一種篩查轉基因小麥的方法
2023-12-10 04:07:41 2
專利名稱：一種篩查轉基因小麥的方法
技術領域：
本發明涉及一種篩查轉基因小麥的方法。
背景技術：
由於小麥的遺傳基因複雜，轉基因小麥品種的研究比其它作物花費了更長的時間，2001年全世界第一個轉基因小麥品種問世，2005年6月已經在美國FDA申請註冊登記。我國的轉基因小麥有改良品質和抗病抗除草劑等，幾年內即將投入商品化生產。隨著我國小麥進出口貿易量增加，小麥中轉基因成分檢測勢在必行，意義重大。
目前，國內外轉基因小麥品系的通用外源基因有來源於農桿菌的胭脂鹼合成酶基因NOS終止子，玉米泛素蛋白基因Ubiquitin啟動子(GENBANK號為AY572837.1GI45862532)和bar，uidA標記基因等；內源基因小麥中有麥谷醇溶蛋白基因GAG56D和蠟質基因Wx012(日本)。
實時螢光定量PCR(real-time Q-PCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重複性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工具。所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的螢光信號，隨著反應時間的進行，監測到的螢光信號的變化可以繪製成一條曲線。在PCR反應早期，產生螢光的水平不能與背景明顯地區別，可以在PCR反應處於指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，並且由此來推斷模板分子最初的拷貝數。首先需設定一定螢光信號的域值，一般這個閾值(域值)(threshold)是以PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號(baseline)，域值的設置是3～15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到螢光信號超過閾值被認為是真正的信號，它可用於定義樣本的域值循環數(Ct)。Ct值的含義是每個反應管內的螢光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個PCR反應的Ct值與該PCR模板的起始拷貝數的對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要測得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。最常用的Real-time Q-PCR是Taqman探針技術。
發明內容
本發明的目的是提供一種篩查轉基因小麥的方法。
本發明所提供的篩查轉基因小麥的方法，是檢測待測小麥的基因組中是否含有Ubiquitin啟動子，若含有Ubiquitin啟動子，則該待測小麥為轉基因小麥。
為了避免在實際操作中出現假陰性結果，所述方法中，還包括檢測待測小麥的基因組中是否含有GAG56D基因。如果在待測小麥中未檢測到GAG56D基因，則表明待測小麥中的核酸沒有提取出來或PCR體系中存在物質抑制等。
所述方法中，採用實時螢光PCR檢測待測小麥的基因組中是否含有GAG56D基因和Ubiquitin啟動子。
所述實時螢光PCR檢測GAG56D基因的一對引物，它們的核苷酸序列為序列表中序列1和序列2，所述實時定量PCR檢測Ubiquitin啟動子的一對引物，它們的核苷酸序列為序列表中序列3和序列4。所述實時螢光PCR檢測GAG56D基因的探針，其核苷酸序列為序列表中序列5；所述實時螢光PCR檢測Ubiquitin啟動子的探針，其核苷酸序列為序列表中序列6。
所述實時螢光PCR檢測GAG56D基因或Ubiquitin啟動子的反應程序為兩步法預變性95℃ 10s，1個循環；95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環；或三步法預變性95℃/10min，1個循環；95℃/5s，50℃/5s，60℃/20s，40個循環。
所述轉基因小麥為含有Ubiquitin啟動子的小麥。所述轉基因小麥中至少含有具有自GENBANK號為AY572837.1(GI45862532)的5′端第2175-2301位核苷酸序列的玉米泛素蛋白基因Ubiquitin啟動子。
本發明的方法通過檢測小麥樣品基因組中是否含有小麥屬內源GAG56D特異參照基因和Ubiquitin啟動子序列，可以準確的檢測該小麥是否是轉基因小麥。本發明的方法使轉基因小麥的篩查更加快速(整個檢測過程只需40-120分鐘，不同螢光PCR儀器檢測時間不同)，簡便，精確。本發明的方法可廣泛用於進出口貿易轉基因小麥以及含有轉基因小麥成分食品的檢測和市場監管。
圖1為內參照基因麥谷醇溶蛋白基因GAG56D的檢測結果圖2為轉基因和非轉基因小麥GAG56D基因的擴增曲線圖3為轉基因和非轉基因小麥Ubiquitin啟動子的擴增曲線具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
實施例中所用材料轉基因小麥B73，B72，B102(B73，B72，B102含有的Ubiquitin啟動子的序列為自GENBANK號為AY572837.1(GI45862532)5′端第2175-2301位核苷酸序列。華中科技大學提供，林剛，何光源.《轉基因小麥「中間試驗」與農藝性狀評價》，武漢植物學研究2004，22(4)284-288)非轉基因冬小麥京冬6號，京花1號(北京農林科學院提供，張曉東，梁榮奇等.優質HMW谷蛋白亞基轉基因小麥的獲得及其遺傳穩定性和品質性狀分析，科學通報，2003，5474-479)；一粒麥(AA)，二粒麥(AABB)，硬粒麥(AABBDD)，斯卑爾脫小麥(AABBDD)，粗山羊草(DD)，黑麥(RR)，大麥亞族中的大麥，同時對小麥亞族以外的燕麥，蕎麥，大豆，玉米，水稻，穀子，亞麻籽(均來自黑龍江省農業科學院)。
實施例1、篩查轉基因小麥的方法的確定及其效果實驗1、內參照基因麥谷醇溶蛋白基因GAG56D的檢測通過GENBANK搜索和同源性分析首次找出了小麥屬特有的內參照基因麥谷醇溶蛋白基因GAG56D(GENBANK號為GI10638295)。
針對小麥中麥谷醇溶蛋白內源參照基因GAG56D設計併合成了探針和引物，引物15′-caacaattttctcagccccaaca-3′(序列表中序列1)，引物25′-ttcttgcatgggttcacctgtt-3′(序列表中序列2)(引物1和引物2擴增的片段為自GENBANK號為10638295的5′端的第353-474位脫氧核苷酸)；探針1為5′FAM--ttcccgcagccccaacaaccgc-Tamra 3′(序列表中序列5)。
提取小麥(染色體組成AABBDD)轉基因小麥B73(圖1中8)，非轉基因冬小麥京花1號(圖1中9)；一粒麥(AA)(圖1中2)，二粒麥(AABB)(圖1中3)，硬粒麥(AABBDD)(圖1中4)，斯卑爾脫小麥(AABBDD)(圖1中5)，粗山羊草(DD)(圖1中7)，黑麥(RR)(圖1中6)，同時對小麥亞族以外的大麥(圖1中10)，燕麥(圖1中11)，蕎麥(圖1中12)，大豆(圖1中13)，玉米(圖1中14)，水稻(圖1中15黑米，16白米)，穀子(圖1中17)，亞麻籽(圖1中18)樣品中的基因組DNA。
以上述提取的基因組DNA為模板，分別以上述引物1和引物2，以探針1為探針，用螢光定量PCR進行了定性檢測。
實時螢光兩步法PCR反應程序為預變性95℃ 10s，1個循環；95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環。
反應體系為10×PCR Buffer 1×，氯化鎂(MgCl2)2.5mmol/L，dNTP(含dUTP)0.2mmol/L，UNG酶0.075U，引物10.2pmol/μL，引物20.2pmol/μL，探針0.2pmol/μL，Taq酶2.5U/μL，DNA模板(20-30ng/μL)5.0μL，補水至50μL。
以引物1和引物2為引物的實時螢光PCR檢測結果如圖1所示，結果表明，所有小麥屬中的品系(2-9號)都出現了擴增曲線，而水空白對照(圖1中1)和其它作物中沒有擴增曲線。說明麥谷醇溶蛋白內源參照基因GAG56D是小麥屬特有的內參照基因。同時也證明了轉基因小麥的DNA提取成功，同時防止了假陰性結果的出現。
2、轉基因小麥的實時螢光PCR定量(性)檢測方法。
選取轉基因小麥B73，B72，B102(B73，B72，B102含有的Ubiquitin啟動子的序列為自GENBANK號為AY572837.1(GI45862532)的5′端第2175-2301位脫氧核苷酸)，非轉基因小麥京冬6號，京花1號，提取基因組DNA。針對小麥屬內源特異參照基因GAG56D，設計了特異的引物序列，引物1和引物2，以及探針1序列5′-FAMttcccgcagccccaacaaccgc-TAMRA 3′。針對目前國內外轉基因小麥品系的通用外源基因Ubiquitin啟動子，設計了特異的引物序列，引物35′-GTCCAGAGGCAGCGACAGA-3′(序列表中序列3)，引物45′-CGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTA-3′(序列表中序列4)(引物3和引物4擴增的片段是自GENBANK號為AY572837.1 GI45862532的5′端第2175-2301位脫氧核苷酸)，探針2序列5′FAM-TGCCGTGCCGTCTGCTTCGCTTG-TAMRA 3′(序列表中序列6)。以上述製備的基因組DNA作為模板，用螢光定量PCR進行了定性定量檢測。
實時螢光PCR反應程序為兩步法為預變性95℃ 10s，1個循環；95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環，或三步法為預變性95℃ 10min，1個循環；95℃ 5s，50℃ 5s，60℃ 20s，40個循環。
檢測轉基因小麥GAG56D和Ubiquitin的PCR反應體系為10×PCR Buffer 1×，氯化鎂(MgCl2)2.5mmol/L，dNTP(含dUTP)0.2mmol/L，UNG酶0.075U，引物(上遊)0.2pmol/μL，引物(下遊)0.2pmol/μL，探針0.2pmol/μL，Taq酶2.5U/μL，DNA模板(20-30ng/μL)5.0μL，補水至50μL。
當外源基因和內源參照基因標記相同的螢光報告基團時，應在不同反應管中分別加入外源基因和內源參照基因的引物、探針，分別進行檢測。
合適的DNA模板量是內參照基因GAG56D檢測的Ct值在15-36之間，外源基因Ubiquitin啟動子檢測的Ct值在27-36之間。否則應進一步增加/減少或純化DNA。
結果如圖2和圖3所示，表明在轉基因小麥B73，B72，B102和非轉基因小麥京冬6號，京花1號的基因組中均檢測到內參照基因GAG56D；在轉基因小麥B73，B72，B102的基因組中均檢測到Ubiquitin啟動子序列，而在非轉基因小麥京冬6號，京花1號基因組中均未檢測到Ubiquitin啟動子序列。
序列表1606210121123212DNA213人工序列220
223
4001caacaatttt ctcagcccca aca 23210221122212DNA213人工序列220
223
4002ttcttgcatg ggttcacctg tt 22210321120212DNA213人工序列220
223
4003gtccagaggcagcgacaga20210421120212DNA213人工序列220
223
4004cgagtagataatgccagcctgtta210521122212DNA213人工序列220
223
4005ttcccgcagc cccaacaacc gc 22210621120212DNA213人工序列
220
223
4006tgccgtgccgtctgcttcgcttg20
權利要求
1.一種篩查轉基因小麥的方法，是檢測待測小麥的基因組中是否含有Ubiquitin啟動子，若含有Ubiquitin啟動子，則該待測小麥為轉基因小麥。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法中，還包括檢測待測小麥的基因組中是否含有GAG56D基因。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述方法中，採用實時螢光PCR檢測待測小麥的基因組中是否含有GAG56D基因和Ubiquitin啟動子。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述實時螢光PCR檢測GAG56D基因的一對引物，它們的核苷酸序列為序列表中序列1和序列2；所述實時螢光PCR檢測Ubiquitin啟動子序列的一對引物，它們的核苷酸序列為序列表中序列3和序列4。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述實時螢光PCR檢測GAG56D基因的探針，其核苷酸序列為序列表中序列5；所述實時螢光PCR檢測Ubiquitin啟動子的探針，其核苷酸序列為序列表中序列6。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述實時螢光PCR檢測GAG56D基因或Ubiquitin啟動子的反應程序為預變性95℃ 10s，1個循環；95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環；或者預變性95℃ 10min，1個循環；95℃ 5s，50℃ 5s，60℃ 20s，40個循環。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特徵在於所述轉基因小麥為基因組基因中含有Ubiquitin啟動子的轉基因小麥。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述轉基因小麥中至少含有GENBANK號為AY572837.1的5′端第2175-2301位脫氧核苷酸的Ubiquitin啟動子片段。
全文摘要
本發明公開了一種篩查轉基因小麥的方法。該方法，是檢測待測小麥的基因組中是否含有Ubiquitin啟動子，若含有Ubiquitin啟動子，則該目的材料為轉基因小麥。本發明的方法篩查轉基因小麥更加快速，簡便，精確。
文檔編號C12Q1/68GK1932037SQ200610113170
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月18日 優先權日2006年9月18日
發明者欒鳳俠, 張洪祥, 白月, 陶波 申請人:欒鳳俠