E L I S A法具有靈敏度高、特異性強、設備簡單、操作簡便、對人體無害等優點，應用廣泛，本研究成功建立了M L C K定量檢測的雙抗體夾心E L I S A法，其定量檢測限為5.1 6 m g / L，批內變異係數6.0 %,批間變異系I 7.8 %，能夠滿足研究需要，EL I S A建立時抗體濃度的選擇是實驗成功的關鍵之一，本實驗通過棋盤滴定法確定了抗體的最佳工作濃度，包被抗體和檢測抗體濃度分別為O，I和I m g / L。為了準確定量,本實驗選擇純化的M L C K重組蛋白為標準品，進行系列濃度稀釋繪製標準曲線，其回歸方程為y = 0.4 5 7 x + 0.4652，R2=0.9 9 5。
[0020]在E L I S A操作中要注意一些問題，(I )加樣是E L I S A中操作最多的步驟，加樣的準確性直接影響到檢測結果的準確性和重複性，因此，應注意將所加物加到酶標板孔底部，避免加到壁上，不
可產生氣泡等；(2)洗板亦是非常關鍵的步驟，因為E L I S A是靠洗滌達到分離游離和結合的酶標記物的目的，以清除殘留於板孔中未與固相抗原或抗體結合的物質及非特異性吸附的幹擾物質；(3 )除此之外，還應注意孵育的時間和溫度，試劑是否恢復室溫等問題；
本實驗建立了簡便快速的檢測人血清MLC K的EL I S A方法，對MLC K在疾病中的臨床應用研究提供了檢測診斷基礎。
【權利要求】
1.一種MLCK定量檢測方法，其特徵在於:建立定量檢測M L C K的雙抗夾心E L I SA法。
2.根據權利要求1所述的一種MLCK定量檢測方法，其特徵在於:用抗ML C K兔多克隆抗體包被酶標板，I %小牛血清白蛋白作為封閉液，抗M L C K羊多克隆抗體和H R P兔抗羊抗體分別為包被抗體和檢測抗體，建立雙抗體夾心E L I S A法。
【文檔編號】G01N33/53GK104459102SQ201410740600
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】敖雲霞 申請人:敖雲霞