一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用的製作方法

2023-12-02 09:38:51 1

一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒。本發明所提供的試劑盒含有如下物質：1）結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示胺基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成；2）經螢光染料A標記的抗CD3的抗體；3）經螢光染料B標記的抗γ-幹擾素的抗體；4）高爾基體阻斷劑；所述螢光染料A和所述螢光染料B所發螢光顏色不同。本發明提供了一種新的可用於結核分枝桿菌感染檢測的方法，實驗證明，本發明可直接利用外周血進行抗原刺激，無需分離外周血單個核細胞，實驗數據顯示用於結核分枝桿菌感染檢測具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡便，成本較低，具有較高的臨床應用價值。
【專利說明】—種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用，特別涉及一種基於流式細胞術利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病，據WHO資料估計，全球約三分之一的人口受結核分枝桿菌隱性感染，每年新發活動性感染病例九百多萬，死亡一百萬例以上。近年來，我國結核病發病率居高不下，每年新發病例超過一百萬，死亡近二十萬例，對我國公民的健康、社會的安定和經濟的發展帶來嚴重的危害。
[0003]結核病的早期診斷對於控制患者疾病進展和感染的蔓延具有重要意義。目前，結核病臨床診斷仍然缺乏高靈敏度和高特異性的手段。傳統的結核菌素皮下試驗所用的抗原(PPD)因為能夠跟卡介苗(BCG)的接種產生交叉反應使得其產生較高比例的假陽性，而臨床診斷的「金標準」結核菌培養則有時間長，陽性率低等缺陷。另外，基於X射線透射和臨床表現的診斷則特異性較低，容易與其他肺部感染或疾病相混淆。
[0004]免疫學研究表明，結核分枝桿菌作為一種胞內寄生菌，其分泌的一些蛋白能夠激發高水平的T細胞免疫反應，而針對這些蛋白中包含的T細胞表位特異性T細胞檢測給TB的診斷帶來了新的機遇。通過結核桿菌與BCG菌株基因組的研究比較發現了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段RDl，針對RDl區編碼的蛋白ESAT-6和CFP-10特異性T細胞分泌產生的IFN-Y的檢測(IGRAs)，催生了兩種商品化結核診斷試劑盒，即基於酶聯免疫斑點技術(ELISP0T)的T-SP0T.TB和基於酶聯免疫吸附技術(ELISA)的QuantiFERON-TB Gold。目前，這兩種診斷試劑盒已經分別於2007年和2008年在美國得到FDA批准上市，作為結核病臨床診斷的輔助手段。ELISP0T方法需要對外周血樣本進行分離，得到外周血單個核細胞並對細胞進行計數後方可進行後續的抗原刺激等試驗，同時對相關實驗與檢測儀器的要求較高，在臨床單位的普及率不高。
[0005]然而，中國特殊的結核病流行病學及生態環境、由於專利保護產生的高成本，使得這些診斷產品並不適用於中國廣泛的臨床診斷應用，因此亟需開發具有自主智慧財產權的結核病快速診斷試劑。此外絕大多數免疫檢測方法如ELISP0T方法均需要首先從全血中分離外周血單個核細胞並對細胞進行計數後方可進行檢測，因此開發一種利用全血直接進行相關檢測實驗的方法可大大提聞相關試劑在臨床的適用性。

【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒。
[0007]本發明所提供的利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒，具體可含有如下物質:
[0008](I)結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；
[0009]所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1_19所示胺基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成；
[0010](2)經螢光染料A標記的抗⑶3的抗體；
[0011](3)經螢光染料B標記的抗Y -幹擾素的抗體；
[0012](4)聞爾基體阻斷劑；
[0013]所述螢光染料A和所述螢光染料B所發螢光顏色不同。
[0014]在所述試劑盒中，所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫中的多肽既可為每條獨立包裝，也可按照等質量混合以後一起包裝。
[0015]在本發明中，所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示胺基酸序列組成的19條多肽組成。
[0016]在所述試劑盒中，還含有說明書；
[0017]所述說明書中記載:按照包括如下步驟的方法檢測待測個體是否被結核分枝桿菌感染:
[0018]Ca)向離體的待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育 14-18h (如 18h)；
[0019](b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4_6h (如6h)；
[0020](c)將步驟(b)的體系離心後，向沉澱中加入細胞固定液，避光反應15_25min (如20min),再加入通透緩衝液；
[0021](d)向步驟(C)的體系中加入所述經螢光染料標記的抗⑶3的抗體和所述經螢光染料標記的抗Y -幹擾素的抗體，避光反應20-30min (如30min);
[0022](e)將步驟(d)的體系離心，取細胞沉澱，加入染色緩衝液，進行流式細胞檢測；
[0023](f)結果判斷:若經所述流式細胞儀檢測，雙陽性細胞的比例大於0.2%，且為空白對照組中雙陽性細胞比例的兩倍以上，則所述待測個體被結核分枝桿菌感染或候選被結核分枝桿菌感染；反之，則所述待測個體未被結核分枝桿菌感染或候選未被結核分枝桿菌感染；
[0024]所述對空對照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述「向待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫」的步驟；
[0025]所述雙陽性細胞為被如下兩種抗體同時標記的細胞:所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體。
[0026]所述雙陽性細胞的比例為雙陽性細胞的數量佔被檢測細胞總數的百分比。
[0027]在本發明中，所述外周血為人外周血，所述抗CD3的抗體為抗人CD3的抗體，所述抗Y-幹擾素的抗體為抗人Y-幹擾素的抗體。
[0028]在所述試劑盒中，所述抗CD3的抗體進一步為抗CD3的單克隆抗體；所述抗Y-幹擾素的抗體進一步為抗Y-幹擾素的單克隆抗體。
[0029]更加具體的，在本發明中，所述經螢光染料A標記的抗CD3的抗體為經異硫氰酸螢光素(FITC)標記的抗⑶3的單克隆抗體；所述經螢光染料B標記的抗Y -幹擾素的抗體為經R-藻紅蛋白(R-PE)標記的抗Y -幹擾素的單克隆抗體。
[0030]在本發明的一個實施例中，所述經異硫氰酸螢光素(FITC)標記的抗⑶3的單克隆抗體具體為北京曠博生物技術有限公司產品，其產品目錄號為6610004。所述經R-藻紅蛋白(R-PE)標記的抗Y-幹擾素的單克隆抗體具體為eBioscience公司產品，其產品目錄號為12-7319-81。所述高爾基體阻斷劑具體為eBioscience公司產品，其產品目錄號為00-4506-51 ο
[0031]為了提高檢測的準確性，所述試劑盒中還可含有作為陽性對照的T細胞非特異性刺激物。
[0032]所述T細胞非特異性刺激物可為植物凝集素(PHA)或刀豆蛋白A (ConA)0
[0033]進一步，所述試劑盒中還可含有細胞固定液和/或通透緩衝液和/或染色緩衝液。
[0034]在本發明中，所述細胞固定液、所述通透緩衝液和所述染色緩衝液均為進行流式細胞檢測對細胞進行前處理過程中的常用試劑。具體而言，在本發明的一個實施例中，所述細胞固定液為eBioscience產品，貨號為00-8222-49 ;所述通透緩衝液為eBioscience產品，貨號為00-8333-56;所述染色緩衝液為北京曠博生物技術有限公司產品，產品目錄號為 6910031。
[0035]除以上外，所述試劑盒中還可含有其他流式檢測所需試劑及耗材。
[0036]本發明的另一個目的是提供所述試劑盒的製備方法。
[0037]所述試劑盒的製備方法，具體可包括將所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫、所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體、所述經螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體和所述高爾基體阻斷劑分別單獨包裝的步驟。
[0038]所述試劑盒在利用外周血體外檢測結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應中的應用也屬於本發明的保護範圍。所述應用為非疾病診斷性應用。
[0039]本發明的再一個目的是提供一種檢測外周血中是否含有結核分枝桿菌特異性T細胞的方法。所述方法為非疾病診斷性方法。
[0040]本發明所提供的檢測外周血中是否含有結核分枝桿菌特異性T細胞的方法，具體可包括如下步驟:
[0041]Ca)向離體的待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育 14-18h (如 18h)；
[0042](b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4_6h (如6h)；
[0043](c)將步驟(b)的體系離心後，向沉澱中加入所述細胞固定液，避光反應15_25min(如20min),再加入所述通透緩衝液；
[0044](d)向步驟(C)的體系中加入所述經螢光染料標記的抗⑶3的抗體和所述經螢光染料標記的抗Y -幹擾素的抗體，避光反應20-30min (如30min);
[0045](e)將步驟(d)的體系離心，取細胞沉澱，加入所述染色緩衝液，進行流式細胞檢測；
[0046](f)結果判斷:若經所述流式細胞儀檢測，雙陽性細胞的比例大於0.2%，且為空白對照組中雙陽性細胞比例的兩倍以上，則所述待測外周血中含有或候選含有結核分枝桿菌特異性T細胞；反之，則所述待測外周血中不含有或候選不含有結核分枝桿菌特異性T細胞；
[0047]所述對空對照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述「向待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫」的步驟；
[0048]所述雙陽性細胞為被如下兩種抗體同時標記的細胞:所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體。[0049]所述雙陽性細胞的比例為雙陽性細胞的數量佔被檢測細胞總數的百分比。
[0050]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(a)中，所述「向待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫」為:向每500 μ I的所述待測外周血中加入的每條多肽的質量均為10 μ go
[0051]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(b)中，所述高爾基體阻斷劑的用量可為所述待測外周血體積的1/250。
[0052]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(b)中，在37°C孵育4_6h (如6h)後，還可包括如下步驟:加入所述待測外周血4倍體積的所述染色緩衝液。
[0053]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(c)中，所述離心為25°C 1500rpm離心3min。所述細胞固定液的加入量可為所述待測外周血體積的2/5。
[0054]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(c)中，所述「加入所述通透緩衝液」具體為:加入所述待測外周血4倍體積的所述通透緩衝液,離心(如1500rpm) 3min,棄上清，向沉澱中再加入所述待測外周血4倍體積的所述通透緩衝液,離心(如1500rpm) 3min,棄上清，向沉澱中再加入所述待測外周血1/5體積的所述通透緩衝液。
[0055]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(d)中，所述經螢光染料標記的抗⑶3的抗體的用量為所述待測外周血體積的8/500 ;所述經螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體的用量為所述待測外周血體積的1/100。
[0056]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(d)中，在所述避光反應20_30min (如30min)後，還包括如下步驟:加入所述待測外周血8倍體積的所述染色緩衝液。
[0057]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(e)中，所述離心為1500rpm離心3min。所述染色緩衝液的加入量為所述待測外周血體積的1/5。
[0058]本發明提供了一種新的可用於結核分枝桿菌感染檢測的胞內因子染色方法，並且實驗證明，本發明可直接利用外周血進行抗原刺激，無需分離外周血單個核細胞，實驗數據顯示用於結核分枝桿菌感染檢測具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡便，臨床適用性強，成本較低，可以用於結核分枝桿菌感染檢測，具有較高的臨床應用價值。
【具體實施方式】
[0059]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0060]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0061]實施例1、利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒的開發
[0062]本發明所提供的利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒包含:
[0063]1、結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；
[0064]所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1_19所示胺基酸序列組成的19條多肽組成；
[0065]2、陽性對照刺激物-植物凝集素(PHA)溶液；
[0066]3、細胞培養用24孔板；
[0067]4、FITC (異硫氰酸突光素)標記人0)3單克隆抗體,R-PE (R-phycoerythrin, R-藻紅蛋白)標記人Y-幹擾素單克隆抗體；
[0068]5、高爾基體阻斷劑(BrefeldinA);[0069]6、細胞固定液與通透緩衝液。
[0070]7、其他流式檢測檢測所需試劑及耗材。
[0071]實施例2、應用實施例1的試劑盒進行結核分枝桿菌感染臨床檢測
[0072]一、外周血樣本的採集
[0073]志願者病例的篩選標準為同時滿足以下臨床診斷標準:
[0074](I)臨床主治醫生根據志願者臨床表現確診為肺結核；
[0075](2)結核分枝桿菌分離培養菌落呈陽性；
[0076](3) X射線影像呈現肺部病變；
[0077](4)結核菌素皮下試驗結果為陽性，斑點直徑大於1cm。
[0078]健康志願者篩選標註為同時滿足以下:
[0079](I)無結核臨床症狀；
[0080]( 2 )無其他疾病或感染。
[0081]經過篩選的個體經臨床醫生體檢合格後，由試驗者告知具體項目流程及所需血液的數量，經志願者同意並籤署知情同意書，臨床醫生將對志願者進行採血。最終本項目篩選了 11例結核病志願者和7例健康志願者，採血時使用含有肝素鋰抗凝的一次性真空採血管(格雷納，奧地利)，每名志願者採血約20-25ml，採血後立即顛倒防止凝血。
[0082]二、應用實施例1的試劑盒進行結核分枝桿菌感染臨床檢測
[0083](一)本發明應用實施例1的試劑盒進行檢測的方法
[0084]結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫溶液的配置:將19條多肽分別每條以DMSO溶解，再等質量(以多肽質量計)混合，再用RPIM1640培養基稀釋至每條多肽的終濃度為20 μ g/ml，備用。
[0085]1、抗原刺激:
[0086]在一塊24孔細胞培養板中加入志願者外周血500 μ I/孔,每例樣本分為3孔,其中I孔加入500 μ I結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫溶液、I孔加入500 μ I植物凝集素(PHA)溶液(Sigma，貨號L1668 ;配製方法:以細胞培養基溶解至濃度為50 μ g/ml)(陽性對照)，另I孔加入500 μ I RPIM1640培養基(空白對照)，蓋上蓋子，在37°C 5%C02培養箱中孵育18小時。
[0087]2、添加阻斷劑:
[0088]在步驟I孵育18小時後，向每孔中加入2μ I高爾基體阻斷劑(BrefeldinA)(eBioscience公司產品，其產品目錄號為00-4506-51)，繼續孵育6小時。防止Y -幹擾素分泌到胞外。
[0089]3、後續處理及結果獲取:
[0090](I)孵育結束後，迅速在每孔加入2ml染色緩衝液(北京曠博生物技術有限公司產品，產品目錄號為6910031)，混勻轉入流式管中，在25°C條件下用水平離心機1500rpm離心3min,棄上清。
[0091](2)每管中加入200 μ I細胞固定液(eBioscience產品，貨號為00-8222-49)，振勻，避光反應20min。
[0092](3)每管加入2ml通透緩衝液(eBioscience產品，貨號為00-8333-56)，振勻1500rpm離心3min,棄上清。並重複該步驟一次。[0093](4)振蕩重懸，每管加入100μ I通透緩衝液(eBioscience產品，貨號為00-8333-56)，再加入胞內螢光抗體FITC-⑶3 (北京曠博生物技術有限公司產品，其產品目錄號為 6610004) 8 μ 1，PE-1FN y (eBioscience 公司產品，其產品目錄號為 12-7319-81)5 μ 10加完後，振勻，避光反應30min。
[0094](5)振蕩重懸，每管加入4ml染色緩衝液(北京曠博生物技術有限公司產品，產品目錄號為6910031), 1500rpm離心3min,棄上清。
[0095](6)每管加入100μ I染色緩衝液(北京曠博生物技術有限公司產品，產品目錄號為6910031)，振蕩重懸後上Becton Dickinson FACSCalibur流式細胞儀檢測。結果分析應用 CellsQuest 軟體。
[0096]陽性反應判斷標準:雙陽性細胞的比例大於0.2%，且為空白對照組中雙陽性細胞比例的兩倍以上(所述雙陽性細胞的比例為雙陽性細胞的數量大於上機檢測細胞總數的百分比)，說明待測外周血中含有結核分枝桿菌特異性T細胞，從而判定相應的個體被結核分枝桿菌感染。所述雙陽性細胞為被如下兩種抗體同時標記的細胞:所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體。本實施例中所有結核病例或健康志願者外周血對結核抗原的反應均按照此標準進行量化並作出陽性或陰性反應判斷，每個樣本反應值超過此標準判定為陽性反應，低於此標準判定為陰性反應。
[0097]實驗重複三次。
[0098](二)ELISP0T 對照方法
[0099]採用現有商品化T-SP0T.TB試劑盒(Oxford Immunotec公司產品)進行。本試劑盒中包括酶標抗體、ESAT-6多肽庫和CFP-10多肽庫及顯色底物等。
[0100]l、PBMCs的分離及抗原刺激
[0101](I)先將新鮮採集的外周血用121°C高壓滅菌冷卻後的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4)稀釋一倍，即20ml外周血加入到20ml的PBS中混勻，將稀釋的血樣小心加入到事先準備好的15ml淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物製品科技有限責任公司產品，貨號LTS10771)中，加入時十分小心，緩慢加入，避免界面混亂。
[0102](2) 25°C條件下用水平離心機700g或2000rpm/min離心20min，剎車時減速調到
最慢。離心後的樣品分四層，將上層血漿用巴斯德移液管吸出，之後小心吸出淋巴細胞層至新的離心管中。
[0103](3 )用等體積的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4 )等體積稀釋吸出的淋巴細胞層，之後離心(2000rpm，10min，25°C)。棄掉上清，重懸後加入無血清RPM1640培養基約7ml清洗，離心1500rpm，5min，25°C。注:此步驟時若發現紅細胞較多，可以加入紅細胞裂解液裂解掉紅細胞，6ml紅細胞裂解液,裂解5min,到時間後加入6ml PBS, 1500rpm離心5min。
[0104](4)棄上清，重懸，加7_8ml含10% (體積分數)血清(Hyclone)的RPM1640培養基清洗，離心 1500rpm, 5min, 25°C。
[0105](5)棄掉上清後用3ml含10% (體積分數)血清的RPM1640培養基重懸，取適量於血球計數板上進行細胞計數，並最終調整至2.5 X IO6細胞/ml密度。
[0106](6)每個結核病例及健康志願者分得的PBMCs同時進行T-SP0T.TB檢測，刺激物分兩孔，I孔加入50 μ I ESAT-6多肽庫(試劑盒隨附)，另I孔加入50 μ I CFP-10多肽庫(試劑盒隨附)。再向每孔中加入100 μ I步驟(5)稀釋後的PBMCs細胞，加完後將ELISP0T板置37°C，5%C02條件下孵育18小時。
[0107]2、後續處理及結果獲取:
[0108](1)孵育結束後，棄掉孔內細胞液，迅速在每孔加入200μ I常溫的去離子水清洗2次，之後PBST清洗3次。
[0109](2)去除洗液，在吸水紙上用力扣幹，每孔加入50μ I稀釋的酶標檢測抗體(試劑盒隨附)，室溫孵育2h。
[0110](3)顯色:去除酶標檢測抗體溶液，PBST清洗3次，之後PBS清洗2次。在吸水紙上用力扣幹，之後每孔加入50 μ I顯色底物溶液(試劑盒隨附)，室溫孵育7分鐘後，當看到清晰的斑點時，用蒸餾水衝洗膜的雙面以中止反應。
[0111](5)37°C或室溫下晾乾，之後將ELISP0T板用自動讀板儀(C.T.L)對ELI SPOT孔內反應的點數進行計數，之後調整參數並進行質量控制，給出最終反應結果。
[0112]陽性反應判斷標準:ELISP0T結果按照T-SP0T.TB試劑盒說明書進行判斷。
[0113]實驗重複三次。
[0114]結果顯示，以上應用實施例1的試劑盒進行臨床檢測的方法在結核病例中的檢測敏感度達到100% (11/11)，且與7名健康志願者結果比較，特異性達100%，與作為對照的ELISP0T法相比，基本一致，無統計學差異(表1)。且三次重複實驗的結果均如表1所示。因此，應用實施例1的試劑盒能夠有效的檢測結核分枝桿菌感染。
[0115]表1應用實施例1的試劑盒進行臨床檢測的方法與ELISP0T法診斷特異性和靈敏
度
[0116]統計
[0117]
【權利要求】
1.一種利用外周血檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒，含有如下物質: (1)結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫； 所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示胺基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成； (2)經螢光染料A標記的抗⑶3的抗體； (3)經螢光染料B標記的抗Y-幹擾素的抗體； (4)聞爾基體阻斷劑； 所述螢光染料A和所述螢光染料B所發螢光顏色不同。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒中還含有說明書； 所述說明書中記載:按照包括如下步驟的方法檢測待測個體是否被結核分枝桿菌感染: (a)向離體的待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育14-18h ； (b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4-6h； (c)將步驟(b)的體系離心後，向沉澱中加入細胞固定液，避光反應15-25min，再加入通透緩衝液； Cd)向步驟(c)的體系中加入所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述經螢光染料標記的抗Y -幹擾素的抗體，避光反應20-30min ； (e)將步驟(d)的體系離心，取細胞沉澱，加入染色緩衝液，進行流式細胞檢測； (f)結果判斷:若經所述流式細胞儀檢測，雙陽性細胞的比例大於0.2%，且為空白對照組中雙陽性細胞比例的兩倍以上，則所述待測個體被結核分枝桿菌感染或候選被結核分枝桿菌感染；反之，則所述待測個體未被結核分枝桿菌感染或候選未被結核分枝桿菌感染； 所述對空對照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述「向待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫」的步驟； 所述雙陽性細胞為被如下兩種抗體同時標記的細胞:所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於:所述抗CD3的抗體為抗CD3的單克隆抗體；和/或 所述抗Y-幹擾素的抗體為抗Y-幹擾素的單克隆抗體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特徵在於:所述經螢光染料A標記的抗CD3的抗體為經異硫氰酸螢光素標記的抗CD3的單克隆抗體；和/或 所述經螢光染料B標記的抗Y-幹擾素的抗體為經R-藻紅蛋白標記的抗Y-幹擾素的單克隆抗體。
5.根據權利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒中還含有T細胞非特異性刺激物； 所述T細胞非特異性刺激物具體為植物凝集素或刀豆蛋白A。
6.根據權利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒中還含有細胞固定液和/或通透緩衝液。
7.根據權利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒中還含有染色緩衝液。
8.權利要求1-7中任一所述的試劑盒的製備方法，包括將所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫、所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體、所述經螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體和所述高爾基體阻斷劑分別單獨包裝的步驟。
9.權利要求1-7中任一所述的試劑盒在利用外周血體外檢測結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應中的應用。
10.一種檢測外周血中是否含有結核分枝桿菌特異性T細胞的方法，包括如下步驟: (a)向離體的待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育14-18h ； (b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4-6h； (c)將步驟(b)的體系離心後，向沉澱中加入所述細胞固定液，避光反應15-25min,再加入所述通透緩衝液； Cd)向步驟(c)的體系中加入所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述經螢光染料標記的抗Y -幹擾素的抗體 ，避光反應20-30min ； (e)將步驟(d)的體系離心，取細胞沉澱，加入所述染色緩衝液，進行流式細胞檢測； Cf)結果判斷:若經所述流式細胞儀檢測，雙陽性細胞的比例大於0.2%，且為空白對照組中雙陽性細胞比例的兩倍以上，則所述待測外周血中含有或候選含有結核分枝桿菌特異性T細胞；反之，則所述待測外周血中不含有或候選不含有結核分枝桿菌特異性T細胞； 所述對空對照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述「向待測外周血中加入所述結核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫」的步驟； 所述雙陽性細胞為被如下兩種抗體同時標記的細胞:所述經螢光染料標記的抗CD3的抗體和所述螢光染料標記的抗Y-幹擾素的抗體。
【文檔編號】G01N33/569GK103760345SQ201410022450
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】石佳, 李啟靖, 董劍峰, 張衛紅 申請人:北京曠博生物技術有限公司