一種可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒及方法與流程
2023-12-10 05:19:01
本發明涉及化學檢測技術領域，具體而言，涉及一種可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒及方法。
背景技術：
汞離子(hg2+)和銀離子(ag+)是高毒性金屬離子和廣泛的環境汙染物中的兩種，即使在低濃度下也會對環境和人造成嚴重的永久性的損害。更嚴重的是，通過汙染水源，ag+和hg2+可以積累到農產品和水產品中，進入人類的食物鏈。hg2+汙染對人類有著極大的危害，人體無法通過自身的代謝排洩食物鏈或其他途徑積累在體內的微量汞，而微量汞在體內的積累將直接導致心臟、肝、甲狀腺等疾病，甚至導致神經系統紊亂、慢性中毒及智力障礙。納米銀有著特殊的殺菌、催化和光學特性，在電子、電鍍、感光等行業有著廣泛的應用，這些涉及銀的行業的生產和應用中會產生含銀的工業廢水，這種含銀廢水對環境的汙染非常嚴重。在現有ag+的環境中長時間暴露的情況下，人可能引起緩慢進行的物理和神經退行性疾病。因此，hg2+和ag+的檢測在環境監測，食品安全和臨床診斷領域非常重要。
汞能夠和胸腺嘧啶t形成t-hg-t結構，銀離子能夠和胞嘧啶c形成c-ag-c的結構，利用這一原理已經建立了一些基於dna的用於檢測水，藥物，食品和臨床樣品中的hg2+或ag+檢測到方法。但是這些檢測都是單種金屬離子檢測。然而，hg2+和ag+通常共存於水，土壤甚至生物系統中，對於hg2+和ag+的共存系統，這些測定需要不同的檢測方法和實驗條件以同時檢測hg2+和ag+，這增加了這些測定的複雜性和不便。為了滿足實際樣品分析的實際需要，也有人建立能夠同時檢測hg2+和ag+的方法，然而這些方法在實際應用中遭受某些限制，例如使用掩蔽劑，低靈敏度和複雜性。因此，在實際樣品中實現hg2+和ag+的簡單和同時檢測仍然是一個巨大的挑戰。
有鑑於此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明設計了一種基於核酸適配體的試劑盒，可以同時檢測汞離子和離子，具有簡單快速的優點。
為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：
描寫獨權的技術方案。
根據本發明的一方面，本發明涉及一種可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述試劑盒包括核酸適配體試紙條以及核酸適配體反應液；
所述核酸適配體試紙條包括樣品墊、反應膜、吸收墊和底板；
所述反應膜上設置有檢測線t線和質控線c線；
所述檢測線t線固定包被有含有5'-aacaaagaacccccccccc-3'的捕獲序列；
所述質控線c線固定包被有質控探針；
所述核酸適配體反應液中包括序列為5'-x1-tttctttcttccccccggttgtttgtt-y1-3'的核酸適配體，其中x1為顯示信號強度的指示劑，y1為與所述質控探針互補的序列。
本發明還涉及一種使用所述的試劑盒檢測汞和/或銀離子的方法，包括：
1).將核酸適配體反應液與待檢離子液混合孵育得到反應混合物；
2).將所述反應混合物加到核酸適配體試紙條的樣品墊上；
3).在質控線c線出現檢測信號的前提下，檢測檢測線t線的信號值，將所述信號值代入預先建好的hg2+和/或ag+的濃度-信號值標準曲線，從而得知待檢離子液中hg2+和/或ag+的含量。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
1)、本發明提供的核酸適配體在用於hg2+和ag+同時檢測時反應快速、靈敏度高、選擇性好；
2)、通過優化反應體系及反應條件，本申請在檢測hg2+和ag+時具有更高的靈敏度及更寬的線性範圍；其中反應ag+和hg2+的檢測極限均低至500ppb，且ag+和hg2+的濃度與螢光信號成線性比例關係；
3)、核酸適配體具有非常好的熱穩定性，因此本發明的試紙條還可以常溫儲運，具有貨架期長、結果可靠等優點。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發明提供的基於核酸適配體同時檢測汞和銀離子的試紙條的示意圖；附圖標記為：1-樣品墊；2-檢測線t線；3-質控線c線；4-反應膜；5-吸收墊；6-底板；
圖2為試紙條上hg2+的螢光適配體濃度優化結果；①～⑥依次為0.2μm、0.1μm、0.08μm、0.05μm、0.02μm、0.01μm；
圖3為適配體螢光試紙條檢測hg2+線性範圍結果；
圖4為適配體螢光試紙條檢測ag+線性範圍結果。
具體實施方式
一種可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述試劑盒包括核酸適配體試紙條以及核酸適配體反應液；
所述試紙條包括樣品墊、反應膜、吸收墊和底板；
所述反應膜上設置有檢測線t線和質控線c線；
所述檢測線t線固定包被有含有5'-aacaaagaacccccccccc-3'的捕獲序列；
所述質控線c線固定包被有質控探針；
所述核酸適配體反應液中包括序列為5'-x1-tttctttcttccccccggttgtttgtt-y1-3'的核酸適配體，其中x1為顯示信號強度的指示劑，y1為與所述質控探針互補的序列。
本發明試紙條結構組成示意圖如圖1所示。
本發明的檢測原理為：
首先將樣品與顯示信號強度的指示劑(例如螢光素)標記的適配體在室溫下反應5分鐘，形成檢測靶標-適配體複合物，然後將反應混合物加到試紙條樣品墊上，反應混合物在層析作用下上行至反應膜檢測線處。反應混合物中剩餘游離的螢光素標記適配體會與檢測線t線處的互補片段結合，在檢測線處出現螢光；而反應混合物中剩餘的靶標-螢光素適配體複合物等會繼續在層析作用下上行至質控線c線處與另一段互補序列結合，在質控線c線處出現螢光信號。如果樣品中待檢靶標濃度越高，則剩餘的游離螢光素標記適配體越少，檢測線t線處的螢光強度越低；反之如果樣品中待檢靶標濃度越低，則剩餘的游離螢光素標記適配體越多，檢測線t線處的螢光強度越高；因此樣品中的靶標濃度與檢測線處的螢光強度成反比，根據檢測線處的螢光信號強度可以計算出樣品中的待檢汞離子或銀離子的濃度。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，在所述核酸適配體反應液中，所述核酸適配體的濃度為0.06μm～0.1μm；優選為0.08μm。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述捕獲序列和所述質控探針通過偶聯生物素包被在標記有親和素的所述反應膜上；
更優選的，所述捕獲序列的3'段偶聯有5'-(ch2)3-biotin-3'。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述x1包括螢光物質、生物素、放射性同位素、電子緻密物、膠體金或酶中的任一種。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述螢光物質包括alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa555、alexa647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基螢光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、cascadeblue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺醯氯、螢光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯並-2-氧雜-1，3-二唑)、oregongreen488、oregongreen500、oregongreen514、pacificblue、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲鹼、花青、黃嘌呤、琥珀醯螢光素、稀土金屬穴狀化合物、三雙吡啶基二胺銪、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青苷、lajolla藍染料、別藻藍蛋白、allococyaninb、藻藍蛋白c、藻藍蛋白r、硫胺、藻紅青蛋白、藻紅蛋白r、reg、羅丹明綠、羅丹明異硫氰酸酯、羅丹明紅、rox、tamra、tet、trit(四甲基羅丹明異硫醇)、四甲基羅丹明和德克薩斯紅中的任一種。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述y1包括polya、polyt、polyg或polyc中的一種。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述y1的核苷酸的數量為9～18個；更優選為12～15個，還可以選擇13、14個。
優選的，如上所述的可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒，所述反應膜為硝酸纖維素膜。
一種使用如上所述的試劑盒檢測汞和/或銀離子的方法，包括：
1).將核酸適配體反應液與待檢離子液混合孵育得到反應混合物；
2).將所述反應混合物加到核酸適配體試紙條的樣品墊上；
3).在質控線c線出現檢測信號的前提下，檢測檢測線t線的信號值，將所述信號值代入預先建好的hg2+和/或ag+的濃度-信號值標準曲線，從而得知待檢離子液中hg2+和/或ag+的含量。
本發明提供的試劑盒可用於單獨檢測汞或銀離子，也可用於二者的同時檢測。
優選的，如上所述的檢測汞和/或銀離子的方法，在步驟1)中，所述核酸適配體反應液與所述待檢離子液的混合比為1：(7～11)；更優選為1：(8～11)；最優選為1:9。
優選的，如上所述的檢測汞和/或銀離子的方法，在步驟2)中，所述反應混合物的上樣量為50μl～70μl；更優選為60μl。
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
實施例1試紙條的製備
首先本發明設計了一段核酸適配體序列及其兩段互補序列，其中兩段互補序列末端分別修飾生物素，然後通過和親和素結合，分別固定在檢測線t線處和c線處。其中核酸適配體序列既可以結合汞離子，也可以結合銀離子，因此本試紙條可同時檢測汞離子和銀離子。
優選的，本發明的核酸適配體序列及兩段互補序列如下：
1、核酸適配體及t線和c線核酸序列合成：
本發明設計的三段寡核苷酸序列按上述序列及修飾方式，委託上海生物工程有限公司合成。
2、試紙條耗材購買：樣品墊(gl-b04)和吸收墊(h5076)均購自上海傑一生物公司，jb6底板、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜(nc膜)(sartotiuscn140)均購自上海捷寧生物公司。
3、c線探針溶液製備：將1mg鏈黴親和素溶解於1mlph為7.4的0.01mm磷酸鹽緩衝液(pbs)中，將50μl鏈黴親和素溶液和350μl5μmdna探針1混合，並在室溫下反應2小時。
4、t線探針溶液製備與以上方法相同。
5、點樣：將硝酸纖維素膜，玻璃纖維素膜，樣品墊和吸收墊按照圖1所示按順序彼此層壓2mm並粘貼到jb6底板上。然後用點樣儀把t線探針溶液和c線探針溶液噴至硝酸纖維素膜上，將試紙條放入37℃的培養箱中孵育30min，用試紙條切割機切成4mm寬的試紙條，放入自封袋裡，在乾燥的環境中放置備用。
實施例2試紙條條件優化
1、試紙條最適適配體濃度的優化
為了達到最佳的檢測結果，要確定螢光適配體的最佳用量，游離的適配體過量，會與適配體靶標複合物競爭雜交到t線的dna探針1上，降低反應的靈敏度，而且浪費試劑，增加該檢測方法的成本。由於隨著靶標物濃度的增加，t線的峰值減小，無靶物質時的峰值為最大值，如果適配體量太少，t線的峰值不夠大，會使t線顯螢光不足，造成反應的檢測範圍小，不能達到檢測的目的。由上海生工公司合成的cy5標記的適配體分別稀釋為0.01μm,0.02μm,0.05μm,0.08μm,0.1μm，和90μl緩衝液(50mmtris-hacph＝7.4，20mmmg(ac)2,20mmkac,10mmnaac,1％蔗糖,0.1％tween20,0.5g/mlpeg)混合在室溫下反應10min後，取60μl反應液滴加到樣品墊上，用試紙條螢光掃描儀在610nm波長下掃描試紙條的螢光強度。實驗結果如圖2，當濃度為0.01,0.02μm時，t線和c線處的螢光峰值較小，說明適配體濃度過小不足以與tc結合，當適配體濃度為0.05μm時，t線的吸收峰面積為668，峰值略低，而0.2μm時的峰值又過大會影響到反應的靈敏度，因此該反應選擇0.08μm的適配體參與反應。
實施例3試紙條的靈敏度檢測研究
1、hg2+靈敏度檢測
基於以上優化的檢測條件，通過該基於適配體競爭法的試紙條分析了不同濃度的hg2+標準液(400ppb,500ppb,600ppb,700ppb,800ppb,900ppb,1000ppb)取上述反應優化好的量的反應液，滴加到試紙條的樣品墊上，每個樣品重複三次，每個樣品滴加時間相隔1min，放置10min後用試紙條螢光掃描儀掃描試紙條的螢光強度。
如圖3，t線的螢光強度隨著hg2+濃度的增加螢光強度降低，並在500ppb-1ppm之間成線性。該方法檢測靈敏度為500bp，標準曲線方程為用y＝-1.501x+1814.6，r2＝0.984。
2、ag+靈敏度檢測
基於以上優化的檢測條件，通過該基於適配體競爭法的試紙條分析了不同濃度的ag+標準液(400ppb,500ppb,600ppb,700ppb,800ppb,900ppb,1000ppb)，取上述反應優化好的量的反應液，滴加到試紙條的樣品墊上，每個樣品重複三次，每個樣品滴加時間相隔1min，放置10min後用試紙條螢光掃描儀掃描試紙條的螢光強度。
如圖4，t線的螢光強度隨著ag+濃度的增加螢光強度降低，並在500ppb-1ppm之間成線性。該方法檢測靈敏度為500bp，標準曲線方程為y＝-1.5365x+1763.6，r2＝0.9815。
實施例4
在樣品溶液中加入1ppm的不同離子(pb2+,cu2+,li+,zn2+,na+,ca2+,mg2+,k+,hg2+和ag+)，在上述優化好的實驗條件基礎上，代替hg2+和ag+進行實驗，使用試紙條螢光掃描儀掃描試紙條的螢光強度，考察其他金屬離子對此檢測方法hg2+和ag+的幹擾。在同樣的反應條件下，用其他重金屬離子進行試紙條實驗，結果發現，其他重金屬離子並不能使實驗中t線螢光強度降低，說明試紙條有良好的特異性。而hg2+、ag+能使t線下降接近80％左右。
最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。
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中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
一種可同時檢測汞和銀離子的核酸適配體試劑盒及方法
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