一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法
2023-12-03 02:26:56 1
專利名稱：一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法 背景技術對SOD的研究起始於1938年。1938年英國T.mann和D.keilin最早從牛血液中分離出含 銅的蘭綠色蛋白，當時稱血銅蛋白。1953年從馬肝中分離出類似蛋白稱肝銅蛋白，後來又從 腦中分離出這種蛋白稱腦銅蛋白。1969年Mccord和Fridovich發現該蛋白有催化02，發生歧化反應的功能，故將此酶命名 為超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase ,SOD ,EC1.15丄1)。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)是生物體防禦氧化損傷的一種十分重要 的生物酶，能夠催化超氧陰離子(O2—)發生歧化反應，從而專一的清除生物體內的超氧陰離 子，平衡機體的氧自由基，較好地抵禦氧自由基和其他氧化物自由基對細胞質膜的毒性。在高等植物中，SOD根據其輔基部位結合的不同金屬離子分為三類MnSOD、 FeSOD、 CuZnSOD。在植物中CuZnSOD是三種超氧化物歧化酶中含量最豐富的一類，主要存在於葉 綠體、胞質和過氧化物酶體中。MnSOD和FeSOD每個亞基都只含有一個金屬離子，MnSOD 主要存在於線粒體中，而FeSOD存在於葉綠體中。MnSOD的催化活性不受其產物H202的抑制。線粒體是真核生物細胞進行有氧呼吸的主 要場所，通過其內膜的電子傳遞鏈實現能量轉換的功能；當生物處於脅迫或病變條件下，線 粒體內膜電子傳遞受阻，將導致活性氧過量產生，對線粒體乃致整個細胞造成傷害。因此 MnSOD是細胞線粒體內消除超氧陰離子、保護線粒體不受活性氧傷害的關鍵酶。MnSOD是人體內除CuZnSOD之外的另一種SOD，與CuZnSOD相比具有壽命長、分子 量小等優點，而且錳的毒性較之銅鐵為低,其小分子配合物作為模擬MnSOD安全性好。因而 近年來有關MnSOD的研究非常活躍。在SOD家族中MnSOD的特點是:生物半衰期較長，抗炎抗輻射作用優於CuZnSOD，這表 明MnSOD作為酶製劑具有十分重要的醫用價值和潛在的臨床應用前景。由於MnSOD僅存於線粒體中，含量甚微，用傳統的生物化學方法難以從天然組織中分離純化較大量的MnSOD蛋白，因此採用分子克隆的方法獲得MnSOD的基因序列，並通過 轉基因的方法使MnSOD基因在酵母中大量表達是深入研究其功能的重要途徑。酵母菌是單細胞真核生物，具有生長快，易於遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯後加工 和修飾、不產生有毒產物等特點，被認為是表達外源蛋白的合適宿主。裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)細胞橢圓形、圓柱形，由營養細胞接合，形成子囊。 有發酵能力，代表種為粟酒裂殖酵母，最早分離自非洲粟米酒，能使菊芋發酵產生酒精。粟 酒裂殖酵母(fission yeast或Schizosaccharomycespombe)是一種簡單的單細胞生物，其基因 組為14 Mb,大約是大腸桿菌基因組的4倍。該酵母區別於同屬於子囊真菌的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，許多研究表明兩種酵母在系統分類、細胞周期、rRNA的生物合 成和基因的組織、結構及基因的表達調控等方面並不相同，在某些方面裂殖酵母與高等動物卻 有一定的相似性，因此，裂殖酵母也是一種良好的研究真核生物的模式生物。 發明內容本發明提供一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法。本發明採取的技術方案是將構建的含有大豆MnSOD基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體 導入粟酒裂殖酵母中得到的。本發明將MnSOD基因插入到粟酒裂殖酵母表達載體的多克隆位點處，將構建的該重組 粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD導入粟酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉化 子，培養重組粟酒裂殖酵母使MnSOD基因得到表達。本發明重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD，該載體含有Pnmtl啟動子、Pnmtl 終止子序列，抗性基因為氨苄青黴素，選擇標記基因LEU，大豆MnSOD基因位於多克隆酶 切位點Sail和BamHI之間。本發明大豆MnSOD基因分別為SEQ ID NO.l ， SEQ ID N0.2 ， SEQ ID N0.3所述。本發明酵母轉化方法是醋酸鋰轉化法及電擊轉化法。本發明中IPTG能誘導MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中大量表達。本發明公布了誘導物IPTG對MnSOD蛋白在粟酒裂殖酵母中的表達的影響，IPTG誘導 酵母表達，在培養48小時MnSOD蛋白表達量最高，並且表達量要高於未加IPTG培養96 小時蛋白的表達量。從而可知IPTG可以誘導MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的大量表達。
本發明比較了不同長度MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表達情況，得到了開放閱讀框 序列構建的表達載體在酵母中表達量及活性最大。本發明所提供的一種含有錳超氧化物歧化酶的粟酒裂殖酵母表達載體的構建方法。同時 將不同長度MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表達。彌補了傳統錳超氧化物歧化酶製備方法 以及原核表達系統、釀酒酵母和畢赤酵母表達系統的不足。此外，若將發明應用於工業化錳 超氧化物歧化酶的生產，則具有生產規模大，錳超氧化物歧化酶活性高，產酶能力強，生長 周期短，提取成本低的優點，具有重要的實際意義和廣闊的開發前景。
圖1為粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC圖譜。圖2為重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD構建圖。圖3為重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD酶切鑑定圖。圖4為重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD PCR鑑定圖。圖5為重組粟酒裂殖酵母轉化子。圖6為重組粟酒裂殖酵母轉化子PCR鑑定圖。圖7為重組粟酒裂殖酵母轉化子酶切鑑定圖。圖8為含有MnSOD基因的重組質粒在粟酒裂殖酵母中的表達(SDS-PAGE) (48h-96h)。 圖9為含有MnSOD基因的重組質粒在粟酒裂殖酵母中的表達(Native-PAGE) (0h-96h)。 圖IO為同一培養時間，MnSOD不同長度片段在粟酒裂殖酵母中的表達量比較具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法 實施例l、含有三種不同片段長度的MnSOD的載體的構建目的基因:MnSOD(來源於黑豆)，大豆MnSOD基因分別為全長序列SEQ IDNO.l，開放閱 讀框序列SEQIDN0.2 ，成熟肽序列SEQIDN0.3所述。構建含有超氧化物歧化酶基因的粟酒裂殖酵母載體pESPUC-MnSOD的過程如圖2所示，具 體步驟如下1)本實驗所用表達載體為穿梭型粟酒裂殖酵母酵母表達載體pESPUC，見圖l。根據 MnSOD的cDNA序列。用帶有酶切位點的引物分別擴增全長序列，開放閱讀框序列和成熟肽 序列。
引物如下(正向引物酶切位點Sail,反向引物酶切位點BamHI) 全長引物FS 5' ATT GTCGAC ATGGC CGCGC GAGCT CTGT 3'FA 5,CG GGATCC GGATC AAACC CTGGA GGCA 3，開放閱讀框序列引物CS 5' ATT GTCGAC ATGGC CGCGC GAGCT CTGT 3'CA 5' GC GGATCC CTAAG AGCTC TCTTT CTCAT AC 3'成熟肽序列引物MS 5' AA GTCGACGCTAC CCGAT CTGGA TTACG 3'MA 5' GG GGATCCAGAGC TCTCT TTCTC ATACACT 3'以黑大豆芽MnSOD的cDNA序列為模板，用帶有酶切位點的引物擴增不同長度的 MnSOD片段。擴增條件如下①全長序列克隆10xPCR buffer5uldNTP4ulFSlulFAlul模板3ulddH2036ultaq酶0.3ulPCR反應條件94。C變性40s， 57。C退火lmin， 72。C延伸lminl0s，共30個循環，72°C 後延伸10min。②開放閱讀框序列克隆10xPCR buffer 5uldNTP 4ulCS lulCA lul 模板 3lll ddH20 36ul taq酶 0.3ulPCR反應條件94。C變性40s， 52。C退火lmin， 72"C延伸lminlOs，共30個循環，72°C 後延伸10min。③成熟肽序列反應條件10xPCR buffer 5ul dNTP 4ul MS lul MA lul 模板 3ul ddH20 36ul taq酶 0.3ul94。C變性40s， 50。C退火lmin, 72。C延伸lminlOs，共30個循環，72'C後延伸10min。 電泳回收目的片段，用SalI和BamHI37。C酶切，4h，跑電泳回收。2) 同時提取重組粟酒裂殖酵母表達載體的質粒，酶切，回收。3) 將載體與目的片段回收，連接得到含有MnSOD的重組質粒，命名為 pESPUC-MnSOD1001 (全長序列酵母表達載體)，pESPUC-MnSOD726 (開放閱讀框序列酵 母表達載體)，pESPUC-MnSOD598 (成熟肽序列酵母表達載體)。4) 重組表達質粒pESPUC-MnSOD的鑑定。 酶切鑑定用Sail和BamHI 37'C酶切3hPCR鑑定10xPCR buffer 5ul dNTP 4ul FS (CS, MS) MFA (CS， MS) lul模板 3ul ddH20 36ul taq酶 0.3ul全長序列反應條件94℃40s， 57°C lmin， 72°C lminl0s共30個循環，72℃後延伸10min。開放閱讀框序列反應條件94℃40s， 52°C lmin， 72°C lminl0s共30個循環，72℃後延伸10min成熟肽序列反應條件94℃40s, 50°C lmin， 72°C lminl0s共30個循環，72℃後延伸10min 酶切，PCR鑑定結果如圖3， 4。圖3中，1泳道為全長序列酶切鑑定結果；2泳道為成熟肽序列酶切鑑定結果；3泳道為 開放閱讀框序列酶切鑑定結果；4泳道為DL2000圖4中，1泳道為DL2000; 2泳道為成熟肽序列PCR結果；3泳道為開放閱讀框序列PCR結果；4泳道為DL2000;5泳道為全長序列PCR結果；6泳道為DL2000; 由圖可知載體構建成功。實施例2、 MriSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表達一、酵母轉化質粒pESPUC-MnSOD宿主菌粟酒裂殖酵母S.pombe大量提取重組表達載體的質粒，運用AcLi法及電擊法將重組質粒轉入酵母細胞中。 1、 AcLi轉化法YPD培養基(PH=5.3): 1%酵母提取物,2%胰蛋白腖,2%葡萄糖,2%瓊脂。 TE Buffer: 10mM Tris.Cl,lmM EDTA (PH=8.0)。 0.2M LiAc: 0.2lg LiAc溶於100ml蒸餾水中。 70% PEG4000: 35g PEG4000溶於50ml蒸餾水中。1) 在5mlYPD培養基中接種S.pombe過夜。2) 170rpm， 30℃過夜培養。至OD600=1.0。3) 2500rpm， 5min，用5ml TE buffer洗一次沉澱。4) 懸浮於0.6ml TE Buffer,用0.5ml細胞懸浮液和0.5ml 0.2M LiAc混合。5) 取10ul質粒DNA和0.1ml上述混合液混合。30℃保溫30分。 6) 加0.1ml 70% PEG4000， 30。C保溫1 h。7) 力n2ml無菌水，混合後，2500rpm5min。8) 將細胞沉澱懸浮於0.5ml水，取O.lml懸浮液塗於EMM選擇平板上。9) 30。C保溫3-4天。 2、電擊法YCD培養基酵母浸粉10g，葡萄糖20g,水解酪蛋白2g，山梨醇218.6g溶於1L蒸餾水中 1.2M山梨醇218.604g山梨醇溶於1L蒸餾水中。1) 電擊酵母細胞的準備(1) 在500ml的YCD培養基中接種5./7ow6e過夜。(2) 250rpm, 30°(:過夜培養,至濃度為1*107細胞/1111(006=0.7)。(3) 細胞放在冰水浴中15分鐘,使其停止生長。(4) 輕輕將細胞倒入兩個滅過菌的250ml離心管中，3000g,5min,4'C,沉澱細胞。(5) 棄上清,將收集有細胞沉澱的離心管置於冰上。(6) 在每個管中加入50ml滅過菌的冰上預冷的山梨醇,懸浮細胞沉澱,然後加山梨醇至 250ml。 3000g，5min,4。C沉澱細胞,棄上清。(7) 重複6。(8 )加入20ml滅過菌的冰冷的山梨醇懸浮沉澱並轉移到冰凍的50ml離心管 中，3000g，5min,4 °C沉澱細胞,棄上清。(9)用0.5ml滅菌,預冷的1.2M的山梨醇懸浮沉澱,使最終細胞體積為1.3ml,細胞濃度為 1 * 109細胞/ml,將細胞放到冰上,儘可能快地用於電擊。2) 電擊(1) 吸取預轉化的質粒DNA樣品(lug)於1.5ml離心管中,將管置於冰上。(2) 加入200ul感受態細胞到每個DNA樣品中,混合均勻。(3) 將micropulser設為'，ShS"。(4) 將DNA細胞樣品轉入0.2cm已被預冷的電擊杯中，(輕輕敲打管底的懸浮液,放入電擊 池中)電擊。(5) 將杯拿出,立即加入冰冷的0.8ml 1.2M山梨醇,然後將稀釋的細胞轉入到滅過菌的管中。
(6) 檢查並紀錄脈衝參數，時間應控制在5毫秒,磁場強度能通過目前的伏特數(kv)/杯的距 離(cm)精確算出。(7) 在室溫下，將管放置40 60min,使電擊細胞在包括1.2M山梨醇的微量培養基中培養生 長.。30°C、 60-96h孵育細胞。圖5為篩選出的重組酵母轉化子l.成熟肽序列轉化子；2.CDS序列轉化子；3.全長序列轉化子；4. pESPUC空載體轉化子 二、重組酵母轉化子的鑑定1、 酵母質粒的提取酵母提取緩衝液2% Triton X-100， 1%SDS， 100mMNaCl， 1 OmM Tris-Cl (PH=8)， lmM EDTA 。1) 挑取EMM固體培養基中的單菌落於EMM液體培養基中3(TC培養1天。 收集酵母菌體，13000rpm, lmin， 4'C離心。2) 棄上清，將菌體在殘餘液體上渦旋。3) 加入0.2ml酵母提取緩衝液，0.2ml酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)和0.3g玻璃珠，渦 方龍5min。 13000rpm， 8 min。4) 將上清取0.2ml放入一個新管。加入l/10 3MNaAc和等體積的異丙醇，靜止3min5) 13000rpm， 10min。6) 用lml70。/。乙醇洗一次，13000rpm， 5min。7) 在空氣中乾燥10min。8) 重懸於20ulddH20 (含有10%RNase)中。9) 在37。C溫育30min。10) it存於-2(rc。2、 PCR和酶切鑑定轉化子 PCR鑑定10xPCR buffer 5ul ■P 4ul Sense lul Antisense lul
模板 3ul ddH20 36ul taq酶 0.3ul全長序列反應條件94。C40s， 57°C lmin， 72°C lminl0s共30個循環，72。C後延伸10min。開放閱讀框序列反應條件94。C40s， 52°C lmin， 72°C lminl0s共30個循環，72。C後延伸10min。成熟肽序列反應條件94。C40s， 50。C lmin， 72°C lminl0s共30個循環，72。C後延伸10min。 酶切鑑定用Sail和BamHI 37'C酶切3h 轉化子PCR，酶切鑑定如圖6， 7。圖7中，泳道l: DL2000;泳道2:成熟肽序列轉化子PCR鑑定結果泳道3: DL2000;泳道4:開放閱讀框序列轉化子PCR鑑定結果 泳道5為DL2000;泳道6全長序列轉化子PCR鑑定結果圖7中，泳道l:成熟肽序列轉化子酶切鑑定結果；泳道2: DL2000;泳道3:全長序列轉化子酶切鑑定結果；泳道4:開放閱讀框序列轉化子酶切鑑定結果；泳道5: DL2000;實施例3:MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表達一、含重組質粒酵母的誘導1、酵母蛋白的提取(用於SDS-PAGE)1) 將含有重組質粒的酵母細胞及含有空載體的酵母細胞接種到20ml的EMM液體培養 基中30'C過夜培養，取出10ml加入IPTG誘導，同時與未加IPTG誘導培養基繼續培養，未 加IPTG與加IPTG分別培養0h， 24h， 48h， 72h， 96h和0h,24h,48h,72h，取樣。2) 收集菌體，12000rpm， 3min， 4'C，棄上清，加入1.5ml的50mMTris-Cl (PH=7.5)， 10mmol/L疊氮化鈉，懸浮沉澱，12000rpm, 5min， 4'C離心沉澱細胞。3) 棄上清，再用30ulESB緩衝液懸浮細胞。4) IO(TC保溫3min，使蛋白酶失活之後，將樣品存放於-2(TC。5) 加入0.3g直徑0.2mm的玻璃珠，劇烈振蕩混合2min。6) 加入150ulESB緩衝液，稍加振蕩，置IO(TC保溫lmin。7) 樣品進行SDS-PAGE電泳。2、酵母蛋白的提取(用於native-PAGE)收集菌體，5000rpm， 5min，用無菌水洗一次，離心下來的菌體加500ul玻璃珠和500ul 破碎緩衝液，置於冰浴中，振蕩破碎(lmin振蕩，lmin冰浴)IO次，12000ipm， 15min，吸 上清，再離心，再吸上清，即為破壁液。加入等體積的加樣緩衝液，混勻，進行native-PAGE 電泳。二、 MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中表達產物檢測1、 SDS-PAGE電泳採用非解離系統的不連續的聚丙烯醯胺凝膠垂直平板電泳。 濃縮膠為PH=6. 8 Tris-Cl緩衝液5%的凝膠分離膠為PH=8. 8 Tris-Cl緩衝液12%的凝膠 電極緩衝液為PH=8. 3的Tris-Gly緩衝液2、 Native-PAGE電泳濃縮膠為PH=6. 7 Tris-Cl緩衝液2. 5%的凝膠 分離膠為PH=8. 9Tris-Cl緩衝液15%的凝膠 電極緩衝液為PH=8. 3的Tris-Gly緩衝液3、 NBT法測活性吸取30ul樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3ml NBT反應液，混勻，在28°C SOD 光化反應室中，2xl5W日光燈光照20min，在560nm處測定吸光度，以NBT反應液作空白 對照，每組設兩個重複，整個測定過程除光化反應外，均在避光或弱光條件下進行，以抑制 NBT光化還原反應速率的50%所需的酶量定為一個酶活力單位。公式如下 樣品酶活力(U/ml) = (OD對照-OD樣品)/ (1/2 0D對照)x稀釋倍數 圖8為含有MnSOD基因的重組質粒在粟酒裂殖酵母中的表達(SDS-PAGE) (48h-96h)。 圖8a為MnSOD成熟肽序列構建的表達載體在酵母中的表達(48h-96h)。泳道l:96h;泳道2: 72h;泳道3: 48h;泳道4:低分子量蛋白標準圖8b為MnSOD開放閱讀框序列構建的表達載體在酵母中的表達(48h-96h)。泳道l:低分子量蛋白標準；泳道2: 48h; 泳道3: 72h; 泳道4: 96h圖8c為MnSOD全長序列構建的表達載體在酵母中的表達(48h-96h)。
泳道l:低分子量蛋白標準；泳道2: 48h; 泳道3: 72h; 泳道4: 96h可看出MnSOD蛋白.表達量隨時間增加而增加。圖9為含有MnSOD基因的重組質粒在粟酒裂殖酵母中的表達(Native-PAGE) (0h-96h) (圖9中註明i的泳道代表此泳道蛋白是IPTG誘導表達的)圖9a為MnSOD成熟肽序列構建的表達載體在酵母中的表達(Native-PAGE) (0h-96h)。泳道l: 0h; 泳道2: 24h; 泳道3: 48h; 泳道4: 72h; 泳道5: 96h; 泳道6:i24h; 泳道7: i48h; 泳道8: i72h圖9b為MnSOD開放閱讀框序列構建的表達載體在酵母中的表達(Native-PAGE) (0h-96h)。泳道l: 0h; 泳道2: 24h; 泳道3: 48h; 泳道4: 72h; 泳道5: 96h; 泳道6:HA處理；泳道7:氯仿/乙醇處理；泳道8: i24h;泳道9:i48h;泳道10: i96h圖9c為MnSOD全長序列構建的表達載體在酵母中的表達(Native-PAGE) (0h-96h)。 泳道l: 0h; 泳道2: 24h; 泳道3: 48h; 泳道4: 72h; 泳道5: 96h; 泳道6: i24h; 泳道7: i48h; 泳道8: i72h由圖9可知，加IPTG誘導的菌株48h產生的活性最大。未加IPTG誘導的菌株72h產生 的活性最大。並且IPTG誘導48h產生的活性要比未用IPTG誘導72h產生的活性及表達量要 大得多。取3ul菌液NBT法測活性，活性變化規律如上所述。圖IO為同一培養時間，MnSOD不同長度片段在粟酒裂殖酵母中的表達量比較泳道l:空載體對照；泳道2:成熟肽序列在酵母中的表達；泳道3:開放閱讀框序列在酵母中的表達；泳道4:全長序列在酵母中的表達。由圖可知，開放閱讀框序列構建的表達載體在粟酒裂殖酵母中的表達量最大，其次為成熟肽序列及全長序列。由上述得出結論MnS0D蛋白構建的酵母真核表達載體在粟酒裂殖酵母中得到了大量的表 達，其中MnSOD開放閱讀框序列蛋白表達量最大，成熟肽序列蛋白表達量其次，再次為全長 序列，並且在IPTG誘導的情況下表達量會明顯增加，所以克隆大豆MnSOD基因的開放閱讀框 序列在粟酒裂殖酵母中IPTG誘導表達可明顯提高MnSOD蛋白的表達量，為進一步進行工業化 生產提供理論基礎。13
序列表<110〉吉林農業大學一種具有大豆MnS0D基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法wangpiwu200704-063〈170〉Patentln version 3. 211200〈212〉DNA〈213〉裡豆 1gata已已acgggccagtgcca已gccttgcatgcctgcaggtCg3Cg3tt3tagatctgatg60gccgcgcgagctctgttgaccaga^a^accctagccaccgttctccgcaacgacgcgaag120cccataatcgg已gctggcatagctgcagctactcattctcgtgggttgcacgtgtacacg180ctccccgatctggattacgactatggcgctctggagccagccatcsgcggtgaaatcatg240ctgctgcaccaccag犯gcaccaccagacttacatcaccaac 11caacaaggccctcgag300cagctccaagacgccgtcgccaagaaagattcctccgccgtcgttaagctccagggcgcc360atcaagttca3CggCgg3ggtcacgtcaacc已ttct已ttttctggaaaaatctagctcct420gttcgtgaagg鄉tggtgaggttcactgggatgggccattgacsc3cat480tttggctcttttgaagcattgttaatgcagaaggtgctgcactacagggg540tctggatgggtgtggcttggtctggac犯agagttga卿ggcttgtagttgaaaccact600gccaaccaggacccactggttact犯gggaccaaatttggttccattgcttggtattgat660gtttgggagcatgcgtact已ctt已cagtac犯gaatgttsgaccagactatctgaagaac720a/tttggaaagttattaattggaaacatgccagtgaagtgtatgagaaagagagctcttag780tctgaaagtgctacttgatatagctcttgagatgacagatttgcagcacggta卿gatg840tgg犯ta3a已tgatgtgatt aataacac taactatttttatgtagttgta900ctgaagaacctcgagcattgt已tggCtgC3tttctttgtactaagttccctcttgtctta960tgggatttttctgatgctctgtt已已ga^3ctattcgtttccagtgatgtatatcttttgc1020formula see original document page 15〈210〉 2〈211〉 1200〈212〉 DNA〈213〉 黑豆〈400〉 2formula see original document page 15
〈210〉 3〈211〉 583<212〉 DNA〈213〉 黑豆〈400〉 3gcgtctctgtgagcagccatcagcggtg朋tcatgcagctgcaccaccag犯gC3CC3CC603gsctt已catcaccaacttcaacaaggccctcgagcagctccaagacgccgtCgCC33g3120aagattcctccgccgtcgttaagctccagggcgccatcaagttcaacggcgg鄉tcacg180tcaaccattctattttctggctcctgttcgtgaaggaggtggtgaaccac240ccaagggttcactgggatgggccattgacacacattttggctcttttgaagcattagt3c300tgc卿aggtgctgcactac郷ggtctgg3tgggtgtggcttggtctgg360ac已aagagttga卿ggcttccactgccaaccaggacccactggttacta420agggacc已aatttggttccattgcttggtattgatgtttgggagc3tgcgtactacttac480tgttagacc8gactatctga3g犯catttggadagttattaattggaaac540atgccagtgaagtgtatgagctggatcccc犯t58權利要求
1、一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌，是將構建的含有大豆MnSOD基因的重組粟酒裂殖酵母表達載體導入粟酒裂殖酵母中得到的。
2、 如權利要求l所述的具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其構 建方法是將MnSOD基因插入到粟酒裂殖酵母表達載體的多克隆位點處，將構建的該重組粟 酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD導入粟酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉化子， 培養重組粟酒裂殖酵母使MnSOD基因得到表達。
3、 如權利要求2所述的具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特 徵在於構建的重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD，該載體含有Pnmtl啟動子、 Pnmtl終止子序列，抗性基因為氨節青黴素，選擇標記基因LEU，大豆MnSOD基因位於多 克隆酶切位點Sail和BamHI之間。
4、 如權利要求l所述的具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特 徵在於大豆MnSOD基因分別為SEQIDNO.l， SEQ ID NO.2 ， SEQIDN0.3所述。
5、 如權利要求2所述的具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌的構建方法，其特 徵在於酵母轉化方法是醋酸鋰轉化法及電擊轉化法。
全文摘要
本發明公開了一種具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其構建方法，包括一種表達錳超氧化物歧化酶基因MnSOD的專用載體pESPUC和該重組質粒在粟酒裂殖酵母中不同時間段的表達情況。本發明克隆了大豆MnSOD基因，構建重組粟酒裂殖酵母表達載體pESPUC-MnSOD，將重組質粒採用醋酸鋰轉化法及電擊轉化法導入到粟酒裂殖酵母菌中，使其得以表達，本發明得到錳超氧化物歧化酶MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中表達的最佳條件，同時將酵母培養用於工業化生產，具有原料便宜，生長周期短，生產規模大，提取成本低的優點，兩者結合起來具有重要的工業應用前景和實際意義。
文檔編號C12N1/19GK101157897SQ20071005595
公開日2008年4月9日 申請日期2007年8月3日 優先權日2007年8月3日
發明者萬麗娜, 付永平, 王丕武 申請人:吉林農業大學